БАРЯКИН ДМИТРИЙ НИКОЛАЕВИЧ ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ РНК
advertisement
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины На правах рукописи БАРЯКИН ДМИТРИЙ НИКОЛАЕВИЧ ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ РНК ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА 03.01.03 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: к.х.н., доцент Семенов Дмитрий Владимирович Новосибирск – 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ОГЛАВЛЕНИЕ ...................................................................................................................................................... 2 ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ .............................................................................................................................. 5 ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................................................................ 8 ГЛАВА 1 ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ РНК ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) ............. 12 1.1 История развития представлений о циркулирующих НК ............................................................... 13 1.2 Формирование набора цРНК .............................................................................................................. 15 1.3 Основные классы циркулирующих РНК........................................................................................... 16 1.4 Формы транспорта циркулирующих РНК ........................................................................................ 19 1.4.1 Экзосомы и микровезикулы ....................................................................................................... 19 1.4.2 Апоптотические тельца............................................................................................................... 22 1.4.3 Липопротеиды высокой плотности ........................................................................................... 23 1.4.4 Свободные рибонуклеопротеидные комплексы ....................................................................... 24 1.5 Проникновение РНК в клетки-реципиенты ...................................................................................... 24 1.6 Биологические функции циркулирующих РНК ............................................................................... 27 1.6.1 Неспецифическое действие циркулирующих РНК .................................................................. 28 1.6.1.1 Свертывание крови.................................................................................................................. 28 1.6.1.2 Врожденный иммунитет ......................................................................................................... 29 1.6.2 Специфическое действие циркулирующих РНК ...................................................................... 32 1.6.2.1 Регуляция иммунного ответа ................................................................................................. 32 1.6.2.2 Регуляция липидного обмена и развития атеросклероза ..................................................... 33 1.6.2.3 Регуляция образования и развития опухолей ........................................................................... 33 1.6.2.4 1.7 Дифференцировка и морфогенез .......................................................................................... 34 Циркулирующие РНК как показатель состояния организма .......................................................... 35 1.7.1 Циркулирующие РНК плода и плаценты в крови матери как показатель протекания беременности ............................................................................................................................................... 36 1.7.2 Циркулирующие РНК при сердечно-сосудистых заболеваниях ............................................ 38 1.7.3 Циркулирующие РНК при воспалительных и системных заболеваниях ............................... 39 1.7.4 Циркулирующие РНК при онкологических заболеваниях ...................................................... 40 1.7.4.1 Рак молочной железы .............................................................................................................. 40 1.7.4.2 Рак легкого ............................................................................................................................... 42 1.7.4.3 Циркулирующие микроРНК при других типах рака ........................................................... 44 1.7.5 1.8 Диагностический потенциал циркулирующих микроРНК...................................................... 46 Заключение .......................................................................................................................................... 51 ГЛАВА 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.................................................................................................. 52 2.1 Материалы и реактивы ............................................................................................................................. 52 2.2 Ферменты ................................................................................................................................................... 52 3 2.3 Буферные растворы ................................................................................................................................... 52 2.4 Методы ....................................................................................................................................................... 53 2.4.1 Конструирование кДНК-библиотек для высокопроизводительного секвенирования ................ 53 2.4.2 Биоинформационный анализ данных высокопроизводительного секвенирования ..................... 55 2.4.3 Подтверждение данных секвенирования методом ПЦР в режиме реального времени............... 56 2.4.4 Синтез аналогов РНК плазмы крови человека ................................................................................ 60 2.4.5 Культуры эукариотических клеток ................................................................................................... 60 2.4.6 Выделение суммарной РНК из клеток MCF-7................................................................................. 60 2.4.7 Синтез аналогов AluYa5 РНК и 7SL РНК человека ........................................................................ 61 2.4.8 Анализ жизнеспособности клеток MCF-7 после трансфекции синтетическими РНК ................ 62 2.4.9 Анализ проапоптотических изменений клеток MCF-7 с помощью проточной цитофлуориметрии ...................................................................................................................................... 62 2.4.10 Анализ изменений транскриптома клеток MCF-7 под действием аналогов Alu- и 7SL РНК на чипах Illumina НТ-12 ................................................................................................................................... 63 2.4.11 Статистические методы анализа полученных результатов .......................................................... 64 ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ................................................................................................... 65 3.1 Определение последовательностей коротких РНК плазмы крови человека с помощью высокопроизводительного секвенирования по технологии SOLiD ........................................................... 65 3.1.1 Подбор здоровых доноров и пациентов с немелкоклеточным раком легкого ............................. 66 3.1.2 Конструирование кДНК-библиотек SOLiD на основе РНК плазмы крови человека .................. 67 3.1.3 Относительный вклад основных групп транскриптов в набор РНК плазмы крови человека .... 71 3.1.4 Описание форм РНК плазмы крови человека по классам .............................................................. 74 3.1.4.1 МикроРНК.................................................................................................................................... 74 Формы транспорта микроРНК в плазме крови человека ................................................................ 77 Регуляторный потенциал циркулирующей микроРНК-223 ............................................................ 78 3.1.4.2 мРНК............................................................................................................................................. 80 3.1.4.3 Митохондриальные РНК ............................................................................................................ 84 3.1.4.4 Длинные некодирующие РНК .................................................................................................... 84 3.1.4.5 Новые микроРНК-подобные формы.......................................................................................... 90 3.1.5 Сравнение вклада отдельных форм РНК плазмы крови здоровых доноров и пациентов с НМРЛ............................................................................................................................................................ 94 3.2 Влияние аналогов РНК плазмы крови человека на жизнеспособность клеток человека в культуре ....................................................................................................................................................... 102 3.2.1 Снижение жизнеспособности клеток MCF-7 под действием аналогов РНК плазмы крови человека ...................................................................................................................................................... 103 3.2.2 Влияние аналогов Alu и 7SL РНК на проапоптотические процессы в клетках аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 .......................................................................................................... 106 3.2.3 Влияние Alu РНК и 7SL РНК в сочетании с цитостатиками на жизнеспособность клеток 4 MCF-7 ......................................................................................................................................................... 109 3.2.4 Анализ изменения экспрессии генов в клетках MCF-7 под действием аналогов Alu и 7SL РНК ..................................................................................................................................................... 112 3.2.5 Предполагаемый механизм снижения жизнеспособности клеток MCF-7 под действием Alu и 7SL РНК ..................................................................................................................................................... 116 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................................................................................. 119 ВЫВОДЫ ........................................................................................................................................................... 121 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................... 122 5 ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ 7SL – РНК-компонент сигнал-распознающей частицы A549 – культура клеток карциномы легкого человека AGO (argonaute RISC catalytic component) – семейство каталитически активных белков, участвующих в РНК-интерференции Alu – семейство коротких геномных повторов приматов scAlu (small cytoplasmic Alu RNA) – малые цитоплазматические Alu РНК AUC (Area under the curve) - площадь под кривой в ROC-тесте Bcl-2 (B-cell lymphoma-2, Apoptosis regulator Bcl-2) – антиапоптотический регулятор, основной представитель семейства Bcl-2. Ct (threshold Cycle) – значение порогового цикла dCt (delta threshold Cycle) – разница в значениях порогового цикла m – трансмембранный потенциал митохондрий DDIT3 (CHOP) (DNA-damage-inducible transcript 3) – транскрипт 3, индуцируемый повреждением ДНК DFF40 (DNA Fragmentation Factor 40) – ДНКаза человека 40 кДа, вызывающая фрагментацию ДНК, характерную для апоптотической гибели клетки DFF45 (DNA Fragmentation Factor 45) – ингибитор ДНКазы DFF40 EPTP – estimated probability that the miRNA candidate is a true positive (параметр программного пакета miRDeep2) FAM – FPKM – карбоксифлуоресцеин фрагментов на тысячу оснований экзона на миллион картированных последовательностей (Fragments per Kilobase per Million) GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) – глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа GFP – зеленый флуоресцентный белок LRR (leucin rich region) – обогащенный лейцином регион белковой молекулы IC40 (inhibitory concentration) – концентрация препарата, при которой рост культуры клеток тормозится на 40% JC-1 – 5.5'.6.6'-тетрахлор-1.1'.3.3'-тетраэтилбензимидазолкарбоцианин йодид MCF-7 – культура клеток аденокарциномы молочной железы человека – 3-(4.5-диметилтиазол-2-ил)-2.5-дифенилтетразолиум бромид MTT MWW – непараметрический критерий Манна-Уитни-Уилкоксона 6 NTP – dNTP – n/a – рибонуклеозидтрифосфаты дезоксирибонуклеозидтрифосфаты not available, нет доступных значений NUPR1 (p8) (nuclear protein, transcriptional regulator, 1) – ядерный белок, транскрипционный регулятор 1 ORF – открытая рамка считывания p53 – фактор, подавляющий рост опухоли Pol III – ДНК-зависимая РНК-полимераза III PARP – поли-(АДФ рибоза)-полимераза PI – пропидий йодид PKR (Protein kinase RNA-activated) – протеинкиназа R, интерферон-индуцируемая, дцРНК-активируемая протеинкиназа или киназа 2 эукариотического фактора инициации трансляции 2-α (EIF2AK2) PS - RefSeq - фосфатидилсерин база данных Национального института здоровья США NCBI human Referenced Sequence database ROC-анализ (receiver operating characteristic) - операционная характеристика приёмника SD – стандартное отклонение среднего SID – трансмембранный белок, осуществляющий транспорт дцРНК SINE (Short INterspersed Elements) – короткие диспергированные повторы SOLiD (System of Oligonucleotid Ligation and Detection) – технология секвенирования ДНК нового поколения, принадлежит компании Life Technologies. SRP (signal recognition particle) – сигналраспознающая частица ТАМ (tumor-associated macrophages) – макрофаги, ассоциированные с опухолью TLR (Toll-like receptor) – толл-подобные рецептор TNF (tumor necrosis factor) – фактор некроза опухоли UPR (Unfolded protein response) – ответ клетки на неправильную укладку белков Y-РНК – малые некодирующие РНК, входящие в состав рибонуклеопротеидной частицы Ro60 АФК – активные формы кислорода ДМСО – диметилсульфоксид ДЭПК – диэтилпирокарбонат ДТТ дитиотреитол – 7 вольтРНК – семейство некодирующих РНК, входящих в состав рибонуклеопротеидного комплекса VAULT ИПТГ – изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид КТ – комнатная температура ЛВП – липопротеиды высокой плотности миРНК – малые интерферирующие РНК мцРНК – малые цитоплазматические РНК мтДНК – митохондриальная ДНК мтРНК – митохондриальные РНК мяРНК – малые ядерные РНК мяоРНК – малые ядрышковые РНК нСМаза – нейтральная сфингомиелиназа НМРЛ – немелкоклеточный рак легкого НТР – нетранслируемый регион мРНК ОТ – обратная транскрипция ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография ПААГ – полиакриламидный гель ПАТ – природный антисмысловой транскрипт ПЦР – полимеразная цепная реакция СКВ – системная красная волчанка СО – стандартное отклонение для среднего значения СР – среднее значение Трис – 2-амино-2-гидроксиметилпропан-1.3-диол ЦКП – центр коллективного пользования цРНК – циркулирующие РНК ЭДТА – этилендиаминтетраацетат ЭР – эндоплазматический ретикулум ЭФ – электрофорез 8 ВВЕДЕНИЕ Рибонуклеиновые кислоты являются одним из наиболее многофункциональных классов биополимеров: РНК участвуют в переносе и реализации генетической информации; транспорте аминокислот; направляют и катализируют химические реакции. В настоящее время известно, что большая часть РНК функционирует и расщепляется в цитоплазме или ядре клетки. Но также известно, что РНК содержатся во внеклеточных жидкостях высших организмов, например, в плазме крови, в плазме молока и в культуральной среде, конденсированной клетками млекопитающих. Экзогенные нуклеиновые кислоты используют в генной терапии, при которой препараты нуклеиновых кислот вводят в организм для коррекции генетических дефектов, для генной иммунизации, основанной на введении в организм нуклеиновых кислот, кодирующих необходимые для иммунизации белки, а также для изменения экспрессии генов по механизму РНК-интерференции. Эндогенные РНК появляются во внеклеточном пространстве в результате апоптотической гибели и/или терминальной дифференцировки клеток, а также при активной секреции жизнеспособными клетками. Показано, что РНК плазмы крови циркулируют в составе свободных рибонуклеопротеидных комплексов, липопротеидов высокой плотности, экзосом, микровезикул и апоптотических телец. Было обнаружено, что в плазме крови пациентов с различными заболеваниями происходит изменение уровня отдельных форм РНК. Исследования эндогенных внеклеточных РНК осуществляются, в основном, в двух направлениях: изучение РНК-опосредованной межклеточной коммуникации и определение диагностических молекулярных РНК-маркеров социально-значимых заболеваний. Современные методы исследований, такие как высокопроизводительное секвенирование, гибридизация на микрочипах и ПЦР в режиме реального времени позволяют проводить не только качественный, но и количественный анализ множества различных форм РНК в одном эксперименте. Это открывает новые возможности для исчерпывающего анализа состава циркулирующих РНК, а также для выявления диагностически значимых РНК-маркеров. Структура всего набора внеклеточных РНК человека и функции отдельных его компонентов в настоящее время исследованы лишь частично. При этом высокая гетерогенность и фрагментированность молекул РНК, циркулирующих в плазме крови, требуют проведения модификации стандартных протоколов подготовки биологических образцов, используемых для анализа препаратов суммарной клеточной РНК и наборов коротких некодирующих РНК. В связи с этим, проведение исчерпывающего исследования набора циркулирующих РНК человека 9 в норме и его изменения при развитии патологических процессов является актуальной задачей современной молекулярной биологии. Целью данной работы являлось детальное описание состава РНК плазмы крови человека, поиск биологически активных форм РНК, а также характеризация изменений набора циркулирующих РНК при немелкоклеточном раке легкого. В ходе работы необходимо было решить следующие задачи: - Адаптировать методику конструирования кДНК-библиотек ABI SOLiD для высокопроизводительного секвенирования наборов коротких РНК (n ≥ 19) с различными вариантами расположения концевых фосфатных групп; - Провести выскокопроизводительное секвенирование РНК плазмы крови здоровых доноров и охарактеризовать набор циркулирующих РНК по представленности основных классов РНК; - Провести высокопроизводительное секвенирование РНК плазмы крови пациентов с немелкоклеточным раком легкого и определить диагностически значимые РНК плазмы крови человека; - Сконструировать аналоги внеклеточных РНК человека и определить их влияние на биологические процессы в культуре клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7. Научная новизна полученных результатов. В настоящей работе впервые проведено усовершенствование метода конструирования кДНК-библиотек, позволяющее анализировать короткие циркулирующие РНК (19-100 н.) с различным расположением концевых фосфатных групп, по технологии высокопроизводительного секвенирования ABI SOLiD. Описан состав РНК плазмы крови в норме и при немелкоклеточном раке легкого, определены наиболее представленные в плазме крови человека формы РНК. Сравнение результатов секвенирования между здоровыми донорами и пациентами с НМРЛ показало, что в наборе цРНК пациентов происходит достоверное увеличение вклада транскриптов геномных повторов, рРНК, тРНК и мРНК и достоверное снижение вклада фрагментов РНК, не аннотированных в базе данных RefSeq. Определен набор форм коротких циркулирующих РНК – потенциальных диагностически значимых маркеров рака легкого. Впервые установлено, что полученные in vitro аналоги циркулирующих фрагментов РНК, а также аналоги полноразмерных Alu и 7SL РНК способны снижать жизнеспособность клеток человека в культуре. Впервые проведен полнотранскриптомный анализ изменений в экспрессии генов в клетках человека, трансфицированных аналогами Alu и 7SL РНК. Полученные данные указывают на то, что механизм цитотоксического действия этих РНК связан с активацией ответа на стресс эндоплазматического ретикулума. 10 Теоретическая и практическая значимость работы. В рамках работы получен массив данных секвенирования РНК плазмы крови человека в норме и при раке легкого, который представляет собой основу для поиска диагностических маркеров рака легкого и новых биологически активных форм РНК. Для детекции ряда потенциальных диагностических форм РНК с помощью метода ОТ-ПЦР в режиме реального времени были разработаны системы праймеров, проведена оценка параметров чувствительности и специфичности разработанных систем. В рамках данной работы проведен анализ биологического действия на культуру клеток человека нескольких форм циркулирующих РНК. Оставшиеся за пределами детального рассмотрения обнаруженные в плазме крови человека потенциальные маркеры рака легкого и биологически активные формы РНК являются перспективным объектом дальнейших научных исследований. Положения, выносимые на защиту. 1. Набор циркулирующих РНК плазмы крови человека включает в себя фрагменты всех классов клеточных РНК. Наборы РНК плазмы крови здоровых доноров и пациентов с немелкоклеточным раком легкого различаются по содержанию основных классов клеточных РНК и отдельных форм циркулирующих РНК. 2. В наборе циркулирующих РНК присутствуют формы РНК, способные влиять на жизнеспособность клеток человека. Аналоги AluYa5 и 7SL РНК индуцируют проапоптотические изменения субпопуляции клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7, при этом происходит изменение транскрипции генов ответа на стресс эндоплазматического ретикулума. Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых научных журналах. Результаты работы были представлены на XLVII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, Россия, 2009), II Международной конференции «Физико-химическая биология» (Новосибирск, Россия, 2011), научной конференции "Фундаментальные науки медицине" (Новосибирск, Россия, 2009), II Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (Новосибирск, Россия, 2011), научной конференции «Высокопроизводительное секвенирование в геномике» (Новосибирск, Россия, 2013), а также на Третьей Школе молодых ученых «Биоинформатика и Системная биология» (Новосибирск, Россия, 2011). Личный вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Выравние экспериментальных последовательностей с референсными последовательностями, определение относительного вклада транскриптов, поиск новых микроРНК-подобных и 11 антисмысловых РНК проводились совместно с научным руководителем работы, к.х.н., доцентом Семеновым Д. В. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 150 страницах, включает 17 рисунков и 30 таблиц. Список литературы содержит 333 источника. 12 ГЛАВА 1 ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ РНК ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) История изучения циркулирующих нуклеиновых кислот насчитывает более 65 лет. За это время охарактеризованы основные формы циркулирующих РНК, установлен механизм секреции и захвата внеклеточных РНК, а также показано, что РНК могут транспортироваться от одних клеток к другим и могут быть использованы как диагностические маркеры [1, 2]. Для описания НК, содержащихся во внеклеточных жидкостях высших организмов, используют ряд синонимичных терминов: термин "циркулирующие НК" (circulating nucleic acids [3], cDNA or cRNA) используют в основном для описания НК, выделенных из плазмы или сыворотки крови; термин "внеклеточные НК" (extracellular nucleic acids [4], cell-free nucleic acids [5]) используют для описания НК, выделенных из всех биологических жидкостей, в том числе, слюны [6], мочи [5], спинномозговой жидкости [7], бронхоальвеолярной мокроты [8], амниотической жидкости [9] и плазмы молока [10]. Также используют термин "челночные НК" (shuttle nucleic acids [11], shRNA), применительно к НК, которые содержатся в везикулярных, неклеточных структурах – микровезикулах и экзосомах. При исследовании состава цРНК показано, что в их наборе содержатся фрагменты всех классов клеточных РНК [12, 13]. Показано, что цРНК появляются во внеклеточном пространстве в результате различных процессов: апоптотической гибели клеток организма, повреждения органов и тканей химическими и физическими факторами, а также в результате активной секреции жизнеспособными клетками [14]. Установлены и охарактеризованы основные формы транспорта циркулирующих РНК: экзосомы, микровезикулы, апоптотические тельца, липопротеиды высокой плотности, свободные рибонуклеопротеидные комплексы [15]. Исследования биологических функций внеклеточных РНК показали, что РНК плазмы крови могут участвовать в активации процессов врожденного иммунитета и свертывания крови [16], мРНК и микроРНК экзосом и микровезикул способны переноситься от одних клеток к другим и индуцировать как процессы дифференцировки клеток в норме, так и процессы метастазирования при развитии онкологический заболеваний [17, 18]. Была обнаружена диагностическая и прогностическая значимость цРНК при различных состояниях организма: при анализе протекания беременности, при онкологических, аутоиммунных заболеваниях, диабете 1 и 2 типа, а также при нарушениях работы сердечнососудистой системы [2, 19]. В настоящем обзоре рассмотрены современные представления о структуре и биологических функциях циркулирующих РНК, формы транспорта циркулирующих РНК в 13 организме и возможности использования таких РНК для диагностики патологических состояний организма. 1.1 История развития представлений о циркулирующих НК Циркулирующие нуклеиновые кислоты плазмы крови человека были впервые обнаружены и описаны в работе 1948 года, авторами Mandel и Metais [2] (Рисунок 1). В 70-х годах XX века основными направлениями изучения РНК плазмы крови человека были измерение количества и исследование представленности индивидуальных форм. В 1972 году Kamm и Smith [20] опубликовали данные о концентрации РНК в плазме крови здоровых людей. Данные были представлены как разница флуоресценции бромистого этидия в комплексе с НК плазмы, обработанными ДНКазой I либо РНКазой А. Было установлено, что концентрация РНК в плазме разных доноров варьирует в широком диапазоне 50 - 215 мг/л, среднее значение составляло 144 ± 22 мг/л. Измеренные концентрации превышали ранее полученные Shutack и соавт. значения [21]. Авторы объяснили более высокие значения концентраций внеклеточных РНК использованием йодацетамида в качестве ингибиртора РНКаз плазмы крови. Открытие межклеточного переноса РНК in vitro, Kolodny. Открытие циркулирующих нуклеиновых кислот, Mandel и Metais. 1979 1968-1975 1948 Обнаружение фетальной РНК в плазме крови матери, Poon и соавт. 2004 1971 Определение концентрации РНК в плазме крови человека, Shutack и соавт., Kamm и Smith. Обнаружение микроРНК в системной циркуляции, Chen и соавт., Mitchell и соавт. 2000 Использование цРНК как индикатора патологических состояний организма, Hamilton и соавт. 2010-2011 2008 Открытие внеклеточных нуклеиновых кислот, связанных с клеточной поверхностью, Laktionov и соавт. Установление механизмов секреции и захвата внеклеточных РНК, Kosaka и соавт., Diken и соавт., Lorenz и соавт. Рис. 1. Хронология значимых событий в изучении циркулирующих нуклеиновых кислот. Анализ форм циркулирующих РНК Guin и соавт. проводили методом электрофоретического разделения в агарозном геле. Было установлено, что РНК плазмы крови представлена тремя формами, подвижность которых в геле соответствует 6S - 27S РНК. Не 14 было обнаружено низкомолекулярных форм РНК (n < 100), а также форм, соответствующих по подвижности в геле тРНК. Полученные данные позволили предположить, что РНК плазмы крови являются фрагментами рРНК или мРНК [22]. Исследование межклеточного переноса молекул РНК с помощью распределения радиоактивномеченых РНК в культуре эукариотических клеток в 1971 году провел Kolodny. Для этого часть культивируемых NIH 3Т3 клеток была "нагружена" танталовыми частицами. Было установлено, что в процессе совместного культивирования "ненагруженных" и "нагруженных" меченой РНК клеток линии NIH 3T3 происходил горизонтальный перенос меченых РНК в "ненагруженные" клетки [23]. Анализ первичной структуры внеклеточных РНК, проведенный Kolodny и соавт., выявил высокое содержание 2'-O-метилированных нуклеотидов [24]. Уже в конце 70-х гг XX века начались первые эксперименты по использованию РНК плазмы крови в качестве диагностического маркера различных заболеваний, но при этом не существовало единой методики выделения РНК из плазмы и измерения ее концентрации. Например, в 1979 году Hamilton и соавт. использовали фенол-хлороформную экстракцию, гидролиз до мононуклеотидов и измерение их количества с помощью ВЭЖХ. В этой работе не было найдено РНК в плазме крови здоровых людей и пациентов с множественной миеломой, но обнаружено 1.1 мг/л РНК в плазме пациентов с макроглобулинемией Вальденстрома [25]. В 1978 году было установлено, что РНК щитовидной железы может стимулировать дифференцировку Т-клеток из лимфоцитов костного мозга [26]. В 1985-87 годах Wieczorek и соавт. обнаружили, что в сыворотке крови пациентов с онкологическими заболеваниями РНК циркулируют в составе липопротеидов и, что их количество коррелирует с развитием заболевания и размером опухоли [27, 28]. В 2000 году Poon и соавт. опубликовали работу, в которой показано, что в плазме крови матери, вынашивающей ребенка мужского пола, присутствует мРНК белка с доменом "цинковые пальцы", специфичного для Y-хромосомы (ZFY) [29]. При исследовании локализации внеклеточных нуклеиновых кислот в ИХБФМ СО РАН обнаружено, что значительная часть внеклеточных РНК и ДНК крови человека связана с клеточной поверхностью эритроцитов и лейкоцитов [30]. В 2008 году исследования Chen и соавт., а также, независимо, Mitchell и соавт. показали, что в сыворотке и плазме крови человека содержатся микроРНК. Циркулирующие микроРНК демонстрировали высокую стабильность при воздействии повреждающих факторов, таких как высокие температуры и воздействие РНКаз, и могли являться биомаркерами физиологических и патологических состояний организма, таких как рак легкого, колоректальный рак, рак простаты и диабет второго типа [31, 32]. 15 В 2011 году было установлено, что внеклеточные РНК проникают в клетки человека по механизмам макропиноцитоза и кавеола-зависимого эндоцитоза [33, 34]. В настоящее время ведутся работы по изучению разнообразных форм транспорта циркулирующих РНК, установлению биологических функций цРНК, использованию цРНК как биомаркеров для диагностики патологических состояний организма, а также по разработке РНК-вакцин для повышения специфического и неспецифического иммунитета, с целью борьбы с вирусными и онкологическими заболеваниями. 1.2 Формирование набора цРНК К настоящему времени установлено, что РНК появляются во внеклеточном пространстве в результате апоптотической и некротической гибели, дифференцировки клеток, а также при активной секреции жизнеспособными клетками. В системной циркуляции обнаружены тканеспецифичные РНК. При этом наибольший вклад в набор циркулирующих РНК вносят РНК из клеток крови и костного мозга, эндотелия сосудов, печени, легких, сердечной и скелетной мускулатуры, а также нервной ткани. Показано, что одним из основных источников РНК плазмы крови, в особенности микроРНК, являются форменные элементы крови. Установлена зависимость между количеством форменных элементов в крови и концентрацией некоторых мажорных форм микроРНК плазмы крови [35]. Показано, что даже небольшое повреждение клеток крови в процессе экспериментов вызывает существенное повышение концентрации РНК в плазме, поэтому Pritchard и соавт. предложили соотносить экспрессию потенциальных биомаркеров, циркулирующих в плазме крови, с показателями подсчета клеток крови [36]. Одной из основных форм микроРНК, циркулирующих в плазме крови человека, является микроРНК-223 [37, 38]. Наибольший уровень микроРНК-223 детектируется в гранулоцитах и их предшественниках [39, 40]. В системной циркуляции также обнаружены микроРНК, специфичные для ткани печени (микроРНК-122), мышечной ткани (микроРНК-133а), ткани сердца (микроРНК-208) и для ткани нервной системы (микроРНК-124) [41, 42]. Было обнаружено, что в крови пациентов с различными онкологическими и аутоиммунными заболеваниями происходит значительное увеличение концентрации циркулирующих нуклеиновых кислот [3, 43]. Это указывает на то, что повреждение тканей и клеток организма в результате развития опухоли и других патологических процессов являются одним из источником внеклеточных РНК. Также показано, что увеличение содержания отдельных форм РНК в крови может быть обусловлено повреждением внутренних органов, вызванным приемом лекарственных препаратов [44]. 16 Исследования набора циркулирующих микроРНК после длительной аэробной нагрузки показали, что изменения в уровне отдельных форм микроРНК наступают сразу после физической нагрузки и снижаются до исходного уровня в течение 24 часов. При этом уровень белковых маркеров, отражающих повреждения мышечной ткани, стресс сердечно-сосудистой системы и общие воспалительные процессы в организме, остается высоким и после 24 часов [45]. Также показано, что при ингибировании экспрессии гена TTR в печени с помощью инъекции миРНК происходит прямо пропорциональное снижение уровня мРНК TTR в сыворотке крови [46]. Это, с одной стороны, указывает на влияние физической активности на набор циркулирующих РНК и, с другой стороны, на то, что изменение набора внеклеточных РНК крови не полностью обусловлено нарушениями целостности клеточных мембран [45]. Обнаружено, что в плазме крови человека циркулируют экзогенные РНК из других организмов, таких как бактерии и грибы, а также из распространенных продуктов питания. В исследованиях in vitro показано, что микроРНК-подобные фрагменты бактериальных рРНК могут влиять на уровень мРНК, участвующих в процессах деградации РНК, апоптоза, опухолеобразования, сигнальных каскадах и др. Wang и соавт. предполагают, что экзогенные РНК плазмы крови могут выполнять роль сигнальных молекул и являться индикатором текущего состояния организма [47]. Таким образом, набор циркулирующих РНК плазмы крови формируется в результате различных физиологических процессов, протекающих в организме человека как в норме, так и при развитии патологических состояний. 1.3 Основные классы циркулирующих РНК В результате изучения состава цРНК показано, что в плазме крови содержатся фрагменты основных классов клеточных РНК: мРНК, тРНК, рРНК, мтРНК, мцРНК, мяРНК, мяоРНК, микроРНК, РНК ретроповторов и длинных некодирующих РНК. Известно, что наибольший вклад в набор клеточных РНК вносят рибосомные РНК. Их доля достигает 80% [48]. В наборе циркулирующих РНК плазмы крови человека преобладают короткие формы РНК, доля фрагментов рибосомных РНК по разным данным составляет от 4% до 9% [12, 13]. При исследовании транскриптома клетки рРНК, как и гены "домашнего хозяйства", часто используют как нормализационный контроль. Однако в работе Рыковой и соавт. показано, что концентрации внеклеточных мРНК гена "домашнего хозяйства" GAPDH, гена ядерного белка, ассоциированного с клеточной пролиферацией Ki-67, а также 18S рРНК варьируют в широком диапазоне и неприменимы для использования нормализационного контроля при исследованиях циркулирующих РНК [49]. в качестве 17 При действии внеклеточных РНКаз протяженные молекулы, такие как мРНК, подвергаются фрагментации и теряют функции, присущие полноразмерным транскриптам, например кодирование полипептидных цепей для мРНК. Фрагменты протяженных РНК при проникновении внутрь клетки, вероятно, могут выступать в качестве регулятора своих клеточных предшественников, представляя собой аналог малых интерферирующих РНК. При этом полноразмерные мРНК также присутствуют в плазме крови в составе экзосом и микровезикул, мембрана которых защищает мРНК от действия РНКаз. Показано, что мРНК микровезикул могут участвовать в физиологических процессах клеток-акцепторов, проникая в цитоплазму и выступая в качестве матрицы для синтеза белка [50]. Одним из наиболее изученных объектов среди набора циркулирующих РНК человека являются микроРНК. МикроРНК – это класс некодирующих 5'-фосфорилированных РНК длиной 19-24 нуклеотида, основной функцией которых является регуляция экспрессии мРНКмишеней. Впервые микроРНК были обнаружены у нематод C. elegans. Позже было установлено, что микроРНК принимают участие в регуляции клеточных процессов в норме и при патологии у высших животных [51]. В плазме крови матери обнаружили микроРНК плаценты [52]; несколько опухоль-ассоциированных микроРНК были детектированы в сыворотке крови пациентов с B-клеточной лимфомой [53]. В настоящее время в геноме человека выявлено более 2000 уникальных генов, кодирующих предшественники микроРНК [54]. МикроРНК синтезируются в эукариотических клетках в составе более длинных (150 – 200 н.) РНК-предшественников, часто имеющих экзонинтронную структуру и обладающих определенной шпилечной вторичной структурой. Вырезание шпилек из первоначальных транскриптов – предшественников микроРНК (премикроРНК) происходит в ядре с помощью Drosha-подобных РНКаз, затем шпильки экспортируются в цитоплазму, где гидролизуются РНКазой Dicer или подобными ей по специфичности цитоплазматическими РНКазами с образованием зрелой микроРНК [55]. Часть микроРНК транскрибируется в составе интронов мРНК и длинных некодирующих РНК. В этом случае образование пре-микроРНК происходит при участии сплайсосомы [55]. Показано, что циркулирующие микроРНК обладают высокой химической и биологической стабильностью, что позволяет использовать такие РНК как диагностические маркеры различных заболеваний [31, 32]. Тем не менее, существует несколько различных мнений о происхождении и биологических функциях внеклеточных микроРНК. Это объясняется неоднородностью набора таких микроРНК как по происхождению, так и по форме транспорта в системной циркуляции [56]. Основными формами транспорта циркулирующих РНК, выявленными к настоящему 18 времени, являются мембранные везикулы, липопротеины и рибонуклеопротеидные комплексы [57]. На основе многочисленных экспериментальных данных о внеклеточных микроРНК была создана база данных miRandola [58]. На начало 2015 года база содержала 2695 записей из 271 публикации о циркулирующих РНК [59]. Также в системной циркуляции обнаруживаются фрагменты малых ядрышковых РНК, входящих в состав малых ядрышковых рибонуклеопротеидных комплексов (мяоРНП). Известно, что мяоРНП участвуют в процессах посттранскрипционной модификации рРНК и мяРНК. Существует два основных класса мяоРНП - H/ACA и C/D бокс РНП. Сайтнаправленность модификации обеспечивается комплементарным связыванием H/ACA и C/D бокс РНК с РНК-мишенью. H/ACA бокс РНК направляют псевдоуридилирование рРНК, C/D бокс РНК направляют 2'-О метилирование РНК-мишеней [60]. Биогенез эукариотических мяоРНК является сложным процессом, объединяющим сборку, процессинг и транспорт РНК. Большинство мяоРНК транскрибируются РНК полимеразой II как часть интронов мРНК или как независимый транскрипт. В обоих случаях транскрипты могут содержать индивидуальную форму мяоРНК или кластер из нескольких мяоРНК [61]. Во многих исследованиях мяоРНК используют как внутренний контроль для нормализации данных ОТ-ПЦР при анализе внеклеточных микроРНК. Однако в ряде работ показано, что уровень экспрессии мяоРНК варьирует в широком диапазоне, ассоциирован с негативным прогнозом при плоскоклеточном раке головы и шеи [62], а также может использоваться в качестве самостоятельного диагностического маркера НМРЛ и рака молочной железы [63, 64]. Таким образом, использование мяоРНК в качестве внутреннего контроля при ОТ-ПЦР циркулирующих РНК не всегда является оправданным. Кроме коротких некодирующих РНК во внеклеточных жидкостях человека обнаружены длинные некодирующие РНК (днРНК) [65]. В группу днРНК входят днРНК с известной функциональной активностью (напр. XIST), антисмысловые днРНК (напр. BOK-AS1), интронные днРНК (напр. MAGI2-IT1), межгенные днРНК (LINC#), а также транскрипты, содержащие предшественники малых некодирующих РНК в интронах и не выполняющие других известных функций (напр. SNHG1) [66]. Характерными чертами днРНК являются высокая тканевая и клеточная специфичность, низкая копийность и слабая эволюционная консервативность [67]. днРНК с известными в настоящий момент функциями собраны в базу данных lncRNAdb [68, 69]. Среди множества днРНК с известными функциями можно выделить три группы днРНК, различающихся по регуляции основных клеточных процессов: транскрипции, трансляции и сплайсинга [70]. 