На правах рукописи ТРЕНДЕЛЕВА Татьяна Алексеевна ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МЕМБРАНОТРОПНЫХ КАТИОНОВ
advertisement
На правах рукописи ТРЕНДЕЛЕВА Татьяна Алексеевна ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МЕМБРАНОТРОПНЫХ КАТИОНОВ С МИТОХОНДРИЯМИ ДРОЖЖЕЙ YARROWIA LIPOLYTICA Специальность 03.01.04 – «Биохимия» АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук МОСКВА – 2012 Работа выполнена в лаборатории биологического окисления Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Р.А. Звягильская Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Д.Б. Зоров доктор биологических наук, профессор Г.И. Эль-Регистан Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук Защита состоится «01» марта 2012 г. в «14» часов на заседании диссертационного совета (Д 002.247.01) при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, строение 2. С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, строение 1. Автореферат разослан «31» января 2012 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Митохондрии часто называют локомотивом клетки. Хотя их роль в образовании АТР посредством окислительного фосфорилирования имеет решающее значение, они выполняют в клетке и другие важные функции, в том числе в катаболическом и анаболическом метаболизме, поддержании гомеостаза Сa2+, образовании активных форм кислорода (АФК), клеточной сигнализации и апоптозе. Предполагается, что окисление биополимеров АФК играет ведущую роль в старении организма [Harman, 1956]. Митохондриальные активные формы кислорода и окислительные повреждения митохондрий, вызванные ими, являются причиной различных патологий, включая диабет, сердечно-сосудистые расстройства, инфаркт, инсульт, нейродегенеративные и другие возрастные заболевания. Неудивительно, что исследователями неоднократно предпринимались попытки замедлить старение с помощью антиоксидантов. Наиболее успешным с этой точки зрения оказалось использование МitoQ – положительно заряженного (следовательно, транспортирующегося исключительно в митохондрии) липофильного катиона трифенилфосфония, соединенного C10алифатической цепью с убихиноном, компонентом электронтранспортной цепи митохондрий, обладающего антиоксидантной активностью (см. обзор [Murphy et al., 2007] и ссылки в нем). Митохондриально-направленные липофильные антиоксиданты имеют существенные преимущества перед другими антиоксидантами, поскольку они транспортируются в клетки и митохондрии в соответствии с величиной мембранного потенциала, генерируемого соответственно на цитоплазматической и митохондриальной мембранах, благодаря чему их концентрация в митохондриях могут увеличиваться на несколько порядков. Это позволяет использовать их в низких, нетоксичных, наномолярных и субмикролярных концентрациях. Более того, липофильные антиоксиданты, накапливаясь в липидном бислое внутренней митохондриальной мембраны, могут восстанавливаться (регенерироваться) компонентами дыхательной цепи, что обеспечивает их многократное функционирование. В.П. Скулачёв (см. обзоры [Скулачёв, 2007; Skulachev et al., 2009] и ссылки в них) предложил заменить убихинон в составе липофильного антиоксиданта на потенциально более мощный природный антиоксидант пластохинон, функционирующий в фотосинтетической цепи переноса электронов в условиях повышенной концентрации кислорода и увеличенной продукции АФК. В рамках руководимого В.П. Скулачёвым проекта были синтезированы различные производные пластохинона (под общим названием SkQ, где Sk означает проникающий катион, а Q – пластохинон). «Skulachev’s ion» – термин, введенный Д. Грином [Green, 1974]. Показано, что катионные производные пластохинона свободно проникают через бислойные липидные мембраны с образованием диффузионного потенциала расчетной величины. В ряде биологических моделей показано преимущество использования ионов Скулачёва (SkQs) по сравнению с МitoQ, поскольку, как первоначально и предполагалось В.П. Скулачёвым, у SkQs интервал концентраций, в которых 1 антиоксидантная активность преобладает над прооксидантной, был существенно шире, чем у МitoQ. Наиболее простой и в то же время адекватной моделью для изучения механизма действия SkQs остаются митохондрии. При этом прочно сопряженные митохондрии дрожжей имеют некоторые преимущества по сравнению с митохондриями животных, поскольку они практически лишены эндогенного дыхания, что позволяет исследовать скорости окисления индивидуальных субстратов окисления, и, как мы показали [Kovaleva et al., 2009], не имеют Ca2+/Pн-зависимых пор, что облегчает интерпретацию полученных данных. АФК могут вызывать не только различные патологии, о которых мы упомянули выше, но и апоптоз. Апоптоз – это генетически запрограммированный, четко отрегулированный, высококоординированный механизм гибели клеток, направленный на удаление невостребованных, поврежденных, инфицированных, ослабленных, закончивших свой жизненный цикл, потенциально опасных клеток. Для дрожжей в настоящее время показаны многочисленные случаи гибели клеток по механизму апоптоза под действием разных внешних стимулов и внутриклеточных дефектов [Ковалева и др., 2010]. Выявлен ряд апоптотических факторов (метакаспаза1 (Yca1p), AIF, AMID, Dnm1p, Rho5, GTPазы), некоторые из которых (цитохром с, эндонуклеаза G, белок, подобный протеазе HtrA– HtrA2) локализованы, как и в митохондриях животных, в межмембранном пространстве, и выход которых при повреждении внешней мембраны должен означать начало необратимой стадии апоптоза, приводящей в конечном итоге к гибели клетки. Однако вопрос о том, каким образом осуществляется выход апоптотических факторов из дрожжевых митохондрий, до недавнего времени не имел ответа. Для митохондрий животных известны два основных пути выхода апоптотических факторов из межмембранного пространства. Первый включает в себя активацию, конформационную