ЛЕКЦИИ Основные методы исследования в биотехнологии
advertisement
МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» ЛЕКЦИИ по дисциплине (модулю) Основные методы исследования в биотехнологии Код и направление подготовки Наименование профиля / программы подготовки научно педагогических кадров в аспирантуре Факультет Кафедра – разработчик Ведущий преподаватель 06.06.01 Биотехнология (в том числе бионанотехнология) Перерабатывающих технологий Биотехнологии, биохимии и биофизики Плутахин Г. А. Краснодар Лекция 1 Биотехнология – определения, история развития Фундаментом современной биотехнологии являются молекулярная биология, микробиология, генетика, биохимия, биофизика, технология, приборостроение. За последние 4050 лет про изошло скачкообразное развитие этих наук, что привело к форменной революции в производстве ветеринарных и медицинских биопрепаратов, созданию трансгенных растений и животных с заданными уникальными свойствами. Подобные исследования являются приоритетными направлениями научно технического прогресса и в XXI веке займут ведущее место среди всех наук. Наука формировалась и эволюционировала по мере формирования и развития человеческого общества. Ее возникновение, становление и развитие условно можно подразделить на 4 периода. I. Эмпирический (греч. «эмперикос» – опытный), или доисторический, период – самый длительный, охватывающий при мерно 8000 лет, из которых более 6000 лет до нашей эры и око ло 2000 лет нашей эры. Древние народы того времени интуи тивно использовали приемы и способы изготовления хлеба, пи ва, уксуса, получение кисломолочных продуктов, квашение ка пусты, силосование, которые теперь мы относим к разряду био технологических. II. II. Этиологический (греч. «аитиа» – причина) период в раз витии биотехнологии охватывает вторую половину XIX века и первую треть XX века (18561933 гг.). Он связан с выдающимися исследованиями великого французского ученого Луи Пастера (18221895) – основоположника научной микробиологии. Пас тер установил микробную природу брожений, доказал возможность жизни в бескислородных условиях, экспериментально оп роверг существовавшее тогда представление о самопроизволь ном зарождении живых существ, создал научные основы вакци нопрофилактики и вакцинотерапии; предложил метод пастери зации как способ стерилизации. В этот же период занимались наукой его выдающиеся уче ники, сотрудники и коллеги: Э. Дюкло, Э. Ру, И.И. Мечников, Р. Кох, Д. Листер, III. Ш. Китазато, Д.И. Ивановский и др. 7 В биотехнологии очень важным этапом является приготовление питательных сред для культивирования микроорганизмов и культур клеток. Уже в 1859 г. Л. Пастер приготовил жидкую питательную среду, Р. Коху в 1876 г. удалось вырастить бацил лы сибирской язвы в капле водянистой влаги, извлеченной из глаза погибшей коровы. В 80е гг. XIX столетия Р. Кох предло жил метод культивирования бактерий на стерильных ломтиках картофеля, а позднее – на агаризованных питательных средах. И как следствие этого, удалось доказать индивидуальность микроорганизмов и получить их в чистых культурах. Более того, каждый вид мог быть размножен на питательных средах и ис пользован в целях воспроизведения соответствующих процессов (бродильных, окислительных и др.); например, маслянокислые бактерии и вызываемое ими маслянокислое брожение, лакто бактерии и молочнокислое брожение, дрожжисахаромицеты и спиртовое брожение, уксуснокислые бактерии и окисление эта лона до уксусной кислоты и т.д. В этот период было начато изготовление прессованных пи щевых дрожжей, а также продуктов обмена бактерий (метабо лизма) – ацетона, бутанола, лимонной и молочной кислот. Во Франции приступили к созданию биоустановок для микробио логической очистки сточных вод. Были решены основные задачи по конструированию, созда нию и внедрению в практику необходимого оборудования, в том числе главного из них – биореактора (ферментера, аппарата культиватора). Это оборудование используют и в настоящее время. Среди научных достижений особо стоит отметить следую щие: 1868 г. – Ф. Мишер получил «нуклеин» (ДНК) из лейкоци тов; 1902 г. – Г. Хаберланд показал возможность культивирова ния клеток различных тканей растений в простых питательных растворах; 1912 г. – Ц. Нейберг раскрыл механизм процессов брожения; 1913 г. – Л. Михаэлис и М.Л. Ментен разработали кинетику ферментативных реакций. IV. . Биотехнический период (19331972 гг.). В 1933 г. А. Клюйвер и А.Х. Перкин опубликовали работу «Методы изучения обмена веществ у плесневых грибов», в ко торой изложили основные технические приемы, а также подхо ды к оценке получаемых результатов при глубинном культиви ровании грибов. Началось внедрение в биотехнологию крупно масштабного герметизированного оборудования, обеспечиваю щего проведение процессов в стерильных условиях. Особенно мощный толчок в развитии промышленного биотехнологиче ского оборудования был отмечен в период становления и разви тия производства антибиотиков (время Второй мировой войны 19391945 гг., когда возникла острая необходимость в противо микробных препаратах для лечения больных с инфицированны ми ранами). Все прогрессивное в области биотехнологических и техни ческих дисциплин, достигнутое к тому времени, нашло свое от ражение в биотехнологии. 1937 г. – Кребс открыл цикл трикарбоновых кислот. 1953 г. – Ф. Крик и Дж. Уотсон расшифровали структуру ДНК. Эти факты стали побудительным мотивом для разработки способов крупномасштабного культивирования клеток различ ного происхождения для получения разнообразных клеточных продуктов и самих клеток для нужд человека, и, прежде всего, пенициллина, стрептомицина, тетрациклинов, декстрана, ряда аминокислот и многих других веществ. К 1950 г. Ж. Моно разработал теоретические основы не прерывного управляемого культивирования микробов, кото рые развили в своих исследованиях М. Стефенсон, И. Малек, М.Д. Иерусалимский и др. В этот период французский ученый Р. Горте предложил спо соб долгого культивирования растительных тканей in vitro (в стекле) за счет периодического пересаживания их на свежую питательную среду. Это открытие дало новый толчок в работе по культуре ткани, который ознаменовался нарастающим чис лом новых объектов, успешно введенных в культуру. С открытием в 1955 г. нового класса фитогормонов цитокининов, в частности кинетина, была получена возмож 9 ность стимулировать деление клеток, поддерживать рост кал лусной ткани, индуцировать морфогенез. Большой успех в биотехнологии растений в нашей стране достигнут в институте физиологии растений А.