19 В настоящее время известно, что фрагменты некодирующих РНК могут участвовать в регуляции клеточных процессов по механизму РНК-интерференции. Такие микроРНКподобные фрагменты образуются из рРНК, тРНК, мяоРНК и транскриптов мобильных элементов [71, 72]. Показано, что малые РНК, вырезаемые из Alu РНК, участвуют в регуляции клеточного цикла, репарации ДНК и сборке хроматина [73]. Можно заключить, что, хотя в системной циркуляции присутствуют фрагменты множества классов клеточных РНК, соотношение различных форм РНК внутри клетки и во внеклеточном пространстве различается. Это указывает как на разные пути образования циркулирующих РНК, так и на существование разных форм транспорта цРНК. 1.4 Формы транспорта циркулирующих РНК Систематические и целенаправленные исследования стабильности РНК вне клетки показали, что экзогенная РНК быстро деградирует в плазме крови и в цельной крови, в то время как некоторые формы эндогенных внеклеточных РНК человека проявляют повышенную стабильность к действию внеклеточных и эктоклеточных нуклеаз [74]. Также известно, что эндогенная РНК не способна проходить через фильтры, пропускающие свободные РНК или ДНК, и что добавление детергентов приводит к быстрому гидролизу эндогенной РНК [75]. Вероятным объяснением повышенной стабильности эндогенных внеклеточной РНК в системной циркуляции является их защита комплексом белков и/или липидов. В настоящее время установлено, что внеклеточные нуклеиновые кислоты попадают в системную циркуляцию в составе нескольких различных структур [15] (Рисунок 2): - везикулярных структур (экзосом и микровезикул); - апоптотических телец; - липопротеидов высокой плотности; - свободных рибонуклеопротеидов 1.4.1 Экзосомы и микровезикулы Экзосомы и микровезкулы являются двумя подклассами мембранных везикулярных структур, различающихся по механизмам образования и секреции [76]. Экзосомы представляют собой везикулярные структуры размером от 40 до 100 нм в диаметре. Процесс их формирования включает в себя три стадии: вначале участок клеточной мембраны вдавливается внутрь с образованием эндосомы, затем мембрана эндосомы вдавливается внутрь, в результате образуется мультивезикулярное тельце, содержащее экзосомы. Секреция экзосом происходит в результате слияния мембраны эндосомального мультивезикулярного тельца с цитоплазматической мембраной и выхода содержимого во внеклеточное пространство (Рисунок 2) [77]. Микровезикулы по размеру больше, чем 20 экзосомы, их диаметр составляет от 100 до 1000 нм. Формирование микровезикул происходит в результате выпячивания наружу участка плазматической мембраны клетки (Рисунок 2) [78]. Микровезикулы и экзосомы окружены липидной оболочкой, поэтому молекулы РНК в них защищены от гидролиза нуклеазами крови, обладают высокой стабильностью и благодаря белкам на поверхности везикул способны адресно направляться к клеткам-реципиентам [50]. Рис. 2. Формы транспорта РНК в плазме крови человека. Известно, что как нормальные, так и онкотрансформированные клетки эукариот секретируют везикулярные структуры во внеклеточное пространство [79, 80]. В результате исследований in vitro показано, что секретировать экзосомы и микровезикулы способны нейроны [81], тучные клетки [50], мышечные [82] и опухолевые клетки [83]. Тем не менее, предполагают, что большинство циркулирующих в плазме крови микровезикул и экзосом секретируется тромбоцитами крови [84, 85]. Присутствие РНК в циркулирующих везикулах in vivo было показано Hunter и соавт. [37]. Методом количественного ПЦР авторы определили уровень содержания 420 микроРНК в микровезикулах периферической крови человека, а также в одноядерных клетках крови и в тромбоцитах. Обнаружены формы микроРНК, присутствие которых является специфичным признаком для каждого типа исследуемых объектов, а также формы микроРНК, представленные в равной степени в микровезикулах и клетках крови, в микровезикулах и тромбоцитах [37]. 21 Показано, что секреция микроРНК из клеток в экзосомы контролируется нейтральной сфингомиелиназой 2 (нСМаза), ключевым ферментом биосинтеза церамидов. Церамиды запускают высвобождение экзосом из мультивезикулярных телец. Обработка культуры клеток ингибитором нСМазы GW4869, а также миРНК, направленными на мРНК нСМазы, вызывала доза-зависимое снижение уровня микроРНК во внеклеточном пространстве [14]. Эти данные указывают на то, что клетки секретируют микроРНК по церамид-зависимому пути образования экзосом. С помощью высокопроизводительного секвенирования и иерархической кластеризации полученных данных установлено, что экзосомы и микровезикулы, секретируемые эмбриональными клетками почки, моноцитами, эндотелиальными клетками и тромбоцитами, содержат наборы микроРНК, отличающиеся от набора клеточных микроРНК [86, 87]. С помощью кластерного анализа результатов ПЦР в режиме реального времени показано, что из 365 тестируемых микроРНК представленность 41 формы микроРНК коррелирует в стволовых клетках человека и в микровезикулах. Обнаружена специфичность секреции (компартментализации) набора из 18 микроРНК из стволовых клеток печени в микровезикулы и набора из 10 микроРНК для мезенхимальных стволовых клеток и их микровезикул. При этом наиболее представленные в микровезикулах микроРНК переносились в клетки-реципиенты после захвата микровезикул [88]. Эти данные указывают на существование специфического механизма транспорта микроРНК во внеклеточные везикулы. К настоящему времени, на основе многочисленных исследований состава везикулярных структур создана база данных ExoCarta, объединяющая информацию о белках, мРНК, микроРНК и липидных молекулах, содержащихся в экзосомах [89]. По данным на 2015 год база содержала собранную из 286 источников информацию о 9769 белковых молекулах, 3408 мРНК и 2838 микроРНК [90]. Установлено, что в наборе белков микровезикул, секретируемых стволовыми клетками человека, содержатся мультифункциональные белки, способные связывать нуклеиновые кислоты. Среди них, например, Tia, Tiar и HuR – белки, экспрессируемые в ядре и стрессовых гранулах [91]; Stau1 и Stau2, участвующие в транспорте и стабилизации мРНК [92]; а также AGO2 - белок, связывающий микроРНК и обеспечивающий ее функциональную активность [93]. Показано, что набор циркулирующих РНК в составе везикулярных структур, высвобождаемых дендритными и Т-клетками мыши, включает в себя митохондриальные транскрипты, мРНК, микроРНК, рРНК, малые ядерные и малые ядрышковые РНК, а также РНК геномных повторов, 7SL РНК, вольтРНК, Y-РНК. Установлено, что РНК внеклеточных везикул обогащены по некодирующим РНК, многие из которых не аннотированы в геномных базах 22 данных [94]. Показано, что полиаденилированные транскрипты (в основном мРНК) составляют около 0.6% от всего набора РНК микровезикул из эмбриональных стволовых клеток. Для сравнения, в клетках, продуцирующих микровезикулы, доля мРНК составляет около 3.5% [95]. Известно, что РНК, переносимые везикулярными структурами, биологически активны и способны нормально функционировать при попадании в клетки-реципиенты. Например, показано, что при переносе в клетки человека мРНК экзосом мыши происходит трансляция этих мРНК [50]. При исследовании РНК-протеолипидных комплексов сыворотки крови пациентов с лимфомой и саркомой было установлено, что микровезикулы, секретируемые раковыми клетками, содержат мРНК и переносят их в моноциты [80]. Трансляционная активность мРНК экзосом и микровезикул также была показана в эксперименте по переносу генной конструкции, кодирующей GFP, на культуре стволовых клеток [95]. В работе Deregibus и соавт. показано, что РНК микровезикул из клеток– предшественников эндотелиоцитов стимулируют ангиогенез in vivo [96]. Ratajczak и соавт. установили, что микровезикулы мышечных эмбриональных стволовых клеток увеличивают пролиферацию кроветворных клеток-предшественников и экспрессию ранних маркеров кроветворения (Scl, HoxB4 и GATA2) и плюрипотентности (Oct-4, Nanog и Rex-1) [79]. Предполагают, что основную роль при регуляции этих процессов играют несколько мРНК, ассоциированных с сигнальным путем фосфатидилинозитол киназы-3 (PI3K/AKT) [96], а также мРНК нескольких факторов роста, таких как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста гепатоцитов (HGF) и интерлейкин-8 (IL-8) [97]. Представленные данные свидетельствуют о возможности горизонтального переноса РНК между стволовыми, опухолевыми клетками, а также клетками эндотелия сосудов и иммунной системы с помощью экзосом и микровезикул. 1.4.2 Апоптотические тельца Известно, что в процессе апоптоза клетка фрагментируется с образованием апоптотических телец. Показано, что большое количество НК в плазме крови онкологических пациентов появляется в результате апоптотической и некротической гибели клеток опухоли. При этом оболочка апоптотических телец защищает НК от деградации нуклеазами крови [98]. Известно, что апоптотические тельца эндотелиальных клеток атеросклеротических бляшек способны участвовать в регуляции ангиогенеза и заживления ран. При захвате таких телец фагоцитами происходит запуск процессов секреции цитокинов и ростовых факторов. Zernecke и соавт. показали, что образующиеся при атеросклерозе апоптотические тельца эндотелиальных клеток содержат набор микроРНК [98]. Наибольший вклад в этот набор вносит микроРНК-126 – ключевой регулятор эндотелиального фактора роста сосудов и фактора роста 23 фибробластов в эндотелиальных клетках. Захват апоптотических телец соседними эндотелиальными клетками приводит к снижению экспрессии гена сигнального G белка 16 мишени микроРНК-126. В результате этого происходит экспрессия противовоспалительного химокина CXCR4 и стимулирование образования CXCL12 – лиганда CXC4. CXCL12 способствует привлечению эндотелиальных клеток-предшественников к атеросклеротическим бляшкам, ограничивая таким образом размер бляшек. Показано, что апоптотические тельца, выделенные из крови пациентов с атеросклерозом, обладают анти-атеросклеротическим действием и могут уменьшать размер бляшек при введении мышам с индуцированным атеросклерозом. Результаты данного исследования указывают на то, что погибающие эндотелиальные клетки формируют набор упакованных в апоптотические тельца микроРНКсигналов, индуцирующих в соседних клетках защитные процессы. Это приводит к локальному восстановлению сосудов и уменьшению последствий атеросклероза [98]. 1.4.3 Липопротеиды высокой плотности Известно, что РНК способны связываться с катионными липидами, например, с фосфатидилхолином [99]. Разнообразные комплексы липидов и нуклеиновых кислот используют для доставки генетического материала в клетки как in vitro, так и in vivo. Липосомы, содержащие основной белковый компонент липопротеидов высокой плотности (ЛВП) – аполипопротеин A-I (apoA-I), использовали для системной и точечной доставки малых интерферирующих РНК в клетки-мишени [100]. В отличие от мембранных везикул, состоящих из билипидного слоя и гидрофильного центра, липопротеиды состоят из одиночного слоя липидов и гидрофобного центра. Основной функцией ЛВП считают обратный транспорт холестерина в печень [101]. Также обнаружены противовоспалительные и антиокислительные функции ЛВП, обеспечивающие защиту сердечнососудистой системы от негативных факторов среды [102, 103]. В работе Vickers и соавт. показано, что в системной циркуляции присутствуют РНК размером 15-30 нуклеотидов, связанные с липопротеидами высокой плотности плазмы крови человека [38]. Установлено, что ингибирование нейтральной сфингомиелиназы 2 и церамидзависимого пути образования экзосом усиливает экспорт микроРНК в ЛВП. Показано, что наборы микроРНК, выделенных из ЛВП и экзосом крови здоровых доноров, существенно различаются. Обнаружено, что у пациентов с наследственной гиперхолестеринемией набор микроРНК из ЛВП обогащен по 22 микроРНК, в наибольшей степени по микроРНК-223, -105 и -106а. Показано, что ЛВП способны доставлять биологически активные микроРНК в гепатоциты Huh7, что приводит к снижению экспрессии мРНК-мишеней [38]. Wagner и соавт. показали, что при инкубации ЛВП с эндотелиальными клетками, клетками гладкой 24 мускулатуры или одноядерными клетками крови происходит перенос менее чем 10 копий микроРНК на клетку в течение 24 часов [104]. Тем не менее, установлено, что ЛВП-связанная микроРНК-223 может захватываться эндотелиальными клетками и осуществлять значительное подаление экспрессии гена ICAM-1 [105]. 1.4.4 Свободные рибонуклеопротеидные комплексы Другой формой транспорта циркулирующих микроРНК являются свободные (внеклеточные, вневезикулярные) рибонуклеопротеидные комплексы. Показано, что в культуре клеток происходит высвобождение во внеклеточное пространство РНК, устойчивых к деградации, но не связанных с микровезикулами и экзосомами. Такие РНК защищены от действия внеклеточных нуклеаз набором РНК-связывающих белков. Среди них гетерогенные ядерные рибонуклеопротеиды HNRNPA2B1, HNRPAB, ядрышковые белки нуклеолин NCL и нуклеофозмин NPM1, а также рибосомальные белки RPL10A, RPL5, RPLP1, RPS12, RPS19 [106]. Также известно, что после созревания микроРНК связываются с одним из четырех белков семейства AGO [107]. Turchinovich и соавт. анализировали копийность микроРНК-16, 21 и -24 в составе различных фракций плазмы крови и культуральной среды, конденсированной клетками человека, с помощью гель-фильтрации. Обнаружено, что наибольшее количество микроРНК связано с 96 кДа белками AGO, в основном с AGO2. Эти данные позволили заключить, что в составе свободных рибонуклеопротеидных комплексов циркулирует больше микроРНК, чем в составе везикулярных структур плазмы [108]. С помощью иммунопреципитации и иммуноблота с антителами к микроРНК-связывающим белкам семейства AGO, Arroyo и соавт. также показали, что микроРНК циркулируют в плазме крови преимущественно в комплексе с AGO2 [109]. Однако вывод о преобладании свободных рибонуклеопротеидов как формы транспорта внеклеточных микроРНК противоречит результатам, полученным Gallo и соавт. о преобладании экзосом и микровезикул как основной формы транспорта внеклеточных микроРНК в сыворотке крови и слюне человека. Полученные данные Gallo и соавт. объясняют улучшением методики выделения экзосом, снижающей лизис экзосом и попадание микроРНК в супернатант [110]. 1.5 Проникновение РНК в клетки-реципиенты В настоящее время известно, что внеклеточные нуклеиновые кислоты взаимодействуют со специфическими рецепторами на клеточной поверхности, захватываются клетками эукариот и индуцируют различные процессы в клетках-акцепторах [1]. 25 Установлено, что захват мРНК незрелыми дендритными клетками in vitro зависит от дозы РНК и от температуры среды. Захват мРНК происходит очень быстро, закодированный в мРНК белок детектируется в цитоплазме уже через несколько минут после обработки клеток препаратом мРНК. В экспериментах Diken и соавт. по определению колокализации мРНК и красителей ФИТЦ-декстран, интернализуемого клетками по механизму макропиноцитоза и зависимому от рецептора маннозы пути, а также люциферы желтой, интернализуемой клетками только микропиноцитозом, установлено, что молекулы мРНК захватываются дендритными клетками человека с помощью макропиноцитоза [33]. В исследовании Lorenz и соавт. показано, что РНК может захватываться не только дендритными клетками, но и первичными клетками гладкой мускулатуры человека, кератиноцитами и фибробластами кожи, а также клетками карциномы шейки матки (HeLa). Установлено, что в данном случае захват мРНК клетками происходил как по механизму макропиноцитоза, так и по кавеолин/липид-зависимому эндоцитозу [34]. С другой стороны, показано, что захват мРНК клетками дермы происходит по кальций-зависимому пути [111]. Также известно, что РНК активно интернализуются клетками млекопитающих с участием белков плотных межклеточных контактов, мембранных рецепторов и каналов [112]. Кроме того, возможность транспорта микроРНК между клетками в культуре посредством экзосом показана во многих исследованиях [50, 80, 113]. С помощью комбинирования методов спектрофлуорометрии, покадровой съемки и иммуно-электронной микроскопии доказано, что экзосомы способны состыковываться, связываться и сливаться с мембраной клетокреципиентов. При исследовании экзосом, нагруженных люциферином, показано, что при слиянии экзосом и мембраны клетки происходит проникновение содержимого экзосом в цитоплазму. Данная модель слияния мембран похожа на модель заражения клеток некоторыми типами вирусов [113]. Понимание механизмов переноса РНК через липидную мембрану посредством специфичных трансмембранных белков и при помощи эндоцитоза необходимо для разработки биологически активных препаратов на основе РНК [114]. В результате исследований мутантов C. elegans, в которых нарушены процессы активации РНК интерференции экзогенными молекулами миРНК, были открыты трансмембранные белки SID (systemic RNAi defective mutants). Белок SID-1 экспрессируется в большинстве тканей нематод (кроме нервных клеток), функционирует в виде мультимера, образуя канал для транспорта дцРНК внутрь клеток. Показано, что транспорт дцРНК через канал SID-1 осуществляется без участия АТФ [115]. Показано, что скорость захвата клетками радиоактивно меченых дцРНК через каналы SID-1 зависит от концентрации РНК в окружающей среде. В экспериментах по пульс-трансфекции установлено, что короткие дцРНК 26 накапливаются в клетке быстрее, чем длинные дцРНК. Эти данные указывают на пассивный (энергонезависимый) характер транспорта РНК через каналы SID-1 [116]. Установлено, что добавление дцРНК к клеткам, экспрессирующим белок SID-1, приводит к увеличению проницаемости клеточной мембраны, обусловленному открытием мембранных каналов SID-1 транспортеров дцРНК. При этом пассивный транспорт дцРНК может происходить как из внеклеточного пространства внутрь клетки, так и из цитоплазмы клетки наружу. Удержание дцРНК внутри клетки происходит благодаря взаимодействию с RISC-комплексом, осуществляющим процессы РНК интерференции [117]. В отличие от SID-1, белок SID-2 экспрессируется специфично в клетках кишечника C. elegans, захватывая дцРНК из пищеварительного тракта. Транспорт дцРНК через канал SID-2 происходит при пониженных значениях рН внеклеточной среды (просвета кишечника). Структурно-функциональный анализ белка SID-2 показал, что для взаимодействия с дцРНК важную роль играют расположенные во внеклеточных доменах остатки гистидина [118]. В геноме млекопитающих кодируются два паралога гена SID-1, присутствующего у C. elegans. Показано, что оба SID-1 паралога экспрессируются в большинстве тканей человека и грызунов [119]. Duxbury и соавт. показали, что гиперэкспрессия FLJ20174 - трансмембранного белка, гомологичного SID-1, приводит к увеличению интернализации родамин-меченой миРНК и усилению подавления гена-мишени (GFP). Сохранение транспорта миРНК при инкубации клеток с олигомицином (ингибитор АТФ-синтаз) и при пониженной температуре указывает на АТФ-независимый механизм транспорта миРНК [120]. Wolfrum и соавт. показали, что гепатоциты HepG2 способны захватывать радиоактивно меченые миРНК, связанные с аполипопротеином apoB1 и холестерином. При этом ингибирование действия трансмембранного белка, гомолога SID-1, с помощью предобработки клеток специфическими миРНК, направленными на мРНК гомолога SID-1, или антителами, связывающимися с наружным доменом белка, приводит к снижению захвата меченых миРНК клетками [121]. Однако у D. melanogaster не было найдено ортологов генов SID. Тем не менее, S2 клетки дрозофилы способны захватывать дцРНК из внеклеточного пространства и осуществлять процессы РНК интерференции при инкубации в среде, содержащей дцРНК. Это указывает на существование альтернативного, SID-независимого механизма захвата дцРНК. Ulvila и соавт. в результате последовательного выключения 2000 кандидатных генов обнаружили, что при захвате дцРНК клетками S2 ключевую роль играет продукт гена тяжелой цепи клатрина - белка, необходимого для осуществления эндоцитоза [122]. Роль эндоцитоза в захвате дцРНК была подтверждена в работе Saleh и соавт. Было показано, что из 7216 просканированных генов в захвате и процессинге дцРНК важную роль играют 23 гена, кодирующих, в том числе, белки, 27 задействованные в везикулярном транспорте, формировании комплекса Гольджи, организации цитоскелета и транспорте белков [123]. Таким образом, существует целый ряд молекулярных механизмов, способных обеспечить эффективную интернализацию молекул РНК из внеклеточного пространства разными типами клеток. Данные, свидетельствующие о межклеточном обмене биологическими соединениями в организме посредством мембранных везикул, в совокупности с информацией о присутствии мРНК и микроРНК в составе экзосом и микровезикул позволяют выдвинуть предположение о том, что мРНК и микроРНК, находящиеся в системной циркуляции, способны осуществлять межклеточную, системную коммуникацию на уровне организма. В подтверждение этой гипотезы показано, что микроРНК экзосом принимает участие в межклеточной коммуникации в процессе развития вирусной инфекции, иммунного ответа и онкологических заболеваний [17, 124, 125]. 1.6 Биологические функции циркулирующих РНК Для определения биологических функций циркулирующих РНК необходимо уставновить, какими свойствами обладают исследуемые молекулы при нахождении внутри клетки (с какими объектами и как взаимодействуют), а также определить, какие эффекты вызывает проникновение исследуемых РНК в клетку извне. Трансфекция клеточной культуры ДНК-конструкциями, кодирующими исследуемые формы РНК, позволяет обеспечить поступление максимального количества полноразмерных транскриптов внутрь клеток. Однако при этом подходе за рамками эксперимента остаются факторы взаимодействия РНК с рецепторами на поверхности клетки и процессы, связанные с селективным транспортом РНК через клеточную мембрану. Такой подход используют для изучения свойств как природных некодирующих РНК (например, [126]), так и их синтетических аналогов, несущих сайты распознования заданных исследователем РНКмишеней [127]. Альтернативным подходом к изучению свойств цРНК является использование липопротеидов и везикулярных структур, выделенных из плазмы крови или культуральной среды [38]. Такие структуры защищают исследуемые РНК от действия РНКаз, обеспечивают доставку активных соединений к чувствительным клеткам и проникновение через клеточную мембрану. При этом сами липопротеиды и везикулы обладают собственным комплексным действием, обусловленным не только молекулами РНК, но также белковыми и липидными соединениями. Поэтому данный подход требует дополнительного подтверждения того, что наблюдаемый биологический эффект обусловлен действием исследуемой формы РНК. 28 Известно, что молекулы РНК способны выполнять множество различных биологических функций: хранение и транспорт генетической информации (матричные РНК), регуляция экспрессии генов (микроРНК), каталитическая активность (рибосомная РНК). Функции внеклеточных РНК можно разделить на два типа: специфическое действие, которое напрямую зависит от клеточных функций РНК и последовательности нуклеотидных оснований, а также неспецифическое, рецептор-опосредованное действие РНК. Среди неспецифических функций внеклеточных РНК установлено участие в инициации свертывания крови и во врожденном иммунном ответе. Специфическое действие циркулирующих РНК зависит от класса рассматриваемых РНК. Интактные молекулы мРНК могут транслироваться в клетках-реципиентах с образованием чужеродных для клетки белков [50, 95]. МикроРНК, а также фрагменты рРНК и мяоРНК способны участвовать в регуляции комплементарных генов мишеней по механизму РНК интерференции [71, 125]. Набор методов, используемый для определения биологических функций цРНК, также зависит от класса исследуемых РНК и варьирует в широком диапазоне. Так, например, при определении функциональной активности мРНК необходимо подтвердить трансляцию белковой молекулы в клетке-реципиенте мРНК, а также ее функциональную активность [50, 95]. При исследовании функций микроРНК и мяоРНК, направляющих ферментативные процессы на основе антисенс-взаимодействия с РНК-мишенью, необходимо подтвердить нарушение трансляции мРНК-мишени, в случае с микроРНК [125], либо модификацию РНКмишени, в случае с мяоРНК [127]. 1.6.1 Неспецифическое действие циркулирующих РНК 1.6.1.1 Свертывание крови Недавние исследования указывают на то, что внеклеточные нуклеиновые кислоты не являются пассивными компонентами в системной циркуляции, а исполняют важные сигнальные функции, стимулируют активацию защитных систем организма в рамках врожденного иммунитета и заживления ран [16]. Установлено, что внеклеточные РНК действуют как кофактор при инициации контактной фазы коагуляции крови in vitro и in vivo [128], в частности, выполняют роль кофактора для автоактивации фактора VII – активирующей протеазы (FSAP). Данный фермент задействован в коагуляции крови и обладает рядом уникальных функций: функцией активации проурокиназы, антипролиферативной активностью и функцией высвобождения нуклеосом [129, 130]. Показано, что положительно заряженный участок белка FSAP специфично связывается с РНК, причем этот участок отличается от других консервативных РНК-связывающих сайтов многих цитоплазматических белков [128]. 29 Долгое время механизм контактной фазы коагуляции крови оставался неопределенным. Считалось, что инициация контактной фазы происходит на чужеродных структурах, попадающих в кровяное русло при повреждении сосудов [131]. В настоящее время установлено, что внеклеточные РНК и другие полианионные структуры дополняют, усиливают, а иногда и заменяют чужеродный материал in vivo в роли инициатора активации фактора XII и последующего тромбообразования при травмах и других патологиях. На животных моделях показано, что гидролиз внеклеточных РНК РНКазой I или деградация полифосфатов фосфатазой существенно снижают риск осложнений от тромбоза, не оказывая существенного влияния на процессы нормального гемостаза. Другими словами, полианион-зависимое усиление процессов свертывания крови стабилизирует формирование тромба, не влияя на фибринолиз [132]. Для осуществления структурно-функциональных взаимодействий, которые, как было показано, являются определяющими факторами прокоагулянтной активности внеклеточных нуклеиновых кислот, требуется наличие полианионной структуры и высокой плотности отрицательных зарядов, которые необходимы для высоко-аффинного связывания с белками контактной фазы (факторы XII и XI, высокомолекулярные кининоген и прекалликреин) [133]. Протяженные молекулы РНК (n > 100 н.) стимулируют активацию системы свертывания крови по механизму матрицы, когда соответствующая протеаза и ее белковый субстрат связываются с одной и той же молекулой РНК [128]. Этот механизм подобен действию гепарина при усилении ингибирования тромбина антитромбином. На животной модели показано, что внеклеточная РНК способствует повышению проницаемости сосудов при тромбозе или сердечном приступе [134, 135]. Тем самым, по характеру действия РНК похожа на гепарин. Молекулы РНК взаимодействуют с несколькими хемокинами, цитокинами и другими основными белками, стимулируя или нейтрализуя их функциональную активность [136]. 1.6.1.2 Врожденный иммунитет Предполагается, что повреждение ткани и высвобождение внутриклеточного материала, в том числе нуклеиновых кислот, во внеклеточное пространство могут вызывать активацию провоспалительных реакций врожденного иммунитета. Клетки врожденной иммунной системы, находящиеся как в тканях, так и в системной циркуляции, способны распознавать появление патогенов и повреждения клеток с помощью множества поверхностных и эндосомальных рецепторов. Основным классом таких рецепторов являются Toll-подобные рецепторы (TLR). Первоначально Toll-подобные рецепторы были обнаружены у Drosophila, а в 1997 г. Toll-подобный гомологичный ген выявлен у млекопитающих (сейчас это TLR4) [137]. Всего у млекопитающих существует 10 групп TLR (TLR1–10). TLR являются трансмембранными рецепторами и состоят из двух доменов: внеклеточного обогащенного лейцином региона LRR 30 (leucin rich region) и цитоплазматического домена TIR (Toll/IL-1 receptor). TLR преимущественно распознают молекулярные мишени, ассоциированные с бактериальными и вирусными патогенами, а также с клеточными повреждениями, в частности: TLR7, 8 распознают оцРНК, при этом TLR7 распознает обогащенную урацилом РНК (например РНК вируса гриппа, ВИЧ); лигандом TLR3 являются внеклеточные дцРНК, появляющиеся при репликации вирусов в организме хозяина; TRL9 взаимодействует с неметилированными CpG мотивами бактериальной ДНК [138]. TLR играют ключевую роль во врожденном иммунном ответе. При активации TLR запускается сигнальный каскад, в котором участвуют белки MyD88, TOLLIP, IRAK или TRAF6. Затем происходит активация внутриклеточных факторов NF-kB, JNK и p38 MAP киназы. В результате активируется экспрессия противовирусных или противомикробных белков, фактора некроза опухолей TNF-, интерлейкина IL-1 или IL-6, а также интерферонов первого типа (Рисунок 3) [139]. Исследования TLR однозначно свидетельствуют о различной чувствительности врожденного иммунитета к экзо- и эндогенной РНК [140]. Возможно, этому способствует посттранскрипционная модификация РНК, например, метилирование оснований и остатков рибозы [141]. При активации врожденного иммунного ответа происходит привлечение к очагам воспаления гранулоцитов и макрофагов, которые уничтожают патогенные микроорганизмы по механизму фагоцитоза. Центральную роль в этом процессе играют воспалительные цитокины, которые увеличивают проницаемость сосудов, активируют экспрессию молекул клеточной адгезии в клетках сосудов и, таким образом, способствуют продвижению лейкоцитов к очагам инфекции и воспаления. Показано, что при повреждении ткани и сосудов внеклеточная РНК активирует адгезию лейкоцитов к эндотелию сосудов и их миграцию через стенки сосудов. Предполагается, что центральную роль в РНК-опосредованном воспалении играют цитокины, в частности фактор некроза опухолей α (ФНО-α) [142]. Показано, что различные провоспалительные агенты, в том числе внеклеточная РНК, могут стимулировать секрецию РНКазы I из телец Вейбеля — Паладе, гранул эндотелиальных клеток [143]. При этом внеклеточные РНК и РНКазы образуют систему регуляции сосудистого гомеостаза, направленную на активацию врожденной иммунной системы и заживления ран [136]. Таким образом, внеклеточные РНК могут выступать в роли сигнальных молекул, высвобождаемых клетками поврежденной ткани, а также, через стимуляцию экспрессии ФНО-α, могут усиливать различные воспалительные реакции. 31 Рис. 3. Механизм иммунного ответа клетки на экзогенные нуклеиновые кислоты при активации Toll-подобных рецепторов. При взаимодействии НК с расположенными на мембране эндосом рецепторами TLR3, TLR7, TLR8, и TLR9 происходит последовательная активация адаптерных белков (MyD88, TRIF) и белков сигнальной трансдукции (киназы семейств IRAK, IKK, убиквитин лигаза TRAF-3 и др.). Активация транскрипционных факторов, таких как IRF-3, IRF7 и NF-kB, приводит к увеличению провоспалительных цитокинов [144]. экспрессии интерферонов первого типа и 32 1.6.2 Специфическое действие циркулирующих РНК 1.6.2.1 Регуляция иммунного ответа Известно, что внеклеточные мРНК при попадании в клетки-реципиенты способны связываться с трансляционным аппаратом и выступать в качестве матрицы для синтеза белковых молекул. Например, показано, что при переносе в клетки человека мРНК из экзосом мыши происходит трансляция, в результате которой синтезируются новые белки, закодированные в мРНК мыши [50]. Возможность трансляции мРНК экзосом и микровезикул была подтверждена Yuan и соавт. в эксперименте по переносу генной конструкции, кодирующей GFP [95]. Способность экзогенной мРНК транслироваться в клетках-реципиентах используют для лечения и профилактики социально-значимых заболеваний. Weiss и соавт. проверили иммуномодулирующее действие вакцины на основе мРНК, кодирующей белокаллерген пыльцы Тимофеевки луговой Phl p5. Показано, что защитный эффект вакцины длится 9 месяцев и приводит к снижению уровня эозинофилов в бронхоальвеолярном смыве [145]. Прямая вакцинация мРНК, кодирующими набор опухоль-специфичных антигенов, является новым и многообещающим подходом в иммунотерапии рака. Компания CureVac (Германия) разработала двухкомпонентную вакцину, которая состоит из свободной и связанной с протамином мРНК. Такой подход обеспечивает экспрессию антигена, стимуляцию CD4+, CD8+ T-клеток и B-клеток иммунной системы, а также активацию системы врожденного иммунитета через TLR-7 [146]. Возможность антиген-зависимого переноса РНК, влияющей на презентацию антигена и иммунный ответ, из Т-клеток в антиген-презентирующие клетки показана на примере микроРНК-335 в работе Mittelbrunn и соавт. [125]. Установлено, что перенос микроРНК-335 происходит во время образования иммунного синапса. Этот процесс осуществляется при помощи экзосом и приводит к специфическому воздействию на экспрессию гена SOX-4 мишени микроРНК-335 [125]. МикроРНК экзосом также способны влиять на систему врожденного иммунитета. Установлено, что клетки, зараженные вирусом Эпштейна-Барра, секретируют экзосомы, содержащие микроРНК, кодируемые в геноме вируса. При взаимодействии экзосом из зараженных клеток с культурой интактных клеток-реципиентов происходило снижение экспрессии генов-мишеней вирусных микроРНК, в частности мРНК лиганда хемокина CXC (CXCL). В результате этого снижалась способность клеток-реципиентов противостоять заражению вирусом [124]. 33 1.6.2.2 Регуляция липидного обмена и развития атеросклероза Нарушения липидного обмена, сопровождающиеся отложением холестерина на стенках сосудов, вызывают хроническое заболевание артерий – атеросклероз. Отложения формируют атеросклеротические бляшки, вызывая изменения клеток гладкой мускулатуры и эндотелия сосудов. Установлено, что экзосомы транспортируют микроРНК-143/145 из эндотелиальных клеток в клетки гладкой мускулатуры, снижая экспрессию генов ELK1, KLF4, CAMK2d, SSH2, а также PHACTR4 и CFL1 – мишеней микроРНК-143 и -145. При этом происходит предотвращение де-дифференцировки клеток гладкой мускулатуры и уменьшение образования атеросклеротических бляшек. Стимулирование экспрессии и экспорта микроРНК-143/145 в клетках эндотелия происходит при участии Круппель-подобного фактора 2 [147]. Zhang Y. и соавт. показали, что микроРНК-150 может переноситься микровезикулами из активированных моноцитов и снижать экспрессию гена транскрипционного фактора c-Myb в эндотелиальных клетках-реципиентах. При этом происходит усиление миграции клеток эндотелия в 2.5 раза. Предполагают, что такие процессы происходят in vivo при атеросклерозе [148]. Показано, что микроРНК, переносимые ЛВП, выделенными из крови пациентов с атеросклерозом, существенно влияют на экспрессию генов, участвующих в липидном метаболизме и развитии атеросклероза, в том числе NDST143, NR1D244, BMPR245, VEGFA и FLT146 [38]. Установлено, что апоптотические тельца больных атеросклерозом отличаются повышенным содержанием микроРНК-126. При попадании в эндотелиальные клеткиреципиенты микроРНК-126 снижает экспрессию генов RGS16, VCAM-1 и SPRED1. Снижение экспрессии гена RGS16 приводит к увеличению экспрессии белка CXCL12, противодействующего развитию атеросклероза [98]. 1.6.2.3 Регуляция образования и развития опухолей Известно, что некоторые типы опухолей влияют на окружающие ткани, способствуя усилению роста клеток опухоли, увеличению хеморезистентности, уходу от действия иммунной системы и метастазированию [149, 150]. Одним из ключевых факторов, обеспечивающих модификацию микроокружения опухоли и уход от действия иммунной системы, является формирование популяции опухоль-ассоциированных макрофагов (ТАМ, tumor-associated macrophages). Такие макрофаги характеризуются измененным фенотипом М2. Цитокины и ростовые факторы, содержащиеся в ТАМ, способствуют процессам инвазии опухолевой ткани и росту кровеносных сосудов вокруг опухоли [151]. Установлено, что микровезикулы макрофагов, стимулированных интерлейкином 4, содержат большое количество микроРНК-223. При захвате микровезикул клетками рака 34 молочной железы происходит усиление метастазирования опухоли. Показано, что микроРНК223 подавляет экспрессию гена энхансера миоцитов Mef2c, что приводит к накоплению βкатенина в ядре раковых клеток и усилению клеточной миграции [17]. Установлено, что клеточные микроРНК могут действовать и как онкогены, и как онкосупрессорные гены, регулируя процессы миграции, инвазии и пролиферации клеток, а также процессы ангиогенеза и апоптоза [152]. Предполагают, что мРНК и микроРНК, секретируемые раковыми клетками, могут влиять на экспрессию генов в соседних неонкотрансформированных клетках, а также оказывать стимулирующее действие, усиливая рост опухоли. Несмотря на то, что данный феномен не доказан в экспериментах in vivo, есть данные о высоком содержании отдельных форм мРНК и микроРНК в микровезикулах первичной культуры клеток глиобластомы человека и в микровезикулах сыворотки крови пациентов с глиобластомой. Причем такие микровезикулы усиливают пролиферацию клеток глиомы человека в культуре, подтверждая предположение о самостимулирующем действии микровезикул раковых клеток [153]. Также обнаружено, что экзосомы клеток карциномы печени содержат набор микроРНК, способных подавлять экспрессию онкосупрессорного гена TAK1 (киназы, активируемой трансформирующим ростовым фактором β), усиливая рост онкотрансформированных клеток [154]. В работе Ohshima K. и соавт. исследовано несколько культур раковых клеток, характеризующихся различной степенью метастазирования. Установлено, что наиболее агрессивные формы рака секретируют через экзосомы наибольшее количество опухольсупрессорных микроРНК семейства let-7. Авторы выдвинули предположение о том, что активно метастазирующие типы клеток избавляются от микроРНК, которые подавляют развитие опухоли, путем секреции микроРНК по экзосомальному пути [155]. 1.6.2.4 Дифференцировка и морфогенез Перенос микроРНК с помощью экзосом между разными клеточными культурами показан в работе Umezu и соавт. [18]. Для установления функциональной активности внеклеточных РНК авторы использовали культуру клеток лейкемии К562 как донор микроРНК92а и клетки эндотелия пупочной вены человека HUVEC как реципиенты микроРНК. С помощью флуоресцентно-меченого предшественника микроРНК-92а показано, что происходит перенос функционально активной микроРНК-92а между клеточными культурами. При этом флуоресцентный сигнал микроРНК был локализован совместно с экзосомальным маркером CD63. Экзогенная микроРНК-92а в клетках-реципиентах подавляла экспрессию гена интегрина а5, стимулируя клеточную миграцию и формирование сосудистого фенотипа [18]. 35 В эксперименте с культурами мезенхимальных стволовых клеток и первичными культурами нейронов и астроцитов показано, что посредством экзосом происходит перенос микроРНК-133b, который приводит к образованию нейритного выроста [156]. Таким образом, циркулирующие РНК плазмы крови оказывают значительное влияние на жизненно важные процессы в организме человека в норме и при развитии патологических состояний. 1.7 Циркулирующие РНК как показатель состояния организма Изменение набора РНК в системной циркуляции в результате развития патологических процессов в организме может служить малоинвазивным маркером этих процессов. До появления технологий высокопроизводительного секвенирования основным методом, применяемым для поиска циркулирующих РНК-маркеров, была обратная транскрипцияамплификация со специфическими праймерами. Основными мишенями для анализа служили опухоль-специфические РНК. Однако использование такого подхода для определения циркулирующих в крови РНК-маркеров давало противоречивые результаты. Так, одним из наиболее показательных примеров несоответствий в экспериментальном подтверждении диагностической значимости цРНК является использование мРНК тиреоглобулина для диагностики онкотрансформации щитовидной железы. В ряде работ показано, что мРНК тиреоглобулина позволяет с высокой точностью (более 80%) детектировать рак щитовидной железы, появление метастазов и рецидив заболевания [157, 158, 159]. С другой стороны, установлено, что использование мРНК тиреоглобулина для обнаружения рецидива рака щитовидной железы нецелесообразно из-за низкой точности анализа [160]. В работе Denizot и соавт. установлено, что чувствительность выявления рака щитовидной железы с использованием мРНК тиреоглобулина не превышает 15% [161]. Eszlinger и соавт. провели анализ содержания мРНК тиреоглобулина в крови нескольких групп доноров: здоровые доноры, пациенты с автономией щитовидной железы, болезнью Грейвса, с синдромом эутиреоидного зоба и пациенты с раком щитовидной железы с выявленными метастазами и без них. Показано, что достоверных отличий в уровне мРНК тиреоглобина исследованных групп пациентов и здоровых доноров не детектируется [162]. Тем не менее, стандартизация методик выделения РНК, использование в качестве источника РНК не цельной крови, а плазмы или сыворотки, а также применение новых способов нормализации данных ПЦР привели к устранению противоречий и повышению диагностических параметров разрабатываемых тест-систем онкологических заболеваний на основе РНК-маркеров. Широкое распространение анализа РНК методом ОТ-ПЦР в реальном времени позволило определять не только качественный состав диагностически значимых форм 36 внеклеточных РНК, но и их количество в исследуемых образцах. Это также существенно увеличило точность проведения анализа. В настоящее время существует множество данных, указывающих на значительную роль микроРНК в ключевых биологических процессах, таких как рост и дифференцировка клеток, пролиферация, развитие эмбриона и апоптоз [163]. Нарушения функционирования микроРНКзависимой регуляции приводит к различным заболеваниям, в том числе к онкологическим [164]. Li и соавт. на основе литературных источников построили базу данных, содержащую ассоциации микроРНК и заболеваний человека (human miRNA disease database – HMDD2) [165]. В 2015 году база данных содержала 10 368 записей, объединяющих 572 микроРНК, 378 заболеваний из 3511 публикаций [166]. микроРНК, циркулирующие в плазме крови человека, обладают рядом преимуществ по сравнению с другими маркерными молекулами: высокой стабильностью и тканеспецифичностью экспрессии. Кроме того, циркулирующие микроРНК могут быть проанализированы методом ОТ-ПЦР – наиболее чувствительным на данный момент методом детекции биомолекул. В связи с этим, в большинстве работ по изучению диагностического потенциала циркулирующих РНК в качестве диагностического параметра используют изменение уровня отдельных форм микроРНК в системной циркуляции. 