Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского
Дальневосточного отделения Российской академии наук
На правах рукописи
Гирич Александр Сергеевич
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ WNT ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ У
ГОЛОТУРИИ EUPENTACTA FRAUDATRIX
03.03.05 – биология развития, эмбриология
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научный руководитель:
доктор биологических наук
И.Ю. Долматов
Владивосток – 2014
2
ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................. 4
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................... 10
1.1. РЕГЕНЕРАЦИЯ .................................................................................................... 10
1.2. РЕГЕНЕРАЦИЯ У ИГЛОКОЖИХ ............................................................................ 11
1.3. РЕГЕНЕРАЦИЯ У EUPENTACTA FRAUDATRIX ........................................................ 16
1.4. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГЕНЕРАЦИИ ................................................... 21
1.5. ГЕНЫ СЕМЕЙСТВА WNT ..................................................................................... 23
1.6. СТРУКТУРА БЕЛКОВ WNT .................................................................................. 25
1.7. ТИПЫ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ WNT ....................................................................... 26
1.8. ФУНКЦИИ WNT .................................................................................................. 31
1.9. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГЕНЕРАЦИИ У ИГЛОКОЖИХ........................... 33
1.10. РОЛЬ WNT В РЕГЕНЕРАЦИИ У ИГЛОКОЖИХ ..................................................... 35
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ............................................................................. 39
2.1. СБОР МАТЕРИАЛА .............................................................................................. 39
2.2. ИММУНОЦИТОХИМИЯ ....................................................................................... 39
2.3. АНАЛИЗ ТРАНСКРИПТОМОВ............................................................................... 40
2.4. БЫСТРАЯ АМПЛИФИКАЦИЯ КОНЦОВ КДНК ...................................................... 41
2.5. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК ......................................................................................... 43
2.6. ЛИГИРОВАНИЕ И ТРАНСФОРМИРОВАНИЕ .......................................................... 43
2.7. СЕКВЕНАЛЬНАЯ РЕАКЦИЯ.................................................................................. 44
2.8. ФИЛОГЕНИЯ ....................................................................................................... 45
2.9. ЛОКАЛИЗАЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ............................................................................. 45
2.10. ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ............................................................................ 46
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ..................................................................................................... 48
3.1. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА WNT5 В ТКАНЯХ E. FRAUDATRIX В НОРМЕ .................. 48
3.2. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА WNT5 В ТКАНЯХ E. FRAUDATRIX В ПРОЦЕССЕ
РЕГЕНЕРАЦИИ ПОСЛЕ ЭВИСЦЕРАЦИИ. ...................................................................... 50
3.3. БИОИНФОРМАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ТРАНСКРИПТОВ ГЕНОВ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ
WNT, ИМЕЮЩИХСЯ В ТРАНСКРИПТОМАХ РЕГЕНЕРИРУЮЩИХ ОРГАНОВ E.
FRAUDATRIX ............................................................................................................... 57
3.4. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА WNTA В НОРМЕ РЕГЕНЕРАЦИИ E. FRAUDATRIX..................... 61
3.5. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА WNT4 В НОРМЕ И РЕГЕНЕРАЦИИ E. FRAUDATRIX .................. 66
3.6. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА WNT6 В НОРМЕ И РЕГЕНЕРАЦИИ E. FRAUDATRIX .................. 71
3.7. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА WNT16 В НОРМЕ И РЕГЕНЕРАЦИИ E. FRAUDATRIX ................ 76
4. ОБСУЖДЕНИЕ ................................................................................................... 81
3
4.1. ГЕНЫ СЕМЕЙСТВА WNT ..................................................................................... 81
4.2. РОЛЬ ГЕНА WNT4 ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ E. FRAUDATRIX .......................................... 85
4.3. РОЛЬ ГЕНА WNT6 ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ E. FRAUDATRIX .......................................... 87
4.4. РОЛЬ ГЕНА WNTA ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ E. FRAUDATRIX ......................................... 88
4.5. РОЛЬ ГЕНА WNT16 ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ E. FRAUDATRIX ........................................ 89
4.6. РОЛЬ WNT5 ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ У E. FRAUDATRIX .............................................. 90
4.7. РОЛЬ ДРУГИХ ГЕНОВ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ WNT ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ У E.
FRAUDATRIX ............................................................................................................... 91
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ....................................................................................................... 94
ВЫВОДЫ .................................................................................................................. 99
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................... 101
4
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность
морфогенетических
темы.
механизмов
Одним
из
являются
важнейших
сигнальные
компонентов
молекулы.
Они
взаимодействуют со специфическими рецепторами и запускают каскад
внутриклеточных реакций, активирующих целевые гены. Примером таких
сигнальных молекул могут служить белки семейства Wnt. Запускаемый ими
каскад реакций, сигнальный путь Wnt, участвует в регуляции многих
биологических
процессов,
в
частности,
формировании
осей
тела
в
эмбриогенезе, развитии ряда органов, регенерации и канцерогенезе (Logan,
Nusse, 2004; Reya, Clevers, 2005; Poustka et al., 2007; Mashanov et al., 2012b).
Гены wnt выявлены у всех многоклеточных животных, от губок до насекомых и
млекопитающих. Число их у разных видов различно и может варьировать от 1-3
(губки) до 19 (млекопитающие) (Schubert et al., 2000; Adamska et al., 2007).
Кроме белков Wnt, выполняющих роль лигандов, в состав сигнального пути
Wnt входят рецепторы Frizzled и LRP5/6, а также внутриклеточные
мессенджеры Dishevelled и β-catenin (Komiya, Habas, 2008). Большое число wnt
и их участие в широком спектре биологических процессов указывает на
важность сигнального пути Wnt в жизнедеятельности многоклеточных
животных.
Одной из важнейших функций сигнального пути Wnt является регуляция
восстановительных
процессов.
Регенерация
является
универсальной
адаптацией к повреждающему действию окружающей среды и свойственна в
той или иной степени всем живым организмам (Лиознер, 1982; Карлсон, 1986).
Показано, что у планарий экспрессия wnt1 и wnt2 имеет градиентный характер
(Petersen, Reddien, 2009). При нарушении этого градиента в результате
повреждения
запускается
сложный
каскад
реакций,
направленный
на
восстановление утраченной части животного. У млекопитающих гены wnt
регулирует процесс восстановления кончиков фаланг пальцев (Takeo et al.,
2013). При ингибировании сигнального пути Wnt восстановление не
5
происходит. Кроме того, участие wnt в регенерации отмечено у широкого круга
животных – губок, книдарий, кольчатых червей, асцидий и амфибий (Lengfeld
et al., 2009; Petersen, Reddien, 2009; Philip et al., 2009; Lin et al., 2012; Takeo et al.,
2013).
Удобными модельными объектами для изучения различных аспектов
регенерации являются голотурии. Они способны в ответ на внешние
раздражители эвисцерировать (выбрасывать) внутренние органы и затем
полностью их восстанавливать (Emson, Wilkie, 1980; Долматов, Машанов,
2007). Некоторые виды голотурий способны регенерировать утраченную часть
тела после поперечного разрезания (Torelle, 1910; Долматов и др., 2012). При
этом они полностью восстанавливают органы пищеварительной, нервной и
дыхательной систем. У некоторых видов голотурий имеется бесполое
размножение в виде поперечного деления (Долматов и др., 2012; Каменев,
2013).
Недавно было показано, что у голотурий при регенерации активируются
гены wnt. В частности, у Holothuria glaberrima при восстановлении кишки
после эвисцерации экспрессируется wnt9 (Mashanov et al., 2012b). При анализе
транскриптомов зачатков структур амбулакра у этой голотурии были выявлены
транскрипты генов wnt2, wnt6 и wnt9 (Mashanov et al., 2014). В исследованиях
Сун и др. (Sun et al., 2013a) было показано изменение экспрессии wnt6 у
дальневосточного
трепанга
Apostichopus
japonicus
при
регенерации
пищеварительной системы.
В настоящее время достаточно подробно исследованы морфологические
и биохимические аспекты регенерации у голотурии Eupentacta fraudatrix
(Dolmatov, 1992; Долматов, Гинанова, 2001; Mashanov et al., 2005, 2008; Lamash,
Dolmatov, 2013). С помощью методов масс-спектрометрии было показано, что в
регенерирующих органах у данного вида присутствует белок Wnt5 (Гирич и
др., 2011). Кроме того, анализ транскриптомов зачатков регенерирующих
органов на начальных стадиях восстановления показал наличие в них
6
фрагментов транскриптов генов семейств wnt и frizzled, а также генов
dishevelled и β-catenin. Полученные данные указывают на участие сигнального
пути Wnt в регуляции регенерации у E. fraudatrix (Долматов, 2013).
В этой связи целью работы была идентификация ряда генов сигнального
пути Wnt (wnt, frizzled, dishevelled и β-catenin) и изучение их экспрессии в
норме и при регенерации после эвисцерации у голотурии E. fraudatrix.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить
следующие конкретные задачи:
1) Изучить локализацию клеток, содержащих белок Wnt5, и динамику
изменения их числа в норме и при регенерации после эвисцерации у голотурии
E. fraudatrix.
2) Провести анализ нуклеотидных последовательностей транскриптов
генов сигнального пути Wnt, обнаруженных в транскриптомах зачатков
внутренних органов голотурии E. fraudatrix.
3) Установить нуклеотидные последовательности кодирующей части
генов семейства Wnt, экспрессирующихся при регенерации после эвисцерации
у голотурии E. fraudatrix.
4) Определить органы и ткани, в которых происходит активация генов
сигнального пути Wnt при регенерации после эвисцерации у E. fraudatrix.
5) Оценить активность экспрессии генов семейства Wnt в норме, а также
при регенерации после эвисцерации у голотурии E. fraudatrix.
Научная новизна. Впервые для иглокожих исследовано распределение
белка Wnt5 в тканях в процессе регенерации. У E. fraudatrix клетки с Wnt5
располагаются преимущественно в радиальном нервном тяже и гиподерме.
Показано, что число Wnt5-положительных клеток возрастает на 7-10 сут после
эвисцерации, в период активного морфогенеза. Это указывает на то, что Wnt5 и
активируемый им сигнальный путь являются неотъемлемой частью механизмов
восстановления внутренних органов у E. fraudatrix.
7
Впервые для голотурий отряда Dendrochirotida были установлены
нуклеотидные последовательности кодирующей части 4-х генов семейства wnt
– wntA, wnt4, wnt6, wnt16. Нуклеотидные последовательности транскриптов
wnt4, wntA и wnt16 были получены впервые для голотурий. Проведен анализ
экспрессии wntA, wnt4, wnt6, wnt16 в процессе регенерации: wnt6 – впервые для
голотурий отряда Dendrochirotida, а wnt4 и wnt16 – впервые для типа
Echinodermata. Впервые для многоклеточных животных показано участие гена
wntA в регенерации. Кроме того, впервые для иглокожих было установлено, что
frizzled1/2/7,
frizzled4,
frizzled5/8
и
dishevelled
экспрессируются
при
регенерации.
Теоретическое и практическое значение работы. Результаты работы по
определению
нуклеотидных
последовательностей
генов
wnt
голотурий
позволяют глубже понять происхождение и эволюционную динамику белков
Wnt. Полученные данные по экспрессии генов сигнального пути Wnt
дополняют и расширяют наши представления об участии Wnt сигналинга в
регенерации у иглокожих и других организмов. Кроме того, результаты наших
исследований являются вкладом в изучение молекулярных механизмов
регенерации у многоклеточных животных. Полученный фактический материал
свидетельствует, что сигнальный путь Wnt является важной и неотъемлемой
частью механизмов восстановления. Понимание конкретных механизмов
восстановительных морфогенезов у голотурий поможет в решении общих
вопросов теории регенерации, а также в разработке методов активации
восстановительных потенций органов у млекопитающих, в частности у
человека.
Личный вклад автора заключается в сборе материала, фиксации,
проведении
иммуноцитохимических
реакций
и
анализе
препаратов,
биоинформационном анализе нуклеотидных последовательностей исследуемых
генов в транскриптоме, подготовке материала и проведении полимеразной
цепной реакции (ПЦР), ПЦР в реальном времени
(qPCR), быстрой
8
амплификации концов кДНК (Rapid amplification of cDNA ends, RACE),
самостоятельном анализе полученных данных и подготовке публикаций.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на
ежегодных научных конференциях ИБМ ДВО РАН (Владивосток, 2011, 2013);
Всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина»
(Москва, 2011); 14-й международной конференции по иглокожим (Brussels,
2012);
Всероссийской
конференции
с
международным
участием
«Физиологические, биохимические и молекулярно-генетические механизмы
адаптаций гидробионтов» (Борок, 2012); Всероссийской конференции с
международным участием «Эмбриональное развитие, морфогенез и эволюция»
(Санкт-Петербург, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ, в том числе
три статьи в отечественных журналах из списка, рекомендованного ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 116
страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов,
результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа
содержит 44 иллюстрации (рисунка). Список литературы состоит из 166
наименований, из них 151 на иностранных языках.
Благодарности. Выражаю благодарность всем сотрудникам Лаборатории
сравнительной цитологии ИБМ ДВО РАН за разностороннее содействие и
поддержку, оказанную в ходе проведения работы. Сердечно благодарю своего
научного руководителя д.б.н. И.Ю. Долматова за интересную и актуальную
тему
исследования,
помощь
и
руководство
на
всем
протяжении
исследовательской работы и оформления диссертации, а также за ценные
советы и рекомендации. Отдельную благодарность выражаю к.б.н. М.Г.
Елисейкиной за помощь в освоении методов иммуноцитохимии, к.б.н. Е.В.
Шамшуриной за обучение методам qPCR, а также к.б.н В.В. Паньковой за
обучение методам молекулярной биологии. Также особую благодарность
выражаю к.м.н. М.П. Исаевой и всем сотрудникам Лаборатории морской
9
биохимии ТИБОХ за неоценимую помощь в обучении методам RACE и
проведении исследований. Кроме того, хотел бы поблагодарить к.б.н. Е.Н.
Толкунову (Лаборатория молекулярной биологии стволовых клеток Института
цитологии РАН) за возможность стажировки и помощь в освоении методов
молекулярной биологии.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты № 11-0400408, 14-04-00239), ДВО РАН (гранты № 13-III-В-06-117, 14-III-В-06-067) и
Правительства РФ (грант № 11.G34.31.0010).
10
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Регенерация
Регенерация – морфологический процесс замены различных структур
(от частей клеток, до крупных частей тела) после естественного изнашивания
или случайной утраты, результатом которого является сохранение целостности
организма и восстановление утраченной функции (Карлсон, 1986; Долматов,
Машанов, 2007). Это сложное и интересное явление, в которое вовлечено
множество различных типов клеток и большое число генов. Все современные
организмы в той или иной степени обладают регенеративными способностями,
которые позволяют им восстанавливаться после физических травм или
болезней,
а
также
осуществлять
физиологическое
обновление
тканей
(Воронцова, Лиознер, 1957; Короткова, 1997). Источником клеток при
регенерации могут служить как стволовые клетки (Ingraham et al., 2011;
Demircan et al., 2013; Rinkevich et al., 2013), так и дифференцированные клетки,
прошедшие дедифференцировку (Карлсон, 1986; Candelaria et al., 2006;
Долматов, Машанов, 2007). В настоящее время регенерация изучается не
только на морфологическом уровне с описанием клеточной пролиферации,
дедифференцировки и миграции (Долматов, Машанов, 2007; Wijk et al., 2012;
Rinkevich et al., 2013), но и на молекулярно-генетическом, с выяснением
основных групп генов, регулирующих восстановление (Ortiz-Pineda et al., 2009;
Munder et al., 2013; Sousounis et al., 2013; Sun et al., 2013a; Umesono et al., 2013;
Rossant, 2014)
Выраженность регенерации и её масштаб могут сильно различаться не
только у представителей разных типов и классов, но и у близких видов (Goss,
1992; Bely, Nyberg, 2010). Например, сравнительный анализ регенерации
скелетной и сердечной мускулатуры, а также некоторых других тканей
млекопитающих показал, что полнота и интенсивность восстановления в ответ
на однотипное повреждение варьирует даже у таксономически близких видов
(Borisov, 1999).
11
Основными объектами для изучения регенерации являются гидроидные
полипы (Lengfeld et al., 2009; Munder et al., 2013), планарии (Petersen, Reddien,
2009; Sikes, Newmark, 2013; Umesono et al., 2013) и амфибии (Carlson, 1998;
Kuhl et al., 2000). Несмотря на интересные и важные результаты, полученные
при изучении перечисленных модельных объектов, эти исследования, на наш
взгляд, имеют один существенный недостаток: используемые виды животных
напрямую не связаны друг с другом, они принадлежат к давно разошедшимся
таксонам, имеющим между собой мало общего как в морфологии, так и в
эмбриональном развитии и регенерации. Все это не дает возможности
проводить сравнительный анализ и делать какие-либо заключения о
происхождении и путях эволюции восстановительных способностей и
механизмов. Для того чтобы получить более полную картину необходимо
увеличение числа модельных объектов.
Среди
вторичноротых
животных
регенеративный
потенциал
максимально выражен у иглокожих. Echinodermata вместе с полухордовыми
образуют группу Ambulacraria, которая является сестринской для хордовых
животных (Swalla, Smith, 2008). Таким образом, с одной стороны они
филогенетически ближе к позвоночным, чем планарии или гидроидные
полипы, а с другой стороны обладают большими восстановительными
потенциями, чем амфибии. В этой связи иглокожих можно рассматривать в
качестве перспективных модельных организмов.
1.2. Регенерация у иглокожих
Тип Echinodermata включает в себя 5 классов: Crinoidea (морские
лилии), Asteroidea (морские звезды), Ophiuroidea (офиуры), Echinoidea (морские
ежи) и Holothuroidea (голотурии). В каждом классе способность к регенерации
выражена в разной степени (Долматов, 1999).
Морские лилии – одна из немногих групп животных, у которой наличие
регенерации
установлено
еще
для
палеозойских
представителей.
12
Палеонтологические данные свидетельствуют, что морские лилии уже в начале
палеозоя обладали способностью к регенерации (Clark, Rowe, 1971).
Современные виды также могут восстанавливать различные структуры.
Стебельчатые морские лилии способны к аутотомии и регенерации всей
чашечки (Amemiya, Oji, 1992). Бесстебельчатые морские лилии могут
регенерировать цирри, пиннулы, руки, кишечник (Thorndyke et al., 2001; Candia
Carnevali, 2005). Морские звезды способны восстанавливать утраченные лучи
(Mladenov et al., 1989; Hernroth et al., 2010). У некоторых видов отдельный луч
может дать начало всему организму (Dupont, Thorndyke, 2006). Офиуры
способны к аутотомии лучей и диска и, соответственно, могут их
восстанавливать (Wilkie, 2001; Charlina et al., 2009; Frolova, Dolmatov, 2010;
Biressi et al., 2010). Морские ежи имеют наименьшие способности к
регенерации среди иглокожих. Они могут репарировать только небольшие
повреждения панциря, и отращивать обломанные иглы и педицеллярии
(Долматов, 1999).
Представители
класса
Holothuroidea
обладают
наибольшим
регенераторным потенциалом (Долматов, 1999). Они способны восстанавливать
небольшие придатки, такие как щупальца и амбулакральные ножки, заживлять
кожные раны. У голотурий имеются механизмы аутотомии. Например, многие
виды отряда Apodida могут отбрасывать заднюю часть тела, а затем полностью
ее восстанавливать (Emson, Wilkie, 1980; Gibson, Burke, 1983). Голотурии
отрядов Aspidochirotida и Dendrochirotida обладают интересной разновидностью
аутотомии – эвисцерацией (Hyman, 1955; Emson, Wilkie, 1980; Долматов, 1996).
Эти животные в ответ на различные раздражители выбрасывают внутренние
органы. Регенерация после эвисцерации может занимать около месяца
(Долматов,
2009).
Имеются
виды
голотурий,
которые
способны
восстанавливать крупные отделы тела после поперечного разрезания (Torelle,
1910; Reichenbach, Holloway, 1995; Долматов и др., 2012; Каменев, 2013). Кроме
того, ряду видов свойственно бесполое размножение путем поперечного
13
деления на две части (Emson, Wilkie, 1980; Долматов и др., 2012; Каменев,
2013). Оба фрагмента восстанавливают утраченные органы.
Наибольшее число работ по регенерации у голотурий посвящено
изучению восстановления пищеварительной системы после эвисцерации (см.
обзоры: Долматов, 2009; Mashanov, García-Arrarás, 2011). Эвисцерация у разных
отрядов
происходит
различными
способами.
Представители
отряда
Aspidochirotida выбрасывают внутренности через анальное отверстие или
разрыв стенки тела (Emson, Wilkie, 1980). При этом удаляется средняя часть
пищеварительной трубки (кишечник), органы дыхания (водные лёгкие) и часть
гонадных трубочек. У животных сохраняются передние (рот, глотка, пищевод)
и задние (клоака) отделы пищеварительной системы. При регенерации
кишечник формируется по свободному краю кишечного мезентерия между
пищеводом и клоакой. У большинства изученных голотурий он развивается из
двух отдельных зачатков, один из которых отрастает от клоаки, а другой – от
пищевода (Bertolini, 1932; Kille, 1936, 1937; Марушкина, Грачева, 1978; GarcíaArrarás, Greenberg, 2001; Долматов и др., 2012).
Наиболее хорошо изучен данный процесс у дальневосточного трепанга
A. japonicus (Марушкина, Грачева, 1978; Leibson, 1992; Шукалюк, Долматов,
2001; Odintsova et al., 2005; Долматов, Машанов, 2007) и H. glaberrima (GarcíaArrarás et al., 1998; García-Arrarás, Greenberg, 2001; Murray, García-Arrarás, 2004;
Candelaria et al., 2006). У этих видов голотурий передний зачаток закладывается
раньше заднего. На 7-е сут после эвисцерации у оборванного конца пищевода
по свободному краю мезентерия развивается соединительнотканное утолщение,
в которое врастает внутренний эпителий пищевода. В зачатке клетки
сохранившегося кишечного эпителия постепенно дедифференцируются и
начинают митотически делиться. При этом они теряют правильную форму,
высота их уменьшается, исчезают полудесмосомы, но межклеточные контакты
сохраняются. Энтероциты дедифференцируются лишь частично, даже в
делящихся клетках сохраняются секреторные вакуоли (Шукалюк, Долматов,
14
2001; Odintsova et al., 2005; Долматов, Машанов, 2007). За счет пролиферации и
миграции клеток зачаток постепенно растет назад по краю мезентерия.
Задний зачаток становится заметным на 10–14-е сут после эвисцерации.
Он развивается как соединительнотканное утолщение по краю мезентерия,
отходящее от клоаки. Кишечный эпителий клоаки врастает в него, формируя
внутреннюю
выстилку.
Энтероциты
частично
дедифференцируются
и
митотически делятся. Тем не менее, они сохраняют межклеточные контакты и
секреторные гранулы в цитоплазме. В дальнейшем оба зачатка удлиняются,
постепенно распространяясь по краю мезентерия навстречу друг другу. На 20–
25-е
сут
они
сливаются,
в
результате
чего
целостность
кишки
восстанавливается.
