Масс - спектрометрия - Молекулярная диагностика
advertisement
Масс-спектрометрия – новое слово в клинической диагностике. Ильина Елена Николаевна Д.б.н., доцент Зав лабораторией молекулярной генетики микроорганизмов НИИ ФХМ ФМБА России План выступления Времяпролетная МАЛДИ массспектрометрия – новая технология в клинической диагностике Что можно сделать сегодня, используя единую технологическую платформу? – Генетика, протеомика и метаболомика - три кита современной диагностики. – Молекулярная микробиология - быстрая идентификация и характеристика патогенов Некоторые определения… Масс-спектрометрия – аналитический метод измерения массы молекул или атомов анализируемого вещества (молекулярные весы) Масс-спектрометр – это инструмент, способный в условиях вакуума разделять находящиеся в газовой фазе заряженные частицы вещества согласно отношению их массы к заряду (m/z ratio). Принцип масс-спектрометрического анализа: Источник ионов МАЛДИ (MALDI) Электроспрей (ESI) Система разделения ионов (массанализатор) • Времяпролетные (TOF) • Квадрупольные (Q) • Ионные ловушки (IT) • Ионно-циклотронного резонанса (ICR-FT) Детекция ионов •Микроканальн ые пластины (MCP) •Диноды •Магнит (ICRFT) Методы мягкой ионизации МАЛДИ – МатричноАссоциированная Лазерная Десорбция/Ионизация + 337 nm УФ лазер растворенный образец (без солей!) _ МАТРИЦА+образец MALDI Конусовидная игла ESI Подходы, базирующиеся на времяпролетной МАЛДИ масс-спектрометрии (MALDI TOF MS) Анализ белковых молекул α-циано-4-гидроксикоричная кислота (СНСА) 2,5-дигидроксибензойная кислота (DHB) Анализ нуклеиновых кислот (ДНК, РНК) 3-гидроксипиколиновая кислота (3-HPA) Подходы, базирующиеся на времяпролетной МАЛДИ масс-спектрометрии (MALDI TOF MS) Анализ белковых молекул Прямое белковое профилирования – видовая идентификации микроорганизмов – бактерий, грибов Протеомное профилирование сыворотки крови (биомаркеры) Анализ нуклеиновых кислот (ДНК, РНК) Обнаружение нуклеотидных мутаций (полиморфизмов) в геноме человека, бактерий, вирусов – Предрасположенность к мультифакториальным заболеваниям человека – типирование микроорганизмов – выявление маркеров лекарственной устойчивости Клиническая диагностика неинфекционных заболеваний человека - генетические факторы предрасположенности развития неинфекционных (системных) заболеваний человека SNP ID Соматические мутации 1:1000 Протеомное профилирование и поиск биомаркеров SNP Генетические исследования Объем информации SNP/STR GWAS Полный геном PCR/SEQ MALDI illumina SOLiD/454 Минисеквенирование сопряженное с времяпролетной МАЛДИ масс-спектрометрией forward (MALDI TOF MS) primer+ ddA DNA reverse PCR amplicons + dNTP primer+dG+ddC primer SAP amplicons dNTP primer extention primer + ddA; ddC dG CT GAXGCT (TC) MALDI-ToF Текущие исследования в области молекулярной генетики человека Определение генетических факторов предрасположенности к развитию цирроза печени различной этиологии (алкоголь, HCV, HBV) Генетические и эпигенетические маркеры онкопатологии толстого кишечника Определение генетических и микробиотических факторов, предрасполагающих к развитию ожирения Разработка и внедрение фармакогенетических тестов для оценки эффективности антикоагуляционной терапии SNP идентификация личности Система генотипирования из 52 единичных нуклеотидных полиморфизмов • Во всех соматических хромосомах • Не сцепленны друг с другом • Частоты аллелей в большинстве популяций от 0.3 до 0.7 Кровь Слюна Букальный соскоб Сперма База данных частот SNP ДНК ПЦР Минисеквенирование в формате мультиплекс Детекцкия на MALDI-ToF Выдача результата: •Индекс отцовства •Совпадение личности по криминалистической базе данных •Получение индивидуального идентификатора личности Обнаружение маркеров для ранней диагностики онкологических заболеваний человека •Генотипирование НАСЛЕДУЕМЫХ нуклеотидных полиморфизмов (SNP), предрасполагающих риск развития онкологии •Генотипирование СОМАТИЧЕСКИХ мутаций, являющихся причиной развития онкологии •Белковое профилирование сывороточных и тканевых биомаркеров ДНК MALDI-ToF MALDI-ToF минисеквенирование Белков ый маркер