1.7.1 Циркулирующие РНК плода и плаценты в крови матери как показатель протекания беременности Одним из направлений исследований циркулирующих РНК является изучение диагностического потенциала эмбриональных РНК в крови матери. Пренатальная диагностика, основанная на измерении представленности отдельных форм эмбриональных РНК в крови матери, предлагается как альтернатива используемым сейчас методам, таким как амниопункция, биопсия хориона и кордоцентез. При исследовании циркулирующих РНК плаценту и специфичные для нее РНК также предлагается рассматривать как модель развития опухоли в организме и появление опухоль-специфичных РНК в системной циркуляции [167]. Присутствие РНК плаценты в системной циркуляции матери было установлено в 2000 году Poon и соавт. [29]. При исследовании РНК плода в плазме крови матери детектировали наличие транскрипта одной из областей Y хромосомы. Было установлено, что концентрация РНК плода, так же как и концентрация ДНК плода в крови матери, увеличивается со сроком беременности [168]. Обнаружение в крови матери мРНК гамма-глобина, экспрессируемого на стадии эмбриона, указывает на то, что кроветворные клетки плода вносят существенный вклад в набор циркулирующих РНК матери [169]. Ng и соавт. показали, что в материнской плазме циркулируют мРНК, кодирующие набор специфичных для плаценты белков: плацентарный лактоген, -субъединицу хорионического гонадотропина человека и кортикотропин-релизинг-гормон. Авторы предложили использовать 37 циркулирующие в крови матери плацентарные РНК для ранней диагностики различных патологий беременности, таких как преэксампсия и хромосомная анеуплоидия [170, 171]. Для ранней диагностики синдрома Дауна у плода Oudejans и соавт. предложили использовать циркулирующую в крови матери РНК HERV-Fb1 (LOC90625), специфичную для хромосомы 21 [172]. Исследования РНК, выделенной из крови матери и плаценты, методом гибридизации на микрочипах выявили наборы из 1245 и 1745 транскриптов, концентрация которых в плазме крови матери повышается в первый и третий триместры беременности, соответственно. Эти данные предлагается использовать в будущем для пренатальной диагностики [173]. Williams и соавт. провели высокопроизводительное секвенирование микроРНК плазмы крови трех матерей, образцов плазмы пуповинной крови этих матерей, а также одного мужчины и двух небеременных женщин. В результате анализа данных методом неконтролируемой иерархической кластеризации показано, что относительный уровень микроРНК-498, микроРНК-127 и микроРНК-134 в ткани плаценты, плазме пуповинной крови и плазме крови матерей был выше, чем в плазме крови мужчины и небеременных женщин [167]. Согласно данным по тканевой специфичности микроРНК, микроРНК-498 является плацентоспецифичной микроРНК у приматов, а микроРНК-127 и микроРНК-134 продуцируются в печени и почках [39]. Williams и соавт. предлагают использовать плаценту как модель солидной опухоли, а плацентоспецифичные микроРНК семейства 498 – как модель опухоль-специфичных микроРНК. Предполагая, что опухоль секретирует микроРНК в количестве сравнимом с плацентой, авторы оценивают, что порог детекции опухоль-специфичных микроРНК в плазме крови достигается при массе опухоли в 0.3 грамма [167]. В работе Yang и соавт. проведено высокопроизводительное секвенирование коротких циркулирующих РНК сыворотки крови беременных женщин без выявленных патологий и с преэклампсией (состояние, характеризующееся артериальной гипертензией, протеинурией и периферическими отеками). Авторы использовали схему последовательного выравнивания данных секвенирования с шестью базами данных: рРНК, мяоРНК, мяРНК, тРНК, микроРНК и геном человека. В среднем для исследованных образцов, 7% последовательностей совпало с библиотекой малых РНК (рРНК, мяоРНК, мяРНК и тРНК), 22% последовательностей совпало с последовательностями известных микроРНК и 71% последовательностей картированы на геном человека. В результате сравнительного анализа показано, что экспрессия 22 различных микроРНК в сыворотке крови ассоциирована с преэклампсией (Р < 0.05), в том числе микроРНК семейств 517, 520 и 125 [12]. Li и соавт. с помощью высокопроизводительного секвенирования проанализировали состав коротких циркулирующих РНК в плазме крови женщин в течение беременности [13]. 38 Обнаружено, что набор циркулирующих РНК изменяется с течением беременности. Наибольший вклад в набор цРНК вносят микроРНК и тРНК, причем доля микроРНК варьировала от 22% до 52%. Вклад других типов РНК, таких как рРНК, мяоРНК и мяРНК, варьировал от 6% до 13%. В результате функционального анализа генов-мишеней наиболее представленных микроРНК плазмы крови беременных женщин установлено, что циркулирующие во время беременности микроРНК влияют на экспрессию генов, участвующих в регуляции генетических расстройств, иммунологических заболеваний, процессов онкотрансформации, клеточного цикла и клеточной сигнализации [13]. Авторы предполагают, что циркулирующие в крови беременных женщин микроРНК могут принимать участие в физиологических процессах, связанных с изменением организма матери при развитии плода и с развитием патологий беременности [13]. 1.7.2 Циркулирующие РНК при сердечно-сосудистых заболеваниях Специфические наборы микроРНК были обнаружены в системной циркуляции при целом ряде сердечнососудистых заболеваний: ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, артериальная гипертензия и сердечная недостаточность [174, 175]. Показано, что при ишемической болезни сердца в системной циркуляции происходит снижение концентрации микроРНК эндотелиальных клеток (микроРНК-126, микроРНК-17 и микроРНК-92а), микроРНК-145, специфичной для гладкомышечных клеток, и экспрессируемой при воспалении микроРНК-155. При этом наблюдается увеличение вклада микроРНК-133 и микроРНК-208а, экспрессируемых в кардиомиоцитах [176]. В работе Li и соавт. с помощью гибридизации на микрочипах показано, что при гипертонической болезни в крови пациентов понижена концентрация 18 микроРНК и повышена концентрация 9 микроРНК, в том числе микроРНК цитомегаловируса человека hcmv-miRUL112 [177]. В сыворотке недостаточностью крови обнаружен пациентов повышенный с хронической уровень 4 систолической микроРНК: сердечной микроРНК-423-5р, микроРНК-320а, микроРНК-22 и микроРНК-92b. Чувствительность и специфичность анализа сердечной недостаточности составили более 90% [178]. Установлена корреляция уровня циркулирующей микроРНК 423-5р с уровнем используемого в клинической практике биомаркера - мозгового натрийуретического пептида [179]. Показано, что уровень микроРНК, специфичных для мышечной ткани (микроРНК-1, микроРНК-133a и микроРНК-499), а также микроРНК-208a, специфичной для сердца, существенно выше в плазме крови пациентов с острым инфарктом миокарда, чем в плазме крови здоровых доноров [180]. Установлено, что уровень микроРНК-1 у пациентов с острым 39 инфарктом миокарда снижается после проведения лечения. При этом увеличение уровня микроРНК-1 в системной циркуляции не было ассоциировано с возрастом, полом, кровяным давлением или наличием сахарного диабета [181]. 1.7.3 Циркулирующие РНК при воспалительных и системных заболеваниях Известно, что циркулирующие мРНК и микроРНК связаны с воспалительными процессами в организме, а также являются маркерами целого ряда заболеваний, таких как сахарный диабет, артрит, бактериальное заражение крови, системная красная волчанка и биполярное аффективное расстройство. При ряде осложнений у пациентов, страдающих сахарным диабетом, в плазме крови обнаруживаются специфичные РНК. Показано, что развитие ретинопатии у больных сахарным диабетом приводит к повышению циркулирующей мРНК родопсина, мРНК нейронспецифичной енолазы, а также мРНК аминооксидазы сетчатки [182, 183]. Обнаружен набор микроРНК, экспрессия которых значительно усилена в сыворотке крови больных диабетом первого типа, в том числе, микроРНК-25 [184]. В системной циркуляции пациентов с диабетом второго типа также обнаружен измененный профиль экспрессии набора микроРНК. Установлено, что концентрация микроРНК-28-3р в плазме крови больных увеличивается, а концентрация набора из 10 других микроРНК снижается. При этом в наибольшей степени снижается уровень эндотелиальной микроРНК-126 [185]. Показано, что уровень микроРНК-132 в плазме крови здоровых доноров был значительно выше, чем у пациентов с ревматоидным артритом и остеоартритом, уровень микроРНК-16, -146а, -155, и -223 в синовиальной жидкости больных с ревматоидным артритом был существенно выше, чем у больных с остеоартритом [186]. Обнаружено, что в плазме крови пациентов с биполярным аффективным расстройством концентрация специфичной для нервной ткани микроРНК-134 понижена по сравнению с концентрацией микроРНК-134 в плазме крови здоровых доноров. После проведения лечения пациентов с биполярным аффективным расстройством с использованием различных комбинаций антипсихотических препаратов уровень микроРНК-134 в плазме крови увеличивается. Исходя из этого, авторы предполагают, что микроРНК в целом и микроРНК-134 в частности играют важную роль при развитии психических расстройств [187]. Показано, что уровень внеклеточных микроРНК семейства-200, микроРНК-205 и -192 в сыворотке крови у пациентов с системной красной волчанкой (СКВ) достоверно ниже, чем у здоровых доноров [188]. Уровень микроРНК-146а и -155 в сыворотке крови больных СКВ был также ниже, а в моче больных СКВ выше, чем в контрольных образцах. Приблизительная скорость клубочковой фильтрации коррелировала с уровнем микроРНК-146а и -155 в 40 сыворотке крови. После лечения препаратом "кальцитриол" в течение 6 месяцев уровень микроРНК-146а в сыворотке пациентов СКВ повышался. Авторы предполагают, что микроРНК-146а и микроРНК-155 принимают участие в патофизиологии СКВ и могут использоваться как биомаркеры заболевания [189]. Установлено, что пониженный уровень микроРНК-223 и микроРНК-146а в сыворотке крови является специфическим индикатором заражения крови – сепсиса. Уровень микроРНК223 и -146а в сыворотке крови больных сепсисом существенно ниже, чем у здоровых доноров и пациентов с синдромом системной воспалительной реакции и коррелирует с уровнем белковых маркеров, С-реактивным белком и интерлейкином-6 [190]. 1.7.4 Циркулирующие РНК при онкологических заболеваниях Известно, что циркулирующие РНК присутствуют в плазме и сыворотки крови пациентов, страдающих различными типами онкологических заболеваний, таких как рак молочной железы, рак легкого, рак простаты, рак щитовидной железы, карцинома печени, меланома, рак желудка, рак почки, рак пищевода, карцинома прямой кишки, рак поджелудочной железы и т.д. В настоящее время внеклеточные РНК предлагается использовать как биологический маркер для раннего обнаружения и диагностики заболеваний, для предсказания постоперационных рецидивов и ответа на химиотерапевтические препараты [191]. Одной из гипотез появления опухолеспецифичных РНК в системной циркуляции является перенос РНК в составе циркулирующих (метастазирующих) раковых клеток [192, 193]. Однако вследствие небольшого количества циркулирующих раковых клеток считается, что опухолеспецифичные РНК циркулируют вне клеток и появляются в системной циркуляции в результате некроза и апоптоза раковых клеток. Современные исследования также указывают на активную секрецию раковыми клетками везикулярных структур, циркулирующих в крови человека – экзосом и микровезикул [83]. Другой подход к определению диагностически значимых форм РНК в системной циркуляции заключается в изучении суммарного набора внеклеточных РНК, в том числе форм РНК, напрямую не связанных с клетками опухоли, а представляющих реакцию организма на развитие заболевания. Это, в первую очередь, транскрипты клеток иммунной системы и эндотелия сосудов, широко представленные в наборе РНК плазмы крови человека [35]. 1.7.4.1 Рак молочной железы Рак молочной железы – наиболее распространенная форма рака среди женщин, а также одно из самых изученных и изучаемых онкологических заболеваний. В зависимости от 41 экспрессии эстрогеновых рецепторов ER и онкогена HER2 рак молочной железы классифицируют по четырем подтипам [194] (Таблица 1). Показано, что мРНК метастазина в сыворотке крови можно использовать как прогностический и диагностический маркер рака молочной железы. Чувствительность метода определения заболевания составила 85%, специфичность – 100%. Высокая концентрация мРНК метастазина в крови свидетельствовала об отдаленных метастазах в легких, печени и костной ткани [195]. Появление метастазов в костной ткани при раке молочной железы также сопровождается статистически достоверным (P < 0.01) увеличением концентрации мРНК гена DKK1 в сыворотке крови пациентов. Продукт гена DKK1 является ингибитором Wntсигнального пути и экспрессируется в клеточных линиях рака молочной железы человека, которые вызывают повреждения костной ткани [196]. Таблица 1. Классификация рака молочной железы. Подтип Частота встречаемости Люминальный А Люминальный B Базальный HER2-позитивный 30-45% 14-18% 27-39% 8-15% Экспрессия ER + + - - Экспрессия HER2 - + - + Показано, что в крови онкологических пациентов содержится мРНК одной из субъединиц теломеразы – hTERT. Обнаружена статистически достоверная разница присутствия мРНК hTERT в плазме крови здоровых доноров и пациентов с раком молочной железы уже на ранней стадии развития заболевания. Установлено, что происходит снижение мРНК hTERT в крови пациентов в результате оперативного удаления опухоли [197]. Одним из часто используемых внутренних контролей для нормализации данных ОТ-ПЦР анализа являются представители класса мяоРНК. Однако было установлено, что отношение уровней мяоРНК U6/SNORD44 в сыворотке крови пациентов с раком молочной железы в 1.5-6.6 раза выше, чем у здоровых доноров. При этом зависимости отношения U6/SNORD44 от статуса опухоли по рецептору эстрогена не было установлено [64]. С помощью сравнительного de novo секвенирования обнаружены наборы микроРНК, которые ассоциированы с вероятностью рецидива, гормональным статусом опухоли (экспрессия рецепторов эстрогена, прогестерона) и наличием воспаления у пациентов с раком молочной железы 2-3 стадии. Показано, что наличие в плазме крови микроРНК-375 в паре с микроРНК-122 указывает на высокую вероятность развития метастазов у пациентов после удаления первичной опухоли и проведенного химиотерапевтического лечения [198]. 42 С помощью прямого анализа уровня циркулирующей микроРНК-21 в сыворотке крови можно выявлять рак молочной железы, а также определять наличие метастаз [199]. Показано, что уровень микроРНК-299-5р и -411 в сыворотке крови пациентов с раком молочной железы достоверно ниже, чем в сыворотке крови здоровых доноров [200]. С помощью полногеномного секвенирования обнаружен набор из семи микроРНК, экспрессия которых значительно увеличена в сыворотке крови пациентов с раком молочной железы: микроРНК-103, -23а, -29а, -222, -23b, -24 и -25. Найдена и подтверждена новая микроРНК miR-BS1, экспрессируемая клетками опухоли. Биоинформационный анализ показал, что потенциальными мишенями новой микроРНК являются гены FOXO3 и KRAS, которые участвуют в регуляции сигнального пути, связанного с опухолеобразованием [201]. 1.7.4.2 Рак легкого Рак лёгкого является одним из наиболее часто встречающихся онкологических заболеваний и одной из наиболее распространенных причин смерти от онкологической патологии. Классификация рака легкого основана на гистологических особенностях опухоли. Различают аденокарциному, плоскоклеточный рак, крупноклеточный рак и мелкоклеточный рак легкого. Первые три класса объединяют в группу под общим названием немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ). Среди всех случаев заболеваний раком легкого доля НМРЛ составляет около 80% [202]. Как и при раке молочной железы, при неконтролируемом делении клеток НМРЛ отмечается гиперфункция теломеразного комплекса. Это приводит к усилению экспрессии белковых субъединиц теломеразы в клетках. При этом показано, что число копий мРНК hTERT в сыворотке пациентов с аденокарциномой и плоскоклеточным раком легкого достоверно (P < 0.05) коррелирует с размером опухоли, числом очагов, наличием метастазов и вероятностью рецидива. Количество копий мРНК EGFR (рецептор эпидермального фактора роста) коррелирует с количеством опухолевых очагов и клинической стадией заболевания. Чувствительность и специфичность диагностического анализа по мРНК hTERT составляли 89.0% и 72.7%, по мРНК EGFR – 71.3% и 80.0%. Показано, что уровень мРНК hTERT и EGFR в сыворотке крови пациентов достоверно коррелировал с уровнем в клетках рака легкого. Количество копий мРНК hTERT в крови значительно понижалось после оперативного лечения. Miura и соавт. предложили использовать уровень мРНК hTERT и мРНК EGFR в сыворотке крови больных раком легкого как биомаркер для диагностики и определения клинической стадии заболевания [203]. Установлено, что уровень трех мяоРНК (snoRD33, snoRD66 и snoRD76) в плазме крови пациентов с НМРЛ превышает уровень в образцах плазмы здоровых доноров и пациентов с хроническим обструктивным заболеванием легких, но не отражает стадию развития и 43 гистологический тип опухоли. Чувствительность и специфичность анализа НМРЛ по набору из трех мяоРНК составили 81% и 96%, соответственно [63]. С помощью высокопроизводительного секвенирования на платформе Solexa установлено, что уровень микроРНК-486 и -30d в сыворотке крови повышен, а уровень микроРНК -1 и -499 понижен в группе пациентов с низким показателем выживаемости по сравнению с группой пациентов с высоким показателем выживаемости при НМРЛ [204]. С помощью гибридизации на микрочипах Foss и соавт. показали, что наборы микроРНК сыворотки крови пациентов с немелкоклеточным раком легкого ранней стадии развития и группы здоровых доноров различаются. Показано, что концентрация микроРНК-1254 и микроРНК-574-5р в сыворотке пациентов с раком легкого значительно выше, чем в контрольной группе. При использовании этих микроРНК можно диагностировать рак легкого за несколько месяцев до клинических проявлений заболевания. При использовании комбинации микроРНК-1254 и микроРНК-574-5р чувствительность и специфичность анализа превышают 70%. Авторы предлагают использовать такую систему для ранней диагностики и скрининга людей из группы риска по раку легкого [205]. Установлено, что при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ) происходят значительные изменения в экспрессии ряда микроРНК в клетках крови, в том числе микроРНК-261, -23b, -126 и микроРНК семейства let-7. Точность диагностического анализа по набору из 27 микроРНК клеток крови составила 95% [206]. В работе Shen и соавт. обнаружен набор микроРНК, обладающий высокой диагностической значимостью для выявления немелкоклеточного рака легкого. Чувствительность и специфичность анализа по микроРНК-21, -126, -210, -182 и 486-5р составили 86% и 95%, соответственно [207]. В результате исследования опухоль-специфичных микроРНК также обнаружено, что уровень микроРНК-21 в сыворотке крови пациентов с немелкоклеточным раком легкого увеличен по сравнению со здоровыми донорами. При этом уровень микроРНК-141 и -200с был понижен. Достоверная разница (Р < 0.05) в уровне микроРНК-21 и микроРНК-200с была обнаружена между группами пациентов с аденокарциномой и плоскоклеточным раком легкого [208]. В независимом исследовании Wei и соавт. подтверждено, что уровень микроРНК-21 в плазме крови пациентов с немелкоклеточным раком легкого увеличен относительно здоровых доноров. Чувствительность и специфичность анализа составили 76% и 70%, соответственно. При этом установлено, что с развитием заболевания концентрация микроРНК-21 в крови увеличивается. При успешном протекании химиотерапии концентрация микроРНК-21 в крови снижается, приближаясь к нормальным показателям [209]. 44 С помощью гибридизации на микрочипах Boeri и соавт. показали, что уровень 21 микроРНК в плазме крови является признаком высокого риска развития НМРЛ, позволяя выявлять заболевание на 1-2 года раньше, чем при использовании компьютерной томографии. Установлено, что уровень микроРНК-21, -126, -15b, -148a, -142, -17, -197, -221 и -28, по сравнению с уровнем микроРНК-486, значительно повышен в группе доноров с низким показателем выживаемости [210]. Таким образом, диагностический потенциал микроРНК-21 при определении НМРЛ показан в нескольких независимых исследованиях. Однако остальные микроРНК-маркеры НМРЛ, обнаруженные при исследовании циркулирующих РНК плазмы и сыворотки крови разными группами ученых, не совпадают. Более того, Hu и соавт. [204] обнаружили повышенный уровень микроРНК-486 в сыворотке крови пациентов с низким показателем выживаемости, в то время как Boeri и соавт. [210] показали, что уровень микроРНК-486 понижен в плазме крови пациентов с НМРЛ с низким показателем выживаемости. Известно, что при получении сыворотки состав внеклеточных микроРНК претерпевает значительные изменения [211]. Поэтому разнонаправленные изменения уровня микроРНК-486 в работах [204] и [210] можно объяснить использованием разных компонентов крови (сыворотка и плазма), а также использованием разных методов для первичного поиска маркеров (высокопроизводительное секвенирование и гибридизация на микрочипах). 1.7.4.3 Циркулирующие микроРНК при других типах рака Konishi и соавт. провели работу по поиску маркеров рака желудка в плазме крови пациентов до и после оперативного лечения. Показано, что концентрация микроРНК-451 и микроРНК-486 после операции уменьшается в большинстве случаев (90% и 93% соответственно) [212]. Установлено, что уровень экспрессии набора из пяти микроРНК (микроРНК-1, -20а, -27а, -34 и -423-5р) повышен в сыворотке крови пациентов с раком желудка по сравнению со здоровыми донорами, при этом концентрация микроРНК увеличивалась с развитием опухоли [213]. Известно, что при раке щитовидной железы в сыворотке крови происходит изменение уровня мРНК рецептора тиреотропина (TSHR). При этом чувствительность анализа составляет 100%, специфичность – 98% [214]. У пациентов с папиллярной карциномой щитовидной железы обнаружен набор из трех микроРНК (let-7e, микроРНК-151-5р, микроРНК-222), концентрация которых в сыворотке крови значительно выше, чем в сыворотке здоровых доноров (чувствительность 86.8%, специфичность 79.5%) и пациентов с доброкачественными узелками (чувствительность 87.8%, специфичность 88.4%) [215]. Показано, что экспрессия микроРНК-21, -155 и -196а в сыворотке крови пациентов с аденокарциномой протоков поджелудочной железы увеличена по сравнению со здоровыми 45 донорами. При этом увеличение количества микроРНК-155 и -196а в системной циркуляции также было характерно и для пациентов с хроническим панкреатитом. Kong и соавт. предложили использовать уровень микроРНК-196а в сыворотке крови как малоинвазивный маркер для прогнозирования течения аденокарциномы протоков поджелудочной железы [216]. Zhang и соавт. показали, что набор из 7 микроРНК сыворотки крови (микроРНК-10а, -22, -100, -148b, -223, -133а и -127-3р) может служить надежным биомаркером плоскоклеточного рака пищевода на ранних стадиях заболевания. С помощью высокопроизводительного секвенирования на платформе Solexa показано, что уровень микроРНК в сыворотке больных значительно выше, чем в сыворотке здоровых доноров. Чувствительность анализа составила 78.5%, специфичность - 96% [217]. Кроме того, установлено, что в плазме крови пациентов происходит повышение уровня микроРНК-21, микроРНК-18а и понижение уровня опухольсупрессорной микроРНК-375. После оперативного лечения происходит значительное снижение уровня микроРНК-21 [218, 219]. С помощью гибридизации на микрочипах и последующей верификации с помощью ОТПЦР в режиме реального времени Wu и соавт. обнаружили, что уровень семи микроРНК в сыворотке крови пациентов с плоскоклеточным раком пищевода (микроРНК-25, микроРНК 100, микроРНК -193-3p, микроРНК -194, микроРНК -223, микроРНК -337-5p и микроРНК -4835p) значительно повышен по сравнению с контрольной группой здоровых доноров (P < 0.01). Более того, высокий уровень микроРНК-25 и микроРНК-100 в сыворотке крови достоверно (Р < 0.05) коррелировал с низкой выживаемостью пациентов [220]. Стоит отметить слабую корреляцию данных Wu и соавт. [220] c полученными ранее данными Zhang и соавт. [217]. В каждой работе обнаружено по 7 диагностически значимых формы микроРНК, однако совпадает только микроРНК-100 и -223. Возможно, это связано с использованием разных методов первичного отбора маркеров. Wu и соавт. использовали гибридизацию на микрочипах низкой плотности [220], а Zhang и соавт. использовали метод высокопроизводительного секвенирования [217]. Обнаружен ряд диагностически значимых микроРНК (микроРНК-92, -141, -29а, -21, 601, -760), которые позволяют выявить пациентов с колоректальным раком с чувствительностью и специфичностью 70-90% [221]. При анализе набора циркулирующих микроРНК обнаружено, что уровень микроРНК375, -9*, -141, -200b и -516а-3р увеличен в сыворотке крови пациентов с раком простаты. В результате сравнительного анализа концентрации микроРНК в сыворотке больных с благоприятным и неблагоприятным прогнозом развития заболевания установлено, что гиперэкспрессия микроРНК-375 и -141 коррелирует с неблагоприятным прогнозом [222]. Lodes и соавт. с помощью гибридизации на микрочипах обнаружили повышенный уровень 15 46 микроРНК в сыворотке крови пациентов с 3 и 4 стадией рака простаты по сравнению со здоровыми донорами (микроРНК-16, -92a, -103, -107, -197, -34b, -328, -485-3p, -486-5p, -92b, 574-3p, -636, -640, -766 и -885-5p) [223]. В работе Kanemaru и соавт. показано, что уровень микроРНК-221 в сыворотке крови пациентов со злокачественной меланомой значительно увеличен по сравнению со здоровыми донорами. При этом уровень микроРНК-221 коррелирует со стадией заболевания и позволяет детектировать болезнь на ранних стадиях развития. После оперативного лечения уровень микроРНК-221 в крови снижается, а при рецидиве увеличивается [224]. Обнаружен набор из семи микроРНК (микроРНК-15b*, -23a, -133a, -150*, -197, -497 и 548b-5p), концентрация которых в сыворотке крови пациентов с астроцитомой существенно ниже, чем в сыворотке здоровых доноров. Диагностические параметры анализа рака мозга по набору из семи микроРНК составили: чувствительность - 88%, специфичность – 98%. Показано, что уровень данных микроРНК в сыворотке крови увеличивается после оперативного лечения опухоли [225]. Показано, что циркулирующие микроРНК могут быть использованы для диагностики хронического лимфолейкоза и установления статуса по клеточному белковому маркеру ZAP-70. Установлено, что наибольшей диагностической значимостью обладают микроРНК-150, -150*, 29а и -135а* [226]. 1.7.5 Диагностический потенциал циркулирующих микроРНК К настоящему времени накоплено значительное количество данных о диагностическом потенциале цРНК. Наибольшее внимание при проведении медико-диагностических исследований уделено цРНК класса микроРНК. Это связано с высокой стабильностью микроРНК в крови, обеспечиваемой защитой белками AGO, и значимостью регуляторных функций микроРНК в организме. Известно, что отдельные формы микроРНК направляют регуляцию экспрессии нескольких мРНК, принимающих участие в разных процессах в клетке. Поэтому однонаправленное изменение представленности одной формы микроРНК в системной циркуляции может быть признаком сразу нескольких патологий, не обеспечивая при этом высокой специфичности диагностики конкретной патологии (Таблица 2). Для повышения специфичности и чувствительности диагностических тестов существует две стратегии проведения анализа. Первая стратегия заключается в тестировании только людей из группы риска по данному заболеванию и использовании данных анамнеза, что позволяет исключить маловероятные заболевания из рассмотрения и повысить специфичность диагностики. Вторая стратегия заключается в использовании сразу нескольких диагностических РНК-маркеров, 47 характерных для одного заболевания, что может способствовать повышению не только специфичности, но и чувствительности диагностического анализа (Таблица 2, 3). Из данных Таблиц 2, 3 видно, что среди заболеваний, обуславливающих изменение представленности отдельных форм микроРНК в системной циркуляции преобладают онкологические заболевания. При этом диагностическим признаком может быть как повышение уровня микроРНК, так и его понижение. Это указывает на различающиеся молекулярные особенности онкотрансформированных клеток разных типов рака. Обнаруженная при сравнении результатов разных исследований, низкая корреляция изменений набора микроРНК плазмы крови при одном и том же типе рака также подтверждает концепцию о сложном характере формирования набора циркулирующих РНК. 48 Таблица 2. Диагностические формы РНК, характерные для нескольких заболеваний. Название РНК микроРНК 1 микроРНК 103 микроРНК 126 микроРНК 133a микроРНК 141 микроРНК 146a микроРНК 150* микроРНК 155 микроРНК 197 Изменение экспрессии повышение повышение снижение повышение снижение снижение повышение снижение снижение повышение снижение повышение повышение снижение микроРНК 200a микроРНК 200b микроРНК 200c микроРНК 208a повышение снижение снижение повышение снижение повышение снижение микроРНК 21 микроРНК 210 микроРНК 22 микроРНК 222 повышение повышение повышение повышение Патология острый инфаркт миокарда рак желудка рак молочной железы рак простаты ишемическая болезнь сердца диабет 2-го типа рак легкого ишемическая болезнь сердца острый инфаркт миокарда рак пищевода астроцитома рак легкого рак простаты системная красная волчанка сепсис астроцитома хронический лимфолейкоз ишемическая болезнь сердца системная красная волчанка рак поджелудочной железы, хронический панкреатит рак простаты Название РНК Изменение экспрессии микроРНК 223 снижение микроРНК 23a микроРНК 24 микроРНК 25 микроРНК 27a повышение повышение снижение повышение снижение повышение повышение микроРНК 29a повышение микроРНК 30a снижение повышение снижение микроРНК 320 повышение диабет 2-го типа астроцитома диабет 1-го типа системная красная волчанка системная красная волчанка рак легкого микроРНК 324 микроРНК 34 микроРНК 375 рак простаты микроРНК 423-5p повышение микроРНК 451 снижение повышение системная красная волчанка рак легкого острый инфаркт миокарда ишемическая болезнь сердца диабет 2-го типа рак молочной железы рак легкого рак поджелудочной железы рак пищевода диабет 1-го типа рак легкого хроническая систолическая сердечная недостаточность рак пищевода рак молочной железы рак щитовидной железы микроРНК 486 повышение снижение повышение снижение повышение снижение повышение микроРНК 574-3p повышение микроРНК 92b повышение Патология преэклампсия диабет 2-го типа сепсис рак пищевода рак молочной железы астроцитома рак молочной железы диабет 1-го типа диабет 2-го типа диабет 1-го типа рак молочной железы диабет 1-го типа рак желудка преэклампсия диабет 1-го типа рак молочной железы хронический лимфолейкоз рак легкого диабет 1-го типа диабет 2-го типа хроническая систолическая сердечная недостаточность рак легкого гипертоническая болезнь рак желудка рак простаты рак пищевода рак простаты хроническая систолическая сердечная недостаточность рак желудка рак легкого рак желудка диабет 2-го типа гипертоническая болезнь рак легкого рак желудка рак простаты рак простаты рак легкого хроническая систолическая сердечная недостаточность рак простаты микроРНК let-7e мРНК hTERT повышение повышение гипертоническая болезнь рак щитовидной железы рак молочной железы рак легкого 49 Таблица 3. Диагностические формы РНК, характерные для одной патологии. Название РНК Изменение экспрессии Патология Название РНК астроцитома микроРНК 125a5p микроРНК 125b микроРНК 15b* микроРНК 497 микроРНК 548b5p снижение микроРНК 134 снижение микроРНК kshvK12-6-3p микроРНК 1252 микроРНК 516b микроРНК 600 микроРНК 602 микроРНК 605 микроРНК 623 микроРНК hcmvUL112 биполярное расстройство мозга микроРНК 517b микроРНК 517c повышение микроРНК 1236 гипертоническая болезнь снижение микроРНК 518e микроРНК 519a микроРНК 519d микроРНК 520g микроРНК 520h микроРНК 521 микроРНК 5423p микроРНК let7a-star микроРНК let-7f1-star мРНК CRH микроРНК 1260 микроРНК 1272 микроРНК 185 микроРНК 320c микроРНК let-7d микроРНК let-7f микроРНК 20a мРНК EGFR микроРНК 182 микроРНК 1254 повышение преэклампсия снижение повышение повышение рак желудка микроРНК 219-a рак легкого микроРНК 7 микроРНК 126 микроРНК 148a микроРНК 152 микроРНК 181a микроРНК 26a микроРНК 27b микроРНК 15a микроРНК 191 микроРНК 20b микроРНК 28-3p Патология микроРНК 136 микроРНК 1227 микроРНК 1249 микроРНК 133b микроРНК 18b* микроРНК 296-5p микроРНК 30d микроРНК 518b микроРНК 615-5p микроРНК 625* микроРНК 634 микроРНК 664 микроРНК ebvBART17-3p микроРНК ebvBART19-5p микроРНК kshvK12-10a микроРНК kshvK12-10b Изменение экспрессии повышение диабет 1-го типа микроРНК 4865p микроРНК 141 микроРНК 2995p снижение снижение микроРНК 411 снижение повышение диабет 2-го типа мРНК S100A4 микроРНК 23b микроРНК BS1 рак молочной железы повышение 50 Таблица 3 (продолжение). Название РНК микроРНК 135a* микроРНК 150 мРНК RPE65 мРНК RHO мРНК RS1 Изменение экспрессии Патология Название РНК повышение хронический лимфолейкоз микроРНК 100 повышение снижение диабетическая ретинопатия мРНК RAO микроРНК 221 повышение микроРНК 145 микроРНК 17 микроРНК 92а снижение ишемическая болезнь сердца микроРНК 499 повышение микроРНК 132 снижение мРНК HERV-Fb1 Патология микроРНК 10a микроРНК 127-3p микроРНК 148b повышение рак пищевода микроРНК 196a повышение рак поджелудочной железы повышение рак простаты повышение повышение рак щитовидной железы микроРНК 516a-3p злокачественная меланома микроРНК 192 микроРНК 205 микроРНК 429 мРНК CGB Изменение экспрессии острый инфаркт миокарда ревматоидный артрит и остеоартрит снижение системная красная волчанка повышение хромосомная анеуплоидия микроРНК 9* микроРНК 107 микроРНК 16 микроРНК 328 микроРНК 485-3p микроРНК 636 микроРНК 640 микроРНК 766 микроРНК 855-5p микроРНК 92a мРНК TSHR микроРНК 151-5p 51 1.8 Заключение Имеющиеся к настоящему времени данные показывают, что в набор циркулирующих РНК входят фрагменты основных классов клеточных РНК. Циркулирующие РНК защищены от РНКаза-зависимого гидролиза мембранами экзосом и микровезикул, белками липопротеидов высокой плотности, а также белками семейства AGO. Установлено, что цРНК могут принимать участие в регуляции и контроле развития и в функционировании различных тканей высших организмов, отражая патологические изменения, что позволяет использовать их для диагностики заболеваний. Однако данные по определению диагностически и прогностически значимых циркулирующих РНК слабо согласуются друг с другом, порой результаты Предположительно, на исследований диагностическую носят прямо значимость противоположный влияет не только характер. выбор последовательности РНК-маркера, но и метод измерения уровня такой РНК в системной циркуляции. Принципиальный характер носит также выбор в качестве объекта исследований плазмы или сыворотки крови. С точки зрения молекулярной диагностики наибольшие сложности возникают при исследовании онкологических заболеваний, так как базовая классификация ряда раковых заболеваний основана на локализации опухоли и не учитывает молекулярных причин онкотрансформации. Поэтому возможны различия в определении циркулирующих РНК, характерных для разных подтипов одного и того же заболевания, а также существование общих фундаментальных механизмов онкотрансформации и метастазирования с общими маркерами для опухолей разной локализации. Результаты исследований свойств и состава внеклеточных РНК указывают на существование межклеточной коммуникации посредством РНК различных классов. При этом основной массив информации получен при исследовании микроРНК и, в меньшей степени, мРНК. Экспериментальных данных о биологической роли РНК других классов существенно меньше. Значительные перспективы представляет исследование биологических функций мтРНК. Только начинается изучение регуляторного потенциала фрагментов кодирующих и некодирующих РНК, составляющих основную часть РНК плазмы крови. Таким образом, определение структуры и биологических функций внеклеточных РНК человека, представляющих как зрелые формы микроРНК, мяоРНК, так и фрагменты протяженных клеточных РНК, является актуальной научной задачей. 52 ГЛАВА 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2.1 Материалы и реактивы В работе использованы следующие реактивы и материалы: Трис, персульфат аммония, хлорид натрия, гуанидин-HCl (Gerbu, Германия), 2-меркаптоэтанол, бикарбонат натрия, ксиленцианол, бромфеноловый синий, бромистый этидий, флуоресцентный краситель JC-1, тетрациклин, метотрексат, монензин, GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit (Sigma, США), ТЕМЕД, дитиотреитол (ДТТ), акриламид, агароза для электрофореза, SDS, ДМСО (Fluka, Швейцария), ЭДТА, ДЭПК, Тритон X-100, Твин 20, бакто-триптон, дрожжевой экстракт, бакто-агар (Helicon, Москва), N,N'-метиленбисакриламид (ICN, США), липофектамин, Тризол, МТТ [3-(4.5-диметилтиазол-2-ил)-2.5-дифенил-2H-тетразолия бромид] (Invitrogen, США), набор реагентов для окрашивания клеток "FITC AnnexinV Apoptosis Detection Kit I" (BD Biosciences), цисплатин (ЛЕНС-Фарм, Россия); циклогексимид, актиномицин D (AppliChem, Germany); интерферон α (Микроген, Россия); тамоксифен (Верофарм, Россия); гликоген, ПЦР набор Maxima SYBRGreen, ингибитор РНКаз "RiboLock RNase Inhibitor" (Fermentas, Латвия); набор для конструирования кДНК-библиотек Total RNA-SEQ для секвенирования по технологии SOLiD (Applied Biosystems, США); маркер молекулярной массы ДНК М28 (СибЭнзайм, Новосибирск). [γ-32P]ATP (1000 Ки/ммоль) синтезирован в Лаборатории биотехнологии ИХБФМ СО РАН к.х.н. Фоминым А.С. Культуральные среды: IMDM, RPMI (Gibco, CША), L-глутамин (ICN, США), сыворотка эмбрионов крупного рогатого скота, гентамицин (Sigma, CША). Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, рибонуклеозидтрифосфаты (Биосан, Новосибирск). 2.2 Ферменты В работе были использованы следующие ферменты: РНК-лигаза фага Т4, щелочная фосфатаза SAP, рекомбинантная ДНКазa I (КРС), ДНК-лигаза фага Т4, РНК-полимераза фага T7 (Fermentas, Латвия), эндонуклеаза рестрикции EcoRI, (СибЭнзим, Новосибирск), ДНКполимераза T.aquaticus (Taq-полимераза), обратная транскриптаза M-MLV, Т4- полинуклеотидкиназа (ПНК) (Лаборатория биоорганической химии ферментов ИХБФМ СО РАН), Трипсин – ЭДТА, (Sigma, США). 2.3 Буферные растворы ТАЕ – 0.040 М Трис-ацетат, 0.002 М ЭДТА, рН 8.0; TBE – 0.089 M Tрис-борат, 0.002 M ЭДТА, pH 8.3; PBS – 1.7 мМ KH2PO4, 5.2 мM Na2HPO4, 150 мM NaCl, pH 7.4; BB (binding buffer) – 10 мМ Hepes/NaOH, pH 7.4, 140 мМ NaCl, 2.5 мМ CaCl2. 53 Буфер для нанесения проб на гель – 50% глицерин, 0.05% ксиленцианол, 0.05% бромфеноловый синий. Среда LB - 10 г/л бакто-триптон, 5 г/л дрожжевой экстракт, 10 г/л NaCl. 2.4 Методы 2.4.1 Конструирование кДНК-библиотек для высокопроизводительного секвенирования Подбор здоровых доноров проводили совместно с сотрудниками Диагностической лаборатории ЦНМТ, г. Новосибирск (зав. лаб., к.м.н. Чикова Е. Д.). Группа здоровых доноров состояла из 4 мужчин и 4 женщин без выявленных онкологических, аутоиммунных и инфекционных заболеваний в возрасте от 20 до 60 лет, с возрастным интервалом 8-12 лет. Подбор пациентов с немелкоклеточным раком легкого был проведен сотрудниками торакального отделения Новосибирского областного онкологического диспансера (зав. отделением, врач-онколог первой категории Козлов В.В.). В группу пациентов входили шесть мужчин и две женщины в возрасте от 49 до 64 лет. У четырех пациентов была выявлена аденокарцинома легкого, у четырех – плоскоклеточный рак, на 1-2 стадии заболевания. Образцы крови пациентов торакального отделения Новосибирского областного онкологического диспансера забирали до начала проведения медикаментозного и оперативного лечения. При взятии образцов крови у здоровых доноров и пациентов с НМРЛ было получено добровольное информированное согласие. Кровь из локтевой вены собирали в вакутейнеры с ЭДТА (BD Biosciences, США) аликвотами по 6 мл. Образцы крови хранили при +4оС не более 2 часов. Образцы центрифугировали при 1200 g, 20 мин, 4°С на центрифуге Eppendorf 5115R для получения плазмы. Выделение суммарной РНК из плазмы крови проводили с помощью реагента Тризол, используя рекомендации производителя (Invitrogen, США). Для выделения суммарной РНК 1.52 мл плазмы крови разделяли на аликвоты по 300 мкл. К каждой аликвоте добавляли 900 мкл Тризол, перемешивали и инкубировали 10 мин при КТ. К полученным смесям добавляли 180 мкл хлороформа, перемешивали и инкубировали 2 мин при КТ. Образцы центрифугировали 15 мин, 12000 g. Водную фазу отбирали, добавляли 5 мкг гликогена. РНК осаждали изопропанолом в соотношении 1:1, 20 мин при -20°С. Образцы центрифугировали 15 мин 16000 g, осадок дважды промывали 500 мкл 75% этанола. Осадки высушивали в вакуумной центрифуге 10 мин при 37°С. Для конструирования кДНК-библиотек использовали набор SOLiD Total RNA-SEQ по методике производителя (Applied biosystems, США) со следующими модификациями. Осадок РНК растворяли в 5.5 мкл воды, добавляли 1 мкл буфера для РНКазы III, содержащего 500 мМ 54 NaCl, 100 мМ Трис pH 7.9, 100 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ. В реакционную смесь добавляли 1 е.а. РНКазы III, 1 е.а. ДНКазы I (Fermentas, Латвия) и 1 е.а. щелочной фосфатазы SAP (Fermentas, Латвия). Реакционную смесь (10 мкл) перемешивали и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Реакцию останавливали нагреванием при 65°С, 10 мин. Для 5'-фосфорилирования РНК в реакционную смесь добавляли 2 МБк [γ-32P] АТФ и 1 е.а. ПНК. Смесь инкубировали при 25°С, 30 мин. Реакционную смесь разделяли электрофорезом в денатурирующем ПААГ (14% АА 20:1 бис-AA, 1x TBE, 6M мочевина). Фрагменты геля, содержащие РНК длиной от 20 н. до ≈250 н., инкубировали в 0.1х ТАЕ буфере 16 ч при КТ. РНК из элюата осаждали 70% этанолом. Осадок растворяли в буфере для гибридизации (Hybridization Solution), добавляли смесь адаптеров (Adaptor Mix) (SOLiD Total RNA-SEQ) и инкубировали в амплификаторе Eppendorf MasterCycler (режим гибридизации: 65°С 10 мин, 16°С 5 мин). В реакционную смесь добавляли буфер для лигирования (Ligation Buffer) и РНК-лигазу (Ligation Enzyme Mix). Лигирование проводили в течение 16 часов при 16 С. Для получения кДНК в лигазную реакционную смесь добавляли буфер для обратной транскриптазы (RT Buffer), дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNTP Mix) и обратную транскриптазу (ArrayScript Reverse Transcriptase). Реакцию проводили при 42°С, 30 мин. кДНК разделяли электрофорезом в 6% ПААГ (АА 20:1 бис-AA, 1x TBE). кДНК длиной 85-200 н. (фрагменты геля) амплифицировали в буфере (PCR Buffer) ДНК-полимеразой (AmpliTaq DNA Polymerase) с праймерами 5′ PCR Primer и 3′ PCR Primer (P1 и P2, SOLiD Total RNA-SEQ kit). Режим аплификации: 95°С – 5 мин; 95°С - 30 с, 62°С - 30 с, 72°С - 30 с – 18-23 цикла; 72°С – 7 мин. Для очистки кДНК-библиотек проводили электрофоретическое разделение ПЦР-смесей в нативном 6% ПААГ с последующей элюцией ДНК длиной 110-250 п.