автореферат - Институт биоорганической химии
advertisement
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук (ИБХ РАН) На правах рукописи ЗАБОЛОТНЕВА АНАСТАСИЯ АЛЕКСАНДРОВНА ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТРАНСКРИПТОМОВ ОПУХОЛЕВЫХ И НОРМАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ ЧЕЛОВЕКА 03.01.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Буздин А. А. Москва, 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, в группе геномного анализа сигнальных систем клетки Научный руководитель: доктор биологических наук Буздин Антон Александрович Официальные оппоненты: доктор биологических наук Николаев Лев Григорьевич, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, старший научный сотрудник лаборатории структуры и функций генов человека кандидат биологических наук Кантидзе Омар Леванович, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук, старший научный сотрудник лаборатории структурно-функциональной организации хромосом Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение Федеральный научно-клинический центр Детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева. Защита состоится «25» сентября 2013 года в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук по адресу: 117997 ГСП-7, г. Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук Автореферат разослан «10 » июля 2013 года. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физико-математических наук В. А. Олейников ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Злокачественные опухоли являются второй после заболеваний сердечно-сосудистой системы причиной смертности людей в мире. При этом заболеваемость раком непрерывно растёт. Ежегодно в мире регистрируется порядка 12 миллионов новых случаев заболевания злокачественными опухолями. Опухолевые клетки, образующиеся из клеток эпителиальной ткани, характеризуются агрессивным ростом, бесконтрольным делением, склонностью к метастазированию; они теряют тканеспецифичную структуру и функциональную активность, изменяют антигенный состав и многие другие свойства, присущие нормально дифференцированным клеткам живого организма. Превращению здоровой клетки в опухолевую способствуют как внешние факторы – канцерогены (химические вещества, ионизирующее и ультрафиолетовое излучение, онкогенные вирусы), так и внутренние причины – дисбаланс гормонов, ростовых факторов или генетические и эпигенетические изменения. Независимо от вида канцерогенного воздействия, пусковым механизмом перерождения клеток является возникновение генетических и эпигенетических изменений, которые приводят к появлению новых путей регуляции жизни и деления клетки. Поэтому одной из важнейших целей современной науки, занимающейся изучением онкогенеза, является обнаружение и характеристика изменений в геноме и транскриптоме клетки, приводящих к опухолеобразованию. В последние годы интенсивно развиваются широкомасштабные методы исследования генома клетки. Благодаря достижениям в секвенировании и новым методам функциональной геномики были сделаны важнейшие открытия в генетике рака и обнаружены новые возможности для проведения эффективной и персонализированной терапии злокачественных новообразований. По встречаемости среди других злокачественных новообразований мочевыделительной системы рак мочевого пузыря (РМП) занимает второе место, а среди всех других видов опухолей – девятое место в мире. При этом ежегодно диагностируется более 360 000 новых случаев заболевания в мире. Заболеваемость РМП преобладает в странах с европеоидным населением. Большой проблемой для онкоурологов в настоящее время является разработка объективного и высокочувствительного метода диагностики РМП без инвазивного вмешательства, которое не только причиняет дискомфорт пациенту, но и связано с риском возникновения серьезных побочных эффектов. В настоящее время существуют некоторые потенциальные панели маркеров и методы диагностики, не требующие инвазивного вмешательства. Как правило, эти методы основаны на молекулярно-генетической диагностике, все больше приобретающей популярность в современной клинической практике. Несмотря на существование ряда недостатков диагностических панелей молекулярных маркеров, можно с уверенностью сказать, что молекулярно-генетическая диагностика является одним из самых перспективных направлений 3 молекулярной медицины и имеет широкий спектр практических применений, например, таких как раннее обнаружение злокачественных изменений, проведение скрининга популяций с целью выявления высокой предрасположенности к развитию РМП, прогнозирование течения заболевания и помощь в выборе адекватной стратегии лечения. При этом так же, как и в случае изучения механизмов канцерогенеза, приорететным направлением поиска новых маркерных молекул является широкомасштабный скрининг различных молекулярных изменений в раковых клетках мочевого пузыря. Данная работа посвящена широкомасштабному анализу транскриптомов опухолевых и нормальных клеток мочевого пузыря и поиску молекулярных изменений, приводящих к канцерогенезу и служащих его маркерами. Цель работы Целью диссертационной работы явилось широкомасштабное изучение генетических и эпигенетических изменений, приводящих к образованию злокачественных опухолей мочевого пузыря, а также поиск новых молекулярных маркеров, пригодных для диагностики РМП. В ходе работы были решены следующие задачи: 1. Проведен комплексный анализ транскриптомов опухолевых и нормальных клеток мочевого пузыря с помощью методов гибридизации на микрочипах, супрессионной вычитающей гибридизации, глубокого секвенирования транскриптов и количественной ПЦР. 2. Проведено исследование экспрессии коротких некодирующих РНК с помощью высокопроизводительного секвенирования библиотек коротких РНК. 3. Получены профили метилирования генов с помощью гибридизации на микрочипах. 