Белковое профилирование Визуализация масс-спектров сывороток крови групп «рак яичников» и «контроль» в виде псевдогеля РАК Контроль Протеомный и пептидный анализ Сыворотка пациента белки Список масс специфичн ых для заболевани я Магнитные микрочастицы с функционализированной поверхностью Магнитная сепарация Элюция и нанесение на чип MB-HIC 8, 18 MB-WCX MB-IMAC-Cu, Построени е моделей на основе алгоритмо в MALDI-ToF MS ClinProt Tools soft GA – генетический алгоритм SNN – нейронная сеть QC-Kruskal – быстрая классификация методом KruskalWallis QC-Ttest – быстрая классификация T-тестом Регистрация MS спектров Метаболом Низкомолекулярные маркеры онкологических заболеваний Лизофосфатидовая кислота (lysophosphatidic acid, LPA) - Рак яичников, молочной железы, матки Липид-ассоциированная сиаловая кислота (Lipidassociated sialic acid, LASA) - Рак яичников, молочной железы, матки Саркозин – Рак предстательной железы Триптофан – Рак толстой кишки Транс-транс-муконовая кислота (tt-MA) - Лейкемия S-фенилмеркаптуровая кислота (S-PMA) – Рак легких 1-Гидроксипирен (1-HOP) – Рак легких у курильщиков Клиническая диагностика инфекционных заболеваний человека Прямое масс-спектрометрическое профилирование микроорганизмов – быстрая видовая идентификация SNP - генетические факторы формирования лекарственной устойчивости, патогенности и вирулентности 20th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Vienna, Austria,10–13 April, 2010 Пленарные лекции: –I believe in sequencing… Я верю в секвенирование MLST Genome projects –I believe in mass spectrometry… Я верю в масс-спектрометрию Direct mass spectrometry profiling of bacterial cells Я верю в масс-спектрометрию… ИССЛЕДОВАНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ФЛОРЫ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМ ПРОФИЛИРОВАНИЕМ ПОЛИПЕПТИДОВ Gram-positive bacteria S. pneumonia S. aureus Gram-negative bacteria Neisseria spp H. pilory ОБНАРУЖЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИДЕТЕРМИНИРОВАННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ Gram-positive bacteria S. pneumonia Gram-negative bacteria M. tuberculosis N. gonorrhoeae Прямое белковое профилирование Прямое белковое профилирование Экстракция белков и пептидов в кислых условиях a.i. 1200 1000 800 600 400 200 4000 6000 8000 10000 12000 14000 m/z Идентификация/классификация микроорганизмов путем сопоставления их масс-спектров Времяпролетная МАЛДИ масс-спектрометрия с применением гидроксикоричной кислоты в качестве матрицы Накопление масс-спектров Intens . [a .u.] Выращивание бактерий 1400 x105 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 m/z Прямое белковое профилирование: узнавание по принципу фингерпринта a.i. 1400 1200 1000 800 600 400 200 4000 6000 8000 10000 12000 14000 Узнаем бактерию по отпечаткам пальцев….. m/z Intens. [a.u.] Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus 3000 2000 Intens. [a.u.] 1000 0 Bacillus subtilis Bacillus subtilis 8000 6000 4000 2000 0 Candida albicans ATCC 10231 Candida albicans 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Escherichia coli DH5alpha Escherichia coli 2500 2000 1500 1000 500 0 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 m/z Тестирование коллекции стафилококков Проанализировано 301 клинический изолят стафилококков Изоляты были собраны от пациентов с различными инфекциями (Fig. 1) в 31 регионах России (Fig. 2) 20th ECCMID, 2010. Ilina EN, Borovskaya AD, et al. O541 Bacteriaemia 14.3% The central nervous system 1.3% Intra-abdominal 7% Urinary tract 12.6% Bone and joint 7% Skin and soft tissue 27.6% The eye and adneha 16.9% Respiratory tract 13.3% Fig 1. Распределение изолятов по типам инфекции Fig 2. Распределение изолятов по точкам сбора Тестирование коллекции стафилококков Идентификация S. aureus на основании коагулазного теста и ферментации маннитола Коагулазонегативные стафилококки были идентифицированы на основании чувствительности к новобиоцину и ручной (API20E panels, bioMérieux, France) или полуавтоматической (ATB Expression, bioMérieux) систем биохимического тестирования