РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Федеральное
advertisement
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН На правах рукописи Данилова Ольга Витальевна НОВЫЕ МЕТАНОТРОФЫ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИ РОДСТВЕННЫЕ ИМ БАКТЕРИИ БОЛОТНЫХ ЭКОСИСТЕМ Специальность 03.02.03 – микробиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Д.б.н. С.Н. Дедыш Москва - 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ Часть 1. ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................5 Актуальность проблемы………………………………………………………………….5 Цель и задачи работы……………………………………………………………………..6 Научная новизна и значимость работы………………………………………………...7 Апробация работы………………………………...............................................................8 Публикации………………………………………………………………………………...8 Объем и структура………………………………………………………………………...8 Место проведения работы и благодарности…………………………………………...8 Часть 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………..............10 Глава 1. Метанотрофы как уникальная группа прокариот…… ……......................10 1.1. Роль метанотрофных организмов в круговороте метана в биосфере…………….10 1.2. Общая характеристика аэробных метанотрофных бактерий………...……………15 1.3. Энергетический метаболизм метанотрофов……………………….......……………17 1.4. Конструктивный метаболизм метанотрофов……………………..……...................22 1.5. Известное разнообразие аэробных метанотрофов………………………………….25 Глава 2. Молекулярные подходы, используемые в исследовании экологии метанотрофных бактерий………………………………………………………………..29 2.1.Амплификация и анализ филогенетических генов………………………………....30 2.2. Амплификация и анализ функциональных генов………………………………….32 2.3. Количественная ПЦР…………………………………………………………………36 2.4. Микрочипы……………………………………………………………………………37 2.5. Метод FISH…………………………………………………………………………...38 2.6. Метод стабильных изотопов (SIP)…………………………………………………..39 Глава 3. Метанотрофы как компонент микробных сообществ северных сфагновых болот…………………………………………………………………………..42 3.1. Исследование экологии и разнообразия метанотрофов в болотах с помощью молекулярных методов……………………………………………………………………43 3.2. Культуральные приемы и характеристика полученных болотных метанотрофов………………………………………………………………………………46 3.3. Пробелы в знаниях о метанотрофных сообществах сфагновых болот……………50 Часть 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ………………..............................................52 Глава 4. Объекты и методы исследования……………………………………………..52 4.1. Образцы нативного торфа, использованные в исследовании……………………...52 4.2. Определение активности окисления метана образцами торфа……………………52 4.3. Оценка численности метанотрофных бактерий с помощью метода FISH……….52 2 4.3.1. Процедура фиксации образцов торфа………………………………………..52 4.3.2. Процедура гибридизации фиксированных образцов с зондами…………….54 4.3.3. Использование ранее разработанных олигонуклеотидных зондов для детекции метанотрофов..…………………………………………………………...54 4.3.4. Разработка новых зондов и проверка их специфичности……………….….55 4.3.5. Микроскопический анализ……………………………………………………..56 4.3.6. Детекция и учет клеток микроорганизмов в образцах торфа…………….56 4.4. Молекулярная идентификация болотных метанотрофов с помощью ПЦРанализа.…………………………………………………………………………………...56 4.4.1. Экстракция тотальной ДНК из образцов торфа……………………………56 4.4.2. Экстракция ДНК из микробных клеток………………………………………56 4.4.3. ПЦР-амплификация филогенетических и функциональных генов исследуемых культур………………………………………………………………….57 4.4.4. Получение библиотек клонов генов pmoA болотных метанотрофов и генов 16S рРНК метанотрофов I типа…………………………………………..59 4.4.5. Выделение плазмидной ДНК, очистка, секвенирование……………………59 4.4.6. Филогенетический анализ…………………………………………………….59 4.5. Культивирование болотных бактерий…………………………………………….60 4.5.1. Получение накопительных культур метанотрофов I типа……………….60 4.5.2. Получение изолятов метанотрофов…………………………………………60 4.5.3. Выделение других бактерий - компонентов метанотрофных сообществ……………………………………………………………………………...61 4.6. Изучение свойств изолятов болотных бактерий…………………………………..61 4.6.1. Методы изучения морфологических и