4. Проведен биоинформатический анализ данных по экспрессии генов-маркеров 5. Исследована роль мобильных элементов генома SVA и SVAF1 в канцерогенезе РМП. мочевого пузыря. 6. Проведен поиск новых потенциальных диагностических маркеров РМП. 7. Проведен анализ сигнальных путей, участвующих в злокачественном перерождении клеток мочевого пузыря. Научная новизна и практическая значимость работы Настоящая работа была направлена на изучение молекулярных механизмов канцерогенеза мочевого пузыря человека с целью выявления общих закономерностей образования и прогрессирования данного типа опухолей. Понимание причин и основных путей онкогенеза 4 позволит разработать наиболее эффективную терапию РМП и чувствительную диагностику, направленую на выявление опухолей на ранних стадиях. В этом состоит практическая значимость работы. Новизну работы отражают следующие факты: 1) впервые для изучения молекулярных изменений в раковых клетках мочевого пузыря был применен интегральный подход, объединивший такие методы исследования транскриптомов и геномов клеток, как гибридизация на микрочипах, супрессионная вычитающая гибридизация, глубокое секвенирования транскриптов и библиотек коротких некодирующих РНК и количественная ПЦР; 2) на основе литературного анализа создана наиболее полная на сегодняшний день база данных молекулярных маркеров РМП; 3) с помощью экспериментального и биоинформатического анализа проведена оценка диагностической ценности известных молекулярных маркеров РМП и выявлены новые маркерные молекулы, потенциально применимые в клинической диагностике заболевания; 4) выявлены общие пути канцерогенеза мочевого пузыря, отражающие наиболее часто происходящие молекулярные изменения в опухолевых клетках у больных российской популяции; полученные результаты могут послужить хорошей базой для разработки индивидуалированного подхода к терапии раковых опухолей и поиска новых мишеней для таргетных препаратов. Апробация работы Результаты работы были представлены на российских и международных конференциях: Четвертой Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике на тему «Геномика и биология клетки», Звенигород, 2010, XXIII Международной зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 7-10 февраля 2011г., Школе-конференции молодых ученых "Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины - 2011", Москва, 29-30 сентября 2011г., конференции "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова", Москва-Пущино, 14-17 ноября 2011 г. Объем работы Диссертационная работа изложена на 128 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, основных выводов, списка литературы и приложений. Диссертация содержит 5 таблиц и 31 рисунков. Публикации По теме диссертационной работы опубликовано 6 статей в отечественных и зарубежных 5 научных журналах, получено 5 патентов на изобретения. Результаты работы представлены на российских международных конференциях: Школе-конференции молодых ученых "Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины - 2011", Москва, 29-30 сентября 2011г., конференции "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова", Москва-Пущино, 14-17 ноября 2011 г. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Создание интегрированной базы данных потенциальных молекулярных маркеров РМП. В публичных базах данных было обнаружено 3718 статей, сообщающих об открытии и/или использовании генетических маркеров РМП. В исследование включались только данные по метилированию и экспрессии генов и микроРНК. Среди 234 найденных маркеров 93 являются маркерами генной экспрессии, 39 – маркерами метилирования ДНК и 102 – дифференциально экспрессирующиеся или дифференциально метилированные микроРНК. Полученные литературные данные по молекулярным маркерам вошли в состав интегральной базы данных, содержащей также информацию о функции гена-маркера или микроРНК, положении в геноме, роли в канцерогенезе мочевого пузыря и ссылки на внешние источники. Интегрированная база данных доступна в Интернет http://bladder.pparser.net/files/SupplementaryFile6.xls. 2. Биоинформатический анализ экспрессии генов-маркеров. Для того, чтобы оценить достоверность литературных данных по экспрессии геновмаркеров, был проведен биоинформатический анализ базы данных Gene Expression Omnibus (GEO, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), содержащей профили экспрессии генов для 46 опухолевых и 9 нормальных образцов мочевого пузыря. С использованием данных GEO было проанализировано 88 из 93 экспрессионных маркеров РМП, поскольку для пяти маркеров информация в базе данных GEO отсутствовала. Дифференциальная экспрессия была обнаружена для 86 генов, в то время как для двух генов ING1 и CDKAL1 показано отсутствие разницы в экспрессии. В литературе, данные гены описаны как потенциальные маркеры РМП, хотя согласно данному исследованию они имеют полностью интактные профили транскрипции. Из обнаруженных дифференциальных генов 26 были гиперэкспрессированы в большинстве образцов (> 50% образцов РМП) и 3 – гипоэкспрессированы. Из подтвержденных дифференциально экспрессирующихся генов 63 имели полностью или большей частью совпадающие профили транскрипции (были гипер- или гипоэкспрессированы), а для 21 гена профили транскрипции противоречили опубликованным данным. Для дальнейшей характеристики маркеров РМП была посчитана их чувствительность (SE) и специфичность (SP) и величина AUC (от англ. Area-Underthe-Curve, AUC=(SE+SP)/2). Величина AUC характеризует прогностическую эффективность маркера и принимает значения от 0 до 1. Если AUC < 0,5, то прогностическая ценность маркера 6 ничтожно мала, при AUC >0,7 маркер считается надежным показателем заболевания. По данным GEO только для 13 исследованных маркеров величина AUC была ≥ 0,7, для 51 маркера AUC было меньше 0,6 и для 30 маркеров – меньше 0,5 (рис. 1). Таким образом, биоинформатический анализ показал, что только ~15% ранее опубликованных экспрессионных маркеров имеют высокий диагностический потенциал и ~37% - имеют ничтожно малую диагностическую ценность. 