У представителей отряда Dendrochirotida эвисцерация осуществляется
через передний конец тела (Hyman, 1955; Emson, Wilkie, 1980). При этом
выбрасывается аквафарингеальный комплекс (АК), весь пищеварительный
тракт (кроме клоаки), часть половых трубочек и иногда левое водное лёгкое
(рис. 1). АК является важной структурой голотурий (Hyman, 1955). В его состав
входят такие интегрирующие органы, как нервное кольцо и кольцевой канал
амбулакральной системы. Кроме того, АК содержит щупальца, ряд органов
амбулакральной системы, мышцы, начальные отделы пищеварительной
системы (Hyman, 1955; Долматов, 1986а, б).
Способность голотурий регенерировать АК была известна достаточно
давно (Torelle, 1910; Bertolini, 1930, 1932; Kille, 1936; Hyman, 1955). Тем не
менее, относительно подробно восстановление АК исследовано только у
четырех видов – Thyone briareus, T. okeni, Thyonella gemmata и Eupentacta
fraudatrix (Kille, 1935; Tracey, 1972; Nace, 1972; Dolmatov, 1992). Судя по
представленным данным, процесс регенерации протекает примерно одинаково
у всех изученных видов. Однако описание его у разных голотурий было
сделано с различной степенью глубины; в основном исследования проводились
с использованием световой микроскопии. Наиболее подробно регенерация АК
15
была изучена у E. fraudatrix (Dolmatov, 1992; Долматов, Машанов, 2007).
Описание восстановления АК у данного вида дано в главе 1.3.
Рис. 1. Процесс эвисцерации у голотурии E. fraudatrix. и – интроверт, к – кишка, пп –
полиев пузырь, пт – половые трубочки (по: Долматов, Машанов, 2007).
У дендрохиротид после эвисцерации из всех структур пищеварительной
системы
сохраняется
только
клоака
(Hyman,
1955;
Долматов,
2009).
Регенерация кишки происходит примерно так же, как и у аспидохиротид – за
счет формирования двух зачатков. На переднем конце животного между
оборванными
концами
амбулакров
развивается
соединительнотканное
утолщение, соответствующее зачатку АК и переднему зачатку кишки. Задний
зачаток появляется в виде уплотнения в вентральном мезентерии на границе с
клоакой. Последующая регенерация сводится к росту зачатков навстречу друг
16
другу, что в конечном итоге приводит к их слиянию и образованию
непрерывной пищеварительной трубки.
Несмотря на то, что в последние 20 лет регенерацию у голотурий
изучают, главным образом, на представителях отряда Aspidochirotida, более
перспективными модельными объектами, на наш взгляд, являются голотурии
отряда Dendrochirotida. У аспидохиротид при эвисцерации удаляются лишь
часть
кишки
и
водные
легкие,
и
регенерация
ограничена
только
пищеварительной и дыхательной системами. У дендрохиротид выбрасывается
не только вся пищеварительная система, но и АК. Соответственно, регенерация
включает в себя восстановление структур практически всех систем органов –
пищеварительной, амбулакральной, нервной и мышечной. В этой связи у
голотурий отряда Dendrochirotida можно изучать более широкий спектр
механизмов
регенерации.
пищеварительный
Кроме
эпителий
того,
формируется
у
ряда
из
видов
клеток
дендрохиротид
мезодермального
происхождения за счет их трансдифференцировки (Долматов, 2009), поэтому
имеется возможность исследовать этот редкий феномен. В настоящее время
наиболее хорошо изучены морфологические особенности регенерации у
голотурии E. fraudatrix, которая и является объектом нашего исследования.
1.3. Регенерация у Eupentacta fraudatrix
Голотурия Eupentacta fraudatrix относится к семейству Sclerodactilidae
отряда Dendrochirotida. Она является обычным представителем фауны
Японского моря, где обитает на глубине от 0,5 до 12 м. Особи данного вида
имеют красновато-розовую окраску (Рис. 1А), их длина может достигать 8-10
см.
В настоящее время у данного вида подробно описаны морфологические
особенности регенерации внутренних органов после эвисцерации (Долматов,
Машанов, 2007). У E. fraudatrix способность к эвисцерации проявляется у
особей размером 1–1,5 см, что, возможно соответствует возрасту 3-4 года
17
(Долматов, 1994). С этого момента голотурии достаточно быстро и полно
восстанавливают удалённые внутренности, процесс регенерации качественно
не отличается у особей всех размерных групп (возрастов). При эвисцерации
удаляется кишка, АК и часть гонадных трубочек (рис. 1А-З, 2А, Б). У E.
fraudatrix наиболее интересным является образование переднего зачатка,
поскольку у данного вида после эвисцерации в передней части тела никаких
энтодермальных тканей не остаётся (рис. 1З, 2Б).
Сразу после эвисцерации происходит сокращение кольцевой и продольной
мускулатуры стенки тела на переднем конце животного, в результате чего
оборванные концы амбулакров вворачиваются внутрь и сближаются друг с
другом. Между ними остаётся только тонкая прослойка соединительной ткани
– остаток гиподермы интроверта. Амбулакры тесно прилежат друг к другу и
вместе с целомоцитами закрывают раневое отверстие (Долматов, Машанов,
2007). Весь процесс регенерации внутренних органов можно разделить на 8
стадий (Lamash, Dolmatov, 2013). Первая стадия (0-1 сут после эвисцерации)
характеризуется воспалительными процессами в поврежденных тканях и
активным очищением места повреждения от разрушенных клеток и различных
патогенных организмов (Dolmatov, 1992). На переднем конце животного, в
месте повреждения накапливаются целомоциты, которые формируют тромб.
Органы, входящие в амбулакр, в месте разрыва теряют правильность строения
и проявляют признаки дезинтеграции (Долматов, Машанов, 2007).
18
Рис. 2. Стадии регенерации внутренних органов E. fraudatrix. А – неповрежденное животное,
Б − сразу после эвисцерации, В − стадия 1 (1 сут), Г − стадия 2 (2−3 сут), Д − стадия 3 (4−5
сут), Е - стадия 4 (6−7 сут), Ж − стадия 5 (8−10 сут), З − стадия 6 (12−14 сут), И − стадия 7
(16−18 сут). Условные обозначения: ac – аквафарингеальный комплекс, ap – передний
зачаток, с – клоака, g – кишка, m − мезентерий, pac − зачаток АК, pp – задний зачаток, rt –
водные легкие, t − щупальца (по: Lamash, Dolmatov, 2013, с изменениями).
19
Через 1 сут после эвисцерации тромб на переднем конце голотурии
замещается небольшим соединительнотканным утолщением (рис. 2В). Боковые
стороны утолщения формируются гиподермой и целомическим эпителием.
Центральная часть занята сетевидной соединительной тканью, в которой
встречаются фибробласты и целомоциты. Клетки целомического эпителия
передней части животного уплощаются и начинают мигрировать по задней
поверхности утолщения, покрывая его несколькими слоями. Амбулакральные
каналы заполнены жидкостью, содержащей целомоциты и гемоциты. На концах
их, в месте разрыва, базальная мембрана отсутствует. Отверстие закрыто
несколькими слоями уплощенных клеток, вероятно, амёбоцитов.
На
второй
стадии
регенерации
(2−3
сут
после
эвисцерации)
соединительнотканное утолщение между концами амбулакров увеличивается в
размерах (рис. 2Г). На этой стадии оно представляет собой пятиугольник, к
центру которого прикрепляется кишечный мезентерий. Концы амбулакров
объединяются с утолщением в единую структуру, которая представляет собой
фактически зачаток АК. Внутренняя часть последнего образована рыхлой
соединительной
тканью.
дедифференцировка
На
клеток
этой
стадии
целомического
начинается
эпителия,
в
активная
дальнейшем
формирующих кишечную выстилку (Mashanov et al., 2005). Главные изменения
происходят на концах амбулакров и характеризуются началом роста структур
амбулакров по соединительнотканному утолщению назад.
Третья стадия регенерации (4-5 сут после эвисцерации) характеризуется
началом формирования переднего зачатка кишки. Он закладывается в виде
соединительно-тканного утолщения, растущего от зачатка АК по краю
кишечного мезентерия (рис. 2Д).
Четвертая стадия (6−7 сут после эвисцерации) характеризуется
активным морфогенезом. Именно на этой стадии закладываются все основные
структуры переднего конца голотурии. В первую очередь начинается развитие
органов АК. Вначале появляются зачатки щупалец. Недалеко от своего конца
20
каждый
амбулакральный
канал
даёт
два
боковых
выроста,
которые
располагаются в соединительной ткани регенерата АК по его периметру. Затем
эти выросты удлиняются и растут вперёд. В дальнейшем они дадут начало
амбулакральной системе щупалец.
На данной стадии регенерации образуется кольцевой амбулакральный
канал. Концы каждого радиального амбулакрального канала раздваиваются и
растут по периметру зачатка АК вокруг формирующейся кишечной трубки.
Объединение их в единое кольцо происходит на 7-е сут после эвисцерации.
Таким же образом, за счет разделения концов растущих нервных тяжей и их
объединения вокруг АК развивается нервное кольцо (Mashanov et al., 2008).
В районе формирующегося амбулакрального кольца и по бокам от
радиальных
амбулакральных
каналов
клетки
целомического
эпителия
начинают мигрировать в соединительную ткань зачатка. Под амбулакрами они
образуют небольшие плотные скопления. Одновременно с миграцией эти
клетки приступают к активному делению. В результате этого здесь возникают
обширные клеточные скопления с микрополостями. Объединение скоплений
приводит к возникновению перифарингеального целома, отделяющего АК от
кишечной
трубки.
На
кольцевом
амбулакральном
канале
начинают
формироваться полиевы пузыри и каменистые каналы.
Передний зачаток кишки удлиняется (рис. 2Е). На этой стадии в нем
начинается закладка пищеварительного эпителия. Целомический эпителий,
покрывающий
зачаток,
формирует
складки,
которые
погружаются
в
подлежащую соединительную ткань. По мере погружения происходит
дедифференцировка клеток. Несмотря на достаточно серьезные структурные
перестройки клетки целомического эпителия не теряют связи между собой,
межклеточные контакты не разрушаются (Mashanov et al., 2005). Оставаясь в
составе погружающегося эпителия, дедифференцированные клетки начинают
митотически делиться. В результате этого в соединительной ткани зачатка
образуются многочисленные клеточные скопления.
21
На 5 стадии (8−10 сут после эвисцерации) происходит формирование
заднего зачатка кишки (рис. 2Ж). В это же время продолжается рост АК и
развитие входящих в него органов. Увеличиваются полиевы пузыри и
каменистые каналы. Стенка полиевых пузырей утолщаются. Во внутренней
области зачатка АК формируется единая выстилка пищеварительного тракта и
наружный эпителий интроверта. АК полностью отделяется от пищеварительной
системы, в перифарингеальном целоме хорошо видны подвесочные тяжи.
Передний зачаток кишки продолжает удлиняться и расти назад по краю
кишечного мезентерия. Складки погрузившегося целомического эпителия
отделяются от основной части эпителия, сливаются друг с другом и формируют
кишечную
выстилку
преобразование
клеток
переднего
завершено,
зачатка
в
их
кишки.
К
этому
цитоплазме
моменту
обнаруживаются
секреторные гранулы, типичные для энтероцитов.
На 6 стадии (12−14 сут после эвисцерации) (рис. 3З) основные органы АК
уже полностью сформированы и в дальнейшем происходит лишь их рост.
Передний зачаток кишки продолжает распространяться по краю мезентерия и
достигает середины длины тела.
На 7 стадии (16−18 сут после эвисцерации) оба зачатка кишки
соединяются (рис. 2И), формируя единую кишечную трубку, а на 8 стадии (2530 сут после эвисцерации) животные начинают питаться, восстановительный
процесс следует считать завершенным (Долматов, Машанов, 2007).
1.4. Молекулярные механизмы регенерации
Регенерация является сложным процессом, в регуляции которого
задействовано большое число генов. Например, при восстановлении у планарий
происходит активация более чем 356 различных генов (Rossant, 2014). Их
продукты взаимодействуют друг с другом и часто объединены в кластеры,
формируя так называемые сигнальные пути. Исследования последних лет
показали, что при регенерации важную роль играют такие сигнальные пути, как
22
Wnt, MAPK, ERK, Hippo, Notch, FGF, nodal, TGF-b и Hedgehog (Schnapp et al.,
2005; Stoick-Cooper et al., 2007; Demircan, Berezikov, 2013; Knapp et al., 2013;
Zhao et al., 2014).
Основой работы всех сигнальных путей является взаимодействие
лиганда
с
рецептором,
проведение
сигнала
в
ядро
и
активация
соответствующих генов. В зависимости от лиганда сигнал может передаваться
на разные расстояния. Например, рецептор Notch и его лиганд Dll/Jagged
располагаются на клеточной мембране, поэтому сигнальный путь Notch
осуществляет взаимодействие только между соседними клетками (Harper et al.,
2003). Чаще сигнальные пути имеют более сложную организацию и в
проведении
сигнала
задействованы
лиганд,
несколько
рецепторов,
внутриклеточные мессенджеры и транскрипционные факторы. Например,
сигнальный путь Hedgehog, являющийся важным молекулярным механизмом,
контролирующим эмбриональное развитие, состоит из лиганда Hedgehog (IHh,
DHh, SHh), рецепторов Patched и Smoothened, транскрипционного фактора Ci и
ряда мессенджеров (Biehs et al., 2010; Ingham et al., 2011).
Участие
сигнальных
путей
в
морфогенезах
разнообразно.
При
регенерации позвоночных Hedgehog сигналинг необходим при формировании
спинного мозга и мышц (Schnapp et al., 2005). Семейство факторов роста
фибробластов (FGF) являются лигандами одноименного сигнального пути,
который способен стимулировать рост эндотелия сосудов и аксонов нейронов, а
также пролиферацию фибробластов (Vlodavsky et al., 2003; Zechel et al., 2010).
При регенерации FGF регулируют формирование нервов, соединительной
ткани, а также энтодермы (Yokoyama et al., 2000). Различные члены семейства
FGF имеют свою уникальную функцию. Так frg8 экспрессируется в
эпителиальных клетках бластемы конечности амфибий, в то время как fgf10 – в
мезенхиме (Randolph et al., 2002). Hippo регулирует активность стволовых
клеток во время развития и регенерации позвоночных, а также был выявлен в
делящихся стволовых клетках планарий (Demircan, Berezikov, 2013).
23
Сигнальные пути могут оказывать не только активирующее, но и
ингибирующее действие на процесс восстановления. Так, белки TGF-β
блокируют пролиферацию клеток (Koniaris et al., 2003; Stoick-Cooper et al.,
2007). Кроме того, данные факторы способны активировать апоптоз (Schnaper
et al., 2003).
Недавние исследования регенерации планарий показывают наличие
паттернов экспрессии генов, формирующих сигнальные пути Wnt, MAPK,
ERK. Часть генов экспрессируется только в головном отделе, часть только в
хвостовом (Umesono et al., 2013). При регенерации конечностей у тритона и
аксолотля активируются гены wnt5a, fgf8, bmp2, bmp7 и многие другие (Knapp
et al., 2013; Looso et al., 2013).
Большинство сигнальных путей, активирующихся при регенерации,
являются высоко консервативными. Они могут быть обнаружены как у
позвоночных,
так
и
у
беспозвоночных.
Может
изменяться
число
представителей отдельных семейств морфогенов, однако основополагающие
принципы остаются те же (Stoick-Cooper et al., 2007; Sun et al., 2011, Knapp et
al., 2013). В этой связи механизмы работы сигнальных путей и их участие в
восстановительных процессах можно изучать на удобных модельных объектах.
1.5. Гены семейства Wnt
Гены семейства Wnt играют заметную роль в регуляции различных
морфогенетических процессов, как в эмбриональном развитии, так и при
регенерации. Название Wnt является объединением сокращенных названий
ортологичных генов wingless (wg) дрозофилы и int-1 (позже wnt-1) мыши.
Мутация по данному гену приводит к отсутствию крыльев у взрослых особей
Drosophila melanogaster, что и определило название гена (Bhat, Babu, 1987).
Гомологичный ген позвоночных int вначале изучали в связи с присутствием в
его локусах нескольких мест интеграции генома вируса рака молочных желез
мыши (Nusse et al., 1984). Исследование роли этих двух генов привело к
24
открытию целого класса лигандов, регулирующих эмбриональное развитие
животных. Отдельные компоненты сигнального пути Wnt консервативны и
встречаются практически у всех многоклеточных животных – от губок до
человека (Schubert et al., 2000; Prud’homme et al., 2002; Cho et al., 2010)
В эмбриогенезе млекопитающих, как и других позвоночных, гены wnt
участвуют в формировании переднезадней оси тела (Fu et al., 2009). Также
белки Wnt способны активировать миграцию опухолевых клеток, тем самым
приводя к образованию метастазов (Wu et al., 2007). Было показано, что при
воздействии на опухолевую клетку белка Wnt5, она изменяла форму,
становилась
более
противоположную
распластанной
месту
и
начинала
присоединения
двигаться
лиганда
Wnt5.
в
У
сторону,
взрослых
млекопитающих экспрессия генов wnt наблюдается при регенерации кожного
эпителия (Fathke et al., 2006), сетчатки глаза (Osakada et al., 2007), а также
кончиков пальцев (Takeo et al., 2013). Активация генов wnt у млекопитающих и
птиц приводит в ряде случаев к регенерации структур, которые в норме не
способны к восстановлению. Известно, что у млекопитающих при ампутации
кончиков пальцев проксимальнее основания когтя регенерация не происходит
(Borgens, 1982). Однако, если в культе активировать сигнальный путь Wnt, то
происходит частичное восстановление дистальной фаланги (Takeo et al., 2013).
Сходный результат был получен и при ампутации крыла у цыплёнка (Kawakami
et al., 2006). При активации Wnt сигналинга происходит частичное
восстановление кости и утраченных тканей. У амфибий, которые способны к
восстановлению конечностей, блокировка Wnt сигналинга приводит к
замедлению или полной остановке регенерации (Kawakami et al., 2006;
Yokoyama et al., 2011)
В
настоящее
время
гены
семейства
wnt
выявлены
у
всех
многоклеточных животных. У разных видов губок обнаружено от 1 до 3
различных wnt (Adamska et al., 2007). При усложнении многоклеточных число
генов wnt увеличивается. У гребневиков обнаружено 4 wnt (Pang et al., 2010), а у
25
книдарий – 9 (wntA, wnt1, wnt2, wnt3, wnt4, wnt7, wnt10, wnt11, wnt16) (Guder et
al., 2006; Lengfeld et al., 2009). У морского ежа Strongylocentrotus purpuratus
выявлено 13 генов wnt: wnt1, wnt2, wnt3, wnt4a, wnt4b, wnt5, wnt6, wnt7a, wnt7b,
wnt8, wnt9, wnt10, wnt16 (Croce et al., 2006). У представителя полухордовых,
Saccoglossus kowalevskii, – 11 (Schubert et al., 2000). У человека обнаружено 19
различных лигандов Wnt (Schubert et al., 2000).
1.6. Структура белков Wnt
Молекула белка Wnt содержат несколько сайтов N-гликозилирования и
23-24 цистеиновых остатка, положение которых высоко консервативно. Wnt
состоят из 350-380 аминокислотных остатков (а.о.), из которых более 100 а.о.
находятся в консервативных позициях. Некоторые Wnt имеют дополнительные
внутренние N-концевые или C-концевые участки. Так, например, белок wg
имеет вставку в 85 а.о. до участка кодирующего его последний экзон. Белок
DWnt3 D. melanogaster имеет вставку в 155 а.о. и длинное N-концевое
продолжение. В большинстве случаев Wnt имеют 30-60% идентичность при
сравнении разных белков у одного животного или гомологичных белков у
животных разных таксонов. Полагают, что мутации в генах wnt накапливались
чрезвычайно медленно, возможно из-за их важной роли в регуляции развития
(Fu et al., 2009). В результате дупликаций происходило образование новых
генов (wnt3a, wnt3b, wnt7, wnt7a), которые в дальнейшем эволюционировали и
приобретали новую функцию.
Белки Wnt имеют большое сходство с секретируемыми ростовыми
факторами (Nusse, Varmus, 1992). У них имеется сайт узнавания сигнала
пептидазы, за которым располагается гидрофобный сигнальный пептид.
Трансмембранный домен отсутствует. Консервативное расположение остатков
цистеина обеспечивает формирование определенной трехмерной структуры за
счет образования дисульфидных мостиков. Кроме того, у Wnt имеются сайты
для N-связанного гликозилирования.
26
1.7. Типы сигнального пути Wnt
Существуют 3 различных сигнальных пути, которые активируют белки
семейства Wnt. В каноническом сигналинге запуск целевых генов происходит
за счет стабилизации β-catenin и накопления его в ядре клетки. В
неканонических типах сигнального пути лиганд Wnt влияет на поведение
клетки, не вызывая изменения концентрации β-catenin. Исторически сигналинг
Wnt разделяли на канонический и неканонические используя три стандартных
метода определения: по активности в культуре клеток C57MG, по способности
влиять на эмбриогенез у Xenopus и по индукции образования почечных
канальцев в изолированной культуре мезенхимальных клеток почки. Однако
позже выяснилось, что выбор сигнального пути зависит не столько от лиганда,
сколько от рецептора и других белков, составляющих сигнальный путь
(Komiya, Habas, 2008).
В канонический сигнальный путь Wnt вовлечены более 50 различных
белков (Komiya, Habas, 2008; Mo, Cui, 2012). Главным исполнительным
элементом этого сигнального пути является белок β-catenin. В отсутствие Wnt,
β-catenin является субстратом для киназ casein kinase 1 (CK1) и glycogen
synthase kinase 3 (GSK3β). Последние, вместе с белками adenomatosis coli (APC)
и Axin, входят в состав находящегося в цитоплазме мультибелкового
комплекса.
Этот
комплекс
связывает
цитоплазматический
β-catenin
и
фосфорилирует его. Фосфорилированный β-catenin подвергается протеолизу.
При поступлении Wnt в межклеточные пространства, он связывается с
рецептором Frizzled и корецептором lipoprotein receptor-related protein (LRP5/6).
При этом происходит активация белка Dishevelled (Dsh), который приобретает
способность взаимодействовать с Axin. Такое взаимодействие инактивирует
мультибелковый
комплекс
APC/Axin/CK1/GSK3β,
что
приводит
к
стабилизации β-catenin и его накоплению в цитоплазме. Далее β-catenin
перемещается в ядро, где он взаимодействует с фактором транскрипции
transcription factor/Lymphoid enhancer-binding factor (TCF/LEF). В отсутствие
27
сигнала факторы TCF/LEF не связываются с «Wnt-ответственными» генами, а
взаимодействуют с другими факторами, например Groucho. Связывание βcatenin с белками TCF/LEF обеспечивает активацию транскрипции генов wnt
(Eisenmann, 2005) (рис. 3).
Неканонический сигнальный путь Wnt – Wnt/JNK у позвоночных или
Wnt/planar (planar cell polarity (PCP)) у беспозвоночных ещё не до конца изучен.
Известно, что β-catenin в этот сигнальный путь не вовлечён (Komiya, Habas,
2008). Впервые данный сигнальный путь был обнаружен у дрозофилы, где он
контролировал полярность эпителиальных клеток глаз, лёгких и кожного
эпителия. В этом сигнальном пути Wnt задействован только рецептор Frizzled
(Seifert, Mlodzik, 2007). Его активация приводит к полимеризации актина, что
обеспечивает асимметрию организации цитоскелета и поляризацию клетки.