физиологических характеристик………………………………………………………………………...61 4.6.2. Аналитические методы ……………………………………………………….62 4.6.3. Электронная микроскопия…………………………………………………….62 4.6.4. Энзимологические исследования………………………………………………63 4.6.5. Определение состава хинонов…………………………………………………63 4.6.6. Анализы состава жирных кислот и липидов…………………………………63 4.6.7. Анализ пигментов………………………………………………………………64 4.6.8. Определение нуклеотидного состава ДНК…………………………………..64 4.6.9. Фотодокументирование материалов и обработка данных………………..64 Глава 5. Оценка активности окисления метана и дифференцированный учет клеток метанотрофов в кислых сфагновых болотах………………………………..65 5.1. Активность окисления CH4 сфагновым торфом………………………………….65 3 5.2. Учет клеток метанотрофов I и II типов в сфагновых болотах различного географического положения…………………………………………………………….65 Глава 6. Оценка филогенетического разнообразия метанотрофов в сфагновых болотах……….............................................................................................68 6.1. Состав метанотрофного сообщества по данным анализа генов pmoA…………..68 6.2. Оценка разнообразия метанотрофов I типа с помощью анализа генов 16S рРНК…………………………………………………………………………………68 Глава 7. Выделение метанотрофных представителей Gammaproteobacteria из сфагновых болот……………………………………………………………………...71 7.1. Представители рода Methylomonas…………………………………………………71 7.1.1. Морфология……………………………………………………………………..71 7.1.2. Физиологические характеристики……………………………………………72 7.1.3. Пути ассимиляции углерода……………………………………………………75 7.1.4. Анализ филогенетических и функциональных генов…………………………76 7.2. Представители рода Methylovulum…………………………………………………79 7.3. Новые метанотрофы спирилло-подобной морфологии…………………………..80 7.3.1. Морфология……………………………………………………………………..80 7.3.2. Анализ филогенетической принадлежности…………………………………81 7.3.3. Разработка и применение зондов для детекции нового метанотрофа спирилло-подобной морфологии.……………………………………………………………82 7.3.4. Анализ функциональных генов…………………………………………………83 7.3.5. Физиологические характеристики…………………………………………….84 Глава 8. Выделение первого представителя нового филогенетического кластера организмов в пределах Alphaproteobacteria, родственного метанотрофам II типа…………………………………………………………………..85 8.1 История выделения и первичный анализ…………………………………………..85 8.2. Изучение морфо-физиологических особенностей………………………………..86 ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………………………..95 ВЫВОДЫ…………………………………………………………………………………….97 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………………………98 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Метан (СН4) является одним из наиболее активных парниковых газов Земли. Из всего разнообразия микроорганизмов лишь метанотрофные бактерии способны использовать его в качестве единственного источника углерода и энергии. Аэробные метанотрофы ныне известны в пределах классов Gamma- и Alphaproteobacteria (метанотрофы I и II типов, соответственно), а также филума Verrucomicrobia (Hanson, Hanson, 1986; Гальченко, 2000; Trotsenko, Murrell, 2008; Троценко, Хмеленина, 2008; Op den Camp et al., 2009). Крупнейшим природным источником метана являются северные болотные экосистемы (Matthews et al., 1987), среди которых наиболее распространены кислые (pH 3.5-5.5) сфагновые болота. Эмиссия метана из болот в атмосферу контролируется аэробными метанотрофными бактериями, населяющими верхние слои болотного профиля. Исследования последних полутора десятков лет позволили установить, что основным компонентом «метанокисляющего фильтра» кислых северных болот являются метанотрофные представители Alphaproteobacteria, относящиеся к семействам Methylocystaceae и Beijerinckiaceae (Dedysh et al., 2001; Chen et al., 2008; Dedysh, 2009). Выделенные из болот метанотрофы родов Methylocystis, Methylocapsa, Methylocella и Methyloferula были охарактеризованы как умеренно ацидофильные организмы, способные окислять метан в кислых и холодных условиях (Dedysh et al., 2000, 2002, 2007; Vorobev et al., 2011; Belova et al., 2013). Помимо адаптации к физико-химическим условиям кислых болот, эти метанотрофы имеют и ряд других экологических преимуществ, в числе которых – способность