н. из геля. Концентрацию ДНК определяли на флуориметре Qubit с использованием набора Qubit dsDNA HS Assay Kit (Life Technologies, США). Полученные кДНК-библиотеки амплифицировали с праймерами 5’-FAM-P1 и P2 (95°С 5 мин и 16 циклов: 95°С - 30 с, 54°С - 30 с, 72°С - 30 с). Распределение по длине 5’-FAMмеченых кДНК-библиотек анализировали методом капиллярного электрофореза на приборе ABI 3130xl Genetic Analyzer (Life Technologies, США) в ЦКП "Геномика" СО РАН. 5’-FAM-P1 5'-FAM-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3′ P2 5′-CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCTGTGTAAGAGGCTGCTGTACGGCCAAGGCG-3′ Очищенные кДНК-библиотеки амплифицировали в водно-масляной эмульсии на магнитных микрочастицах, проводили стадию обогащения на полистироловых микрочастицах, иммобилизовали на стеклянные пластины и проводили циклы лигирования и детекции по технологии SOLiD v2.5 в ЦКП "Геномика" СО РАН. 55 2.4.2 Биоинформационный анализ данных высокопроизводительного секвенирования Выравнивание экспериментальных последовательностей, полученных в результате высокопроизводительного секвенирования, проводили с использованием программного пакета Bowtie v.0.9.6-0.12.6 [227] с параметром "– k 2", позволяющим находить для каждой экспериментальной последовательости не более двух гомологов в референсной последовательности. Выравнивание экспериментальных последовательностей (csfasta и qual) с референсными последовательностями ДНК и РНК человека проводили поэтапно. На первом этапе проводили выравнивание последовательностей с последовательностью митохондриальной ДНК человека (NC_0129920) [228]. При этом отдельно сохраняли экспериментальные последовательности, для которых не было найдено гомологов в последовательности митохондриальной ДНК человека (с использованием опции - -un bowtie). Эти последовательности на втором этапе выравнивали с последовательностями геномных повторов человека. Для этого нами был собран набор последовательностей из базы данных Repbase [229], содержащий следующие последовательности: SINE-повторы (семейств Alu и Mir); LINE-повторы (L1-L3); LTR (ERV, MaLR); ДНК-элементов (hAT, Tc-1). Кроме того, на данном этапе выравнивания в референсный файл были включены последовательности тРНК [230], рРНК (18S rRNA, NR_003286; 5.8S rRNA, NR_003285; 28S rRNA, NR_003287; 5S rRNA, NR_023379) и мяРНК U1-U12 человека (NR_004402; NR_002716; NR_002761; NR_006880; NR_003925; NR_002756; NR_002757; NR_002754; NR_002755; NR_002753; NR_004394; NR_023317; NR_033294; NR_029422). А также включены последовательности мононуклеотидных и динуклеотидных гомоповторов и последовательности P1-, P2-адаптеров SOLiD. Экспериментальные последовательности, которым не было найдено гомологов на втором этапе, на третьем этапе выравнивали с последовательностями РНК из базы данных Национального института здоровья США NCBI human Referenced Sequence database (RefSeq RNA) [231]. Для этого использовали таблицу расположения транскриптов в геноме человека GRCh37/hg19 из аннотаций GoldenPath UCSC [232]. RefSeq RNA GTF-аннотации были конвертированы в Bioscope-совместимый формат с помощью "refgene2gtf" из программного пакета Bioscope (ABI, Life Technologies). С использованием RefSeq RNA GTF-аннотаций была составлена база последовательностей human RefSeq RNA с помощью программы "take_fasta_from_gtf", разработанной Курильщиковым А. М. [233]. База данных содержала 35649 последовательностей с NM и NR идентификаторами, в том числе, микроРНК, мРНК, мяоРНК, мцРНК, днРНК и других РНК человека. 56 Последовательности, которым не было найдено гомологов на предыдущих этапах, на четвертом этапе выравнивали с последовательностями генома человека (сборка GRCh37/hg19) [234]. Результаты выравнивания экспериментальных последовательностей с референсными последовательностями (SAM-файлы) сортировали, индексировали и конвертировали в BAMформат с помощью программного пакета Samtools v.0.1.18 [235]. Результаты выравнивания визуализировали с помощью программы IGV v.2.1.10 [236]. Результаты выравнивания экспериментальных последовательностей с референсными последовательностями (BAM-файлы) анализировали с помощью программного пакета Cufflinks v.2.1.1 [237]. Полученные данные об относительном вкладе транскриптов (transcripts.gtf) в формате FPKM (Fragments per Kilobase per Million) [238] объединяли в кумулятивные таблицы с помощью программы CuffCompare из программного пакета Cufflinks v.2.1.1. При определении относительного вклада индивидуальных транскриптов (FPKM) исключали вклад последовательностей, гомологичных P1-, P2-адаптерам SOLiD (опция "-compatible-hits-norm"). Для определения абсолютного ненормированного вклада фрагментов индивидуальных транскриптов использовали модуль "idxstats" из программного пакета Samtools v.0.1.18. Относительный вклад зрелых микроРНК и их фрагментов (FPKM) определяли с помощью программного пакета Cufflinks v.2.1.1 с использованием таблицы GTF-аннотаций, содержащей координаты зрелых форм микроРНК в составе пре-микроРНК, составленной с использованием данных из базы miRBase [239]. Поиск новых микроРНК проводили в массиве экспериментальных последовательностей, выравненных с последовательностями геномом человека. Для определения потенциальных новых микроРНК использовали программный пакет mirDeep2 [240]. Функциональный анализ генов проводили с использованием базы данных GO (The Gene Ontology от 10.07.2013) при помощи расширения ClueGO v.2.1.3 программы Cytoscape v.3.1.1; поиск потенциальных мишеней микроРНК-подобных форм с использованием программного пакета и базы данных TargetScanHuman Custom [241, 242]. 2.4.3 Подтверждение данных секвенирования методом ПЦР в режиме реального времени Подтверждение наличия обнаруженных форм РНК в системной циркуляции проводили с помощью обратной транскрипции с удлиненными специфическими праймерами и ПЦР с детекцией в режиме реального времени с помощью специфического прямого праймера и универсального обратного праймера (Таблица 4-7). Конструирование удлиненных праймеров 57 проводили по методике [243]. Для ПЦР кДНК использовали универсальный обратный праймер: Uni 5’-GCAGACAATCATCGACCTCG-3’. Таблица 4. Специфические праймеры, использованные для подтверждения наличия новых форм РНК в плазме крови методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Обозначение Обратный праймер для ОТ Прямой праймер для ПЦР микроРНК и микроРНК-подобны формы 223 103 N6 N12 N16 N14 N8 N7 N4 N12a N2 N9 5’-gcagacaatcatcgacctcgTGGGGTATTTG-3’ 5’-gcagacaatcatcgacctcgTCATAGCCCTG-3’ 5’-gcagacaatcatcgacctcgAATAATGGTC-3’ 5’-gcagacaatcatcgacctcgGCATTATGGAA-3’ 5’-gcagacaatcatcgacctcgTTACTTCTG-3’ 5’-gcagacaatcatcgacctcgAGAATCTAG-3’ 5’-gcagacaatcatcgacctcgAGTAGAC-3’ 5’-gcagacaatcatcgacctcgGATTAGGC-3’ 5’-gcagacaatcatcgacctcgGAAATCTAG-3’ 5’-gcagacaatcatcgacctcgCCTTAGGCTG-3’ 5’-gcagacaatcatcgacctcgAGACACTGTC-3’ 5’-gcagacaatcatcgacctcgGAAGGCTGAA-3’ 5’-aacTGTCAGTTTGTCAAAT-3’ 5’-aacAGCAGCATTGTACAGG-3’ 5’-aacGATGAACTAGAAAGACC-3’ 5’-aacGGTACATCACTATTCCA-3’ 5’-aacTCTCACATTGAACTC-3’ 5’-aacTCTTTTTTAATGCAC-3’ 5’-aacTCAGAAATTAAGTATAG-3’ 5’-aacTTAAGTGTAATGCC-3’ 5’-aacATAAGGGATTGGC-3’ 5’-aacCTTTCCATAGCTAC-3’ 5’-aacGTGAATTTGGTATG-3’ 5’-aacATTCTCCTGGAAAT-3’ антисмысловые транскрипты LOC GDNF P4HA1 STX7 GTF3C2 NOG CENPK TGFBR2 mizuguchi FAT3 XPR1 VHLL 5’-gcagacaatcatcgacctcgCCGAGCTG-3’ 5’-gcagacaatcatcgacctcgTCCTAGAAG-3’ 5’-gcagacaatcatcgacctcgTTCTTAGTG-3’ 5’-gcagacaatcatcgacctcgTTAGGCTG-3’ 5’-gcagacaatcatcgacctcgGCCGCGCT-3’ 5’-gcagacaatcatcgacctcgCCGTGCTG-3’ 5’-gcagacaatcatcgacctcgCTGCTGCTG-3’ 5’-gcagacaatcatcgacctcgCAACGTGTTG-3’ 5’-gcagacaatcatcgacctcgACCCCACAC-3’ 5’-gcagacaatcatcgacctcgGGTCATCAC-3’ 5’-gcagacaatcatcgacctcgATTCCTGC-3’ 5’-gcagacaatcatcgacctcgCCAGGAAG-3’ 5’-aacGCGGAACGCCTGACAG-3’ 5’-aacCGATTCCGCTCTCTT-3’ 5’-aacGCAAGGTATTAGCAC-3’ 5’-aacATATCCATAATATCAG-3’ 5’-aacTATTCCATAATGCAGC-3’ 5’-aacCGTTCCACGCGTACAG-3’ 5’-aacAATTCCATTACGCAG-3’ 5’-aacCCTCGATCTCTCAA-3’ 5’-aacGGGAGCTCGTCGGTG-3’ 5’-aacATGTCTGCGGCAGTG-3’ 5’-aacGAAGCGAAGCCAAGC-3’ 5’-aacTCGGCGCCCAACTCTT-3’ Cуммарную РНК (1-10 нг) вносили в реакционную смесь для обратной транскрипции, содержащую 100 мМ КCl, 50 мМ Трис-НСl, рН 7.5, 5 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ и 1.5 мМ dNTP. Добавляли праймер для ОТ Uni до конечной концентрации 300 нМ. Отжиг проводили в режиме 75°С – 5 мин, 25°С – 3 мин. В охлажденную реакционную смесь добавляли 100 е.а. M-MLV обратной транскриптазы. Реакцию ОТ проводили при 42°С, 60 мин. ПЦР проводили с использованием Maxima SYBR Green/Fluorescein Master Mix (Fermentas, Латвия). В реакционную смесь добавляли 1.5 мкл ОТ-смеси и праймеры до конечной концентрации 300 нМ. Амплификацию проводили на приборе IQ5 Bio-Rad, режим амплификации: 96°- 2 мин; 96°С - 10 с, 51°С - 10 с, 72°С - 10 с - 50 циклов, с детекцией на стадии 72°С. Продукты реакции анализировали по параметрам кривых плавления ДНК. 58 Таблица 5. Специфические праймеры, использованные для подтверждения наличия фрагментов мРНК в плазме крови методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Обозначение TBC1D21 PEX6 HIST1H2AE CYP11B2 OR1OX1 AKR1CL1 HLA-DPA1 MRPS17 DTX1 ATF4 XAGE5 DUSP6 TP53I11 TWF1 SOXT2OT LOH12CR1 WHSC2 GIGYF1 MTERFD2 Обратный праймер для ОТ Прямой праймер для ПЦР 5'-gcagacaatcatcgacctcgGCTTAATCCT-3' 5'-aacCCCATCTCCGAAAAGG-3' 5-'gcagacaatcatcgacctcgAGAAGATGG-3' 5'-aacGACAAAACTGCAGGC-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgAACGCGTTT-3' 5'-aacTCGGGCAAAAGCTAAA-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgAGGGCACG-3' 5'-aacCAGGAACTTCCACCACC-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgAGTGCAAGC-3' 5'-aacAACTTGTGGCCTCTGC-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgGTGCAGACATTG-3' 5'-aacAGTGAAACTGCCAATG-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgGGTCAGCAATTC-3' 5'-aacAGTGGCTGACTGAATTG-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgAAACACCACAG-3' 5'-aacTGTCCAGTTTCTCTGT-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgCAGACAGAAGG-3' 5'-aacCCCATCTCCAGGC-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgCACAGAGAACAC-3' 5'-aacCCCATCTCCAGGTGT-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgTGTGGTTTC-3' 5'-aacGAAGGAGGGGAAGGGA-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgATATACCCTTTG-3' 5'-aacCTTTTCTAATCCAAAG-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgGAGCCAAAGGG-3' 5'-aacGGGCCTCGGCTTCC-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgGCTGAATCCTTG-3' 5'-aacAAGAGGATTCCCAAG-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgTTGAAATAATTAA-3' 5'-aacTTCTCCTAATTTAAT-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgGGGAGAAGGAG-3' 5'-aacCAAATAGGGCCTCT-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgGTCTTCCTTC-3' 5'-aacGAGGCGAAGCGGAGA-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgTCCTCTTCC-3' 5'-aacAGGGCGAAGCGGGAGG-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgAACTCATGAC-3' 5'-aacGGAGCTAGAGAGGGT-3' Наличие той или иной формы РНК считали подтвержденным, если при амплификации реакционных смесей с РНК-матрицами, подвергнутыми обратной транскрипции и без обратной транскрипции ("ОТ-" контроль), разница в пороговых значениях Ct была больше 10 циклов, и само пороговое значение Ct было меньше 36 циклов (аналогично критериям, использованным в работе [244]). 59 Таблица 6. Специфические праймеры, использованные для подтверждения наличия некодирующих РНК в плазме крови методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Обозначение hsa-miR-449b hsa-miR-563 hsa-miR-1287 hsa-miR-148b-3p hsa-miR-892b hsa-miR-29a-3p hsa-miR-10b-5p Обратный праймер для ОТ микроРНК Прямой праймер для ПЦР 5'-gcagacaatcatcgacctcgAGGGTAGTTG-3' 5'-aacGTCAGCAGCCACAAC-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgGCTACCAGGG-3' 5'-aacTTGACATACGTTTCC-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgAGACTCGAAC-3' 5'-aacTGCTGGATCAGTGGT-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgGAGACAAAG-3' 5'-aacAGTGCATCACAGAACT-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgCCTTGCTCTAC-3' 5'-aacGCTCCTTTCTGGGTA-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgTAACCGATTTC-3' 5'-aacCTAGCACCATCTGAA-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgACACAAATTCG-3' 5'-aacACCCTGTAGAACCGA-3' мяоРНК SNORD27 SNORD50A SNORD74 SNORD45A 5'-gcagacaatcatcgacctcgCTCAGTAGTAAG-3 5'-aacAGTGATGTCATCTTAC-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgATCTCAGAAGCC-3' 5'-aacTTTACGGATCTGGCT-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgCCGCCATCAG-3' 5'-aacAATGCCAACCGCTCT-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgATACATGCCAAC-3' 5'-aacGTCAATGATGTGTTG-3' XLOC_042973 XLOC_033938 XLOC_017329 XLOC_064897 XLOC_075858 XLOC_056262 XLOC_004265 XLOC_045331 5'-gcagacaatcatcgacctcgATGTTGAAG-3' 5'-aacCCAGGTGTTATCCTT-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgGGTACATGAC-3' 5'-aacCCAGGTCAATAGAGTC-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgCTGCACCTCAG-3' 5'-aacTACTTGGTTATCCTG-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgGATAATTCATTG-3' 5'-aacTGACTAGATGTCAAT-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgAAGAATCGATG-3' 5'-aacCGTGGCTTCGTCCATC-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgTGGTTATTTTAG-3' 5'-aacATGCTACAAAGCTAA-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgTTCTACTCCTTTC-3' 5'-aacGAAATAGGGCCAGAA-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgATGAAGGACAACGTG-3' 5'-aacCCTCGATCTCTCAACAC-3' Новые формы РНК Таблица 7. Специфические праймеры, использованные для подтверждения наличия контрольных фрагментов РНК в плазме крови методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Обозначение IKBKG IDUA CENPB hsa-miR-191 hsa-miR-451 hsa-miR-103 Обратный праймер для ОТ Прямой праймер для ПЦР 5'-gcagacaatcatcgacctcgAGACCTCGAC-3' 5'-aacGAGGAAGCGGCATGTC-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgTCGGGCTG-3' 5'-aacGCGGAACCGGCAGTGC-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgGCCAGCTGCAC-3' 5'-aacGGCCTGCGGCATGTGC-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgCAGCTGCTTTTG-3' 5'-aacCAACGGAATCCCAAAAG-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgAAACTCAGT-3' 5'-aacAAACCGTTACCATTAC-3' 5'-gcagacaatcatcgacctcgTCATAGCCC-3' 5'-aacAGCAGCATTGTACAGG-3' 60 2.4.4 Синтез аналогов РНК плазмы крови человека Для получения ДНК-матриц, содержащих промотор фага Т7, проводили ПЦР в реакционной смеси, содержащей 100 мкл 20 мM (NH4)2SO4, 75 мM Трис-HCl, 0.01% Твин 20, 1мM MgCl2, 150 мкM dNTP и 300 мкM праймеров (ProBS73, BS37 либо ProBS37, BS73), 5 е.а. Taq-полимеразы. Режим аплификации: 96°С - 10 с, 55°С - 10 с, 72°С - 60 с - 35 циклов. ДНК из реакционной смеси осаждали 75% этанолом (10 мин, -20°С). Осадки ДНК высушивали в вакуумной центрифуге (15 мин, 37°С) и растворяли в деионизованной воде. Аликвоты реакционных смесей анализировали электрофорезом в 2% агарозном геле, визуализировали окраской бромистым этидием. Последовательности праймеров (строчным шрифтом выделен промотор T7 РНКполимеразы): ProBS73 5'-atgtaatacgactcactatagggTCGATAAGCTTGATATCG-3' BS37 5'-TGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATT-3' ProBS37 5'-atgtaatacgactcactatagggTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATT-3' BS73 5'-ACGGTATCGATAAGCTTGATATCG-3' Реакцию транскрипции аналогов РНК плазмы крови проводили в реакционной смеси, содержащей 40 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 6 мМ MgCl2, 10 мМ ДTT, 10 мМ NaCl, 2 мМ спермидин, 2 мМ NTP и 30 е.а. РНК-полимеразы фага Т7 при 37°С в течение 2 часов. РНК анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле. Количество РНК оценивали с помощью программы Gel-Pro Analyzer 3.1. 2.4.5 Культуры эукариотических клеток Для анализа действия аналогов РНК на клетки человека использовали клетки аденокарциномы молочной железы человека линии MCF-7 (Российская коллекция клеточных культур позвоночных, ИНЦ РАН, Санкт-Петербург). Клетки MCF-7 культивировали в среде IMDM с 10 мМ L-глутамина и 40 мкг/мл гентамицина в присутствии 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) при 37оС в атмосфере 5% СО2 в культуральных флаконах с площадью поверхности дна 25 см2. Подсчет количества клеток проводили в камере Горяева по стандартной методике. 2.4.6 Выделение суммарной РНК из клеток MCF-7 Выделение РНК проводили из 1х106 клеток с помощью реагента Trizol LS, используя методику производителя (Invitrogen, США), аналогично п. 2.5.1. Осадок РНК растворяли в 9 мкл обработанной ДЭПК воды, добавляли 1 мкл 10х буфера для ДНКазы и 1.5 е.а. ДНКазы I (Fermentas, Латвия). Реакционную смесь инкубировали 40 мин при 37оС. Инактивацию 61 фермента проводили при 65оС, 15 мин. К реакционной смеси добавляли 90 мкл 70% этанола, центрифугировали 10 мин при 12000g. Супернатант отбирали, осадок РНК растворяли в 10 мкл обработанной ДЭПК воды. 2.4.7 Синтез аналогов AluYa5 РНК и 7SL РНК человека Геномную ДНК клеток MCF-7 выделяли с помощью набора GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit (Sigma, США). Культуру клеток (~5*106 клеток) обрабатывали трипсином 5 мин, 37оС, центрифугировали 5 мин, 300 g, добавляли 200 мкл Resuspension Solution, перемешивали. Добавляли 20 мкл протеиназы К и 200 мкл Lysis Solution C, перемешивали и инкубировали при 70оС, 10 мин. На колонки GeneElute Miniprep Binding Column наносили 500 мкл Colomn Preparation Solution и центрифугировали при 12000 g, 1 мин. К лизату клеток добавляли 200 мкл этанола, перемешивали. Лизат переносили на подготовленные колонки, центрифугировали 7000 g, 1 мин. Колонку дважды промывали 500 мкл Wash Solution. Затем на колонки наносили 200 мкл Elution Solution, инкубировали 5 мин при КТ, центрифугировали 7000 g, 1 мин. Для получения ДНК-матриц – продуктов ПЦР, кодирующих аналоги Alu- и 7SL РНК под промотором РНК-полимеразы фага Т7, геномную ДНК клеток MCF-7 амплифицировали со следующими парами праймеров (строчным шрифтом выделен промотор T7-РНК-полимеразы): AluYa5, chr6:104,183,151–104,183,559: 5'-ATTTGATTCGGTTATTTCCAAGA-3', 5'-atgcagctaatacgactcactataggGAGAGTCTCAGCTACAGAATTGAA-3'; 7SL, chr14:50,329,268–50,329,585: 5'-AAGAGACGGGGTCTCGCTAT-3', 5'-atgcagctaatacgactcactatagggTTCGCAGCGTCTCCGACC-3'. ДНК-матрицы очищали с помощью электрофореза в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) в нативных условиях. ДНК элюировали из геля в присутствии 100 мМ NaAc и переосаждали 70% этанолом. Синтез аналогов AluYa5 РНК и 7SL РНК человека проводили транскрипцией in vitro в реакционной смеси, содержащей 40 мМ Трис-HCl (pH 8.0), 6 мМ MgCl2, 10 мМ ДTT, 10 мМ NaCl, 2 мМ спермидина, 2 мМ NTP и 30 е.а. РНК-полимеразы фага Т7 при 37°С в течение 2 часов. ДНК-матрицы гидролизовали в присутствии 1 е.а. ДНКазы I, 40 мин при 37°С, с последующей инактивацией ДНКазы, 15 мин при 65°С. Для очистки синтетических РНК от компонентов транскрипционной смеси проводили обращенно-фазовую ВЭЖХ на хроматографической системе «Миллихром A2» (Эконова, Россия), оснащенной колонкой ProntoSIL-120-5-C18 AQ и многоволновым спектрофотометром. Для элюции использовали линейный градиент в системе растворителей: раствор А – 0.05 М водный раствор тетраэтиламмоний ацетата (рН 7.5); раствор Б – 0.05 М раствор 62 тетраэтиламмоний ацетата в 20% растворе ацетонитрила (рН 7.5). Обработку результатов хроматографии проводили с помощью программного пакета МультиХром версии 1.5х-Е. Осаждение РНК из хроматографических фракций проводили 70% этанолом в присутствии 100 мМ NaAc. Концентрацию синтетических РНК определяли спектрофотометрически, измеряя поглощение раствора РНК на длине волны 260 нм с учетом коэффициента экстинкции ε260 = 25 М-1см-1. Первичную структуру аналогов подтверждали с помощью обратной транскрипции РНК, амплификации и секвенирования кДНК по методу Сэнгера на автоматическом секвенаторе ABI 3730XL Genetic Analyser в ЦКП «Геномика» СО РАН. 2.4.8 Анализ жизнеспособности клеток MCF-7 после трансфекции синтетическими РНК Клетки MCF-7 культивировали в 96-луночных планшетах до достижения плотности 60– 70% монослоя. Клетки трансфицировали 1 мкг/мл РНК в комплексе c липофектамином по методике производителя (Invitrogen, США) и инкубировали в течение 72 ч. В культуральную среду добавляли MTT до конечной концентрации 0.5 мг/мл и инкубировали в течение 4 часов при 37°С [245]. Среду удаляли, MTT-формазан растворяли в изопропиловом спирте и определяли оптическую плотность раствора при λ = 570 нм с контролем при λ = 620 нм на многоканальном спектрофотометре Apollo 8 LB 912 (Berthold technologies, Германия). 2.4.9 Анализ проапоптотических изменений клеток MCF-7 с помощью проточной цитофлуориметрии Клетки MCF-7, трансфицированные аналогами Alu- и 7SL РНК, и контрольные клетки, инкубированные в среде с липофектамином без РНК, промывали тремя сменами PBS, инкубировали в течение 5 мин при 37оС в присутствии 0.1 мг/мл трипсина. Для анализа изменений клеточной мембраны суспензию клеток инкубировали в присутствии 4.5 мкг/мл йодида пропидия и конъюгата аннексина V – ФИТЦ по методике производителя (BD, США). Для анализа изменений трансмембранного потенциала митохондрий (m) суспензию клеток инкубировали в присутствии 2.5 мкг/мл JC-1. Препараты анализировали с помощью проточной цитофлуориметрии на приборе Beckman Coulter FC 500 по методу, описанному в работе [246]. В качестве положительного контроля проапоптотических изменений использовали препараты клеток MCF-7, инкубированных 24 ч в присутствии 5 мкг/мл фактора некроза опухолей α, или в присутствии 1 мкМ стауроспорина. 63 2.4.10 Анализ изменений транскриптома клеток MCF-7 под действием аналогов Alu- и 7SL РНК на чипах Illumina НТ-12 Клетки MCF-7 трансфицировали 1 мкг/мл Alu РНК либо 1 мкг/мл 7SL РНК в комплексе c липофектамином по методике производителя (Invitrogen, США) и инкубировали 24 ч при 37°С в атмосфере 5% СО2. В качестве контроля использовали клетки, инкубированные в тех же условиях с липофектамином без РНК. Для сравнения клетки MCF-7 также трансфицировали синтетическим аналогом РНК L1MA5 (кодируется в локусе chr13:58,561,232 - 58,561,341, hg19), полученным по методу 2.4.4. Гибридизация суммарной РНК клеток MCF-7 на чипах HT-12 Illumina, а также первичный анализ данных с использованием алгоритма "Illumina custom" [247] и нормированием данных по методу "rank invariant" были проведены в ЗАО "Геноаналитика" (Москва). Для интерпретации результатов дифференциального анализа изменений экспрессии генов использовали транскрипты, для которых параметр Detection_Pval < 0.05. При интерпретации данных об увеличении экспрессии генов под действием Alu РНК из рассмотрения исключали транскрипты, для которых структура гибридизационных зондов (Illumina PROBE_SEQUENCE) содержала прямые последовательности Alu-повторов. Изменением экспрессии считали увеличение или уменьшение интенсивности сигнала гибридизации в три и более раза относительно интенсивности сигнала контрольного образца РНК из клеток, обработанных липофектамином без РНК. Выборочную верификацию результатов полнотранскриптомного анализа проводили методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием ПЦР-набора Maxima SYBRGreen (Fermentas, Латвия) на приборе IQ5 (BioRad, США) с использованием следующих пар праймеров: PSPH: 5'-ATGATTGGAGATGGTGCCAC-3', 5'-CAGTGATATACCATTTGGCG-3'; DDIT3: 5'-GACCTGCAAGAGGTCCTGTC-3', 5'-AAGCAGGGTCAAGAGTGGTG-3'; MTHFD: 5'-TGTAGGACGAATGTGTTTGG-3', 5'-AACATTGCAATGGGCATTCC-3'; TDP1: 5'-CTCATCAGTTACTTGATGGC-3', 5'-TGACTTCCTTGAAAGCGTCC-3'; ZNF682: 5'-AAGCCAGAACTGATTAGCCG-3', 5'-AAGGTCTTCAGTGTAATGAG-3'; CEBPG: 5'-CGCTCGGAGTGGAGGCCGCC-3', 5'-CAGGGTGATCAATGGTTTCC-3'. В качестве нормировочного контроля использовали мРНК GAPDH, HPRT [248]. 64 2.4.11 Статистические методы анализа полученных результатов Достоверность различия относительного вклада (FPKM) РНК по классам между группами 8 здоровых доноров и 8 пациентов с НМРЛ определяли с помощью U-критерия Манна - Уитни – Уилкоксона, Р < 0.05. Достоверность различия относительного вклада (FPKM) кодирующих и некодирующих участков мРНК определяли с помощью t-критерия Стьюдента для фрагментов мРНК плазмы крови здоровых доноров, отностиельный вклад которых FPKM > 0 (10696 транскриптов). При проведении анализа генной онтологии с помощью расширения ClueGO v.2.1.3 программы Cytoscape v.3.1.1 значение P определяли по точному критерию Фишера с корректировкой по Бонферрони. Коэффициент корреляции при сравнительном кластерном анализе представленности индивидуальных форм РНК определяли по методу ранговой корреляции Спирмена с помощью программного пакета MEV v.4.7.4. Достоверность различия в представленности (ОТ-ПЦР в режиме реального времени) потенциальных диагностических форм РНК между группамы 11 здоровых доноров и 10 пациентов с НМРЛ определяли по U-критерию Манна - Уитни – Уилкоксона (P < 0.01) с помощью программного пакета OriginPro 8 SR0 v8.0724. Диагностическую значимость оценивали с помощью ROC-анализа [249, 250]. При анализе жизнеспособности клеток MCF-7 после трансфекции синтетическими РНК, а также при анализе проапоптотических изменений клеток MCF-7 после трансфекции аналогами Alu и 7SL РНК достоверность различий определяли с помощью t-критерия Стьюдента (P < 0.05) в трех независимых экспериментах. 65 ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Циркулирующие РНК участвуют в межклеточной регуляции процессов дифференцировки клеток [18, 156], врожденного иммунитета [138, 142] и свертывания крови [16]. Нахождение внеклеточных РНК в составе микровезикул [37], экзосом [50], апоптотических телец [98], липопротеидов [38] и рибонуклеопротеидных комплексов [108, 109] обеспечивает защиту от РНКаз крови и способствует реализации регуляторных функций молекул РНК. Известно, что изменение уровня отдельных форм РНК в плазме и сыворотке крови [2, 19], а также общей концентрации циркулирующей РНК может являться диагностическим и прогностическим признаком различных заболеваний человека [251, 252]. Следует отметить, что такие факторы как отсутствие единых стандартов фракционирования крови и выделения РНК, отсутствие универсальных внутренних РНК-контролей для нормализации данных, а также несоответствие выявляемых диагностически значимых наборов РНК в разных исследованиях ограничивают внедрение внеклеточных РНК-маркеров в клиническую практику (см. Раздел 1.7). Тем не менее, благодаря исследованиям свойств внеклеточных РНК были разработаны новые области применения РНК в клинической практике, такие как мРНК-вакцинация [145, 146] и миРНК-терапия [114, 117, 121]. Большинство исследований внеклеточных РНК плазмы крови человека затрагивает только отдельные классы РНК, такие как микроРНК и мРНК. К настоящему моменту недостаточно изученными остаются структура и биологические функции фрагментов протяженных РНК плазмы крови и других биологических жидкостей человека. Для изучения структуры и свойств РНК плазмы крови человека и определения их клеточных предшественников в данной работе использовали высокопроизводительное секвенирование по технологии SOLiD, а также МТТ-тест, цитофлуориметрию и анализ методом гибридизации на микрочипах суммарной мРНК культуры клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7, обработанных аналогами РНК плазмы крови человека. 3.1 Определение последовательностей коротких РНК плазмы крови человека с помощью высокопроизводительного секвенирования по технологии SOLiD В ранних работах по изучению состава РНК плазмы крови были выявлены протяженные формы РНК (6S - 27S) [22]. При этом было известно, что причиной быстрой деградации молекул РНК в крови является высокая активность РНКаз [253, 254]. К настоящему времени в составе циркулирующих РНК обнаружены также и короткие РНК, представляющие как зрелые формы микроРНК, так и фрагменты клеточных РНК других классов [31]. 66 Из Рисунка 4 видно, что длина циркулирующих РНК плазмы крови человека варьирует в широком диапазоне. При этом значительная часть РНК представлена набором молекул длиной менее 18 нуклеотидов. Так как поиск клеточных предшественников фрагментов РНК n ≤ 18 осложнен в связи с многозначностью картирования на геном, для выявления клеточных РНКпредшественников циркулирующих РНК в данной работе анализировали молекулы длиной 19 н. и более. На Рисунке 4 показано, что в наборе РНК исследуемого диапазона (более 19 н.) преобладают фрагменты длиной 19-30 н. Максимумы распределения соответствуют формам РНК длиной 20-22 н. и 80-85 н. По размеру эти фракции соответствуют классам микроРНК и тРНК, но также могут включать продукты деградации РНК других классов. Рис. 4. Анализ распределения внеклеточных РНК по длине при помощи электрофореза 5'-[32P]-меченого препарата суммарной РНК плазмы крови человека. 3.1.1 Подбор здоровых доноров и пациентов с немелкоклеточным раком легкого Для анализа набора коротких форм РНК (19-100 н.), циркулирующих в плазме крови здоровых доноров, нами была подобрана группа доноров без выявленных онкологических, аутоиммунных и острых инфекционных заболеваний, состоящая из 4-х мужчин и 4-х женщин в возрасте от 20 до 53 лет с возрастным интервалом 8-12 лет (Таблица 8). 67 Таблица 8. Характеристика группы здоровых доноров. № Возраст Пол Д1 22 М Д2 32 Ж Д3 32 М Д4 53 Ж Д5 53 М Д6 20 Ж Д7 39 М Д8 41 Ж Для анализа набора форм коротких РНК плазмы крови пациентов с онкологическим заболеванием была подобрана группа пациентов с диагнозом аденокарцинома легкого либо плоскоклеточный рак легкого (Таблица 9). Подбор пациентов и постановка диагноза были проведены в торакальном отделении Новосибирского областного онкологического диспансера (зав. отделением, врач-онколог первой категории, Козлов В.В.). Таблица 9. Характеристика группы пациентов с НМРЛ. № Возраст Пол Диагноз TNM* стадия заболевания П9 51 М Плоскоклеточный рак T2N0M0 П10 52 М Плоскоклеточный рак T2N1M0 П11 59 М Плоскоклеточный рак T2NxM0 П12 64 Ж Аденокарцинома T1NxM0 П13 56 Ж Аденокарцинома T2N0M0 П14 63 М Плоскоклеточный рак T2N0M0 П15 62 М Аденокарцинома T2N0M0 П16 49 М Аденокарцинома T1N0M0 *международная классификация стадий злокачественных новообразований (T - распространённость первичной опухоли, N - наличие, отсутствие и распространённость метастазов в регионарных лимфатических узлах, M - наличие или отсутствие отдалённых метастазов). 3.1.2 Конструирование кДНК-библиотек SOLiD на основе РНК плазмы крови человека Для конструирования полнотранскриптомных кДНК-библиотек РНК плазмы крови здоровых доноров и пациентов с НМРЛ мы использовали набор Total RNA-seq [255]. В стандартный протокол конструирования кДНК-библиотек суммарной клеточной РНК, рекомендованный производителем (Applied Biosystems, США), был внесен ряд модификаций, направленных на адаптацию набора Total RNA-seq для конструирования кДНК-библиотек внеклеточных РНК. Известно, что РНК-лигазы, используемые для лигирования олигонуклеотидных адаптеров в наборе Total RNA-seq [255], катализируют образование фосфодиэфирных связей 68 только между 5'-фосфорилированным РНК-донором и 3'-дефосфорилированным РНКакцептором [256]. При использовании протокола конструирования кДНК-библиотек на основе коротких РНК (SOLiD Small RNA Expression Kit, RNA-Seq) в реакции лигирования с 5'- и 3'адаптерами участвуют РНК с 5'-фосфатной и 3'-гидроксильной группами (Рисунок 5, IV), в том числе зрелые микроРНК [31, 223]. При этом известно, что в наборе фрагментов РНК, циркулирующих в плазме крови, присутствуют продукты гидролиза протяженных молекул РНК РНКазой А, содержащие свободную 5'-гидроксильную группу и остаток фосфорной кислоты на 3'-конце (Рисунок 5, II) [253, 257, 258]. Такие продукты гидролиза РНК не проявляют субстратных свойств в реакциях, катализируемых РНК-лигазами. Для того, чтобы полученные нами кДНК-библиотеки содержали копии РНК с разными вариантами расположения фосфатной и гидроксильной групп на 5'- и 3'-концах, в стандартный протокол конструирования нами были добавлены стадии дефосфорилирования и 5'-фосфорилирования РНК (Рисунок 6). Рис. 5. Возможные положения фосфатных и гидроксильных групп на 5'- и 3'-концах олиго- и полинуклеотидов. Субстратные свойства в реакции лигирования РНК с 5'- и 3'олигонуклеотидными адаптерами SOLiD (РНК лигаза II) проявляют олиго- и полинуклеотиды c 5'-фосфатом и свободной 3'-ОН -группой (IV). Известно, что при конструировании кДНК-библиотек SOLiD с помощью набора Total RNA-seq возможно образование побочного ДНК-продукта длиной 89 п.н., который является результатом прямого лигирования адаптеров без РНК-вставки [255]. Для того чтобы минимизировать вклад побочных продуктов конструирования, а также чтобы снизить вклад коротких РНК (n < 19 н.) в кДНК-библиотеках, к стандартному протоколу нами были добавлены дополнительные стадии очистки РНК (n > 19 н.), а также стадия очистки амплифицированных кДНК-библиотек (n > 110 п.н.) с помощью ЭФ в ПААГ и последующей элюции НК из геля (Рисунок 6). 69 Рис. 6. Схема конструирования кДНК-библиотек РНК плазмы крови для анализа методом высокопроизводительного секвенирования на платформе SOLiD. Для конструирования использовали набор Total RNA-seq (Applied Biosystems, США). К стандартному протоколу конструирования кДНК-библиотек на основе суммарной клеточной РНК [255] были добавлены стадии дефосфорилирования и 5'-фосфорилирования РНК, а также дополнительные стадии очистки НК с помощью ЭФ в ПААГ. Для анализа полученных кДНК-библиотек проводили амплификацию с 5’-FAM-P1 и P2 праймерами. Распределение 5’-FAM-меченых кДНК-библиотек по длине анализировали капиллярным электрофорезом на ДНК-анализаторе ABI 3130xl Genetic Analyzer (Рисунок 7). Видно, что в полученных кДНК-библиотеках вклад побочных продуктов не превышал 10%. При этом каждая из полученных кДНК-библиотек содержала специфический набор форм ДНК с максимумами в области, соответствующей РНК-вставке длиной 21-30 н. (Рисунок 7). 70 Рис. 7. Анализ кДНК-библиотек РНК плазмы крови здоровых доноров (Д1 - Д8), и пациентов с НМРЛ (П9 – П16) методом капиллярного электрофореза на ДНК-анализаторе ABI 3130xl Genetic Analyzer. Стрелками показаны времена выхода маркеров молекулярной массы ДНК и длина кДНК-вставки, кодирующей фрагменты РНК длиной 21 – 30 н. Согласно технологии SOLiD, полученные кДНК-библиотеки амплифицировали в водномасляной эмульсии на магнитных микрочастицах, проводили обогащение на полистироловых микрочастицах, иммобилизовали целевые конструкции на стеклянные пластины и проводили циклы лигирования и детекции в ЦКП "Геномика" СО РАН с длиной прочтения 35 н. В результате секвенирования было получено от 32 до 87 млн последовательностей на кДНКбиблиотеку (Таблица 10). Таким образом, для определения состава коротких циркулирующих РНК плазмы крови здоровых доноров и пациентов с НМРЛ нами использован метод высокопроизводительного секвенирования по технологии SOLiD, позволяющий анализировать десятки миллионов последовательностей в образце. Суммарное количество полученных последовательностей составило 1.05*109. 71 Таблица 10. Количество первичных данных высокопроизводительного секвенирования кДНК-библиотек РНК плазмы крови здоровых доноров (Д1 – Д8) и пациентов с НМРЛ (П9 – П16). Здоровые доноры Последовательностей, млн. Пациенты с НМРЛ Последовательностей, млн. Д1 Д2 Д3 Д4 Д5 Д6 Д7 Д8 43.5 47.2 31.8 40.2 65.7 56.1 57.8 50.8 П9 П10 П11 П12 П13 П14 П15 П16 77.6 86.7 81.9 86 76 82.9 81.4 85 3.1.3 Относительный вклад основных групп транскриптов в набор РНК плазмы крови человека Для поиска предшественников циркулирующих фрагментов РНК мы использовали программный пакет Bowtie [227]. Стратегия поиска геномных предшественников РНК плазмы крови человека носила последовательный характер (Рисунок 8). Известно, что в ядерной ДНК человека присутствуют участки, гомологичные последовательностям митохондриальной ДНК [259]. Для того, чтобы короткие циркулирующие фрагменты митохондриальных транскриптов не были ошибочно отнесены к транскриптам ядерной ДНК, на первом этапе мы провели выравнивание массива данных высокоэфективного секвенирования с последовательностью мтДНК человека [228] (Рисунок 8). Затем среди экспериментальных последовательностей, которые не проявляли гомологии к мтДНК, были выявлены фрагменты транскрибируемых геномных повторов человека (SINE, LINE, LTR и др.), а также фрагменты рРНК, тРНК и мяРНК (Рисунок 8). Таким образом, на этом этапе поиска предшественников были выявлены, классифицированы и удалены из первоначального массива данных секвенирования фрагменты тех РНК, гены которых имеют большое количество копий в геноме человека. На следующем этапе были картированы экспериментальные последовательности, совпадающие с транскриптами, аннотированными в базе данных Национального института здоровья США NCBI human Referenced Sequence database (RefSeq RNA) [231], которая содержит последовательности известных мРНК, малых некодирующих РНК (в том числе и премикроРНК), ряда длинных некодирующих РНК и др. (Рисунок 8). 72 Последовательности РНК, предшественники которых не были выявлены на предыдущих этапах, выравнивали с последовательностями ДНК генома человека (сборка GRCh37/hg19) [234]. Рис. 8. Схема поиска предшественников РНК плазмы крови человека. Выравнивание массива данных высокоэффективного параллельного секвенирования проводили последовательно с использованием мтДНК [228], баз данных повторяющихся элементов (Repbase [229]) и RefSeq RNA [231]. Предшественники РНК, не имеющие гомологов среди известных, аннотированных транскриптов человека, определяли с использованием баз данных генома человека [234]. Классификация фрагментов циркулирующих РНК позволила подтвердить то, что плазма крови содержит фрагменты РНК основных классов РНК клеток человека [12, 13] (Рисунок 9). При этом установлено, что набор РНК плазмы крови значительно отличается от ожидаемого набора продуктов частичного гидролиза суммарной РНК клеток человека: вклад фрагментов рРНК в набор циркулирующих РНК (6.8%, Рисунок 9) существенно ниже, чем вклад рРНК в суммарную клеточную РНК (> 80%, [48]). Вклад митохондриальных транскриптов (7.2%, Рисунок 9) был повышен относительно вклада мтРНК в суммарную клеточную РНК (менее 2%) 73 и сравним с вкладом мтРНК в обогащенную, поли-А-фракцию клеточных РНК (в зависимости от типа ткани значения варьируют от 5% до 30%, [260]). Рис. 9. Распределение циркулирующих РНК плазмы крови человека по основным классам клеточных РНК. Приведены усредненные значения вклада РНК различных классов по результатам анализа массива данных секвенирования здоровых доноров. Сравнение представленности циркулирующих РНК между группами здоровых доноров и онкологических пациентов по основным классам клеточных РНК показало, что у больных происходит достоверное увеличение вклада транскриптов геномных повторов (Р < 0.01) и достоверное снижение вклада фрагментов РНК, не аннотированных в базе данных RefSeq (Таблица 11). Обнаружено также увеличение доли рРНК в 1.8 раза, тРНК в 3 раза и RefSeq РНК (в основном фрагментов мРНК) в 1.2 раза в группе пациентов с НМРЛ по сравнению с группой здоровых доноров (Таблица 11). При этом увеличение вклада рРНК и тРНК не было обусловлено изменением уровня одного или нескольких выделенных фрагментов этих РНК, а характеризовало изменения большинства форм рРНК и тРНК. В настоящее время механизмы появления РНК во внеклеточном пространстве, а также процессы, обеспечивающие стабильность отдельных форм и фрагментов РНК в плазме крови, исследованы лишь частично. Вместе с тем, можно предположить, что достоверное увеличение вклада рРНК и тРНК в наборе РНК плазмы крови пациентов с НМРЛ связано с повышением уровня компонентов трансляционного аппарата клеток (например, в клетках костного мозга, форменных элементах крови, эндотелии сосудов) и сопровождается увеличением синтеза рибосомных и тРНК-связывающих белков, способных обеспечить наблюдаемое повышение стабильности циркулирующих фрагментов рРНК и тРНК у пациентов с НМРЛ (Таблица 11). 74 Таблица 11. Вклад основных классов клеточных РНК в общий набор РНК плазмы крови в группах здоровых доноров и пациентов с НМРЛ. мтДНК рРНК тРНК повторы* RefSeq Non RefSeq Здоровые доноры, % 7.2 ± 8.1 6.8 ± 5.2 0.2 ± 0.2 1.4 ± 0.5 40 ± 3.8 45 ± 9.1 НМРЛ, % 3.1 ± 2.3 12 ± 2.4 0.6 ± 0.4 3.9 ± 1.7 48 ± 7.6 32 ± 4.7 P** 0.357 0.033 0.041 0.001 0.020 0.005 *фрагменты транскриптов геномных повторов человека **значения вероятности для U-критерия Манна - Уитни – Уилкоксона 3.1.4 Описание форм РНК плазмы крови человека по классам 3.1.4.1 МикроРНК Одним из наиболее популярных объектов исследований циркулирующих РНК человека являются микроРНК [2, 19]. Извесно, что циркулирующие микроРНК проявляют повышенную стабильность и могут являться биомаркерами физиологических и патологических состояний организма [31, 32]. При анализе данных высокоэффективного секвенирования РНК плазмы крови нами установлено, что вклад микроРНК в массив данных варьирует от 0.03% до 0.11% у здоровых доноров (в среднем 0.05%) и от 0.05% до 0.5% у пациентов с НМРЛ (в среднем 0.12%). В Таблице 12 представлены формы микроРНК в порядке убывания вклада в массив данных секвенирования (в терминах FPKM – фрагментов на тысячу оснований транскрипта, на миллион картированных последовательностей [238]). Приведенные в Таблице 12 микроРНК (кроме микроРНК-23b-3p, -10b-5p, -145-5p, -4093p и -942) ранее были обнаружены в сыворотке крови здоровых доноров Chen и соавт. [31] при помощи методов высокопроизводительного секвенирования на платформе Solexa и количественного ОТ-ПЦР. Наиболее представленными микроРНК в сыворотке крови, по данным [31], были микроРНК-451, -16, -486-5p, -101, let-7g, let-7h, let-7a, -185, -20a и -106b. За исключением микроРНК-451а и -185-5p, данные микроРНК не были обнаружены нами среди наиболее представленных микроРНК плазмы крови здоровых доноров (ранги 4 и 8, Таблица 12). При этом выявленные нами три наиболее представленных микроРНК-223-3p, -191-5p и -243p плазмы крови (Таблица 12) были обнаружены Chen и соавт. с рангами 49, 37 и 51, соответственно [31]. 