перестройку, встраивание во внешнюю мембрану митохондрий и димеризацию проапоптотического белка Bax, члена семейства белков Bcl-2, в результате чего образуется пора [Sheridan et al., 2008; Yamaguchi et al., 2008]. Другим механизмом выхода апоптотических факторов из митохондрий является увеличение проницаемости митохондрий в результате открытия ряда пор во внутренней митохондриальной мембране [Kovaleva et al., 2009]. Дрожжи лишены белков семейства Bcl-2, а информация об индукции неспецифической проницаемости дрожжевых митохондрий крайне скудна и противоречива. Ранее [Kovaleva et al., 2009] в нашей лаборатории было показано, что митохондрии дрожжей аэробного типа обмена Yarrowia lipolytica и Dipodascus magnusii лишены Ca2+/Pн-зависимой, циклоспорин А-чувствительной поры и поры, индуцируемой одновременным добавлением относительно низких концентраций жирных кислот и Ca2+. Однако не все возможности индукции неспецифических пор были исследованы. Поэтому нами были поставлены следующие цели работы: 1. Исследовать влияние мембранотропных катионов на энергетические параметры митохондрий дрожжей Y. lipolytica; 2 2. Завершить исследование индукции митохондриях дрожжей Y. lipolytica. неспецифической проницаемости в В соответствии с целями работы были поставлены следующие задачи: 1. Выявить антиоксидантное, разобщающее, прооксидантное, ингибирующее и детергентное действие мембранотропных катионов с локализованным и делокализованным зарядами на дыхание и мембранный потенциал митохондрий Y. lipolytica, а также способность мембранотропных катионов усиливать разобщающее действие жирных кислот; 2. Исследовать возможность индукции неспецифической проницаемости в условиях анаэробиоза; 3. Исследовать возможность неспецифическую пору. превращения АТР-зависимого К+-канала в Научная новизна. Впервые проведено систематическое исследование влияния ионов Скулачёва (SkQs) на дрожжевые митохондрии. Показано, что в относительно низких концентрациях SkQs не повреждают целостность митохондриальной мембраны, не шунтируют перенос электронов по дыхательной цепи митохондрий, обладают антиоксидантной и разобщающей активностью, снижают мембранный потенциал. В более высоких концентрациях SkQs ингибируют дыхание в состоянии 3, оказывают прооксидантное, в еще более высоких – детергентное действие. Впервые показано, что только мембранотропные катионы с делокализованным зарядом усиливают транспорт гидрофобных карбоксилатов, в том числе жирных кислот. Обнаружена энергизация митохондрий дрожжей Y. lipolytica в условиях анаэробиоза за счет гидролиза ATP. Найдено, что Са2+ (в присутствии Са2+ ионофора ЕТН129) даже в условиях анаэробиоза не индуцирует повышенную проницаемость внутренней митохондриальной мембраны дрожжей Y. lipolytica. Найдено, что в условиях окислительного стресса при действии прооксидантов, особенно при использовании SkQs в концентрациях, вызывающих прооксидантный эффект, АТР-зависимый К+канал митохондрий дрожжей Y. lipolytica превращается в неспецифическую пору. Практическое значение работы. Данные, полученные при изучении SkQs, используются для оптимизации условий при заживлении ран, а также для лечения патологий митохондриального происхождения, вызванных окислительным стрессом, в частности «возрастных» болезней (катаракта, ретинопатия, макулодистрофия, глаукома, диабет, остеопороз и некоторые другие) (доклинические испытания). Особенно перспективным представляется использование полученных нами данных об усилении ионами Скулачёва разобщающего действия карбоксилатов и других гидрофобных анионов при лечении ожирения. Попытки лечения ожирения с помощью классического разобщителя 2,4-динитрофенола (DNF) неоднократно предпринимались в прошлом (начиная с 40-х годов), однако признавались неудачными из-за заметного токсического действия DNF, добавляемого в высоких концентрациях. При совместном использовании катионного SkQ и анионного DNF появляется возможность многократно уменьшить действующие концентрации DNF. 3 Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Всероссийской конференции молодых учёных и II школы «Окисление, окислительный стресс и антиоксиданты» им. Академика Н.М. Эммануэля (2006, Москва); Европейских Биоэнергетических Конференциях (EBEC) (2006, Москва; 2010, Варшава); Конгрессах FEBS (2007, Вена; 2008, Афины; 2009, Прага); 24-й Международной конференции «Yeast Transport and Energetics» (2006, Прага); 2-м Съезде микологов России с международным участием «Современная микология в России» (2008, Москва); XXII Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2010, Москва). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей в рецензируемых журналах, 1 статья в сборнике, а также 8 тезисов докладов на конференциях. Объем и структура работы. Работа изложена на 180 страницах печатного текста, содержит 110 рисунков и 4 таблицы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (385 источников, в том числе 349 на иностранных языках). МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Организм и условия выращивания. В работе использовали дрожжи Yarrowia lipolytica (Wick.) van der Walt and Arx, полученные из эпифитной микрофлоры листьев пустынных растений (пустыня Негев, Израиль) и идентифицированные как анаморфа Y. lipolytica [Zvyagilskaya et al., 2001]. Клетки выращивали на 750-мл колбах Эрленмейера (рабочий объем – 100 мл) при 28oC на роторной качалке (220 об/мин) на полусинтетической среде [Андреищева и др., 1997], содержавшей в качестве источника углерода и энергии 1%-ый сукцинат, и собирали в поздней экспоненциальной фазе роста (10-12 г сырой биомассы/л). Выделение митохондрий осуществляли по методу, разработанному в нашей лаборатории [Kovaleva et al., 2009]. Скорость поглощения кислорода определяли полярографическим методом в ячейке (рабочий объём 1 мл) c закрытым кислородным электродом