Frizzled взаимодействует с Dsh, который в свою очередь активирует два
независимых сигнальных пути – через ГТФазы Rho и Rac (Wallingford, Habs,
2005) (рис. 4). Для активации Rho требуется белок Dishevelled-associated
activator of morphogenesis 1 (Daam-1). Взаимодействие Rho и Daam-1 приводит
к активации Rho-асоциированой киназы ROCK.
28
Рис. 3. Канонический сигнальный путь Wnt. Условные обозначения: APC − adenomatosis
coli, CK1 − casein kinase 1, Dsh – Dishevelled, Fz – Frizzled, GSK3 − glycogen synthase kinase
3, TCF − transcription factor, β-cat – β-catenin, (по: Komiya, Habas, 2008).
Rac независима от Daam-1, она стимулирует активность киназы Jun (рис.
4). Как и компоненты канонического сигнального пути, белки сигнального пути
PCP являются высоко консервативными (Huelsken,
2008).
Behrens, 2002; Vincan,
29
Рис. 4. Неканонический сигнальный путь Wnt-planar cell polarity (PCP). Условные
обозначения: Daam1 − Dishevelled-associated activator of morphogenesis 1, Dsh −
Dishevelled, Fz − Frizzled, JNK − c-Jun N-terminal kinases, ROCK − Rho-associated kinase
(по: Komiya, Habas, 2008).
Взаимодействие Wnt с рецептором Frizzled может приводить к
высвобождению ионов кальция из клетки (сигнальный путь Wnt/Ca2+). В этот
сигнальный путь вовлечены ко-рецепторы Frizzled: Knypek и Ror2 (Nishita et al.,
2006). Кроме того, в передаче сигнала задействованы внутриклеточные
вторичные мессенджеры – гетеротримерный G-белок, фосфолипаза C и
протеинкиназа C (Saneyoshi et al., 2002) (рис. 5). Гены, которые активируются
сигнальным путём Wnt/Ca2+, неизвестны. Тем не менее, был обнаружен фактор
транскрипции Nuclear factor of activated T-cells (NFAT), вовлеченный в этот
сигнальный путь (Saneyoshi et al., 2002). Сигнальный путь Wnt/Ca2+ важен для
клеточной адгезии и движений клетки во время гаструляции (Komiya, Habas
2008).
30
Рис. 5. Сигнальный путь Wnt/Ca2+. Условные обозначения: Dsh – Dishevelled, Fz –
Frizzled, NEMO − NFAT - Nuclear factor of activated T-cells, PDE − phosphodiesterase, PKC
− Protein kinase C, PLC − Phospholipase C, β-cat − β-catenin (по: Komiya, Habas, 2008).
Какой именно сигнальный путь будет активирован в том или ином
случае зависит от многих факторов: лиганда Wnt, рецептора Frizzled,
корецептора LRP5/6 (Komiya, Habas, 2008). Один и тот же белок Wnt способен
взаимодействовать с различными рецепторами и активировать различные
сигнальные пути. Кроме того, на функциональность лигандов влияет степень
их
гликозилированности
и
метилированности.
Было
показано,
что
негликозилированный Wnt не способен активировать корецептор LRP5/6 и,
соответственно, запускать канонический сигналинг (Komekado et al., 2006).
У позвоночных известно несколько белков, модулирующих активность
Wnt или его рецепторов. Например, белок Sclerostin связывает LRP5/6 и
31
ингибирует сигнальный путь Wnt (Ott et al., 2005). Кроме того, известно
взаимодействие этого сигнального пути с тримерными G-белками, а также
некоторыми протеинкиназами и фосфатазами (Huelsken, Behrens, 2002).
Имеются факторы, которые могут блокировать сигнальный путь Wnt. Их
можно разделить на два функциональных класса – Frizzled-подобные белки
(sFRP) и Dickkopf-подобные белки (Dkk) (Jones, Jomary, 2002). Члены класса
sFRP включают гены sfrp, wnt inhibitory factor 1 и cerberus. Их продукты
связываются
непосредственно
с
Wnt
и
изменяют
его
способность
взаимодействовать с рецепторами. Члены класса Dkk блокируют передачу
сигналов Wnt, связываясь с LRP5/6. Предполагается, что инактивация LRP5/6
происходит в результате взаимодействия Dkk с белком Kremen, что вызывает
инвагинацию цитоплазмы и удаление комплекса Dkk-LRP5/6 с поверхности
клетки.
Отсутствие
LRP5/6
делает
Wnt
неспособным
активизировать
внутриклеточную передачу сигнала. Считается, что sFRP блокируют и
канонический и неканонический сигнальные пути Wnt, тогда как Dkk
блокирует только β-catenin-зависимый канонический путь (Kawano, Kypta,
2003).
1.8. Функции Wnt
Большинство
генов
семейства
Wnt
задействованы
в
регуляции
эмбриогенеза. Например, wnt1, wnt3A, wnt8, wnt8B экспрессируются на
вентральной стороне зародыша Xenopus laevis, индуцируя формирование
передне-задней оси тела (Moon et al., 1997; Fan et al., 1998). Белки Wnt4 и Wnt11
не участвуют в установлении передне-задней оси тела у X. laevis, что
свидетельствует об активации β-catenin-независимых сигнальных путей (Du et
al.,
1995).
Интересно,
что
некоторые
Wnt
могут
активировать
как
канононический, так и неканонический сигналинг, запуская противоположные
процессы (Kuhl et al., 2000; Grumolato et al., 2010). В частности, Wnt5A может
индуцировать формирование передне-задней оси у X. laevis за счет
32
взаимодействия с рецептором Frizzled5/6. В то же время, было обнаружено, что
Wnt5A способен также блокировать формирования оси тела, за счет активации
Wnt8, который стимулирует выброса Са2+ и активацию PKC. В связи с этим
предполагают, что Wnt5A может активировать различные процессы в клетке в
зависимости от наличия рецептора (Kuhl et al., 2000).
Экспрессия генов wnt в различных процессах может приобретать
градиентный характер. Например, у интактных планарий активность wnt1 и
wnt2 максимальна в задней части тела. Сразу после удаления переднего конца
животного их экспрессия обнаруживается в субэпителиальных клетках по
всему телу планарии. Однако в дальнейшем активность wnt1 и wnt2 в передней
части, в месте формирования головы, снижается и восстанавливается градиент,
характерный для нормальных животных (Petersen, Reddien, 2009).
Одной из известных функций сигнального пути Wnt у животных
является регуляция клеточной миграции. У позвоночных при развитии
некоторых видов опухолей молекулы Wnt5 воздействуют на раковые клетки,
запуская процесс миграции, что приводит к появлению метастазов (Witze et al.,
2008). Кроме того, Wnt5 может регулировать образование ламеллоподий и
изменять ориентацию центра организации микротрубочек у клеток культуры
M93-047, что активирует их миграцию (Nomachi et al., 2008). Подобным
образом действуют и другие члены семейства Wnt, например Wnt11 (Debeir et
al., 2008).
Еще одной важной функцией Wnt является регуляция активности генов
матриксных металлопротеиназ (Wu et al., 2007). Продуктами этих генов
являются ферменты, способные модифицировать внеклеточный матрикс. Белки
Wnt по каноническому пути способны запускать экспрессию mmp2 и mmp9 у Tлимфоцитов, тем самым активируя их миграцию. Блокировка же этого
сигнального пути предотвращает миграцию Т-лимфоцитов как in vivo, так и in
vitro (Wu et al., 2007). Сходные результаты были получены и на стволовых
33
клетках: при подавлении Wnt сигналинга через Dkk-1 миграция их
прекращается (Ingraham et al., 2011).
1.9. Молекулярные механизмы регенерации у иглокожих
Исследований, посвященных молекулярным механизмам морфогенезов
у иглокожих, в отличие от других животных, достаточно мало. Исключением
являются морские ежи. Для одного вида Echinoidea – S. purpuratus, был
секвенирован геном (Sodergreen et al., 2006). Это пока единственный вид
иглокожих с известным геномом. На морских ежах активно изучаются
молекулярные механизмы эмбриогенеза и личиночного развития (HowardAshby et al., 2006; Hammond, Hofman, 2012; Angerer et al., 2014). Однако среди
иглокожих именно у морских ежей способности к регенерации наименее
выражены (Долматов, 1999), в связи с чем исследовать молекулярные
механизмы восстановления на них невозможно.
При регенерации луча у офиуры Amphiura filiformis в мигрирующих
клетках амбулакрального канала была выявлена экспрессия генов tgf-β
(Bannister et al., 2008). У этого же вида в амбулакральной системе была
обнаружена экспрессия гена bmp2/4, важного морфогена, отвечающего за
формирование оси тела эмбриона. Его продукты были обнаружены в
эпителиальных клетках радиального амбулакрального канала. Появление белка
Bmp2/4 обычно наблюдается через 14 сут после аутотомии луча (Bannister et al.,
2008). Кроме того, выявлен ряд генов, ответственных за формирование скелета
рук при регенерации, в частности тропомиозина и альфа-коллагена. Были
обнаружены и несколько транскрипционных факторов: ets1/2, alx1, foxB, gataC
(Czarkwiani et al., 2013).
Существуют лишь две работы, посвященные выяснению молекулярных
механизмов регенерации у морских лилий (Candia Carnevali et al., 1998; Patruno
et al., 2002). В первой были изучены клеточные механизмы регенерации руки
морской лилии, а также участие в этом процессе фактора роста нервов (NGF)
34
(Candia Carnevali et al., 1998). Во второй был исследован трансформирующий
ростовой фактор-бета (TGF-β). Было показано, что этот белок локализуется в
гранулярных и амебоидных клетках. Причем на ранних стадиях регенерации в
некоторых амебоцитах на раневой поверхности TGF-β присутствует как в
цитоплазме, так и в ядре. В клетках бластемы данный белок локализован в ядре,
преимущественно в ядрышке (Patruno et al., 2002).
Более активно исследуются механизмы регенерации кишки у голотурий
A. japonicus (Sun et al., 2011, 2013a, b) и H. glaberrima (Ortiz-Pineda et al., 2009;
Mashanov et al., 2012a, b). У H. glaberrima было проведено секвенирование
транскриптомов зачатков регенерирующей кишки на 3 сут, 7 сут и 14 сут после
эвисцерации (Ortiz-Pineda et al., 2009). Были выявлены 3 основные группы
генов, экспрессирующиеся при восстановлении: гены, регулирующие процесс
развития, гены, кодирующие цитоскелетные белки, и гены компонентов
внеклеточного матрикса. В первую группу вошли гены семейств Hox (Hox 9,
Hox 10, Hox 12) и wnt, а также bmp1 и Krüppel-like factor2. Вторую группу
составили actin, tubulin alfa, myosin, gelsolin precursor. К третьей группе были
отнесены mmp, echinonectin, collagen alfa-1, laminin alpha и tenascin-r (RojasCartagena et al., 2007; Ortiz-Pineda et al., 2009). Было показано, что многие гены
проявляют дифференциальную активность на разных стадиях регенерации.
Гены actin, wnt9, hox12 имеют максимум экспрессиии на 3 сут регенерации,
тогда как mmp11, mmp14, mmp15 – на 7 сут. Некоторые гены экспрессируются
на всех стадиях регенерации (wnt9, actin, myosin-II), другие – только на ранних
(hox9, hox10, mmp14, mmp15) или только на поздних стадиях (hox5, bmp1)
(Ortiz-Pineda et al., 2009).
Обнаружено, что ген bmp1 экспрессируется в мезентерии и эпителии
амбулакральных каналов интактной H. glaberrima. На ранних сроках
регенерации (2 сут), его продукты наблюдаются лишь в мезентерии. На 7 сут
транскрипты этого гена обнаруживаются еще и в зачатке кишки. Далее на 14
сут сохраняется экспрессия в мезентерии и зачатке кишки, а также появляется в
35
соединительной ткани зачатка АК. К 24 сут регенерации локализация
экспрессии данного гена сходна с нормой, его транскрипты не обнаруживаются
в АК и кишке (Mashanov et al., 2012b).
Исследование
регенерации
перерезанного
амбулакра, содержащего
соединительную ткань гиподермы, радиальный нервный тяж, амбулакральный
канал, а также мышцы, на 2, 6, 12, 20 сут после повреждения у голотурии H.
glaberrima показало, что наибольшее количество транскриптов принадлежит
генам, отвечающим за внеклеточный матрикс (col, lama, integrin beta). Также
обнаружены транскрипты генов, ответственных за сигнальные пути - survivin,
myc, oct, bmp7, sox11 и другие (Mashanov et al., 2014).
Сун и др. (Sun et al., 2013a) в исследованиях на A. japonicus разделяют
гены, экспрессирующиеся при регенерации кишки, на две группы. Одни
активны у неповрежденных животных, а при регенерации уровень их
экспрессии значительно уменьшается и в дальнейшем постепенно приходит в
норме. Эти гены необходимы животному для поддержания нормальных
физиологических процессов и, вероятно, в них нет особой необходимости при
регенерации (pcsk, tag, loc, obg). Другая группа генов (his1, he7, ldp, rap, tfp,
hox6) наоборот имеет низкий уровень экспрессии у интактных животных,
однако при регенерации количество их транскриптов резко возрастает. Более
подробно исследована активность гена hox6 (Sun et al., 2013b). В норме
экспрессия
hox6
осуществляется
на
достаточно
низком
уровне.
При
регенерации количество транскриптов постепенно увеличивается и достигает
максимума на 14 сут, после чего вновь уменьшается. В целом при регенерации
у данног вида голотурий экспрессируется более 5 тысяч различных генов (Sun
et al., 2011).
1.10. Роль Wnt в регенерации у иглокожих
Основные данные по разнообразию генов семейства Wnt у иглокожих
были получены при анализе генома S. purpuratus (Sodergreen, 2006). Было
36
обнаружено 12 генов: wntA, wnt1, wnt2, wnt3, wnt4, wnt5, wnt6, wnt7, wnt8, wnt9,
wnt10, wnt16 (Croce et al., 2006). По другим классам иглокожих такого полного
исследования генов данного семейства не проводилось. Имеются лишь работы,
посвященные отдельным членам семейства Wnt (Mashanov et al., 2012b; Vaughn
et al., 2012; McCauley et al., 2013).
Как и в случае с другими генами, данных по структуре wnt и их участию
в регенерации у иглокожих мало. У голотурии A. japonicus был изучен ген wnt6
(Sun et. al., 2013b). Полная нуклеотидная последовательность его транскрипта
составляет 1140 нуклеотидов, включая 2-нуклеотидный 5’- нетранслируемый
участок, 109-нуклеотидный 3’- нетранслируемый регион и 1029-нуклеотидную
открытую
рамку
считывания
(кодирующую
342
аминокислоты).
Предположительный молекулярный вес белка составил 38кДа и теоретическая
изоэлектрическая точка – 8,82. Полученная последовательность имеет 51%-ную
гомологию с генами wnt6 морских ежей. Было показано, что при регенерации
кишки у A. japonicus происходит активация wnt6. Его экспрессия увеличивается
на 3 и 7 сут после эвисцерации, а затем постепенно снижается, приближаясь к
норме. Авторы утверждают, что возрастание активности wnt6 совпадает с
формированием бластемы, что, возможно, указывает на его роль в регуляции
восстановления кишки у голотурий (Sun et. al., 2013b). Однако, у данного вида
при восстановлении кишки бластема отсутствует (Шукалюк, Долматов, 2001;
Odintsova et al., 2005). В этой связи не совсем понятна функция wnt6 при
регенерации кишки у A. japonicus.
В работе Машанова и др. (Mashanov et al., 2012b) была установлена
локализация и изучена динамика изменения экспрессии wnt9 при регенерации
кишки у H. glaberrima. Показано, что этот ген кодирует белок длиной 368 а.о., у
которого имеется N-концевой секреторный сигнальный пептид длиной в 32 а.о.,
необходимый для пересечения мембраны эндоплазматического ретикулума. На
ранних этапах регенерации (2 сут после эвисцерации) экспрессия wnt9
наблюдается только в заднем зачатке кишки и в мезентерии. Продукты гена
37
располагаются в перитонеальных клетках целомического эпителия. На 7 сут
после эвисцерации wnt9 экспрессируется как в заднем, так и в переднем
зачатках кишки. Его продукты обнаруживаются в перитонеальных клетках
целомического эпителия, который покрывает зачатки кишки, мезентерий,
клоаку и пищевод. Кроме того, экспрессия wnt9 наблюдается во внутреннем
эпителии регенерирующего пищевода. На 14 сут после эвисцерации продукты
wnt9 в кишечном эпителии не выявляются. К 21 сут, когда передний и задний
зачатки срастаются, экспрессия сохраняется лишь в целомическом эпителии
переднего зачатка и мезентерия.
Кроме изучения регенерации кишки, были проведены исследования
восстановления стенки тела после повреждения у этой же голотурии. При этом
были выявлены транскрипты генов wnt2, wnt6, wnt9 (Mashanov et al., 2014).
Таким образом, имеющийся фактический материал дает основание
предположить, что Wnt сигналинг является важным компонентом механизмов
регенерации. При этом практически все члены семейства Wnt в той или иной
мере задействованы в регуляции восстановительных процессов (Lyons et al.,
2004; Jiang et al., 2014; Philipp et al., 2009; Robert et al., 2014). Также в
регенерации участвуют все три сигнальных пути Wnt. К настоящему времени
основные
данные
по
участию
сигнального
пути
Wnt
в
регуляции
восстановительных морфогенезов были получены на животных, которые либо
имеют слабый восстановительный потенциал (насекомые, млекопитающие и
морские ежи) (Croce et al., 2006; Lavery et al., 2008a, b), либо филогенетически
далеки от млекопитающих (Cnidaria, планарии) (Guder et al., 2006; Sikes,
Newmark, 2013; Petersen, Reddien, 2009). Голотурии в этом отношении являются
более подходящими модельными объектами, поскольку вместе с позвоночными
входят в группу Deuterostomia и обладают хорошими способностями к
регенерации (Долматов Машанов, 2007). Изучение Wnt сигналинга у голотурий
позволит глубже понять механизмы восстановительного процесса и даст
возможность активировать регенерацию у позвоночных (Kawakami et al., 2006).
38
Кроме того, у иглокожих в отличие от планарий и насекомых имеется полный
набор генов wnt, что дает возможность изучать функции каждого гена или
белка семейства Wnt. В настоящее время достаточно полно изучены клеточные
механизмы регенерации у голотурии E. fraudatrix (Долматов, Машанов, 2007).
Особенностью
этого
вида
является
наличие
у
него
механизмов
трансдифференцировки (Mashanov et al., 2005). Таким образом E. fraudatrix
является удобным и интересным модельным объектом для исследований
восстановительных морфогенезов и механизмов глубокой перестройки работы
генома клеток в ходе регенерации.
39
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Сбор материала
Исследования проводили на голотурии Eupentacta fraudatrix Djakonov et
Baranova (Holothuroidea, Dendrochirotida). Животных собирали в зал. Петра
Великого Японского моря с помощью водолазной службы ИБМ ДВО РАН и
помещали в аквариумы с аэрируемой морской водой. Эвисцерацию вызывали
инъекцией в полость тела дистиллированной воды (Лейбсон, Долматов, 1989).
На разных стадиях регенерации животных вскрывали ножницами вдоль
правого вентрального радиуса. Зачатки органов (АК и кишка) вырезали
ножницами с использованием бинокуляра Leica ES2, после чего помещали в
соответствующий фиксатор или замораживали.
2.2. Иммуноцитохимия
Для иммуноцитохимических исследований использовали переднюю ¼
часть тела животного, в которой содержатся АК и начальные отделы кишки.
Исследовали неповрежденных особей (контроль) и голотурий через 3, 5, 7, 9,
12, 14 и 24 сут после эвисцерации. Материал фиксировали в 4%
параформальдегиде на 0,1 М фосфатном буфере (PBS, pH 7,4) в течение часа.
На каждый срок регенерации брали по три особи. После фиксации материал
отмывали в фосфатном буфере в течение двух дней. Затем удаляли наружный
слой стенки тела (дерму), содержащую большое количество спикул, и
помещали в среду для приготовления замороженных срезов NEG 50 (RichardAllan Scientific) на 1 сут.
Срезы толщиной 5-14 мкм получали на криотоме Cryo-Star HM 560 MV.
Использовали следующие параметры: температурный режим ножа: −30ºС,
блока: −20ºС. Срезы помещали на предметные стекла, покрытые органосиланом
или полилизином и обводили жировым карандашом. Препараты хранили в
холодильной камере при −20ºС. Перед окраской антителами срезы 15 мин
промывали в PBS, после чего обрабатывали 0,1−0,2% раствором Triton X100 в
40
течение 30 мин. После трех десятиминутных промывок в PBS срезы
обрабатывали 10% раствором бычьего сывороточного альбумина (BSA) во
влажной камере в течение двух часов.
Ранее
с
помощью
методов
масс-спектрометрии
MALDI-TOF
в
регенерирующем АК были идентифицированы два белковых фрагмента Wnt5
(Гирич и др., 2011). Для выявления белка Wnt5 использовали поликлональные
кроличьи
антитела
искусственного
к
участку
пептида
молекулы
Wnt5
E.
fraudatrix.
(GTNGSTLMCCGRGYNSFTK)
и
Синтез
получение
поликлональных антител (АТ) к нему были проведены компанией ООО «РБЛЦентр» (Русбиолинк). Полученные антитела наносили в разведении 1:100 и
оставляли
при +4°C на ночь. Для контроля использовались срезы без
нанесённых первичных антител. В качестве вторичных антител использовались
мышиные моноклональные антитела Alexa Fluor 488 в концентрации 1:700,
разведённые в 1% BSA на PBS. После этого срезы отмывали в PBS три раза по
15 мин. Ядра окрашивали флуоресцентным красителем DAPI. После этого
срезы заключали в N-пропилгаллат. Изучение и фотографирование препаратов
проводили на конфокальных микроскопах LSM 510 META и LSM 780 (Carl
Zeiss). Анализ полученных фотографий и подсчет меченых клеток проводили в
программе Zeiss LSM Image Browser (Carl Zeiss). Статистическую обработку
данных проводили в программе Microsoft Excel 2010. При этом производили
расчет стандартной ошибки среднего и вероятности ошибки.
2.3. Анализ транскриптомов
Ранее компанией Евроген (ЗАО Евроген) с использованием секвенатора
Illumina HiSeq (Illumina) были секвенированны транскриптомы зачатков АК и
кишки E. fraudatrix на 3, 5 и 7 сут регенерации. Результаты секвенирования
транскриптомов анализировали с помощью ресурсов www.ncbi.nim.nih.gov и
программ
Blast,
Mega,
Gene
Runner,
Ugene.
Идентифицированные
41
последовательности одного гена соединяли в более длинные, основываясь на
перекрываемых участках нуклеотидных последовательностей.