3. Характеристика профилей транскрипции генов в опухолевых и нормальных клетках мочевого пузыря с помощью супрессионной вычитающей гибридизации кДНК и гибридизации на микрочипах. Для того, чтобы охарактеризовать профили экспрессии генов в нормальных и опухолевых тканях мочевого пузыря, а также обнаружить новые, специфичные для раковых или здоровых клеток транскрипты, были применены методы супрессионной вычитающей гибридизации кДНК (СВГ) и гибридизации на микрочипах (ГМ). 25 AUC > 0,7 Число маркеров 20 15 10 5 0,94 0,875 0,775 0,665 0,655 0,625 0,595 0,54 0,515 0,485 0,44 0,415 0,405 0,335 0,28 0,245 0,19 0,165 0,12 0,065 0 0 AUC Рис. 1. Оценка диагностической ценности заявленных в литературе маркеров на основе анализа базы данных GEO. Диаграмма показывает какое число заявленных маркеров имеют определенную величину AUC по данным GEO. 3.1. Анализ экспрессии генов методом СВГ. Для СВГ в исследовании было взято 9 объединенных образцов опухолевых тканей и 6 объединенных образцов нормальных тканей мочевого пузыря. После проведения СВГ были получены 2 библиотеки кДНК, обогащенные последовательностями специфичными либо для 7 раковых клеток (РМП+), либо для нормальных клеток (РМП-). Полученные библиотеки были секвенированы с ипользованием платформы Illumina GAIIx. После биоинформатической обработки данных были получены значения нормализованной цифровой экспрессии для 61 потенциального маркера РМП. Для 39 маркеров (64%) статус экспрессии (гипер- или гипоэкспрессирован) был подтвержден СВГ. Таким образом, результаты СВГ лучше согласовались с данными GEO (в 83% случаев), чем с литературными данными. Все обнаруженные с помощью СВГ дифференциально экспрессирующиеся в раковых и здоровых тканях мочевого пузыря гены представлены на сайте http://cellgenetics.ru/postparser/bladder/expression.php. Еще одним важным результатом СВГ явилось обнаружение ряда новых транскриптов с неизвестной функцией, часть из которых картировались в области интронов генов. Обнаруженные последовательности специфично транскрибировались либо в опухолевых, либо в нормальных тканях мочевого пузыря. По следующим ссылкам можно обнаружить последовательности, специфичные для раковых или нормальных клеток мочевого пузыря – http://cellgenetics.ru/postparser/bladder/view_reads_ok.php?id=ABC1_contigs (рак), http://cellgenetics.ru/postparser/bladder/view_reads_ok.php?id=ABC2_contigs (норма). 3.2. Анализ экспрессии генов методом гибридизации на микрочипах. Следующим этапом работы было исследование экспрессии генов в 17 образцах опухолевых и 10 образцах здоровых тканей мочевого пузыря с помощью микрочипов Illumina humanHT-12v4. Все 93 экспрессионных маркера РМП, обнаруженных в литературе, оказались представлены на этом микрочипе. В результате статус 64% маркеров подтвердился в исследовании с использованием микрочипов, в то время как в 36% случаев наблюдалось расхождение с данными ГМ. В целом, данные ГМ хорошо согласовались с результатами СВГ (в 79% случаев) и результатами анализа GEO (в 78% случаев). Согласно данным ГМ 27 (29%) опубликованных экспрессионных маркеров имеют AUC >0,7. Значения AUC ниже 0,6 наблюдались для 52 маркеров и ниже 0,5 – для 29 маркеров (рис. 2). Таким образом, исследование экспрессии генов с помощью микрочипов выявило 29 маркеров с низкой диагностической ценностью и в два раза больше маркеров (по сравнению с исследованием базы GEO) с высоким диагностическим потенциалом (значение AUC >0,7). Профили экспрессии других генов в раковых и нормальных клетках мочевого пузыря представлены в файле http://bladder.pparser.net/files/SupplementaryFile4.xls. 8 AUC > 0,7 20 18 Число маркеров 16 14 12 10 8 6 4 2 0,83 0,74 0,70 0,65 0,61 0,57 0,50 0,46 0,41 0,37 0,33 0,26 0,22 0,18 0,15 0,11 0,04 0,00 0 AUC Рис. 2. Оценка диагностической ценности заявленных в литературе маркеров на основе анализа экспрессии генов с помощью микрочипов. Диаграмма показывает какое число заявленных маркеров имеют определенную величину AUC по данным микрочипового анализа. 3.3. Обнаружение новых экспрессионных маркеров РМП. В экспериментальных исследованиях по экспрессии генов нами были охарактеризованы транскриптомы опухолевых и нормальных клеток мочевого пузыря человека. В результате анализа полученных данных были обнаружены 13 новых экспрессионных маркеров РМП со значением AUC >0,7. Причем, согласно литературным данным, экспрессия этих генов не была ассоциирована с РМП, в то время как в наших тестах наблюдалась строгая зависимость уровня экспрессии гена-маркера от стадии и типа опухоли. Среди обнаруженных маркеров два гена (BCL2 и RARB) имели сниженную экспрессию в РМП и значения AUC 0,74-0,75. Остальные 11 генов (CCNE1, CDH1, IGFBP3, PYCARD, STAT1, KIFC1, TRIB1, NUSAP1, PRC1, UBE2C и TFDP1) были сверхэкспрессированы в опухолевых тканях мочевого пузыря, а значения AUC варьировали от 0,72 до 0,92. Для шести из этих генов значения AUC были выше 0,85. Немаловажно, что транскрипционные профили для 10 генов (BCL2, CCNE1, CDH1, IGFBP3, STAT1, TRIB1, NUSAP1, PRC1, UBE2C и TFDP1) коррелировали не только между экспериментальными данными и данными GEO, но также и данными СВГ. Экспрессия только одного гена KIFC1 по результатам СВГ была не изменена в РМП. Для того, чтобы подтердить экспрессию шести новых, наиболее ценных потенциальных маркеров РМП, была проведена количественная ПЦР с использованием 15 нормальных и 20 опухолевых образцов тканей мочевого пузыря. В качестве положительных контролей использовали известные маркеры РМП – гены AURKA1 и UHRF1, также подтвердивших