типа Кларка. Величины дыхательного контроля и ADP/O рассчитывали по методу Чанса-Вильямса [Chance, Williams, 1956]. Основная среда инкубации содержала 0,6 М маннит, 0,2 мМ Tris-фосфатный буфер, рН 7,2 – 7,4, 20 мМ пируват, 5 мМ малат и митохондриальный белок (0,5 мг/мл). Потенциал, генерируемый на внутренней митохондриальной мембране, регистрировали на спектрофотометре Beckman coulter DU-650, используя двуволновой 4 режим (511 – 533 нм), с сафранином О в качестве потенциал-зависимого зонда [Akerman and Wikstrom, 1976]. Набухание митохондрий регистрировали на спектрофотометре Hitachi 557 (Япония), по уменьшению оптической плотности митохондриальной суспензии при 540 нм. Митохондриальный белок определяли по методу Брэдфорд [Bradford, 1976] с бычьим сывороточным альбумином в качестве стандарта. Образование пероксида водорода митохондриями оценивали флуориметрически на спектрофлуориметре MPF4 Hitachi (используя пару длин волн – 595 и 550 нм) в среде инкубации митохондрий, дополненной 0,0125 мг/мл пероксидазы хрена и 2 мкМ Amplex Red. Двумерный электрофорез проводили по O΄Фарреллу (1975) в градиенте полиакриламидного геля (ПААГ) при напряжении 200 В и токе 30 мА. Детекцию белковых фракций на гелевых пластинах осуществляли с использованием кумасси R250 [Fairbancs, 1971] и азотнокислого серебра [Blum, 1987]. Эту часть проводили совместно с Л.И. Ковалёвым. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Поглощение кислорода, нA В работе использовали только прочно-сопряженные митохондриальные препараты дрожжей Y. lipolytica. Они сохраняли регуляцию метаболического состояния – на Рис. 1. видны чёткие переходы из состояния 4 дыхания в состояние 3 при добавлении ADP и спонтанный выход в состояние 4 после фосфорилирования добавленного ADP. Митохондрии окисляли добавленные субстраты с высокими скоростями (Рис. 1), высокими величинами дыхательного контроля [Chance and Williams, 1955] и величинами ADP/O, близкими к теоретически возможным. ADP 240 нмоль 450 400 106 456 ADP 240 нмоль 350 88 449 300 72 250 0 1 2 Время, мин 3 4 Рис. 1. Амперометрическая кривая поглощения кислорода митохондриями, выделенными из дрожжей Y. lipolytica. Среда инкубации содержала 0,6 М маннит, 2 мМ Tris-фосфатный буфер, 1 мМ ЭДТА, рН 7,2-7,4, 20 мМ Tris-пируват, 5 мМ Tris-малат, митохондриальный белок – 0,5 мг/мл. Величины ДК при последовательных добавках ADP составляли: 4,3; 5,17; 6,2. Величины ADP/O при последовательных добавках ADP составляли: 3,0. Скорости поглощения кислорода (указаны вдоль кривой) выражены в нг-атом О/мин на 1 мг белка. В первой части работы исследовали влияние митохондриально-направленных мембранотропных катионов с делокализованным и локализованным зарядом на 5 характеристики митохондрий дрожжей Yarrowia lipolytica (скорость дыхания, набухание и величину мембранного потенциала). Формулы использованных веществ приведены на Рис. 2. Видно, что это вещества разной химической природы, содержащие в качестве проникающего катиона тетрафенилфосфоний (SkQs), родамин19 (SkQR19), метилкарнитин (SkQ2M) или природные катионы растительного происхождения палматин и берберин (SkQ9palmatine и SkQ9berberine). В качестве редокс-компонента в большинстве соединений использовался пластохинон (компонент фотосинтетической редокс-цепи), в случае MitoQ – убихинон (компонент дыхательной цепи). Исследовали и соединения, не содержащие хиноновой части (С12ТРР, С12R19, C10palmatine и C10berberine). Большинство представленных соединений имеют делокализованный заряд, за исключением ДТАБ (додецилтриметиламмонийбромид, DTAB), ЦТАБ (цетиллтриметиламмонийбромид, CTAB) и SkQ2М, имеющих локализованный заряд. 9 9 Рис. 2. Формулы использованных мембранотропных катионов [Скулачёв, 2007; Antonenko et al., 2008]. 6 Поглощение кислорода, нA 450 ADP 720 нмоль SkQ9berberine 4 мкM 400 350 300 Ротенон 16 мг/мг белка 250 200 150 100 50 пируват + малат 0 2 4 6 8 10 А Поглощение кислорода, нA Найдено, что ионы Скулачёва (SkQs) (на примере SKQ9berbrerine) не вызывают шунтирования переноса электронов в дыхательной цепи (Рис. 3). В качестве субстратов и ингибитора комплекса I дыхательной цепи использовались соответственно NAD- зависимые субстраты и ротенон, а комплекса II – сукцинат и малонат. 600 SkQ9berberine 6 мкM 550 500 450 Малонат 2 мM 400 350 300 250 200 150 100 50 12 ADP 400 нмоль сукцинат 0 2 4 6 8 10 Б 12 Время, мин Время, мин Рис. 3. SkQs не шунтируют перенос электронов по дыхательной цепи митохондрий дрожжей Y. lipolytica. Среда инкубации содержала 0,6 М маннит, 2 мМ Tris-фосфатный буфер, 1 мМ ЭДТА, рН 7,2-7,4, митохондриальный белок – 0,5 мг/мл. А) SkQ9berberine не шунтирует перенос электронов по дыхательной цепи от комлекса I. Среда инкубации содержала 20 мМ пируват, 5 мМ малат; Б) SkQ9berberine не шунтирует перенос электронов по дыхательной цепи от комлекса II. Среда инкубации содержала 10 мМ сукцинат. Все без исключения SkQs увеличивали скорость окисления NAD-зависимых субстратов (пирувата + малата) в состоянии 4 ~ в 2,5- 4 раза (Рис. 4), что указывало на их разобщающий эффект. В более высоких концентрациях их разобщающее действие сменялось на ингибирующее, что, как мы предположили, может быть связано с проявлением ими уже прооксидантного действия. V/V4 SkQ1 (К50 = 2,6 мкM) SkQ3 (К50 = 7 мкM) 4,0 Рис. 4. Скорость дыхания митохондрий Y. lipolytica в состоянии 4 как функция концентрации SkQs. Среда инкубации содержала 0,6 М маннит, 2 мМ Tris-фосфатный буфер, 1 мМ ЭДТА, рН 7,2-7,4, 20 мМ пируват, 5 мМ малат, митохондриальный белок – 0,5 мг/мл. SkQ9palmatine (К50 = 4,3 мкM) SkQ9berberine (К50 = 4,9 мкM) SkQR19 (К50 = 1,3 мкM) MitoQ (К50 = 6,1 мкM) 3,0 2,0 1,0 2 4 6 8 10 12 14 [SkQs], мкM 16 18 20 22 7 Путем прямого измерения образования пероксида водорода с Amplex Red и пероксидазой хрена показано (Рис. 5), что в низких концентрациях SkQs