На основе полученных последовательностей транскриптов производили
дизайн праймеров, используя программу Primer Premier 5 (Premier Biosoft
International). Праймеры подбирались по следующим характеристикам: длина
20-23 нуклеотидов; температура отжига от 60оС до 65оС; содержание GC
45−50%; ∆G вторичных структур ≤ 3. Производили дизайн праймеров для ПЦР
и RACE двух видов: вырожденные праймеры на консервативные места для всех
генов
семейства
и
специфические
праймеры
на
уникальные
последовательности соответствующего гена. Подбирали 3−4 пары праймеров на
каждый ген (рис. 6). Также подбирали праймеры для qPCR, не образующих
вторичных структур и длиной продукта 150–200 пар оснований. Синтез
праймеров осуществлялся компанией Евроген (ЗАО Евроген).
2.4. Быстрая амплификация концов кДНК
Для быстрой амплификации концов кДНК (Rapid amplification of cDNA
ends, RACE) была использована смесь кДНК полученных из всех органов
интактных животных: АК, водные легкие, кишка, гонады, гиподерма и
целомический эпителий стенки тела (в дальнейшем – стенка тела) и
продольные мышечные ленты, а также зачатков АК и кишки через 3, 5, 7, 9, 12,
14, 20 сут после эвисцерации. Материал выдерживали в RNAlater solution
(Ambion) 1 сут при +4°С и затем хранили при -20°С.
Тотальную РНК выделяли с помощью экстракции с тризолом (TRI
reagent)
(MRC)
по
стандартной
методике.
Гомогенизация
материала
проводилась на аппарате Tissue Lyser LT (Qiagen). РНК хранили при -70°С.
Концентрацию РНК измеряли на Smart Spec Plus Spectrophotometer (BioRad).
Качество
получаемой
РНК
проверяли
с
помощью
горизонтального
электрофореза (см. главу 2.5). Затем выделенную РНК обрабатывали ДНКазой1
42
(ThermoScientific)
с
добавлением
ингибитора
РНКаз
RiboLock
(ThermoScientific).
Рис. 6. Карта праймеров для транскриптов генов wnt. Красные линии – кодирующая
последовательность транскрипта, синие линии – последовательности, полученные в
результате секвенирования транскриптомов. Стрелками обозначены праймеры. Wnt F, Wnt R
– вырожденные праймеры на консервативные места всех генов семейства. Wnt4 F, Wnt4 R,
WntА F, WntА R, Wnt6 F, Wnt6 R – специфичные праймеры на уникальные
последовательности генов.
Синтез одно- и двухцепочечной кДНК проводили с использованием
набора Mint (Evrogene) по стандартному протоколу, изначально использовав
1мкг РНК. В 10 мкл смеси для проведения реакции содержалось: 4,8 мкл miliQ,
полученной на Simplicity 185 (Milipore), 0,2 мкл 50x Encyclo polymerase
(Евроген), 1 мкл 10x Encyclo buffer (Евроген), 1 мкл 50x 50мкМ dNTP
(Evrogen), 1 мкл 5 мкМ Mix1/Mix2/Mix3 (Mint RACE primer set (Евроген)) и 1
мкл 5 мкМ специфичного/вырожденного праймера.
Для первого шага RACE использовали суммарную кДНК, разведенную в
отношении 1:20 в miliQ, адаптерные праймеры Mix1, вырожденные праймеры
на консервативные места и температуру отжига 55oС. Полученную ДНК
анализировали с помощью электрофореза и разводили в отношении 1:20 в miliQ
для следующего шага RACE. При этом использовали Mix2, специфичные
43
праймеры на уникальные последовательности и температуру отжига повышали
до 60oС. На последнем шаге RACE использовался праймеры Mix3 и
специфичные праймеры при температуре отжига 65oС.
После получения фрагмента нужной длины последний этап RACE
повторяли в 30 мкл, пропорционально увеличивая объем реагентов. В работе
использовали два амплификатора: C1000 Thermal Cycler (Bio Rad) и Tetrad 2
Pelter Thermal cycler (Bio Rad). Выделение из геля проводили с помощью набора
Silica Bead DNA Gel Extraction (ThermoScientific), при этом электрофорез
проводили в 0,8% геле. После выделения ДНК растворяли в 15 мкл miliQ.
Рассчет массы и изоэлектрической точки и моделирование структуры
белков
Wnt
были
проведены
с
использованием
ресурсов
сайта
http://www.expasy.org/.
2.5. Электрофорез ДНК
Горизонтальный электрофорез производился в 1,2% агарозном геле, при
этом использовали трис-ацетатный буфер (ТАЕ) и следующие параметры:
напряжение 4 В/см, время 30-40 минут. В качестве маркера длин использовали
Gene Ruler DNA Ladder Mix (Thermo Scientific), лидирующего краситель – 6х
DNA Loading Dye (Thermo Scientific). Гель окрашивали в растворе бромистого
этидия (Biotium) (0,5 мкг/мл) в течение 15 минут. Затем производили анализ
геля с помощью трансиллюминатора ChemiDoc XRS+ (BioRad) и пакета
программ ImageLab.
2.6. Лигирование и трансформирование
Лигирование выделенных фрагментов в плазмидный вектор pTZS7R/T
ThermoScientific) проводили в растворе, содержащем 1 мкл T4 DNA Ligase
(ThermoScientific), 1 мкл 10x Ligase Buffer (ThermoScientific), 0,5−1 мкл Vector,
4-6 мкл выделенного фрагмента. Общий объем смеси составлял 10 мкл. Данную
смесь оставляли на ночь при +22°C. Утром останавливали реакцию
44
прогреванием при +70°C в течение 5 мин.
Для приготовления компетентных клеток готовили среды SOC и LB,
используя бактотриптон (Applichem), дрожевой экстракт (Applichem), агар
(Helicon). После автоклавирования в среду LB добавляли ампициллин (ОАО
Дальхимфарм), xGal (Thermo Scientific), IPTG dioxane free (Thermo Scientific).
Готовую среду заливали в пластиковые чашки Петри и после застывания
хранили при +4°C. Для трансформирования вектора в компетентные клетки
готовили электрокомпетентные клетки штамма Top10, после чего разливали
аликвоты по 40 мкл.
Электропорацию компетентных клеток проводили на электропораторе
(Eppendorf) при параметрах тока 1700 В/см 5 млс в 1 мм кюветах Electroporation
cuvette 1mm gap 100μl (Eppendorf). Посев клеток производился на чашки со
средой LB, содержащей ампициллин, xGal и IPTG для селекции клеток,
содержащих вставку.
Наличие вставки проверяли с помощью ПЦР, проводимой в 10 мкл смеси
с праймерами на вектор P001 (3,2 мкМ) и P007 (3,2 мкМ). Колонии со вставкой
переносились на наращивание в новую чашку со средой. Использовали лизат
клеток одного клона в качестве матрицы для ПЦР в 30 мкл смеси.
Детекцию
продукта
проводили
с
помощью
горизонтального
электрофореза (см. главу 2.5.). Далее проводили чистку из PCR смеси,
аналогично выделению из геля (см. главу 2.4.). Измеряли концентрацию
полученного фрагмента на Smart Spec Plus Spectrophotometer (BioRad).
2.7. Секвенальная реакция
Секвенальную реакцию проводили с использованием: 1,5 мкл Big Dye
Terminator v 3.1 cycle Sequencing kit (Applied biosystems), 1,2 мкл Big Dye
Terminator v 1.1 v 3.1 5x Sequencing buffer (Applied biosystems), 0,8 мкл
праймера, 1-4 мкл полученного фрагмента, после чего доводили водой miliQ до
10 мкл. Использовали следующую программу амплификатора: этап 1 − 1 мин
45
при 95oС, этап 2 − 10 сек при 96oС, этап 3 − 5 сек при 50oС, этап 4 − 4 мин при
60oС. Этапы 2-4 повторяли 35 циклов.
Чистку фрагментов ДНК после секвенальной реакции проводили 96% и
70%
этанолом,
используя
в
качестве
соосадителя
50мМ
этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) (Thermo Scientific). Полученые
сухие образцы растворяли в формамиде. Секвенирование проводилось на
Genetic Analyser 3130(Applied biosystems).
2.8. Филогения
Полученные полные последовательности генов анализировались с
помощью программы Mega5.1. После выравнивания аминокислотных и
нуклеотидных последовательностей найденных генов и их гомологов у других
животных, производили построение филогенетических деревьев с помощью
метода Neighbort-Joining tree. Расчет производился как по аминокислотной, так
и по нуклеотидной последовательностям. Также просчитывалось количество
аминокислотных замен между родственными животными.
2.9. Локализация экспрессии
Для анализа экспрессии генов у интактных животных использовали
гонаду, водное легкое, кишку, продольные мышечные ленты, стенку тела, АК и
клоаку. При регенерации исследовали органы передней части голотурии
(зачаток АК и передний зачаток кишки), обозначаемые далее как передний
зачаток (ПЗ), а также задний регенерат кишки (задний зачаток, ЗЗ). Синтез
одноцепочечной кДНК проводили с помощью набора MMLV RT kit (Евроген).
Для синтеза первой цепи брали 1 мкг РНК. Измеряли концентрацию
полученной кДНК. ПЦР проводили с использованием прямых и обратных
геноспецифичных праймеров (рис. 6) в 10 мкл смеси.
Полученный продукт анализировали с помощью электрофореза с
параметрами, описанными ранее (см. главу 2.5.).
46
2.10. ПЦР в реальном времени
Для анализа динамики активности генов использовали неповрежденные
АК и зачаток АК и кишки через 3, 5, 7, 10, 14 и 20 сут после эвисцерации. На
каждую стадию регенерации и в норме брали по 3 особи. Материал хранили в
RNAlater solution (Ambion) при -20oС.
Далее проводили выделение РНК как описано выше (см. главу 2.4.).
Обрабатывали ДНКазой (ThermoScientific) и ингибитором РНКаз RiboLock
(ThermoScientific). Затем осуществляли синтез первой цепи кДНК идентично
таковому для ПЦР (см. главу 2.9.).
ПЦР в реальном времени (qPCR) проводили в 20 мкл смеси, состоящей из
9,8 мкл miliQ, 2 мкл 10х PCR буфера Б (Синтол), 2 мкл 2,5 мМ дНТФ (Синтол),
1 мкл 25 mM MgCl2 (Синтол), 0,2 мкл Syn Taq ДНК-полимеразы (Синтол) и 2
мкл 5 мкМ специфичного праймера. В работе использовался С1000 Thermal
Cycler с CFX RT-System (Bio Rad). При этом использовали следующую
программу амплификации - этап 1 − 1 мин при 95oС, этап 2 − 10 сек при 96oС,
этап 3 − 30 сек при 63oС, этап 4 − 10 сек при 72oС. Этапы 2−4 повторяли 35
циклов, после чего строили кривую плавления продукта, увеличивая
температуру денатурации с 60 oС до 95oС на 0,5oС. Результаты обрабатывались
с помощью программ Bio-Rad CFX Manager 2.1 и Microsoft Excel.
Для
определения
оптимальной
температуры
работы
праймеров
проводили градиентную ПЦР с температурами отжига праймеров 60−65°С.
Также
анализировали
эффективность
работы
праймеров
различных
концентраций. Оптимум разведения кДНК определяли с помощью серий
двукратных разведений. В работе использовали праймеры с эффективностью
95-105%, учитывая показатель эффективности при расчетах.
Для проверки загрязнения РНК при выделении проводили qPCR
используя в качестве матрицы тотальную мРНК. Дополнительно проверяли
наличие и качество продукта с помощью электрофореза.
47
При проведении ПЦР в реальном времени делали по 3 повтора каждой
пробы. В качестве отрицательного контроля использовали ту же смесь, но без
кДНК. В качестве положительного контроля – наработанный ПЦР фрагмент. В
качестве референсного гена использовали актин. При этом праймеры были
получены на специфичную последовательность актина E. fraudatrix.
Расчет производили по следующим формулам:
Относительный уровень экспрессии = 2-ΔΔСт+ S
где стандартное отклонение S = (S12 +S22)1/2
S1 – стандартное отклонение актина
S2 – стандартное отклонение исследуемого гена
ΔΔСт = ΔСт образца регенерации - ΔСт нормы
ΔСт = Ст исследуемого гена / E - Ст актина / E
где Ст – среднее значение цикла достижения порогового уровня
накопления флуоресценции (100 относительных единиц флуоресценции), E –
эффективноть пары праймеров.
48
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Распределение белка Wnt5 в тканях E. fraudatrix в норме
Идентифицированные ранее белковые фрагменты Wnt5 имели длину 17 и
22 а.о. Первая последовательность, TCWLQLSPFNRVGSILK, полностью
идентична Wnt5 морского ежа Heliocidaris erythrogramma и на 94% идентична
Wnt5 морских ежей S. purpuratus и Lytechinus variegatus. Первая часть этой
последовательности, TCW, свойственна всем белкам семейства Wnt, остальной
фрагмент характерен именно для Wnt5. Второй белковый фрагмент –
TSMGTNGSTLMCCGRGYNSFTK имеет такие же параметры гомологии,
однако содержит два консервативных для белков семейства Wnt участка – TS и
CCGRG. Поскольку первый фрагмент оказался более специфичным для белков
Wnt5, было решено заказать искусственный полипептид именно с такой
аминокислотной последовательностью. Поликлональные антитела к этому
полипептиду будут специфически выявлять в тканях белок Wnt5.
С помощью полученных антител было показано, что у неповрежденных
голотурий клетки, содержавшие продукты гена wnt5, встречались редко.
Одиночные
Wnt5-положительные
клетки
присутствовали
только
в
соединительной ткани стенки тела (гиподерме) (рис. 7, 8А, Б) и в
эктонейральной части радиальных нервных тяжей (рис. 7, 9А, Б). Белок Wnt5 в
виде характерных мелких гранул равномерно распределялся по всей
цитоплазме. В соединительной ткани клетки имели округлую форму, не
образовывали отростки (рис. 8Б) и располагались преимущественно на внешней
границе гиподермы. В нервных тяжах одиночные Wnt5-положительные клетки
располагались по периферии эктонейральной части радиальных нервов (рис.
9А, Б). Они имели длинные отростки, уходившие во внутреннюю часть тяжа.
Кроме того, единичные клетки с меткой были выявлены в целоме (рис. 8А).
49
Рис. 7. Изменение количества Wnt5-положительных клеток в радиальных нервах и
соединительной ткани у голотурии E. fraudatrix при регенерации. Данные представлены как
среднее значение ± SE (N = 9). Звездочкой обозначены статистически достоверные
изменения (P<0,05).
А
А
Б
Рис. 8. Wnt5-положительные клетки у неповрежденных особей E. fraudatrix. А – меченые
клетки в целоме и гиподерме (стрелки). Б – округлая клетка с Wnt5 в гиподерме при
большем увеличении. АТ (Wnt5) (зелёная флуоресценция) и ядерной ДНК DAPI (синяя
флуоресценция). Масштаб – 10 мкм.
50
А
Эн
Б
Гн
А
Эн
Рис. 9. Wnt5-положительные клетки в радиальном нервном тяже у неповрежденных особей
E. fraudatrix. А – общий вид радиального нервного тяжа. В – эктонейральная часть
радиального нервного тяжа. АТ (Wnt5) (зелёная флуоресценция) и ядерной ДНК DAPI
(синяя флуоресценция). Стрелками отмечены клетки с Wnt5. Гн – гипонейральная часть
нервного тяжа, Эн – эктонейральная часть нервного тяжа. Масштаб – 50 мкм.
3.2. Распределение белка Wnt5 в тканях E. fraudatrix в процессе регенерации
после эвисцерации.
Через 3-5 сут после эвисцерации число меченых клеток у голотурий
возрастало (рис. 7). В соединительной ткани они образовывали небольшие
скопления (рис. 10). По форме эти клетки отличались от таковых в норме:
клетки удлинялись, у них появлялись отростки (рис. 11). Белок Wnt5
присутствовал также в цитоплазме некоторых амебоцитов, находящихся в
полостях органов амбулакральной системы (рис. 12). В неповрежденной части
нервных тяжей антителами окрашивались почти все клетки периферии
эктонейральной части радиального нерва (рис. 13). Кроме того, белок Wnt5
выявлялся и в растущих концах радиальных нервных тяжей, расположенных в
зачатке АК (рис. 14). Достаточно интенсивная метка была обнаружена в
апикальной части клеток целомического эпителия интеррадиусов стенки тела
(рис. 15). В других органах, таких как продольные мышечные ленты и
кишечный мезентерий, Wnt5-положительные клетки отсутствовали.
51
Рис. 10. Скопление клеток с Wnt5 в стенке тела E. fraudatrix через 3 сут после
эвисцерации. АТ (Wnt5) (зелёная флуоресценция) и ядерной ДНК DAPI (синяя
флуоресценция). Масштаб – 50 мкм.
Рис. 11. Меченая клетка с отростком в гиподерме E. fraudatrix через 3 сут после
эвисцерации. АТ (Wnt5) (зелёная флуоресценция) и ядерной ДНК DAPI (синяя
флуоресценция). Масштаб – 10 мкм.
52
Рис. 12. Целомоциты с Wnt5 в ампулах амбулакральных ножек E. fraudatrix через 3 сут после
эвисцерации. АТ (Wnt5) (зелёная флуоресценция) и ядерной ДНК DAPI (синяя
флуоресценция). Масштаб – 10 мкм.
А
Б
Гн
Эн
Эн
Рис. 13. Меченые клетки с отростками в радиальных нервных тяжах E. fraudatrix через 3 сут
после эвисцерации. А – общий вид радиального нерва, Б – меченые клетки на периферии
эктонейральной части радиального нерва. АТ (Wnt5) (зелёная флуоресценция) и ядерной
ДНК DAPI (синяя флуоресценция). Гн – гипонейральная часть нервного тяжа, Эн –
эктонейральная часть нервного тяжа. Масштаб – 50 мкм.
53
Рис. 14. Меченые клетки в нерве зачатка АК E. fraudatrix, на 3 сут регенерации, АТ (Wnt5)
(зелёная флуоресценция) и ядерной ДНК DAPI (синяя флуоресценция). Масштаб – 50мкм.
Рис. 15. Клетки с Wnt5 в целомическом эпителии интеррадиуса E. fraudatrix через 3 сут
после эвисцерации. АТ (Wnt5) (зелёная флуоресценция) и ядерной ДНК DAPI (синяя
флуоресценция). Масштаб – 50 мкм.
Через 6-7 сут после эвисцерации мезентерий, на котором формируется
зачаток кишки, содержал многочисленные отростки клеток, маркировавшиеся
антителами к Wnt5 (рис. 16). Отростки находились в средней части
целомического
эпителия
базиэпителиального
и,
вероятно,
нервного
плексуса.
представляли
В
самом
собой
зачатке
аксоны
кишки
и
54
покрывающем его целомическом эпителии Wnt5-положительные клетки
отсутствовали.
Относительное число Wnt5-положительных клеток в соединительной
ткани на данной стадии регенерации увеличивалось до 11±2,3% (рис. 7). Они
встречались не только в гиподерме стенки тела, но и во внутренних областях
зачатка АК, где были представлены как отдельными клетками, так и достаточно
крупными скоплениями (рис. 17). В этот период возрастает активность
экспрессии исследуемого гена и в нервной системе. Белок Wnt5 выявляется в
большинстве клеток эктонейральной части нервного тяжа и в отдельных
нейронах гипонейральной части (рис. 18). Относительное число меченых
клеток составляло 13,5±0,4% (рис. 7). В растущих концах радиальных нервных
тяжей, расположенных в зачатке АК, присутствовали единичные меченые
клетки.
Рис. 16. Клеточные отростки с Wnt5 в мезентерии E. fraudatrix через 7 сут после
эвисцерации. АТ (Wnt5) (зелёная флуоресценция) и ядерной ДНК DAPI (синяя
флуоресценция). Стрелками отмечены клетки с Wnt5. Масштаб – 50 мкм.
55
Рис. 17. Wnt5-положительные клетки в зачатке АК E. fraudatrix через 7 сут после
эвисцерации. АТ (Wnt5) (зелёная флуоресценция) и ядерной ДНК DAPI (синяя
флуоресценция). Масштаб – 50 мкм.
Эн
Гн
Рис. 18. Wnt5-положительные клетки в радиальных нервом тяже E. fraudatrix через 7 сут
после эвисцерации. АТ (Wnt5) (зелёная флуоресценция) и ядерной ДНК DAPI (синяя
флуоресценция). Гн – гипонейральная часть нервного тяжа, Эн – эктонейральная часть
нервного тяжа. Стрелками обозначены меченые клетки в гипонейральной части. Масштаб –
50 мкм.
Через 10-14 сут после эвисцерации характер распределения Wnt5положительных клеток в тканях голотурии сохранялся. Как и на предыдущей
стадии белок Wnt5 присутствовал в клетках соединительной и нервной ткани, в
56
амебоцитах и апикальной части перитонеоцитов целомического эпителия
интеррадиусов стенки тела. При этом число меченых клеток в радиальном
нервном тяже и гиподерме по сравнению с предыдущей стадией увеличилось и
достигло своих максимальных значений, 29% и 17% соответственно (рис. 7, 19,
20).
Рис. 19. Скопление клеток с Wnt5 в гиподерме E. fraudatrix через 14 сут после
эвисцерации. АТ (Wnt5) (зелёная флуоресценция) и ядерной ДНК DAPI (синяя
флуоресценция). Масштаб – 50 мкм.
Рис. 20. Wnt5-положительные клетки в радиальном нервном тяже E. fraudatrix через 14 сут
после эвисцерации. АТ (Wnt-5) (зелёная флуоресценция) и ядерной ДНК DAPI (синяя
флуоресценция). Масштаб – 50 мкм.
57
В дальнейшем, через 24 сут после эвисцерации, белок Wnt5 выявлялся
лишь в нервах стенки тела и редких эллипсовидных клетках в гиподерме. Такое
распределение меченых клеток близко к норме. Также уменьшается и число
Wnt5-положительных клеток (рис. 7, 21).
Рис. 21. Wnt5-положительные клетки в радиальном нервном тяже E. fraudatrix через 24 сут
после эвисцерации. АТ (Wnt-5) (зелёная флуоресценция) и ядерной ДНК DAPI (синяя
флуоресценция). Масштаб – 50 мкм.
3.3. Биоинформационный анализ транскриптов генов сигнального пути Wnt,
имеющихся в транскриптомах регенерирующих органов E. fraudatrix
Анализ транскриптомов регенерирующих органов E. fraudatrix выявил
наличие фрагментов транскриптов генов семейств Wnt и frizzled, а также генов
β-catenin и dishevelled. Экспрессия генов сигнального пути Wnt зависела от
стадии регенерации. Продукты генов семейства Wnt были обнаружены только
на 5 и 7 сут регенерации. Всего был идентифицирован 21 контиг,
представляющий фрагменты транскриптов этих генов. Данные контиги имели
высокую гомологию с генами wntA, wnt4 и wnt6 морского ежа S. purpuratus.
Анализ
нуклеотидных
последовательностей
показал,
что
фрагменты
идентифицированных генов E. fraudatrix имеют только 45-55% гомологию с
соответствующими генами S. purpuratus. Дальнейшее выравнивание данных
контигов, с последующим объединением, позволила получить более длинные
58
последовательности длиной 280 нуклеотидов (wnt4), 134 нуклеотида (wntА) и
245 нуклеотидов (wnt6).