некоторых представителей к росту на ацетате (Dedysh et al., 2005; Belova et al., 2011, 2013) и обладание мембранной метанмонооксигеназой высокого сродства к СН4 (Belova et al., 2013). В общей картине состава метанокисляющего сообщества болотных экосистем, тем не менее, остается ряд существенных пробелов. Первый из них, это нерешенный вопрос о присутствии в кислых болотах и вкладе в процесс окисления метана метанотрофов I типа. До недавнего времени, среди метанотрофов I типа ацидофилов известно не было. По данным анализа кислых торфов с помощью флуоресцентной in situ гибридизации (FISH), метанотрофы I типа в них немногочисленны и составляют не более нескольких процентов от общей численности метанотрофных бактерий (Dedysh et al., 2001; 2003). Все 5 же, нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК и pmoA, обнаруживающие сходство с таковыми у представителей родов Methylobacter и Methylomonas, были неоднократно выявлены в экстрактах тотальной ДНК, полученных из сфагнового торфа (Morris et al., 2002; Jaatinen et al., 2005; Слободова и др., 2006; Chen et al., 2008; Kip et al., 2010, 2011a). Первый аргумент в пользу существования ацидофильных метанотрофов I типа был получен голландскими исследователями, выделившими два штамма Methylomonas- и Methylovulum-подобных бактерий из кислого торфа (Kip et al., 2011б). Эти изоляты, однако, были лишь частично охарактеризованы, а их роль в окислении метана в кислых болотах оставалась неподтвержденной. Вторым нерешенным вопросом является природа организмов, идентифицированных голландскими микробиологами в качестве «симбиотических» метанотрофов, населяющих гиалиновые клетки сфагновых мхов (Raghoebarsing et al., 2005). Последовательности генов 16S рРНК этих пока некультивируемых бактерий принадлежат к обширному кластеру клонов, полученных из болотных экосистем различного географического положения и почв различного генезиса. Этот кластер принадлежит к Alphaproteobacteria и филогенетически равноудален от семейств Methylocystaceae и Beijerinckiaceae. Физиологические характеристики представителей этого кластера неизвестны, так как получить культуры представляющих его организмов до последнего времени не удавалось. Выделение этих бактерий, филогенетически родственных метанотрофам II типа, и изучение их метаболического потенциала представляло особый интерес для установления их роли в болотных экосистемах. Настоящее исследование было предпринято для восполнения вышеперечисленных пробелов в знаниях о метанотрофных бактериях северных болотных экосистем. Цели и задачи исследования Цель работы – оценка численности и филогенетического разнообразия метанотрофов I типа в кислых сфагновых болотах, выделение и описание новых представителей болотных метанотрофов, а также филогенетически родственных им неметанотрофных организмов. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Определение популяционной численности и молекулярная идентификация метанотрофов I типа, населяющих сфагновые болота. 6 2. Получение репрезентативных изолятов метанотрофов I типа из кислых торфов, изучение их рН-предпочтений и установление таксономической принадлежности. 3. Изучение биологии представителей нового филогенетического кластера организмов в пределах Alphaproteobacteria, родственного метанотрофным бактериям семейств Methylocystaceae и Beijerinckiaceae. Научная новизна и значимость работы Впервые проведена комплексная оценка численности и филогенетического разнообразия метанотрофов I типа в северных сфагновых болотах России. Описан и узаконен первый ацидотолерантный вид рода Methylomonas - Methylomonas paludis sp. nov., который также является первым ацидотолерантным представителем семейства Methylococcaceae. Установлена способность метанотрофов этого вида развиваться в кислых средах (рН 3.8-4.5). Типовой штамм нового вида депонирован в международных коллекциях микроорганизмов DSMZ и ВКМ. Впервые из нескольких болот переходного типа получен в накопительных культурах метанотроф необычной спиралевидной формы Candidatus Methylospira palustris, представляющий новый род и вид семейства Methylococcaceae. С помощью анализа библиотек клонов генов pmoA и 16S рРНК установлено присутствие этих