обладают антиоксидантным действием (образование пероксида водорода митохондриями уменьшается ниже исходного уровня). С повышением концентрации SkQs образование перекиси возрастало, превышая исходный уровень, что свидетельствовало о проявлении ими уже прооксидантного действия. SkQ1 SkQ9palmatine SkQ9berberine Образование H2O2 , нM 0,6 Рис. 5. SkQs оказывают антиоксидантное (в низких) и прооксидантное (в более высоких концентрациях) действие на митохондрии дрожжей Y. lipolytica. Образование пероксида водорода митохондриями в ответ на добавление в среду инкубации различных концентраций SkQs. Среда инкубации содержала 0,6 М маннит, 2 мМ Tris-фосфатный буфер, 1 мМ ЭДТА, рН 7,2-7,4, 20 мМ Tris-пируват, 5 мМ Tris-малат, 2 мкМ Amplex Red, 0,0125 мг/мл пероксидазы, митохондриальный белок – 0,2 мг/мл 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 SkQs, мкM Слабо выраженным антиоксидантным действием обладали и молекулы SkQs, лишенные хиноновой части (не показано), что вероятно связано с эффектом вызываемого ими «мягкого разобщения». Как будет показано ниже, эти соединения, как и SkQs, вызывали снижение величины мембранного потенциала, что должно ограничивать образование активных форм кислорода (АФК), поскольку известно [Sukhanova et al., 2010] , что уже незначительное снижение мембранного потенциала существенно тормозит образование АФК. Антиоксидантная активность SkQs была подтверждена и другими независимыми методами (не показано). Нами выявлены условия, позволяющие измерять мембранный потенциал при использовании сафранина О в качестве потенциал-зависимого зонда при действии всех SkQs, включая родаминовые производные. Bсе исследованные SkQs в относительно низких концентрациях деполяризовали мембрану (снижали мембранный потенциал) (Рис. 6 А). При этом, как показано на примере SkQ9berberine (Рис. 6 Б), они не повреждали ее целостности, поскольку добавленный АТР полностью реполяризовал мембрану. В более высоких концентрациях SkQs ингибировали дыхание в состоянии 3, как показано на примере SkQ9berberine (Рис. 7). Точный механизм ингибирования остается неясным, но, вероятнее всего, он связан с прооксидантным действием SkQs. 8 SkQ3 (К50 = 6,95 мкM) SkQ9palmatine (К50 = 6,7 мкM) 100 SkQ9berberine (К50 = 10,4 мкM 80 SkQR19 (К50 = 1,3 мкM) MitoQ (К50 = 3,8 мкM) 60 40 20 0 А 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 [SkQs], мкM Meмбранный потенциал (511-533 нм),ОП Мембранный потенциал, % макс SkQ1 (К50 = 4,55 мкM) 0,14 0,12 SkQ9berberine 0,25 мкM 0,10 КЦХФ 3 мкМ SkQ9berberine 0,5 мкM ATP 250 мкM 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 -0,02 Mито 0 Б 100 200 300 400 500 600 Время, сек Рис. 6. SkQs деполяризуют мембрану митохондрий дрожжей Y. lipolytica, не повреждая её целостности. Среда инкубации содержала 0,6 М маннит, 0,2 мМ Tris-фосфатный буфер, 1 мМ ЭДТА, рН 7,2-7,4, 20 мМ Tris-сукцинат, сафранин О 20 мкМ, митохондриальный белок – 0,5 мг/мл. А) Концентрационные зависимости влияния SkQs на мембранный потенциал; Б) Кривая титрования SkQ9berberine на мембранном потенциале митохондрий. Добавка АТР полностью восстанавливает уровень мембранного потенциала. SkQ9berberine 4 мкM SkQ9berberine 4 мкM 400 300 200 100 0 А 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Поглощение кислорода в состоянии 3 дыхания, % макс 500 Поглощение кислорода, нA SkQ1 (К50 = 9,8 мкM) ADP 720 нмоль Время, мин SkQ3 SkQ9palmatine (К50 = 8,1 мкM) 120 SkQ9berberine (К50 = 7 мкM) SkQR19 (К50 = 6 мкM) 100 MitoQ (К50 = 6 мкM) 80 60 40 20 Б 0 2 4 6 8 10 [SkQs], мкM 12 14 Рис. 7. SkQs ингибируют дыхание митохондрий дрожжей Y. lipolytica в состоянии 3. Среда инкубации как на Рис. 4. А) Кривая титрования дыхания в состоянии 3 при добавлении SkQ9berberine; Б) Концентрационные зависимости поглощения кислорода дрожжевыми митохондриями в состоянии 3 от добавления SkQs. Таким образом, в низких концентрациях SkQs обладали антиоксидантными и разобщающими свойствами, деполяризовали мембрану (снижали мембранный потенциал), не повреждая ее целостности, в более высоких концентрациях проявляли прооксидантные свойства и ингибировали дыхание в состоянии 3. 9 Возникло предположение, что разобщающая активность SkQs, по крайней мере, отчасти, может быть связана с эндогенным пулом жирных кислот. Поэтому следующим нашим шагом было изучение влияния жирных кислот (насыщенных – пальмитиновой, стеариновой, лауриновой, пентадекановой и ненасыщенных – олеиновой и линолевой) на мембранный потенциал митохондрий дрожжей и их взаимодействие с SkQs. 0,16 Пальмитат 4 мкM 0,14 Пальмитат (К50= 10,1 мкМ) КЦХФ 3 мкМ Пальмитат 4 мкM 0,12 Пальмитат 2 мкM 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 ATP 250 мкM 0,00 -0,02 Mито 0 100 А 200 300 400 500 600 Meмбранный потенциал, % макс Meмбранный потенциал (511-533 нм),ОП Как показано на примере пальмитиновой кислоты, все жирные кислоты обладали разобщающим действием, то есть вызывали деполяризацию внутренней мембраны митохондрий (Рис. 8), которая снималась добавлением АТР (Рис. 8 А). Стеарат (К50= 23 мкМ) Лаурат (К50= 24 мкМ) 100 Пентадеканоат (К50= 22,8 мкМ) 80 Олеат (К50= 18,5 мкМ) Линолеат (К50= 16 мкМ) 60 40 20 0 Б 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 [Вещество], мкM Время, сек Рис. 8. Жирные кислоты деполяризуют мембрану митохондрий дрожжей Y. lipolytica, не повреждая её целостности. Среда инкубации как на Рис. 6. А) Кривая титрования мембранного потенциала дрожжевых митохондрий пальмитатом. Добавление АТР полностью реполяризует мембрану; Б) Концентрационные зависимости величины мембранного потенциала митохондрий от различных концентраций жирных кислот. При совместном действии жирных кислот и низких, еще не разобщающих концентраций SkQs, а также фрагментов молекул, лишенных хиноновой части, разобщение, вызываемое жирными кислотами, значительно усиливалось. Кривые зависимости деполяризации мембраны от концентрации жирных кислот в присутствии SkQs заметно сдвигались в сторону более низких концентраций, при этом концентрации жирных кислот, вызывающие полумаксимальное разобщение уменьшались примерно в 2 раза. А при добавлении концентраций SkQs, вызывающих снижение величины мембранного потенциала на 20 %, концентрации жирных кислот, вызывающие полумаксимальное разобщение, уменьшались примерно в 4 раза. Примеры приведены на Рис. 9. 