Транскрипты β-catenin были обнаружены на ранних этапах регенерации
(3 и 5 сут после эвисцерации). В результате выравнивания имеющихся контигов
были получены два неперекрывающихся фрагмента длиной 832 и 631
нуклеотид. С помощью ПЦР был получен и отсеквенирован фрагмент длиной
600 нуклеотидов, тем самым было подтверждено наличие экспрессии β-catenin
при регенерации у E. fraudatrix. Полученный фрагмент на 81% гомологичен βcatenin
морских
ежей
L.
variegatus
(U34814.1)
и
S.
purpuratus
(NM_001032371.2).
В транскриптомах зачатков на 3, 5 и 7 сут регенерации были обнаружены
в общей сложности 27 фрагментов транскрипта гена dishevelled. Общая длина
суммарного
фрагмента
составила
717
нуклеотидов.
Предполагаемая
аминокислотная последовательность этого фрагмента имеет гомологию
с
dishevelled S. kowalevskii (NM_001165021.1) – 76% и с dishevelled L. variegatus
(AY624074.1)
–
74%.
При
этом
у
предполагаемой
аминокислотной
последовательности были обнаружены домены: DIX домен, ответственный за
гомо- и гетеро-олигомеризацию белка axin и Dishevelled specific домен.
Также были обнаружены транскрипты трех рецепторов семейства Frizzled
– frizzled1/2/7, frizzled4, frizzled5/8. Транскрипты frizzled4 были найдены только
в транскриптоме зачатков на 3 сут регенерации. Суммарный фрагмент
транскрипта
имел
длину
302
нуклеотида.
Наибольшая
гомология
аминокислотной последовательности наблюдалась с frizzled4-like S. purpuratus
(XM_003727098.1) – 82%, frizzled4 P. lividus (JN712907.1) – 81%, frizzled4-like S.
kowalevskii (XM_002730449.2) – 71%.
Для frizzled5/8 были получены 2 неперекрывающихся фрагмента длиной
376 и 416 нуклеотидов из транскриптомов зачатков на 3 и 5 сут регенерации.
Первый
фрагмент
(NM_001168075.1)
гомологичен
и
на
75%
на
80%
frizzled5-like
frizzled5/8
S.
Ornythorhynchus
kowalevskii
anatinus
59
(XM_001520775.3). Второй фрагмент имеет 49% сходство с frizzled5-like S.
purpuratus
(XM_775994.3)
и
40%
с
frizzled5
Poecilia
reticulata
(XM_008429625.1).
Экспрессия гена frizzled1/2/7 была обнаружена на всех анализируемых
стадиях. Суммарная длина полученного фрагмента составила 697 нуклеотидов.
Этот фрагмент имел наибольшее сходство с frizzled receptor1/2/7 Ptychodera
flava (HQ291267.1) – 63%, frizzled7 P. lividus (HQ322502.1) – 62%, frizzled-1-like
S.
purpuratus
(XM_003724513.1)
–
62%,
frizzled1
S.
kowalevskii
(XM_006820088.1) – 62%. Данный фрагмент кодирует аминокислотную
последовательность региона связывания с мембраной (pfam01534).
Дополнительно нам удалось проанализировать активность frizzled1/2/7 \в
процессе регенерации ПЗ. Было установлено, что экспрессия данного гена
происходит на всех сроках регенерации АК и передней части кишки (3, 5, 7, 10,
14 сут) и во всех исследованных органах в норме (рис. 22). При регенерации ЗЗ
транскрипты frizzled1/2/7 отсутствовали на 7 и 14 сут (рис. 22).
С
помощью
qPCR
также
было
показано,
что
ген
frizzled1/2/7
экспрессируется в норме и на всех стадиях регенерации АК E. fraudatrix (рис.
23). На 3 сут после эвисцерации количество транскриптов достоверно
снижается относительно нормы, далее происходит увеличение уровня
экспрессии, который достигает максимума на 7 сут. На 10 сут после
эвисцерации активность frizzled1/2/7 вновь уменьшается и остается ниже нормы
до конца регенерации.
60
Рис. 22. Экспрессия гена frizzled1/2/7 в норме и при регенерации у E. fraudatrix. M – маркер,
1 – ПЗ на 3 сут регенерации, 2 – ПЗ на 5 сут регенерации, 3 – ПЗ на 7 сут регенерации, 4 – ПЗ
на 10 сут регенерации, 5 – ПЗ на 14 сут регенерации, 6 – интактная кишка, 7 – интактная
стенка тела, 8 – интактная мышца, 9 – интактная гонада, 10 – ЗЗ на 3 сут регенерации, 11 – ЗЗ
на 5 сут регенерации, 12 – ЗЗ на 7 сут регенерации, 13 – ЗЗ на 10 сут регенерации, 14 – ЗЗ на
14 сут регенерации, 15 – клоака и задняя чать кишки в норме , 16 – интактный АК.
Рис. 23. Относительный уровень экспрессии гена frizzled1/2/7 при регенерации
аквафарингеального комплекса и переднего зачатка кишки у E. fraudatrix. Значения
нормализованы по референсному гену - актину. Данные представлены как среднее значение
± SE (N = 9). Значения нормы приняты в качестве 1. Звездочкой обозначены статистически
достоверные изменения (P<0.05).
61
3.4. Экспрессия гена wntA в норме регенерации E. fraudatrix
Фрагменты транскриптов гена wntA были найдены в транскриптоме
зачатков АК и кишки только на 5 сут регенерации. С помощью ПЦР было
показано, что в передней части голотурии данный ген экспрессируется на всех
исследуемых сроках регенерации. В ЗЗ активность wntА наблюдалась только на
поздних сроках восстановления, начиная с 10 сут после эвисцерации (рис. 24).
Также было показано, что в норме данный ген активен в водных легких, гонаде,
кишке и стенке тела (рис. 25). Экспрессия не была обнаружена лишь в мышцах.
Рис. 24. Экспрессия генов семейства Wnt в заднем зачатке кишки на разных сроках
регенерации у E. fraudatrix.
Рис. 25. Экспрессия генов семейства Wnt в различных органах E. fraudatrix в норме.
В результате последовательных этапов RACE были секвенированны
концевые участки гена. Однако при этом вместо одного было получено 3
фрагмента разной длины, отличающихся приблизительно на 150 нуклеотидов
(рис. 26). После секвенирования было установлено, что транскрипты
отличаются длиной нуклеотидных последовательностей 3’- и 5’-концевых
нетранслируемых областей. Таким образом, существует несколько вариантов
62
транскриптов гена wntA с одинаковой кодирующей областью, но разными
нетранслируемыми участками.
Кодирующая
последовательность
гена
wntA
имеет
длину
1035
нуклеотидов. Она соответствует аминокислотной последовательности в 345 а.о.
включающей начальный метионин и стоп-кодон (рис. 26, 27). Предполагаемая
масса белка составляет 36 кДа, теоретическая изоэлектрическая точка 8,5. В
составе молекулы имеются 24 остатка цистеина в высоко консервативных
местах
(рис.
26,
последовательности,
27).
Консервативный
характерный
для
участок
всех
генов
аминокислотной
wnt
имеет
две
аминокислотные замены CKCYGVSASC.
Филогенетический анализ данной последовательности показывает, что
wntA E. fraudatrix принадлежит к группе генов WntA, которая включает
гомологичные гены многих многоклеточных животных, от гидроидных
полипов до асцидий (рис. 28). Наибольшая гомология наблюдается с wnt4 S.
purpuratus (XP_797603.1) – 56%, wntA P. lividus (KJ000376.1) – 56% и wntA S.
kowalevskii (NM001171247.1) – 47% (рис 27, 28). При этом наиболее сходными
оказываются участки рядом с остатками цистеина (рис. 27).
Для анализа относительного
уровня
экспрессии гена
wntA при
регенерации внутренних органов E. fraudatrix была проведена qPCR. РНК,
выделяемая с помощью экстракции тризолом, не содержала примеси ДНК (рис.
29). При проведении опыта был получен один пик на кривой плавления – 86°C,
означающий специфичное накопление продукта. Кроме того, результат
дополнительно проверялся с помощью электрофореза, где также был выявлен
лишь специфичный продукт ожидаемой длины – 180 нуклеотидов (рис. 30).
Показано, что уже через 3 сут после эвисцерации уровень экспрессии
увеличивается по сравнению с нормой более чем в 5 раз (рис. 31). Активность
wntA достигает максимума на 7 сут регенерации, при этом относительный
уровень экспрессии превышает норму более чем в 10 раз. В дальнейшем, на 1020 сут активность гена снижается, но остается достоверно выше уровня нормы.
63
Рис. 26. Нуклеотидная последовательность кодирующей части гена wntA E. fraudatrix (1035
нуклеотидов), выравненная с предполагаемой аминокислотной последовательностью. Стопкодон отмечен звездочкой. Консервативный домен выделен серым цветом. Кругами
обведены 24 остатка цистеина в консервативных местах.
64
Рис. 27. Выравнивание предполагаемых аминокислотных последовательностей белков WntA
E. fraudatrix и других животных. Выравнивание произведено с помощью ClustalW. Серым
отмечены регионы идентичности а.о. Для сравнения были взяты следующие
последовательности: Strongylocentrotus purpuratus Wnt-4-like (XP797603.1), Saccoglossus
kowalevskii WntA (NP001164718.1), Aplysia californica Wnt5a-like (XP005092048.1), Platyneris
dumerilii WntA (AJ 491801.2), Nematostella vectensis WntA (AY534532.1). Стоп-кодон отмечен
звездочкой.
65
Рис. 28. Филогенетическое древо транскриптов wntA различных животных, построенное с
помощью метода «Neighbor-Joining». Безкорневое филогенетическое дерево было
сгенерировано с использованием метода дистанций последовательностей «Neighbor-Joining»,
используя выравнивание с помощью Clustal X. Масштаб показывает эволюционное
расстояние, соответствующее 10 заменам на каждые 100 аминокислот. Цифрами показана
достоверность ветвления 100 альтернативных деревьев с помощью bootstrap-анализа. Для
анализа использованы последовательности Strongylocentrotus purpuratus wnt-4-like
(XP_797603.1), Saccoglossus kowalevskii wntA (NP001164718.1), Aplysia californica wnt5a-like
(XP_005092048.1), Platyneris dumerilii wntA (AJ491801.2), Nematostella vectensis wntA
(AY534532.1), Paracentrotus lividus wntA (KJ000376.1)
28S
18S
Рис. 29. Тотальная РНК E. fraudatrix, выделенная с помощью экстракции тризолом.
Одинаковая интенсивность свечения 28s рРНК и 18s рРНК, а также присутствие
дополнительных полос, свидетельствует о сохранности РНК.
66
Рис. 30. Фрагменты транскрипта wntA E. fraudatrix, амплифицированные в результате qPCR.
Отсутствие дополнительных полос свидетельствует о специфическом связывании праймеров
Рис. 31. Относительный уровень экспрессии гена wntA при регенерации аквафарингеального
комплекса и переднего зачатка кишки у E. fraudatrix. Значения нормализованы по
референсному гену - актину. Данные представлены как среднее значение ± SE (N = 9).
Значения нормы приняты в качестве 1. Звездочкой обозначены статистически достоверные
изменения (P<0,05).
3.5. Экспрессия гена wnt4 в норме и регенерации E. fraudatrix
Фрагменты транскриптов гена wnt4 обнаружены в транскриптоме
зачатков на 7 сут регенерации. Длина суммарного полученного фрагмента
составила 325 нуклеотидов. С помощью аналитической ПЦР было показано,
67
что данный ген экспрессируется в норме и на всех изученных сроках
регенерации, как в передней, так и задней частях голотурии (рис. 24). У
неповрежденных животных активность wnt4 обнаружена в мышцах, стенке
тела, гонадах, АК, водных легких и кишке (рис. 25). После проведения RACE
была определена полная кодирующая последовательность гена. Как и в случае с
геном wntA, у wnt4 имеются варианты транскриптов разной длины,
отличающиеся некодируемой областью.
Кодирующая
последовательность
гена
wnt4
имеет
длину
1077
нуклеотидов, ей соответствует аминокислотная последовательность в 359 а.о.,
включающая начальный метионин и стоп-кодон (рис. 32, 33) Предполагаемая
масса белка составляет 35 кДа, теоретическая изоэлектрическая точка – 8,3.
Имеются 24 остатка цистеина в высоко консервативных местах (рис. 32, 33).
Консервативный
участок
аминокислотной
последовательности,
CKCHGVSGSC, характерный для всех генов семейства Wnt, не имеет
аминокислотных замен.
Филогенетический анализ wnt4 голотурии E. fraudatrix показал, что
данный ген имеет большую гомологию с wnt4 P. lividus (AHY22359.1) – 69%, c
wnt4 S. kowalevskii (XP002737259.1) – 63% и 63-65% сходства с wnt4
млекопитающих (рис. 33, 34).
С помощью метода qPCR было показано, что уровень экспрессии wnt4 в
органах
неповрежденных
животных
относительно
невысок
(рис.
35).
Повреждающее воздействие вызывает, видимо, быструю активацию wnt4,
поскольку уже через 3 сут после эвисцерации уровень экспрессии достигает
своих максимальных значений за весь период регенерации (рис. 35). Далее на 5
сут активность гена уменьшается и вновь достоверно увеличивается на 7 сут. С
10 по 20 сут уровень экспрессии снижается, но остается достоверно выше
нормы.
68
Рис. 32. Нуклеотидная последовательность кодирующей части гена wnt4 E. fraudatrix (1077
нуклеотидов), выравненная с предполагаемой аминокислотной последовательностью. Стопкодон отмечен звездочкой. Консервативный домен выделен серым цветом. Кругами
обведены 24 остатка цистеина в консервативных местах.
69
Рис. 33. Выравнивание предполагаемых аминокислотных последовательностей белков Wnt4
E.fraudatrix и других животных. Выравнивание произведено с помощью ClustalW. Серым
отмечены регионы идентичности а.о. Для сравнения были взяты следующие
последовательности: Paracentrotus lividus Wnt4 (AHY22359.1), Danio rerio Wnt4
(AAA96518.1), Glandirana rugosa Wnt4 (BAE16611.1), Branchiostoma floridae
Wnt4
(XP002613927.1), Perionyx excavatus Wnt4a (GU938465.1), Nematostella vectensis Wnt4
(AY687348.1). Стоп-кодон отмечен звездочкой.
70
Рис. 34. Филогенетическое древо транскриптов wnt4 различных животных, построенное с
помощью метода «Neighbor-Joining». Безкорневое филогенетическое дерево было
сгенерировано с использованием метода дистанций последовательностей «Neighbor-Joining»,
выравнивание проведено с помощью Clustal X. Масштаб показывает эволюционное
расстояние, соответствующее 5 заменам на каждые 100 аминокислот. Цифрами показана
достоверность ветвления 100 альтернативных деревьев с помощью bootstrap-анализа. Для
анализа использованы последовательности Xenopus laevis wnt4 (NM_001087728.1), Mus
musculus wnt4 (NM_009523.2), Paracentrotus lividus wnt4 (AHY22359.1), Danio rerio wnt4b
(AF139536.1), Danio rerio wnt4a (NM_001040387.1), Glandirana rugosa wnt4 (BAE16611.1),
Branchiostoma floridae wnt4 (XP002613927.1), Perionyx excavatus wnt4a (GU938465.1),
Nematostella vectensis wnt4 (AY687348.1).
71
Рис. 35. Относительный уровень экспрессии гена wnt4 при регенерации аквафарингеального
комплекса и переднего зачатка кишки у E. fraudatrix. Значения нормализованы по актину.
Данные представлены как среднее значение ± SE (N = 9). Значения нормы приняты в
качестве 1. Звездочкой обозначены статистически достоверные изменения (P<0,05).
3.6. Экспрессия гена wnt6 в норме и регенерации E. fraudatrix
Фрагменты транскриптов гена wnt6 обнаружены в транскриптоме зачатка
на 5 сут регенерации. Длина суммарного полученного фрагмента составила 325
нуклеотидов. С помощью аналитической ПЦР экспрессия wnt6 была выявлена
на 7 сут регенерации как в ПЗ так и в ЗЗ (рис. 24). Установлено, что в норме
экспрессия wnt6 происходит в мышцах, гонадах, водных лёгких и кишке (рис.
25). После проведения RACE была определена полная последовательность
кодирующей части гена wnt6. Как и у других wnt E. fraudatrix, имелись
транскрипты разной длины.
Кодирующая
последовательность
гена
wnt6
имеет
длину
1077
нуклеотидов, ей соответствовала аминокислотная последовательность в 359 а.о.
включающая начальный метионин и стоп-кодон (рис. 36, 37). Предполагаемая
масса белка составляет 35 кДа, теоретическая изоэлектрическая точка – 8,5.
72
Имеются 24 остатка цистеина в высоко консервативных местах (рис. 36, 37).
Консервативный участок аминокислотной последовательности, CKCHGLSGSC,
имеет одну аминокислотную замену. Остаток валина заменен на остаток
лейцина.
Транскрипт wnt6 имеет наибольшее сходство c wnt6 голотурии A.
japonicus (AGA62464.1) – 71%. С wnt6 морских ежей S. purpuratus и P. lividus
сходство немного ниже – 62%, а позвоночных (D. rerio, X. laevis) еще меньше –
55% (рис. 37, 38).
Было показано, что в норме у голотурии E. fraudatrix имеется небольшое
количество транскриптов wnt6 (рис. 39). На начальных этапах регенерации это
количество остается неизменным. На 7 сут регенерации происходит резкое
возрастание экспрессии гена wnt6. К 10 сут количество транскриптов вновь
возвращается к уровню нормы и в дальнейшем не подвергается значительным
изменениям.
73
Рис. 36. Нуклеотидная последовательность кодирующей части гена wnt6 E. fraudatrix (1077
нуклеотидов), выравненная с предполагаемой аминокислотной последовательностью. Стопкодон отмечен звездочкой. Консервативный домен выделен серым цветом. Кругами
обведены 24 остатка цистеина в консервативных местах.
74
Рис. 37. Выравнивание предполагаемых аминокислотных последовательностей белков Wnt6
E. fraudatrix и других животных. Выравнивание произведено с помощью ClustalW. Серым
отмечены регионы идентичности а.о. Для сравнения были взяты следующие
последовательности: Strongylocentrotus purpuratus Wnt6 (XM_784984.3), Xenopus laevis Wnt6
(EU_332159.1), Danio rerio Wnt6 (XP_003199189.2), Mus musculus Wnt6 (NM_009526.3),
Paracentrotus lividus Wnt6 (HQ322504.1), Eucidaris tribuloides Wnt6 (AHY23956.1). Стопкодон отмечен звездочкой.
75
Рис. 38. Филогенетическое древо транскриптов wnt6 различных животных, построенное с
помощью метода «Neighbor-Joining». Безкорневое филогенетическое дерево было
сгенерировано с использованием метода дистанций последовательностей «Neighbor-Joining»,
выравнивание проведено с помощью Clustal X. Масштаб показывает эволюционное
расстояние, соответствующее 5 заменам на каждые 100 аминокислот. Цифрами показана
достоверность ветвления 100 альтернативных деревьев с помощью bootstrap-анализа. Для
анализа
использованы
последовательности
Strongylocentrotus
purpuratus
wnt6
(XM_784984.3), Xenopus laevis wnt6 (EU_332159.1), Danio rerio wnt6 (XP_003199189.2), Mus
musculus wnt6 (NM_009526.3), Paracentrotus lividus wnt6 (HQ322504.1), Eucidaris tribuloides
wnt6 (AHY23956.1), Nematostella vectensis wnt6 (AY725203.1), Saccoglossus kowalevskii wnt6
(GU076160.1).
76
Рис. 39. Относительный уровень экспрессии гена wnt6 при регенерации аквафарингеального
комплекса и переднего зачатка кишки у E. fraudatrix. Значения нормализованы по актину.
Данные представлены как среднее значение ± SE (N = 9). Значения нормы приняты в
качестве 1. Звездочкой обозначены статистически достоверные изменения.
3.7. Экспрессия гена wnt16 в норме и регенерации E. fraudatrix
Транскрипты wnt16 были выявлены только в результате RACE с
вырожденными праймерами, но не были обнаружены в секвенированных
транскриптомах. Аналитическая ПЦР показала, что экспрессия wnt16 в норме у
E. fraudatrix происходит в водных легких гонадах и кишке (рис. 25). При
регенерации АК и передней части кишки данный ген активен на 5 сут. При
регенерации задней части кишки транскрипты wnt16 были найдены на 3 и 10
сут (рис. 24). Как и в случае с другими генами wnt, были обнаружены
транскрипты разной длины.
Кодирующая
последовательность
гена
wnt16
имеет
длину
1056
нуклеотидов, ей соответствует аминокислотная последовательность в 352 а.о.
включающая начальный метионин и стоп-кодон (рис. 41, 42). Предполагаемая
масса белка составляет 37 кДа, теоретическая изоэлектрическая точка – 9,32.
Имеются 23 остатка цистеина в высоко консервативных местах (рис. 40, 41).
77
Консервативный участок аминокислотной последовательности, характерный
для всех генов wnt имеет две замены: СRCHGVSSSC. В первой случае вместо
остатка лизина присутствует аргинин, во второй остаток глицина заменен на
серин.
Полученный в результате 3’RACE фрагмент транскрипта wnt16 E.
fraudatrix имел наибольшую гомологию с wnt7 S. purpuratus (M91305.1).
Филогенетический анализ кодирующей последовательности показал, что wnt16
E. fraudatrix принадлежит к однородной группе генов Wnt16. Гомологи этого
гена имеются уже у книдарий (рис. 42). Предполагаемая аминокислотная
последовательность Wnt16 E. fraudatrix имеет 49% гомологию с wnt16 S.
kowalevskii (EU931648.1) и 45% с P. lividus (KJ000375.1). Ген wnt16 E. fraudatrix
показывает наименьшее сходство с гомологичными генами морских ежей и
полухордовых (рис. 42).
78
Рис. 40. Нуклеотидная последовательность кодирующей части wnt16 E. fraudatrix (1056
нуклеотидов), выравненная с предполагаемой аминокислотной последовательностью. Стопкодон отмечен звездочкой. Консервативный домен выделен серым цветом. Кругами
обведены 23 остатка цистеина в консервативных местах.
79
Рис. 41. Выравнивание предполагаемых аминокислотных последовательностей белков Wnt16
E. fraudatrix и других животных. Выравнивание произведено с помощью ClustalW. Серым
отмечены регионы идентичности а.о. Для сравнения были взяты следующие
последовательности: Strongylocentrotus purpuratus Wnt16 (XM_791523.2), Xenopus laevis
Wnt16 (DQ658157.1), Danio rerio Wnt16 (NM_001100046.1), Mus musculus Wnt16
(NM_053116.4), Paracentrotus lividus Wnt16 (KJ000375.1), Eucidaris tribuloides Wnt16
(AHY24796.1). Стоп-кодон отмечен звездочкой.
