колокализация арабиногалактановых белков и фенолов в

Структура и динамика молекулярных систем, 2007 г., Выпуск №1
УДК 581.1
КОЛОКАЛИЗАЦИЯ АРАБИНОГАЛАКТАНОВЫХ БЕЛКОВ И
ФЕНОЛОВ В КЛЕТКАХ ПРОЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОЧНЫХ
КОМПЛЕКСОВ МОРФОГЕННОГО КАЛЛУСА И НЕЗРЕЛЫХ
ПЛОДОВ ГРЕЧИХИ ТАТАРСКОЙ1
Архипова С.С., Акулов А.Н., Румянцева Н.И.
Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН
Введение
Арабиногалактановые белки (АГБ) – это протеогликаны, участие
которых в регуляции морфогенеза in vitro показано во многих работах
(Румянцева, 2005). АГБ в комплексе с другими секретируемыми белками и полисахаридами формируют специфическую фибриллярную
структуру на поверхности проэмбриональных клеточных комплексов
(ПЭКК) морфогенных каллусов (МК), которая отсутствует на поверхности клеток неморфогенных каллусов (НК) (Румянцева и др., 2003).
ПЭКК рассматриваются рядом авторов, как зиготические зародыши,
остановленные в развитии на стадии проэмбрио, добавлением ауксина в
среду культивирования (Souter, Lindsey, 2000). Тем не менее, в литературе до сих пор нет единого мнения о природе ПЭКК и способе их воспроизведения in vitro. Ранее было показано, что ПЭКК МК гречихи татарской являются сложно дифференцированными структурами, образованными несколькими типами клеток (Румянцева и др., 2004). На поверхности ПЭКК находятся клетки, имеющие крупную вакуоль с коричневым содержимым. В этих же клетках ранее с использованием моноклональных антител к АГБ была установлена вакуолярная локализация АГБ (Румянцева и др., 2002). Данные о том, какими клетками секретируются АГБ, так же как и сведения о локализации АГБ в ПЭКК и
тканях незрелых плодов в литературе представлены слабо. Цель работы
заключалась в изучении локализации АГБ в клетках ПЭКК и незрелых
плодов гречихи татарской.
Материалы и методы
Объектом исследования служил дикий вид гречихи Fagopyrum
tataricum (L.) Gaertn. Растения выращивали в вегетационных сосудах на
открытом воздухе. Каллусные культуры были получены из незрелых
зародышей по методике, описанной ранее (Румянцева и др., 1989). Для
1
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 05-04-49433a.
Раздел 1
гистохимических исследований материал фиксировали в 10% -ном нейтральном формалине, обезвоживали в ряде спиртов с повышением концентрации и через ксилол заключали в парафин. Срезы толщиной 7 мкм
депарафинировали, регидратировали и окрашивали гистологическими
красителями. АГБ выявляли окрашиванием срезов в растворе 0,05%ного реагента Ярива в 0,05 М калий-фосфатном буфере с добавлением
NaCl до концентрации l%. Для выявления бесцветных проантоцианидинов (неокисленных таннинов) срезы окрашивали 1%-ным раствором
ванилина в 6Н НСl (Debeaujon еt al., 2000), фенолы – 1%-ным толуидиновым синим. Идентификацию поверхностных АГБ, образующих фибриллярную структуру на поверхности ПЭКК, проводили с помощью
реагента Ярива на сделанных вручную срезах нефиксированного материала. Срезы анализировали с использованием светового микроскопа
Jеnamed (Carl Zeiss, Германия) и фотографировали с помощью фотоприставки AxioCam MRc5 (Carl Zeiss, Германия). Для электронномикроскопических исследований материал фиксировали в 2,5%-ном глютаровом альдегиде на 0,1М фосфатном буфере, обезвоживали в ряде спиртов
с повышением концентрации, ацетоне, пропиленоксиде и далее заключали в эпон. Срезы получали на ультрамикротоме LKB (Швеция) и просматривали на электронном микроскопе Jeol 1200SX (Япония).
Результаты и их обсуждение
Электронномикроскопически было показано, что поверхностные
клетки ПЭКК имеют в вакуоли электронноплотное содержимое, которое
может заполнять всю вакуоль (рис.1а). Коричневое окрашивание содержимого вакуолей, выявляемое на неокрашенных срезах, могло свидетельствовать о том, что в вакуоли содержатся таннины, поскольку появление коричневой окраски наблюдается при окислении бесцветных
предшественников таннинов (Barz, 1977). Окрашивание срезов ПЭКК с
помощью солянокислого ванилина, специфичного к таннинам, подтвердило это предположение (рис.1 б). Используя реагент Ярива – краситель, специфически связывающийся с АГБ, мы подтвердили полученные ранее результаты (Румянцева и др., 2002, 2003; Акулов, 2006), свидетельствующие о том, что АГБ входят в состав фибриллярной структуры, покрывающей поверхность ПЭКК морфогенного каллуса (рис.1в).