10 100 Meмбранный потенциал, % макс Meмбранный потенциал, % макс К50 = 10,1 мкM + SkQ1 0,3 мкM (К50 = 6 мкM) + SkQ1 0,6 мкM (К50 = 2 мкM) + SkQ9berberine (К50 = 2,8 мкM) 80 + SkQ9palmatine (К50 = 2,7 мкM) 60 40 20 0 А 0 5 10 15 20 [Пальмитат], мкM К50 = 10,1 мкM + C12TPP (К50 = 6 мкM) + C12TPP (К50 = 2,4 мкM) 100 + C10berberine (К50 = 3,4 мкM) 80 + C10palmatine (К50 = 3 мкM) 60 40 20 0 Б 0 5 10 15 20 [Пальмитат], мкM Рис. 9. SkQs (А) и фрагменты молекул SkQs, лишенные хиноновой части (Б), усиливают разобщающее действие пальмитиновой кислоты. Среда инкубации как на Рис. 6. Изменение величины мембранного потенциала при совместном действии пальмитата и низких концентраций SkQs (А) или фрагментов молекул SkQs, лишенных хиноновой части (Б). И наоборот, жирные кислоты, в свою очередь, способствовали большему разобщающему действию SkQs (не показано). Вероятнее всего, это может протекать по механизму, предложенному В.П. Скулачёвым, согласно которому жирные кислоты пересекают митохондриальную мембрану в протонированной форме по механизму flip-flop и затем депротонируются в митохондриях. Образующаяся при этом анионная форма жирной кислоты формирует комплекс с липофильным катионом, что значительно облегчает диффузию пары (анион жирной кислоты – липофильный катион) через митохондриальную мембрану в обратном направлении. Цикл завершается протонированием жирной кислоты и освобождением липофильного катиона, который вновь поступает в митохондрии электрофоретически. Происходящее при этом снижение мембранного потенциала будет способствовать тому, что меньшие концентрации липофильных катионов будут поступать в митохондрии, обеспечивая тем самым механизм «мягкого» разобщения и предотвращая полный коллапс мембранного потенциала. Есть основание полагать, что разобщающее действие липофильных катионов может быть, по крайней мере, отчасти, объяснено взаимодействием с эндогенным пулом жирных кислот. Интересно, что SkQs усиливали разобщающее действие не только жирных кислот (насыщенных и ненасыщенных), но других гидрофобных карбоксилатов, например, ауксинов 3-индолилуксусной и 1- нафтилуксусной кислот (Рис. 10) (по-видимому, в соответствии с вышеописанным механизмом). В присутствии низких, неразобщающих, концентраций SkQs (на примере SkQ1), наблюдался значительный сдвиг концентрационной зависимости деполяризации мембраны митохондрий от добавленных ауксинов в сторону меньших величин. 11 100 Meмбранный потенциал, % макс Meмбранный потенциал, % макс К50 = 2,9 мM + SkQ1 0,3 мкM (К50 = 1,25 мM) 80 60 40 20 0 0,0 А 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 [3-ИУК], мM К50 = 2,85 мM + SkQ1 0,3 мкM (К50 = 1,2 мM) 100 80 60 40 20 Б 0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 [1-НУК], мM Рис. 10. SkQs усиливают разобщающее влияние гидрофобных карбоксилатов 3индолилуксусной (А) и 1- нафтилуксусной (Б) кислот на мембранный потенциал митохондрий дрожжей Y. lipolytica. Среда инкубации как на Рис. 6. ДТАБ 69 мкM (ЦТАБ 35 мкМ) 0,16 К50= 7,4 мкM КЦХФ 3 мкM 0,12 0,08 0,04 0,00 Mито 0 100 200 300 400 500 600 А Meмбранный потенциал, % макс Meмбранный потенциал (511-533 нм),ОП Однако таким свойством обладали лишь мембранотропные катионы с делокализованным зарядом. Цетилтриметиламмонийбромид (ЦТАБ) и его производное додецилтриаммонийбромид (ДТАБ), мембранотропные катионы с локализованным зарядом, вызывали снижение величины мембранного потенциала митохондрий, правда, в значительно более высоких концентрациях по сравнению с SkQs (К50 составляли соответственно 140 мкМ и 170 мкМ), но не усиливали разобщающего действия жирных кислот (Рис.11). 100 SkQ1 0,3 мкM (К50= 6,1 мкM) ЦТАБ 35 мкM (К50= 7,5 мкM) 80 ДТАБ 69 мкM (К50= 7,5 мкM) 60 40 20 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Б [Пальмитат], мкM Время, сек Рис. 11. Мембранотропные катионы с локализованным зарядом, ЦТАБ и ДТАБ, не усиливают деполяризацию мембраны митохондрий дрожжей Y. lipolytica. Среда инкубации как на Рис. 6. А) 35 мк М ЦТАБ и 69 мкМ ДТАБ не снижали мембранный потенциал дрожжевых митохондрий; Б) Концентрационные зависимости действия на мембранный потенциал пальмитиновой кислоты в присутствии неразобщающих концентраций ЦТАБ, ДТАБ и SkQ1. 12 Еще один представитель мембранотропных катионов с локализованным зарядом SkQ2M, новое, синтезированное в рамках проекта В.П. Скулачёва, соединение. Изначально представлялось многообещающим, поскольку как хиноновая его часть, так и проникающий катион (метилкарнитин) обладают антиоксидантными свойствами. Однако, как было показано нами, SkQ2M нарушает целостность внутренней мембраны митохондрий, ингибирует окисление NAD-зависимых субстратов и обладает выраженным детергентным действием, особенно в присутствии NADзависимых субстратов (не показано), что делает невозможным его практическое применение. К сожалению, эти негативные воздействия SkQ2M ускользнули из поля зрения исследователей (работа на митохондриях животных проводится преимущественно, если не исключительно, с использованием сукцината, наиболее быстро окисляемого субстрата). Наши исследования еще раз подчеркивают важность использования дрожжевых митохондрий (см. Введение) при такого рода исследованиях. В концентрациях, значительно превышающих их разобщающее или ингибирующее действие (выше 60 мкМ), SkQs проявляли детергентное действие (Рис. 12). 