75 Таблица 12. Зрелые микроРНК, выявленные в массиве данных высокопроизводительного секвенирования РНК плазмы крови здоровых доноров. Ранг* микроРНК FPKM 10-5** SD FPKM 10-5*** 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 17 19 20 21 24 26 28 29 30 hsa-miR-223-3p hsa-miR-191-5p hsa-miR-24-3p hsa-miR-451a hsa-miR-103a-3p hsa-miR-107 hsa-miR-26a-5p hsa-miR-185-5p hsa-miR-126-3p hsa-miR-23b-3p hsa-miR-23a-3p hsa-miR-21-5p hsa-miR-320d hsa-miR-10b-5p hsa-miR-140-3p hsa-miR-145-5p hsa-miR-320e hsa-miR-17-5p hsa-miR-409-3p hsa-miR-942 hsa-miR-126-5p hsa-miR-146a-5p hsa-miR-425-5p 103 31.7 27.3 8.79 8.53 7.38 6.45 6.35 4.43 4.33 3.71 3.62 3.43 2.77 2.72 2.18 2.11 1.80 1.30 1.00 0.80 0.75 0.73 114 28.7 28.4 6.84 9.02 7.63 4.75 4.33 3.10 3.65 3.80 3.27 4.84 1.91 1.59 1.34 2.72 1.19 0.93 2.63 0.46 0.60 0.50 Vickers et al. [38] Hunter et al. [37] Arroyo et al. [109] микровезикулы плазмы одноядерные клетки тромбоциты липопротеиды высокой плотности экзосомы везикулы везикулы и белки плазмы белки плазмы топ-10**** топ-10 топ-10 --В>>К --топ-10 --топ-10 ----+ В>>К --+ --В>>К В>>К ----топ-10 топ-10 + топ-10 топ-10 + --+ --топ-10 --+ ----К>>В + --К>>В --+ + ----+ топ-10 + --топ-10 топ-10 ------топ-10 --топ-10 ----+ + --+ --+ + ----топ-10 топ-10 --- топ-10 + топ-10 топ-10 + + + + топ-10 + + + + --+ + + топ-10 + + топ-10 + + топ-10 топ-10 + + + --+ --топ-10 ----+ + --+ --+ + ----топ-10 топ-10 + ----------------------------------------------- --+ ------------+ ----------------------+ ----- + --+ + + + --------+ + ------------------+ --- 76 Примечания к Таблице 12. *представлены данные для зрелых форм микроРНК; в таблице не приведены данные по микроРНК hsa-miR-3920, -1281, -4306, -4295, -4291, -3675-3p и -4271, так как анализ их содержания в субфракциях крови в работах [37, 38 и 109] не проводили. **среднее для здоровых доноров значение FPKM - фрагментов зрелых микроРНК на тысячу оснований транскрипта, на миллион картированных последовательностей ***стандартное отклонение FPKM ****"+" – форма обнаружена; "---" – форма не обнаружена; "топ-10" – форма обнаружена среди 10 наиболее представленных микроРНК; "В>>К" – формы микроРНК, уровень которых в везикулярной фракции был значительно выше (в 2 и более раза, Р < 0.0006), чем во фракции клеток крови; "К>>В" - формы микроРНК, уровень которых во фракции клеток крови был значительно выше (в 2 и более раза, Р < 0.0006), чем в везикулярной фракции [37]. 77 Несоответствия, наблюдаемые между нашими данными и данными, опубликованными ранее Chen и соавт. [31], являются результатом использования различных подходов к подготовке проб для конструирования кДНК-библиотек. Известно, что при коагуляции крови и получении сыворотки состав внеклеточных микроРНК претерпевает значительные изменения [211]. Поэтому различие в представленности отдельных форм микроРНК может быть обусловлено тем, что в нашем подходе использована РНК плазмы крови, в то время как Chen и соавт. [31] использовали РНК сыворотки крови человека. Кроме того, полученные в настоящей работе кДНК-библиотеки содержат фрагменты РНК вне зависимости от наличия 5'- или 3'концевых фосфатных групп (Рисунок 6), в то время как стандартный протокол пробоподготовки, использованный в работе [31], позволяет лигировать с адаптерными молекулами только формы РНК с 5'-фосфатом и 3'-гидроксилом. Поэтому имеющиеся различия в данных о представленности микроРНК можно также объяснить ограниченным гидролизом циркулирующих РНК нуклеазами крови, так как продукты гидролиза РНК недоступны для реакции лигирования и последующего конструирования кДНК–библиотек. Формы транспорта микроРНК в плазме крови человека Показано, что большая часть внеклеточных микроРНК плазмы крови человека находится в комплексе с белками AGO2 – компонента RISC-комплекса [108, 109]. При этом результаты Hunter с соавт. [37] и данные Vickers с соавт. [38] указывают на то, что значительная часть микроРНК присутствует в плазме как компонент микровезикул/экзосом и ЛВП. Мы сравнили наши данные о представленности отдельных форм микроРНК в системной циркуляции с результатами анализа микроРНК, выделенных из микровезикул, экзосом [37] и липопротеидов высокой плотности плазмы крови человека [38], а также результатами анализа распределения микроРНК между свободными рибонуклеопротеидными комплексами и везикулярными структурами крови [109] (Таблица 12). Все микроРНК, перечисленные в Таблице 12, кроме микроРНК-23b, были обнаружены ранее в работах [37, 38, 109]. Наиболее представленные микроРНК плазмы крови человека микроРНК-223-3p, -191-5p, -26a-5p, -24-3p, -126-3р, -126-5p и -146a-5p (Таблица 12) являются одними из наиболее представленных микроРНК микровезикул крови человека [37]. По данным Vickers и соавт. [38] микроРНК-223-3p, -191-5p, -126-3p, -126-5p и -146a-5p также являются одними из наиболее представленных микроРНК экзосом крови человека. Эти данные позволяют предположить, что РНК циркулирующих мембранных структур, таких как микровезикулы и экзосомы, вносят значительный вклад в суммарную популяцию РНК плазмы крови человека. МикроРНК-223-3p, -451а, -24-3p, -126-3p, -17-5p и -126-5p также являются одними из наиболее представленных микроРНК ЛВП крови человека (Таблица 12) [38]. 78 Последовательности, совпадающие с микроРНК-135a, а также с микроРНК-936 (наиболее представленные микроРНК ЛВП [38]), также входят в полученный нами набор данных секвенирования, но не на лидирующих позициях (350 и 153, соответственно). Эти данные указывают на то, что РНК, связанные с ЛВП, вносят гораздо меньший вклад в набор суммарных циркулирующих РНК плазмы крови человека, чем РНК экзосом и микровезикул. В противоположность данным [37, 38], в данных Arroyo и соавт. [109] показано, что невезикулярная фракция рибонуклеопротеидов, циркулирующих в плазме крови человека, обогащена микроРНК-223-3p, -24-3p, -451а, в то время как микроРНК-191-5p, -126-3p и -126-5p обнаружены как в составе экзосом, так и в составе свободных рибонуклеопротеидных комплексов (Таблица 12). Различия в данных распределения микроРНК между фракциями свободных рибонуклеопротеидных комплексов и экзосом можно объяснить тем, что часть везикулярных структур крови была нестабильна в условиях гель-фильтрации, использованной для их выделения из плазмы крови [109]. Это предположение подтверждают данные Turchinovich и соавт. [108], которые обнаружили микроРНК-103a, -598, -100, -18a, -27a исключительно во фракции, осаждаемой при 110000 g (соответствует везикулярным структурам). В то же время, согласно [109], теми же микроРНК обогащены вне-везикулярные фракции плазмы крови. Кроме того, субпопуляция микроРНК, вероятно, может секретироваться клетками как во фракции свободных рибонуклеопротеидных комплексов, так и во фракции микровезикул/экзосом. МикроРНК-рибонуклеопротеидные комплексы также могут быть нековалентно связаны с наружной поверхностью мембраны везикулярных структур и отделяться от мембраны при выделении везикул. Таким образом, наши данные указывают на то, что наборы микроРНК плазмы крови представляют собой сложную и вариабельную суперпозицию из микроРНК и экзосом, и микровезикул, и липопротеидов, и свободных рибонуклеопротеидов. Кроме того, присутствуют также и другие формы, которые не были выявлены в работах [37, 38, 109] (Таблица 12, микроРНК-10b). При этом наиболее близко полученные нами данные о составе микроРНК плазмы соотносятся с результатами анализа набора микроРНК микровезикул и экзосом крови человека [37, 38]. Поэтому наши данные в совокупности с данными литературы позволяют предположить, что микровезикулы и экзосомы вносят значительный вклад в общий набор не только микроРНК, но и других классов циркулирующих РНК. Регуляторный потенциал циркулирующей микроРНК-223 Согласно полученным нами данным, наиболее представленной в плазме крови человека формой микроРНК является микроРНК-223-3p (Таблица 12). МикроРНК-223-3p кодируется в межгенном участке хромосомы Х (65155437–65155546), ее экспрессия регулируется двумя 79 сайтами CEBPA (CCAAT/enhancer binding protein-alpha). По данным анализа тканевой и клеточной специфичности экспрессии микроРНК Landgraf и соавт. [39], микроРНК-223-3p является одной из пяти микроРНК, которые специфически продуцируются в миелоидных клетках: моноцитах, гранулоцитах и дендритных клетках. Georgantas и соавт. также обнаружили высокий уровень микроРНК-223-3p в клетках-предшественниках гранулоцитов [261]. Наши данные о высокой представленности микроРНК-223-3p в плазме крови человека указывают на значительную регуляторную роль внеклеточной микроРНК-223-3p (Таблица 12). В работе Vickers и соавт. показано, что циркулирующая в плазме крови микроРНК-223-3p может осуществлять системную регуляцию мРНК-мишеней. Так, микроРНК-223-3p в составе нековалентных комплексов с ЛВП после проникновения в клетки реципиенты снижает экспрессию генов-мишеней EFNA1 и RHOB [38]. Также известно, что микроРНК-223-3p принимает участие в регуляторных процессах, направляющих дифференцировку гранулоцитов человека (гранулопоэз) через подавление экспрессии генов ядерного фактора I-A (NFI-A) [262] и ключевого фактора дифференцировки эритроцитов LMO2 [263]. Повышение экспрессии микроРНК-223-3p в культуре клеток К562 не только подавляет дифференцировку по эритроцитарному пути, но и усиливает дифференцировку мегакариоцитов [264]. Можно предположить, что изменение уровня микроРНК-223-3p в системной циркуляции влияет на соотношение вновь образующихся форменных элементов крови при дифференцировке клеток костного мозга. В крови мышей, нокаутных по гену MIR223, происходит увеличение числа нейтрофилов. Причем для таких нейтрофилов характерен ряд морфологических особенностей и гиперчувствительность к активирующим агентам [265]. Это указывает на регуляторную роль микроРНК-223-3p при созревании и активации нейтрофилов. Также высокий уровень микроРНК-223-3p в кардиомиоцитах приводит к повышению экспрессии транспортера глюкозы 4 (Glut4) и усилению захвата глюкозы клетками сердечной мышцы [266]. Такие типы клеток как миелоидные клетки костного мозга, нейтрофилы и кардиомиоциты постоянно находятся в непосредственном контакте с компонентами крови, поэтому данные литературы о регуляторной роли микроРНК-223-3p в совокупности с полученными в настоящей работе данными о высоком уровне микроРНК-223-3p в плазме позволяют предположить, что циркулирующая микроРНК-223-3p может на межклеточном уровне осуществлять регуляцию таких важных биологических процессов, как контроль дифференцировки и функционирования форменных элементов крови, а также транспорта глюкозы в клетки организма. 80 3.1.4.2 мРНК Белок-кодирующие транскрипты в образцах плазмы крови были представлены вариабельным набором фрагментов. Анализ распределения экспериментальных последовательностей по длине мРНК, а также сравнительный анализ вклада фрагментов 5'-НТР, кодирующей области и 3'-НТР позволил выявить достоверное увеличение вклада (P < 10-5) фрагментов 5'-НТР, относительно кодирующей области и 3'-НТР мРНК (Таблица 13). Эти данные указывают на повышенную сохранность 5'-НТР мРНК в системной циркуляции. Отсутствие полного покрытия мРНК фрагментами, циркулирующими в плазме крови, и пониженное покрытие кодирующей области (Таблица 13) не позволяет делать выводы о целостности мРНК в плазме и наличии кодирующего потенциала циркулирующих РНК. Таблица 13. Распределение экспериментальных последовательностей между транслируемым и нетранслируемыми районами мРНК. FPKM* SD FPKM** 1786*** 24368 5'-НТР Кодирующая 42 238 область 3'-НТР 381 7563 *среднее значение FPKM для мРНК с покрытием экспериментальными последовательностями больше 0 **стандартное отклонение FPKM ***показано достоверное различие значений FPKM для 5'-НТР, кодирующей области и 3'-НТР при попарном сравнении с помощью t-критерия Стьюдента, Р < 10-5 мРНК с наибольшим вкладом фрагментов (FPKM) в набор РНК плазмы крови здоровых доноров перечислены в Таблице 14. Среди 20 наиболее представленных в плазме крови мРНК отсутствуют мРНК, экспрессия которых специфична для форменных элементов крови (эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов). При этом экспрессия только одной мРНК (LOH12CR1) повышена в незрелых эритроцитах (Таблица 14). Вторым по численности классом форменных элементов после эритроцитов являются тромбоциты. Установлено, что пять наиболее представленных мРНК тромбоцитов человека (B2M, NRGN, PPBP, PF4, OST4 [267]) содержатся в полученном нами наборе наиболее представленных мРНК плазмы крови на позициях с 46 по 328. Поэтому можно заключить, что полученные нами препараты РНК содержали лишь незначительные количества РНК, появляющихся в препаратах плазмы в результате лизиса форменных элементов крови. Среди 20 наиболее представленных мРНК, фрагменты которых были обнаружены в результате секвенирования РНК плазмы крови здоровых доноров, содержатся мРНК генов 81 рибосомных белков (RPS7, MRPS15); мРНК транскрипционных факторов (HOXC4, HOXC6, TAF9); регуляторных киназ/фосфатаз (DUSP, BRSK1), а также мРНК гормона окситоцина и фрагменты мРНК дефензинов - пептидов иммунной системы (DEFB128, DEFB131, DEFB108B) (Таблица 14). Предполагая, что мРНК, перечисленные в Таблице 14, представляют в основном ту часть набора циркулирующих мРНК, фрагменты которых проявляют повышенную устойчивость к действию нуклеаз, мы можем подчеркнуть общее разнообразие и гетерогенность происхождения индивидуальных наборов циркулирующих мРНК. С помощью плагина ClueGo 2.1.3 для программы Cytoscape 3.1.1 мы провели анализ генной онтологии 100 наиболее представленных мРНК плазмы крови здоровых доноров. Из Таблицы 15 видно, что набор мРНК плазмы обогащен (Р < 0.01) фрагментами мРНК генов, продукты которых локализуются преимущественно внутри секреторных альфа-гранул тромбоцитов. Принимая во внимание отсутствие достоверного обогащения фрагментами мРНК, характерных для тромбоцитов в целом, можно предположить существование избирательных механизмов секреции из тромбоцитов во внеклеточное пространство фрагментов тех мРНК, продукты которых связаны с секреторными альфа-гранулами. Набор мРНК плазмы также обогащен (Р < 0.01) фрагментами мРНК секретируемых катионных белков иммунной системы семейства бета-дефензинов (Таблица 15). Бетадефензины экспрессируются лейкоцитами и эпителиальными клетками в различных органах и тканях при ответе на провоспалительные факторы [268]. Обогащение набора циркулирующих мРНК по фрагментам бета-дефензинов можно объяснить тем, что клетки, продуцирующие дефензины, являются источником внеклеточных РНК человека. 82 Таблица 14. мРНК с наибольшим вкладом фрагментов (FPKM) в набор РНК плазмы крови здоровых доноров. Ген Идентификатор Среднее, СО, FPKM FPKM Экспрессия* 955 Ранние эритроциты костного мозга CD71+, легкое, B-клетки периферической крови CD19+ Гипоталамус, гладкая мускулатура, скелетная мускулатура loss of heterozygosity 12 chromosomal region 1 oxytocin, prepropeptide 773 529 - cytochrome P450, family 4, subfamily V, polypeptide 2 NM_001037732 NM_021109 703 683 609 292 defensin, beta 128 thymosin beta 4, X-linked NM_005663 662 451 Клетки костного мозга CD34+, NK-клетки периферической крови CD56+, эндотелиальные клетки костного мозга CD105+ Клетки костного мозга CD34+, эндотелиальные клетки костного мозга CD105+, эпителиальные клетки бронхов TAF9 RNA polymerase II, TATA box binding protein (TBP)-associated factor, 32kDa chromosome 19 open reading frame 55 BR serine/threonine kinase 1 homeobox C6 LOH12CR1 NM_058169 2293 1365 OXT NM_000915 987 CYP4V2 NM_207352 DEFB128 TMSB4X WHSC2 TAF9 NM_016283 654 484 C19orf55 BRSK1 HOXC6 NM_001039887 NM_032430 NM_153693 434 431 408 384 276 293 DUSP6 NM_022652 377 213 TWF1 NM_002822 367 235 HOXC4 PCDHB7 TP53I11 NM_014620 NM_018940 NM_006034 363 356 346 263 239 203 MRPS15 NM_031280 331 300 NM_001040448 324 239 ЦНС, миндалина, сердечная ткань Адипоциты, спинной мозг, надпочечник Миелоидные клетки костного мозга CD33+, моноциты периферической крови CD14+, эпителиальные клетки бронхов эпителиальные клетки бронхов, гладкая мускулатура, щитовидная железа NK-клетки периферической крови CD56+, кардиомиоциты, печень кардиомиоциты, адипоциты, скелетная мускулатура эпителиальные клетки бронхов, интерстициальные и клетки зародышевого пути яичка Клетки периферической крови CD19+, Клетки костного мозга CD34+, NM_001011 277 128 RPS7 T-клетки периферической крови CD4+ 274 181 DEFB108B NM_001002035 NM_001139456 225 103 Нейроны мерцательного ганглия, поджелудочная железа, надпочечник SVOPL *указаны три типа ткани/клеток с наибольшей экспрессией мРНК, согласно данным GNF Atlas 2 [269]. DEFB131 Описание Wolf-Hirschhorn syndrome candidate 2 dual specificity phosphatase 6 twinfilin, actin-binding protein, homolog 1 (Drosophila) homeobox C4 protocadherin beta 7 tumor protein p53 inducible protein 11 mitochondrial ribosomal protein S15, nuclear gene encoding mitochondrial protein defensin, beta 131 ribosomal protein S7 defensin, beta 108B SVOP-like 83 Таблица 15. Анализ генной онтологии (GeneOntology) 100 мРНК с наибольшим вкладом фрагментов в набор РНК плазмы крови здоровых доноров. Ассоциированные База данных Идентификатор GO-аннотация Р* Ассоциированные гены гены**, % GO:0021510 spinal cord development 0.0021 4.2 [DNAAF3, DPYSL2, LHX5, SUFU] GO_BiologicalProcess GO:0021575 hindbrain morphogenesis 0.0026 5.6 [DNAAF3, HES1, LHX5] GO:0034774 secretory granule lumen 0.0020 4.2 GO:0031093 platelet alpha granule lumen 0.0031 5.8 [PF4, TGFB1, TMSB4X] GO_CellularComponent GO:0031091 platelet alpha granule 0.0031 4.5 GO:0015935 small ribosomal subunit 0.0031 4.5 [MRPS15, RPS26, RPS7] REACTOME:115897 Beta defensins 0.0024 6.8 REACTOME [DEFB108B, DEFB128, DEFB131] REACTOME:115846 Defensins 0.0026 5.6 *значение Р скорректировано по Бонферрони **доля генов, относящихся к GO-аннотации, выраженная в процентном отношении к общему числу генов данной GO-аннотации 84 3.1.4.3 Митохондриальные РНК Глубина покрытия митохондриальной ДНК фрагментами РНК, циркулирующими в плазме крови человека, составляет от 4.2 до 880 прочтений на нуклеотид мтДНК. Такая высокая глубина покрытия мтДНК экспериментальными последовательностями, вероятно, является результатом высокой стабильности мтРНК в циркуляции. Это позволяет предположить, что препараты плазмы содержали целые или незначительно поврежденные митохондрии, находящиеся вне клеток. С помощью метода ОТ-ПЦР митохондриальные РНК ранее были обнаружены в плазме крови пациентов с раком и доброкачественной опухолью простаты [270]. При этом наблюдалась корреляция между уровнем мтДНК и мтРНК в плазме крови, что поддерживает предположение о присутствии в плазме интактных митохондрий, находящихся вне клетки. Известно, что основными формами транспорта цРНК являются апоптотические тельца [98], микровезикулы и экзосомы [37, 38], а также ЛВП [38]. Однако митохондриальные липиды и белки не были обнаружены в экзосомах [271, 272], что указывает на отсутствие митохондрий во фракциях экзосом. Было показано, что при созревании ретикулоцитов млекопитающих происходит выталкивание покрытых мембраной частиц, содержащих митохондрии [273]. Митохондрии также были обнаружены внутри цитоплазматических микровезикул клеток карциномы почки [274, 275]. Установлено, что митохондриальные белки содержатся в микровезикулах и апоптотических тельцах Т-лимфоцитов [276]. Эти данные указывают на то, что апоптотические тельца и микровезикулы являются основными формами транспорта внеклеточных митохондрий. Поэтому митохондриальная РНК может служить маркером крупных мембранных частиц крови, таких как микровезикулы и апоптотические тельца. 3.1.4.4 Длинные некодирующие РНК В результате секвенирования РНК плазмы крови человека нами обнаружены фрагменты длинных некодирующих РНК (днРНК) человека, аннотированных в базах данных RefSeq (Таблица 16) и GENECODE (Таблица 17). Набор днРНК, фрагменты которых обнаружены в плазме крови человека, включает в себя межгенные днРНК, псевдогены, антисмысловые транскрипты, нетранслируемые сплайс-варианты мРНК, а также интронные формы днРНК и хост-гены коротких некодирующих РНК (Таблица 1617). Известно, что межгенные днРНК способны участвовать в регуляции ключевых клеточных процессов, таких как транскрипция, трансляция и сплайсинг [70]. Также 85 предложен ряд механизмов влияния антисмысловых днРНК на экспрессию комплементарных генов, в том числе ингибирование трансляции путем блокирования ассоциации мРНК с рибосомами [277]; стабилизация мРНК-мишени путем образования дуплекса [278]; нарушение сплайсинга мРНК-мишеней, приводящее к экзонизации интронов [279]; сохранение молчащего состояния хроматина [280]. Среди обнаруженных нами в плазме крови РНК, неаннотированных в геномных базах данных (Рисунок 9), также могут содержаться фрагменты новых форм днРНК. Для идентификации новых форм днРНК мы использовали полученный массив последовательностей циркулирующих РНК плазмы крови человека. При этом из анализа исключили последовательности, совпадающие с митохондриальными транскриптами, транскриптами геномных повторов человека и с известными транскриптами человека, аннотированными в базе данных RefSeq. Массив данных, использованный нами для поиска новых форм РНК содержал 310 млн коротких (19 - 35 н.) последовательностей. С помощью программы Cufflinks множество коротких последовательностей было объединено в массивы фрагментов длиной 200 н. и более – предполагаемых предшественников РНК плазмы. В полученный массив данных входят межгенные, интронные, антисмысловые транскрипты, промотор- и терминатор-ассоциированные транскрипты, а также транскрипты геномных повторов человека (всего 79607 потенциальных новых форм РНК) (Таблица 16-17). В настоящее время известны биологические функции лишь небольшого количества днРНК (287 днРНК, по данным на 2015 г. [68]), однако функции фрагментов днРНК неизвестны. Тем не менее, можно предположить, что фрагменты антисмысловых днРНК, обнаруженные нами в результате секвенирования РНК плазмы крови, способны участвовать в регуляции комплементарных РНК-мишеней по механизму, схожему с РНК-интерференцией. 86 Таблица 16. Наиболее представленные в плазме крови здоровых доноров днРНК, аннотированные в базе данных RefSeq. Обозначение Идентификатор* Среднее, FPKM** СО, FPKM*** Описание SOX2OT NR_004053 2291 4621 SMEK3P NR_002784 1243 2010 SRRM2-AS1 NR_027275 542 779 SOX2 overlapping transcript SMEK homolog 3, suppressor of mek1 (Dictyostelium) pseudogene SRRM2 antisense RNA 1 HOXC5 NR_003084 511 1072 homeobox C5 BCYRN1 MSX2P1 NR_001568 NR_002307 243 167 341 402 MSL3L2 NR_024322 101 214 brain cytoplasmic RNA 1 msh homeobox 2 pseudogene 1 male-specific lethal 3 homolog (Drosophila) pseudogene 1 SRGN NR_036430 90 139 P2RX6P NR_002829 79 69 BASP1P1 NR_033774 86 54 *идентификатор транскрипта в базе данных RefSeq **среднее значение FPKM для здоровых доноров ***стандартное отклонение FPKM serglycin purinergic receptor P2X, ligand-gated ion channel, 6 pseudogene brain abundant, membrane attached signal protein 1 pseudogene 1 Подкласс межгенная днРНК псевдоген антисмысловая днРНК нетранслируемый сплайс-вариант мРНК межгенная днРНК псевдоген псевдоген нетранслируемый сплайс-вариант мРНК псевдоген псевдоген 87 Таблица 17. Наиболее представленные в плазме крови здоровых доноров днРНК, аннотированные в базе данных GENECODE. Обозначение Идентификатор* Локализация Среднее, FPKM** СО, FPKM*** AC097500.2 EGFLAM-AS2 AC005682.5 5S_rRNA RP11-717A5.2 ENST00000427108.1 ENSG00000248572.1 ENST00000432668.1 ENSG00000261122.2 ENST00000610137.1 chr2:186,897,618-186,947,960 (-) chr5:38,399,916-38,403,515 (-) chr7:22,893,797-22,901,021 (+) chr16:34,977,639-34,990,886 (+) chr2:85,614,197-85,614,269 (-) 5596 1081 1000 891 678 14180 1839 1844 2193 1101 AC006947.1 ENST00000457168.2 chr17:64,672,490-64,673,522 (+) 513 1356 chr1:155,579,567-155,580,171 (-) RP11-29H23.4 ENSG00000232519.2 ENSG00000234741.3 chr1:173,833,038-173,838,020 (-) GAS5 ENSG00000242828.1 chr3:80,810,193-80,838,114 (-) RP11-47P18.1 ENST00000607090.1 chr6:107,165,327-107,235,416 (-) RP1-60O19.1 *идентификатор транскрипта в базе данных GENECODE 486 357 320 318 1276 944 561 816 **среднее значение FPKM для здоровых доноров ***стандартное отклонение FPKM Подкласс межгенная днРНК антисмысловая днРНК межгенная днРНК повтор 5S рРНК антисмысловая днРНК смысловая интронная днРНК антисмысловая днРНК хост-ген мяоРНК межгенная днРНК межгенная днРНК 88 Для идентификации антисмысловых РНК среди потенциальных новых форм РНК нами был проведен анализ перекрывания геномных координат экспериментальных последовательностей с геномными координатами экзонов известных транскриптов человека (human RefSeq RNA). В результате обнаружено 1669 циркулирующих РНК, координаты которых перекрываются с координатами известных РНК человека. При этом высокий уровень экспрессии (> 100 прочтений) большей части обнаруженных форм наблюдали только в одиночных образцах плазмы. 27 транскриптов обнаружены в 50% и более образцов плазмы крови здоровых доноров и пациентов с НМРЛ. Наши данные согласуются с данными проекта ENCODE, в результате выполнения которого показано, что 80% длинных некодирующих РНК являются низкокопийными РНК и представлены в среднем менее чем одной копией на клетку [67]. Из Таблицы 18 видно, что методом ОТ-ПЦР подтверждено присутствие 6 новых форм антисмысловых РНК в плазме крови и в форменных элементах крови здоровх доноров. Присутствие еще 4 форм антисмысловых РНК было подтверждено только в форменных элементах крови. Результаты проведенных экспериментов подтверждают показанные ранее в работе [67] высокую вариабельность и низкий уровень экспрессии днРНК человека, а также то, что форменные элементы крови являются вероятным источником циркулирующих днРНК. Высокая специфичность экспрессии днРНК для разных типов клеток человека, показанная в работе [67], а также обнаружение нами фрагментов днРНК в системной циркуляции позволяет предположить, что изменение набора циркулирующих в плазме крови фрагментов днРНК может указывать на изменение физиологического состояния организма. 89 Таблица 18. Фрагменты антисмысловых транскриптов, выявленные в плазме и форменных элементах крови человека. Комплементарный ген Идентификатор* Геномные координаты наиболее представленных фрагментов антисмысловых РНК** NR_037600 NM_001190468 chr15:93,426,096-93,426,116 (-) chr5:37,816,111-37,816,131 (+) подтвержден независимым анализом РНК методом ОТ-ПЦР*** в форменных в плазме элементах крови + + + Описание продукта комплементарного гена uncharacterized long non-coding RNA glial cell derived neurotrophic factor prolyl 4-hydroxylase, alpha polypeptide NM_001017962 chr10:74,767,199-74,767,219 (+) P4HA1 + I NM_003569 chr6:132,789,598-132,789,618 (+) syntaxin 7 STX7 general transcription factor IIIC, NM_001521 chr2:27,579,781-27,579,801 (+) GTF3C2 + + polypeptide 2, beta 110kDa NM_005450 chr17:54,672,051-54,672,071 (-) noggin NOG + + NM_001267038 chr5:64,814,359-64,814,379 (+) centromere protein K CENPK + + transforming growth factor, beta NM_001024847 chr3:30,729,946-30,729,966 (-) TGFBR2 receptor II (70/80kDa) MIR663A host gene, long non-coding NR_040095 chr20:26,189,996-26,190,016 (-) MIR663AHG**** + RNA NM_001008781 chr11:92,257,801-92,257,821 (-) FAT atypical cadherin 3 FAT3 + + xenotropic and polytropic retrovirus NM_004736 chr1:180,805,711-180,805,731 (-) XPR1 + receptor 1 von Hippel-Lindau tumor suppressorNM_001004319 chr1:156,268,883-156,268,903 (+) VHLL + + like *идентификаторы генов, комплементарных обнаруженным антисмысловым РНК плазмы крови человека LOC100507217 GDNF **подтверждение присутствия антисмысловых РНК в плазме крови методом ОТ-ПЦР проводили на примере наиболее представленного фрагмента антисмысловых РНК ***для подтверждения присутствия РНК использовали критерии, аналогичные [244] ****обнаруженная антисмысловая РНК перекрывается с has-miR-mizuguchi-146 (идентификатор GenBank: AB372718) 90 3.1.4.5 Новые микроРНК-подобные формы Для поиска новых микроРНК-подобных форм, неаннотированных в базах данных human RefSeq RNA и MirBase, мы использовали программный пакет mirDeep2. Достоверность кандидатов в микроРНК программный пакет mirDeep2 оценивает по ряду параметров: количество прочтений, стабильность вторичной структуры предшественника и соотношение количеств прочтений зрелой микроРНК, предшественника микроРНК и пассажирской последовательности [240]. В результате работы программы mirDeep2, было выявлено 824 кандидата новых микроРНК подобных формы. Далее были выбраны формы, представленные в библиотеках не менее чем 100 копиями и с параметром EPTP не менее 60%. Для дальнейшего рассмотрения мы отобрали последовательности с характерной для пре-микроРНК вторичной структурой (Рисунок 10), геномные координаты которых не перекрывались с известными повторами Alu, L1, MIR и др. Таким образом, для подтверждения данных секвенирования методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени были отобраны 10 микроРНК-подобных форм с количеством прочтений от 120 до 1733 (Таблица 19, Рисунок 10). Из Таблицы 19 видно, что из 10 тестируемых микроРНКподобных форм присутствие 6 форм было выявлено в препаратах суммарных РНК клеток крови человека и в препаратах плазмы крови человека. Принимая во внимание высокую стабильность микроРНК в системной циркуляции [31] и значительный регуляторный потенциал внеклеточных микроРНК (Раздел 1.6), можно предположить, что обнаруженные нами новые микроРНК-подобные формы способны принимать участие в регуляции стабильности и трансляции мРНК-мишеней в клеткахакцепторах. Поиск потенциальных мРНК-мишеней обнаруженных микроРНК-подобных форм проводили с помощью TargetScanHuman Custom [241, 242]. Было установлено, что обнаруженные методом высокопроизводительного секвенирования и подтвержденные методом ОТ-ПЦР микроРНК-подобные формы плазмы крови человека потенциально участвуют в регуляции от 105 до 657 мРНК-мишеней. 91 Рис. 10. Рассчитанные с помощью программного пакета mirDeep2 вторичные структуры предшественников микроРНК-подобных форм, обнаруженных в плазме крови человека. А – микроРНК-подобные формы, подтвержденные независимым анализом методом ОТ-ПЦР; Б – неподтвержденные формы. Красным шрифтом выделены нуклеотиды зрелой формы микроРНК, голубым – нуклеотиды пассажирской последовательности, зеленым – нуклеотиды соединительной последовательности. 92 Таблица 19. Новые микроРНК-подобные формы, выявленные в плазме и форменных элементах крови человека Идентификатор* Число прочтений Геномные координаты зрелой формы РНК chr16_81233 chr14_75567 chr8_48278 chr12_66154 chr9_53386 chr2_13591 chr7_42652 chr4_25712 chr12_67873 chr6_39987 1733 1571 1482 435 284 258 245 187 141 120 chr16:49,975,771-49,975,793 (-) chr14:47,706,338-47,706,360 (-) chr8:70,015,239-70,015,261 (+) chr12:29,171,592-29,171,614 (+) chr9:80,136,453-80,136,475 (+) chr2:84,977,939-84,977,961 (-) chr7:51,918,067-51,918,089 (+) chr4:146,901,775-146,901,797 (+) chr12:5,148,529-5,148,551 (-) chr6:71,771,107-71,771,129 (-) подтвержден независимым анализом РНК методом ОТ-ПЦР** в в плазме форменных крови элементах + + + + + + + + + + + + - *индивидуальный идентификатор присвоен программным пакетом miRDeep2 **для подтверждения присутствия РНК использовали критерии, аналогичные [244] В набор потенциальных мРНК-мишеней микроРНК-подобных форм входят мРНК протоонкогена MAF, фактора сплайсинга пре-мРНК SFRS3, а также мРНК транскрипционного фактора NR2C2, принимающего участие в регуляции развития нервной, мышечной и костной ткани, апоптоза рака простаты и метаболических процессов [281]. В результате анализа in silico нами установлено, что все шесть подтвержденных методом ОТ-ПЦР микроРНК-подобных форм потенциально принимают участие в регуляции мРНК гена TNRC6B, продукт которого входит в семейство белков GW182. Известно, что белки семейства GW182 способствуют связыванию деаденилазного комплекса с полиА-последовательностью мРНК-мишени и необходимы для микроРНК-зависимой репрессии трансляции и миРНК-зависимого гидролиза комплементарных мРНК-мишеней белками семейства AGO [55, 282]. Согласно проведенному с помощью плагина ClueGo для программы Cytoscape анализу генной онтологии (Таблица 20) видно, что продукты потенциальных мРНК-мишеней новых микроРНК-подобных форм принимают участие в регуляции множества ключевых клеточных процессов, таких как метилирование и убиквитинирование белков, транспорт и гидролиз мРНК, а также в развитии и дифференцировке нервной, мышечной и легочной тканей организма (Таблица 20). 93 Таблица 20. Анализ генной онтологии (GeneOntology) потенциальных мРНК-мишеней новых микроРНК-подобных форм. Идентификатор GO:0042692 GO:0006479 GO:0060038 GO:1902115 GO:0031032 Аннотация chr16_81233 muscle cell differentiation protein methylation cardiac muscle cell proliferation regulation of organelle assembly actomyosin structure organization 6.5*10-3 7.4*10-3 7.8*10-3 3.5*10-2 4.0*10-2 GO:0007275 GO:0044260 GO:0048513 GO:0016043 GO:0050794 chr12_66154 multicellular organismal development cellular macromolecule metabolic process organ development cellular component organization regulation of cellular process 3.2*10-11 2.5*10-7 2.5*10-7 8.6*10-7 1.3*10-6 GO:0050680 GO:0001764 GO:0007423 GO:0000910 GO:0043928 GO:0030219 GO:0021953 WP:138 GO:0048015 GO:0042787 chr2_13591 negative regulation of epithelial cell proliferation neuron migration sensory organ development cytokinesis exonucleolytic nuclear-transcribed mRNA catabolic process involved in deadenylation-dependent decay chr7_42652 megakaryocyte differentiation central nervous system neuron differentiation Androgen receptor signaling pathway phosphatidylinositol-mediated signaling protein ubiquitination involved in ubiquitindependent protein catabolic process Р* 4.3*10-3 2.8*10-2 2.9*10-2 2.9*10-2 3.9*10-2 2.6*10-3 3.0*10-3 9.3*10-3 1.6*10-2 2.7*10-2 chr4_25712 GO:0030324 GO:0030323 GO:0048596 GO:0006406 GO:0006513 lung development respiratory tube development embryonic camera-type eye morphogenesis mRNA export from nucleus protein monoubiquitination chr12_67873 GO:0007399 nervous system development GO:0051254 positive regulation of RNA metabolic process GO:0009890 negative regulation of biosynthetic process GO:0009790 embryo development GO:0007420 brain development *значение Р скорректировано по методу Бонферрони 1.1*10-4 1.2*10-4 4.2*10-4 1.7*10-2 1.9*10-2 6.3*10-13 1.8*10-12 4.0*10-7 8.6*10-7 4.1*10-6 94 Обнаружение в системной циркуляции микроРНК-подобных форм, потенциальных регуляторов жизненно-важных процессов в организме человека, подтверждает значимую биологическую роль циркулирующих РНК плазмы крови и позволяет предложить обнаруженные микроРНК-подобные формы в качестве биологического агента для создания новых терапевтических препаратов, действующих по принципу РНК-интерференции. 3.1.5 Сравнение вклада отдельных форм РНК плазмы крови здоровых доноров и пациентов с НМРЛ Известно, что показатель смертности среди больных с диагнозом рак легкого значительно варьирует в зависимости от стадии заболевания [283]. Выживаемость в течение пяти лет после лечения пациентов I стадии составляет 70%, а IV стадии – менее 5%. К сожалению, выявляемость заболевания на I-II стадии составляет 26.4%, на III-IV стадии заболевания - 70.1% [283]. Таким образом, основная причина высокой смертности от рака легкого связана с поздним выявлением заболевания. Диагностический потенциал изменения уровня отдельных микроРНК при онкологических заболеваниях показан во многих исследованиях (Раздел 1.7.4). Также известно, что микроРНК способны оказывать значительное влияние на рост онкотрансформированных клеток, стимулировать и подавлять процессы метастазирования [152]. Проведенный нами сравнительный кластерный анализ представленности индивидуальных микроРНК показал, что наборы микроРНК плазмы крови здоровых доноров и пациентов с НМРЛ образуют два отдельных кластера с коэффициентом корреляции Спирмена ~0.275 (Рисунок 11). При этом корреляционный анализ не выявил сходства наборов РНК внутри группы здоровых доноров по возрасту и полу, а также сходства по гистологическому типу опухоли внутри группы пациентов с НМРЛ. Аналогичные данные по кластеризации наборов транскриптов получены также для других классов циркулирующих РНК – фрагментов мРНК и днРНК. Эти данные указывают на то, что в наборе циркулирующих РНК присутствуют потенциальные диагностические формы РНК, индивидуальная представленность которых в плазме крови различается между группами здоровых доноров и пациентов с НМРЛ. Для того чтобы выявить и охарактеризовать наиболее значимые различия в наборах РНК плазмы крови здоровых доноров и пациентов с НМРЛ, нами был проведен анализ вклада отдельных форм РНК (FPKM) в массивах данных высокопроизводительного секвенирования. Было обнаружено, что представленность 567 транскриптов (319 RefSeq РНК, 233 зрелых формы микроРНК и 15 новых РНК, не аннотированных в базе данных RefSeq) в плазме крови 95 достоверно различается между группами здоровых доноров и пациентов с немелкоклеточным раком легкого (Р < 0.01, критерий Манна-Уитни-Уилкоксона). Рис. 11. Сравнительный кластерный анализ представленности индивидуальных микроРНК (пре-микроРНК) в массивах данных высокопроизводительного секвенирования, проведенный с помощью программного пакета MEV v.4.7.4. Для анализа использованы данные о представленности (FPKM) всего набора пре-микроРНК в массиве данных human RefSeq RNA. Кластеризация проведена по методу ранговой корреляции Спирмена. Приведен фрагмент тепловой карты. Выявленные дополнительному транскрипты, анализу с потенциальные использованием маркеры следующих рака легкого, критериев: подвергли отличие в представленности транскриптов обусловлено разницей количества прочтений одного и того же фрагмента транскрипта (принцип использования критерия иллюстрирован на Рисунке 12); индивидуальный фрагмент РНК представлен не менее чем 100 экспериментальными последовательностями в кДНК-библиотеках РНК здоровых доноров либо пациентов с НМРЛ (допускается исключение для одной кДНК-библиотеки); фрагменты не содержат одно- и динуклеотидные повторы с n > 4. 96 Рис. 12. Анализ распределения экспериментальных последовательностей по мРНК гена WHSC2 (NM_005663) (А) и HOXC6 (NM_153693) (Б), направленный на поиск диагностически значимых фрагментов РНК. Построение распределения экспериментальных данных проводили с помощью программы последовательностей. экспериментальных IGV v.2.1.20. Прямоугольной "Reads" рамкой последовательностей. – количество выделены Стрелками указан экспериментальных максимумы распределения диагностически значимый фрагмент мРНК WHSC2. Диагностически значимых фрагментов мРНК HOXC6 не обнаружено. Таким образом, нами был определен набор РНК, в который входят 19 фрагментов мРНК, 4 фрагмента мяоРНК, 8 новых форм РНК и 7 микроРНК (Таблица 21, 22). Также определен набор контрольных фрагментов РНК, представленность которых в кДНК-библиотеках здоровых доноров и пациентов с НМРЛ характеризовалась низким разбросом от донора к донору. В контрольный набор входят 3 фрагмента мРНК и 3 микроРНК (Таблица 23). 97 Для анализа изменения относительного содержания выбранных РНК в препаратах плазмы был проведен подбор систем праймеров и условий проведения ОТ-ПЦР с использованием суммарной РНК плазмы крови здоровых доноров (Таблица 4-7, 21-23). Таблица 21. Фрагменты мРНК и днРНК, присутствие которых достоверно (P < 0.01) различалось в препаратах плазмы крови здоровых доноров и пациентов с НМРЛ по данным высокопроизводительного секвенирования. Обозначение Экспрессия при НМРЛ Последовательность HIST1H2AE CYP11B2 PEX6 MRPS17 DTX1 TBC1D21 HLA-DPA1 AKR1CL1 OR1OX1 ATF4 SOXT2OT WHSC2 DUSP6 GIGYF1 TWF1 TP53I11 LOH12CR1 MTERFD2 XAGE5 увеличение увеличение увеличение увеличение увеличение увеличение увеличение увеличение увеличение увеличение снижение снижение снижение снижение снижение снижение снижение снижение снижение UCGGGCAAAAGCUAAAACGCGUU CAGGAACUUCCACCACGUGCCCU GACAAAACUGCAGGCCAUCUUCU UGUCCAGUUUCUCUGUGGUGUUU CCCAUCUCCAGGCCUUCUGUCUG CCCAUCUCCGAAAAGGAUUAAGC AGUGGCUGACUGAAUUGCUGACC AGUGAAACUGCCAAUGUCUGCAC AACUUGUGGCCUCUGCUUGCACU CCCAUCUCCAGGUGUUCUCUGUG UUCUCCUAAUUUAAUUAUUUCAA GAGGCGAAGCGGAGAAGGAAGAC CUUUUCUAAUCCAAAGGGUAUAU AGGGCGAAGCGGGAGGAAGAGGA AAGAGGAUUCCCAAGGAUUCAGC GGGCCUCGGCUUCCCUUUGGCUC CAAAUAGGGCCUCUCCUUCUCCC GGAGCUAGAGAGGGUCAUGAGUU GAAGGAGGGGAAGGGAAACCACA Плазма крови, dCt**** Ct* 39.3 50+** 40.5 50+ 40.8 50+ 29.4 12.3 27.8 11.4 37.6 7.5 25.7 6.5 32.4 6 37.9 2.7 32.6 2.35 н/д*** н/д 34.6 50+ 25.2 17.5 24.9 13.9 24.3 13.4 20.3 12.2 29.6 11.6 31.6 7.1 38.7 2.14 *представлено среднее значение Ct ОТ-ПЦР РНК плазмы крови здорового донора. Стандартное отклонение Ct не превышало 1.0 **значение "50+" показывает, что значение Сt при амплификации контрольного образца РНК без обратной транскрипции было ниже 50 ***значение "н/д" означает, что фрагмент РНК не выявлен в плазме крови здорового донора ****разница значении Ct при амплификации РНК-матриц плазмы крови подвергнутых и не подвергнутых обратной транскрипции. 98 Таблица 22. Фрагменты некодирующих РНК, присутствие которых достоверно (P < 0.01) различалось в препаратах плазмы здоровых доноров и пациентов с НМРЛ по данным высокопроизводительного секвенирования. Обозначение Экспрессия при НМРЛ hsa-miR-148b-3p hsa-miR-29a-3p hsa-miR-1287 hsa-miR-563 hsa-miR-892b hsa-miR-449b hsa-miR-10b-5p увеличение увеличение увеличение увеличение увеличение увеличение снижение SNORD74 SNORD45A SNORD27 SNORD50A увеличение увеличение увеличение увеличение XLOC_042973 XLOC_064897 XLOC_075858 XLOC_033938 XLOC_017329 XLOC_056262 XLOC_004265 XLOC_045331 увеличение увеличение увеличение увеличение увеличение увеличение снижение снижение Последовательность микроРНК AGUGCAUCACAGAACUUUGUCUC CUAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA UGCUGGAUCAGUGGUUCGAGUCU UUGACAUACGUUUCCCUGGUAGC GCUCCUUUCUGGGUAGAGCAAGG GUCAGCAGCCACAACUACCCU ACCCUGUAGAACCGAAUUUGUGU мяоРНК AAUGCCAACCGCUCUGAUGGCGG GUCAAUGAUGUGUUGGCAUGUAU AGUGAUGUCAUCUUACUACUGAG UUUACGGAUCUGGCUUCUGAGAU новые формы РНК CCAGGUGUUAUCCUUCAACAU UGACUAGAUGUCAAUGAAUUAUC CGUGGCUUCGUCCAUCGAUUCUU CCAGGUCAAUAGAGUCAUGUACC UACUUGGUUAUCCUGAGGUGCAG AUGCUACAAAGCUAAAAUAACCA GAAAUAGGGCCAGAAAGGAGUAGAA CCUCGAUCUCUCAACACGUUGUCCUUCAU Плазма крови, Ct* dCt **** н/д *** 40 31 30.4 29.1 28.7 21.4 н/д 50+** 10.9 10.7 10.3 8.43 16.5 44.5 28.3 31.9 27 50+ 10.2 8.94 8.4 н/д 45 37.4 32 31.8 42.2 21.4 35.5 н/д 50+ 8.44 7.11 6.11 -1.53 19.5 -3.05 *представлено среднее значение Ct ОТ-ПЦР РНК плазмы крови здорового донора. Стандартное отклонение Ct не превышало 1.0 **значение "50+" показывает, что значение Сt при амплификации контрольного образца РНК без обратной транскрипции было ниже 50 ***значение "н/д" означает, что фрагмент РНК не выявлен в плазме крови здорового донора ****разница значении Ct при амплификации РНК-матриц плазмы крови подвергнутых и не подвергнутых обратной транскрипции. Из данных Таблиц 21 - 22 видно, что ряд коротких РНК (фрагмент мРНК SOXT2OT, hsamiR-148b-3p и XLOC_042973) не детектируются в плазме крови здоровых доноров (Ct > 50). В набор диагностически значимых РНК с высоким значением dCt входят фрагменты мРНК генов WHSC2 (компонент фактора негативной регуляции элонгации РНК полимеразой II) и MRPS17 (белок малой субъединицы митохондриальных рибосом) (Таблица 21), а также микроРНК miR- 99 29a, участвующая в регуляции дифференцировки остеобластов и миелоидных клеток, апоптоза клеток острого миелоидного лейкоза [284] (Таблица 22). В набор контрольных фрагментов РНК входит фрагмент мРНК гена CENPB (высококонсервативный ДНК-связывающий белок, участвующий в формировании центромер) и микроРНК-451, принимающая участие в дифференцировке эритроцитов в норме [285] (Таблица 23). Таблица 23. Контрольные фрагменты мРНК и микроРНК с низким разбросом от донора к донору по данным высокопроизводительного секвенирования. Обозначение CENPB IDUA IKBKG hsa-miR-451 hsa-miR-103 hsa-miR-191 Плазма крови, Ct* мРНК GGCCUGCGGCAUGUGCAGCUGGC 23.2 мРНК GCGGAACCGGCAGUGCAGCCCGA 32.4 мРНК GAGGAAGCGGCAUGUCGAGGUCU 29.6 микроРНК AAACCGUUACCAUUACUGAGUUU 27.3 микроРНК AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA 18.8 микроРНК CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG 23 Класс Последовательность dCt*** 12.6 8.6 6.04 50+** 12.7 8.78 *представлено среднее значение Ct ОТ-ПЦР РНК плазмы крови здорового донора. Стандартное отклонение Ct не превышало 1.0 **значение "50+" показывает, что значение Сt при амплификации контрольного образца РНК без обратной транскрипции было ниже 50 ***разница значении Ct при амплификации РНК-матриц плазмы крови подвергнутых и не подвергнутых обратной транскрипции. Для анализа диагностической значимости обнаруженных в плазме крови РНК-маркеров НМРЛ мы проводили ОТ-ПЦР РНК плазмы крови здоровых доноров и пациентов с НМРЛ (Таблица 24). Для этого были использованы препараты плазмы крови 11 здоровых доноров и 10 пациентов с НМРЛ. Нормализацию данных ОТ-ПЦР проводили по методу ΔΔCt [286], с помощью внутреннего контроля – фрагмента мРНК CENPB (ΔCtХ=CtХ-CtCENPB). Было установлено, что представленность в плазме крови микроРНК-451, фрагмента мРНК WHSC2 и микроРНК-29а достоверно различается в группах здоровых доноров и пациентов с НМРЛ (P < 0.01, критерий Манна-Уитни-Уилкоксона) (Таблица 24). Диагностическую значимость разработанных систем оценивали с помощью ROC-анализа (receiver operating characteristic, операционная характеристика приёмника) [249, 250]. Были определены значения AUC (Area under the curve, площадь под кривой) для индивидуальных маркеров микроРНК-451, WHSC2, микроРНК-29а, MRPS17 (Таблица 24). Известно, что чем ближе значение AUC к 1.0, тем более точным является диагностический метод [249, 250]. Из Таблицы 24 видно, что наибольшее значение AUC (0.97) получено при использовании в качестве маркера фрагмента мРНК WHSC2. 