А. Курсановым и Р.Г. Бутенко. В этот период появляются биотехнологические процессы, значительно ускорившие процесс воспроизводства животных. В начале XX века был предложен И.И. Ивановым метод искусст венного осеменения животных. В 1890 г. английский биолог из Кембриджского университета У. Вальтер провел успешную трансплантацию зиготы у кроликов и получил потомство. Начи ная с 1930 г. проводились многочисленные опыты по транс плантации эмбрионов хирургическим путем у лабораторных и сельскохозяйственных животных. В нашей стране наиболее ус пешно осуществлял трансплантацию эмбрионов овец А.И. Ло пырин, свиней – А.В. Квасницкий. IV. Период биотехнологии – геннотехнический (греч. «гине сис» – происхождение, возникновение, рождение) – начался с 1972 г. В этом году в США П. Берг создал первую рекомби нантную молекулу ДНК, тем самым показав возможность на правленных манипуляций с генетическим материалом бактерий. Естественно, что без фундаментальной работы Ф. Крика и Дж. Уотсона (1953 г.) по установлению структуры ДНК, рас шифровки генетического кода (М. Ниренберг, С. Очао, Г. Кора на, 19621966 гг.) было невозможным достигнуть современных результатов в области биотехнологии. Выяснение механизмов функционирования и репликации ДНК, выделение и изучение специфических ферментов привело к формированию строго на учного подхода к разработке биотехнических процессов на ос нове генноинженерных манипуляций. В 1977 г. Итокура синтезировал ген гормона соматотропина человека, а в 1979 г. – ген инсулина человека. Уже в 1982 г. поступил в продажу человеческий инсулин, продуцируемый клетками кишечной палочки. Наряду с инсули ном разработаны следующие генноинженерные препараты: ин терфероны, фактор некротизации опухали (TNF), интерлейкин2, соматотропный гормон человека и аналог его соматодомин Ц, αантитрипсин, гемопоэтин и др. 10 В 1982 г. американские ученые Пальмитер и Бриксон полу чили первых трансгенных мышей. А сегодня уже получены сот ни трансгенных животных и растений. Большие возможности перед генной инженерией открыло изобретение в 1985 г. К. Мулисом полимеразной цепной реак ции, позволившей сделать рутинным процесс синтеза генов. Большой прорыв в клеточной инженерии животных был сделан после разработки Келлером и Милстайном (1975 г.) ме тодики получения моноклональных антител. Стало возможным получать безопасные вакцины (без ДНК возбудителя), а также диагностикумы. Клонирование (копирование) животных только на основе наследственности одного из родителей было впервые осуществ лено Гердоном (в 1962 г.) на лягушках и Вилмутом (1997 г.) – на овцах. В настоящее время имеются сотни клонированных жи вотных, некоторые – в 34 поколениях. С. Вилладсен (Кембридж) разработал микрохирургическую методику деления эмбриона и получения искусственных близ нецов, а также способ клонирования эмбрионов для получения большого количества однородных животных. Так, в Англии для производства высококачественного мяс ного скота разработан дешевый метод получения эмбрионов. Яйцеклетки, полученные от мясных животных, помещают в культуральную среду и оплодотворяют спермой высококласс ных мясных быков. После 6дневного культивирования эмбрио ны вводят молочным малоценным или более старым коровам тем же способом, который применяют при искусственном осе менении. Таким дешевым способом производят 75% говядины в Великобритании. В результате комбинации эмбриональных клеток овец и коз в Великобритании, Германии и США получены овцекозы и хи меры. Наиболее важные достижения биотехнологии в IV периоде. 1. Разработка интенсивных процессов (вместо экстенсив ных) на основе направленных, фундаментальных исследований (с суперпродуцентами антибиотиков, ферментов, аминокислот, витаминов). 2. Создание различных продуктов, необходимых человеку на основе генноинженерных технологий. 11 3. Создание необычных организмов, ранее не существовав ших в природе: неклубеньковых растений, несущих ген азотбак терий, которые отвечают за способность фиксировать молеку лярный азот из воздуха, в результате чего отпадает необходи мость удобрять почву азотсодержащими удобрениями; светя щихся растений; получение химер – овцекозы в США, индоутки – в России; поматогибрида картофеля и томата, клонирование животных. 4. Разработка и внедрение в практику специальной аппара туры, биотехнологических схем. 5. Автоматизация и компьютеризация биотехнологических оптимальных производственных процессов при максимальном использовании дешевого сырья и минимальном потреблении энергии. 6. Внедрение биотехнологии в воспроизводство животных – трансплантация эмбрионов от донора реципиентам – позволяет получить от выдающихся коров более 100 телят и ускоряет в 23 раза селекционный процесс. Лекция 2 Методы культивирования микроорганизмов глубинный, поверхностный, твердофазный Биосинтез пенициллина методом ферментации в 1940-х гг. явился отправным пунктом современной промышленной биотехнологии. Для промышленности выбор между химическим и биологическим синтезом определяется экономическими и экологическими факторами. При химическом синтезе сырьем служат нефть и ее производные, в то время как при биосинтезе используют побочные продукты пищевой и химической промышленности. Кроме утилизации отходов пищевой промышленности микробиологический синтез имеет также то преимущество, что конечный продукт не загрязнен промежуточными продуктами синтеза, и стоимость очистки значительно понижается. Энергетические затраты при этом значительно сокращаются, т.