0,35 C12TPP 10 мкM SkQ1 20 мкM SkQ1 10 мкM 0,35 0,30 Набухание (540 нм) Набухание (540 нм) 0,30 C12TPP 20 мкM 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,25 C12TPP 20 мкM 0,20 0,15 0,10 0,05 А 0 50 100 150 200 250 Б 300 0 50 100 150 200 250 300 Время, сек Время, сек Рис. 12. SkQs (А) и фрагменты молекул SkQs, лишенные хиноновой части, (Б) в высоких концентрациях оказывают детергентное действие на митохондрии дрожжей Y. lipolytica. Среда инкубации содержала 0,6 М маннит, 2 мМ Tris-фосфатный буфер, 1 мМ ЭДТА, 20 мМ КСl, рН 7,2-7,4, митохондриальный белок – 0,5 мг/мл. Низкие концентрации SkQs, проявлявшие антиоксидантную активность, ускоряли рост и дыхание клеток дрожжей Y. lipolytica, причем полумаксимальные концентрации SkQs, вызывающие ускорение дыхания целых клеток, были на несколько порядков ниже по сравнению с концентрациями тех же агентов, вызывавших ускорение дыхания митохондрий (не показано). Это явление объясняется транспортом SkQs (катионов) 13 внутрь клетки и митохондрии в соответствии с величиной мембранного потенциала (см. Введение). Во второй части работы мы продолжили начатый ранее в лаборатории поиск условий, индуцирующих неспецифическую проницаемость внутренней мембраны дрожжей Y. lipolytica, в частности, возможность пермеабилизации митохондрий в условиях анаэробиоза. Состояние достигали добавлением к митохондриям смеси субстратов – пирувата, малата, сукцината и α-глицерофосфата. Скорость дыхания митохондрий в таких условиях увеличивалась до максимальной, что приводило к быстрому исчерпанию кислорода, т. е. возникновению гипоксии или анаэробиоза (Рис. 13). Mито сукцинат 20 мM Поглощение кислорода, нA 600 Рис. 13. Добавление смеси дыхательных субстратов максимально увеличивает скорость дыхания митохондрий дрожжей Y. lipolytica. Среда инкубации содержала 0,6 М маннит, 2 мМ Tris-фосфатный буфер, 1 мМ ЭДТА, 20 мМ пируват, 5 мМ малат, рН 7,2-7,4, митохондриальный белок – 0,5 мг/мл. a-ГФ 10 мM 400 200 0 пируват + малат 0 2 4 6 8 Время, мин При добавлении к дрожжевым митохондриям смеси субстратов, происходила деполяризация мембраны, мембранный потенциал восстанавливался до исходного уровня введением микромолярных концентраций пероксида водорода (Рис. 14 А). Пероксид водорода, добавленный к митохондриям на начальной стадии инкубации, предотвращал снижение уровня мембранного потенциала в результате анаэробиоза (Рис. 14 Б). Нами впервые было обнаружено, что мембранный потенциал, сниженный в результате наступления анаэробиоза, восстанавливался не только добавлением пероксида водорода, но и ATP или системой регенерации АТР (Рис. 15 А). Система регенерации АТР, добавленная вначале, предотвращала снижение величины мембранного потенциала, вызванного наступлением анаэробиоза (Рис. 15 Б). Тем самым впервые показана энергизация митохондрий Y. lipolytica в условиях анаэробиоза за счет энергии гидролиза ATP. Умеренные концентрации Ca2+ в состоянии анаэробиоза на фоне АТР не вызывали снижения мембранного потенциала, оно имело место только при одновременном добавлении Ca2+ и ионофора ЕТН129 (Рис. 16 А), за счет, как было нами показано ранее, активации Ca2+/H+- обмена, зависимого от эндогенного пула жирных кислот. 14 0,16 0,12 0,08 0,04 0,00 -0,04 пируват + малат+ сукцинат + a-ГФ Mито 0 100 200 300 400 500 600 700 А 800 Время, сек Meмбранный потенциал (511-533 нм),ОП Meмбранный потенциал (511-533 нм),ОП КЦХФ 3 мкM H2O2 10 мкM H2O2 10 мкM 0,16 КЦХФ 3 мкM 0,12 0,08 0,04 0,00 пируват + малат+ сукцинат + a-ГФ Mито 0 100 200 300 400 500 Б 600 Время, сек ATP ФЕП 50 мкM 1,5 мM 0.12 0.10 КЦХФ 3 мкM ПK 2 мкл 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 -0.02 пируват + малат + a-ГФ Mито 0 100 200 300 400 Время, сек 500 600 А Meмбранный потенциал (511-533 нм),ОП Meмбранный потенциал (511-533 нм),ОП Рис. 14. Пероксид водорода обращал снижение величины мембранного потенциала митохондрий дрожжей Y. lipolytica в условиях анаэробиоза. Среда инкубации содержала 0,6 М маннит, 0,2 мМ Tris-фосфатный буфер, 1 мМ ЭДТА, рН 7,2-7,4, 20 мМ смесь субстратов дыхания, сафранин О 20 мкМ, митохондриальный белок – 0,5 мг/мл. А) Добавление смеси субстратов деполяризует мембрану, мембранный потенциал восстанавливается до исходного уровня введением микромолярных концентраций пероксида; Б) Пероксид водорода, добавленный к митохондриям на начальной стадии инкубации, предотвращает снижение уровня трансмембранного потенциала в результате анаэробиоза. ATP ПK 50 мкM 2 мкл 0,12 0,10 КЦХФ 3 мкM ФЕП 1,5 мM 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 -0,02 пируват + малат + a-ГФ Mито 0 100 200 300 400 500 600 700 Б 800 Время, сек Рис. 15. Система регенерации АТР восстанавливает мембранный потенциал, сниженный наступлением анаэробиоза, и обращает снижение величины мембранного потенциала в условиях анаэробиоза. Среда инкубации содержала 0,6 М маннит, 0,2 мМ Tris-фосфатный буфер, 1 мМ ЭДТА, рН 7,2-7,4, 20 мМ Tris-пируват, 5 мМ Tris-малат, 10 мМ Tris-α-ГФ, сафранин О 20 мкМ, митохондриальный белок – 0,5 мг/мл. А) Добавление к митохондриям в состоянии анаэробиоза системы регенерации АТР восстанавливает мембранный потенциал митохондрий; Б) Добавление системы регенерации АТР в начале инкубации способствует поддержанию величины мембранного потенциала в условиях анаэробиоза. 15 ATP 50 мкM ETH129 2+ + ФЕП 1,5 мM Ca 7 мкM 100 мкM + ПK 2 мкл КЦХФ 3 мкM 0,14 0,12 Набухание (540 нм) Meмбранный потенциал (511-533 нм),ОП При одновременном добавлении Ca2+ и ионофора ЕТН129 не наблюдалось высокоамплитудного набухания митохондрий, т. е. образования мегаканала (Рис. 16 Б). 