100 Таблица 24. Анализ относительного вклада микроРНК-451, микроРНК29-a, фрагментов мРНК WHSC2 и MRPS17 в РНК плазмы крови группы здоровых доноров и группы пациентов с НМРЛ. Маркер mir451 WHSC2 mir29-a MRPS17 Здоровые доноры* 8.0 10.4 17.7 6.2 Здоровые доноры, СО** 2.2 0.8 2.0 1.8 Пациенты НМРЛ* 14.7 13.3 22.5 6.4 Пациенты НМРЛ, СО** 4.6 1.2 3.9 0.9 P*** 0.0086 0.0014 0.0034 0.4869 AUC**** Чувствительность***** Специфичность 0.91 0.97 0.85 0.51 80% 100% 80% --- 82% 82% 82% --- *представлены средние нормализованные значения ΔCt, рассчитанные по формуле ΔCt=Ct-CtCENPB с использованием в качестве нормализовочного контроля значения Ct для фрагмента мРНК CENPB. **стандартное отклонение среднего ΔCt. ***значения вероятности для U-критерия Манна-Уитни–Уилкоксона. ****значение AUC ROC-анализа [250]. *****указаны значения чувствительности и специфичности. 101 Тенденции к изменению представленности потенциальных РНК-маркеров между группами здоровых доноров и пациентов с НМРЛ, полученные при использовании метода ОТПЦР в режиме реального времени, коррелируют с полученными ранее с помощью высокопроизводительного секвенирования данными лишь частично, для фрагментов генов CENPB и WHSC2. С помощью ОТ-ПЦР также обнаружено достоверное снижение представленности микроРНК-451 в группе пациентов (Таблица 24), в то время как по данным секвенирования достоверных различий между группами здоровых доноров и пациентов обнаружено не было. Увеличение представленности микроРНК-29а и фрагмента MRPS17 в группе пациентов с НМРЛ, обнаруженное с помощью секвенирования, при использовании метода ОТ-ПЦР с нормализацией по методу ΔΔCt на фрагмент гена CENPB не подтвердилось (Таблица 24). Известно, что использование отличающихся методик при анализе такого сложного объекта как внеклеточные РНК является причиной расхождений в результатах исследования диагностического потенциала микроРНК-486 в работах Hu и соавт. [204] и Boeri и соавт. [210]. Однако даже использование одинаковых методов не гарантирует полного совпадения результатов при поиске диагностических РНК-маркеров онкологических заболеваний (Раздел Это 1.7.4). связано с высокой степенью фрагментированности и вариабельности циркулирующих РНК, а также с отсутствием общепринятой молекулярной классификации большинства разновидностей рака, в том числе рака легкого. Поэтому сложность исследуемого объекта, а именно высокая степень фрагментированности и вариабельности РНК, может являться причиной несоответствия тенденций, обнаруженных при использовании методов высокопроизводительного секвенирования и ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Тем не менее, обнаружение достоверных отличий в представленности в плазме крови микроРНК-451, фрагмента мРНК WHSC2 и микроРНК-29а с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени указывает на высокий потенциал данных фрагментов РНК для создания диагностических ОТПЦР систем немелкоклеточного рака легкого. Ранее было показано, что концентрация микроРНК-451 снижена в плазме крови пациентов с немелкоклеточным раком легкого [210]. Известно также, что микроРНК-451 является онкосупрессором и гиперэкспрессия этой микроРНК вызывает снижение пролиферации клеток аденокарциномы легкого А549 [287]. Использование микроРНК-451 в качестве диагностического маркера было предложено для пациентов с раком желудка [212]. Повышение уровня циркулирующей микроРНК-29а наблюдали при преэклампсии [12], диабете 1-го типа [184], раке молочной железы [201] и хроническом лимфолейкозе [226] (Таблица 2). 102 Таким образом, в данной работе была подобрана ОТ-ПЦР система для анализа микроРНК-451, фрагмента мРНК WHSC2, микроРНК-29a и контрольной РНК – фрагмента мРНК CENPB, в плазме крови человека. Использование этой системы при анализе РНК плазмы крови группы пациентов с НМРЛ и группы здоровых доноров позволяет выявлять НМРЛ с чувствительностью и специфичностью более 80%. Наши данные показывают, что микроРНК451, микроРНК-29а, а также фрагменты мРНК WHSC и CENP могут быть использованы для дальнейшей разработки ОТ-ПЦР систем диагностики злокачественных новообразований легкого. 3.2 Влияние аналогов РНК плазмы крови человека на жизнеспособность клеток человека в культуре Известно, что внеклеточные РНК способны осуществлять межклеточную регуляцию физиологических процессов в организме (Раздел 1.6 Биологические функции циркулирующих РНК). Показано, что короткие РНК могут влиять на экспрессию генов по рецепторопосредованному механизму и механизму РНК-интерференции. Так, например, вирусные РНК способны индуцировать пути врожденного иммунного ответа при взаимодействии с рецепторами TLR3 и TLR7 [138], а инкубация культуры клеток с комплексами ЛВП-микроРНК223 приводит к снижению экспрессии репортерного гена люциферазы [38]. Известно также, что протяженные кодирующие РНК (мРНК) могут транспортироваться по кровяному руслу, проникать в клетки-реципиенты и транслироваться с образованием чужеродных для клеткиреципиента белковых молекул [50, 95]. Вместе с тем, влияние некодирующих внеклеточных РНК на жизненно важные процессы в клетках человека исследовано лишь частично. Ранее нами определены последовательности нескольких форм РНК плазмы крови человека, среди которых обнаружены фрагменты рРНК, тРНК, мяоРНК, пре-мРНК, а также микроРНК-подобные малые РНК [288]. Чтобы определить влияние внеклеточных РНК на клетки человека, мы синтезировали серии аналогов таких РНК и оценили их действие на жизнеспособность клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 в культуре. Клетки линии MCF-7 были выбраны в данной работе как модель для исследования действия аналогов циркулирующих РНК, так как данная клеточная линия является одной из наиболее охарактеризованных моделей для изучения процессов карценогенеза [289, 290] и метастазирования [291], ответа злокачественных опухолей на стероидные гормоны [292], а также для исследования действия биологически-активных соединений и новых терапевтических препаратов на клетки человека [293, 294]. Кроме того, клетки MCF-7 являются одной из самых востребованных линий для молекулярно-биологических и генетических исследований с описанным набором геномных перестроек и особенностей транскриптома [295, 296]. 103 Установлены механизмы гибели клеток MCF-7 по пути апоптоза и аутофагии [297], описан механизм снижения жизнеспособности клеток MCF-7 под действием липидных молекул [298, 299] и ряда микроРНК человека [300, 301]. 3.2.1 Снижение жизнеспособности клеток MCF-7 под действием аналогов РНК плазмы крови человека Аналоги обнаруженных ранее в плазме крови фрагментов клеточных РНК (Таблица 25) синтезировали с помощью транскрипции нуклеотидных конструкций, содержащих последовательности ДНК, комплементарные циркулирующим РНК, в системе in vitro. Анализ влияния аналогов РНК плазмы на изменение жизнеспособности клеток MCF-7 проводили с помощью MTT-теста. Таблица 25. Предполагаемые геномные предшественники внеклеточных РНК плазмы крови человека, обнаруженных в работе [288]. № 1. 2. 3. Позиция в геноме (hg19) chr10: 126,702,871 - 126,702,980 chr8: 144,944,466 - 144,944,488 chr13: 58,561,232 - 58,561,341 Длина, н. 110 24 - 25 119 4. chr17: 25,988,756 - 25,988,773 21 - 22 5. chr5: 88,129,890 - 88,129,909 30 Описание Alu-повтор в интроне пре-мРНК белка 2, связывающего С-конец (CTBP2) фрагмент мРНК гена эпиплакина 1 (EPPK1) фрагмент второй рамки считывания повтора L1MA5 фрагмент межгенной днРНК ENST00000583179.1 (RP11-19P22.5) (GENECODE) фрагмент интрона пре-мРНК энхансерфактора миоцитов 2C (MEF2C) Из данных Рисунка 13 видно, что наибольшее понижение жизнеспособности клеток MCF-7 (40%) вызывал комплементарный аналог Alu РНК (Рисунок 13, “1-”). Комплементарный аналог фрагмента экзона гена эпиплакина (Рисунок 13, "2-") вызывал снижение жизнеспособности клеток MCF-7 на 35%. Прямой аналог Alu РНК плазмы крови человека, РНК/РНК дуплекс L1-повтора, а также двуцепочечный фрагмент межгенной днРНК RP1119P22.5 вызывали снижение жизнеспособности клеток более чем на 20% (Рисунок 13, “1+”, “3±”,“4±”). Использованная в качестве контроля суммарная РНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae, также как и ряд аналогов РНК плазмы крови человека не оказывали существенного влияния на жизнеспособность клеток MCF-7 (Рисунок 13). Следовательно, можно заключить, что РНК плазмы крови человека, содержащие и прямой, и комплементарный аналог Alu РНК, РНК-РНК 104 - ORF2 L1-транскрипта и днРНК RP11-19P22.5, а также РНК, комплементарную фрагменту гена EPPK1, способны подавлять жизненно важные процессы в культивируемых клетках человека. Рис. 13. Влияние аналогов внеклеточных РНК плазмы крови человека на жизнеспособность клеток MCF-7 в культуре. Трансфекцию РНК проводили безприменения трансфицирующих агентов. Жизнеспособность клеток MCF-7 (МТТ-индекс), инкубированных: без РНК - контроль; с суммарной РНК Saccharomyces cerevisiae - дРНК; числовые обозначения cоответствуют аналогам циркулирующих РНК №1-5, представленным в Таблице 25. Обозначение "+" соответствует прямым аналогам РНК, обозначение "-" соответствует РНК, комплементарным РНК плазмы крови человека, обозначение "+-" соответствует РНК-РНК дуплексам. "*" – для указанных образцов при сравнении с контролем P < 0.05 (t-критерий Стьюдента). Среди прямых аналогов РНК плазмы крови человека наибольшее достоверное снижение жизнеспособности оказывала Alu-содержащая РНК. Alu повторы являются наиболее многочисленными мобильными элементами генома человека, представлены ~1.1*106 копий и занимают 10.6% ядерной ДНК человека [302]. Alu-повтор человека состоит из двух мономеров, разделенных олигоА-последовательностью и гомологичных Alu-домену гена 7SL РНК (Рисунок 14) [303]. 7SL РНК входит в состав Signal Recognition Particle (SRP) - частицы, распознающей сигнальный пептид. Количество полноразмерных Pol III Alu транскриптов составляет 102 - 103 молекул на клетку [304]. Регуляция экспрессии Alu-РНК в клетках человека отличается от регуляции других Pol III-транскриптов. Ингибитор трансляции циклогексимид и тепловой шок увеличивают экспрессию Alu-РНК в большей степени, чем других Pol III-транскриптов, таких, как 7SL, 7SK, 5S и U6 РНК [304]. Образование новых копий Alu- и родственных им SINE- 105 повторов в геноме млекопитающих происходит по механизму ретротранспозиции, который включает стадию образования РНК-копий SINE-ДНК [303]. Рис. 14. Вторичная структура Alu РНК (а) и 7SL РНК (б) в соответствии с данными [305]. Известно, что трансфекция клеток HeLa ДНК-конструкциями, содержащими транскрипционно активные Alu-повторы, а также конструкциями, кодирующими 7SL РНК, вызывает подавление репликации ДНК, ингибирует трансляцию и оказывает антипролиферативное действие [126 306]. Установлено, что трансфекция клеток HEK 293 почки эмбриона человека ДНК, кодирующей Alu-повторы, приводит к специфической активации экспрессии репортерных генов [307]. Как и 7SL РНК, Alu транскрипты прочно связываются с белками SRP9 и SRP14, а образующийся комплекс Alu-SRP9/14 способен взаимодействовать с А-участком рибосомы и ингибировать трансляцию суммарной мРНК клеток HeLa in vitro в экстрактах зародышей пшеницы [305]. Кроме того известно, что Aluсодержащие РНК, не связанные с белками SRP9/14, могут активировать трансляцию in vitro [305]. При изучении географической атрофии сетчатки установлено, что гибель клеток пигментного эпителия сетчатки сопровождается снижением экспрессии гена DICER1 и накоплением AluSc-транскрипта [308]. Показано, что РНКаза Dicer1 гидролизует Alu-РНК in vitro, и что снижение экспрессии DICER1 приводит к накоплению AluSc-РНК, которая подавляет жизнеспособность и вызывает апоптотическую гибель клеток эпителия сетчатки [308]. При этом увеличение уровня экспрессии Alu-РНК рассматривается в качестве основной причины гибели клеток при географической атрофии сетчатки [308, 309]. Постоянное присутствие полноразмерных Alu-транскриптов в цитоплазме, а также увеличение экспрессии этих РНК при стрессе, с одной стороны, указывает на Alu-РНК как на строго контролируемый эндогенный фактор мутагенеза, а с другой, позволяет предположить, что Alu-РНК являются регуляторами жизненно важных клеточных процессов [305, 310]. Для анализа влияния Alu и 7SL РНК на жизнеспособность и активацию проапоптотических 106 процессов в клетках аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 мы синтезировали полноразмерные аналоги этих РНК. 3.2.2 Влияние аналогов Alu и 7SL РНК на проапоптотические процессы в клетках аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 Аналоги Alu и 7SL РНК получали методом транкрипции in vitro ДНК-конструкций, полученных при амплификации геномной ДНК клеток MCF-7. Из Рисунка 15 видно, что полученные аналоги отличаются от природных РНК добавлением с 5' и 3' (Alu) или только с 5'конца (7SL) последовательностей, фланкирующих Alu и 7SL в геноме человека. Для характеризации биологических свойств полученных аналогов Alu и 7SL РНК использовали комплексный подход, включающий определение изменения жизнеспособности, клеточной мембраны и трансмембранного потенциала митохондрий клеток MCF-7, трансфицированных аналогами Alu РНК и 7SL РНК (Таблица 26). Из данных Таблицы 26 видно, что аналоги Alu РНК и 7SL РНК, также как и циркулирующий фрагмент Alu повтора (Рисунок 13), вызывают достоверное снижение жизнеспособности клеток MCF-7 в условиях трансфекции с липофектамином (P < 0.05). Рис. 15. ДНК-конструкции, кодирующие аналоги Alu (А) и 7SL РНК (Б). Бокс А, Бокс В – внутренний промотор РНК полимеразы III. Аn – олиго-А-последовательность. Рамкой выделены участки, кодирующие природные Alu (А) и 7SL РНК (Б). * - Последовательности, фланкирующие Alu и 7SL в геноме человека. Для оценки степени индукции проапоптотических процессов в клетках MCF-7 под действием Alu- и 7SL РНК мы провели анализ изменений трансмембранного потенциала митохондрий m с использованием индикатора JC-1 и анализ появления фосфатидилсерина на внешней поверхности мембраны клеток с помощью системы аннексин V/PI (Таблица 26). 107 Таблица 26. Влияние аналогов Alu РНК и 7SL РНК на жизнеспособность, асимметрию и проницаемость цитоплазматической мембраны и трансмембранный потенциал митохондрий клеток MCF-7 Снижение жизнеспособности (MTT-индекс** ± SD, %) 7SL РНК Alu РНК РНК MCF-7 Липофектамин Трансмебранный потенциал митохондрий δ**** Проапоптотические изменения мембраны*** AnnV-/PI(жизнеспособные клетки, %) AnnV+/PI(апоптототические тельца, %) 69.2 68.7 85.2 89.9 19.3 13.8 7.4 6.8 19.0±4.8 15.3±6.5 -2.8±8.2 0±2.5 Ann+/PI+ (вторичные некротические клетки, %) 11.5 17.5 7.3 3.3 без диссипации с диссипацией 83.4 85.6 97.9 99.7 16.6 14.4 2.1 0.3 *трансфекцию клеток проводили 1 мкг/мл РНК в комплексе с липофектамином. **за 100% принимали жизнеспособность (MTT-индекс) клеток, инкубированных в среде с липофектамином без РНК. ***изменения мембраны клеток анализировали c использованием ФИТЦ-меченого аннексина V (Ann V) и пропидий йодида (PI) методом проточной цитофлуориметрии. ****диссипацию трансмембранного потенциала митохондрий оценивали окраской клеток митохондриальным красителем JC-1, с последующим анализом препаратов проточной цитофлуориметрией. 108 В митохондриях жизнеспособных клеток индикатор JC-1 образует агрегаты со спектром флуоресценции, смещенным в длинноволновую область (max = 590 нм). Диссипация трансмембранного потенциала митохондрий m сопровождается сдвигом максимума спектра флуоресценции индикатора в зеленую область (max = 527 нм). Анализ клеточных препаратов методом проточной цитофлуориметрии в присутствии индикатора JC-1 позволяет оценить относительный вклад популяции клеток с проапоптотическими изменениями мембраны митохондрий [246, 311]. Установлено, что снижение жизнеспособности клеток MCF-7 под действием аналога 7SL РНК сопровождается снижением трансмембранного потенциала m примерно в 17% клеток (Таблица 26). При этом действие 7SL РНК не отличалось от действия аналога Alu РНК (P > 0.05). Таким образом, данные об изменении потенциала митохондрий m согласуются с результатами анализа жизнеспособности с использованием MTT-теста. Аннексин V – белок, который специфично связывает фофатидилсерин (PS). В норме PS локализуется преимущественно на внутренней поверхности мембраны клетки. При апоптозе нарушается работа мембранных транспортеров, обеспечивающих ассиметричное распределение PS, и происходит увеличение доли PS, экспонированного на внешней поверхности мембраны клеток и апоптотических телец [312]. Из данных Таблицы 26 видно, что трансфекция клеток MCF-7 аналогами Alu и 7SL РНК приводит к появлению постклеточных структур, экспонирующих на внешней поверхности фосфатидилсерин, а также структур, мембрана которых проницаема для пропидий-йодида – апоптотических и вторичных некротических телец. Суммарный вклад апоптотических и вторичных некротических телец в общую популяцию клеток, трансфицированных аналогом Alu РНК или аналогом 7SL РНК, составил ~ 31% (Таблица 26). Экспозиция фосфатидилсерина на внешней поверхности цитоплазматической мембраны, детектируемая по окраске аннексином V, является одним из самых ранних биохимических признаков апоптоза [312]. В то же время, снижение активности митохондриальных и цитоплазматических оксидоредуктаз и изменение уровня NADH/NADPH, детектируемое с помощью MTT-теста [313], характерно для поздних стадий апоптоза. Поэтому, наблюдаемые различия в оценке цитотоксического действия Alu и 7SL РНК по снижению MTT-индекса (15 19%) и индукции проницаемости апоптотических цитоплазматичесокой процессов мембраны по экспозиции (31%) можно фосфатидилсерина объяснить и большей чувствительностью подхода с использованием системы аннексин V/PI. В целом эти результаты позволяют заключить, что и аналоги Alu РНК, и аналоги 7SL РНК снижают жизнеспособность и индуцируют проапоптотические изменения субпопуляции клеток MCF-7, а действие аналогов Alu РНК не существенно отличается от действия 7SL РНК 109 на уровне изменения активности цитоплазматических и митохондриальных дегидрогеназ (MTT-тест) и диссипации трансмембранного потенциала митохондрий m. 3.2.3 Влияние Alu РНК и 7SL РНК в сочетании с цитостатиками на жизнеспособность клеток MCF-7 Для определения ключевых процессов, подавление или активация которых происходит при трансфекции клеток аналогами Alu РНК и 7SL РНК, мы оценили изменение жизнеспособности клеток MCF-7 в условиях совместного действия аналогов и серии цитостатиков (Таблица 27, 28). Анализ совместного действия РНК и ингибиторов клеточных процессов проводили при такой концентрации цитостатиков в культуральной среде, которая к 72 ч инкубации индуцировала снижение жизнеспособности клеток MCF-7 на 40% (Таблица 28, IC40). Из данных Таблицы 28 видно, что трансфекция клеток аналогами Alu РНК и 7SL РНК усиливает цитотоксическое действие: цисплатина на ~25 и 20%; циклогексимида на ~ 18 и 15%; интерферона на ~18 и 27%, соответственно (P < 0.05). Таким образом, для этого набора эффекторов трансфекция аналогами Alu и 7SL РНК оказывала однонаправленное и сравнимое по величине действие на клетки MCF-7. Таблица 27. Механизмы действия цитостатиков, используемых для совместной трансфекции с препаратами Alu и 7SL РНК. Соединение Цисплатин Тамоксифен Метотрексат Монензин Актиномицин D Циклогексимид Интерферон Механизм действия Ингибитор процессов репликации, репарации и транскрипции ДНК. Взаимодействует с эстрогеновым рецептором, антагонист эстрогена, ингибитор транскрипции эстроген-зависимых генов. Антиметаболит, антагонист фолиевой кислоты, ингибитор дегидрофлатредуктазы, ингибитор биосинтеза пуринов, ингибитор процессов репликации и репарации ДНК. Ионофор, Na+/H+ антипортер, ингибитор функций аппарата Гольджи, лизосом и эндосом. Ингибитор транскрипции про- и эукариот. Ингибитор трансляции мРНК 80S рибосомами, индуктор и модулятор апоптоза Подавляет синтез белка, активирует PKR, стимулирует противовирусную активность Ссылки 314 315 316 317 318 319 320 110 Таблица 28. Влияние аналогов Alu РНК и 7SL РНК на жизнеспособность клеток MCF-7 в присутствии цитостатиков Alu РНК MTT-индекс (%)** ± SD Цисплатин (9.5 µM) 25.7 ± 7.7 Циклогексимид (0.56 µM) 17.9 ± 6.7 17.8 ± 7.6 Интерферон (400 u/ml) Метотрексат (33.3 µM) 11.5 ± 10.2 Монензин (2.5 pM) 3.8 ± 6.3 Тамоксифен (450 µM) -1.2 ± 12.7 Актиномицин D (5.6 nM) 21.5 ± 21.2 Эффектор (IC40*) P*** 0.004 0.010 0.022 0.171 0.352 0.897 0.232 7SL РНК MTT-индекс (%) ± SD 20.0 ± 3.5 14.9 ± 7.5 26.5 ± 7.9 26.5 ± 8.4 10.8 ± 5.1 -12.1 ± 12.6 -57.7 ± 22.6 P 0.001 0.026 0.009 0.011 0.021 0.244 0.031 *указаны экспериментально-подобранные концентрации эффекторов, при которых происходило снижение жизнеспособности клеток на 40% через 72 ч инкубации (в присутствии липофектамина). **дополнительное снижение MTT-индекса к 72 ч после трансфекции клеток РНК. За "0%" принимали жизнеспособность клеток, инкубированных в среде с липофектамином, с указанной концентрацией эффектора и без РНК. ***значение вероятности для t-критерия Стьюдента. В основе цитотоксического действия цисплатина лежит образование нерепарируемых сшивок ДНК, подавление репликации и митоза (Таблица 27, [314]). Аддитивное действие цисплатина с Alu РНК и с 7SL РНК (Таблица 28) непосредственно указывает на то, что цитотоксическое действие цисплатина с Alu РНК или с 7SL РНК – независимые процессы, а действие этих РНК напрямую не связано c репликацией ДНК и активацией репарационных процессов в клетках MCF-7. Действие интерферона основано на рецептор-опосредованной активации транскрипции интерферон-индуцибельных генов, в том числе и гена протеинкиназы PKR (Таблица 27, [320]). PKR активируется при взаимодействии с двуцепочечной РНК или с РНК, содержащей протяженные шпильки, и ингибирует синтез белка в клетке путем фосфорилирования фактора инициации трансляции eIF2 [321]. Однако, несмотря на развитую вторичную структуру Alu и 7SL РНК (Рисунок 14), в целом ряде работ показано, что действие Alu РНК на различные процессы в клетках млекопитающих напрямую не связано с активацией PKR [126, 309, 322]. Кроме того, PKR-зависимый механизм действия РНК с развитой вторичной структурой предусматривает многократное усиление действия интерферона (синергический эффект), в то время как полученные аналоги и Alu, и 7SL РНК вызывают аддитивное снижение MTT-индекса интерферон-стимулированных клеток, сравнимое со снижением жизнеспособности в сочетании с ингибитором элонгации трансляции циклогексимидом или с действием самих РНК без интерферона (Таблица 26, 28). Таким образом, PKR-зависимый 111 механизм действия структурированных РНК, а также интерфероногенное действие таких РНК только частично объясняет индукцию проапоптотических процессов Alu и 7SL РНК в клетках MCF-7. 7SL РНК вызывала достоверное снижение MTT-индекса в сочетании c метотрексатом и с монензином (P < 0.05), а изменение жизнеспособности клеток при трансфекции Alu РНК в сочетании c этими цитостатиками не было статистически достоверным (Таблица 28). При этом снижение MTT-индекса 7SL РНК в присутствии метотрексата или монензина достоверно отличалось от снижения, индуцируемого Alu РНК в сочетании с этими цитостатиками (P < 0.05). Эти данные показывают, что ингибитор дегидрофолатредуктазы – метотрексат и ионофор – монензин частично подавляют цитотоксическое действие Alu РНК, но не 7SL РНК. В препаратах клеток, инкубированных в среде с тамоксифеном, не происходило достоверного дополнительного снижения жизнеспособности (P > 0.05) при трансфекции Alu РНК или 7SL РНК (Таблица 28). Поэтому, можно заключить, что тамоксифен частично подавляет цитотоксическое действие и Alu РНК, и 7SL РНК на клетки MCF-7. Известно, что тамоксифен является ингибитором рецепторов эстрогена, и его действие на клетки MCF-7 обусловлено изменением транскрипции эстроген-зависимых генов [315]. Тамоксифен также является эффективным модулятором действия интерферонов. Совместное действие интерферона и тамоксифена синергически снижает жизнеспособность и индуцирует массовую гибель клеток MCF-7 как в культуре, так и в модели ксенографтов [323, 324]. Поэтому, частичное подавление тамоксифеном цитотоксического действия аналогов Alu и 7SL РНК на клетки MCF-7 подтверждает предположение о том, что влияние этих РНК на жизнеспособность не связано с потенциальным интерфероногенными свойствами этих структурированных РНК. ДНК-интеркалятор и ингибитор транскрипции и репликации актиномицин D полностью подавлял цитотоксическое действие аналога 7SL РНК, а Alu РНК не вызывала достоверного дополнительного снижения жизнеспособности в сочетании с этим цитостатиком (Таблица 28). Принимая во внимание тот факт, что ингибирование репликации цисплатином не снижало действия Alu и 7SL РНК, можно заключить, что частичная, в случае с Alu РНК, и полная, в случае с 7SL РНК, отмена их цитотоксического действия актиномицином D обусловлена влиянием этих РНК на транскрипцию ДНК в клетках человека. Данные о компенсации цитотоксического эффекта Alu и 7SL РНК модулятором транскрипции тамоксифеном (Таблица 28) подтверждают вывод о том, что ключевым элементом механизма действия и Alu РНК, и ее гомолога 7SL РНК на жизнеспособность клеток человека MCF-7 является модуляция транскрипции ядерной ДНК. 112 3.2.4 Анализ изменения экспрессии генов в клетках MCF-7 под действием аналогов Alu и 7SL РНК Для того чтобы выявить гены, экспрессия которых изменяется под действием аналогов Alu и 7SL РНК, мы провели полнотранскриптомный анализ РНК клеток MCF-7 на микрочипах Illumina HT-12. В качестве контроля использовали клетки, инкубированные в среде с липофектамином без РНК. Было установлено, что трансфекция Alu РНК в клетки MCF-7 приводит к повышению экспрессии в три и более раза 68 транскриптов и к понижению экспрессии 87 транскриптов (Рисунок 16). Трансфекция клеток 7SL РНК повышала в три и более раза уровень 45 генов и понижала 74 (Рисунок 16). В группах транскриптов с повышенной экспрессией для Alu и 7SL РНК выявлено 13 общих транскриптов, и 25 общих транскриптов выявлено в группах с пониженной экспрессией (Рисунок 16). Эти данные показывают, что Alu РНК и 7SL РНК вызывают изменения различающихся наборов транскриптов, и позволяют предположить, что различаются также и специфичность влияния, а возможно, и механизмы индукции проапоптотических процессов в клетках человека. Рис. 16. Изменение транскриптома клеток MCF-7 под действием аналогов Alu и 7SL РНК. Приведены данные для транскриптов, изменение экспрессии которых происходило в три и более раз по сравнению с контрольными клетками, обработанными липофектамином без РНК. Из данных Таблиц 29, 30 видно, что в списке транскриптов, экспрессия которых повышается в наибольшей степени, практически отсутствуют продукты интерферониндуцируемых генов, таких как OAS, ISG, IFIT или STAT1 [325]. Кроме того, анализ GOаннотаций в группе из 68 Alu РНК-индуцированных транскриптов, и в группе 45 транскриптов, индуцированных 7SL РНК, не выявил достоверного (P < 0.05) повышения вклада групп генов интерферонового ответа и генов врожденного иммунного ответа. Эти результаты подтверждают вывод о том, что индукция проапоптотических процессов в клетках человека аналогами Alu РНК и 7SL РНК не связана с активацией PKR, взаимодействием c TLRрецепторами или другим механизмом, связанным с интерфероногенным действием этих РНК. 113 Таблица 29. Транскрипты клеток MCF-7, экспрессия которых изменяется под действием аналога Alu РНК Относительное изменение экспрессии** Повышение экспрессии Транскрипт* Идентификатор Краткое описание NUPR1 NM_001042483 5.3 nuclear protein, transcriptional regulator PER3 NM_016831 5.1 period homolog 3 (Drosophila) TXNIP NM_006472 4.7 thioredoxin interacting protein ASNS NM_133436 4.5 asparagine synthetase, transcript variant 1 ZNF773 NM_198542 4.3 zinc finger protein 773 FAM119A NM_001127395 4.1 family with sequence similarity 119, member ZNF750 NM_024702 4.1 zinc finger protein 750 PRRT2 NM_145239 4.0 proline-rich transmembrane protein 2 KCNE4 NM_080671 3.9 potassium voltage-gated channel C6ORF48 NM_001040437 3.9 chromosome 6 open reading frame 48 AUH NM_001698 3.8 AU RNA binding protein DDIT3 NM_004083 3.8 DNA-damage-inducible transcript 3 KRT81 NM_002281 3.7 keratin 81 RNASE4 NM_194430 3.6 ribonuclease, RNase A family 4 FBXO15 NM_152676 3.6 F-box protein 15 FLJ45244*** NM_207443 3.6 DICER1 antisense RNA 1 non-coding RNA MTHFD2 NM_001040409 3.5 methylenetetrahydrofolate dehydrogenase Понижение экспрессии FOXRED2 NM_024955 0.15 PPRC1 NM_015062 0.19 CHP NM_007236 0.21 FAD-dependent oxidoreductase domain containing 2 peroxisome proliferator-activated receptor gamma, coactivator-related 1 calcium binding protein P22 PHLDA2 NM_003311 0.21 pleckstrin homology-like domain, family A, member 2 TMEM158 NM_015444 0.21 transmembrane protein 158 ATN1 NM_001007026 0.22 atrophin 1 (ATN1) DLK2 NM_206539 0.23 delta-like 2 homolog (Drosophila) HPS1 NM_182639 0.23 Hermansky-Pudlak syndrome 1. TMEM214 NM_017727 0.23 transmembrane protein 214 MED24 NM_014815 0.24 mediator complex subunit 24 PLEC1 NM_000445 0.24 plectin 1, intermediate filament binding protein 500kDa ZYX NM_003461 0.24 zyxin ACD NM_022914 0.25 adrenocortical dysplasia homolog (mouse) PCDH7 NM_002589 0.25 protocadherin 7 (PCDH7 RDH10 NM_172037 0.25 retinol dehydrogenase 10 (all-trans) GPX2 NM_002083 0.26 glutathione peroxidase 2 (gastrointestinal) *приведены транскрипты, аннотированные в базе данных RefSeq (accessions NM, NR). Серым цветом выделены транскрипты, экспрессия который изменилась под действием и Alu РНК, и 7SL РНК. **изменение уровня транскрипта в клетках, обработанных Alu РНК, относительно контрольных клеток, обработанных липофектамином. ***последовательность зонда HT-12 Illumina для гена FLJ45244 совпадает с участком chr14:95,645,96595,646,014 последовательностьи DICER-AS1 (NR_015415). 114 Таблица 30. Транскрипты клеток MCF-7, экспрессия которых изменяется под действием аналога 7SL РНК Относительное изменение экспрессии** Повышение экспрессии Транскрипт* Идентификатор Краткое описание NUPR1 NM_001042483 4.5 nuclear protein, transcriptional regulator TXNIP NM_006472 4.3 thioredoxin interacting protein PRRT2 NM_145239 4.3 proline-rich transmembrane protein 2 PSPH NM_004577 4.2 phosphoserine phosphatase ASNS NM_133436 3.8 asparagine synthetase, transcript variant 1 KY NM_178554 3.8 kyphoscoliosis peptidase FABP6 NM_001445 3.7 fatty acid binding protein 6, ileal DDIT3 NM_004083 3.6 DNA-damage-inducible transcript 3 CTSK NM_000396 3.6 cathepsin K KRT81 NM_002281 3.6 keratin 81 PFAAP5 NM_014887 3.4 phosphonoformate immuno-associated protein 5 NT5E NM_002526 3.4 5'-nucleotidase, ecto (CD73) ARL3 NM_004311 3.4 ADP-ribosylation factor-like 3 ULBP1 NM_025218 3.4 UL16 binding protein 1 BACE2 NM_138992 3.4 beta-site APP-cleaving enzyme 2 RNASE4 NM_194431 3.3 ribonuclease, RNase A family 4 Понижение экспрессии FOXRED2 NM_024955 0.16 FAD-dependent oxidoreductase domain containing 2 GPX2 NM_002083 0.16 glutathione peroxidase 2 (gastrointestinal) TUBB2A NM_001069 0.17 tubulin, beta 2A PLEC1 NM_000445 0.19 plectin 1, intermediate filament binding protein ZC3HAV1 NM_024625 0.20 zinc finger CCCH-type, antiviral 1 SLC35C1 NM_018389 0.21 solute carrier family 35, member C1 NCOR2 NM_001077261 0.21 nuclear receptor co-repressor 2 PIGW NM_178517 0.22 phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis, class W MUC1 NM_001044391 0.22 OPA3 NM_025136 0.23 PDPK1 NM_002613 0.23 SLC29A3 NM_018344 0.23 HCFC1 NM_005334 0.24 FAHD1 NM_001018104 0.24 PARP12 NM_022750 0.24 mucin 1, cell surface associated optic atrophy 3 (autosomal recessive, with chorea and spastic paraplegia) 3-phosphoinositide dependent protein kinase-1 solute carrier family 29 (nucleoside transporters), member 3 host cell factor C1 (VP16-accessory protein) fumarylacetoacetate hydrolase domain containing 1 (FAHD1) poly (ADP-ribose) polymerase family, member 12 LRRC14 NM_014665 0.25 leucine rich repeat containing 14 * приведены транскрипты, аннотированные в базе данных RefSeq (accessions NM, NR). Серым цветом выделены транскрипты, экспрессия которых изменилась под действием и Alu РНК, и 7SL РНК. **изменение количества транскрипта в клетках, обработанных Alu РНК, относительно контрольных клеток, обработанных липофектамином. 115 Среди генов, экспрессия которых повышается под действием и Alu РНК, и 7SL РНК (Таблица 29, 30) присутствует NUPR1. Известно, что экспрессия гена транскрипционного регулятора NUPR1 (кодирует белок p8) повышается в ответ на различные стрессовые воздействия и вызывает устойчивость клеток к химиотерапевтическим средствам, а понижение экспрессии NUPR1 сопровождается подавлением роста раковых клеток in vitro и in vivo [326, 327]. Однако, повышение уровня мРНК NUPR1 приводит к апоптотическим изменениям клеток астроцитомы U87MG [328]. Продукт гена DDIT3 – транскрипционный фактор CHOP, является ключевым медиатором клеточной гибели в ответ на стресс эндоплазматического ретикулума. Повышение экспрессии этого гена или микроинъекции белка CHOP вызывают диссипацию трансмембранного потенциала митохондрий (m), генерацию активных форм кислорода и апоптотическую гибель клетки [329]. Поэтому, наблюдаемое повышение экспрессии гена DDIT3 в клетках MCF-7 под действием аналогов Alu и 7SL РНК (Таблица 29, 30) является существенным проапоптотическим стимулом. Повышение экспрессии DDIT3 (CHOP) и индукция апоптоза в ответ на стресс эндоплазматического ретикулума могут быть вызваны непосредственно активацией гена NUPR1 (p8), как это было показано для канабиноидиндуцируемого апоптоза клеток астроцитомы U87MG [328]. Повышение уровня мРНК DDIT3, а также мРНК PSPH и MTHFD в клетках MCF-7 под действием Alu РНК или 7SL РНК (Таблица 29, 30) было подтверждено при выборочной проверке результатов полнотранскриптомного анализа независимым методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Экспрессия гена FOXRED2 понижается под действием и Alu, и 7SL РНК (Таблица 29, 30). Продукт гена FOXRED2, флавопротеин ERFAD, участвует в дислокации белков из эндоплазматического ретикулума в цитоплазму. Снижение экспрессии этого гена связывают с активацией протеотоксического стресса эндоплазматического ретикулума [330]. Еще одним признаком активации ответа на стресс эндоплазматического ретикулума является повышение экспрессии гена аспарагин синтетазы ASNS, транскрипция которого активируется CCAAT/энхансер-связывающим белком CHOP [331]. Таким образом, наблюдаемое снижение экспрессии FOXRED2, совместно с повышением уровня NUPR1 (p8), DDIT3 (CHOP) и ASNS, позволяет заключить, что индукция проапоптотических процессов в клетках MCF-7 под действием Alu и 7SL РНК связана с модуляцией транскрипции ключевых эндоплазматического ретикулума. клеточных факторов ответа на стресс 116 3.2.5 Предполагаемый механизм снижения жизнеспособности клеток MCF-7 под действием Alu и 7SL РНК Ранее Sakamoto K. с соавт. показали, что трансфекция клеток HeLa ДНК-конструкциями, содержащими транскрипционно-активные Alu повторы, а также трансфекция конструкциями, кодирующими 7SL РНК, вызывает подавление репликации ДНК, ингибирует трансляцию и оказывает антипролиферативное действие на клетки человека [126]. Однако при этом не было предложено молекулярного механизма влияния Alu РНК на инициацию трансляции новосинтезированных мРНК. В экспериментах in vitro показано, что Alu РНК непосредственно взаимодействует с каталитической субъединицей РНК полимеразы II человека и подавляет активность комплекса Pol II-TBP-TFIIB-TFIIF на стадии инициации транскрипции [332, 333]. При анализе влияния аналогов Alu и 7SL РНК на жизнеспособность клеток MCF-7 в сочетании с актиномицином D и тамоксифеном нами установлено, что цитотоксическое действие этих РНК обусловлено модуляцией транскрипции. Эти данные позволяют предположить, что полученные нами аналоги Alu РНК, как и природные Alu РНК, являются неспецифическими регуляторами транскрипции мРНК в клетках человека. Полученные нами данные показывают, что и Alu, и 7SL РНК вызывают сравнимые изменения трансмембранного потенциала митохондрий клеток MCF-7 (Таблица 26). Следовательно, по крайней мере, в эпителиоцитах MCF-7 и Alu, и 7SL РНК индуцируют близкие по глубине изменения мембраны митохондрий. Участие митохондрий в гибели клеток под действием Alu РНК было также установлено при исследовании молекулярных и клеточных механизмов географической атрофии сетчатки [126]. Предложен молекулярный механизм цитотоксического действия Alu РНК в клетках пигментированного эпителия, который включает в себя генерацию активных форм кислорода митохондриями, активацию NLRP3-инфламмасом, а также активацию MyD88-сигнального каскада [309]. Однако нерешенным оставался вопрос о причинах, по которым Alu РНК вызывает генерацию активных форм кислорода. Данные об изменении экспрессии генов показывают, что трансфекция клеток аналогами Alu РНК или 7SL РНК сопровождается не только неспецифическим ответом на экзогенную РНК – увеличением уровня рибонуклеазы RNASE4, 5'-эктонуклеотидазы NT5E (Таблица 29, 30), но и появлением проапоптотических стимулов: NUPR1 (p8); DDIT3 (CHOP), FOXRED2 (ERFAD). При этом NUPR1 является фактором, индуцируемым в ответ на широкий спектр стрессовых воздействий, а DDIT3 и FOXRED2 связаны с ответом на стресс эндоплазматического ретикулума. Продукт гена DDIT3 – белок CHOP является ключевым индуктором апоптоза в ответ на протеотоксический стресс ЭР [329]. 117 Ранее Hasler J. и Strub K. предположили, что участие Alu транскриптов в клеточных процессах обусловлено их структурным сходством с 7SL РНК (Рисунок 14) [305]. Как и 7SL РНК, Alu РНК взаимодействует с белками сигнал-распознающей частицы – SRP (signal recognition particle). Способность Alu РНК модулировать трансляцию авторы объясняли взаимодействием с белками SRP9/14: показано, что Alu РНК активирует трансляцию, а Alu РНК в комплексе с SRP9/14 ингибирует трансляцию мРНК in vitro [305]. В связи с этим можно предположить, что активация аналогами Alu и 7SL РНК ответа на стресс эндоплазматического ретикулума обусловлена нарушением функционирования SRP. Полученные нами данные в совокупности с результатами литературы позволяют предложить механизм проапоптотического действия Alu и 7SL РНК в субпопуляции клеток MCF-7 (Рисунок 17). В целом, полученные нами данные указывают на то, что ключевым процессом, опосредующим снижение жизнеспособности клеток аденокарциномы человека MCF-7 под действием аналогов как Alu РНК, так и 7SL РНК является транскрипция ядерной ДНК. Трансфекция клеток MCF-7 Alu РНК или 7SL РНК сопровождается изменением экспрессии ряда генов, в том числе NUPR1, DDIT3, FOXRED2 и ASNS. Из данных литературы известно, что изменение транскрипции этих генов ассоциировано с комплексным ответом клетки на стресс ЭР, который способен индуцировать образование активных форм кислорода и гибель клетки по митохондриальному пути апоптоза. Предположительно, активация ответа на стресс ЭР под действием аналогов Alu и 7SL РНК связана с нарушением функционирования в клетках сигналраспознающей частицы SRP. Полученные результаты, а также данные литературы показывают, что Alu РНК является не только маркером, но и медиатором сигналов клеточного стресса. 118 Рис. 17. Схема предполагаемого механизма индукции проапоптотических процессов в клетках MCF-7, трансфицированных аналогами Alu и 7SL РНК. Трансфекция клеток аналогами Alu и 7SL РНК сопровождается увеличением экспрессии гена транскрипционного регулятора NURP1 (p8), который активирует транскрипцию DDIT3 (CHOP) [328]. Увеличение экспрессии транскрипционного фактора DDIT3 вызывает апоптотические изменения внешней мембраны митохондрий по механизму, включающему понижение транскрипции Bcl-2 и активацию транскрипции Bim. Апоптоз, индуцируемый CHOP (DDIT3), сопровождается генерацией активных форм кислорода (АФК) [329]. Увеличение экспрессии DDIT3 может происходить в ответ на стресс эндоплазматического ретикулума, вызванного взаимодействием аналогов Alu и 7SL РНК с белками SRP – нарушением транспорта белков через мембрану ЭПР. Стресс эндоплазматического ретикулума сопровождается повышением экспрессии гена аспарагин синтетазы ASNS, транскрипция которого активируется CHOP [331]. 