к. микробный синтез не требует высоких температур и давлений. Особое преимущество состоит в том, что большинство как исходных, так и побочных продуктов являются природными биологическими молекулами (первичными и вторичными метаболитами), разрушаемыми в естественных условиях. В агропромышленном комплексе микроорганизмы используются в процессах защиты растений от насекомых используют для утилизации отходов животноводческих ферм, с их помощью получают пищевые добавки для нужд животноводства, микроорганизмы, борются с загрязнением окружающей среды нефтью и ее производными. Набор микроорганизмов, используемый биотехнологами, достаточно широк. В естественных условиях обитания микроорганизмы размножаются только там, где имеются подходящие условия существования. Антагонизм в естественных условиях позволяют выживать только тем организмам, которые более адаптированы к внешней среде и выделяют метаболиты, уничтожающие конкурентов. Именно изучение таких процессов позволило обнаружить первый антибиотик пенициллин и разработать технологию получения его в промышленных масштабах. В настоящее время микроорганизмы (бактерии, дрожжи, плесневые грибы и др.) синтезируют необходимые человеку и животным аминокислоты, витамины, ферменты, кормовые белки и ряд других веществ, питаясь углеводами, создаваемыми в процессе фотосинтеза. Естественно, питательные среды и иные условия подбирают для каждого организма отдельно, однако основные компоненты часто идентичны и достаточно дешевы. Способы культивирования микроорганизмов бывают поверхностными и глубинными. В первом случае клетки выращивают на поверхности либо жидкой питательной среды, либо среды, содержащей гелеобразователь, например, агар-агар. Как правило, это необходимо для ряда аэробных организмов. Глубинное культивирование в жидкой питательной среде используют при выращивании анаэробов и аэробов. В последнем случае питательную среду обогащают кислородом (аэрируют), продувая ее стерильным воздухом. Процесс глубинного культивирования осуществляют в пробирках, колбах и ферментерах. После термической стерилизации ферментер заполняется питательной стерильной средой, подаваемой по специальному трубопроводу, затем вводится культура микроорганизмов в объеме, необходимом для оптимального протекания процесса. Скорость обменных процессов у клеток зависит от поступления внутрь через плазматическую мембрану необходимых питательных веществ. Оптимизация этого процесса осуществляется путем интенсивного перемешивания жидкости (мешалкой с электроприводом). Клетки не оседают на дно ферментера, что ускоряет процесс размножения культуры и синтеза биологически активных веществ. Контроль за процессом осуществляют либо с помощью встроенных датчиков, определяющими необходимый набор параметров, либо периодически стерильно отбирают часть жидкости для лабораторного анализа. Для успешного культивирования аэробных микроорганизмов необходимо постоянное пополнение среды кислородом. Это осуществляется продуванием через специальное распылительное устройство, называемое барботером, стерильного воздуха. При этом идет сильное пенообразование, и возникает опасность, что за период ферментации с пеной и отработанным воздухом может уйти почти вся культуральная среда. Для борьбы с этим явлением в ферментер добавляют пеногасители. По окончании процесса ферментации культуральная жидкость сливается из аппарата и начинается стадия очистки биологически активного компонента. Описанный процесс имеет периодический характер. Более экономически целесообразным является культивирование микроорганизмов с периодическим или непрерывным удалением части культуральной среды и добавлением свежей питательной смеси. При этой технологии процесс культивирования может протекать непрерывно несколько месяцев. Лекция 3 Рестрикционный анализ ДНК. ПЦР. Банки генов Получение генов с помощью специфических эндонуклеаз – рестриктаз. Эти ферментыоткрыты в 1953 г. у бактерий. С помощью рестриктаз расщепляют ДНК бактерий другого штамма или клетки-хозяина. К настоящему времени из разных микроорганизмов выделено более тысячи различных рестриктаз; в генетической инженерии используется около 200. Рестриктазы гидролизируют ДНК строго по определенным специфическим последовательностям, называемым сайтами рестрикции. Каждая из рестриктаз узнает свой сайт рестрикции и разрезает ДНК либо внутри сайта, либо в непосредственной близости от него. Обозначение растриктаз складывается из начальных букв латинского названия вида бактерии, из которой выделен фермент, и дополнительного обозначения, т.к. из бактерий одного вида может быть выделено несколько различных рестриктаз: Escherichia coli – Eco R1, Eco RV; Thermus aguaticus Tag 1. Из нескольких типов рестриктаз в генной инженерии часто используются рестриктазы двух типов, которые узнают определенную последовательность ДНК и гидролизуют ее внутри последовательности сайта рестрикции. Сайты их рестрикции представлены симметричными при повороте на 1800 последовательностям-полиндромами: 5' ГААТТЦ 3' 3' ЦТТААГ5' сайт рестрикции рестриктазы Eco R1 5' ТАГА 3' 3' АТЦГ 5' сайт рестрикции рестриктазы Tag 1. Если рестриктазы II вносят разрывы по оси симметрии узнаваемой последовательности, то они образуют «тупые» концы: ТА ↓ ГА 3' 5' ГТТ ↓ ААЦ 3' Таg АТ ↑ ЦТ 5' Hinc 1 3' ЦАА ↑ ТТГ 5' Если же разрывы образуются со сдвигом и образованием «ступенек», то образуются «липкие» концы: 5' Г ↓ ААТТЦ 3' 5' Ц ↓ ЦГГ 3' Eco R 3' ЦТТАА ↑ Г Hpa II 3' ГГЦ ↑ Ц 5' Фрагменты ДНК, имеющие одинаковые «липкие» концы, могут соединяться друг с другом с помощью ДНК-лигазы, при этом сайт рестрикции восстанавливается. Фрагменты с «липкими» концами наиболее удобны для создания рекомбинантных ДНК. Однако рестриктазы не «выстригают» полностью ген и его нужно либо достраивать химическим путем, либо отщеплять лишние нуклеотидные последовательности. Лекция 4 Методы получение трансгенных организмов. Векторы генной инженерии. В новой биотехнологии чаще используются вирусы и бактерии, растения и животные и их клетки, полученные (или улучшенные) с использованием методов генетической инженерии. Последовательность генно-инженерных процессов следующая: 1. Получение генов. 2. Введение гена в вектор и их клонирование. 3. Методы трансформации животных и растительных клеток. 4. Скрининг – отбор бактерий или клеток, в которые встроился ген. 5. Экспрессия (функционирование) генов у реципиента. 6. Вылавливание генных продуктов из «грязной» смеси. Методы получения генов 1. Химический синтез. Расшифровав последовательность аминокислот в белке и используя генетический код, определяют последовательность нуклеотидов ДНК на участке гена и производят его синтез из нуклеотидов при помощи фермента полимераза-1. Таким путем в 1969 г. Корана впервые синтезировал участок молекулы ДНК, кодирующий аланиновую т-РНК, а в 1977 г. Бойер синтезировал ген соматостатина человека, а затем и ген инсулина. В 1977 г. В. Гилбертом, а также Ф. Сэнгером был предложен метод секвенирования, т.е. распознавания последовательности нуклеотидов в фрагментах нуклеиновых кислот. Метод химиче ского синтеза генов оказался трудоемким и малоэффективным. Затем появились быстрые и простые методы синтеза сравнительно длинных олигонуклеотидов с определенной, заранее заданной, последовательностью нуклеотидов. Теперь довольно легко можно синтезировать последовательность до 100 нуклеотидов. Автоматизация этих процессов еще более облегчает и ускоряет синтез. 