метанотрофов в различных местообитаниях. Описан новый род и вид умеренно ацидофильных, факультативно анаэробных бактерий-бродильщиков, Roseiarcus fermentans gen. nov., sp. nov. Это первый представитель обширного кластера ранее некультивируемых микроорганизмов, филогенетически равноудаленного от семейств Methylocystaceae и Beijerinckiaceae, и представленного клонами из различных болот и почв. Типовой штамм нового рода и вида депонирован в международных коллекциях микроорганизмов DSMZ и ВКМ. Практическая значимость Существенно расширена база данных последовательностей генов pmoA и 16S рРНК метанотрофных бактерий, населяющих северные сфагновые болота. Совокупность полученных в работе новых последовательностей депонирована в GenBank. 7 Разработаны и апробированы 16S рРНК-специфичные флуоресцентно-меченные олигонуклеотидные зонды для детекции новой группы метанотрофов-спирилл Candidatus Methylospira palustris. Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и симпозиумах: 1. 4th Congress of European Microbiologists (FEMS-4), Geneva, Switzerland, 2011. 2. VII Молодежной школе-конференции “Актуальные аспекты современной микробиологии”, ИНМИ РАН, Москва, 2011. 3. 14th International Symposium on Microbial Ecology (ISME-14), Copenhagen, Denmark, 2012. 4. IX Молодежной школе-конференции “Актуальные аспекты современной микробиологии”, ИНМИ РАН, Москва, 2013. Публикации Материалы диссертации содержатся в 7 печатных работах: 3 экспериментальных статьях и 4 тезисах конференций. Объём и структура диссертации Диссертация состоит из введения, глав, заключения и выводов, изложенных на 97 страницах, включая 11 таблиц, 25 рисунков и списка литературы из 224 наименований, из них 21 - на русском и 203 – на английском языке. Место проведения работы и благодарности Работа была выполнена в лаборатории Микробиологии болотных экосистем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института микробиологии им С.Н. Виноградского РАН с 2010 по 2013 годы. Использованные в работе образцы торфа были предоставлены автору к.б.н. И.С. Куличевской и к.б.н. С.Э. Беловой, а также отобраны автором. Изоляты MG30T и Pf56T были выделены и предоставлены автору к.б.н. И.С. Куличевской (ИНМИ РАН, Москва). Исследования ультратонкого строения клеток были проведены к.б.н. Н.Е. Сузиной, а 8 энзимологический анализ - к.б.н. О.Н. Розовой (ИБФМ РАН, Пущино). Анализ хинонов был проведен к.х.н. Б. П. Баскуновым (ИБФМ РАН, Пущино). ДНК-ДНК гибридизация и определение содержания Г+Ц пар в ДНК проведены совместно с к.б.н. Е. Н. Детковой, а анализ продуктов брожения – с В.В. Кевбрином (ИНМИ РАН, Москва). Автор выражает глубокую признательность научному руководителю С.Н. Дедыш, а также всему составу лаборатории за всестороннюю помощь и советы при выполнении работы. Работа выполнена при поддержке программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и Российского Фонда Фундаментальных Исследований (проект № 12-04-00768). 9 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Метанотрофы как уникальная группа прокариот. Метанотрофы представляют собой уникальную группу прокариотных микроорганизмов, структурно и функционально специализированных на использовании метана (СН4) в качестве единственного источника углерода и энергии (Hanson, Hanson, 1996; Гальченко, 2001; Trotsenko, Murrell, 2008). Первый метанотроф был описан в 1906 году немецким исследователем Зенгеным, который выделил c поверхности растений пресноводного пруда бактерию, способную расти на метане, и назвал ее ‘Bacillus methanicus’ (Söhngen, 1906). Метанотрофы играют ключевую роль в глобальных циклах углерода и азота. Не менее важное свойство данных организмов заключается в способности к деградации опасных загрязнителей (Singleton et al., 2007), что побуждает ученых более внимательно взглянуть на них как на потенциальные агенты биоремедиации загрязненных территорий. Большинство из описанных ныне метанотрофов являются мезофиллами, растущими в диапазоне температур 20 - 35°С и предпочитающими около-нейтральные значения рН (58). Однако, среди них также встречаются термофильные (> 40°С) и психрофильные (<15°С) представители. Ряд метанотрофов предпочитает расти в щелочных средах (рН > 9.0), тогда как другие представители этих бактерий обитают в кислых условиях (рН <5). Несмотря на все многообразие метанотрофных организмов, они объединены одним общим признаком – способностью окислять СН4, что делает их ключевым звеном глобального цикла углерода (Nazaries et al., 2013). 