свой 9 диагностический потенциал в других тестах. В качестве отрицательных контролей взяли гены ATP6V1C1 и B4GALT6, для которых не наблюдалось дифференциальной экспрессии при РМП как по литературным данным, так и в проведенных в ходе работы экспериментах. Уровень транскрипции каждого исследуемого гена был нормализован на уровень транскрипции гена домашнего хозяйства бета-актин (ACTB1). Количественная ПЦР подтвердила сверхэкспрессию генов KIFC1, TRIB1, NUSAP1, PRC1, UBE2C, TFDP1, AURKA1 в РМП (рис. 3), незначительно повышенный уровень экспрессии гена UHRF1 и отсутствие изменений в транскрипции контрольных генов ATP6V1C1 и B4GALT6. Результаты количественной ПЦР показали, что экспрессия обнаруженных в данном исследовании генов-маркеров (KIFC1, TRIB1, NUSAP1, PRC1, UBE2C, TFDP1) была строго ассоциирована с РМП. На это указывают и значения AUC, варьирующие от 0,72 до 0,88 (рис. 4). Кроме того, эти гены транскрибировались в РМП на значительно более высоком уровне, чем известные гены-маркеры AURKA1 и UHRF1. Общее среднее значение AUC, подсчитанное на основе результатов всех тестов, также доказало высокую диагностическую ценность найденных маркеров (рис. 4). 4. Исследование профилей экспрессии микроРНК в раковых и нормальных клетках мочевого пузыря. 4.1. Исследование экспрессии генов-маркеров, кодирующих микроРНК. Профилирование экспрессии генов, кодирующих микроРНК, продилось с помощью микрочипирования. Из 102 обнаруженных в литературе микроРНК-маркеров РМП, только 75 были представлены на микрочипах платформы Illumina humanHT-12v4. Согласно данным ГМ, в 96% случаев гены-маркеры были интактны. Только три микроРНК показали дифференциальную экспрессию в образцах опухолевых тканей мочевого пузыря. При этом микроРНК MIR21 и MIR205 были сверхэкспрессированы в большинстве случаев РМП, в то время как в литературе имеется противоречивая информация – в одних источниках указывается на их сверхэкспрессию в РМП, в других - на подавление экспрессии. Экспрессия третьей дифференциальной микроРНК MIR185 была подавлена во всех образцах РМП, хотя в литературе указывается на ее сверхэкспрессию. В целом, для генов-маркеров микроРНК наблюдалось намного больше разногласий в ожидаемых и наблюдаемых результатах исследования их экспрессии с помощью ГМ, чем для генов-маркеров, кодирующих белковые продукты. Однако, в данном исследовании оказалось невозможным определить профили экспрессии еще для 27 микроРНК, а значит, и сделать вывод о диагностической ценности этих маркерных молекул. 10 Рис. 3. Нормализованный на бета-актин уровень экспрессии потенциальных маркеров РМП в опухолевых и нормальных тканях мочевого пузыря, измеренный с помощью количественной ПЦР. По оси ординат отложен нормализованный уровень экспрессии гена-маркера. 11 Рис. 4. Оценка чувствительности и специфичности всех обнаруженных в литературе маркеров РМП на основе анализа их экспрессии с помощью методов СВГ, ГМ и исследования базы данных GEO. SE – чувствительность маркера, SP – специфичность маркера. 4.2. Исследование экспрессии коротких некодирующих РНК (кнРНК) с помощью глубокого секвенирования библиотек кнРНК. Для анализа экспрессии кнРНК с помощью глубокого секвенирования нами были созданы библиотеки кнРНК, выделенных из 9 опухолевых тканей и смеси из двух нормальных тканей мочевого пузыря. Полученные библиотеки были секвенированы одним из методов секвенирования нового поколения – TruSeq DNA sequencing с использованием платформы Illumina GAIIx. После картирования полученных последовательностей на геном человека оказалось, что часть последовательностей соотвествует известным генам, кодирующим микроРНК, но при этом более 800 последовательностей не соответствовали никаким известным микроРНК генам и приобрели, таким образом, статус новых кнРНК. Очень важно, что большинство из новых кнРНК (180 из 806) были представлены большим числом прочтений (более 10.000 прочтений, при том, что среднее число прочтений в каждой библиотеке составило ∼5 млн), что свидетельствует об их высокой и специфичной экспрессии в опухолевых или нормальных клетках мочевого пузыря, а также указывает на потенциальную возможность их использования в диагностических и/или 12 прогностических целях. Однако, необходимо отметить, что требуются дополнительные исследования для классификации обнаруженных кнРНК и изучения их роли в канцерогенезе мочевого пузыря. Картирование всех обнаруженных в данном исследовании коротких РНК представлено в Интернет по адресу small.mrna.ru. 5. Оценка диагностической ценности микроРНК маркеров экспериментальными методами. 5.1. Анализ экспрессии генов, кодирующих микроРНК. Для экспериментальной оценки диагностической ценности опубликованных микроРНК маркеров были изучены профили экспрессии генов, кодирующих микроРНК, с помощью методов супрессионной вычитающей гибридизации кДНК и гибридизации на микрочипах. Принцип работы СВГ, а также методы нормализации получаемых данных были описаны ранее. С помощью СВГ были получены профили экспрессии для 43 микроРНК генов-маркеров РМП. Из них только 4 маркера (9%) имели такой же статус экспрессии, как и было заявлено в литературе. Затем для 8 образцов опухолевых и четырех образцов нормальных тканей мочевого пузыря было проведено исследование прфилей экспрессии генов с помощью микрочипов Illumina humanHT-12v4 beadarrays. Только 34 микроРНК маркера РМП были представлены на данном чипе. Согласно полученным данным, большинство микроРНК генов (94%) не показали разницы в экспрессии в опухолевых и нормальных тканях мочевого пузыря. Только 3 гена были дифференциально экспрессированы. Интересно, что для микроРНК MIR21 и MIR205, показавших повышенную экспрессию в большинстве образцов РМП, в литературе имелись противоречивые данные – часть источников указывала на их повышенную экспрессию в