80
Рис. 42. Филогенетическое древо транскриптов wnt16 различных животных, построенное с
помощью метода «Neighbor-Joining». Безкорневое филогенетическое дерево было
сгенерировано с использованием метода дистанций последовательностей «Neighbor-Joining»,
выравнивание проведено с помощью Clustal X. Масштаб показывает эволюционное
расстояние, соответствующее 10 заменам на каждые 100 аминокислот. Цифрами показана
достоверность ветвления 100 альтернативных деревьев с помощью bootstrap-анализа. Для
анализа
использованы
последовательности
Strongylocentrotus
purpuratus
wnt16
(XM_791523.2), Xenopus laevis wnt16 (DQ658157.1), Danio rerio wnt16 (NM_001100046.1),
Mus musculus wnt16 (NM_053116.4), Paracentrotus lividus wnt16 (KJ000375.1), Eucidaris
tribuloides wnt16 (AHY24796.1), Nematostella vectensis wnt16 (DQ492688.1), Saccoglossus
kowalevskii wnt16 (EU931648.1).
81
4. ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Гены семейства Wnt
Наше исследование показало, что у голотурии E. fraudatrix присутствуют
гены сигнального пути Wnt. Они активны как в норме, так и при регенерации.
Кроме ранее обнаруженного Wnt5, нами было идентифицировано еще четыре
сигнальные молекулы семейства Wnt, три разновидности рецептора Frizzled и
внутриклеточные мессенджеры Dishevelled и β-catenin. Все они гомологичны
соответствующим генам иглокожих.
В нашей работе мы столкнулись с определенными сложностями в
идентификации генов семейства Wnt. В основном, как и ожидалось, гены wnt
E. fraudatrix имели наибольшее сходство с гомологичными генами S. purpuratus
(45-69%) (рис. 28, 34, 38, 42). Однако транскипт wntA E. fraudatrix имел
наибольшее сходство с wnt4-like S. purpuratus (рис. 28, 43). Кроме того,
наблюдалась гомология еще и с wnt4b D. rerio. В результате этого, выявленный
нами транскрипт был изначально идентифицирован как wnt4b. Лишь после
анализа филогении всех генов семейства Wnt (рис. 43) оказалось, что это этот
ген принадлежит к WntA. Кроме того первоначально полученный фрагмент
транскрипта wnt16 длиной 246 нуклеотидов, имел наибольшую гомологию с
wnt7 S. purpuratus. Только после получения полной последовательности стало
возможным правильное определение данного гена.
По-видимому,
последовательности
корректное
и
правильная
определение
идентификация
нуклеотидной
транскриптов
генов
семейства Wnt является непростой задачей и для других исследователей. При
регенерации кишки у дальневосточного трепанга A. japonicus была выявлена
экспрессия гена wnt6 и была определена нуклеотидная последовательность
транскрипта этого гена (Sun et al., 2011, 2013b). Анализ представленной в базах
данных последовательности транскрипта wnt6 A. japonicus и сравнение ее с
wnt6 E. fraudatrix показали, что у wnt6A. japonicus ближе к 3’-концу отсутствует
82
Рис. 43. Филогенетическое древо транскриптов wnt различных животных построенное с
помощью метода «Neighbort-Joining». Без корневое филогенетическое дерево было
сгенерировано с использованием метода дистанций последовательностей «Neighbort-Joining»
используя выравнивание с помощью Clustal X. Цифрами показана достоверность ветвления
100 альтернативных деревьев с помощью bootstrap-анализа (>50%). Черным кругом
отмечены определённые нами последовательности. Красным ромбом – wnt базальных
многоклеточных. Зеленым треугольником – wnt кишечнополостных.
83
один нуклеотид, тем самым смещая рамку считывания. Вследствие этого
сдвига, стоп-кодон находиться в другом месте, укорачивая аминокислотную
последовательность. Также при такой рамке считывания отсутствует концевой
участок транскрипта, богатый остатками цистеина, которые имеют большое
значение для функционирования белка Wnt. Возможно, авторы считают, что
данная делеция действительно произошла у A. japonicus. Однако сигнальные
молекулы Wnt играют значительную роль в морфогенезе и любые мутации,
вызывающие изменение структуры лиганда чаще всего приводят к нарушению
сигналинга, вызывая образование опухолей или смерть организма (Polakis et al.,
2000).
Поэтому
мы
считаем,
что
при
построении
нуклеотидной
последовательности транскрипта wnt6 голотурии A. japonicus авторы допустили
ошибку и пропустили один нуклеотид в позиции 851±3. Вероятно, неправильно
идентифицирован и wnt8 офиур (Vaughn et al., 2012), который, по-видимому,
является wnt2 (см. ниже).
Для более точной идентификации разных членов семейства Wnt
необходимо не только получение полных последовательностей (или хотя бы
транслируемых участков) генов wnt для большего числа видов, но и подробный
анализ филогении Wnt (Sidow, 1992; Schubert et al., 2000; Prud’homme et al.,
2002; Holsten, 2008). В этой связи была предпринята попытка построения
филогенетического дерева транскриптов генов семейства Wnt. Для этого были
использованы
млекопитающих,
известные
рыб,
последовательности
полухордовых,
транскриптов
иглокожих,
wnt
насекомых,
многощетинковых червей, кишечнополостных, губок, гребневиков и Trichoplax,
а также идентифицированные нами wnt E. fraudatrix (рис. 43). Хорошо
охарактеризованные гены wnt млекопитающих, рыб и полухордовых помогли
создать отдельные группы генов, а wnt низших многоклеточных определяли
положение групп относительно друг друга.
В отдельных группах генов wnt наблюдается правильное распределение
по филогенетическому дереву, с расположением полухордовых и иглокожих в
84
основании дерева, а млекопитающих и рыб на вершине. Достоверность такого
ветвления варьировала от 65 до 99 процентов. Достоверность расположения
отдельных групп wnt чаще всего не превышала 50%. Однако wnt низших
позвоночных были распределены именно в основании дерева, или же не
попадали ни в одну группу, что говорит о правильности построения дерева.
Также в пользу правильности составления дерева говорит гомология wnt1, wnt6
и wnt10, которые у большинства беспозвоночных располагаются тандемно на
одной хромосоме (Holstein, 2014).
В результате построения было выявлено, что wnt4-like S. purpuratus, повидимому, является геном wntA (рис. 43). К этой же группе генов принадлежит
и wnt5a брюхоногого моллюска Aplysia californica. Кроме того, при построении
нами филогенетического дерева, wnt8 офиуры O. vendtii (Vaughn et al., 2012)
оказался в группе генов Wnt2. В этой связи функции wnt8 у офиур,
предположенные на основе функций гомологичных генов других иглокожих
(Vaughn et al., 2012), по-видимому, не верны. Анализ филогении показал
родство генов wnt7 и wnt16 (рис. 43), что объясняет нашу ошибку в
первоначальной идентификации wnt16 у E. fraudatrix.
Среди генов семейства Wnt наименее изученным является wntA. Он
найден у кишечнополостных, круглых червей, насекомых, иглокожих,
оболочников, однако не обнаружен у высших хордовых. Происхождение гена
wntA не совсем понятно. По данным Прудхома и др. (Prud’homme et al., 2002)
он имеет наибольшую гомологию с wnt8. Чо и др. (Cho et al., 2010) считают, что
wntA имеет сходство с wnt1 и wnt6. По нашим данным этот ген наиболее
гомологичен wnt4 и wnt5.
Предсказанная аминокислотная последовательность консервативного для
всех белков Wnt участка wntA E. fraudatrix имеет 2 аминокислотные замены.
Подобные замены характерны для предковых wnt и могут быть свидетельством
того, что wntA являются базальной группой wnt. Данное предположение
85
частично подтверждается филогенией wnt у червей, в которой wntA выступает
именно как одна из базальных групп (Riddiford, Olson, 2011).
При определении последовательностей транскриптов генов wnt E.
fraudatrix нами было обнаружено, что у всех исследуемых генов существует
несколько
вариантов
транскриптов,
определяемых
нетранслируемыми
областями. Эти данные позволяют предположить наличие альтернативного
сплайсинга у этих генов. Ранее альтернативный сплайсинг wnt был описан для
млекопитающих (Katoh et al., 2000), однако для иглокожих подобных данных
нет. Смысловые участки транскриптов (между начальным метионином и стопкодоном) для каждого гена wnt E. fraudatrix были идентичными. Это дает
основание
предполагать,
что
в
результате
сплайсинга
при
любых
обстоятельствах получается одна и та же аминокислотная последовательность.
Возможно, разные нетранслируемые области необходимы для регуляции
экспрессии гена (Soergel et al., 2006; Pimentel et al., 2013).
4.2. Роль гена wnt4 при регенерации E. fraudatrix
У неповрежденных особей E. fraudatrix экспрессия wnt4 была нами
обнаружена во всех исследуемых органах – гонадах, водных легких, кишке,
стенке тела, мышцах и АК (рис. 25). Это указывает, что данный ген участвует в
регуляции
различных
физиологических
процессов.
Наши
результаты
соответствует данным, полученным на других животных. Показано, что у
млекопитающих мутации по этому гену приводят к избыточному синтезу
тестостерона и нарушениям функционирования половых органов (BiasonLauber et al., 2007). Кроме того, у позвоночных Wnt4 регулирует формирование
нервно-мышечных контактов и соотношение быстрых и медленных мышечных
волокон (Strochlic et al., 2012).
При регенерации активность wnt4 у E. fraudatrix повышается, что
указывает на участие Wnt4 в регуляции восстановительного процесса.
Максимальная экспрессия отмечена уже через 3 сут после эвисцерации (стадия
86
2) (рис. 35). В этот период начинают запускаться основные механизмы
регенерации – происходит активация клеточной миграции, пролиферации,
дедифференцировки (Dolmatov, 1992). Сходным образом Wnt4 участвует в
регенерации кожи у млекопитающих (Zhang et al., 2014). Его блокировка
останавливает клеточную пролиферацию и миграцию.
Следующее повышение активности wnt4 отмечается на 7 сут после
эвисцерации (стадия 4) (рис. 35). На этой стадии у E. fraudatrix происходит
активный морфогенез и закладка основных структур переднего конца тела – АК
и кишки (Dolmatov, 1992; Mashanov et al., 2005; Долматов, Машанов, 2007).
Повышение экспрессии wnt4 указывает, что он участвует в регуляции и этих
процессов. На 8-12 сут после эвисцерации (стадии 5 и 6) в АК запускаются
механизмы кальцификации, в результате чего формируется окологлоточное
известковое кольцо (Dolmatov, 1992). В этой связи интересны недавно
полученные данные о том, что wnt4 регулирует процесс обызвествления при
формировании костей у млекопитающих (Yu et al., 2014).
Необычным оказалось статистически достоверное увеличение активности
wnt4 на 20 сут после эвисцерации (стадия 7). В это время все органы уже
сформированы, передний и задний зачатки кишки объединены в единую
пищеварительную трубку (Mashanov et al., 2005; Долматов, Машанов, 2007;
Долматов, 2009). Возможно, такая динамика отражает многообразную роль
этого гена в морфогенезах, которая видна по другим животным. У морских
ежей в эмбриогенезе wnt4 участвует в контроле формирования внутренних
органов, в частности пищеварительной системы (Robert et al., 2014). У
млекопитающих он регулирует клеточную пролиферацию и экспрессию гена
антимюллеровского гормона во время оогенеза (Prunskaite-Hyyrylainen et al.,
2014). При формировании опухоли Wnt4 способен заблокировать клетку в G1
периоде, не давая ей возможности делиться. При этом не происходит активация
β-catenin (Garcia-Castro et al., 2013). Активация неканонического сигнального
пути (PCP) с помощью Wnt4 обнаружена у дрозофилы при развитии крыльев
87
(Wu et al., 2013). У рыб wnt4 участвует в формировании эпителия передних
отделов кишки, отвечая за миграцию клеток (Choe et al., 2013).
При регенерации wnt4 активен не только в органах переднего конца
голотурии, но и в заднем зачатке кишки на всех сроках восстановления (рис.
24). Это может указывать на отсутствие градиента экспрессии данного гена
вдоль переднезадней оси тела. Следовательно, wnt4 у E. fraudatrix не принимает
участия в позиционировании клеток, а, вероятно, регулирует процессы
миграции и пролиферации.
4.3. Роль гена wnt6 при регенерации E. fraudatrix
У неповрежденных особей E. fraudatrix ген wnt6 экспрессируется почти
во всех исследованных органах, за исключением стенки тела (рис. 25). Наши
результаты согласуются с данными по голотурии A. japonicus, у которой
продукты wnt6 обнаружены в кишечнике в норме (Sun et al., 2013b). Не совсем
понятно, почему у E. fraudatrix транскрипты wnt6 имелись в продольных
мышечных лентах и отсутствовали в стенке тела. Последняя у голотурий
содержит большое число миоэпителиальных клеток (Garsia-Arraras, Dolmatov,
2010). В раннем онтогенезе иглокожих миоциты соматической мускулатуры
формируются за счет клеток целомического эпителия (Долматов, Ивантей,
1993; Dolmatov et al., 2007). При этом промежуточной стадией является
образование миоэпителиальных клеток, что указывает на общее происхождение
всей сократительной системы (Garcia-Arraras, Dolmatov, 2010). Разница в
экспрессии wnt6 в мышцах и стенке тела дает основание предположить, что,
несмотря
на
родство,
регуляция
тканевого
гомеостаза
миоцитов
и
миоэпителиальных клеток у иглокожих различно.
Динамика экспрессии wnt6 при регенерации у E. fraudatrix имеет
пикообразный характер (рис. 39). В переднем конце голотурии до 7 сут после
эвисцерации активность его не отличается от нормы. На 7 сут отмечается
резкое возрастание уровня экспрессии, а затем, на 10 сут, снова снижение.
88
Сходным образом, вероятно, происходит изменение экспрессии wnt6 и в заднем
конце животного. По нашим данным транскрипты wnt6 обнаруживаются в
заднем зачатке кишки только на 7 сут после эвисцерации. Этот период
характеризуется началом формирования пищеварительной системы у E.
fraudatrix (Mashanov et al., 2005; Долматов, 2009). Именно через 7 сут после
эвисцерации закладываются передний и задний зачатки кишки. В этой связи
можно предположить, что wnt6 участвует в запуске процесса формирования
пищеварительной системы. Наше предположение согласуется с данными по
голотурии A. japonicus. Было показано, что у этого вида при регенерации кишки
после эвисцерации активность wnt6 возрастает, достигая максимума на 7 сут и в
дальнейшем постепенно уменьшается (Sun et al., 2013b). В этот период у A.
japonicus начинается активная дедифференцировка клеток остатка пищевода и
формирование
переднего
зачатка
кишки
(Шукалюк,
Долматов,
1999).
Пикообразный характер экспрессии wnt6, возможно указывает, что у голотурий
этот ген является переключателем, запуская или наоборот блокируя какие-то
процессы, связанные с дедифференцировкой.
Данные по экспрессии wnt6 при регенерации у других иглокожих
отсутствуют. Однако показано, что он задействован в формировании
пищеварительной системы при развитии морских ежей (Croce et al., 2011;
Robert et al., 2014). Это дает основание предположить, что у иглокожих wnt6
участвует в механизмах образования кишки при различных морфогенезах.
4.4. Роль гена wntA при регенерации E. fraudatrix
У неповрежденных особей E. fraudatrix экспрессия гена wntA была
обнаружена в водных легких, гонадах, кишке, АК и стенке тела, но не была
найдена в мышцах (рис. 25). Вероятно, как и в случае с wnt6 разница в
экспрессии в мышцах и стенке тела указывает на разные механизмы регуляции
тканевого гомеостаза миоцитов и миоэпителиальных клеток у иглокожих.
89
Динамика активности wntA при регенерации органов переднего конца E.
fraudatrix сходна с таковой гена wnt4. Увеличение уровня экспрессии
отмечается уже через 3 сут после эвисцерации (стадия 2), когда происходит
запуск программ восстановления (рис. 31). Пик активности wntA отмечается в
период активного морфогенеза (стадия 4). В течение всего периода
восстановления, как и в случае с wnt4, уровень экспрессии wntA достоверно
выше нормы. Сходство динамики активности этих двух генов дает основание
предположить, что они регулируют регенерацию одних и тех же структур.
В заднем зачатке кишки экспрессия wntA отмечается только на поздних
стадиях восстановления, начиная с 10 сут после эвисцерации (стадия 5) (рис.
24). К этому моменту зачаток кишки уже сформирован и растет по мезентерию
вперед (Долматов, Машанов, 2007; Долматов, 2009). В нем происходит
пролиферация энтероцитов и их специализация. По-видимому, wntA участвует
в регуляции этих процессов.
Исследования роли wntA в регенерации у других животных отсутствуют,
однако есть некоторые данные по его активности в раннем развитии. В
эмбриогенезе морского ежа P. lividus wntA экспрессируется в клетках будущей
энтодермы и мезодермы (Robert et al., 2014). Аналогичный паттерн экспрессии
наблюдается при развитии актинии N. vectensis (Guder et al., 2006). Во время
личиночного развития насекомых wntA активируется в некоторых клетках
нервной системы, причем у разных видов локализация транскриптов различна
(Bolognesi et al., 2008). Такое разнообразие функций и тканей, в которых
экспрессируется wntA (как эктодермального, так и энто- и мезодермального
происхождения), возможно указывает на древность его происхождения.
4.5. Роль гена wnt16 при регенерации E. fraudatrix
У неповрежденных особей E. fraudatrix ген wnt16 экспрессируется в
водных легких, гонаде и кишке (рис. 25), что указывает на участие его в
регуляции физиологических процессов в этих структурах. Для позвоночных
90
было показано, что Wnt16 через неканонический сигналинг активирует
сигнальный
путь
Notch,
который
в
свою
очередь,
контролирует
дифференцировку стволовых клеток (Clements et al., 2011). Возможно, что у E.
fraudatrix в половых трубочках wnt16 участвует в регуляции формирования
яйцеклеток и сперматозоидов из первичных половых клеток.
Экспрессия wnt16 при регенерации у E. fraudatrix отмечается только на 3
и 10 сут в ЗЗ (рис. 24) тела и 5 сут в ПЗ. У данного вида голотурий на 3-5 сут
после эвисцерации в задней части происходят заживление раны и начальные
этапы дедифференцировки целомического эпителия и энтероцитов клоаки
(Долматов, 2009). В этой связи можно предположить, что wnt16 может
регулировать иммунный ответ и дедифференцировку. Сходную функцию он
может выполнять на ранних этапах регенерации и в переднем конце животного.
Однако, поскольку детально динамика активности wnt16 у E. fraudatrix не
анализировалась, для решения вопроса о функциях этого гена необходимы
дополнительные исследования.
4.6. Роль Wnt5 при регенерации у E. fraudatrix
Наше исследование подтвердило ранее полученные результаты о том, что
при регенерации после эвисцерации у E. fraudatrix происходит синтез белка
Wnt5 (Гирич и др., 2011). У неповрежденных животных были найдены только
редкие Wnt5-положительные клетки в соединительной ткани стенки тела и
нервной системе (рис. 10, 13). В процессе регенерации происходит активация
синтеза Wnt5. Помимо нервной и соединительной тканей этот белок
обнаруживается в целомическом эпителии и амебоцитах (рис. 12, 15).
Целомический эпителий играет важную роль в регенерации у иглокожих
(Долматов, 1999). Он первым реагирует на повреждение и уже на ранних
сроках восстановления его клетки начинают мигрировать и митотически
делиться
(Dolmatov,
1992;
Murray,
García-Arrarás,
2004).
В
процессе
регенерации целомический эпителий покрывает все формирующиеся органы,
91
является источником клеток для восстановления мышц и кишки (Dolmatov,
Ginanova, 2001; Mashanov et al., 2005), у E. fraudatrix за счет него образуется
выстилка перифарингеального целома (Dolmatov, 1992). Возможно, что именно
Wnt5 является основным регулятором преобразования клеток целомического
эпителия.
Участие Wnt5 в регуляции клеточной миграции подтверждается данными
по другим животным. У позвоночных при развитии некоторых видов опухолей
молекулы Wnt5 воздействуют на раковые клетки, запуская процесс миграции,
приводящий к появлению метастазов (Witze et al., 2008). Кроме того, Wnt5
может регулировать образование ламеллоподий и ориентацию центра
организации микротрубочек у клеток культуры M93-047, что вызывает
активацию клеточной миграции (Nomachi et al., 2008).
Экспрессия Wnt5 в радиальных нервах при восстановлении у E. fraudatrix
указывает, что данный белок участвует и в регуляции регенерации нервной
системы. Сходную функцию выполняет продукт гомологичного гена SmedWnt5 у планарий. У этих животных при регенерации Wnt5 является
регулятором формирования и роста нервной системы (Adell et al., 2009).
4.7. Роль других генов сигнального пути Wnt при регенерации у E. fraudatrix
Помимо Wnt у E. fraudatrix нам удалось идентифицировать некоторые
компоненты сигнального пути Wnt – рецепторы Frizzled и мессенджеры
Dishevelled и β-catenin. Известно, что разнообразие Frizzled намного меньше,
чем лигандов Wnt. Например, у иглокожих было выявлено только 4 различных
гена: frizzled1/2/7, frizzled4, frizzled5/8, frizzled9/10 (Robert et al., 2014). В этой
связи понятно, что каждый из рецепторов Frizzled может взаимодействовать с
несколькими лигандами Wnt. У E. fraudatrix при регенерации нами были
идентифицированы транскрипты трех рецепторов. Транскрипты frizzled4 были
найдены на 3 сут регенерации, frizzled5/8 на 3 и 5 сут, а frizzled1/2/7 на всех
сроках восстановления. Имеющиеся в настоящее время данные по иглокожим
92
(включая и наши) не дают возможности точно установить с какими именно Wnt
взаимодействует каждый из этих рецепторов, поэтому можно сделать только
некоторые предположения.
В эмбриогенезе морского ежа P. lividus frizzled4 активируется на стадии
ранней гаструлы. Экспрессия происходит в клетках вокруг бластопора. В этих
же клетках обнаружена экспрессия wntA, что дает основание предположить
взаимодействие этого лиганда с frizzled4 (Robert et al., 2014). При регенерации
E. fraudatrix в то время, когда происходит экспрессия frizzled4 (3 сут)
наблюдается экспрессия wntA и wnt4. Возможно, что на ранних этапах
восстановления
эти
лиганды
взаимодействуют
с
Frizzled4,
инициируя
транскрипцию генов, необходимых для начала регенерации.
Имеются данные, что у амфибий рецептор frizzled5/8 способен
взаимодействовать с Wnt5, обеспечивая запуск неканонического сигнального
пути (Kuhl et al., 2000). В наших исследованиях было выявлено, что у E.
fraudatrix frizzled5/8 экспрессируется на 5 сут регенерации. Возможно,
активация PCP сигнального пути через этот рецептор приводит к запуску
клеточной миграции, необходимой для восстановительного процесса. В этот же
период регенерации отмечается увеличение числа Wnt5-положительных клеток,
что, вероятно, указывает на взаимодействие лиганда Wnt5 с рецептором
Frizzled5/8.
Транскрипты frizzled1/2/7 были найдены на всех стадиях восстановления
АК и переднего отдела кишки у E. fraudatrix, при этом уровень экспрессии
frizzled1/2/7 меняется в ходе регенерации. Это свидетельствует о важности
данного рецептора в регуляции восстановительного процесса. Показано, что
сразу после эвисцерации и на ранних сроках регенерации уровень активность
этого гена падает по сравнению с нормой. Затем он увеличивается примерно
вдвое к 7 сут, после чего снова уменьшается. В целом динамика активности
frizzled1/2/7 сходна с таковой wntA и wnt6. Это может быть свидетельством
того, что WntA и Wnt6 взаимодействуют с данным рецептором. Корреляция
93
экспрессии frizzled1/2/7 и wnt6 наблюдается и у морского ежа P. lividus (Robert
et al., 2014). Этот тандем лиганда и рецептора активирует канонический
сигнальный
мезодермы
путь
Wnt,
(Lhomond
et
контролирующий
al.,
2012;
спецификацию
Robert
et
al.,
не
2014).