2. Рестрикционный метод, или получение генов с помощью специфических эндонуклеаз – рестриктаз (предыдущая лекция). 3. Ферментативный синтез генов стал возможен после открытия фермента обратной транскриптазы или ДНК-ревертазы (Г. Тёмин, Мизутани, 1970), выделенной из онкогенных вирусов. Ревертазы могут синтезировать комплементарную цепь ДНК (к-ДНК) на РНК-матрице. При помощи ДНК-зонда (одноцепочечная меченая молекула ДНК, комплементарная какому-либо участку и-РНК) находят информационную (матричную) РНК. Практически все эукариотические и-РНК содержат на своем 3' конце последовательность, состоящую из остатков аденина (поли А-последовательность), которая присоединяется к и-РНК в результате сплайсинга. Для начала реакции синтеза ДНК-ревертазе нужна затравка в виде небольшого двухцепочечного отрезка. Эту функцию выполняют короткие олигонуклеотиды из 18-20 тиминовых остатков (поли д-Т), которые соединяются по принципу комплементарности с поли А-последовательностью и-РНК. В результате образуется гибридная и-РНК – к-ДНК молекула, причем на конце у нее будет синтезироваться короткий отрезок двухцепочечной ДНК – шпилька. Шпилька служит затравкой для синтеза второй комплементарной цепи ДНК, осуществляющегося уже ферментом ДНК-полимеразойэ Цепь и-РНК гидролизуется РНК-азой, а шпилька (одноцепочечная ДНК) – эндонуклеазой S1. В результате получится двухцепочечная молекула к-ДНК, соответствуюшая структурному гену, с которого транскрибировалась исходная молекула иРНК. К полученной ДНК присоединяют «липкие» концы для встраивания в плазмиду и размножения гена. Подобная схема была использована для получения генов, кодирующих инсулин, гормона роста, интерферона, альбумина, иммуноглобулинов и др. белков, производство которых уже налажено в промышленных масштабах. Возможно и соединение фрагментов ДНК с «тупыми» концами за счет действия ДНК-лигазы, но эффективность такого «сшивания» на порядок ниже. Разработаны методы соединения фрагментов ДНК с «липкими» и «тупыми» концами, что позволяет создавать рекомбинантные молекулы ДНК и в тех случаях, если даже эти фрагменты были получены с использованием различных рестриктаз. Под рекомбинантными ДНК понимают ДНК, образованные объединением in vitro двух и более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников. 4. Химико-ферментативный синтез генов применяется наиболее часто. Химическим путем синтезируют олигонуклеотиды: линкеры, адаптеры, праймеры, промоторы, а гены синтезируют ферментативным методом. Линкеры (англ. «Iink» – соединять) – короткий двухцепочечный олигонуклеотид, содержащий сайты узнавания для ряда рестриктаз. Адаптеры – это линкеры, содержащие более одного сайта узнавания рестриктазой, он предназначен для соединения фрагментов с несовместимыми концами. Праймеры – короткие одноцепочечные фрагменты, комплементарные началу или концу гена. Промотор (80-10 нуклеотидов) – фрагмент ДНК, узнаваемый РНК-полимеразой. В качестве векторов используют, как правило, плазмиды, бактериофаги, мобильные элементы, вирусы животных. В настоящее время создано большое число векторов, и по профилю использования их можно подразделить на несколько типов. 1. Векторы для клонирования фрагмента ДНК. Для этого используются чаще бактериальные плазмиды и фаги. 2. Экспрессионные векторы. Их используют для анализа конкретных последовательностей генов и их белковых продуктов, а также наработок конкретного белка. Экспрессионные векторы для эукариотических организмов всегда содержат так называемую экспрессионную кассету, состоящую из промотора, способного работать в данном организме, и сайта полиаденилирования. 3. Векторы для трансформации. Используются для введения чужеродного фрагмента ДНК в геном реципиента. Обычно такие векторы содержат специфические последовательности, способствующие интеграции в геном. Современные векторные системы часто бывают полифункциональными, совмещая несколько функций в одном векторе. Большинство из них сконструировано при помощи методов генной инженерии. В качестве векторов прокариот используют плазмиды, фаги и их комбинации. Плазмиды – это бактериальные внехромосомные двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК с вариабельными молекулярными массами (1-3% генома бактериальной клетки). Используют плазмиды, способные размножаться автономно, давая до 200 копий, а под действием ингибитора биосинтеза протеинов (хлорамфеникола) – до нескольких тысяч. Используют коньюгативные плазмиды (F) и неконьюгативные (R, Col, D). R-плазмиды содержат гены устойчивости к антибиотикам, Col-плазмиды обеспечивают синтез разных колицинов – высокоспецифических антибиотиков, подавляющих жизнедеятель ность других штаммов и видов бактерий, Д-плазмиды вызывают биодеградацию. Бактериальная клетка обычно может содержать в своем составе плазмиды только одного типа. Встраивание чужеродной ДНК в векторную плазмиду – довольно редкое событие. Только одна из 10-30 полученных после легирования молекул будет рекомбинантной, т.е. нести в своем составе чужеродный фрагмент. Такие клетки отбирают на селективной среде с антибиотиками. Плазмидные векторы имеют небольшую емкость, в них можно клонировать фрагменты длиной не более 7-8 тысяч нуклеотидных пар (т.н.п.), т.е. они пригодны только для клонирования генов прокариот. В генетической инженерии часто используют плазмиду рВR 322, которая содержит репликатор колициногенной плазмиды Col Е1, ген устойчивости к антибиотикам – ампициллину (Amp') и тетрациклину (Тс'). Плазмидные векторы используются чаще всего для размножения (клонирования) гена. В настоящее время клонирование генов успешно осуществляется при помощи полимеразой цепной реакции (ПЦР) в специальных автоматах. Фрагмент ДНК (ген) помещают в прибор, добавляют праймеры (олигонуклеотиды, комплементарные концам фрагмента ДНК), нуклеотиды, ДНК-полимеразу. Раствор нагревают до 950С, вызывая денатурацию ДНК. Затем смесь охлаждают до 50-650С, и праймеры прикрепляются к концам каждой свободной нити ДНК. Снова повышают температуру до 720С, и ДНКполимераза начинает присоединять нуклеотиды к праймерам и строить копии цепочки ДНК. Изменяя температуру, повторяют цикл и копируют ДНК десятки и сотни раз. После 20 циклов счет идет на миллионы. Для прокариот сконструированы векторы на основе фага λ, в которые можно включать фрагменты чужеродной ДНК до 22 т.н.п. Из генома фага вырезают его собственную ДНК, оставляя концевые фрагменты фага неизменными, так как они необходимы для репликации и упаковки ДНК в головку фага (cos-сайты). Для клонирования и переноса более крупных фрагментов ДНК (30-45 т.