119 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Понимание структуры циркулирующих РНК расширяет фундаментальные знания межклеточных взаимодействий и дистантной регуляции физиологических процессов, а также позволяет разработать новые молекулярные диагностические и прогностические подходы. В данной работе с помощью разработанных экспериментальных и программных подходов проведен комплексный анализ многообразия РНК, циркулирующих в плазме крови человека здоровых доноров и пациентов с немелкоклеточным раком легкого, направленный на выявление новых видов регуляторных РНК и определение перспективных диагностических маркеров. Получен массив данных, состоящий из миллиарда последовательностей фрагментов РНК, циркулирующих в плазме крови человека. Проведено сравнение полученных результатов с литературными источниками и базами данных, содержащими данные анализа РНК форменных элементов крови, везикулярных и невезикулярных субфракций плазмы крови человека, а также ряда клеточных и тканевых субтипов – потенциальных источников цРНК. Одним из важнейших вопросов при изучении внеклеточных РНК является определение различных форм транспорта цРНК (экзосом, микровезикул, апоптотических телец и свободных рибонуклеопротеидов). Нами получены данные, указывающие на то, что преобладающей формой транспорта микроРНК являются экзосомы и микровезикулы. Тем не менее, определение доминирующих форм транспорта для РНК других классов требует дальнейших исследований. Нами показано, что значительная доля циркулирующих РНК картируется на неаннотированные в базах данных участки генома человека. Такие последовательности обладают низкой представленностью индивидуальных форм. Однако, в целом их вклад в общее число обнаруженных фрагментов цРНК составляет более 40%, что позволяет предполагать существование потенциально важных биологических функцих таких фрагментов РНК и их клеточных предшественников. Сравнение представленности циркулирующих РНК между группами здоровых доноров и онкологических пациентов по основным классам клеточных РНК показало, что в наборе цРНК пациентов происходит достоверное увеличение вклада транскриптов геномных повторов, рРНК, тРНК и мРНК и достоверное снижение вклада фрагментов РНК, не аннотированных в базе данных RefSeq. Проведено подтверждение присутствия в плазме крови ряда обнаруженных форм РНК, в том числе диагностически значимых и микроРНК-подобных форм, независимым методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени. 120 В настоящее время известно, что циркулирующие РНК обладают значительным потенциалом регуляции основных клеточных процессов (транскрипции, трансляции, сплайсинга) и точечного влияния на экспрессию отдельных генов в клетках-акцепторах. Однако механизмы и регуляторные пути действия цРНК требуют детального изучения. В данной работе установлено, что полученные in vitro аналоги циркулирующих фрагментов РНК способны снижать жизнеспособность клеток человека в культуре. Установлено, что аналоги полноразмерных Alu и 7SL РНК, фрагменты которых широко представлены в плазме крови человека, оказывают значительное цитотоксическое действие на клетки человека в культуре. Полученные данные указывают на то, что механизм цитотоксического действия этих РНК основан на активации ответа на стресс эндоплазматического ретикулума. В целом, полученный в данной работе массив данных секвенирования РНК плазмы крови человека в норме и при раке легкого представляет собой основу для поиска новых биологически активных форм РНК и диагностических маркеров рака легкого. В рамках данной работы оценена эффективность ряда потенциальных диагностических форм РНК и проведен анализ биологического действия аналогов ряда форм циркулирующих РНК на культуру клеток человека. 121 ВЫВОДЫ 1. Проведено усовершенствование метода конструирования кДНК-библиотек, позволяющее анализировать короткие циркулирующие РНК (19-100 н.) с различным расположением концевых фосфатных групп, по технологии высокопроизводительного секвенирования ABI SOLiD. С использованием этой технологии проведен анализ РНК, циркулирующих в плазме крови доноров без выявленных онкологических, аутоиммунных и острых инфекционных заболеваний. Определен вклад в общий набор РНК плазмы крови человека фрагментов РНК по классам: рРНК, мРНК, митоРНК, тРНК, днРНК, мяоРНК, транскрибируемые геномные повторы человека и микроРНК. Определены наиболее представленные в плазме крови индивидуальные формы микроРНК, мРНК и днРНК. Наличие в плазме крови набора новых микроРНК-подобных РНК и антисмысловых РНК подтверждено независимым методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени. 2. Сравнительный анализ данных высокопроизводительного секвенирования на платформе ABI SOLiD РНК плазмы крови здоровых доноров и пациентов с немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ) показал, что в наборе циркулирующих РНК пациентов с НМРЛ по сравнению с набором циркулирующих РНК здоровых доноров происходит изменение вклада фрагментов основных классов клеточных РНК, таких как транскрипты геномных повторов и формы РНК, не аннотированные в базе human RefSeq RNA (Р < 0.01), а также рРНК, тРНК и мРНК (Р < 0.05). Обнаружен ряд потенциально диагностически значимых циркулирующих РНК: микроРНК-451, фрагмент мРНК WHSC2 и микроРНК29-a. 3. Трансфекция клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 аналогами циркулирующих РНК, содержащими последовательность Alu-повтора человека, двуцепочечный фрагмент L1-транскрипта, а также РНК, комплементарную фрагменту гена эпиплакина 1, приводит к снижению жизнеспособности клеток MCF-7 в культуре. 4. Установлено, что аналоги AluYa5 и 7SL РНК снижают жизнеспособность и индуцируют проапоптотические изменения субпопуляции клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7. Предложен механизм индукции проапоптотических процессов в клетках MCF-7 под действием Alu и 7SL РНК, основанный на изменении транскрипции генов NUPR1, DDIT3, FOXRED2 и ASNS, участвующих в комплексном ответе клетки на стресс эндоплазматического ретикулума. 122 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Dinger, M. E., Mercer, T. R., Mattick, J. S. RNAs as extracellular signaling molecules // J. Mol. Endocrinol. – 2008. - V. 40. – P. 151-159. 2. Weiland, M., Gao, X. H., Zhou, L., Mi, Q. S. Small RNAs have a large impact: circulating microRNAs as biomarkers for human diseases // RNA Biol. – 2012. – V. 9. – N. 6. – P.850-859. 3. Fleischhacker, M., Schmidt, B. Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer – a survey // Biochim. Biophys. Acta – 2007. – V. 1775. – N. 1. – P. 181–232. 4. O’Driscoll, L. Extracellular nucleic acids and their potential as diagnostic, prognostic and predictive biomarkers // Anticancer Res. – 2007. – V. 27. – N. 3A. – P. 1257–65. 5. Bryzgunova, O. E., Skvortsova, T. E., Kolesnikova, E. V., Starikov, A. V., Rykova, E. Y., Vlassov, V. V., Laktionov, P. P. Isolation and comparative study of cell-free nucleic acids from human urine // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2006. – V. 1075. – P. 334–44. 6. Spielmann, N., Ilsley, D., Gu, J., Lea, K., Brockman, J., Heater, S., Setterquist, R., Wong, D. T. The human salivary RNA transcriptome revealed by massively parallel sequencing // Clin. Chem. – 2012. – V. 58. – N. 9. – P. 1314-21. 7. Burgos, K. L., Javaherian, A., Bomprezzi, R., Ghaffari, L., Rhodes, S., Courtright, A., Tembe, W., Kim, S., Metpally, R., Van Keuren-Jensen, K. Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing // RNA – 2013. – V. 19. – N. 5. – P. 712-22. 8. Levänen, B., Bhakta, N. R., Torregrosa Paredes, P., Barbeau, R., Hiltbrunner, S., Pollack, J. L., Sköld, C. M., Svartengren, M., Grunewald, J., Gabrielsson, S., Eklund, A., Larsson, B. M., Woodruff, P. G., Erle, D. J., Wheelock, A. M. Altered microRNA profiles in bronchoalveolar lavage fluid exosomes in asthmatic patients // J. Allergy Clin. Immunol. – 2013. – V. 131. – N. 3. – P. 894903. 9. Massingham, L. J., Johnson, K. L., Bianchi, D. W., Pei, S., Peter, I., Cowan, J. M., Tantravahi, U., Morrison, T. B. Proof of concept study to assess fetal gene expression in amniotic fluid by nanoarray PCR // J. Mol. Diagn. – 2011. – V. 13. – N. 5. – P. 565-70. 10. Lässer, C., Alikhani, V. S., Ekström, K., Eldh, M., Paredes, P. T., Bossios, A., Sjöstrand, M., Gabrielsson, S., Lötvall, J., Valadi, H. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages // J. Transl. Med. – 2011. – V. 9. – P. 9-17. 11. Eldh, M., Ekström, K., Valadi, H., Sjöstrand, M., Olsson, B., Jernås, M., Lötvall, J. Exosomes communicate protective messages during oxidative stress; possible role of exosomal shuttle RNA // PLoS One – 2010. – V. 5. – N. 12. – P. e15353. 123 12. Yang, Q., Lu, J., Wang, S., Li, H., Ge, Q., Lu, Z. Application of next-generation sequencing technology to profile the circulating microRNAs in the serum of preeclampsia versus normal pregnant women // Clin. Chim. Acta. – 2011. – V. 412. – P. 2167-73. 13. Li, H., Guo, L., Wu, Q., Lu, J., Ge, Q., Lu, Z. A comprehensive survey of maternal plasma miRNAs expression profiles using high-throughput sequencing // Clin. Chim. Acta. – 2012. – V. 413. – P. 568-76. 14. Kosaka, N., Iguchi, H., Yoshioka, Y., Takeshita, F., Matsuki, Y., Ochiya, T. Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells // J. Biol. Chem. – 2010. – V. 285. – P. 17442–17452. 15. Tzimagiorgis, G., Michailidou, E. Z., Kritis, A., Markopoulos, A. K., Kouidou, S. Recovering circulating extracellular or cell-free RNA from bodily fluids // Cancer Epidemiol. – 2011. – V. 35. – N. 6. – P. 580-9. 16. Fischer, S., Preissner, K. T. Extracellular nucleic acids as novel alarm signals in the vascular system // Mediators of defence and disease. Hamostaseologie. – 2013. - V. 33. – N. 1. – P. 3742. 17. Yang, M., Chen, J., Su, F., Yu, B., Su, F., Lin, L., Liu, Y., Huang, J. D., Song, E. Microvesicles secreted by macrophages shuttle invasion-potentiating microRNAs into breast cancer cells // Mol. Cancer – 2011. – V. 10. – P. 117-130. 18. Umezu, T., Ohyashiki, K., Kuroda, M., Ohyashiki, J. H. Leukemia cell to endothelial cell communication via exosomal miRNAs // Oncogene – 2013. – V. 32. – N. 22. – P. 2747-55. 19. Reid, G., Kirschner, M. B., van Zandwijk, N. Circulating microRNAs: Association with disease and potential use as biomarkers // Crit. Rev. Oncol. Hematol. – 2011. – V. 80. – N. 2. – P. 193208. 20. Kamm, R.C., Smith, A.G. Nucleic Acid Concentrations in Normal Human Plasma // Clin. Chem. – 1972. - V. 18. – N. 6. – P. 519-522. 21. Shutack, J.G., Baxt, J., Wasniewski, J.J. A study of the RNA levels of normal blood serum // J. Am. Osteopath. Assoc. - 1968 – V. 67 – N. 9. – P. 1051-1053. 22. Guin, L.W., Griswold, K.E., Patton, S., Kamm, R.C., Smith, A.G. Electrophoretic Characterization of Plasma RNA // Biochem. Med. -1975. – V. 13. – P. 224-230. 23. Kolodny, G.M. Evidence for transfer of macromolecular RNA between mammalian cells in culture // Exp. Cell Res. – 1971. – V. 65. – N. 2. – P. 313-324. 24. Kolodny, G.M., Culp, L.A., Rosenthal, L.J. Secretion of RNA by normal and transformed cells // Exp. Cell Res. – 1972. – V. 73. – N. 1. – P. 65-72. 124 25. Hamilton, T.C., Smith, A.G., Griffin, C.A., Henderson, R.J., Jr. Ribonucleic Acid in Plasma from Normal Adults and Multiple Myeloma Patients // Clin. Chem. – 1979. – V. 25 – N. 10 – P. 17741779. 26. Archer, S.J. Induction of a T-cell specific antigen on bone marrow lymphocytes with thymus RNA // Immunology. – 1978. – V. 34. – P. 123-9. 27. Wieczorek, A. J., Rhyner, C., Block, L. H. Isolation and characterization of an RNAproteolipid complex associated with the malignant state in humans // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. – 1985. – V. 82. – N. 10. – P. 3455-9. 28. Wieczorek, A. J., Sitaramam, V., Machleidt, W., Rhyner, K., Perruchoud, A. P., Block, L. H. Diagnostic and prognostic value of RNA-proteolipid in sera of patients with malignant disorders following therapy: first clinical evaluation of a novel tumor marker // Cancer Res. – 1987. – V. 47. – N. 23. – P. 6407-12. 29. Poon, L. L., Leung, T. N., Lau, T. K., Lo, Y. M. Presence of fetal RNA in maternal plasma // Clin. Chem. – 2000. – V. 46. – P. 1832–4. 30. Laktionov, P. P., Tamkovich, S. N., Rykova, E. Y., Bryzgunova, O. E., Starikov, A. V., Kuznetsova, N. P., Vlassov, V. V. Cell-surface-bound nucleic acids: Free and cell-surface-bound nucleic acids in blood of healthy donors and breast cancer patients // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2004. – V. 1022. – P. 221-7. 31. Chen, X., Ba, Y., Ma, L., Cai, X., Yin, Y., Wang, K., Guo, J., Zhang, Y., Chen, J., Guo, X., Li, Q., Li, X., Wang, W., Zhang, Y., Wang, J., Jiang, X., Xiang, Y., Xu, C., Zheng, P., Zhang, J., Li, R., Zhang, H., Shang, X., Gong, T., Ning, G., Wang, J., Zen, K., Zhang, J., Zhang, C. Y. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases // Cell Res. – 2008. – V. 18. – P. 997–1006. 32. Mitchell, P. S., Parkin, R. K., Kroh, E. M., Fritz, B. R., Wyman, S. K., PogosovaAgadjanyan, E. L., Peterson, A., Noteboom, J., O'Briant, K. C., Allen, A., Lin, D. W., Urban, N., Drescher, C. W., Knudsen, B. S., Stirewalt, D. L., Gentleman, R., Vessella, R. L., Nelson, P. S., Martin, D. B., Tewari, M. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection // Proc. Natl. Acad. Sci. USA – 2008. – V. 105. – P. 10513–10518. 33. Diken, M., Kreiter, S., Selmi, A., Britten, C. M., Huber, C., Tu¨ reci, O., Sahin, U. Selective uptake of naked vaccine RNA by dendritic cells is driven by macropinocytosis and abrogated upon DC maturation // Gene Therapy – 2011. – V. 18. – P. 702–708. 34. Lorenz, C., Fotin-Mleczek, M., Roth, G., Becker, C., Dam, T. C., Verdurmen, W. P., Brock, R., Probst, J., Schlake, T. Protein expression from exogenous mRNA: uptake by receptormediated endocytosis and trafficking via the lysosomal pathway // RNA Biol. – 2011. – V. 8. –N . 4. – P. 627-36. 125 35. Duttagupta, R., Jiang, R., Gollub, J., Getts, R. C., Jones, K. W. Impact of Cellular miRNAs on Circulating miRNA Biomarker Signatures // PLoS One – 2011. – V. 6. – P. e20769. 36. Pritchard, C. C., Kroh, E., Wood, B., Arroyo, J. D., Dougherty, K. J., Miyaji, M. M., Tait, J. F., Tewari, M. Blood cell origin of circulating microRNAs: a cautionary note for cancer biomarker studies // Cancer Prev. Res. Phila. – 2012. – V. 5. – N. 3. – P. 492-7. 37. Hunter, M. P., Ismail, N., Zhang, X., Aguda, B. D., Lee, E. J., Yu, L., Xiao, T., Schafer, J., Lee, M. L., Schmittgen, T. D., Nana-Sinkam, S. P., Jarjoura, D., Marsh, C. B. Detection of microRNA expression in human peripheral blood microvesicles // PLoS ONE – 2008. – V. 3. – P. e3694. 38. Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins // Nat. Cell Biol. – 2011. – V. 13. – P. 423–433. 39. Landgraf, P., Rusu, M., Sheridan, R., Sewer, A., Iovino, N., Aravin, A., Pfeffer, S., Rice, A., Kamphorst, A. O., Landthaler, M., Lin, C., Socci, N. D., Hermida, L., Fulci, V., Chiaretti, S., Foà, R., Schliwka, J., Fuchs, U., Novosel, A., Müller, R. U., Schermer, B., Bissels, U., Inman, J., Phan, Q., Chien, M., Weir, D. B., Choksi, R., De Vita, G., Frezzetti, D., Trompeter, H. I., Hornung, V., Teng, G., Hartmann, G., Palkovits, M., Di Lauro, R., Wernet, P., Macino, G., Rogler, C. E., Nagle, J. W., Ju, J., Papavasiliou, F. N., Benzing, T., Lichter, P., Tam, W., Brownstein, M. J., Bosio, A., Borkhardt, A., Russo, J. J., Sander, C., Zavolan, M., Tuschl, T. A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing // Cell – 2007. – V. 129. – N. 7. – P. 1401-14. 40. Georgantas, R. W. 3rd, Hildreth, R., Morisot, S., Alder, J., Liu, C. G., Heimfeld, S., Calin, G. A., Croce, C. M., Civin, C. I. CD34+ hematopoietic stem-progenitor cell microRNA expression and function: a circuit diagram of differentiation control // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 2007. –V. 104. – N. 8. – P. 2750-5. 41. Corsten, M. F., Dennert, R., Jochems, S., Kuznetsova, T., Devaux, Y., Hofstra, L., Wagner, D. R., Staessen, J. A., Heymans, S., Schroen, B. Circulating microRNA-208b and microRNA-499 reflect myocardial damage in cardiovascular disease // Circ. Cardiovasc. Genet. – 2010. – V. 3. – P. 499–506. 42. Lewis, A. P., Jopling, C. L. Regulation and biological function of the liver-specific miR122 // Biochem. Soc. Trans. – 2010. – V. 38. – P. 1553–1557. 43. Feng, G., Li, G., Gentil-Perret, A., Tostain, J., Genin, C. Elevated serum-circulating RNA in patients with conventional renal cell cancer // Anticancer Res. – 2008. – V. 28. –P. 321–6. 44. Starkey Lewis, P. J., Dear, J., Platt, V., Simpson, K. J., Craig, D. G., Antoine, D. J., French, N. S., Dhaun, N., Webb, D. J., Costello, E. M., Neoptolemos, J. P., Moggs, J., Goldring, C. E., Park, B. K. Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury // Hepatology – 2011. – V. 54. – P. 1767-76. 126 45. Baggish, A. L., Park, J., Min, P. K., Isaacs, S., Parker, B. A., Thompson, P. D., Troyanos, C., D'Hemecourt, P., Dyer, S., Thiel, M., Hale, A., Chan, S. Y. Rapid upregulation and clearance of distinct circulating microRNAs after prolonged aerobic exercise // J. Appl. Physiol. – 2014. – V. 116. – N. 5. – P. 522-531. 46. Sehgal, A., Chen, Q., Gibbings, D., Sah, D. W., Bumcrot, D. Tissue-specific gene silencing monitored in circulating RNA // RNA. – 2014. – V. 20. – N. 2. – P. 143-149. 47. Wang, K., Li, H., Yuan, Y., Etheridge, A., Zhou, Y., Huang, D., Wilmes, P., Galas, D. The complex exogenous RNA spectra in human plasma: an interface with human gut biota // PLoS One – 2012. – V. 7. – N. 12. – P. e51009. 48. Moss, T., Stefanovsky, V. Y. Promotion and regulation of ribosomal transcription in eukaryotes by RNA polymerase I // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. – 1995. – V. 50. – P. 25-66. 49. Rykova, E. Y., Wunsche, W., Brizgunova, O. E., Skvortsova, T. E., Tamkovich, S. N., Senin, I. S., Laktionov, P. P., Sczakiel, G., Vlassov, V. V. Concentrations of circulating RNA from healthy donors and cancer patients estimated by different methods // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2006. – V. 1075. – P. 328-33. 50. Valadi, H., Ekström, K., Bossios, A., Sjöstrand, M., Lee, J. J., Lötvall, J. O. Exosomemediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells // Nat. Cell Biol. – 2007. – V. 9. – P. 654–659. 51. Finnegan, E. F., Pasquinelli, A. E. MicroRNA biogenesis: regulating the regulators // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. – 2013. – V. 48. – N. 1. – P. 51-68. 52. Chim, S. S., Shing, T. K., Hung, E. C., Leung, T. Y., Lau, T. K., Chiu, R. W., Lo, Y. M. Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma // Clin. Chem. – 2008. – V. 54. – P. 482–490. 53. Lawrie, C. H., Gal, S., Dunlop, H. M., Pushkaran, B., Liggins, A. P., Pulford, K., Banham, A. H., Pezzella, F., Boultwood, J., Wainscoat, J. S., Hatton, C. S., Harris, A. L. Detection of elevated levels of tumourassociated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma // Br. J. Haematol. – 2008. – V. 141. – P. 672–675. 54. URL: http://www.mirbase.org/ 55. Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay // Nat. Rev. Genet. – 2010. – V. 11. – P. 597–610. 56. Turchinovich, A., Weiz, L., Burwinkel, B. Extracellular miRNAs: the mystery of their origin and function // Trends Biochem. Sci. – 2012. – V. 37. – N. 11. – P. 460-5. 57. Boon, R. A., Vickers, K. C. Intercellular transport of microRNAs // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2013. – V. 33. – N. 2. – P. 186-92. 127 58. Russo, F., Di Bella, S., Bonnici, V., Laganà, A., Rainaldi, G., Pellegrini, M., Pulvirenti, A., Giugno, R., Ferro, A. A knowledge base for the discovery of function, diagnostic potential and drug effects on cellular and extracellular miRNAs // BMC Genomics. – 2014. – V. 15. - Suppl 3:S4. 59. URL: http://atlas.dmi.unict.it/mirandola/index.php 60. Watkins, N. J., Bohnsack, M. T. The box C/D and H/ACA snoRNPs: key players in the modification, processing and the dynamic folding of ribosomal RNA // Wiley Interdiscip. Rev. RNA – 2012. – V. 3. – N. 3. – P. 397-414. 61. Dieci, G., Preti, M., Montanini, B. Eukaryotic snoRNAs: a paradigm for gene expression flexibility // Genomics – 2009. – V. 94. – P. 83–88. 62. Gee, H. E., Buffa, F. M., Camps, C., Ramachandran, A., Leek, R., Taylor, M., Patil, M., Sheldon, H., Betts, G., Homer, J., West, C., Ragoussis, J., Harris, A. L. The small-nucleolar RNAs commonly used for microRNA normalisation correlate with tumour pathology and prognosis // Br. J. Cancer – 2011. – V. 104. – P. 1168–1177. 63. Liao, J., Yu, L., Mei, Y., Guarnera, M., Shen, J., Li, R., Liu, Z., Jiang, F. Small nucleolar RNA signatures as biomarkers for non-small-cell lung cancer // Mol. Cancer – 2010. – V. 27. – N. 9. P. 198–207. 64. Appaiah, H. N., Goswami, C. P., Mina, L. A., Badve, S., Sledge, G. W. Jr., Liu, Y., Nakshatri, H. Persistent upregulation of U6:SNORD44 small RNA ratio in the serum of breast cancer patients // Breast Cancer Res. - 2011 – V. 13. – N. 5. – P. R86. 65. Van Roosbroeck, K., Pollet, J., Calin, G. A. miRNAs and long noncoding RNAs as biomarkers in human diseases // Expert Rev. Mol. Diagn. – 2013. – V. 13. – N. 2. – P. 183-204. 66. Wright, M. W., Bruford, E. A. Naming 'junk': human non-protein coding RNA (ncRNA) gene nomenclature // Hum. Genomics. – 2011. – V. 5. – N. 2. – P. 90-8. 67. Djebali, S., Davis, C. A., Merkel, A., Dobin, A., Lassmann, T., Mortazavi, A., Tanzer, A., Lagarde, J., Lin, W., Schlesinger, F., Xue, C., Marinov, G. K., Khatun, J., Williams, B. A., Zaleski, C., Rozowsky, J., Röder, M., Kokocinski, F., Abdelhamid, R. F., Alioto, T., Antoshechkin, I., Baer, M. T., Bar, N. S., Batut, P., Bell, K., Bell, I., Chakrabortty, S., Chen, X., Chrast, J., Curado, J., Derrien, T., Drenkow, J., Dumais, E., Dumais, J., Duttagupta, R., Falconnet, E., Fastuca, M., Fejes-Toth, K., Ferreira, P., Foissac, S., Fullwood, M. J., Gao, H., Gonzalez, D., Gordon, A., Gunawardena, H., Howald, C., Jha, S., Johnson, R., Kapranov, P., King, B., Kingswood, C., Luo, O. J., Park, E., Persaud, K., Preall, J. B., Ribeca, P., Risk, B., Robyr, D., Sammeth, M., Schaffer, L., See, L. H., Shahab, A., Skancke, J., Suzuki, A. M., Takahashi, H., Tilgner, H., Trout, D., Walters, N., Wang, H., Wrobel, J., Yu, Y., Ruan, X., Hayashizaki, Y., Harrow, J., Gerstein, M., Hubbard, T., Reymond, A., Antonarakis, S. E., Hannon, G., Giddings, M. C., Ruan, Y., Wold, B., Carninci, P., Guigó, R., Gingeras, T. R. Landscape of transcription in human cells // Nature. – 2012. – V. 489. – N. 7414. – P. 101-8. 128 68. URL: http://www.lncrnadb.org/ 69. Quek, X. C., Thomson, D. W., Maag, J. L., Bartonicek, N., Signal, B., Clark, M. B., Gloss, B. S., Dinger, M. E. lncRNAdb v2.0: expanding the reference database for functional long noncoding RNAs // Nucleic Acids Res. – 2015. – V. 43. – D. 168-73. 70. Ma, L., Bajic, V. B., Zhang, Z. On the classification of long non-coding RNAs // RNA Biol. – 2013. – V. 10. – N. 6. – P. 925-33. 71. Li, Z., Ender, C., Meister, G., Moore, P. S., Chang, Y., John, B. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs // Nucleic Acids Res. – 2012. – V. 40. - N. 14. – P. 6787-99. 72. Falaleeva, M., Stamm, S. Processing of snoRNAs as a new source of regulatory non-coding RNAs: snoRNA fragments form a new class of functional RNAs // Bioessays. – 2013. – V. 35. – N. 1. – P.46-54. 73. Blackwell, B. J., Lopez, M. F., Wang, J., Krastins, B., Sarracino, D., Tollervey, J. R., Dobke, M., Jordan, I. K., Lunyak, V. V. Protein interactions with piALU RNA indicates putative participation of retroRNA in the cell cycle, DNA repair and chromatin assembly // Mob. Genet. Elements – 2012. – V. 2. –N. 1. – P. 26-35. 74. Tsui, N.B., Ng, E.K. Lo, Y.M. Molecular analysis of circulating RNA in plasma // Methods Mol. Biol. – 2006. – V. 336. – P. 123-134. 75. Ng, E.K., Tsui, N.B., Lam, N.Y., Chiu, R.W., Yu, S.C., Wong, S.C., Lo, E.S., Rainer, T.H., Johnson, P.J., Lo, Y.M. Presence of filterable and nonfilterable mRNA in the plasma of cancer patients and healthy individuals // Clin. Chem. – 2002. – V. 48. – P. 1212-1217. 76. Théry, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications // Biol. Rep. – 2011. – V. 3. – P. 15. 77. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function // Nat. Rev. Immunol. – 2002. – V. 2. – P. 569–579. 78. Mause, S. F., Weber, C. Microparticles: protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange // Circ. Res. – 2010. – V. 107. – P. 1047–1057. 79. Ratajczak, J., Miekus, K., Kucia, M., Zhang, J., Reca, R., Dvorak, P., Ratajczak, M.Z. Embryonic stem cell-derived microvesicles reprogram hematopoietic progenitors: evidence for horizontal transfer of mRNA and protein delivery // Leukemia. – 2006. – V. 20. – P. 847-856. 80. Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. Tumour derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes // Immunol. Lett. - 2007. – V. 113. – P. 76-82. 129 81. Lachenal, G., Pernet-Gallay, K., Chivet, M., Hemming, F. J., Belly, A., Bodon, G., Blot, B., Haase, G., Goldberg, Y., Sadoul, R. Release of exosomes from differentiated neurons and its regulation by synaptic glutamatergic activity // Mol. Cell Neurosci. – 2011. – V. 46. – P. 409–418. 82. Vrijsen, K. R., Sluijter, J. P., Schuchardt, M. W., van Balkom, B. W., Noort, W. A., Chamuleau, S. A., Doevendans, P. A. Cardiomyocyte progenitor cell-derived exosomes stimulate migration of endothelial cells // J. Cell Mol. Med. – 2010. – V. 14. – P. 1064–1070. 83. Rosell, R., Wei, J., Taron, M. Circulating MicroRNA Signatures of Tumor-Derived Exosomes for Early Diagnosis of Non-Small-Cell Lung Cancer // Clin. Lung Cancer – 2009. – V. 10. P. 8–9. 84. Van Wijk, M. J., Van Bavel, E., Sturk, A., Nieuwland, R. Microparticles in cardiovascular diseases // Cardiovasc. Res. – 2003. – V. 59. – P. 277–287. 85. Heijnen, H. F., Schiel, A. E., Fijnheer, R., Geuze, H. J., Sixma, J. J. Activated platelets release two types of membrane vesicles: microvesicles by surface shedding and exosomes derived from exocytosis of multivesicular bodies and alpha-granules // Blood – 1999. – V. 94. – P. 3791–3799. 86. Guduric-Fuchs, J., O'Connor, A., Camp, B., O'Neill, C. L., Medina, R. J., Simpson, D. A. Selective extracellular vesicle-mediated export of an overlapping set of microRNAs from multiple cell types // BMC Genomics – 2012. – V. 13. – P. 357-75. 87. Diehl, P., Fricke, A., Sander, L., Stamm, J., Bassler, N., Htun, N., Ziemann, M., Helbing, T., El-Osta, A., Jowett, J. B., Peter, K. Microparticles: major transport vehicles for distinct microRNAs in circulation // Cardiovasc. Res. – 2012. – V. 93. – N. 4. – P. 633-44. 88. Collino, F., Deregibus, M. C., Bruno, S., Sterpone, L., Aghemo, G., Viltono, L., Tetta, C., Camussi, G. Microvesicles derived from adult human bone marrow and tissue specific mesenchymal stem cells shuttle selected pattern of miRNAs// PLoS ONE – 2010. –V. 5. – P. e11803. 89. Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids // Nucleic Acids Res. – 2012. – V. 40. – P. 1241-4. 90. URL: http://exocarta.org 91. Anderson, P., Kedersha, N. RNA granules // J. Cell Biol. – 2006. – V. 172. – P. 803–808. 92. Thomas, M. G., Martinez Tosar, L. J., Loschi, M., Pasquini, J. M., Correale, J., Kindler, S., Boccaccio, G. L. Staufen recruitment into stress granules does not affect early mRNA transport in oligodendrocytes // Mol. Biol. Cell – 2005. – V. 16. – P. 405–420. 93. Hock, J., Meister, G. The Argonaute protein family // Genome Biol. – 2008. – V. 9. – P. 210-18. 94. Nolte-'t Hoen, E. N., Buermans, H. P., Waasdorp, M., Stoorvogel, W., Wauben, M. H., 't Hoen, P. A. Deep sequencing of RNA from immune cell-derived vesicles uncovers the selective 130 incorporation of small non-coding RNA biotypes with potential regulatory functions // Nucleic Acids Res. – 2012. – V. 40. – N. 18. – P. 9272-85. 95. Yuan, A., Farber, E. L., Rapoport, A. L., Tejada, D., Deniskin, R., Akhmedov, N. B., Farber, D. B. Transfer of microRNAs by embryonic stem cell microvesicles // PLoS One – 2009. – V. 4. – N. 3. – P. e4722. 96. Deregibus, M. C., Cantaluppi, V., Calogero, R., Lo Iacono, M., Tetta, C., Biancone, L., Bruno, S., Bussolati, B., Camussi, G. Endothelial progenitor cell derived microvesicles activate an angiogenic program in endothelial cells by a horizontal transfer of mRNA // Blood – 2007. – V. 110. – P. 2440–2448. 97. Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Urbanowicz, B., Bran´ ski, P., Ratajczak, M. Z., Zembala, M. Tumour-derived microvesicles carry several surface determinants and mRNA of tumour cells and transfer some of these determinants to monocytes // Cancer Immunol. Immunother. – 2006. – V. 55. – N. 7. – P. 808–18. 98. Zernecke, A., Bidzhekov, K., Noels, H., Shagdarsuren, E., Gan, L., Denecke, B., Hristov, M., Köppel, T., Jahantigh, M. N., Lutgens, E., Wang, S., Olson, E. N., Schober, A., Weber, C. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection // Sci. Signal. – 2009. – V. 2. – P. ra81. 99. Janas, T., Janas, T., Yarus, M. Specific RNA binding to ordered phospholipid bilayers // Nucleic Acids Res. – 2006. – V. 34. – P. 2128–2136. 100. Shahzad, M. M., Mangala, L. S., Han, H. D., Lu, C., Bottsford-Miller, J., Nishimura, M., Mora, E. M., Lee, J. W., Stone, R. L., Pecot, C. V., Thanapprapasr, D., Roh, J. W., Gaur, P., Nair, M. P., Park, Y. Y., Sabnis, N., Deavers, M. T., Lee, J. S., Ellis, L. M., Lopez-Berestein, G., McConathy, W. J., Prokai, L., Lacko, A. G., Sood, A. K. Targeted delivery of small interfering RNA using reconstituted high-density lipoprotein nanoparticles // Neoplasia – 2011. – V. 13. – P. 309–319. 101. Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport // Curr. Opin. Lipidol. – 2010. – V. 21. –P. 229–238. 102. Andrews, K. L., Moore, X. L., Chin-Dusting, J. P. Anti-atherogenic effects of high-density lipoprotein on nitric oxide synthesis in the endothelium // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. – 2010. – V. 37. – N. 7. – P. 736-42. 103. Podrez, E. A. Antioxidant Properties of High Density Lipoprotein and Atherosclerosis // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. – 2010. – V. 37. – P. 719–725. 104. Wagner, J., Riwanto, M., Besler, C., Knau, A., Fichtlscherer, S., Röxe, T., Zeiher, A. M., Landmesser, U., Dimmeler, S. Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2013. –V. 33. N. 6. – P. 13921400. 131 105. Tabet, F., Vickers, K. C., Cuesta Torres, L. F., Wiese, C. B., Shoucri, B. M., Lambert, G., Catherinet, C., Prado-Lourenco, L., Levin, M. G., Thacker, S., Sethupathy, P., Barter, P. J., Remaley, A. T., Rye, K. A. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells // Nat. Commun. – 2014. – V. 5. – N. 3292. 106. Wang, K., Zhang, S., Weber, J., Baxter, D., Galas, D. J. Export of microRNAs and microRNA-protective protein by mammalian cells // Nucleic Acids Res. – 2010. – V. 38. – P. 7248– 7259. 107. Gagnon, K. T., Corey, D. R. Argonaute and the nuclear RNAs: new pathways for RNAmediated control of gene expression // Nucleic Acid Ther. – 2012. – V. 22. – N. 1. – P. 3-16. 108. Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA // Nucleic Acids Res. – 2011. – V. 39. – P. 7223–7233. 109. Arroyo, J. D., Chevillet, J. R., Kroh, E. M., Ruf, I. K., Pritchard, C. C., Gibson, D. F., Mitchell, P. S., Bennett, C. F., Pogosova-Agadjanyan, E. L., Stirewalt, D. L., Tait, J. F., Tewari, M. Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 2011. – V. 108. – P. 5003–5008. 110. Gallo, A., Tandon, M., Alevizos, I., Illei, G. G. The majority of microRNAs detectable in serum and saliva is concentrated in exosomes // PLoS ONE – 2012. – V. 7. – P. e30679. 111. Probst, J., Weide, B., Scheel, B., Pichler, B. J., Hoerr, I., Rammensee, H. G. Pascolo, S. Spontaneous cellular uptake of exogenous messenger RNA in vivo is nucleic acid-specific, saturable and ion dependent // Gene Therapy – 2007. – V. 14. – P. 1175–1180. 112. Valiunas, V., Polosina, Y.Y., Miller, H., Potapova, I.A., Valiuniene, L., Doronin, S., Mathias, R.T., Robinson, R.B., Rosen, M.R., Cohen, I.S., Brink, P.R. Connexin-specific cell-to-cell transfer of short interfering RNA by gap junctions // J. Physiol. – 2005. – V. 568. – P. 459–468. 113. Montecalvo, A., Larregina, A. T., Shufesky, W. J., Stolz, D. B., Sullivan, M. L., Karlsson, J. M., Baty, C. J., Gibson, G. A., Erdos, G., Wang, Z., Milosevic, J., Tkacheva, O. A., Divito, S. J., Jordan, R., Lyons-Weiler, J., Watkins, S. C., Morelli, A. E. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes // Blood – 2012. – V. 119. – P. 756–766. 114. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review // J. Insect. Physiol. – 2010. – V. 56. – N. 3. – P. 227-35. 115. Feinberg, E.H., Hunter, C.P. Transport of dsRNA into cells by the transmembrane protein SID-1 // Science. – 2003. – V. 301. – P. 1545–1547. 116. Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length // RNA. – 2009. – V. 15. – N. 3. – P. 384-90. 117. Shih, J. D., Hunter, C. P. SID-1 is a dsRNA-selective dsRNA-gated channel // RNA. – 2011. – V. 17. – N. 6. – P. 1057-65. 132 118. McEwan, D. L., Weisman, A. S., Hunter, C. P. Uptake of extracellular double-stranded RNA by SID-2 // Mol. Cell. – 2012. – V. 47. – N. 5. – P. 746-54. 119. Su, A.I., Wiltshire, T., Batalov, S., Lapp, H., Ching, K.A., Block, D., Zhang, J., Soden, R., Hayakawa, M., Kreiman, G., Cooke, M.P., Walker, J.R., Hogenesch, J.B. A gene atlas of the mouse and human protein-encoding transcriptomes // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. – 2004. – V. 101. – P. 6062-6067. 120. Duxbury, M.S., Ashley, S.W., Whang, E.E. RNA interference: a mammalian SID-1 homologue enhances siRNA uptake and gene silencing efficacy in human cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2005. – V. 331. – P. 459-463. 121. Wolfrum, C., Shi, S., Jayaprakash, K.N., Jayaraman, M., Wang, G., Pandey, R.K., Rajeev, K.G., Nakayama, T., Charrise, K., Ndungo, E.M., Zimmermann, T., Koteliansky, V., Manoharan, M., Stoffel, M. Mechanisms and optimization of in vivo delivery of lipophilic siRNAs // Nat. Biotechnol. – 2007. – V. 25. – P. 1149-1157. 122. Ulvila, J., Parikka, M., Kleino, A., Sormunen, R., Ezekowitz, R. A., Kocks, C., Rämet, M. Double-stranded RNA is internalized by scavenger receptor-mediated endocytosis in Drosophila S2 cells // J. Biol. Chem. – 2006. – V. 281. – N. 20. – P. 4370-5. 123. Saleh, M. C., van Rij, R. P., Hekele, A., Gillis, A., Foley, E., O'Farrell, P. H., Andino, R. The endocytic pathway mediates cell entry of dsRNA to induce RNAi silencing // Nat. Cell. Biol. – 2006. – V. 8. – N. 8. – P. 793-802. 124. Pegtel, D. M., Cosmopoulos, K., Thorley-Lawson, D. A., van Eijndhoven, M. A., Hopmans, E. S., Lindenberg, J. L., de Gruijl, T. D., Würdinger, T., Middeldorp, J. M. Functional delivery of viral miRNAs via exosomes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 2010. – V. 107. – P. 6328– 6333. 125. Mittelbrunn, M., Gutiérrez-Vázquez, C., Villarroya-Beltri, C., González, S., SánchezCabo, F., González, M. Á., Bernad, A., Sánchez-Madrid, F. Unidirectional transfer of microRNA loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells // Nat. Commun. – 2011. – V. 2. – P. 282. 126. Sakamoto, K., Fordis, C. M., Corsico, C. D., Howard, T. H., Howard, B. H. Modulation of HeLa cell growth by transfected 7SL RNA and Alu gene sequences // J. Biol. Chem. - 1991. - V. 266. – N. 5. - P. 3031-3038. 127. Zhao, X., Yu, Y. T. Targeted pre-mRNA modification for gene silencing and regulation // Nat. Methods – 2008. – V. 5. – N. 1. – P. 95-100. 128. Nakazawa, F., Kannemeier, C., Shibamiya, A., Song, Y., Tzima, E., Schubert, U., Koyama, T., Niepmann, M., Trusheim, H., Engelmann, B., Preissner, K. T. Extracellular RNA is a natural cofactor for the (auto-)activation of Factor VII-activating protease (FSAP) // Biochem. J. – 2005. – V. 385. – P. 831–838. 133 129. Muhl, L., Nykjaer, A., Wygrecka, M., Monard, D., Preissner, K. T., Kanse, S. M. Inhibition of PDGF-BB by factor VII-activating protease (FSAP) is neutralized by protease nexin-1 and the FSAP-inhibitor complexes are internalized via LRP // Biochem. J. – 2007. – V. 404. – P. 191– 196. 130. Zeerleder, S., Zwart, B., te Velthuis, H., Stephan, F., Manoe, R., Rensink, I., Aarden, L. A. Nucleosome-releasing factor: a new role for factor VII-activating protease (FSAP) // FASEB J. – 2008. – V. 22. – P. 4077–4084. 131. Colman, R. W., Schmaier, A. H. Contact system: a vascular biology modulator with anticoagulant, profibrinolytic, antiadhesive, and proinflammatory attributes // Blood – 1997. – V. 90. – P. 3819–3843. 132. Müller, F., Mutch, N. J., Schenk, W. A., Smith, S. A., Esterl, L., Spronk, H. M., Schmidbauer, S., Gahl, W. A., Morrissey, J. H., Renné, T. Platelet polyphosphates are proinflammatory and procoagulant mediators in vivo // Cell – 2009. – V. 139. – P. 1143–1156. 133. Gansler, J., Jaax, M., Leiting, S., Appel, B., Greinacher, A., Fischer, S., Preissner, K. T. Structural requirements for the procoagulant activity of nucleic acids // Plos ONE – 2012. – V. 7. – P. e50399. 134. Fischer, S., Gerriets, T., Wessels, C., Walberer, M., Kostin, S., Stolz, E., Zheleva, K., Hocke, A., Hippenstiel, S., Preissner, K. T. Extracellular RNA mediates endothelial-cell permeability via vascular endothelial growth factor // Blood – 2007. – V. 110. – P. 2457–2465. 135. Fischer, S., Nishio, M., Peters, S. C., Tschernatsch, M., Walberer, M., Weidemann, S., Heidenreich, R., Couraud, P. O., Weksler, B. B., Romero, I. A., Gerriets, T., Preissner, K. T. Signaling mechanism of extracellular RNA in endothelial cells // FASEB J. – 2009. – V. 23. – P. 2100–2109. 136. Deindl, E., Fischer, S., Preissner, K. T. New directions in inflammation and immunity: the multi-functional role of the extracellular RNA/RNase system // Indian J. Biochem. Biophys. – 2009. – V. 46. – P. 461–466. 137. Medzhitov, R., Preston-Hurburt, P., Janeway, C. A. Jr. A human homologue of the Drophila Toll protein signals activation of adaptive immunity // Nature – 1997. – V. 368. – P. 394– 397. 138. Takeda, K., Akira, S. Toll-like receptors in innate immunity // Int. Immunol. - 2005. V. 17. – N. 1. - P. 1-14. 139. Palaniyar, N., Nadesalingam, J., Clark, H., Shih, M. J., Dodds, A. W., Reid, K. B. Nucleic acid is a novel ligand for innate, immune pattern recognition collectins surfactant proteins A and D and mannose-binding lectin // J. Biol. Chem. – 2004. – V. 279. – P. 32728–32736. 140. Sioud, M. Innate sensing of self and non-self RNAs by Toll-like receptors // Trends Mol. Med. – 2006. – V. 12. - P. 167–176. 134 141. Ishii, K.J., Akira, S. TLR ignores methylated RNA // Immunity. – 2005. – V. 23. – P. 111–113. 142. Fischer, S., Grantzow, T., Pagel, J. I., Tschernatsch, M., Sperandio, M., Preissner, K. T., Deindl, E. Extracellular RNA promotes leukocyte recruitment in the vascular system by mobilizing proinflammatory cytokines // Thromb. Haemost. – 2012. – V. 108. – P. 730–741. 143. Fischer, S., Nishio, M., Dadkhahi, S., Gansler, J., Saffarzadeh, M., Shibamiyama, A., Kral, N., Baal, N., Koyama, T., Deindl, E., Preissner, K. T. Expression and localisation of vascular ribonucleases in endothelial cells // Thromb. Haemost. – 2011. – V. 105. – P. 345–355. 144. Blasius, A. L, Beutler, B. Intracellular toll-like receptors // Immunity. – 2010. – V. 32. – N. 3. – P.305–315. 145. Weiss, R., Scheiblhofer, S., Roesler, E., Weinberger, E., Thalhamer, J. mRNA vaccination as a safe approach for specific protection from type I allergy // Expert Rev. Vaccines – 2012. – V. 11. – N. 1. – P. 55-67. 146. Fotin-Mleczek, M., Zanzinger, K., Heidenreich, R., Lorenz, C., Thess, A., Duchardt, K. M., Kallen, K. J. Highly potent mRNA based cancer vaccines represent an attractive platform for combination therapies supporting an improved therapeutic effect // J. Gene Med. – 2012. - V. 14. – N. 6. – P.428-39. 147. Hergenreider, E., Heydt, S., Tréguer, K., Boettger, T., Horrevoets, A. J., Zeiher, A. M., Scheffer, M. P., Frangakis, A. S., Yin, X., Mayr, M., Braun, T., Urbich, C., Boon, R. A., Dimmeler, S. Atheroprotective communication between endothelial cells and smooth muscle cells through miRNAs // Nat. Cell Biol. – 2012. – V. 14. – P. 249–256. 148. Zhang, Y., Liu, D., Chen, X., Li, J., Li, L., Bian, Z., Sun, F., Lu, J., Yin, Y., Cai, X., Sun, Q., Wang, K., Ba, Y., Wang, Q., Wang, D., Yang, J., Liu, P., Xu, T., Yan, Q., Zhang, J., Zen, K., Zhang, C. Y. Secreted monocytic miR-150 enhances targeted endothelial cell migration // Mol. Cell. – 2010. – V. 39. – P. 133–144. 149. Mazzocca, A., Coppari, R., De Franco, R., Cho, J. Y., Libermann, T. A., Pinzani, M., Toker, A. A secreted form of ADAM9 promotes carcinoma invasion through tumor-stromal interactions // Cancer research – 2005. – V. 65. – P. 4728–4738. 150. Singer, C. F., Gschwantler-Kaulich, D., Fink-Retter, A., Haas, C., Hudelist, G., Czerwenka, K., Kubista, E. Differential gene expression profile in breast cancer-derived stromal fibroblasts // Breast Cancer Res. Treat. – 2008. – V. 110. – N. 2. – P. 273-81. 151. Chanmee, T., Ontong, P., Konno, K., Itano, N. Tumor-associated macrophages as major players in the tumor microenvironment // Cancers (Basel) – 2014. – V. 6. – N. 3. – P. 1670-90. 135 152. White, N. M., Fatoohi, E., Metias, M., Jung, K., Stephan, C., Yousef, G. M. Metastamirs: A stepping stone towards improved cancer management // Nat. Rev. Clin. Oncol. – 2011. – V. 8. – P. 75–84. 153. Skog, J., Würdinger, T., van Rijn, S., Meijer, D. H., Gainche, L., Sena-Esteves, M., Curry, W. T. Jr., Carter, B. S., Krichevsky, A. M., Breakefield, X. O. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers // Nat. Cell Biol. – 2008. – V. 10. – P. 1470–1476. 154. Kogure, T., Lin, W. L., Yan, I. K., Braconi, C., Patel, T. Intercellular nanovesiclemediated microRNA transfer: a mechanism of environmental modulation of hepatocellular cancer cell growth // Hepatology – 2011. – V. 54. – P. 1237–1248. 155. Ohshima, K., Inoue, K., Fujiwara, A., Hatakeyama, K., Kanto, K., Watanabe, Y., Muramatsu, K., Fukuda, Y., Ogura, S., Yamaguchi, K., Mochizuki, T. Let-7 microRNA family is selectively secreted into the extracellular environment via exosomes in a metastatic gastric cancer cell line // PLoS ONE – 2010. – V. 5. – P. e13247. 