Нами также было показано, что реагентом Ярива окрашиваются вакуоли
поверхностных клеток ПЭКК с темным содержимым (рис.1г). Эти данные согласуются с проведенными ранее иммуноцитохимическими исследованиями (Румянцева и др., 2002). Таким образом, мы впервые выявили вакуолярную колоколизацию АГБ и таннинов в эмбриогенных
тканях.
Структура и динамика молекулярных систем, 2007 г., Выпуск №1
а
д
е
б
ж
в
г
Рис.1. Идентификация АГБ и таннинов в клетках ПЭКК и тканях незрелых плодов гречихи татарской на 2 сут. после опыления: а – электронноплотные включения в вакуолях поверхностных клеток ПЭКК, электронная микроскопия; б –
таннины в вакуолях поверхностных клеток ПЭКК, окрашивание солянокислым
ванилином; в – АГБ в фибриллярной сети на поверхности ПЭКК, окрашивание
реагентом Ярива; г – АГБ в вакуолях поверхностных клеток ПЭКК, окрашивание реагентом Ярива; д - АГБ в тканях незрелого плода, окрашивание реагентом Ярива; е - фенолы в тканях незрелого плода, окрашивание толуидиновым
синим; ж - клетки эндокарпия, окрашенные реагентом Ярива; ЭнК – эндокарпий, ЭзТ – экзотелий, ХЛ – халаза, Ф – фуникулюс, ЦВ – центральная вакуоль,
Н – нуцеллус, стрелками обозначены указанные области.
Раздел 1
Важно отметить, что таннины обнаруживают высокую аффинность к пролин-содержащим белкам (Hagerman, Butler, 1981), к которым относятся АГБ. В связи с этим их колокализация представляется
вполне объяснимой. Тем не менее, функции поверхностных клеток,
содержащих АГБ и таннины в вакуоли, не известны. Поскольку развитие соматических зародышей имеет большое сходство с развитием зиготических зародышей, мы проверили, существуют ли в тканях незрелых
плодов подобные клетки. Недавно было обнаружено (Debeaujon et al.,
2003), что клетки микропиле, халазы и эндотелия плодов арабидопсиса
содержат таннины. Предполагаемые функции этих клеток: защитные и
регуляторные. На выполненных нами гистологических срезах хорошо
видно, что ткани фуникулуса, халазы, микропиле, экзотелия и эндокарпия 2 сут плода гречихи татарской окрашиваются одновременно на фенолы и АГБ (рис.1 д,е,ж). Имеется одно отличие: в клетках эндокарпия
фенолы, вероятно, присутствуют в цитоплазме, а в клетках фуникулуса,
халазы, микропиле и экзотелия - в вакуолях, что сближает эти клетки
по структуре с поверхностными клетками ПЭКК. Крайне важным представляется изучение функций клеток, имеющих колокализацию АГБ и
фенолов в морфологических структурах различного типа.
Литература:
Акулов А.Н. //Автореф. дисс…. канд. биол. наук. Казань: КИББ КНЦ
РАН. 2006. 24 с.
Румянцева Н.И., Сергеева Н.В., Хакимова Л.В., Сальников В.В., Гумерова Е.А., Лозовая В.В. //Физиол. растений. 1989. Т.36. С.187-194.
Румянцева Н.И., Шамай Й., Энзикат Х.-Й., Балушка Ф., Фолькманн Д. //
Труды III съезда биохим. общества. Санкт-Петербург. 2002 г. С.459.
Румянцева Н.И., Шамай Й., Энзикат Х.-Й., Сальников В.В., Костюкова
Ю.А., Балушка Ф., Фолькманн Д. // Докл.АН. 2003.Т.391. С.123-127.
Румянцева Н.И., Акулов А.Н., Мухитов А.Р. // Прикладная биохимия и
микробиология . 2004. Т.40. С.571-578.
Румянцева Н.Н. // Биохимия. 2005 Т. 70. С. 1301 – 1317 .
Barz W. //Physiol. Veg. 1977. V. 15. P. 261–277.
Debeaujon I., Leon-Kloosterziel K.M., Koornneef M. //Plant Physiol. 2000.
V.122. P. 403–413.
Debeaujon I., Nesi N., Perez P., Devic M., Grandjean O., Caboche M., Lepiniec L. // The Plant Cell. 2003.Vol. 15. P.2514–2531.
Hagerman A.E., Butler L. G. //The journal of biol. chemistry. 1981. Vol. 256.
P. 4494-4497.
Souter M., Lindsey K. //J. Exp.Bot. 2000. V. 51. P. 971-983.