н.п.) были сконструированы искусственные векторы – космиды, содержащие cos-участок генома фага, за счет чего они могут упаковываться в голову фага λ и специальные последовательности (ori-сайт), позволяющие им реплицироваться по плазмидному типу. Космидами трансформируют клетки E. coli, где они размножаются как плазмиды, и каждая фаговая частица вызывает образование колонии индивидуального бактериального трансформанта. Клонирование фрагментов ДНК от 100 т.н.п. и более осуществляют в специально сконструированных векторах ВАС и VAC. ВАС-векторы получены на основе F-плазмид бактерий и содержат гены, ответственные за репликацию и копийность этих плазмид в бактериальных клетках. Емкость ВАС-векторов составляет 100-300 т.н.п. VAC-векторы представляют собой искусственную дрожжевую минихромосому, содержат центромеру, теломеру и точку начала репликации. В такой вектор можно встроить фрагмент чужеродной ДНК более 100 т.н.п., и такая минихромосома, введенная в клетки дрожжей, будет реплицироваться и вести себя аналогично другим дрожжевым хромосомам при митозе. Эукариотические вирусы нашли более скромное применение в качестве векторов. Практически используется только онкогенный вирус SV-40 и его производные. Все эти векторы – дефектные вирусы, не способные дать полноценные вирусные частицы в клетке хозяина. В генной инженерии широко используются геномные библиотеки и библиотеки кДНК. Геномная библиотека представляет собой клонированный в составе векторов полный набор последовательностей ДНК какого-либо организма. Полученные при помощи рестриктаз фрагменты ДНК лигируют с плечами фага и упаковывают в уже готовые головки фаговых частиц. Хранят фаговый банк под хлороформом при -700С. Библиотекой к-ДНК называют совокупность векторных плазмид, каждая из которых несет в своем составе к-ДНК. Молекулы к-ДНК, сшитые с векторными молекулами, трансформируют в бактериальные клетки: каждая бактерия получает только одну рекомбинантную плазмиду. Лекция 5 Биоконверсия растительного сырья. Традиционные методы заготовки кормов сопряжены с большими потерями питательных веществ, поэтому важно не только стремиться к повышению урожайности и улучшению ботанического состава травостоя, но и применять технологии, сокращающие потери при заготовке и хранении. Основным фактором, обуславливающим повышение продуктивности животных, является биологически полноценное кормление, сбалансированное по всем элементам. При этом особое значение придается обеспеченности животных белком и витаминами. В настоящее время в хозяйствах на одну кормовую единицу приходится в среднем 80 г протеина вместо 105 - 110 г по норме. В результате дефицита протеина продуктивность животных снижается на 30 - 35 %, а себестоимость возрастает в 1,5 - 2 раза. Экономически выгодной высокобелковой кормовой культурой является люцерна. Эта многолетняя культура обеспечивает устойчивый высокий урожай, а по выходу белка и витаминов с единицы площади не уступает даже таким высокобелковым культурам, как горох и соя. Силосование — один из древнейших способов консервирования зеленых кормов. По сравнению с другими способами оно меньше зависит от погодных условий. Силосование является сложным микробиологическим процессом. Кислая реакция среды является основным фактором, регулирующим ферментативные процессы в консервированном естественным способом корме. Поэтому от соблюдения технологии заготовки и хранения зависит качество и выход питательных веществ в норме с единицы площади. По данным краевой лаборатории качества кормов, в последние годы заготавливалось 60 - 68% силоса 1 и 2 класса, а неклассного 10 - 12%. Это значит, что ежегодно теряется часть зеленого корма. Поэтому важной задачей, наряду с увеличением производства консервированных кормов, является улучшение качества и снижение затрат, связанных с их заготовкой. При силосовании свежескошенного сырья с вытекающим соком происходят потери питательных веществ. При консервировании трудносилосующихся и несилосующихся растений, таких, как люцерна, клевер, эспарцет и других содержащих мало сахара, важная роль отводится удалению избытка влаги с целью увеличения осмотического давления в растительной клетке, т.е. влагоудерживающей силы, противостоящей сосущей силе большинства анаэробных бактерий. Так, при обезвоживании растений до влажности 68 70% влагоудерживающая сила клеток повышается до 27 кг/см2, а сосущая сила большинства анаэробных бактерий составляет 50 - 52 кг/см2. Поэтому подсушивание или обезвоживание зеленых растений является одним из методов их консервирования. Наибольшее распространение получила технология заготовки сенажа. Однако соблюдение всех технологических операций заготовки сенажа является сложной и зачастую сложновыполнимой задачей. Введение в технологию заготовки зеленых кормов метода частичного механического обезвоживания зеленых растений позволяет заготавливать корм стабильной влажности (63 67 %) независимо от исходной, которая может колебаться от 70 до 85 %, обеспечить высокую сохранность питательных веществ, значительно снизить энерго- и трудо- затраты, а следовательно, и его себестоимость. Кроме того, данная технология позволяет перевести заготовку зеленых кормов на промышленную основу и практически исключить зависимость ее от погодных условий. Полученный при этом отжатый травяной сок используется при кормлении свиней и птицы как белково-витаминная добавка. Технология приготовления травяной муки из отжатой люцерны отличается от традиционной лишь наличием дополнительной линии для измельчения и частичного обезвоживания зеленой массы перед ее подачей в сушильную камеру агрегатов. Для получения 1 кг травяной муки из зеленых трав необходимо выпаривать до 4,5 кг воды, в то время как при сушке жома - всего 1,25 кг, независимо от влажности поступающей на переработку зеленой массы. При этом на получение 1т травяной муки при сушке зеленой массы расходуется 275 кг/т дизтоплива, при сушке травы после отжима расход дизтоплива составляет 120 кг/т, что на 149 кг меньше расхода ГСМ при заготовке по обычной технологии. Технология механического обезвоживания зеленой массы люцерны и ее заготовки. Заготовку зеленой массы для обезвоживания из бобовых трав производят в фазе начала бутонизации и не позднее начала фазы цветения. кошенная в поле масса доставляется на линию механического фракционирования. Процесс фракционирования на сок и жом производится на стационарной линии, располагающейся непосредственно у кормохранилищ, или в линии агрегата АВМ - 1.5. Механическое фракционирование зеленой люцерны осуществляется следующим образом (рис. 6.1): из транспортных средств масса перегружается в питатель зеленой массы типа ПЗМ - 1.5 из которого подается в измельчитель, где производится разрушение клеточной структуры и стеблей (преимущественно вдоль волокон). Затем масса подвергается отжиму на прессе с удельным давлением 2,5-4,0 МПа и разделяется на сок и жом. В сок переходит 25-35% влаги, содержащейся в исходной массе. Он подвергается очистке от клетчатки и грубых включений в механическом фильтре, смешивается с консервантом и перекачивается в накопительную емкость для дальнейшей коагуляции. Ферментированный сок и коагулят используются при кормлении животных, при выращивании кормовых дрожжей в качестве биостимулятора либо для производства протеиновых зеленых концентратов и т.