1.1. Роль метанотрофных организмов в круговороте метана в биосфере. Метан является вторым после углекислого газа наиболее активным парниковым газом Земли. Его вклад в общий эффект, оказываемый парниковыми газами, составляет не менее 20-30% (Conrad, 2009). С начала индустриальной эпохи (начало XIX в.), концентрация метана в атмосфере постоянно увеличивалась с 0.7 p.p.m (объемная концентрация) до 1.745 p.p.m. к 2000 году. Начиная с 2005 года, наблюдалось некоторое замедление прироста метана, и уровень его в течение нескольких лет колебался в пределах 1.77-1.78 p.p.m. На сегодняшний день происходит медленное увеличение 10 количества метана в атмосфере на 0.1% в год, и его глобальный бюджет оценивается в 500-600 Тг СН4 год-1 (Lelieveld et al., 1998; Wang et al., 2004). Микробное образование метана осуществляется группой метаногенных архей в процессе конечного этапа анаэробного разложения органического вещества. Метаногенные представители Euryarcheota способны синтезировать метан из водорода и углекислого газа, а в некоторых случаях, из ацетата и метанола в строго анаэробных условиях (Thauer et al., 2008). В дальнейшем, образованный метан окисляется метанотрофными бактериями, которые в большинстве своем аэробы, замыкая тем самым цикл углерода (Рис.1). Рисунок 1. Глобальный цикл углерода в природе и роль метана в нем. Серыми прямоугольниками показаны главные звенья цикла углерода (Nazaries et al., 2013). Основными естественными источниками метана являются болота, океаны, пресноводные осадки, растения, термиты (Conrad, 2009). Примерно 25% общего количества метана, поступающего в атмосферу, связано с разработкой месторождений полезных ископаемых, сжиганием ископаемого топлива, а также с окислением органической биомассы (Рис. 2). Крупнейшими природными источниками поступления метана в атмосферу Земли являются болотные экосистемы. На их долю приходится около 2/3 общего потока природного метана (Conrad, 2009). С другой стороны, за последние 100 лет значительно 11 возросла роль антропогенных источников в эмиссии метана, на долю которых приходится до 63% потока СН4. Наиболее значимыми из них являются рисовые чеки, животноводство, а также обширные свалки, в которых происходит разложение органических отходов с образованием больших количеств метана. Метан, Рисунок 2. Глобальные источники атмосферного метана. На рисунке показаны крупнейшие источники метана – мировые (на левой диаграмме) и антропогенного характера (на правой диаграмме) (цитировано по Nazaries et al., 2013). продуцируемый в результате процессов брожения в кишечнике термитов, а также образующийся в океане и высвобождающийся из газовых гидратов, вносит сравнительно небольшой вклад в общий бюджет (Conrad, 2009). Дальнейшая судьба атмосферного метана может быть различна. Около 90% его подвергается фотохимическому окислению в тропосфере, инициированному реакциями с ОН-радикалами (Cicerone, Oremland, 1988). Около 7% атмосферного метана диффундирует в стратосферу, где также достаточно быстро окисляется. Третьим важным стоком метана (5-7%) является его поглощение и последующее окисление до СО2 в автоморфных почвах. Однако, для большинства источников величины продукции СН4 обычно намного больше величин его эмиссии, что объясняется активным потреблением значительной части образованного метана 12 метанотрофными бактериями, населяющими данные местообитания (Frenzel, 2000; Reeburgh, 2003). На сегодняшний день, способность к аэробному росту на метане выявлена у представителей двух филогенетических групп домена Bacteria: Proteobacteria и Verrucomicrobia (Hanson, Hanson, 1996; Op den Camp et al., 2009). Метанотрофные представители Verrucomicrobia были описаны недавно и информация об их разнообразии и распространении в природе пока чрезвычайно ограничена. Они представляют собой уникальную группу организмов, способных развиваться в экстремальных условиях (рН 1.0, температура 50°С) и