Протестированы две системы автоматической идентификации BD Phoenix analyser и MALDI Biotyper Секвенирование генов 16S rRNA было проведено для всех несовпадающих результатов. Routine ID 200 41 S. aureus S. epidermidis BD Phoenix ID 198 S. aureus 1 1 22 3 1 1 1 6 1 2 1 1 S. haemolyticus S. epidermidis S. epidermidis S. hominis S. saprophyticus S. warneri S. aureus Staphylococcus spp. S. haemolyticus S. saprophyticus S. hominis S. capitis 2 no identification MALDI Biotyper ID 197 S. aureus 1 S. epidermidis 1 S. haemolyticus 1 S. warneri 34 S. epidermidis 1 2 1 1 1 1 S. haemolyticus S. saprophyticus S. hominis S. capitis no identification S. epidermidis 5 Routine ID S. haemolyticus 4 S. saprophyticus 1 S. warneri 50 Staphylococcus spp. 5 3 1 1 7 1 3 2 1 16 BD Phoenix ID S. haemolyticus S. saprophyticus Staphylococcus spp. S. warneri S. haemolyticus S. simulans S. lugdunensis S. aureus S. epidermidis S. epidermidis 4 S. hominis 9 S. saprophyticus 4 S. warneri 1 S. pasteuri 2 S. kloosi MALDI Biotyper ID 5 S. haemolyticus 4 S. saprophyticus 1 7 1 3 S. warneri S. haemolyticus S. simulans S. lugdunensis 3 S. aureus 17 S. epidermidis 3 1 S. hominis S. hominis 10 S. saprophyticus 2 1 1 1 S. warneri S. warneri S. warneri not staphylococci Во всех «спорных» случаях были проанализированы последовательности генов 16S pPHK, что подтвердило правильность видовой идентификации по технологии MALDI Biotyper Генетически-детерминированная лекарственная устойчивость WILD TYPE ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ DRUG РЕЗИСТЕНТНОСТИ - УСТОЙЧИВЫЕ НАРУШЕНИЯ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ В ОПРЕДЕЛЕННЫХ УЧАСТКАХ БАКТЕРИАЛЬНОГО ГЕНОМА, СВЯЗАННЫЕ С ФОРМИРОВАНИЕМ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ТОМУ ИЛИ ИНОМУ ПРОТИВОМИКРОБНОМУ ПРЕПАРАТУ DRUG MUTANT Изониазид Мутации в генах katG, inhA, ahpC, oxyR, furA Рифампицин Мутации в гене rpoB Пиразинамид Мутации в гене pncA Этамбутол Мутации в гене embB Стрептомицин Мутации в гене rpsL, rrs Фторхинолоны Мутации в генах gyrA, gyrB Канамицин/ амикацин Мутации в гене rrs (16S pРНК) Минисеквенирование с последующей МАЛДИ масс-спектрометрией Амплификация геномного фрагмента Обнаружение нуклеотидных замен в реакции Реакция минисеквенирования миниcеквенирования 531 Ser Mt531-for WILD TYPE Ser531Leu Ser531Trp Ser531Gly Ser531Val Leu533Pro CGC ... ... ... ... ... CGA ... ... ... ... ... CTG ... ... ... ... ... Mt531-for 6675 Da tcg’ 6690 Da mut(TTG) GCG ... ... ... ... ... CTG ... ... ... ... .C. GGG CCC GGC GGT ...Mt533-rev ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... В смеси: dTTP, dATP, dCTP, ddGTP 5768 Da wt(TCG) TCG .T. .G. GG. GT. ... 533 Leu ttg’ CTG ... ... ... ... ... 4814 Da Mt533-rev wt (CTG) g’a 5440 Da mut(CCG) g’ 5127 Da Минисеквенирование с последующей МАЛДИ масс-спектрометрией wt533 5127 5440 Mt531-for Intensity, a.u. 5768 Mt533-rev Времяпролетная МАЛДИ масс-спектрометрия с применением wt531 3-гидроксипиколиновой кислоты 4814 6675 4500 5000 5500 6000 6500 7000 m/z Заключение: отсутствие мутаций в кодоне 531 гена rpoB и наличие мутации CTG-CCG (Leu-Pro) в кодоне 533 Типирование возбудителя туберкулеза Антибиотик Рифампицин RIF Изониазид, INH Этамбутол EMB Маркеры резистентности RpoB: His526→Asp, Tyr, Asn, Pro, Leu, Arg, Phe, Cys, Ser, Ile, Thr, Val, Gly, Ala Leu533→Pro; Ser531→Leu, Trp, Ala Leu511→ Pro, Arg; Phe514a Gln513→Leu, Pro, Agr, Lys, Ile, Thr Asp516→ Glu, Val, Gly, Arg, Trp, Leu, Met Ser522→ Leu, Trp KatG: Ser315→Thr, Arg, Asn, Ile, Pro, His, Leu, Lys inhA: C-15→T; T-8→A EmbB: Met306 →Val, Leu, Thr, Ile Gly406 →Ser, Cys, Asp, Ala •Отмечено преобладание изолятов, несущих маркеры устойчивости к рифампицину и изониазиду •Установлена диагностическая чувствительность метода обнаружения устойчивости к рифампицину (90 %), изониазиду (94 %) и этамбутолу (54,0 %) Afanas’ev MV, et al. 2007, JAC Сопоставление результатов генетического (ГЕН) и бактериологического (БАКТ) определения чувствительности M. tuberculosis к рифампицину (RIF), изониазиду (INH) и этамбутолу (EMB) Спасибо за внимание Вопросы?...