156. Xin, H., Li, Y., Buller, B., Katakowski, M., Zhang, Y., Wang, X., Shang, X., Zhang, Z. G., Chopp, M. Exosome-mediated transfer of miR-133b from multipotent mesenchymal stromal cells to neural cells contributes to neurite outgrowth // Stem Cells – 2012. – V. 30. – P. 1556–1564. 157. Chinnappa, P., Taguba, L., Arciaga, R., Faiman, C., Siperstein, A., Mehta, A. E., Reddy, S. K., Nasr, C., Gupta, M. K. Detection of thyrotropin-receptor messenger ribonucleic acid (mRNA) and thyroglobulin mRNA transcripts in peripheral blood of patients with thyroid disease: sensitive and specific markers for thyroid cancer // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2004. – V. 89. – N. 8. –P. 3705–9. 158. Coelho, S. M., Buescu, A., Corbo, R., Carvalho, D. P., Vaisman, M. Recurrence of papillary thyroid cancer suspected by high anti-thyroglobulin antibody levels and detection of peripheral blood thyroglobulin mRNA // Arq. Bras. Endocrinol. Metabol. – 2008. – V. 52. –N. 8. – P. 1321–5. 159. Fugazzola, L., Mihalich, A., Persani, L., Cerutti, N., Reina, M., Bonomi, M., Ponti, E., Mannavola, D., Giammona, E., Vannucchi, G., di Blasio, A. M., Beck-Peccoz, P. Highly sensitive serum thyroglobulin and circulating thyroglobulin mRNA evaluations in the management of patients with differentiated thyroid cancer in apparent remission // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2002. – V. 87. – N. 7. – P. 3201–8. 160. Lombardi, C. P., Bossola, M., Princi, P., Boscherini, M., La Torre, G., Raffaelli, M., Traini, E., Salvatori, M., Pontecorvi, A., Bellantone, R. Circulating thyroglobulin mRNA does not predict early and midterm recurrences in patients undergoing thyroidectomy for cancer // Am. J. Surg. – 2008. – V. 196. – N. 3. – P. 326–32. 136 161. Denizot, A., Delfino, C., Dutour-Meyer, A., Fina, F., Ouafik, L. Evaluation of quantitative measurement of thyroglobulin mRNA in the follow-up of differentiated thyroid cancer // Thyroid – 2003. – V. 13. – N. 9. – P. 867–72. 162. Eszlinger, M., Neumann, S., Otto, L., Paschke, R. Thyroglobulin mRNA quantification in the peripheral blood is not a reliable marker for the follow-up of patients with differentiated thyroid cancer // Eur. J. Endocrinol. – 2002. – V. 147. – N. 5. – P. 575–82. 163. Okamura, K. Diversity of animal small RNA pathways and their biological utility // Wiley Interdiscip. Rev. RNA – 2012. – V. 3. – N. 3. – P. 351-68. 164. Aigner, A. MicroRNAs (miRNAs) in cancer invasion and metastasis: therapeutic approaches based on metastasis-related miRNAs // J. Mol. Med. Berl. – 2011. – V. 89. – N. 5. – P. 445-57. 165. Li, Y., Qiu, C., Tu, J., Geng, B., Yang, J., Jiang, T., Cui, Q. HMDD v2.0: a database for experimentally supported human microRNA and disease associations // Nucleic Acids Res. – 2014. – V. 42. - D1070-4. 166. URL: http://www.cuilab.cn/hmdd 167. Williams, Z., Ben-Dov, I. Z., Elias, R., Mihailovic, A., Brown, M., Rosenwaks, Z., Tuschl, T. Comprehensive profiling of circulating microRNA via small RNA sequencing of cDNA libraries reveals biomarker potential and limitations // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 2013. – V. 110. – N. 11. – P. 4255-60. 168. Poon, L.L., Leung, T.N., Lau, T.K., Lo, Y.M. Circulating fetal RNA in maternal plasma // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 2001. – V. 945. – P. 207-210. 169. Wataganara, T., LeShane, E. S., Chen, A. Y., Borgatta, L., Peter, I., Johnson, K. L., Bianchi, D. W. Plasma gamma-globin gene expression suggests that fetal hematopoietic cells contribute to the pool of circulating cell-free fetal nucleic acids during pregnancy // Clin. Chem. – 2004. – V. 50. – P. 689–93. 170. Ng, E. K., Leung, T. N., Tsui, N. B., Lau, T. K., Panesar, N. S., Chiu, R. W., Lo. Y. M. The concentration of circulating corticotropin-releasing hormone mRNA in maternal plasma is increased in preeclampsia // Clin. Chem. – 2003. – V. 49. – P. 727–31. 171. Picchiassi, E., Coata, G., Centra, M., Pennacchi, L., Bini, V., Di Renzo, G.C. Identification of universal mRNA markers for noninvasive prenatal screening of trisomies // Prenat. Diagn. – 2010. – V. 30. – N. 8. – P. 764-770. 172. Oudejans, C. B., Go, A. T., Visser, A., Mulders, M. A., Westerman, B. A., Blankenstein, M. A., van Vugt, J. M. Detection of chromosome 21-encoded mRNA of placental origin in maternal plasma // Clin. Chem. – 2003. – V. 49. – P. 1445–9. 137 173. Tsui, N. B., Chim, S. S., Chiu, R. W., Lau, T. K., Ng, E. K., Leung, T. N, Tong, Y. K., Chan, K. C., Lo, Y. M. Systematic microarray based identification of placental mRNA in maternal plasma: towards noninvasive prenatal gene expression profiling // J. Med. Genet. – 2004. – V. 41. – P. 461–7. 174. Tijsen, A. J., Pinto, Y. M., Creemers, E. E. Circulating microRNAs as diagnostic biomarkers for cardiovascular diseases // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2012. – V. 303. - N. 9. – P.1085-95. 175. Gupta, S. K., Bang, C., Thum, T. Circulating microRNAs as biomarkers and potential paracrine mediators of cardiovascular disease // Circ. Cardiovasc. Genet. – 2010. – V. 3. – P. 484–488. 176. Fichtlscherer, S., De Rosa, S., Fox, H., Schwietz, T., Fischer, A., Liebetrau, C., Weber, M., Hamm, C. W., Roxe, T., Muller-Ardogan, M., Bonauer, A., Zeiher, A. M., Dimmeler, S. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease // Circ. Res. – 2010. – V. 107. – P. 677-684. 177. Li, S., Zhu, J., Zhang, W., Chen, Y., Zhang, K., Popescu, L. M., Ma, X., Lau, W. B., Rong, R., Yu, X., Wang, B., Li, Y., Xiao, C., Zhang, M., Wang, S., Yu, L., Chen, A. F., Yang, X., Cai, J. Signature microRNA expression profile of essential hypertension and its novel link to human cytomegalovirus infection // Circulation – 2011. – V. 124. – P. 175-184. 178. Goren, Y., Kushnir, M., Zafrir, B., Tabak, S., Lewis, B. S., Amir, O. Serum levels of 624 microRNAs in patients with heart failure // Eur. J. Heart Fail. - 2011. – V. 14. – N. 2. – P. 147-54. 179. Tijsen, A. J., Creemers, E. E., Moerland, P. D., de Windt, L. J., van der Wal, A. C., Kok, W. E., Pinto, Y. M. MiR423-5p as a circulating biomarker for heart failure // Circ. Res. – 2010. – V. 106. –P. 1035-1039. 180. Wang, G. K., Zhu, J. Q., Zhang, J. T., Li, Q., Li, Y., He, J., Qin, Y. W., Jing, Q. Circulating microRNA: a novel potential biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in humans // Eur. Heart J. – 2010. – V. 31. – P. 659–66. 181. Ai, J., Zhang, R., Li, Y., Pu, J., Lu, Y., Jiao, J., Li, K., Yu, B., Li, Z., Wang, R., Wang, L., Li, Q., Wang, N., Shan, H., Li, Z., Yang, B. Circulating microRNA-1 as a potential novel biomarker for acute myocardial infarction // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2010. – V. 391. – P. 73–7. 182. Shalchi, Z., Sandhu, H. S., Butt, A. N., Smith, S., Powrie, J., Swaminathan, R. Retinaspecific mRNA in the assessment of diabetic retinopathy // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2008. – V. 1137. – P. 253–7. 183. Butt, A., Ahmad, M. S., Powrie, J., Swaminathan, R. Assessment of diabetic retinopathy by measuring retina-specific mRNA in blood // Expert Opin. Biol. Ther. – 2012. – V. 12. – P. S79-84. 184. Nielsen, L. B., Wang, C., Sørensen, K., Bang-Berthelsen, C. H., Hansen, L., Andersen, M. L., Hougaard, P., Juul, A., Zhang, C. Y., Pociot, F., Mortensen, H. B. Circulating levels of microRNA 138 from children with newly diagnosed type 1 diabetes and healthy controls: evidence that miR-25 associates to residual beta-cell function and glycaemic control during disease progression // Exp. Diabetes Res. – 2012. – V. 2012. 185. Zampetaki, A., Kiechl, S., Drozdov, I., Willeit, P., Mayr, U., Prokopi, M., Mayr, A., Weger, S., Oberhollenzer, F., Bonora, E., Shah, A., Willeit, J., Mayr, M. Plasma microRNA profiling reveals loss of endothelial miR-126 and other microRNAs in type 2 diabetes // Circ. Res. – 2010. – V. 107. – P. 810-817. 186. Murata, K., Yoshitomi, H., Tanida, S., Ishikawa, M., Nishitani, K., Ito, H., Nakamura, T. Plasma and synovial fluid microRNAs as potential biomarkers of rheumatoid arthritis and osteoarthritis // Arthritis. Res. Ther. – 2010. – V. 12. –P. R86. 187. Rong, H., Liu, T. B., Yang, K. J., Yang, H. C., Wu, D. H., Liao, C. P., Hong, F., Yang, H. Z., Wan, F., Ye, X. Y., Xu, D., Zhang, X., Chao, C. A., Shen, Q. J. MicroRNA-134 plasma levels before and after treatment for bipolar mania // J. Psychiatr. Res. – 2011. –V. 45. –P. 92-5. 188. Wang, G., Tam, L. S., Li, E. K., Kwan, B. C., Chow, K. M., Luk, C. C., Li, P. K., Szeto, C. C. Serum and urinary free microRNA level in patients with systemic lupus erythematosus // Lupus – 2011. – V. 20. – N. 5. – P. 493-500. 189. Wang, G., Tam, L. S., Li, E. K., Kwan, B. C., Chow, K. M., Luk, C. C., Li, P. K., Szeto, C. C. Serum and urinary cell-free MiR-146a and MiR-155 in patients with systemic lupus erythematosus // J. Rheumatol. – 2010. –V. 37. –N. 12. – P. 2516-22. 190. Wang, J. F., Yu, M. L., Yu, G., Bian, J. J., Deng, X. M., Wan, X. J., Zhu, K. M. Serum miR-1467a and miR-223 as potential new biomarkers for sepsis // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2010. – V. 394. – P. 184–188. 191. Tzimagiorgis, G., Michailidou, E. Z., Kritis, A., Markopoulos, A. K., Kouidou, S. Recovering circulating extracellular or cell-free RNA from bodily fluids // Cancer Epidemiol. – 2011. – V. 35. –N. 6. – P. 580-9. 192. Yu, M., Ting, D. T., Stott, S. L., Wittner, B. S., Ozsolak, F., Paul, S., Ciciliano, J. C., Smas, M. E., Winokur, D., Gilman, A. J., Ulman, M. J., Xega, K., Contino, G., Alagesan, B., Brannigan, B. W., Milos, P. M., Ryan, D. P., Sequist, L. V., Bardeesy, N., Ramaswamy, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis // Nature – 2012. – V. 487. – P. 510-3. 193. Ramsköld, D., Luo, S., Wang, Y. C., Li, R., Deng, Q., Faridani, O. R., Daniels, G. A., Khrebtukova, I., Loring, J. F., Laurent, L. C., Schroth, G. P., Sandberg, R. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells // Nat. Biotechnol. – 2012. – V. 30. – N. 8. – P. 777-82. 139 194. Кулигина, Е. Ш. Эпидемиологические и молекулярные аспекты рака молочной железы // Практическая онкология. — 2010. — Т. 11. — № 4. — С. 203-216. 195. El-Abd, E., El-Tahan, R., Fahmy, L., Zaki, S., Faid, W., Sobhi, A., Kandil, K., El-Kwisky, F. Serum metastasin mRNA is an important survival predictor in breast cancer // Br. J. Biomed. Sci. – 2008. – V. 65. – N. 2. – P. 90–4. 196. Voorzanger-Rousselot, N., Goehrig, D., Journe, F., Doriath, V., Body, J. J., Cle´ zardin, P., Garnero, P. Increased Dickkopf-1 expression in breast cancer bone metastases // Br. J. Cancer – 2007. – V. 97. – N. 7. – P. 964–70. 197. Perhavec, A., Cerkovnik, P., Novakovic, S., Zgajnar, J. The hTERT mRNA in plasma samples of early breast cancer patients, non-cancer patients and healthy individuals // Neoplasma – 2008. – V. 55. – N. 6. – P. 549–54. 198. Wu, X., Somlo, G., Yu, Y., Palomares, M. R., Li, A. X., Zhou, W., Chow, A., Yen, Y., Rossi, J. J., Gao, H., Wang, J., Yuan, Y. C., Frankel, P., Li, S., Ashing-Giwa, K. T., Sun, G., Wang, Y., Smith, R., Robinson, K., Ren, X., Wang, S. E. De novo sequencing of circulating miRNAs identifies novel markers predicting clinical outcome of locally advanced breast cancer // J. Transl. Med. – 2012 – V. 10. – P. 42. 199. Asaga, S., Kuo, C., Nguyen, T., Terpenning, M., Giuliano, A. E., Hoon, D. S. Direct serum assay for microRNA-21 concentrations in early and advanced breast cancer // Clin. Chem. – 2011. – V. 57. –P. 84-91. 200. van Schooneveld, E., Wouters, M. C., Van der Auwera, I., Peeters, D. J., Wildiers, H., Van Dam, P. A., Vergote, I., Vermeulen, P. B., Dirix, L. Y., Van Laere, S. J. Expression profiling of cancerous and normal breast tissues identifies microRNAs that are differentially expressed in serum from patients with (metastatic) breast cancer and healthy volunteers // Breast Cancer Res. - 2012. – V. 14. –N. 1. – P. R34. 201. Wu, Q., Wang, C., Lu, Z., Guo, L., Ge, Q. Analysis of serum genome-wide microRNAs for breast cancer detection // Clin. Chim. Acta – 2012. – V. 413. – P. 1058-65. 202. Орлов, С. В. Симптоматика, диагностика и стадирование немелкоклеточного рака легкого // Практическая Онкология. – 2000. - №3 – c. 8-16. 203. Miura, N., Nakamura, H., Sato, R., Tsukamoto, T., Harada, T., Takahashi, S., Adachi, Y., Shomori, K., Sano, A., Kishimoto, Y., Ito, H., Hasegawa, J., Shiota, G. Clinical usefulness of serum telomerase reverse transcriptase (hTERT) mRNA and epidermal growth factor receptor (EGFR) mRNA as a novel tumor marker for lung cancer // Cancer Sci. – 2006. – V. 97. – N. 12. – P. 1366–73. 204. Hu, Z., Chen, X., Zhao, Y., Tian, T., Jin, G., Shu, Y., Chen, Y., Xu, L., Zen, K., Zhang, C., Shen, H. Serum microRNA signatures identified in a genomewide serum microRNA expression 140 profiling predict survival of non-small-cell lung cancer // J. Clin. Oncol. – 2010. – V. 28. – N. 10. – P. 1721–6. 205. Foss, K. M., Sima, C., Ugolini, D., Neri, M., Allen, K. E., Weiss, G. J. MiR-1254 and miR-574-5p: serum-based microRNA biomarkers for early-stage non-small cell lung cancer // J. Thorac. Oncol. – 2011. – V. 6. – P. 482–8. 206. Keller, A., Leidinger, P., Borries, A., Wendschlag, A., Wucherpfennig, F., Scheffler, M., Huwer, H., Lenhof, H. P., Meese, E. MiRNAs in lung cancer – studying complex fingerprints in patient’s blood cells by microarray experiments // BMC Cancer – 2009. – V. 9. – P. 353-363. 207. Shen, J., Todd, N. W., Zhang, H., Yu, L., Lingxiao, X., Mei, Y., Guarnera, M., Liao, J., Chou, A., Lu, C. L., Jiang, Z., Fang, H., Katz, R. L., Jiang, F. Plasma microRNAs as potential biomarkers for non-small-cell lung cancer // Lab. Invest. – 2011. – V. 91. – P. 579–87. 208. Liu, X. G., Zhu, W. Y., Huang, Y. Y., Ma, L. N., Zhou, S. Q., Wang, Y. K., Zeng, F., Zhou, J. H., Zhang, Y. K. High expression of serum miR-21 and tumor miR-200c associated with poor prognosis in patients with lung cancer // Med. Oncol. – 2011. – V. 29. – N. 2. – P. 618-26. 209. Wei, J., Gao, W., Zhu, C. J., Liu, Y. Q., Mei, Z., Cheng, T., Shu, Y. Q. Identification of plasma microRNA-21 as a biomarker for early detection and chemosensitivity of nonsmall cell lung cancer // Chin. J. Cancer – 2011. – V. 30. – N. 6. – P. 407-14. 210. Boeri, M., Verri, C., Conte, D., Roz, L., Modena, P., Facchinetti, F., Calabro, E., Croce, C. M., Pastorino, U., Sozzi, G. MicroRNA signatures in tissues and plasma predict development and prognosis of computed tomography detected lung cancer // Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. – 2011. – V. 108. – P. 3713–8. 211. Wang, K., Yuan, Y., Cho, J. H., McClarty, S., Baxter, D., Galas, D. Comparing the MicroRNA spectrum between serum and plasma // J. PLoS One. – 2012. – V. 7. – N. 7. - P: e41561. 212. Konishi, H., Ichikawa, D., Komatsu, S., Shiozaki, A., Tsujiura, M., Takeshita, H., Morimura, R., Nagata, H., Arita, T., Kawaguchi, T., Hirashima, S., Fujiwara, H., Okamoto, K., Otsuji, E. Detection of gastric cancer-associated microRNAs on microRNA microarray comparing pre- and post-operative plasma // Br. J. Cancer – 2012. – V. 106. – N. 4. – P. 740-7. 213. Liu, R., Zhang, C., Hu, Z., Li, G., Wang, C., Yang, C., Huang, D., Chen, X., Zhang, H., Zhuang, R., Deng, T., Liu, H., Yin, J., Wang, S., Zen, K., Ba, Y., Zhang, C. Y. A five-microRNA signature identified from genomewide serum microRNA expression profiling serves as a fingerprint for gastric cancer diagnosis // Eur. J. Cancer – 2011. – V. 47. – P. 784-91. 214. Barbosa, G. F., Milas, M. Peripheral thyrotropin receptor mRNA as a novel marker for differentiated thyroid cancer diagnosis and surveillance // Expert Rev. Anticancer Ther. – 2008. –V. 8. – N. 9. – P. 1415–24. 141 215. Yu, S., Liu, Y., Wang, J., Guo, Z., Zhang, Q., Yu, F., Zhang, Y., Huang, K., Li, Y., Song, E., Zheng, X. L., Xiao, H. Circulating microRNA profiles as potential biomarkers for diagnosis of papillary thyroid carcinoma // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2012. – V. 97. – N. 6. – P. 2084-92. 216. Kong, X., Du, Y., Wang, G., Gao, J., Gong, Y., Li, L., Zhang, Z., Zhu, J., Jing, Q., Qin, Y., Li, Z. Detection of differentially expressed microRNAs in serum of pancreatic ductal adenocarcinoma patients: miR-196a could be a potential marker for poor prognosis // Dig. Dis. Sci. – 2011. – V. 56. – P. 602-9. 217. Zhang, C., Wang, C., Chen, X., Yang, C., Li, K., Wang, J., Dai, J., Hu, Z., Zhou, X., Chen, L., Zhang, Y., Li, Y., Qiu, H., Xing, J., Liang, Z., Ren, B., Yang, C., Zen, K., Zhang, C. Y. Expression profile of microRNAs in serum: a fingerprint for esophageal squamous cell carcinoma // Clin. Chem. – 2010. – V. 56. – P. 1871-9. 218. Komatsu, S., Ichikawa, D., Takeshita, H., Tsujiura, M., Morimura, R., Nagata, H., Kosuga, T., Iitaka, D., Konishi, H., Shiozaki, A., Fujiwara, H., Okamoto, K., Otsuji, E. Circulating microRNAs in plasma of patients with oesophageal squamous cell carcinoma // Br. J. Cancer – 2011. – V. 105. – P. 104-11. 219. Hirajima, S., Komatsu, S., Ichikawa, D., Takeshita, H., Konishi, H., Shiozaki, A., Morimura, R., Tsujiura, M., Nagata, H., Kawaguchi, T., Arita, T., Kubota, T., Fujiwara, H., Okamoto, K., Otsuji, E. Clinical impact of circulating miR-18a in plasma of patients with oesophageal squamous cell carcinoma // Br. J. Cancer. – 2013. – V. 108. – N. 9. – P.1822-1829. 220. Wu, C., Wang, C., Guan, X., Liu, Y., Li, D., Zhou, X., Zhang, Y., Chen, X., Wang, J., Zen, K., Zhang, C. Y., Zhang, C. Diagnostic and Prognostic Implications of a Serum miRNA Panel in Oesophageal Squamous Cell Carcinoma // PLoS One. – 2014. – V. 9. – N. 3. – e92292. 221. Yang, Y., Gu, X., Zhou, M., Xiang, J., Chen, Z. Serum microRNAs: A new diagnostic method for colorectal cancer // Biomed. Rep. – 2013. – V. 1. – N. 4. – P. 495-498. 222. Brase, J. C., Johannes, M., Schlomm, T., Fälth, M., Haese, A., Steuber, T., Beissbarth, T., Kuner, R., Sültmann, H. Circulating miRNAs are correlated with tumor progression in prostate cancer // Int. J. Cancer – 2011. – V. 128. – P. 608-16. 223. Lodes, M.J., Caraballo, M., Suciu, D., Munro, S., Kumar, A., Anderson, B. Detection of Cancer with Serum miRNAs on an Oligonucleotide Microarray // PLoS ONE. – 2009. – V. 4. – P. e6229. 224. Kanemaru, H., Fukushima, S., Yamashita, J., Honda, N., Oyama, R., Kakimoto, A., Masuguchi, S., Ishihara, T., Inoue, Y., Jinnin, M., Ihn, H. The circulating microRNA-221 level in patients with malignant melanoma as a new tumor marker // J. Dermatol. Sci. – 2011. – V. 61. – P. 187-93. 142 225. Yang, C., Wang, C., Chen, X., Chen, S., Zhang, Y., Zhi, F., Wang, J., Li, L., Zhou, X., Li, N., Pan, H., Zhang, J., Zen, K., Zhang, C. Y., Zhang, C. Identification of seven serum microRNAs from a genome-wide serum microRNA expression profile as potential noninvasive biomarkers for malignant astrocytomas // Int. J. Cancer – 2013. – V. 132. – N. 1. – P. 116-27. 226. Moussay, E., Wang, K., Cho, J. H., van Moer, K., Pierson, S., Paggetti, J., Nazarov, P. V., Palissot, V., Hood, L. E., Berchem, G., Galas, D. J. MicroRNA as biomarkers and regulators in B-cell chronic lymphocytic leukemia // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 2011. – V. 108. – P. 6573–6578. 227. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S.L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome // Genome Biol. – 2009. – V.10. – N. 3. R25. 228. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/251831106 229. Jurka, J., Kapitonov, V. V., Pavlicek, A., Klonowski, P., Kohany, O., Walichiewicz, J. Repbase Update, a database of eukaryotic repetitive elements // Cytogenet. Genome Res. – 2005. – V. 110. – P. 462-467. 230. Chan, P. P., Lowe, T. M. GtRNAdb: A database of transfer RNA genes detected in genomic sequence // Nucl. Acids Res. – 2009. – V. 37. - (Database issue) D93-97. 231. URL: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Homo_sapiens/RNA/ 232. URL: ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/refGen.txt.gz 233. URL: https://github.com/alexa-kur/transcript2genome 234. URL: ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/chromosomes 235. URL: http://www.htslib.org 236. URL: http://www.broadinstitute.org/igv/ 237. URL: http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/ 238. Trapnell, C., Williams, B. A., Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., van Baren, M. J., Salzberg, S. L., Wold, B. J., Pachter, L. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation // Nat. Biotechnol. – 2010. – V. 28. - N. 5. – P. 511-515. 239. URL: ftp://mirbase.org/pub/mirbase/CURRENT/mature.fa.gz 240. Friedländer, M. R., Mackowiak, S. D., Li, N., Chen, W., Rajewsky, N. miRDeep2 accurately identifies known and hundreds of novel microRNA genes in seven animal clades // Nucleic Acids Res. - 2012. – V. 40. - P. 37-52. 241. Lewis B. P., Burge C. B., Bartel D.P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets // Cell. – 2005. – V. 120. – P. 15–20. 242. URL: http://www.targetscan.org/vert_50/seedmatch.html 143 243. Raymond, C. K., Roberts, B. S., Garrett-Engele, P., Lim, L. P., Johnson, J. M. Simple, quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs // RNA. – 2005. – V. 11. – N. 11. – P.1737-44. 244. Shen, J., Xie, K., Xiong, L. Global expression profiling of rice microRNAs by one-tube stem-loop reverse transcription quantitative PCR revealed important roles of microRNAs in abiotic stress responses // Mol. Genet. Genomics. – 2010. – V. 284. – N. 6. – P. 477-88. 245. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // Journal of immunological methods. - 1983. - V. 65. - P. 55-63. 246. Galluzzi L., Vitale I., Kepp O., Seror C., Hangen E., Perfettini J.L., Modjtahedi N., Kroemer G. Methods to dissect mitochondrial membrane permeabilization in the course of apoptosis // Methods in enzymology. - 2008. - V. 442. - P. 355-374. 247. URL: http://www.illumina.com, Normalization & Differential Analysis Algorithms, BeadStudio Framework User Guide VERSIO3 248. Stepanov, G. A., Semenov, D. V., Savelyeva, A. V., Kuligina, E. V., Koval, O. A., Rabinov, I. V., Richter, V. A. Artificial box C/D RNAs affect pre-mRNA maturation in human cells. // Biomed. Res. Int. - 2013. - e. 656158. 249. Zweig, M. H., Campbell, G. Receiver-operating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine // Clin. Chem. – 1993. – V. 39. – N. 4. – P. 561-77. 250. Florkowski, C. M. Sensitivity, specificity, receiver-operating characteristic (ROC) curves and likelihood ratios: communicating the performance of diagnostic tests // Clin. Biochem. Rev. – 2008. – V. 29. – P. S83-87. 251. Rykova, E. Y., Wunsche, W., Brizgunova, O. E., Skvortsova, T. E., Tamkovich, S. N., Senin, I. S., Laktionov, P. P., Sczakiel, G., Vlassov, V. V. Concentration of circulating RNA from healthy donors and cancer patients estimated by different methods // Ann. New York Acad. Sci. 2006. - V. 1075. - P. 328-333. 252. Feng, G., Li, G., Gentil-Perret, A., Tostain, J., Genin, C. Elevated serum-circulating RNA in patients with conventional renal cell cancer // Anticancer Res. – 2008. – V. 28. – P. 321–6. 253. Kamm, R. C., Smith, A. G. Ribonuclease activity in human plasma // Clin. Biochem. – 1972. – V. 5. – N. 4. – P. 198-200. 254. Tsui, N. B., Ng, E. K., Lo, Y. M. Stability of endogenous and added RNA in blood specimens, serum, and plasma // Clin. Chem. – 2002. – V. 48. – N. 10. – P. 1647-53. 255. SOLiD Whole Transcriptome Analysis Kit Protocol // Life Technologies Corporation, 2009. 256. Ho, C. K., Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of RNA ligase // Structure. – 2004. –V. 12. – N. 2. – P. 327-39. 144 257. Dyer, K.D., Rosenberg, H. F. The RNase a superfamily: generation of diversity and innate host defense // Mol. Divers. - 2006. – V. 10. – N. 4. – P. 585-97. 258. Cuchillo, C. M., Nogués, M. V., Raines, R. T. Bovine pancreatic ribonuclease: fifty years of the first enzymatic reaction mechanism // Biochemistry. – 2011. – V. 50. – N. 37. – P. 7835-41. 259. Hazkani-Covo, E., Zeller, R. M., Martin, W. Molecular poltergeists: mitochondrial DNA copies (numts) in sequenced nuclear genomes // PLoS Genet. – 2010. – V. 6. – N. 2. – e. 1000834. 260. Mercer, T. R., Neph, S., Dinger, M. E., Crawford, J., Smith, M. A., Shearwood, A. M., Haugen, E., Bracken, C. P., Rackham, O., Stamatoyannopoulos, J. A., Filipovska, A., Mattick, J. S. The human mitochondrial transcriptome // Cell. – 2011. – V. 146. – N. 4. – P. 645-58. 261. Georgantas, R. W. 3rd, Hildreth, R., Morisot, S., Alder, J., Liu, C. G., Heimfeld, S., Calin, G. A., Croce, C. M., Civin, C. I. CD34+ hematopoietic stem-progenitor cell microRNA expression and function: a circuit diagram of differentiation control // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2007. – V. 104. – N. 8. – P. 2750-2755. 262. Zardo, G., Ciolfi, A., Vian, L., Starnes, L. M., Billi, M., Racanicchi, S., Maresca, C., Fazi, F., Travaglini, L., Noguera, N., Mancini, M., Nanni, M., Cimino, G., Lo-Coco, F., Grignani, F., Nervi, C. Polycombs and microRNA-223 regulate human granulopoiesis by transcriptional control of target gene expression // Blood. – 2012. – V. 119. – N. 17. – P. 4034-46. 263. Felli, N., Pedini, F., Romania, P., Biffoni, M., Morsilli, O., Castelli, G., Santoro, S., Chicarella, S., Sorrentino, A., Peschle, C., Marziali, G. MicroRNA 223-dependent expression of LMO2 regulates normal erythropoiesis // Haematologica – 2009. – V. 94. – N. 4. – P. 479-86. 264. Yuan, J. Y., Wang, F., Yu, J., Yang, G. H., Liu, X. L., Zhang, J. W. MicroRNA-223 reversibly regulates erythroid and megakaryocytic differentiation of K562 cells // J. Cell Mol. Med. – 2009. – V. 13. – P. 4551-9. 265. Johnnidis, J. B., Harris, M. H., Wheeler, R. T., Stehling-Sun, S., Lam, M. H., Kirak, O., Brummelkamp, T. R., Fleming, M. D., Camargo, F. D. Regulation of progenitor cell proliferation and granulocyte function by microRNA-223 // Nature. – 2008. – V. 451. – P. 1125-9. 266. Lu, H., Buchan, R. J., Cook, S. A. MicroRNA-223 regulates Glut4 expression and cardiomyocyte glucose metabolism // Cardiovasc. Res. – 2010. – V. 86. – N. 3. – P. 410-20. 267. Rowley, J. W., Oler, A. J., Tolley, N. D., Hunter, B. N., Low, E. N., Nix, D. A., Yost, C. C., Zimmerman, G. A., Weyrich, A. S. Genome-wide RNA-seq analysis of human and mouse platelet transcriptomes // Blood. – 2011. –V. 118. – N. 14. – P. 101-111. 268. Yamaguchi, Y., Ouchi, Y. Antimicrobial peptide defensin: identification of novel isoforms and the characterization of their physiological roles and their significance in the pathogenesis of diseases // Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. – 2012. – V. 88. – N. 4. – P. 152-66. 145 269. Su, A. I., Wiltshire, T., Batalov, S., Lapp, H., Ching, K. A., Block, D., Zhang, J., Soden, R., Hayakawa, M., Kreiman, G., Cooke, M. P., Walker, J. R., Hogenesch, J. B. A gene atlas of the mouse and human protein-encoding transcriptomes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2004. – V. 101. N. 16. – P. 6062-6067. 270. Mehra, N., Penning, M., Maas, J., van Daal, N., Giles, R. H., Voest, E. E. Circulating mitochondrial nucleic acids have prognostic value for survival in patients with advanced prostate cancer // Clin. Cancer Res. – 2007. –V. 13. – N. 2. – P. 421-6. 271. Wubbolts, R., Leckie, R. S., Veenhuizen, P. T., Schwarzmann, G., Möbius, W., Hoernschemeyer, J., Slot, J. W., Geuze, H. J., Stoorvogel, W. Proteomic and biochemical analyses of human B cell-derived exosomes. Potential implications for their function and multivesicular body formation // J. Biol. Chem. – 2003. – V. 278. – N. 13. – P. 10963-72. 272. Mears, R., Craven, R. A., Hanrahan, S., Totty, N., Upton, C., Young, S. L., Patel, P., Selby, P. J., Banks, R. E. Proteomic analysis of melanoma-derived exosomes by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis and mass spectrometry // Proteomics. – 2004. – V. 4. – N. 12. P. 4019-31. 273. Gronowicz, G., Swift, H., Steck, T. L. Maturation of the reticulocyte in vitro // J. Cell Sci. – 1984. – V. 71. – P. 177-97. 274. Tickoo, S. K., Lee, M. W., Eble, J. N., Amin, M., Christopherson, T., Zarbo, R. J., Amin, M. B. Ultrastructural observations on mitochondria and microvesicles in renal oncocytoma, chromophobe renal cell carcinoma, and eosinophilic variant of conventional (clear cell) renal cell carcinoma // Am. J. Surg. Pathol. – 2000. – V. 24. – N. 9. – P. 1247-56. 275. Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. Membrane-derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication // Leukemia. – 2006. – V. 20. – N. 9. – P. 1487-95. 276. Turiák, L., Misják, P., Szabó, T. G., Aradi, B., Pálóczi, K., Ozohanics, O., Drahos, L., Kittel, A., Falus, A., Buzás, E. I., Vékey, K. Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice // J. Proteomics. – 2011. – V. 74. – N. 10. – P. 2025-33. 277. Ebralidze, A. K., Guibal, F. C., Steidl, U., Zhang, P., Lee, S., Bartholdy, B., Jorda, M. A., Petkova, V., Rosenbauer, F., Huang, G., Dayaram, T., Klupp, J., O’Brien, K. B., Will, B., Hoogenkamp, M., Borden, K. L., Bonifer, C., Tenen, D. G. PU.1 expression is modulated by the balance of functional sense and antisense RNAs regulated by a shared cis-regulatory element // Genes. Dev. – 2008. – V. 22 - P. 2085–2092. 278. Faghihi, M. A., Modarresi, F., Khalil, A. M., Wood, D. E., Sahagan, B. G., Morgan, T. E., Finch, C. E., St Laurent III, G., Kenny, P. J., Wahlestedt, C. Expression of a noncoding RNA is 146 elevated in Alzheimer’s disease and drives rapid feed-forward regulation of beta-secretase // Nat. Med. – 2008. – V. 14. - P. 723–730. 279. Beltran, M., Puig, I., Pena, C., Garcia, J. M., Alvarez, A. B., Pena, R., Bonilla, F., de Herreros, A. G. A natural antisense transcript regulates Zeb2/Sip1 gene expression during Snail1induced epithelial-mesenchymal transition // Genes. Dev. – 2008. – V. 22. - P. 756–769. 280. Yap, K. L., Li, S., Munoz-Cabello, A. M., Raguz, S., Zeng, L., Mujtaba, S., Gil, J., Walsh, M. J., Zhou, M. M. Molecular interplay of the noncoding RNA ANRIL and methylated histone H3 lysine 27 by polycomb CBX7 in transcriptional silencing of INK4a // Mol. Cell. – 2010. – V. 38. – P. 662–674. 281. Lin, S. J., Zhang, Y., Liu, N. C., Yang, D. R., Li, G., Chang, C. Minireview: Pathophysiological roles of the TR4 nuclear receptor: lessons learned from mice lacking TR4 // Mol. Endocrinol. – 2014. – V. 28. – N. 6. – P. 805-21. 282. Yao, B., Li, S., Chan, E. K. Function of GW182 and GW bodies in siRNA and miRNA pathways // Adv. Exp. Med. Biol. – 2013. – V. 768. – P. 71-96. 283. Состояние онкологической помощи населению России в 2012 году. Под ред. А. Д. Каприна, В. В. Старинского, Г. В. Петровой // М.: ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздрава России, 2013. - 232 с. 284. Fiserova, B., Kubiczkova, L., Sedlarikova, L., Hajek, R., Sevcikova, S. The miR-29 family in hematological malignancies // Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. – 2014. – V. 158. – P. 1-8. 285. Masaki, S., Ohtsuka, R., Abe, Y., Muta, K., Umemura, T. Expression patterns of microRNAs 155 and 451 during normal human erythropoiesis // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2007. – V. 364. – N. 3. – P. 509-14. 286. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method // Methods. – 2001. – V. 25. – N. 4. – P. 402-8. 287. Wang, X. C., Tian, L. L., Jiang, X. Y., Wang, Y. Y., Li, D. G., She, Y., Chang, J. H., Meng, A. M. The expression and function of miRNA-451 in non-small cell lung cancer // Cancer Lett. – 2011. – V. 311. – N. 2. – P. 203-9. 288. Semenov, D. V., Baryakin, D. N., Kamynina, T. P., Kuligina, E. V., Richter, V. A. Fragments of noncoding RNA in plasma of human blood // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2008. – V. 1137. – P.130-134. 289. Yue, W., Yager, J. D., Wang, J. P., Jupe, E. R., Santen, R. J. Estrogen receptor-dependent and independent mechanisms of breast cancer carcinogenesis // Steroids – 2013. – V. 78. – N. 2. – P. 161-70. 147 290. Yager, J. D. Mechanisms of estrogen carcinogenesis: The role of E2/E1-quinone metabolites suggests new approaches to preventive intervention - A review // Steroids – 2015. – V. 99. – P. 56-60. 291. Fang, X. J., Jiang, H., Zhao, X. P., Jiang, W. M. The role of a new CD44st in increasing the invasion capability of the human breast cancer cell line MCF-7 // BMC Cancer – 2011. – V. 11. – P. 290-300. 292. Obiorah, I. E., Fan, P., Sengupta, S., Jordan, V. C. Selective estrogen-induced apoptosis in breast cancer // Steroids – 2014. – V. 90. – P. 60-70. 293. Li, L., Wang, Y., Qi, B., Yuan, D., Dong, S., Guo, D., Zhang, C., Yu, M. Suppression of PMA-induced tumor cell invasion and migration by ginsenoside Rg1 via the inhibition of NF-κBdependent MMP-9 expression // Oncol. Rep. – 2014. – V. 32. – N. 5. – P. 1779-86. 294. Nass, N., Brömme, H. J., Hartig, R., Korkmaz, S., Sel, S., Hirche, F., Ward, A., Simm, A., Wiemann, S., Lykkesfeldt, A. E., Roessner, A., Kalinski, T. Differential response to α-oxoaldehydes in tamoxifen resistant MCF-7 breast cancer cells // PLoS One – 2014. – V. 9. – N. 7. – P. e101473. 295. Hampton, O. A., Den Hollander, P., Miller, C. A., Delgado, D. A., Li, J., Coarfa, C., Harris, R. A., Richards, S., Scherer, S. E., Muzny, D. M., Gibbs, R. A., Lee, A. V., Milosavljevic, A. A sequence-level map of chromosomal breakpoints in the MCF-7 breast cancer cell line yields insights into the evolution of a cancer genome. // Genome Res. – 2009. – V. 19. – N. 2. – P. 167-77. 296. Weirather, J. L., Afshar, P. T., Clark, T. A., Tseng, E., Powers, L. S., Underwood, J. G., Zabner, J., Korlach, J., Wong, W. H., Au, K. F. Characterization of fusion genes and the significantly expressed fusion isoforms in breast cancer by hybrid sequencing // Nucleic Acids Res. – 2015. - pii: gkv562. 297. Bursch, W., Karwan, A., Mayer, M., Dornetshuber, J., Fröhwein, U., Schulte-Hermann, R., Fazi, B., Di Sano, F., Piredda, L., Piacentini, M., Petrovski, G., Fésüs, L., Gerner, C. Cell death and autophagy: cytokines, drugs, and nutritional factors // Toxicology – 2008. – V. 254. – N. 3. – P. 14757. 298. Meacham, W. D., Antoon, J. W., Burow, M. E., Struckhoff, A. P., Beckman, B. S. Sphingolipids as determinants of apoptosis and chemoresistance in the MCF-7 cell model system // Exp. Biol. Med. (Maywood) – 2009. – V. 234. – N. 11. – P. 1253-63. 299. Semenov, D. V., Aronov, P. A., Kuligina, E. V., Potapenko, M. O., Richter, V. A. Oligonucleosome DNA fragmentation of caspase 3 deficient MCF-7 cells in palmitate-induced apoptosis // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids – 2004. – V. 23. – P. 831-6. 300. Luo, E. C., Chang, Y. C., Sher, Y. P., Huang, W. Y., Chuang, L. L., Chiu, Y. C., Tsai, M. H., Chuang, E. Y., Lai, L. C. MicroRNA-769-3p down-regulates NDRG1 and enhances apoptosis in MCF-7 cells during reoxygenation // Sci. Rep. – 2014. - V. 4. – P. 5908. 148 301. Liang, H., Fu, Z., Jiang, X., Wang, N., Wang, F., Wang, X., Zhang, S., Wang, Y., Yan, X., Guan, W. X., Zhang, C. Y., Zen, K., Zhang, Y., Chen, X., Zhou, G. miR-16 promotes the apoptosis of human cancer cells by targeting FEAT // BMC Cancer. – 2015. – V. 15. – P. 448. 302. Deininger, P. L., Batzer, M. A. Mammalian retroelements // Genome Res. – 2002. – V. 12. – N. 10. – P. 1455-1465. 303. Finnegan, D. J. Retrotransposons // Curr. Biol. – 2012. – V. 22. – N. 11. – P. 432-437. 304. Liu, W. M., Chu, W. M., Choudary, P. V., Schmid, C. W. Cell stress and translational inhibitors transiently increase the abundance of mammalian SINE transcripts // Nucleic Acids Res. 1995. - V. 23. – N. 10. - P. 1758-1765. 305. Hasler, J., Strub, K. Alu RNP and Alu RNA regulate translation initiation in vitro // Nucleic Acids Res. - 2006. - V. 34. – N. 8. - P. 2374-2385. 306. Sakamoto, K., Fordis, C. M., Corsico, C. D., Howard, T. H., Howard, B. H. Modulation of HeLa cell growth by transfected 7SL RNA and Alu gene sequences // J. Biol. Chem. - 1991. - V. 266. – N. 5. - P. 3031-3038. 307. Chu, W. M., Ballard, R., Carpick, B. W., Williams, B. R., Schmid, C. W. Potential Alu function: regulation of the activity of double-stranded RNA-activated kinase PKR // Mol. Cell Biol. – 1998. – V. 18. N. 1. – P. 58-68. 308. Kaneko, H., Dridi, S., Tarallo, V., Gelfand, B. D., Fowler, B. J., Cho, W. G., Kleinman, M. E., Ponicsan, S. L., Hauswirth, W. W., Chiodo, V. A., Karikó, K., Yoo, J. W., Lee, D. K., Hadziahmetovic, M., Song, Y., Misra, S., Chaudhuri, G., Buaas, F. W., Braun, R. E., Hinton, D. R., Zhang, Q., Grossniklaus, H. E., Provis, J. M., Madigan, M. C., Milam, A. H., Justice, N. L., Albuquerque, R. J., Blandford, A. D., Bogdanovich, S., Hirano, Y., Witta, J., Fuchs, E., Littman, D. R., Ambati, B. K., Rudin, C. M., Chong, M. M., Provost, P., Kugel, J. F., Goodrich, J. A., Dunaief, J. L., Baffi, J. Z., Ambati, J. DICER1 deficit induces Alu RNA toxicity in age-related macular degeneration // Nature. – 2011. – V. 471. – N. 7338. – P. 325-30. 309. Tarallo, V., Hirano, Y., Gelfand, B. D., Dridi, S., Kerur, N., Kim, Y., Cho, W. G., Kaneko, H., Fowler, B. J., Bogdanovich, S., Albuquerque, R. J., Hauswirth, W. W., Chiodo, V. A., Kugel, J. F., Goodrich, J. A., Ponicsan, S. L., Chaudhuri, G., Murphy, M. P., Dunaief, J. L., Ambati, B. K., Ogura, Y., Yoo, J. W., Lee, D. K., Provost, P., Hinton, D. R., Núñez, G., Baffi, J. Z., Kleinman, M. E., Ambati, J. DICER1 loss and Alu RNA induce age-related macular degeneration via the NLRP3 inflammasome and MyD88 // Cell. - 2012. - V. 149. – N. 4. - P. 847-859. 310. Häsler, J., Strub, K. Alu elements as regulators of gene expression // Nucleic Acids Res. – 2006. – V. 34. – N. 19. – P. 5491-7. 311. Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death // Physiol. Rev. - 2007. - V. 87. – N. 1. - P. 99-163. 149 312. Demchenko A. P. The change of cellular membranes on apoptosis: fluorescence detection // Exp. Oncol. - 2012. - V. 34. – N. 3. - P. 263-268. 313. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction // Biotechnol. Annu. Rev. - 2005. - V. 11. - P. 127-152. 314. Siddik, Z. H. Cisplatin: mode of cytotoxic action and molecular basis of resistance // Oncogene. - 2003. - V. 22. – N. 47. - P. 7265-7279. 315. Jordan, V. C. Tamoxifen (ICI46.474) as a targeted therapy to treat and prevent breast cancer // Br. J. Pharmacol. - 2006. - V. 147. - P. S269-S276. 316. Huennekens, F. M. The methotrexate story: a paradigm for development of cancer chemotherapeutic agents // Adv. Enzyme Regul. - 1994. - V. 34. - P.397-419. 317. Mollenhauer, H. H., Morre, D. J., Rowe, L. D. Alteration of intracellular traffic by monensin; mechanism, specificity and relationship to toxicity // Biochim. Biophys. Acta. - 1990. - V. 1031. - P. 225-246. 318. Sobell, H. Actinomycin and DNA transcription // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1985. - V. 82. - P. 5328–5331. 319. Schneider-Poetsch, T., Ju, J., Eyler, D. E., Dang, Y., Bhat, S., Merrick, W. C., Green, R., Shen, B., Liu, J. O. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin // Nat. Chem. Biol. – 2010. – V. 6. – N. 3. – P. 209-217. 320. Fensterl, V., Sen, G. C. Interferons and viral infections // Biofactors. – 2009. – V. 35. – N. 1. – P. 14-20. 321. Dabo, S., Meurs, E. F. dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection // Viruses. – 2012. – V. 4. – N. 11. – P. 2598-635. 322. Rubin, C. M., Kimura, R. H., Schmid, C. W. Selective stimulation of translational expression by Alu RNA // Nucleic Acids Res. – 2002. – V. 30. – N. 14. – P. 3253-61. 323. Lindner, D. J., Kolla, V., Kalvakolanu, D. V., Borden, E. C. Tamoxifen enhances interferon-regulated gene expression in breast cancer cells // Mol. Cell Biochem. - 1997. - V. 167. – N. 1-2. - P. 169-177. 324. Iacopino, F., Robustelli della Cuna, G., Sica, G. Natural interferon-alpha activity in hormone-sensitive, hormone-resistant and autonomous human breast-cancer cell lines // Int. J. Cancer. - 1997. - V. 71. – N. 6. - P.1103-1108. 325. Der, S. D., Zhou, A., Williams, B. R., Silverman, R. H. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. – N. 26. - P. 15623-15628. 326. Goruppi, S., Iovanna, J. L. Stress-inducible protein p8 is involved in several physiological and pathological processes // J. Biol. Chem. - 2010. - V. 285. – N. 3. - P. 1577-1581. 150 327. Guo X., Wang W., Hu J., Feng K., Pan Y., Zhang L., Feng Y. Lentivirus-mediated RNAi knockdown of NUPR1 inhibits human nonsmall cell lung cancer growth in vitro and in vivo // Anat. Rec. (Hoboken). - 2012. - V. 295. – N. 12. - P. 2114-2121. 328. Carracedo, A., Lorente, M., Egia, A., Blázquez, C., García, S., Giroux, V., Malicet, C., Villuendas, R., Gironella, M., González-Feria, L., Piris, M. A., Iovanna, J. L., Guzmán, M., Velasco, G. The stress-regulated protein p8 mediates cannabinoid-induced apoptosis of tumor cells // Cancer Cell. - 2006. - V. 9. – N. 4. - P. 301-312. 329. Tabas, I., Ron, D. Integrating the mechanisms of apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress // Nat. Cell Biol. - 2011. - V. 13. – N. 3. - P. 184–190. 330. Riemer J., Appenzeller-Herzog C., Johansson L., Bodenmiller B., Hartmann-Petersen R., Ellgaard L. A luminal flavoprotein in endoplasmic reticulum-associated degradation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2009. - V. 106. – N. 35. - P. 14831-14836. 331. Siu F., Chen C., Zhong C., Kilberg M.S. CCAAT/enhancer-binding protein-beta is a mediator of the nutrient-sensing response pathway that activates the human asparagine synthetase gene // J. Biol. Chem. - 2001. - V. 276. – N. 51. - P. 48100-48107. 332. Mariner, P. D., Walters, R. D., Espinoza, C. A., Drullinger, L. F., Wagner, S. D., Kugel, J. F., Goodrich, J. A. Human Alu RNA is a modular transacting repressor of mRNA transcription during heat shock // Mol. Cell. - 2008. - V. 29. – N. 4. - P. 499-509. 333. Yakovchuk, P., Goodrich, J. A., Kugel, J. F. B2 RNA and Alu RNA repress transcription by disrupting contacts between RNA polymerase II and promoter DNA within assembled complexes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2009. - V. 106. – N. 14. - P. 5569-5574.