РМП и другая часть – на сниженную экспрессию. Третья дифференциально экспрессирующаяся микроРНК, MIR185, имела сниженную экспрессию во всех раковых образцах, в то время как согласно литературным данным эта микроРНК была сверхэкспрессирована в РМП. Значения AUC для MIR21 и MIR205 были соответственно 0.75 и 0.95, если принимать их сверхэкспрессию в РМП в качестве диагностического критерия. Для MIR185 значение AUC было ниже 0.5, если рассматривать его в качестве сверхэкспрессированного маркера. Однако, наши данные указывают на возможность использования сниженной экспрессии данной микроРНК в опухолевых клетках мочевого пузыря для диагностических целей, в этом случае значение AUC для данного маркера приближается к 1. В целом, наблюдалось большое расхождение в ожидаемых и экспериментальных данных гибридизации на микрочипах. Однако, это может быть также связано с отсутствием 68 последовательностей микроРНК генов на микрочипе, имеющих, возможно, более высокую диагностическую ценность. 13 5.2. Высокопроизводительное секвенирование микроРНК. Для обнаружения дифференциально экспрессирующихся известных микроРНК было проведено профилирование экспрессии генов для 9 образцов опухолевых тканей и 2 смешанных образцов нормальных тканей мочевого пузыря. Нормализация числа прочтений каждой микроРНК проводилась путем оценки отношения числа прочтений данной последовательности в исследуемой библиотеке к общему числу прочтений в библиотеке. Таким образом, было обнаружено 179 дифференциально экспрессирующихся микроРНК. Помимо известных микроРНК, мы обнаружили также большое количество неизвестных последовательностей (не соответствующих никаким заявленным в базах данных микроРНК), экспрессия которых значительно отличалась в опухолевом и нормальном уротелии. Однако, только 39 из 95 обнаруженных в литературе потенциальных микроРНК маркеров были представлены в данных секвенирования. Из 39 маркеров только для 27 (69%) был подтвержден статус экспрессии. Кроме того, среди известных микроРНК, обнаруженных с помощью глубокого секвенирования, были найдены 33 последовательности, экспрессирующиеся на высоком уровне и строго специфично в раковых или нормальных тканях. Эти последовательности, ранее не отнесенные к маркерам РМП, имеют высокий диагностический потенциал и, без сомнения, требуют более углубленного изучения для оценки возможности их использования в клинической практике. 5.3. Обнаружение новых маркерных микроРНК в РМП. С помощью микрочипового анализа была обнаружена только одна маркерная микроРНК MIR185, показавшая значительно сниженную экспрессию во всех образцах опухолевых тканей по сравнению с нормальными тканями мочевого пузыря, чувствительность маркера составила ~100%, а значение AUC ~1. Ранее, в литературных данных указывалось, что экспрессия MIR185 повышена при РМП, что совершенно не соответсвовало результатам наших тестов. Результаты глубокого секвенирования оказались более обнадеживающими. Мы обнаружили 33 новых потенциальных микроРНК-маркера РМП, среди которых экспрессиия 21 микроРНК была подавлена и 12 – сверхактивирована. Все потенциальные маркеры имели значение чувствительности больше или равное 0,8, а 18 маркеров имели значение чувствительности равное 1. Эти данные указывают на необходимость прицельного изучения найденных микроРНК для оценки их диагностической, прогностической и терапевтической ценности. 14 6. Исследование профилей метилирования ДНК в раковых и нормальных клетках мочевого пузыря. 6.1. Проверка диагностической ценности маркеров метилирования ДНК в РМП. Маркеры метилирования ДНК были исследованы с использованием микрочипов Illumina Human methylation27. Для исследования были взяты 10 образцов опухолевых тканей и 4 образца нормальных тканей мочевого пузыря. Согласно литературным данным, все 39 обнаруженных маркеров гиперметилированы при РМП. Однако, по данным нашего микрочипового исследования только 24 (63%) из этих маркеров были гиперметилированы. Для 16 (41%) маркеров значение AUC было больше 0.7, для 20 маркеров – меньше 0.6 и для 17 – меньше 0.5 (рис. 5). 1,20 1,00 0,80 AUC 0,60 0,40 0,20 0,00 Ген Рис. 5. Оценка диагностической ценности маркеров метилирования ДНК на основе анализа с использованием микрочипов. Например, данные микрочипового анализа метилирования генных промоторов SOX9, KISS1, SOCS1, RASSF1, CDH4, IGFBP3, MLH1, WIF1 и EDNRB совпали с литературными данными, все гены оказались гиперметилированы в РМП. В то же время, промоторы генов CDKN2B, TP63, DAP2IP и CASP8, оказались в ~100% случаев гипометилированы, хотя по литературным данным они в РМП должны быть гиперметилированны. Среди маркеров метилирования, доля молекул с высокой диагностической ценностью оказалась выше, чем среди экспрессионных маркеров (41% против 29%). 6.2. Обнаружение новых маркеров метилирования ДНК в РМП. В исследовании с использованием микрочипов было проанализировано более 27000 сайтов метилирования в геноме человека, в результате чего было обнаружено 26 новых маркеров 15 метилирования, ассоциированных с развитием РМП и имеющих значение AUC > 0,7. К данным маркерам относятся промоторы генов ARHGDIB, CD82, CD9, CDC91L1, DBC1, EGFR, ERBB2, FGF2, FOS, FOXO1A, HOXA13, HRAS, IGFBP5, KRAS, KRT8, LGALS3, MAPK1, MMP2, PLAUR, PTEN, SFRP1, TRIB1, TRIO, UBE2C, UHRF1 и UPK3A. Среди обнаруженных маркеров были как гиперметилированные последовательности, так и 5 гипометилированных промоторов генов ARHGDIB, FOXO1A, MAPK1, MMP2 и PLAUR. По сравнению с ранее опубликованными маркерами метилирования, найденные 26 маркеров показали более высокий уровень чувствительности и специфичности. 