д. Выходящий из-под пресса жом с влажностью 63-67 % (влажность зависит от физикомеханических свойств перерабатываемой массы, температуры окружающей среды, укоса, вида растений) попадает на транспортер, из которого поступает в кормохранилище. Производительность одной технологической линии зависит от пропускной способности пресса и может составлять от 10 до 25 т/час по зеленой массе В результате отжима сока из вегетативной части зеленых расте-ний, получается измельченная рассыпая масса с характерным травяным запахом. В отжатой люцерне до 80% составляют частицы размером 15-20 и до 20 % — частицы размером 30-50 мм. В процессе прессования влажность травы резко снижается (до 63.5-67%), что обеспечивает благоприятные условия для дальнейшего консервирования и получения доброкачественного корма. Химический состав жома изменяется в зависимости от качества исходной массы, укоса и режима ее обработки. Из зеленой массы люцерны влажностью 76-82% выход травы составляет 60-63%. Отжатая трава имеет высокую биологическую ценность, т.к. в ней сщхраняется до 80 % питательных веществ исходной массы. В сухом веществе отжатой люцерны содержится в среднем: протеина 15.2-16.6%, клетчатки 28.3-39.0%, каротина до 150 мг/кг. Соотношение органических и минеральных веществ в отжатой люцерне оптимально (сбалансировано) для кормления крупного рогатого скота в отличие от исходной массы. Сахаропротеиновое отношение обеспечивает быстрое заквашивание корма и его сохранность. В 1 кг натурального корма содержится 0.26-0.30 кормовых единиц и 29-32 г переваримого протеина, в абсолютно сухом веществе соответственно — 0.76-0.7 и 130-150 г. При консервировании отжатой люцерны получается корм высокого качества с приятным фруктовым запахом, зеленовато-желтого цвета, с хорошо сохраненной структурой растительного сырья. Сохранность сухого вещества при силосовании корма с влажностью протеина — 968-90%. Суммарные потери при заготовке и хранении отжатой люцерны не превышают 6 %. Одним из методов, обеспечивающих снижение потерь питательных веществ в процессе укладки и хранения влажных зеленых кормов, является их химическое консервирование. Для химического консервирования используются органические кислоты (пропионовая, муравьиная, уксусная, бензойная, молочная, и др.), минеральные препараты — пиросульфит натрия, бисульфит натрия, серная, фосфорная кислоты и их смеси. Кроме того в качестве консерванта используют получивший наибольшее распространение консервант КНМК (концентрат низкомолекулярных кислот). Доза внесения консервантов зависит от вида растений и их влажности. Снижение влажности силосуемого сырья сопровождается снижением дозы концентрата. Так при влажности люцерны на выходе из пресса 63-67% доза внесения консерванта КНМК составляет 0.3-0.5%. Химические консерванты обладают и бактерицидными, и фунгицидными свойствами. Они препятствуют, замедляют или прекращают плесневение, закисление, брожение и загнивание кормов при хранении, не подавляя при этом ферментативные процессы в желудочно-кишечном тракте животного. В результате в обработанной консервантами люцерне в течение 2-х суток замедляются процессы самонагревания, что благотворно сказывается на процессе консервирования при вынужденных перерывах в заготовке (непогода и пр.). Ферментированный травяной сок и влажный коагулят можно получить в каждом хозяйстве практически из всех видов зеленых растений, хранить в консервированном виде в течение года, до полного использования. При этом выход питательных веществ с единицы площади возрастет в сравнении с традиционным способом заготовки кормов в 1.5-2 раза. Кроме того, значительно снижаются потери питательных веществ как при производстве, так и при хранении полученных продуктов. Все продукты, полученные при фракционировании зеленой массы, богаты белком, каротином, витаминами группы В, минеральными веществами. Особенно богат ими пастообразный коагулят, полученный из люцерны. В нем содержится 65 г/кг переваримого протеина, до 70 мг/кг каротина. Биоконверсия целлюлозолигниновых субстратов Подготовленное одним или группой описанных физико-химических способов целлюлозолигниновое сырье может дальше перерабатываться биологическими методами, то есть подвергаться биоконверсии. В качестве основных направлений, где требуется грамотное регулирование процессов биоконверсии с целью получения нужных конечных продуктов, можно назвать следующие. Повышение эффективности использования грубых кормов в живой ферментационной системе, какой является желудочно-кишечный тракт жвачных животных. Получение гидролизатов при ферментации грубых субстратов с помощью готовых форм ферментов и их препаратов, полученных промышленным способом. Микробиологическая переработка целлюлозолигнинового сырья для получения углеводно-белковых комплексов. Сюда можно отнести и силосование (заквашивание) соломы. Многоцелевая биоконверсия отходов растениеводства с использованием их для выращивания грибов, получения белково-углеводных добавок, биогумуса и процесса вермикультивирования (выращивания калифорнийского червя). Схема деструкции грубых кормов в четырехкамерном желудке жвачных это вариант микробной ферментации in vivo по многим параметрам копируется микробной ферментацией in vitro в промышленных условиях. Принципиальная сущность этого процесса заключается в том, что в организме жвачных не вырабатывается фермент целлюлаза и переваривание протекает отчасти с помощью бактерий и инфузорий, которые являются симбионтами животных и способны вырабатывать целлюлозу. Как известно, микроорганизмы составляют около 10% сухого вещества содержимого рубца, и