скелетной
Возможное
взаимодействие WntA и Wnt6 с Frizzled1/2/7 косвенно подтверждаются нашими
данными по экспрессии frizzled1/2/7 у неповрежденных голотурий. У E.
fraudatrix в норме продукты frizzled1/2/7 были выявлены во всех органах
голотурии – мышцах, стенке тела, АК, гонадах и водных легких. В этих же
органах обнаружены и транскрипты wntA и wnt6.
Также было показано, что у E. fraudatrix транскрипты frizzled1/2/7
присутствуют в заднем зачатке кишки на ранних стадиях регенерации (3-5 сут
после эвисцерации, стадии 2 и 3) и на стадии 5 (10 сут после эвисцерации).
Экспрессия frizzled1/2/7 совпадает в какой-то мере с активностью wntA и wnt4
(рис. 24). В то же время, на 7 сут после эвисцерации, когда транскрипты гена
этого рецептора в заднем зачатке кишки отсутствуют, выявляется экспрессия
wnt6. В этой связи можно предположить, что, по крайней мере, в задней части
голотурии Wnt6 взаимодействует не с Frizzled1/2/7, а с другим рецептором.
Белки Dishevelled и β-catenin являются важными участниками сигнальных
путей Wnt (Eisenmann, 2005; Komiya, Habas, 2008), поэтому не удивительно, что
у E. fraudatrix в процессе регенерации нами были обнаружены транскрипты
dishevelled и β-catenin. Экспрессия последнего указывает, что канонический
Wnt сигналинг является важным фактором при регенерации у голотурий.
Лигандами для β-catenin-зависимого сигнального пути могут быть Wnt4, Wnt6
и Wnt16 (Lyons et al., 2004; Jiang et al., 2014; Cawthorn et al., 2012).
94
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Несмотря на то, что Wnt сигналинг известен давно и активно изучается,
до сих пор достаточно мало исследований его роли в регенерации.
Показательно, что опубликованный недавно сборник статей «Cold Spring
Harbor Perspectives in Biology» посвященный Wnt, не содержит ни одного
обзора по участию генов wnt в регенерации. В этой связи наши данные вносят
определенный вклад в понимание функционирования сигнального пути Wnt и
его роли в восстановительных морфогенезах. Наше исследование показало, что
сигнальный путь Wnt играет большую роль в жизнедеятельности голотурий. Он
активен у неповрежденных животных и, следовательно, участвует в регуляции
различных физиологических процессов поддержания тканевого гомеостаза. В
норме у E. fraudatrix обнаружены продукты пяти генов семейства Wnt: wntA,
wnt4, wnt5, wnt6 и wnt16. Кроме того, были выявлены некоторые компоненты
сигнального пути Wnt – рецепторы семейства Frizzled. Таким образом, в
клетках неповрежденных голотурий имеются лиганды, запускающие как
канонический (Wnt4, Wnt6) (Lyons et al., 2004; Jiang et al., 2014), так и
неканонический сигналинг (Wnt5, WntA) (Philipp et al., 2009; Robert et al., 2014).
Wnt16 способен активировать оба вида сигнальных путей (Jiang et al., 2014;
Clements et al., 2011).
Нами,
впервые
для
голотурий,
определены
нуклеотидные
последовательности транскриптов wntA, wnt4 и wnt16. Полученная нами
информация помогла точнее определить принадлежность wnt к разным группам
внутри семейства. В частности, wnt4-like морского ежа S. purpuratus, скорее
всего, является геном wntA (рис. 43). К этой же группе генов, по-видимому,
принадлежит и wnt5a брюхоногого моллюска Aplysia californica. Кроме того,
оказалось, что wnt8 офиуры O. vendtii (Vaughn et al., 2012) входит в группу
генов wnt2.
Проведенное
исследование
показало,
что
изменение
экспрессии
изученных генов в процессе регенерации внутренних органов у E. fraudatrix
95
характеризуется индивидуальными особенностями, что, вероятно, отражает
сложность механизмов восстановления и разнообразие происходящих событий.
На первых этапах восстановительного процесса основную роль играют
механизмы вывода клеток из стабильного состояния, переключения работы
генома, синтеза межклеточного вещества. На переднем конце животного
формируется соединительно-тканное утолщение (Долматов, Машанов, 2007;
Lamash, Dolmatov, 2013). В этот период активируются гены wnt4 и wntA,
возрастает число Wnt5-положительных клеток. Интересно, что относительный
уровень экспрессии wnt4 и wntA различен (рис. 44), что, возможно, говорит о
разном вкладе этих генов в регуляцию восстановительного процесса.
Поскольку активность wnt4 в этот период достигает своего максимума (рис. 44),
именно Wnt4 является основным кандидатом на роль лиганда, запускающего
процессы миграции и дедифференцировки, аналогично Wnt4 у позвоночных
(Zhang et al., 2014). Увеличение числа клеток с белком Wnt5, вероятно, связано
с запуском перестройки цитоскелета через сигнальный путь PCP (Philipp et al.,
2009). Кроме того, возрастание числа Wnt5-положительных клеток в нервных
клетках указывает на активацию нервной системы. Хорошо известно, что
восстановительный процесс протекает успешно только при иннервации
регенерирующего органа (Карлсон, 1986; Короткова, 1997).
96
Рис. 44. Относительный уровень экспрессии генов wntA, wnt4 и wnt6 при регенерации
аквафарингеального комплекса и переднего зачатка кишки у E. fraudatrix. Значения
нормализованы по актину. Данные представлены как среднее значение ± SE (N = 9).
Значения экспрессии wnt6 в норме приняты в качестве 1. Звездочкой обозначены
статистически достоверные изменения (P<0,05).
Следующим важным этапом восстановления передних структур E.
fraudatrix является стадия 4 (6-7 сут после эвисцерации). В этот период
происходит активный морфогенез и закладываются все основные структуры
АК: формируется амбулакральный кольцевой сосуд, нервное кольцо, начинают
развиваться щупальца и другие органы амбулакральной системы, кроме того
идет развитие переднего зачатка кишки (Dolmatov, 1992; Долматов, Машанов,
2007). На данной стадии экспрессия wntA, wnt6 и frizzled1/2/7 достигает своих
максимальных значений за весь период восстановления (рис. 44). При активном
формировании органов особо необходим контроль над расположением клеток,
которым, вероятно, управляет wntA (Guder et al., 2006). Число Wnt5
положительных клеток у E. fraudatrix еще более увеличивается. Поскольку у
иглокожих большую роль в регенерации играет клеточная миграция (Долматов,
1999, 2009), возможно сигнальный путь Wnt5 также активирует миграцию
97
клеток. На это может указывать локализация Wnt5 при регенерации в тех
тканях, в которых происходит наиболее интенсивное перемещение клеток –
мезентерий и гиподерма стенки тела. Экспрессия гена wnt6 на этой стадии
регенерации увеличивается более чем в 10 раз, по относительному уровню
превышая другие исследуемые гены (рис. 44). У позвоночных Wnt6 участвует в
регуляции развития мускулатуры и ряда эпителиальных тканей (Lavery et al.,
2008a, b). По всей видимости, у E. fraudatrix wnt6 выполняет сходную функцию,
являясь частью механизмов дифференцировки клеток при формировании мышц
и целомического эпителия.
На стадиях 5 и 6 (8-14 сут после эвисцерации) основные структуры АК и
переднего отдела кишки уже сформированы и происходит дифференцировка и
специализация входящих в них клеток. Этот период характеризуется
максимальным содержанием Wnt5-положительных клеток в нервной системе и
соединительной ткани. Очевидно, что Wnt5 задействован в регуляции
восстановления
нервной
системы
и
синтеза
внеклеточного
матрикса.
Экспрессия wnt6 падает до уровня нормы и в дальнейшем более не
увеличивается. Также количество транскриптов wntA на 10 сут уменьшается до
нормы с незначительными колебаниями на 14 и 20 сут. Экспрессия wnt4
постепенно уменьшается к 14 сут, однако уровень экспрессии даже на 20 сут
сохраняется достоверно выше нормы.
В механизмах регенерации заднего зачатка кишки также задействован
Wnt сигналинг. Ранние этапы формирования (стадии 1-4) характеризуются
активностью wnt4 и wnt16. Таким образом, данные гены могут участвовать в
регуляции процессов дедифференцировки и миграции клеток кишечной
выстилки клоаки. В дальнейшем активизируются wntA и wnt6, которые вместе с
wnt4,
возможно,
контролируют
пролиферацию
и
дифференцировку
энтероцитов.
Таким образом, сложная
динамика изменения
активности
генов
сигнального пути Wnt при регенерации внутренних органов у E. fraudatrix
98
указывает на участие данного сигналинга в регуляции восстановительного
процесса. Этот вид голотурий является хорошим модельным объектом, и
полученные нами результаты создают базис для более детального изучения
молекулярных механизмов регенерации у иглокожих, в частности выяснения
роли конкретных генов в регуляции тех или иных процессов.
99
ВЫВОДЫ
1) У голотурии E. fraudatrix в тканях как в норме, так и при регенерации после
эвисцерации
присутствуют
клетки,
содержащие
белок
Wnt5.
У
неповрежденных животных число Wnt5-положительных клеток невелико. Они
имеются в амбулакральной системе, радиальных нервных тяжах и гиподерме.
При регенерации распределение клеток, содержащих Wnt5, сходно, однако
число клеток увеличивается, достигая максимума в период активного
морфогенеза (стадии 4 и 5), а затем снижается. Наиболее выраженная динамика
изменения числа Wnt5-положительных клеток отмечена для гиподермы и
нервной системы.
2) При регенерации аквафарингеального комплекса и кишки у E. fraudatrix
отмечается активность генов frizzled4, frizzled5/8, dishevelled и β-catenin.
Экспрессия гена dishevelled происходит на всех исследованных стадиях
восстановления, а β-catenin, frizzled4 и frizzled5/8 – только на ранних этапах
регенерации.
3) Длина кодирующей последовательности гена wntA E. fraudatrix составляет
1035 нуклеотидов. У неповрежденных животных wntA экспрессируется в
водных легких, стенке тела, гонадах, аквафарингеальном комплексе и кишке.
При регенерации задней части кишки экспрессия wntA происходит лишь на
поздних сроках восстановления. При регенерации передней части кишки и
аквафарингеального комплекса высокий уровень экспрессии wntA отмечается в
течение всего восстановительного процесса, с максимальными значениями в
периоды закладки органов (стадия 2) и активного морфогенеза (стадия 4).
4) Длина кодирующей последовательности гена wnt4 E. fraudatrix составляет
1077 нуклеотидов. У неповрежденных животных wnt4 экспрессируется в
мышцах, водных легких, стенке тела, гонадах, аквафарингеальном комплексе и
кишке. При регенерации задней части кишки экспрессия wnt4 наблюдается на
100
всех стадиях восстановительного процесса. При регенерации передней части
кишки и аквафарингеального комплекса максимальная экспрессия wnt4
отмечается на ранних этапах восстановления (стадия 2) и в период активного
морфогенеза (стадия 4). Далее происходит спад активности wnt4, однако даже в
конце регенерации (стадия 8) уровень его экспрессии остается выше нормы.
5) Длина кодирующей последовательности гена wnt6 E. fraudatrix составляет
1077 нуклеотидов. У неповрежденных животных wnt6 экспрессируется в
водных легких, мышцах, гонадах, аквафарингеальном комплексе и кишке. При
регенерации задней части кишки экспрессия wnt6 выявляется лишь в период
закладки органа. При регенерации передней части кишки и аквафарингеального
комплекса высокий уровень экспрессии наблюдается только в период
активного морфогенеза (стадия 4). На остальных стадиях восстановления его
активность достоверно не отличается от нормы.
6) Длина кодирующей последовательности гена wnt16 E. fraudatrix составляет
1056 нуклеотидов. У неповрежденных животных wnt16 экспрессируется в
водных легких, гонадах и кишке. Его продукты обнаружены на ранних этапах
формирования кишки и в конце периода активного морфогенеза (стадия 5).
7) У неповрежденных особей E. fraudatrix ген frizzled1/2/7 экспрессируется в
мышцах, водных легких, стенке тела, гонадах и кишке. При регенерации задней
части
кишки
экспрессия
frizzled1/2/7
наблюдается
в
течение
всего
восстановительного процесса. При регенерации передней части кишки и
аквафарингеального
комплекса
его
активность
сначала
снижается
по
сравнению с нормой, затем увеличивается, достигая максимума в период
активного морфогенеза (стадия 4), после чего снова снижается до уровня
нормы.
101
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гирич А.С., Долматов И.Ю., Ламаш Н.Е., Елесейкина М.Г. Экспрессия
гена wnt5 при регенерации у голотурии Eupentacta fraudatrix // Регенеративная
биология и медицина. Сборник научных трудов. М: Издательский Дом
«Нарконет». 2011. С. 45-46.
2. Долматов И.Ю. Строение аквафарингеального комплекса голотурии
Cucumaria fraudatrix (Holothuroidea, Dendrochirota) // Зоологический журнал.
1986а. Т. 65. С. 1332-1340.
3. Долматов И.Ю. Электронно-микроскопическое изучение основных
органов аквафарингеального комплекса голотурии Cucumaria fraudatrix //
Цитология. 1986б. Т. 28. С. 1183-1189.
4. Долматов И.Ю. Бесполое размножение, эвисцерация и регенерация у
голотурий // Онтогенез. 1996. Т. 27. С. 256-265.
5. Долматов И.Ю. Регенерация у иглокожих // Биология моря. 1999. Т. 25.
С. 191-200.
6. Долматов И.Ю. Регенерация пищеварительной системы у голотурий //
Журнал общей биологии. 2009. Т. 4. С. 316-327.
7. Долматов И.Ю., Ивантей В.А. Гистогенез продольных мышечных лент
у голотурий // Онтогенез. 1993. Т. 24, № 6. С. 67-72.
8. Долматов И.Ю., Машанов В.С. Регенерация у голотурий //
Владивосток: Дальнаука. 2007. 212 с.
9. Долматов И.Ю., Нгуен Ан Хан, Каменев Я.О. Особенности бесполого
размножения, эвисцерации и регенерации у голотурий (Holothuroidea) из залива
Нячанг Южно-Китайского моря // Биология моря. 2012. Т. 38. № 3. С. 227-236.
10. Каменев Я.И. Ультраструктура внутренних органов, бесполое
размножение и регенерация у голотурии Cladolabes schmeltzii // Автореф. дис.
канд. биолог. наук. Владивосток. 2013. 24 с.
11. Карлсон Б.М. Проблемы биологии развития // Москва: Наука. 1986.
296с.
102
12. Короткова Г.П. Регенерация животных // Санкт-Петербург.: Изд-во
СПбГУ. 1997. 480с.
13. Лейбсон Н.Л., Долматов И.Ю. Эвисцерация и регенерация внутренего
комплекса у голотурии Eupentacta fraudatrix (Holothurioidea, Dendrochirotida) //
Зоологический журнал. 1989. Т. 68, № 8. С. 67-74.
14. Марушкина Н.Б., Грачева Н.Д. Авторадиографическое изучение
пролиферативной активности в эпителии кишки трепанга Stichopus japonicus в
нормальных условиях и после аутотомии // Цитология. 1978. Т. 20, № 4. С. 426–
431.
15. Шукалюк А.И., Долматов И.Ю. Регенерация пищеварительной трубки
у голотурии Apostichopus japonicus после эвисцерации // Биология моря. 2001.
Т. 27. С. 202-206.
16. Adamska M., Degnan S.M., Green K.M., et al. Wnt and TGF-β expression
in the sponge Amphimedon queenslandica and the origin of metazoan embryonic
patterning // Plos One. 2007. V. 10. P. 1-6.
17. Adell T., Muller W.E.G. Expression pattern of the Brachyury and Tbx2
homologues from the sponge Suberites domuncula // Biol. Cell. 2005. V. 97. P. 641650.
18. Adell T., Salo E., Boutros M., Bartscherer K. Smed-Evi/Wntless is required
for beta-catenin-dependet and –independent processes during planarian regeneration
// Development. 2009. V. 136. P. 905-910.
19. Amemiya S., Oji T. Regeneration in sea lilies // Nature. 1992. V. 357. P.
546-547.
20. Ang S.L., Rossant J. HNF-3beta is essential for node and notochord
formation in mouse development // Cell. 1994. V. 78. P. 561–574.
21. Angerer L.M., Chambers S.A., Yang Q. Expression of a collagen gene in
mesenchyme lineages of the Strongylocentrotus purpuratus embryo // Gen. Dev. V.
2. P. 239-246.
103
22. Bannister R., McGonnell I.M., Graham A., et al. Coelomic expression of a
novel bone morphogenetic protein in regenerating arms of the brittle star Amphiura
filiformis // Dev. Genes Evol. 2008. V. 218. P. 33-38.
23. Bely A.E., Nyberg K.G. Evolution of animal regeneration: re-emergence of
a field // Trends. Ecol. Evol. 2010. V. 25. P. 161-70.
24. Bertolini F. Regenerazione dell'apparato digerente nello Stichopus regalis //
Pubbl. Staz. Zool. Napoli. 1930. V. 10. P. 439–449.
25. Bertolini F. Rigenerazione dell’apparato digerente nelle Holothuria //
Pubbl. Staz. Zool. Napoli. 1932. V. 12. P. 432-443.
26. Biason-Lauber A., De Filippo G., Konrad D., et al. Wnt4 deficiency - a
clinical phenotype distinct from the classic mayer-rokitansky-kuster-hauser
syndrome: a case report // Hum. Reprod. 2007. V. 22. P. 224–229.
27. Biressi A., Zou T., Dupont S., et al. Wound healing and arm regeneration
in Ophioderma longicaudum and Amphiura filiformis (Ophiuroidea, Echinodermata):
comparative morphogenesis and histogenesis // Zoomorphology. 2010. V. 129. P. 1–
19.
28. Bhat S.G., Babu P. Wingless mutation in Drosophila melanogaster // J.
Biosci. 1987. V. 12. P. 1-11.
29. Biehs B., Kechris K., Liu S., Kornberg T.B. Hedgehog targets in the
Drosophila embryo and the mechanisms that generate tissue-specific outputs of
hedgehog signaling // Development. 2010. V. 137. P. 3887-3898.
30. Bolognesi R., Beermann A., Farzana L., et al. Tribolium Wnts: evidence for
a larger repertoire in insects with overlapping expression patterns that suggest
multiple redundant functions in embryogenesis // Dev. Genes Evol. 2008. V. 218. P.
193-202.
31. Borgens R.B. What is the role of naturally produced electric current in
vertebrate regeneration and healing // Int. Rev. Cytol. 1982. V. 76. P. 245-298.
104
32. Borisov A.B. Regeneration of skeletal and cardiac muscle in mammals: Do
nonprimate models resemble human pathology? // Wound Repair Regen. 1999. V. 7.
P. 26–35.
33. Candelaria A.G., Murray G., File S.K., Garcia-Arrarás J.E. Contribution of
mesenterial muscle dedifferentiation to intestine regeneration in the sea
cucumber Holothuria glaberrima // Cell. Tissue. Res. 2006. V. 325, № 1. P. 55–65.
34. Candia Carnevali M.B. Regenerative response and endocrine disrupters in
crinoid echinoderms: an old experimental model, a new ecotoxicological test // Prog.
Mol. Subcell. Biol. 2005. V. 39. P. 167-200.
35. Candia Carnevali M.D., Bonasoro F., Patruno M., Thorndyke M.C. Cellular
and molecular mechanisms of arm regeneration in crinoid echinoderms: the potential
of arm explants // Dev. Genes Evol. 1998. V. 208. P. 421-430.
36. Carlson B.M. Development and regeneration, with special emphasis on the
amphibian limb // Cellular and molecular basis of regeneration: from invertebrates to
humans / eds. P. Ferretti, J. Geraudie. Chichester: John Wiley&Sons, 1998. P. 45-62.
37. Cawthorn W.P., Bree A.J., Yao Y., et al. Wnt6, Wnt10a and Wnt10b
inhibit adipogenesis and stimulate osteoblastogenesis through a β-catenin-dependent
mechanism // Bone. 2012. V. 50. P. 477-489.
38. Charlina N.A., Dolmatov I.Yu., Wilkie I.C. Juxtaligamental system of the
disc and oral frame of the ophiuroid Amphipholis kochii (Echinodermata:
Ophiuroidea) and its role in autotomy // Invertebr. Biol. 2009. V. 128. P. 145–156.
39. Cho S., Valle`s Y., Giani Jr V.C., et al. Evolutionary Dynamics of the wnt
Gene Family: A Lophotrochozoan Perspective // Mol. Biol. Evol. 2010. V. 27. P.
1645–1658.
40. Choe C.P., Collazo A., Trinh Le. A., et al. Wnt-dependent epithelial
transitions drive pharyngeal pouch formation // Dev. Cell. 2013. V. 24. P. 296-309.
41. Clark A.M., Rowe F.W.E. Monograph of the shallow-water Indo-West
Pacific echinoderms // London: Trustees of the British Museum (Natural History),
1971. 238 p.
105
42. Clements V.K., Kim A.D., Ong K.G., et al. A somatic Wnt16/Notch
pathway specifies heamatopoetic stem cell // Nature. 2011. V. 474. P. 220-224.
43. Conand C. Population status, fisheries and trade of sea cucumbers in Africa
and Indian ocean // 2008. P. 153–205. In: Toral-Granda V., Lovatelli A. and
Vasconcellos M. (eds). Sea cucumbers. A global review on fishery and trade. F.A.O
Fish. Tech. Pap. №. 516. FAO, Rome 319 p.
44. Croce J. C., Wu S.Y., Byrum C., et al. A genome-wide survey of the
evolutionarily conserved Wnt pathways in the sea urchin Strongylocentrotus
purpuratus // Dev. Biol. 2006. V. 300. P. 121-131.
45. Croce J., Range R., Wu S. Y., et al. Wnt6 activates in the sea urchin gene
regulatoty // Biol. Reprod. 2011. V. 138. P. 3297-3306.
46. Czarkwiani A., Dylus D.V., Oliveri P. Expression of skeletogenic genes
during arm regeneration in the brittle star Amphiura filiformis // Gene Expr. Patterns.
2013. V. 13. P. 464-472.
47. Debeir O., Adanja I., Kiss R., Decaestecker C. Models of cancer cell
migration and cellular imaging and analysis // Trans. Res. Net. 2008. V. 37. P. 129.
48. Demircan T., Berezikov E. The Hippo pathway regulates stem cells during
homeostasis and regeneration of the flatworm Macrostomum lignano // Stem Cells
Dev. 2013. V. 22. P. 2174-2185.
49. Dolmatov I.Y. Regeneration of the aquapharyngeal complex in the
holothurian Eupentacta fraudatrix (Holothuroidea, Dendrochirota) // Keys for
Regeneration. Monogr. Dev. Biol. V. 23. Basel: Karger. 1992. С. 40-50.