7. Анализ корреляции экспрессии и метилирования генов-маркеров со степенью прогрессии РМП. В работе также был проведен анализ корреляции уровня экспрессии и метилирования наиболее прогностически ценных маркеров (имеющих значение AUC > 0,7) и таких признаков прогресссии опухоли, как размер, степень инвазии, степень дифференцировки и метастатический потенциал опухоли. В результате проведенного анализа лишь для небольшого числа генов были обнаружены статистически важные корреляции. 7.1. Маркеры генной экспрессии. Среди транскрипционных маркеров, имеющих значения AUC>0,7 была обнаружена положительная корреляция метастатического потенциала и экспрессии генов KRT20 (p=0,014), CCNE1 (p=0,017) и PYCARD (p=0,035). Степень дифференцировки опухоли положительно коррелировала с экспрессией гена BCL2L1 (p=0,05). Менее значимая положительная корреляция была также обнаружена для генов CCND1 (p=0,068), PRC1 (p=0,07) и UBE2C (p=0,06). С другой стороны, степень дифференцировки опухоли отрицательно коррелировала с экспрессией генов FGFR3 (p=0,011), Il8 (p=0,021) и PLAUR (p=0,014). Степень инвазии опухоли положительно коррелировала с экспрессией гена H19 (p=0,027) и отрицательно – с экспрессией гена IGFBP3 (p=0,076). Размер опухоли положительно коррелировал с экспрессией генеов CDKN1A (p=0,077), FGFR3 (p=0,07) и PPARG (p=0,061). Интересно, что экспрессия гена FGFR3, кодирующего белок семейства рецепторов факторов роста фибробластов, коррелировала как с размером опухоли (положительная корреляция), так и со степенью дифференцировки (отрицательная корреляция). 7.2 Маркеры метилирования ДНК. Уровень метилирования ДНК положительно коррелировал с метастатическим потенциалом опухоли для генов ERBB2 (p=0,026), IGFBP5 (p=0,026) и FGF2 (p=0,06). Отрицательные корреляции наблюдались для генов CDC91L1 (p=0,044) и KRT8 (p=0,038). 16 Степень дифференцировки опухоли отрицательно коррелировала с метилированием маркеров HRAS (p=0,007) и UHRF1 (p=0,05). Степень инвазии опухоли положительно коррелировала только с метилированием ERBB2 (p=0,029). Размер опухоли, как оказалось, также положительно коррелировал с метилированием маркера ERBB2 (p=0,046) и, менее значимо, с метилированием гена TRIO (p=0,064). Немаловажно, что метилирование ERBB2 положительно коррелировало с высоким метастатическим потенциалом, степенью инвазии и размером опухоли, что указывает на возможность использования данного маркера в прогнозировании течения РМП. 8. Исследование экспрессии ретроэлементов генома SVA и SVAF1 в раковых и нормальных клетках мочевого пузыря. Ретроэлементы – это мобильные генетические элементы, распространяющиеся по геному хозяина путем обратной транскрипции своей РНК. Они составляют около 42% человеческой геномной ДНК и являются единственным классом мобильных элементов, распространяющихся естественным путем у приматов. В настоящем исследовании мы решили проверить имеет ли место повышенная транскрипционная активность SVA и SVAF1 элементов в опухолевых тканях мочевого пузыря по сравнению с нормальными тканями мочевого пузыря, и другими тканями человека (половых желез, сердца, легких и мозга), взятых в качестве контрольных, а также наблюдается ли корреляция транскрипционной активности гена MAST2 и элементов подсемейства SVAF1. Для этого была проведена количественная оценка уровня транскрипции мобильных элементов и гена MAST2 в различных тканях человека с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. С помощью ПЦР-РВ был обнаружен повышенный уровень транскрипционной активности гена MAST2 в нормальных (неопухолевых) яичках, мозге и сердце (рис. 6). По крайней мере 84 представителя подсемейства SVAF1 содержат последовательность на своем 5’-конце, заимствованную от CpG-островка гена MAST2. С помощью ОТ-ПЦР было обнаружено, что транскрипция гена MAST2 в 16 исследованных образцах тканей человека коррелировала с транскрипцией тех элементов подсемейства SVAF1, которые включали участок гена MAST2 (коэффициент корреляции 0,706, р=0,00224, рис. 6). Данные, полученные при анализе базы данных ESТ, также указывают на наличие транскрипционной активности элементов подсемейства SVAF1. С другой стороны, анализ с помощью ОТ-ПЦР не выявил корреляции между общей транскрипционной актиностью всех элементов SVA и транскрипцией гена MAST2 или элементов подсемейства SVAF1, содержащих последовательность гена MAST2, в большинстве исследованных тканей (рис. 6). 17 Коэффициенты корреляции и значения р-value при сравнении уровней транскрипции MAST2-SVA и MAST2-SVAF1 были, соответственно, равны: 0,401; 0,12 и 0,048; 0,86. Таким образом, в исследованных образцах тканей человека наблюдалась корреляция транскрипционной активности гена MAST2 и мобильных элементов подсемейства SVAF1 , в то время как общая траскрипционная активность всех SVA элементов не коррелировала с таковой гена MAST2. Этот факт дает основание полагать, что транскрипция гена MAST2 и мобильных элементов подсемейства SVAF1, содержащих последовательность гена MAST2, контролируется одной и той же регуляторной последовательностью гена MAST2. Следующим этапом работы была проверка статуса метилирования СpG-островков в составе гена MAST2 и мобильных элементов подсемейства SVAF1, содержащих экзон 1 гена MAST2. Для этого были взяты три смешанных образца ДНК, выделенной из: (1) трех образцов тканей яичников человека; (2) четырех образцов яичек человека, экспрессирующих MAST2 на относительно высоком уровне (> 8% от ACTB); (3) четырех образцов яичек человека, экспрессирующих MAST2 на относительно низком уровне (< 0,5% от ACTB). В результате было обнаружено, что CpGостровки, локализованные в гене MAST2 были практически полностью деметилированы во всех исследованных образцах. В то же время, CpG-островок, входящий в состав последовательности экзона 1 гена MAST2 в элементах SVAF1, был сильно метилирован в тех образцах, где наблюдался низкий уровень экспрессии MAST2 (яичники, образец яичек #1) и значительно меньше метилирован в образце тканей яичек #2, в котором