сами впоследствии становятся источником микробного белка эндогенного синтеза. Эффективность воздействия микроорганизмов на клетчатку зависит как от предварительной подготовки грубых кормов вне организма, так и от соблюдения многих условий, способствующих активному размножению микроорганизмов. Здесь следует учитывать, что бактерии, гидролизующие клетчатку, являются анаэробами и хорошо развиваются в нейтральной среде при рН 6,5-7,5. Подкисление и подщелачивание содержимого рубца снижает активность микробного воздействия. В результате гидролиза клетчатки в рубце сначала образуется глюкоза, значительная часть которой затем сбраживается до органических кислот, 50-70% из которых приходятся на уксусную ,15-30% пропионовую и 9-20% масляную кислоты. Остальные кислоты в сумме составляют не более 10%. Кроме кислот продуктами сбраживания углеводов являются метан, углекислый газ и водород, не имеющие питательной ценности, но в условиях биоконверсии вне организма животного находящие применение в качестве топлива для котлов (СН4, Н2) и консерванта (СО2). Важнейшим фактором повышения эффективности переработки клетчатки является уровень азотного питания бактерий, причем здесь, как известно вполне могут быть использованы и небелковые источники азота, такие как карбамид (мочевина) и аммонийные соли большинства кислот (не более 30% по сырому протеину). В условиях промышленной биоконверсии эти параметры могут быть другими, вплоть до 100% использования азотистых небелковых соединений. В живом же организме возникает возможность отравления животного избыточным количеством выделяющегося аммиака. Среди прочих условий успешного воздействия микроорганизмов на целлюлозолигниновые субстраты следует назвать присутствие необходимого количества легкоферментируемых углеводов (сахаров), а также многих макро- и микроэлементов, важнейшими из которых являются фосфор, сера, натрий, калий, марганец, кобальт, цинк и йод. Лекция животных 6 Клонирование сельскохозяйственных растений и Фитогормоны и синтетические регуляторы роста и раз-вития растений Фитогормоны - это вещества, синтезируемые растениями и регулирующие рост и органогенез растений. Открытие фитогормонов позволило после изучения их синтеза, транспорта и функций разработать технологию их использования в целях регуляции развития растения, а также синтезировать аналоги. Механизм действия фитогормонов заключается в образовании ими активного комплекса с белками-мишенями. Возможно два пути реализации фитогормональной активности: путем воздействия на уровне регуляции экспрессии генов, что связано с синтезом новых белков, либо путем изменения активности ферментов. В первом случае проявление действия фитогормонов задерживается на период от десятков минут до нескольких часов, необходимых для изменения генетической программы, во втором случае действие проявляется через несколько минут. Согласно современным представлениям, насчитывают восемь групп фитогормонов. Остановимся только на двух из них Ауксины вызывают рост клеток, их дедифференцировку, изменение положения различных органов растения (тропизмы). Апикальное доминирование также связано с аттрагирующими свойствами этого фитогормона. Цитокинины активируют клеточное деление, снимают апикаль-ное доминирование, задерживают старение листьев, регулируют транспирацию, повышают устойчивость к неблагоприятным факторам окружающей среды — повреждающим температурам, засоленности почвы, засухе. Гиббереллины стимулируют ростовые процессы путем усиления синтеза материала клеточной стенки растения и обладают видовой специфичностью. Ускоряя рост стебля, эти фитогормоны не влияют на рост листьев и угнетают развитие корней. Большую роли играют гиббереллины в процессе перехода к формированию регенеративных органов и зацветанию, а у некоторых розеточных растений даже в условиях неблагоприятного светового дня. Фиторегуляторы используют в пищевой, фармацевтической и микробиологической промышленности. Гибберелинами обрабатывают прорастающее зерно ячменя для -амилазы при получении ячменного солода. При получении ряда лекарств путем культивирования растительных клеток в ферментерах требуется введение на определенных этапах фитогормонов для оптимизации процесса синтеза продукта и повышения его выхода. Производство посадочного материала плодовых культур и винограда основано на ля индукции корнеобразования или индолилуксусной кислотами. Однако, применение регуляторных веществ при прививке пока не нашло широкого распространения. Исследования на животных показали, что ЛД50 (летальная доза) для ряда регуляторов роста составляет от 470 мг/кг (тур, хломекват) до 4000 (картолин). В связи с этим к регуляторам роста и развития растений предъявляются такие же требования, как к пестицидам и важное значение имеет разработка эффективных методов, позволяющих заблаговременно определять экологическую и экономическую целесообразность применения тех или иных веществ. Всестороннюю оценку прошел хлорхолинхлорид, который в рекомендуемых дозах не оказывает вредного действия на развитие эмбрионов животных или человека, не вызывает мутации, не накапливается в организме. Препараты на основе этефона не представляют опасности для человека как канцерогены, более того, у них обнаружено защитное действие против канцерогенов окружающей среды. Это препарат полностью вписывается в метаболизм растения. Являясь физиологически активными веществами, регуляторы роста оказывают влияние на изменение гормонального статуса растений. Поэтому их применение может оказывать как положительное, так и отрицательное (например, мутагенное) воздействие. В связи с этим в целях экологической безопасности важное место должно уделяться оценке генетического риска на этапе государственных испытаний. Многие полезные растения произрастают в определенных климатических зонах и их развитие имеет сезонный характер. Необходимость в лекарственных препаратах, являющихся вторичными метаболитами растений (алкалоиды, глюкозиды, стероиды и др.) требует источников сырья. Проблема может быть успешно решена, если выращивать не растения, а их клетки. Клетки и ткани растений, выращиваемые на искусственных питательных средах, называют культурой изолированных тканей. Идея выращивания животных и растительных клеток на искус-ственных питательных средах подобно микроорганизмам возникла достаточно давно. Но если животные клетки научились культивировать еще в начале века, то с растениями эта задача решалась относительно долго. Связано это было, прежде всего, со сложностью подбора состава питательной среды, оказавшимся многокомпонентным, что в свою очередь потребовало создания условий жесткой стерильности, так как многие микроорганизмы эффективно размножаются в таких благоприятных условиях. Для работы необходимы стерильные растительные ткани, питательные среды и инструменты. Поэтому все манипуляции с клеточными культурами проводят в стерильных боксах либо в ламинарбоксах. Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей включают в себя набор необходимых растениям химических элементов, а также витамины, углеводы, фитогормоны и др. Наиболее часто применяют среду Мурасиге и Скуга (таб. 4.2), состав которой опубликован ими в 1962 г. Фитогормоны необходимы для управления процессом дедифференцировки клеток и индукции клеточных делений. На безгормональной среде живут опухолевые растительные ткани. В качестве ауксинов используют индолилуксусную кислоту (УИК), роль цитокининов играет кинетин. опухолевыми тканями. Каллусная культура является колонией дедифференцированных клеток. Каллус в естественных условиях появляется на растении при повреждении, представляет собой мозолеподобное образование, затягивающее рану. Каллусная ткань бывает белого или желтого цвета и для своего развития не требует света, так как лишена хлоропластов. Наиболее легко ее можно получить из апикальной меристемы растения, не утратившей в отличие от других клеток способности к делению. Растения в природе размножаются семенами и вегетативно. При семенном размножении посадочный материал генетически неоднороден, а во многих случаях семена обладают плохой всхожестью либо она полностью отсутствует. Вегетативное размножение позволяет получить генетически однородный посадочный материал (клон), однако не все виды пород в ювенильный период могут размножаться достаточно эффективно, возможно накопление инфекции, к тому же способ трудоемок. Методом черенкования не удается размножать многие древесные породы старше 10-15 лет. Способность растительных клеток реализо-вать присущую им тотипотентность позволило разработать принципиально новый метод вегетативного размножения - клональное микроразмножение с использованием каллуса в качестве промежуточного этапа в этом процессе. Основные преимущества этого метода состоят в следующем: - получается генетически однородный материал; - безвирусное потомство; - высокий коэффициент размножения (104 – 106); - сокращение продолжительности селекционного периода; - сокращение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития; - размножение растений, которые плохо размножаются иными методами; - независимость проведения работ от времени года, сокращение площадей для выращивания посадочного материала; - возможность автоматизации процесса. Первые успехи в клональном микроразмножении были достигнуты в конце 50-х годов Морелем, получившим из апикальной меристемы растения-регенеранты орхидей. В Западной Европе орхидеи, выращенные методом клонального микроразмножения, были первыми растениями, полученными биотехнологическими методами в коммерческих целях. Клонирование сельскохозяйственных животных Механизм полового размножения направлен на поддержание необходимого генетического разнообразия в популяции и в тоже время препятствует точному воспроизведению генетически ценных пород, поэтому в селекции животных возникла проблема получения точных копий выдающихся животных. Для этого разработаны методы клонирования сельскохозяйственных животных путем пересадки ядер соматических клеток в яйцеклетку с удаленным ядром либо индуцированием партеногенеза, позволяющего полностью передавать потомкам генотип одного из родителей. У животных после стадии морулы или бластулы соматические клетки дифференцированы, что объясняется дифференциальной транскрипцией генома в различных клеточных системах, несмотря на идентичное содержание генетической информации в них. Дифференциальная транскрипция приводит к утере тотипотентности, т.е. способности развиваться в подходящих условиях в полноценную особь. Это объясняется не потерей хромосомами части генетического материала, а глубокой и стабильной репрессией или инактивацией части генома. Поэтому из нормальной соматической клетки вырастить организм не удается. Снять репрессию можно, поместив клеточное ядро в подходящие условия, которые в природе имеются в яйцеклетках. Использование инактивированного вируса Сендай позволило разработать метод введения ядра путем его слияния с клеткой-реципиентом. В 1997 г. английским исследователям удалось получить потомство овцы, используя технологию пересадки ядра соматической клетки в яйцеклетку другого животного. Этот эксперимент, вызвавший небывалую реакцию в научных, политических и иных кругах показал, что принципиально возможно получение близнецов в любых количествах. В научно-производственном биотехнологическом центре Российской академии сельскохозяйственных наук в том же году были проклонированы овца, коза и свинья. В селекции животных, особенно при чистопородном разведении, традиционно используют линейное разведение, целью которого является поддержание высокого генетического сходства с выдающимся родоначальником. Этого достигают путем умеренного инбридинга и целенаправленного отбора. Имея высокую степень гомозиготности, животные таких линий отличаются большим генетическим сходством, а внутри линии создается высокая фенотипическая однородность в отношении физиологических и морфологических признаков. Этот процесс занимает много времени, так как связан с расщеплением и рекомбинацией генов, низкой плодовитостью и большими интервалами между генерациями. Используя технику пересадки ядер, из зиготы, находящейся на стадии двух пронуклеусов, хирургически удаляют мужской или женский пронуклеус. В результате остается только один гаплоидный набор хромосом мужской или женский. Для развития зиготы с гаплоидным набором хромосом требуется восстановление диплоидного набора. Для этого зиготу кратковременно инкубируют в растворе цитохалазина В, блокирующего деление зиготы и активирующего деление ядра. Как только деление ядра завершается, зародыш отмывают от цитохалазина В. В результате получают потомков, полностью гомозиготных по всем генам одного из родителей. Изложенный метод клонирования животных позволяет получить только женских особей, хотя одни потомки будут гомозиготны по генам матери, другие по генам отца. Это связано с тем, что в материнском ядре отсутствуют Y-хромосомы, а эмбрионы, имеющие отцовские гены с двумя Y-хромосомами, летальны.