0,10 0,08 0,06 0,04 ЭГТА 20 мкM 0,02 0,00 -0,02 Mито 0 100 пируват + малат + a-ГФ 200 300 400 500 ETH129 7 мкM 0,34 Ca2+ 100 мкM 0,32 0,30 пируват + малат + a-ГФ А 0 600 Время, сек 50 100 150 200 250 Б 300 Время, сек Рис. 16. Кальций и ионофор ЕТН129 способствуют деполяризации внутренней митохондриальной мембраны (А), но не набуханию митохондрий дрожжей Y. lipolytica в условиях анаэробиоза (Б). А) Среда инкубации как на Рис. 15. Б) Среда инкубации содержала 0,5 М маннит, 40 мМ КСl, 2 мМ Tris-фосфатный буфер, 1 мМ ЭДТА, 20 мМ КСl, рН 7,2-7,4, 20 мМ Tris-пируват, 5 мМ Tris-малат, 10 мМ Tris-α-ГФ, митохондриальный белок – 0,5 мг/мл. Таким образом, в митохондриях дрожжей Y. lipolytica, в отличие от митохондрий животных и растений, не индуцируется проницаемость внутренней митохондриальной мембраны под действием Ca2+ даже в условиях анаэробиоза. Впервые показана ATPзависимая энергизация дрожжевых митохондрий в условиях анаэробиоза за счет энергии гидролиза ATP. Сделан общий вывод о том, что митохондрии дрожжей лишены Ca2+-зависимых пор. Анализ литературы показал, что дрожжевые митохондрии не уникальны в этом отношении, такими же свойствами обладают и митохондрии простейших. Мы продолжили исследование АТР-зависимого К+-канала дрожжей Y. lipolytica, обнаруженного ранее в нашей лаборатории [Ковалёва М.В., кандидатская диссертация]. Найдено, что закрытию АТР-зависимого К+-канала способствует не только АТР или система регенерации АТР, но и неорганический фосфат (не показано). Ингибитор митохондриального К+-переносчика хинин (квинин) не влиял на митохондриальный АТР-зависимый К+-канал дрожжей Y. lipolytica. При инкубации митохондрий в 0,3 М манните, дополненном 150 мМ KCl и 250 мМ ATP, энергетические параметры митохондрий (скорости дыхания, величины дыхательного контроля) оставались высокими, практически не отличались от таковых, наблюдаемых при инкубации митохондрий в стандартной среде (не показано). Это свидетельствует о 16 сохранности системы окислительного фосфорилирования в условиях, когда канал закрыт. Менадион 20 мкM KCl 150 мM 0,12 ФАО 30 мкM OA 1,5 мM 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 ATP 250 мкM 0,00 -0,02 А Mито 0 100 200 300 400 500 600 Время, сек Meмбранный потенциал (511-533 нм),ОП Meмбранный потенциал (511-533 нм),ОП В присутствии прооксидантов (менадиона, оксалоацетата и фениларсиноксида и особенно SkQs, взятых в концентрациях, вызывающих прооксидатный эффект) закрытый ATP-зависимый К+-канал может вновь открываться (Рис. 17). SkQ1 5 мкM KCl 150 мM 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 ATP 250 мкM 0,00 -0,02 Б Mито 0 100 200 300 400 500 600 Время, сек Рис. 17. SkQs и прооксиданты повторно снижают уровень мембранного потенциала митохондрий дрожжей Y. lipolytica. Среда инкубации как на Рис. 11. Повторное открытие канала под действием прооксидантов наблюдали и при изучении набухания митохондрий, причем и в этом случае SkQs (Рис. 18 А) действовали сильнее классических прооксидантов (Рис. 18 Б). SkQ1 5 мкM 0,30 0,25 0,20 ATP 250 мкM 0 50 Meнадион 80 мкM 0,35 SkQ1 5 мкM Набухание (540 нм) Набухание (540 нм) 0,35 100 150 200 250 А ФАО 120 мкM ОА 3 мM 0,30 0,25 0,20 300 ATP 250 мкM 0 50 100 150 200 250 Б 300 Время, сек Время, сек Рис. 18. SkQs и прооксиданты индуцируют повторное набухание митохондрий дрожжей Y. lipolytica. Среда инкубации содержала 0,3 М маннит, 0,15 КСl, АТР 250 мкМ, 2 мМ Tris-фосфатный буфер, 1 мМ ЭДТА, рН 7,2-7,4, митохондриальный белок – 0,5 мг/мл. 17 Повторное открытие канала (т. е. существенное набухание митохондрий) может указывать на образование неспецифической поры. Окончательным доказательством образования неспецифической поры мог бы служить выход митохондриальных белков под действием прооксидантов. Для этой цели выделенные препараты сопряженных митохондрий были разделены на две равные части. В контрольном образце митохондрии инкубировали в течение трех минут в среде, содержащей 0,3 М маннит, 0,15 М КСl и 250 мкМ АТР (т.е. в условиях, когда, по нашим данным, АТР-зависимый К+-канал должен оставаться в закрытом состоянии). Опытный образец инкубировали в течение того же времени в той же среде, но дополненной 10 мкМ SkQ1, вызывающим, как показано выше, повторное открытие канала. Митохондрии осаждали центрифугированием при 6800 g в течение 20 минут. В полученных супернатантах белки осаждали ТХУ и анализировали методом двумерного электрофореза (анализ проведен Л.И. Ковалёвым). Видно, что действительно при инкубации митохондрий с SkQ1 происходит выход митохондриальных белков (Рис. 19). Маркер, мол. масса, кДа 60 50 40 30 25 20 рН 7.0 рН градиент 15 рН 4.0 рН 7.0 рН градиент рН 4.0 Рис. 19. Двумерный электрофорез супернатантов митохондрий дрожжей Y. lipolytica. Среда инкубации содержала 0,3 М маннит, 0,15 М КСl, АТР 250 мкМ, 0,2 мМ Tris-фосфатный буфер, 1 мМ ЭДТА, рН 7,2-7,4, 10 мМ сукцинат, митохондриальный белок – 0,5 мг/мл (А); Б) в среду того же состава был добавлен SkQ1 10 мкМ. Таким образом, нам наконец удалось найти условия индукции неспецифической проницаемости дрожжевых митохондрий, а именно при превращении закрытого АТРзависимого К+-канала в неспецифическую пору, через которую могли бы выходить белки межмембранного пространства митохондрий, в том числе, вероятно, и апоптотические факторы. 18 ВЫВОДЫ 1. SkQs в относительно низких концентрациях не повреждают целостность митохондриальной мембраны Y. lipolytica; не шунтируют перенос электронов по дыхательной цепи митохондрий, обладают антиоксидантной и разобщающей активностью, снижают мембранный потенциал, в более высоких концентрациях ингибируют дыхание в состоянии 3, оказывают прооксидантное воздействие, в еще более высоких концентрациях являются детергентами. 2. Только мембранотропные катионы с делокализованным зарядом усиливают транспорт гидрофобных карбоксилатов, в том числе жирных кислот. 3. Показана ATP-зависимая энергизация митохондрий Y. lipolytica в условиях анаэробиоза. Са2+ (в присутствии Са2+-ионофора ЕТН129) даже в условиях анаэробиоза не индуцировал повышенную проницаемость внутренней митохондриальной мембраны дрожжей. Высказано предположение о том, что дрожжевые митохондрии не имеют Са2+-зависимых пор, напоминая в этом отношении митохондрии беспозвоночных. 