транскрипция гена MAST2 была высокой. Эти результаты указывают на вероятную важную функциональную роль в транскрипционной активности CpG-островков гена MAST2, включенных в состав элементов подсемейства SVAF1. Гипометилирование CpG-островков гена MAST2 в тканях, которые сами не экспрессируют MAST2, скорее всего представляет собой типичную ситуацию для большинства CpG-островков человека, которые в нормальном состоянии не метилированы, независимо от транскрипционного статуса соседних генов. Возникновение участка гена MAST2 в элементе SVA могло быть выгодным для распространения SVAF1, поскольку это гарантировало экспрессию SVAF1 и его последующую ретротраспозицию в герминальных клетках, что облегчило фиксацию новых вставок SVA в геноме человека. В результате проведенного анализа было выявлено значительное увеличение уровня транскрипции SVAF1 ретротранспозонов в одном из образцов тканей опухолей мочевого пузыря по сравнению с нормальными тканями мочевого пузыря и тканями яичников и легких. Причем уровень транскрипции гена MAST2 коррелировал с уровнем транскрипции SVAF1, в отличие от транскрипции всех элементов SVA в опухолевых и нормальных образцах тканей мочевого пузыря (рис. 6). Возможно, транскрипционная активность SVAF1 в раковых тканях мочевого пузыря обусловлена аберрантным деметилированием CpG-SVA, происходящим во время канцерогенеза мочевого пузыря. В свою очередь повышенная активность этих ретротранспозонов усиливает 18 Рис. 6. Транскрипция MAST2, SVA (А) и SVAF1 (Б) элементов в различных тканях человека. Уровень транскрипции ретроэлементов измерялся в %% относительно количества РНК гена ACTB с помощью ОТПЦР в реальном времени. Для исследования были взяты ткани человека: Т1-Т4 – яички, С1, С2 – миокард, М1, М2 – мозг, Л1, Л2 – легкие, Я1, Я2 – яичники, П1, П2 – мочевой пузырь (норма), Р1, Р2 – мочевой пузырь (рак). 19 мутагенез в малигнизирующихся клетках, ослабляя тем самым защитные способности клеткок. Для изучения роли SVAF1 в канцерогенезе мочевого пузыря и связи активности ретротранспозонов со степенью злокачественности и метастатического потенциала опухоли требуется проведение дополнительного исследования не в рамках данной работы. 9. Выявление основных путей канцерогенеза мочевого пузыря. На основе данных, полученных в результате широкомасштабного скрининга молекулярных изменений, происходящих при РМП, в сотрудничестве с лабораторией Николая Михайловича Борисова из ФМБА ФГУ Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна были составлены пути генной активации и выявлены основные мишени для терапии для каждого из рассмотренных пациентов. Разработанный группой Н. М. Борисова алгоритм сравнения активированных и подавленных генов предположительно позволяет, таким образом, подбирать наиболее оптимальную терапию для лечения РМП. Из литературных данных известно, что процесс опухолеобразования в мочевом пузыре в большинстве случаев происходит двумя путями. Первый путь связан с возникновением активирующих мутаций в генах FGFR3 или RAS, что приводит к гиперплазии уротелия и, в конечном итоге, к образованию папиллярных опухолей (неинвазирующих в мышечный слой и имеющих благоприятный прогноз лечения). Другой путь связан с мутациями гена р53 и изменениями в его сигнальном пути, приводящих к более агрессивному поведению опухоли – сначала развивается дисплазия эпителия, а затем карцинома in situ (CIS) и инвазивная опухоль с высоким метастатическим потенциалом Несмотря на описанную в литературе модель, в наших экспериментах подтвердились данные только для участия пути р53 в развитии опухолей мочевого пузыря. Интересно, что данный путь был подавлен у 100% исследованных пациентов. Среди сигнальных путей, наиболее часто инактивированных в РМП, оказались Fas-сигнальный путь (94% случаев), GSK3 путь (88%) и другие пути, вовлеченные в пролиферацию и апоптоз клетки. Однако, наиболее часто активированными путями были Notch (в 94% случаев), RNA polymerase II Complex (88%) и IL6 (82%), AHR (82%), TRAF (82%) и другие. Активация этих путей необходима для транскрипции мРНК, ангиогенеза, метаболизма ксенобиотиков (лекарственных препаратов) опухолевой клеткой, пролиферации и т. д. Изучение сигнальных путей, активированных или подавленных при канцерогенезе, важно не только для понимания механизмов возникновения и развития опухолей, но также и для подбора наиболее эффективной терапии. Каждый случай заболевания злокачественным новообразованием по своей сути является уникальным, поскольку каждая опухоль развивается из отдельных клеток, отличающихся у каждого пациента. Индивидуализированный подход к 20 диагностике и лечению опухолей, основанный на полнотранскриптомном и геномном исследовании раковых клеток, по-видимому, является наиболее перспективным направлением медицины будущего. Вместе с разработкой новых методов крупномасштабного анализа молекулярных изменений в клетках и снижением стоимости такого анализа лечение и диагностика рака будут более точными и эффективными. ВЫВОДЫ 1. На основе литературного поиска, биоинформатического анализа и экспериментального исследования транскриптомов опухолевых и нормальных клеток мочевого пузыря человека создана интегрированная база данных маркеров РМП, содержащая оценку их диагностической ценности для российской популяции. 2. Выявлено, что только 18% опубликованных маркеров РМП имеют высокий диагностический потенциал. 3. Обнаружено 26 новых маркеров метилирования ДНК, 13 экспрессионных маркеров и 1 маркерная микроРНК, не заявленных в литературе в качестве потенциальных маркеров РМП, но показавших высокую диагностическую ценность в данном исследовании. 