обладающих многими чертами метанотрофов Proteobacteria. Тем не менее, метанотрофные представители Verrucomicrobia имеют ряд существенных отличий. Так, они обладают ключевым ферментом окисления метана, мембранной метанмонооксигеназой, однако внутрицитоплазматические мембраны в клетках этих бактерий отсутствуют. Кроме того, у метанотрофов Verrucomicrobia отсутствуют известные для аэробных метанотрофов пути ассимиляции формальдегида, а необходимый углерод для клетки они получают путем фиксации СО2 через цикл Кальвина-Бенсона (Dunfield et al., 2007). Несмотря на успешное выделение некоторых метанотрофов Verrucomicrobia в чистую культуру, сложность их культивирования затрудняет процесс депонирования в международных коллекциях, тем самым делая невозможным процесс валидации новых таксонов. Эти трудности, тем не менее, не мешают всесторонним исследованиям новых необычных метанотрофов, которые уже привели к значительным успехам в понимании физиологии, биохимии и генетики данной уникальной группы организмов (Hou et al., 2008; Khadem et al., 2010, 2011, 2012a,b,c). Биология и экология метанотрофных представителей Proteobacteria активно изучается в течение последних 40 лет (Hanson, Hanson, 1996; Гальченко, 2001; Trotsenko, Murrell, 2008). По отношению к кислороду все таксономически охарактеризованные на настоящий момент метанотрофные бактерии являются облигатными аэробами. Тем не менее, существование микробного процесса окисления метана в анаэробных условиях известно уже довольно давно. Более 30 лет назад было впервые показано существование градиента концентрации метана в морских осадках (Reeburgh, 1976, 1980; Иванов и др., 1984; Пименов и др., 2000). По оценкам исследователей, большая часть вновь образованного метана (около 90%) поглощается в анаэробной зоне, и суммарный вклад океанов в мировую эмиссию данного газа составляет не более 3% (Conrad, 2009). 13 Установлено, что анаэробный процесс окисления метана осуществляется синтрофной ассоциацей метанокисляющих водородобразующих архей и водородокисляющих сульфатвосстанавливающих бактерий (Hoehler et al., 1994; Thauer, Shima, 2008). Сульфат в данном процессе используется в качестве акцептора электронов в реакции окисления метана путем процесса обратного метаногенеза. Организмы, способные выполнять этот процесс – это сульфатредуцирующие бактерии родов Desulfosarcina and Desulfococcus и археи группы ANME (Hinrichs et al., 1999; Boetus, 2000). Данная группа архей родственна Methanosarcinales и Methanomicrobiales и содержит в себе подгруппы ANME-1, ANME-2 и ANME-3 (Knittel, Boetus, 2009). Археи группы ANME, помимо присутствия в морях, также широко распространены в других природных экосистемах, таких как осадки пресноводных озер, полигоны ТБО, почвы, а также шахтные воды (Cadillo-Quiroz et al., 2008; Castro et al., 2004; Grossman et al., 2002; Maclean et al., 2007). Присутствие их в данных местообитаниях было подтверждено путем обнаружения ключевого фермента метаногенеза – метил-коэнзим-М-редуктазы (ген mcrA). Еще один ныне известный вариант анаэробного окисления метана связан с процессом денитрификации. Голландским исследователям удалось получить накопительную культуру микроорганизмов, осуществляющих процесс окисления метана до СО2 с одновременным восстановлением нитрата (Raghoebarsing et al., 2006). Первоначально предполагалось, что такую реакцию осуществляет синтрофная ассоциация архей с нитратредукторами по аналогии с сульфатредуцирующими бактериями. Однако, анализ генома доминирующего в смешанной культуре микроорганизма показал, что процесс окисления метана у него идет по аэробному пути, с использованием молекулы кислорода, образованной данной бактерией в процессе денитрификации. Окисление метана происходит обычным для аэробных метанотрофов путем, с участием мембранной менамонооксигеназы (Wu et al., 2011, 2012). Организм, осуществляющий данный процесс, получен в виде высоко обогащенной накопительной культуры, условно назван Candidatus Methylomirabilis oxifera и относится к филе-кандидату NC10 (Ettwig et al., 2009; 2010). В настоящее время рассматриваются также возможности протекания в морских экосистемах процессов анаэробного окисления метана, связанных с использованием марганца и железа в качестве акцепторов электронов (Beal et al., 2009). Однако, микробные агенты, осуществляющие данные реакции, до настоящего времени остаются 14 неизвестны. Исследование биохимических и микробиологических особенностей процесса анаэробного окисления метана является приоритетной задачей для ряда ведущих лабораторий в области метанотрофии. 