50. Dolmatov I.Y., Ginanova T.T. Muscle regeneration in holothurians
// Microsc. Res. Tech. 2001. V. 55. P. 452–63.
51. Dolmatov I.Y., Mashanov V.S., Zueva O.R. Derevation of muscles of the
Aristotle’s lantern from coelomic epithelia // Cell. Tissue. Res. 2007. V. 327. P. 371384.
106
52. Du S.J., Purcell S.M., Christian J.L., et al. Identification of distinct classes
and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric
proteins in Xenopus embryos // Mol. Cel. Biol. 1995. V. 15. P. 2625-2634.
53. Dupont S., Thorndyke M.C. Growth or differentiation. Adaptive
regeneration in the brittlestar Amphiura filiformis // J. Exp. Biol. 2006. V. 209. P.
3873-3881.
54. Eisenmann D.M. Wnt signaling // WormBook. 2005. P. 17.
55. Emson R.H., Wilkie I.C. Fission and autotomy in echinoderms // Oceanogr.
Mar. Biol. Ann. Rev. 1980. V. 18. P. 155-250.
56. Fan M.J., Ning W.G., Walz G., Sokol S.Y. Wnt signaling and
transcriptional control of siamois in Xenopus embryos // Dev. Biol. 1998. V. 95. P.
5626–5631.
57. Fathke C., Wilson L., Shah K., et al. Wnt signaling induces epithelial
differentiation during cutaneous wound healing // B.M.C. Cell. Biol. 2006. V. 7, №.
4. P. 1-9.
58. Frolova L.T., Dolmatov I.Y. Microscopyc anatomy of the digestive system
in normal and regeneration speciments of the brittlestar Amphipholis koshii // Biol.
Bull. 2010. V. 218. P. 303-316.
59. Fu J., Jiang M., Mirando A.J., et al. Reciprocal regulation of Wnt and
Gpr177/mouse Wntless is required for embryonic axis formation // Proc. Nat. Acad.
Sci. USA. 2009. V. 106, №. 44. P. 18598–18603.
60. Garcia-Arraras J.E., Dolmatov I.Y. Echinoderms: potential model systems
for stydies on muscle regeneration // Curr. Pharm. Des. 2010. V. 16. P. 942-955.
61. Gibson A.W., Bukre R.D. Gut regeneration by morphallaxis in the sea
cucumber Leprosynapta clarki (Heding, 1928) // Can. J. Zool. 1983. V. 61. P. 27202732.
62. Goss R.J. The evolution of regeneration – adaptive or inherent // J. Theor.
Biol. 1992. V. 159. P. 241-260.
107
63. Grumolato L., Liu G., Mong P., et al. Canonical and noncanonical Wnts
use a common mechanism to activate completely unrelated coreceptors // Gen. Dev.
2010. V. 24. P. 2517–2530.
64. Guder C., Philipp I., Lengfeld T. The Wnt code: cnidarians signal the way
// Oncogene. 2006. V. 25. P. 7450–7460.
65. Jiang Z., Von den Hoff J.W., Torensma R., et al. Wnt16 is involved in
intramembranous ossification and suppresses osteoblast differentiation through the
Wnt/β-catenin pathway // J. Cell. Physiol. 2014. V. 229. P. 384-92.
66. Jones S.E., Jomary C. Secreted Frizzled-related proteins: searching for
relationships and patterns // Bioessays. 2002. V. 24. P. 811-820.
67. Hammond L.M., Hofmann G.E. Early developmental gene regulation in
Strongylocentrotus purpuratus embryos in response to elevated CO2 seawater
conditions // J. Exp. Biol. 2012. V. 215. P. 2445-2454.
68. Harper J.A., Yuan J.S., Tan J.B., et al. Notch signaling in development and
disease // Clin. Genet. 2003. V. 64. P. 461-472.
69. Holsten T.W. Wnt signaling in cnidarians // Methods. Mol. Biol. 2008. V.
469. P. 47-54.
70. Howard-Ashby M., Materna S.C., Brown C.T., et al. Identification and
characterization of homeobox transcription factor genes in Strongylocentrotus
purpuratus, and their expression in embryonic development // Dev. Biol. 2006. V.
300. P. 74-89.
71. Huelsken J., Behrens J. The Wnt signalling pathway // Cell Science at a
Glance. 2002. V. 115. P. 3977-3978.
72. Hyman L.H. The invertibrates: Echinodermata. The coelome Bilateria //
New York: McGraw-Hill Book Co. Inc. 1995. 763 p.
73. Ingham P.W., Nakano Y., Seger C. Mechanisms and functions of
Hedgehog signalling across the metazoa // Nat. Rev. Genet. 2011. V. 12. P. 393-406.
74. Ingraham C.A., Park G.C., Makarenkova H.P., Crossin K.L. Matrix
metalloproteinase (MMP)-9 induced by Wnt signaling increases the proliferation and
108
migration of embryonic neural stem cells at low O2 levels // J. Biol. Chem. 2011. V.
286. P. 17649-17657.
75. Katoh M., Kirikoshi H., Saitih T., et al. Alternative splicing of the wnt2B/wnt-13 gene // Biochem. Biophys. Res. Com. 200. V. 275. P. 209-216.
76. Kawakami Y., Esteban C.R., Raya M., et al. Wnt/beta-catenin signaling
regulates vertebrate limb regeneration // Gene. Dev. 2006. V. 20. P. 3232-3237.
77. Kawano Y., Kypta R. Secreted antagonists of the Wnt signalling pathway//
J. Cell. Science. 2003. V. 116. P. 2627-2634.
78. Kille F.R. Regeneration in Thyone briareus Lesueur following induced
autotomy // Biol. Bull. 1935. V. 69. P. 82–103.
79. Kille F.R. Regeneration in holothurians // Ann. Rept. Tortugas Lab.
Carnegie Inst. Wash. 1936. V. 35. P. 85–86.
80. Kille F.R. Regeneration in the genus Holothuria // Yb. Carnegie Inst. Wash.
1937. V. 36. P. 93–94.
81. Knapp D., Schulz H., Rascon C.A., et al. Comparative transcriptional
profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program
// Plos One. 2013. V. 8. P. 1-20.
82. Komekado H., Yamamoto H., Chiba T., Kikuchi A. Glycosylation and
palmitoylation of Wnt-3a are coupled to produce an active form of Wnt-3a // Genes
to cell. 2006. V. 12. P. 521-534.
83. Komiya.Y., Habs. R. Wnt signal transduction pathways // Landes
Bioscience 2008. V. 4. P. 68-75.
84. Koniaris L.G., McKillop I.H., Schwartz S.I., Zimmers T.A. Liver
regeneration // J. Am. Coll. Surg. 2003. V. 197. P. 634–659.
85. Kirikoshi H., Sekihara H., Katoh M. Expression profiles of 10 members of
Frizzled gene family in human gastric cancer // Int. J. Oncol. 2001. V. 19. P. 767-771.
86. Kuhl M., Sheldahl L.C., Malbon C.C., Moon R.T. Ca²/calmodulindependent protein kinase ll is stimulated by Wnt and Frizzled homologs and
109
promotes ventral cell fates in Xenopus // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 1270112711.
87. Lamash N. E., Dolmatov I. Yu. Proteases from the regenerating gut of the
Holothurian Eupentacta fraudatrix // Plos One. 2013. V. 8. P. 1-12.
88. Lavery D.L., Martin J., Turnbull Y.D., Hoppler S. Wnt6 signaling regulates
heart muscle development during organogenesis // Dev. Biol. 2008a. V. 323. P. 177188.
89. Lavery D.L., Davenport I.R., Turnbull Y.D., et al. Wnt6 expression in
epidermis and epithelial tissues during Xenopus organogenesis // Dev. Dyn. 2008b.
V. 237. P. 768-779.
90. Leibson N.L. Regeneration of digestive tube in holothurians Stichopus
japonicus and Eupentacta fraudatrix // Key. Regen. Monogr. Dev. Biol. 1992. V. 23.
P. 51–61.
91. Lengfeld T., Watanabe H., Simakov O., et al. Multiple Wnts are involved
in Hydra organizer formation and regeneration // Dev. Biol. 2009. V. 330. P. 169199.
92. Lhomond G., McClay D.R. Gache C., Croce J.C. Frizzled1/2/7 signaling
derects β-catenin nucrearisation and inintiates endoderm specification in macromeres
during sea urchin embryogenesis // Development. 2012. V. 139. P. 816-825.
93. Looso M., Preussner J., Sousounis K. et al. A de novo assembly of the newt
transcriptome combined with proteomic validation identifies new protein families
expressed during tissue regeneration // Genome Biology. 2013. V. 14.
94. Lyons J.P. Mueller U.W., Ji H., et al. Wnt4 activate the canonical betacatenin-mediated Wnt pathway and binds Frizzled-6 CRD: functional implications of
Wnt/beta-catenin activity in kidney epithelial cells // Exp. Cell. Res. 2004. V. 298. P.
369-387.
95. Mashanov V.S., Dolmatov I.Y., Heinzeller T. Transdifferentiation in
holothurian gut regeneration // Biol. Bull. 2005. V. 209. P. 184–193.
110
96. Mashanov V.S., García-Arrarás J.E. Gut regeneration in holothurians: a
snapshot of recent developments. Biol. Bull. 2011. V. 221. P. 93-109.
97. Mashanov V.S., Zueva O.R, Heinzeller T. Regeneration of the radial nerve
cord in a holothurian: a promising new model system for studying post-traumatic
recovery in the adult nervous system // Tissue. Cell. 2008. V. 40. P. 351-72.
98. Mashanov V.S., Zueva O.R., Garcia-Arraras J.E. Retrotransposons in
animal regeneration: Overlooked components of the regenerative machinery? // Mob.
Genet. Elements. 2012a. V. 2. P. 244-247.
99. Mashanov V.S., Zueva O.R., García-Arrarás J.E. Expression of Wnt9,
TCTP, and Bmp1/Tll in sea cucumber visceral regeneration // Gene. Expr. Patterns.
2012b. V. 12. P. 24-35.
100. Mashanov V.S., Zueva O.R., García-Arrarás J.E. Transcriptomic changes
during regeneration of the central nervous system in en echinoderm // B.M.C.
Genomic. 2014. V. 15.
101. Mladenov P.V., Bisgrove B., Asotra S., Burke R.D. Mechanisms of arm
tip regeneration in the sea star, Leptasterias hexactis // Roux’s. Arch. Dev. Biol.
1989. V. 198. N. 1. P. 425-436.
102. Moon R.T., Brown J.D., Torres M. WNTs modulate cell fate and
behavior during vertebrate development // Trends. Genet. 1997. V. 13. P. 157-162.
103. McCauley B.S., Akyar E., Filliger L., Hinman V.F. Expression of wnt and
frizzled genes during early sea star development // Gene Expr. Patterns. 2013. V. 13.
P. 437-444.
104. Mo S., Cui Z. Regulation of canonical wnt signaling during development
and diseases // Embryogenesis, Dr. Ken-Ichi Sato (Ed.). 2012. InTech.
105. Munder S., Tischer S., Grundhuber M. Notch-signalling is required for
head regeneration and tentacle patterning in Hydra // Dev. Biol. 2013. V. 383. P. 146157.
106. Murray G., García-Arrarás J.E. Myogenesis during holothurian intestinal
regeneration // Cell Tissue Res. 2004. V. 318. P. 515–524.
111
107. Nace A.G. The degestive system and lantern complex of Thyonella
gemmata (Pourtales): structure and regeneration // Diss.Abstr. Int. 1972. V. 32B. №
9. P. 5539.
108. Nishita M., Yoo S.K., Nomachi A., et al. Filopodia formation mediated by
receptor tyrosine kinase Ror2 is required for Wnt5a-induced cell migration // J. Cell
Biol. 2006. V. 175. P. 555–562.
109. Nomachi A., Nishita M., Inaba D., et al. Receptor tyrosine kinase ror2
mediates wnt5a-induced polarized cell migration by activating c-jun n-terminal
kinase via actin-binding protein filamina // J. Biol. Chem. 2008. V. 283. P. 2797327981.
110. Nusse R., van Ooyen A., Cox D., et al. Mode of proviral activation of a
putative mammary oncogene (int-1) on mouse chromosome 15 // Nature. 1984. V.
307. P. 131-136.
111. Nusse R., Varmust H.E. Wnt genes // Cell. 1992. V. 69. P. 1073-1087.
112. Odintsova N.A., Dolmatov I.Yu., Mashanov V.S. Regenerating
holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures // Mar. Biol. 2005.
V. 146. P. 915–921.
113. Ortiz-Pineda P.A., Ramírez-Gómez F., Pérez-Ortiz J., et al. Gene
expression profiling of intestinal regeneration in the sea cucumber // B.M.C.
Genomics. 2009. V. 10. P. 262.
114. Osakada F., Ooto S., Akagi T., et al. Wnt signaling promotes regeneration
in the retina of adult mammals // J. Neurosci. 2007. V. 27. P. 4210-4219.
115. Ott S.M. Sclerostin and wnt signaling - the pathway to bone strength //
J.C.E.M. 2005. V. 90. P. 6741-6743.
116. Pang K., Ryan J.F. Genomic insights into Wnt signaling in an early
diverging metazoan, the ctenophore Mnemiopsis leidyi // Evol. Devo. 2010. V. 1. P.
1-15.
117. Patruno M., Smertenko A., Candia Carnevali M.D., et al. Expression of
transforming growth factor beta-like molecules in normal and regenerating arms of
112
the crinoid Antedon mediterranea: immunocytochemical and biochemical evidence //
Proc. Biol. Sci. 2002. V. 269. P. 1741-1747.
118. Pimentel H., Parra M., Gee S., et al. A dynamic alternative splicing
program regulates gene expression during terminal erythropoiesis // Nucl. Acids. Res.
2013. V. 42. P. 4031-4042.
119. Petersen C.P., Reddien P.W. A wound-induced wnt expression program
controls planarian regeneration polarity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106.
P. 17061-17066.
120. Philipp I., Aufschnaiter R., Ozbek S., et al. Wnt/beta-catenin and
noncanonical Wnt signaling interact in tissue evagination in the simple eumetazoan
Hydra // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. P. 4290-4295.
121. Polakis P. Wnt signaling and cancer // Gen. Dev. 2000. V. 14. P. 18371851.
122. Prud’homme B., Lartillot N., Balavoine G., et al. Phylogenetic analysis of
the Wnt gene family: Insights from Lophotrochozoan members // Current Biology.
2002. V. 12. P. 1395–1400.
123. Prunskaite-Hyyrylainen R., Shan J., Railo A., et al. Wnt4, a pleotropic
signal for controlling cell polarity, basement membrane integrity, and antimullerian
hormone expression during oocyte maturation in the female follicle // F.A.S.E.B.
2014. V. 28. P. 1568-1581.
124. Randolph N., Christensen E., Weinstein M., Tassava R. Expression of
fibroblast growth factors 4, 8, and 10 in limbs, flanks, and blastemas of Ambystoma //
Dev. Dynam. 2002. V. 223. P. 193–203.
125. Reichenbach N., Holloway S. Potential for asexual propagation of several
commercially important species of tropical sea cucumbers (Echinodermata) // J.
World Aquac. Soc. 1995. V. 26. P. 272-278.
126. Riddiford N., Olson P.D. Wnt gene lost in flatworms // Dev. Genes Evol.
2011. V. 221. P. 187-197.
113
127. Ring A., Kim Y.M., Kahn M. Wnt/Catenin signaling in adult stem cell
physiology and desease // Stem Cell. 2014. V.10. P. 512-525.
128. Rinkevich Y., Voskoboynik A., Rosner A., et al. Repeated, long-term
cycling of putative stem cells between niches in a basal chordate // Dev. Cell. 2013.
V. P. 1-23.
129. Robert N., Lhomond G., Schubert M., Croce J.C. A comprehensive survey
of wnt and frizzled expression in the sea urchin Paracentrotus lividus // Genesis.
2014. V. 52. P. 235-250.
130. Rojas-Cartagena C., Ortíz-Pineda P., Ramírez-Gómez F., et al. Distinct
profiles of expressed sequence tags during intestinal regeneration in the sea
cucumber Holothuria glaberrima // Physiol. Gen. V. 31. P. 203-215.
131. Rossant J. Genes for regeneration // Elife. 2014. V. 3.
132. Saneyoshi T., Kume S., Amasaki Y., Mikoshiba K. The Wnt/calcium
pathway activates NF-AT and promotes ventral cell fate in Xenopus embryos
// Nature. 2002. V. 417. P. 295–299.
133. Schubert M., Holland L.Z., Holland N.D., Jacobs D.K. A. Phylogenetic
tree of the wnt genes based on all available full-length sequences, including five from
the cephalochordate Amphioxus // Mol. Biol. Evol. 2000. V. 17. P. 1896–1903.
134. Sidow A. Deversification of the Wnt gene family on the ancestral lineage
of vertebrates // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 5098-5102.
135. Sikes J.M., Newmark P.A. Restoration of anterior regeneration in a
planarian with limited regenerative ability // Nature. 2013. V. 500. P. 77-81.
136. Seifert J.R., Mlodzik M. Frizzled/PCP signalling: a conserved mechanism
regulating cell polarity and directed motility // Nat. Rev. Genet. 2007. V. 8. P. 126–
138.
137. Schnaper H.W., Hayashida T., Hubchak S.C., Poncelet A.C. TGF-beta
signal transduction and mesangial cell fibrogenesis // Am. J. Physiol. Renal.
Physiol. 2003. V. 284. P. 243-252.
114
138. Schnapp E., Kragl M., Rubin L., Tanaka E.M. Hedgehog signaling
controls dorsoventral patterning, blastema cell proliferation and cartilage induction
during axolotl tail regeneration // Development. 2005. V. 132. P. 3243–3253.
139. Sodergreen E., Weinstock G.M., Davidson E.H., et al. The genome of the
sea urchin Strongulocentrotus purpuratus // Science. 2006. V. 314. №. 5801. P. 941952.
140. Soergel D.A.W., Lareau L.F., Brenner S.E. Regulation of gene expression
by cupling of alternative splucing and NMD // Maquart L.E. (Ed) Nonsense-mediated
mRNA Decay. 2006. P. 195-196.
141. Sousounis K., Looso M., Maki N., et al. Transcriptome analysis of newt
lens regeneration reveals distinct gradient in gene expression patterns // Plos One.
2013. V. 8. P. 1-18.
142. Stoick-Cooper C. L., Moon R.T., Weidinger G. Advances in signaling in
vertebrate regeneration as a prelude to regenerative medicine // Gen. Dev. 2007. V.
21. P. 1292-1315.
143. Strochlic L., Falk J., Goillot E., et al. Wnt4 participates in the formation of
vertebrate neuromuscular junction // Plos One. 2012. V. 7. P. 1-12.
144. Sun L., Chen M., Yang H. et al. Large scale gene expression profiling
during intestine and body wall regeneration in the sea cucumber Apostichopus
japonicus // Genomics Proteomics. 2011. V. 6. P. 195–205.
145. Sun L., Yang H., Chen M. et al. RNA-Seq reveals dynamic changes of
gene expression in key stages of intestine regeneration in the sea cucumber
Apostichopus japonicas // Plos One. 2013a. V. 8. P. 1-18.
146. Sun L.N., Yang H.S., Chen M.Y., Xu D.X. Cloning and expression
analysis of Wnt6 and Hox6 during intestinal during regeneration in the sea cucumber
Apostichopus japonicas // G.M.R. 2013b. V. 12. P. 5321-5334.
147. Swalla B.J., Smith A.B. Deciphering deuterostome phylogeny: molecular,
morphological and palaentological perspectives // Phil. Trans. R. Soc. B. 2008. V.
363. P. 1557–1568.
115
148. Takeo M., Chou W.C., Sun Q., et al. Wnt activation in nail epithelium
couples nail growth to digit regeneration // Nature. 2013. V. 499. P. 228–232.
149. Torelle E. Regeneration in holothuria // Zool. Anz. 1910. V. 3. P. 15–22.
150. Tracey D.J. Evisceration and regeneration in Thyone okeni (Bell, 1884) //
Proc. Linnean Soc. N.S.W. 1972. V. 97. P. 72–81.
151. Umesono Y., Tasaki J., Nishimura Y., et al. The molecular logic for
planarian regeneration along the anterior–posterior axis // Nature. 2013. V. 500. P.
73-77.
152. Vaughn R., Garnhart N., Garey J.R., et al. Sequencing and analysis of the
gastrula transcriptome of the brittle star Ophiocoma wendtii // Evol. Devo. 2012. V.
19. P. 1-16.
153. Vincan E. Wnt Signaling // Humana press. New York. 2008. P. 469.
154. Vlodavsky C. R., Bråkenhielm E., Pawliuk R., et al. Angiogenic
synergism, vascular stability and improvement of hind-limb ischemia by a
combination of PDGF-BB and FGF-2 // Nature Med. 2003. V. 9. P. 604-613.
155. Wallingford J.B., Habas R. The developmental biology of Dishevelled: an
enigmatic protein governing cell fate and cell polarity // Development. 2005. V. 132.
P. 4421–4436.
156. Wang Q., Lu J., Zhang S., et al. Wnt6 is essential for stromal cell
proliferation during decidualization in mice // Biol. Reprod. V. 88.
157. Wijk B., Gunst D.Q., Moorman F. M., Hoff J. B. Cardiac regeneration
from activated epicardium // Plos One. 2012. V. 7. P. 1-14.
158. Wilkie I.C. Autotomy as a prelude to regeneration in echinoderms //
Microsc. Res. Tech. 2001. V. 55. P. 369-396.
159. Witze E.S., Litman L.S., Argastas G.M., et al. Wnt5a Control of cell
polarity and directional movement by polarized redistribution of adhesion receptors //
Science. 2008. V. 320. P. 365–369.
116
160. Wu B., Crampton S.P., Hughes C.C. Wnt signaling induces matrix
metalloproteinase expression and regulates T cell transmigration // Immunity. 2007.
V. 26. P. 227–239.
161. Yokoyama H., Yonei-Tamura S., Endo T., et al. Mesenchyme with fgf-10
expression is responsible for regenerative capacity in Xenopus limb buds // Dev. Biol.
2000. V. 219. P. 18–29.
162. Yokoyama H., Maruoka T., Ochi H., et al. Different requirement for
Wnt/β-catenin signaling in limb regeneration of larval and adult Xenopus // Plos
One. 2011. V. 6. P. 1-13.
163. Yu B., Chang J., Liu Y., et al. Wnt4 signaling prevent skeletal aging and
inflammation by inhibiting nuclear factor-kB // Nat. Med. 2014. V. 20. P. 1009-1017.
164. Zechel S., Werner S., Unsicker K., et al. Expression and functions of
fibroblast growth factor 2 (FGF-2) in hippocampal formation // Neuroscientist. 2010.
V. 16. P. 357-373.
165. Zhang B., Wang M., Gong A., et al. HucMSC-exosome-mediated Wnt4
signaling is required for cutaneous wound healing // Stem Cells. 2014.
166. Zhao L., Borikova A.L., Ben-Yair R., et al. Notch signaling regulates
cardiomyocyte proliferation during zebrafish heart regeneration // P.N.A.S. 2014. V.
11. P. 1403-1408.