4. Методом СВГ впервые были обнаружены некодирующие транскрипты, дифференциально экспрессирующиеся в опухолевых или нормальных клетках мочевого пузыря; последовательности найденных транскриптов картировались в геноме человека на интронные или другие некодирующие области и полностью не соответствовали никаким известным РНК человека. Найденные транскрипты могут являться потенциальными маркерами РМП и играть важную роль в канцерогенезе мочевого пузыря. 5. Впервые с помощью метода глубокого секвенирования библиотек коротких РНК были обнаружены дифференциально экспрессирующиеся в раковых и нормальных клетках мочевого пузыря кнРНК, не соответсвующие никаким известным кнРНК человека. 6. Методом глубокого секвенирования библиотек коротких РНК обнаружен ряд микроРНК, специфично экспрессируемых в опухолевых клетках мочевого пузыря. Найденные микроРНК могут играть ключевую роль в онкогенезе мочевого пузыря, а также в клеточном иммунном ответе против распространения вирусов или мобильных элементов генома. 21 7. Анализ транскрипции мобильных элементов генома SVA и SVAF1 в различных тканях человека выявил котранскрипцию гена MAST2 и элементов подсемейства SVAF1, и отсутствие котранскрипции гена MAST2 и всех ретротранспозонов семейства SVA. 8. Приобретение CpG-островка гена MAST2 мобильными элементами подсемейства SVAF1 могло сыграть положительную роль в успехе этого подсемейства. Последовательность MAST2 на 5’конце SVAF1 элементов выполняет роль положительного регулятора транскрипции в человеческих герминальных клетках. 9. Статус метилирования участка гена MAST2 на 5’-конце SVAF1 элементов обратно коррелировал с транскрипционной активностью MAST2. Аберрантное деметилирование CpG-островков, происходящее при канцерогенезе, возможно, увеличивает транскрипционную активность мобильных элементов SVAF1, в том числе при РМП. 10. С помощью комплексного анализа транскриптомов опухолевых и нормальных клеток мочевого пузыря выявлены основные пути канцерогенеза через подавление сигнализации p53, Fas, GSK3 и апоптотического пути, и активацию убиквитин-протеасомного пути, а также путей Notch, TGF-β, BRCA1, EGFR, AHR и TRAF. 22 ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ Публикации в научных журналах 1. Zabolotneva A, Tkachev V, Filatov F, Buzdin A. (2010) How many antiviral small interfering RNAs may be encoded by the mammalian genomes? Biology Direct, 5:62. 2. Заболотнева А.А., Гайфуллин Н.М., Буздин А.А., Алексеев Б.Я., Андреева Ю.Ю., Шегай П.В., Соков Д.Г., Русаков И.Г. (2011) Молекулярные маркеры рака мочевого пузыря: от частного к целому, Онкоурология, 3, 12-15. 3. Baskaev K., Garazha A., Gaifullin N., Suntsova M.V., Zabolotneva A.A., Buzdin A.A. (2012) nMETR: technique for facile recovery of hypomethylation genomic tags. Gene, 498(1):75-80. 4. Zabolotneva A., Bantysh O., Suntsova M., Efimova N., Malakhova G., Schumann G., Gayfullin N., Buzdin A. (2012) Transcriptional regulation of human-specific SVAF1 retrotransposons by cis-regulatory MAST2 sequences. Gene, 505 (1): 128-36. 5. Alexandrova E.A., Olovnikov I.A., Malakhova G.V., Zabolotneva A.A., Suntsova M.V., Dmitriev S.E., Buzdin A.A. (2012) Sense transcripts originated from an internal part of the human retrotransposon LINE-1 5' UTR. Gene, 511(1):46-53. 6. Zabolotneva A.A., Zhavoronkov A., Garazha A.V., Roumiantsev S.A. and Buzdin A.A. (2013) Characteristic patterns of microRNA expression in human bladder cancer. Front. Genet. 3:310. Патенты на изобретения 1. Заболотнева А.А., Шегай П.В., Гайфуллин Н.М., Русаков И.Г., Алексеев Б.Я., Буздин А.А. Патент на изобретение №2469323 (RU) «Способ диагностики рака мочевого пузыря (варианты) и набор для его осуществления», опубликовано 10.12.2012. 2. Заболотнева А.А., Шегай П.В., Гайфуллин Н.М., Русаков И.Г., Алексеев Б.Я., Буздин А.А. Патент на изобретение №2469098 (RU) «Способ оценки эффективности терапии рака мочевого пузыря человека методом ПЦР в режиме реального времени и набор для его осуществления», опубликовано 10.12.2012. 3. Заболотнева А.А., Шегай П.В., Гайфуллин Н.М., Русаков И.Г., Алексеев Б.Я., Буздин А.А. Патент на изобретение №2468372 (RU) «Способ оценки эффективности терапии рака мочевого пузыря с помощью онкомаркера NUSAP1», опубликовано 27.11.2012. 4. Заболотнева А.А., Шегай П.В., Гайфуллин Н.М., Русаков И.Г., Алексеев Б.Я., Буздин А.А. Патент на изобретение №2463354 (RU) «Способ диагностики рака мочевого пузыря с помощью онкомаркера TFDP1 (варианты) и набор для его осуществления», опубликовано 10.10.2012. 23 5. Заболотнева А.А., Шегай П.В., Гайфуллин Н.М., Русаков И.Г., Алексеев Б.Я., Буздин А.А. Патент на изобретение №2468088 (RU) «Способ оценки эффективности терапии рака мочевого пузыря человека методом иммуноферментного анализа», опубликовано 16.03.2011. Материалы российских и международных конференций 1. А.А. Заболотнева, Н.М. Гайфуллин, Д.Г. Соков, П.В. Шегай, И.Г. Русаков, А.А. Буздин, Разработка новой диагностической панели молекулярных маркеров рака мочевого пузыря, Четвертая Международная школа молодых ученых по молекулярной генетике на тему «Геномика и биология клетки», Звенигород, 2010. 2. Заболотнева А.А., Гайфуллин Н.М., Соков Д.Г., Шегай П.В., Русаков И.Г., Буздин А.А., Разработка диагностической панели молекулярно-генетических маркеров для рака мочевого пузыря, XXIII Международная зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 7-10 февраля 2011г. 3. Заболотнева А.А., Гайфуллин Н.М., Соков Д.Г., Шегай П.В., Русаков И.Г., Буздин А.А., Разработка диагностической панели молекулярно-генетических маркеров для рака мочевого пузыря , Школа-конференция молодых ученых "Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины - 2011", Москва, 29-30 сентября 2011г. 4. Заболотнева А.А., Гайфуллин Н.М., Шегай П.В., Буздин А.А., Разработка диагностической панели молекулярно-генетических маркеров для рака мочевого пузыря, "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова", Москва-Пущино, 14-17 ноября 2011 г. 24