4. В условиях окислительного стресса специфический АТР-зависимый К+-канал превращается в митохондриях дрожжей Y. lipolytica в неспецифическую пору. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах: 1. Kovaleva M.V., Sukhanova E.I., Trendeleva T.A., Zylkova M.V., Uralskaya L.A., Popova K.M., Saris N.E., Zvyagilskaya R.A. (2009) Induction of a non-specific permeability transition in mitochondria from Yarrowia lipolytica and Dipodascus (Endomyces) magnusii yeasts. J. Bioenerg. Biomembr., 2009, 41 (3): 239-249. 2. Суханова Е.И., Тренделева Т.А., Звягильская Р.А. (2010) Взаимодействие дрожжевых митохондрии с жирными кислотами и митохондриально-направленными липофильными катионами. Биохимия, 75 (2): 169-176. 3. Ковалёва М.В., Суханова Е.И., Тренделева Т.А., Попова К.М., Зылькова М.В., Уральская Л.А., Звягильская Р.А. (2010). Индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей (обзор). Биохимия, 75 (3): 365-372. 19 4. Skulachev V.P., Antonenko Yu., Cherepanov D.A., Chernyak B.V., Khailova L.S., Korshunova G.A., Lyamzaev K. G., Roginsky V.A., Rokitskaya T.I., Severin F. F., Severina I.I., Simonyan R.A., Skulachev M.V., Sumbatian N.V., Sukhanova E.I., Tashlitsky V.N., Trendeleva T.A., Vyssokikh M.Yu., Zvyagilskaya R.A. (2010) Prevention of cardiolipin oxidation and fatty acid cycling as two antioxidant mechanisms of cationic derivatives of plastoquinone (SkQs) (review) Biochim. Biophys. Acta (Bioenergetics), 1797 (6-7): 878-889. 5. Trendeleva T.А., Sukhanova E.I., Ural’skaya L.A., Saris N-E., Zvyagilskaya R.A. (2011) Mitochondria from Dipodascus (Endomyces) magnusii and Yarrowia lipolytica yeasts did not undergo a Ca2+-dependent permeability transition even under anaerobic conditions. J. Bioenerg. Biomembr., 43: 623-631. 6. Trendeleva T.А., Sukhanova E.I., Ural’skaya L.A., Saris N-E., Zvyagilskaya R.A. (2011) Effect of prooxidants on yeast mitochondria. J. Bioenerg. Biomembr., 43: 633-644. Статья в сборнике: Тренделева Т.А., Суханова Е.И., Ковалева М.В., Уральская Л.А., Звягильская Р.А. (2011) ATP открывает неспецифический канал в митохондриях Saccharomyces cerevisiae, но закрывает K+-канал в митохондриях Yarrowia lipolytica и Dipodascus magnusii. Сборник статей Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (под редакцией В.П. Зинченко, С.С. Колесникова, А.В. Бережнова). Пущино, т. 2, сс. 732-737. Тезисы докладов: 1. Zvyagilskaya R.A., Zyl’kova M.V., Sukhanova E.I., Kovaleva M.V., Trendeleva T.A. (2008) Mitochondrial permeability transition pore (mPTP) in different yeast species is dissimilarly regulated. Biochim. Biophys. Acta, Bioenergetics, 15th EBEC. Shoort Reports, р. 32. 2. Зылькова М.В., Ковалева М.В., Суханова Е.И., Тренделева Т.А., Леин С.А., Звягильская Р.А. (2008) Индукция неспецифической проницаемости дрожжевых митохондрий. Труды 2-го Съезда микологов России с международным участием «Современная микология в России», т.2, с. 127-128. 3. Zvyagilskaya R.A., Sukhanova E.I., Kovaleva M.V., Trendeleva T.A. (2009) Pathways for release of apoptotic factors from yeast mitochondria. The FEBS J. Abstracts of 34th FEBS Congress «life’s Molecular Interactions». Prague, Czech Republic, v. 4-143, p. 229. 20 4. Zylkova M.V., Sukhanova E.I., Trendeleva T.A., Kovaleva M.V., Zvyagilskaya R.A.. (2008) More on permeability transition in Yarrowia lipolytica mitochondria. Abstr. Bari Intern. Symposium on « Mitochondrial physiology and pathology» IUBMB Sympos. S1 Satellite events of the 33th FEBS Congress and 11th IUBMB Athens, SC2. 38. 5. Звягильская Р.А., Суханова Е.И., Тренделева Т.А., Леин С.А. (2009) Действие прооксидантов на митохондрии дрожжей. Труды конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» Судак, Украина, с. 25. 6. Тренделева Т.А. (2010) Каким образом апоптотические факторы выходят из дрожжевых митохондрий. XXII Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», с. 89. 7. Суханова Е.И., Тренделева Т.А. (2010) Влияние митохондриальнонаправленных липофильных катионов на дрожжевые митохондрии. XXII Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», с. 88. 8. Trendeleva T.A., Sukhanova E.I., Zvyagilskaya R.A. (2010) Effect of fatty acids and mitochondria-targeted lipophilic cations on yeast mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, Bioenergetics,Shot Reports 16th EBEC, p. 63. Работа выполнена при финансовой поддержке Института митоинженерии МГУ им. М.В. Ломоносова, Программы РАН по клеточной и молекулярной биологии и РФФИ (гранты 06-04-49687 и 09-04-01238). 21 СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В ТЕКСТЕ АФК – активные формы кислорода ДТАБ – додецилтриметиламмонийбромид 3-ИУК – 3-индолилуксусная кислота КЦХФ – карбонилцианид-м-хлорфенилгидразон 1-НУК – 1-нафтилуксусная кислота ОА – оксалоацетат Олиго – олигомицин ФАО – фениларсиноксид ЦТАБ – цетилтриметиламмонийбромид ЭДТА – этилендиамин N`,N`,N`,N`-тетрауксусная кислота ADP – аденозин-5`-дифосфат АТР – аденозин-5`-трифосфат C10berberine – 13-(децилоксикарбонилметил) берберин C10palmatine – 13-(децилоксикарбонилметил) палматин C12TPP – додецилтрифенилфосфоний C12R19 – децилродамин 19 ЕТН129 – специфический кальциевый ионофор MitoQ – 10-(6′-убихинон)децилтрифенилфосфоний NADН – никотинамидадениндинуклеотид Рн – неорганический фосфат SkQs – «ионы Скулачёва» (катионные производные пластохинона или метилпластохинона) SkQ1 – 10-(6-пластохинон) децил трифенилфосфоний SkQ2М – 10-(6-пластохинон) децилметилкарнитин SkQ3 – 10-(5-метилпластохинон) децилтрифенилфосфоний SkQ9berberine – 13-[9- (6- пластохинон) нонилоксикарбонилметил] берберин SkQ9palmatine – 13-[9-(6- пластохинон) нонилоксикарбонилметил] палматин SkQR19 – 10-(6- пластохинон) децилродамин 19 TPP+ – тетрафенилфосфоний 22