1.2. Общая характеристика аэробных метанотрофных бактерий. Исторически, все аробные метанотрофные бактерии были разделены на две большие группы, на основании их различий в морфологии, ультраструктуре клеток и вариантах метаболических путей - метанотрофы I и II типов (Whittenbury et al., 1970). Для дифференциации метанотрофов I и II типов было предложено использовать ряд характеристик, включающих особенности организации внутрицитоплазматических мембран (ВЦМ), вариабельность путей ассимиляции формальдегида, различия в составе основных жирных кислот клеток, а также способность к фиксации молекулярного азота. На настоящий момент лишь часть из них остаются надежными дифференцирующими признаками. ВЦМ метанотрофов I типа представляют собой стопки уплощенных везикул, заполняющие большую часть содержимого клетки и ориентированные перпендикулярно клеточной мембране. ВЦМ метанотрофов II типа, напротив, ориентированы параллельно внешней мембране и расположены по периметру клетки (Whittenbury et al., 1970). Причины такой структурно-функциональной корреляции, возможно, связаны с различной эффективностью энергетических процессов, происходящих на мембранах I и II типов и/или разной энергоемкостью основных путей метаболизма (Троценко, Хмеленина, 2008). Другой характеристикой, отличающей метанотрофов разных групп, являются различия в путях ассимиляции С1-соединений. Метанотрофы Gammaproteobacetria используют рибулозомонофосфатный путь (РМФ) фиксации формальдегида, в то время как метанотрофы Alphaproteobacteria – сериновый путь. Ряд метанотрофов - к ним относятся представители родов Methylococcus и Methylocaldum - были объединены в так называемую группу Х, благодаря наличию у них наряду с РМФ-путем ассимиляции углерода процесса фиксации углерода с использованием цикла Кальвина (Taylor, 1977; Hanson, Hanson, 1996; Bodrossy et al., 1997; Троценко, Хмеленина, 2008). Долгое время считалось, что для метанотрофов разных типов характерно преобладание в клеточных мембранах определенных жирных кислот. Для метанотрофов Gammaproteobacteria и Alphaproteobacteria – это жирные кислоты с 16-ю и 18-ю атомами 15 углерода, соответственно (Андреев, Гальченко, 1978; Гальченко и др., 1986; Bowman et al., 1991; Guckert et al., 1991; Гальченко, 2001). Однако, на настоящий момент, этот признак уже не является универсальным, так как были описаны метанотрофы, составляющие исключение из этих правил. Например, в клетках Methylocella и Methylocapsa отсутствует кислота 18:1ɷ8с, считавшаяся раннее ‘индикаторной’ для метанотрофов Alphaproteobacteria (Dedysh et al., 2002, 2004; Dunfield et al., 2003). В составе жирных кислот Methylohalobius crimensis, относящегося к Gammaproteobacteria, преобладают жирные кислоты с 18 атомами углерода и отсутствует жирная кислота 16:1ɷ8с – ‘индикатор’ метанотрофов I типа (Heyer et al., 2005). В составе жирных кислот метанотрофа II типа Methylocystis heyeri есть как 18:1ɷ8с, так и 16:1ɷ8с (Dedysh et al., 2007). Способность к фиксации молекулярного азота на настоящий момент также уже не является отличительным признаком метанотрофов II типа, так как было показано, что многие представители родов Methylomonas, Methylobacter и Methylococcus являются азотфиксаторами (Auman et al., 2001). Таким образом, очевидно, что с течением времени происходило описание новых таксонов метанотрофных бактерий, а также развитие методов их исследования, вследствие чего некоторые из вышеперечисленных характеристик, на основании которых метанотрофы относили к I или II типу, утратили свое значение. Метанотрофы I типа относятся к классу Gammaproteobacteria и на настоящий момент представлены 13 родами в пределах семейства Methylococcaceae: Methylobacter, Methylomicrobium, Methylomonas, Methylocaldum, Methylosphaera, Methylothermus, Methylosarcina, Methylohalobius, Methylosoma, Methylovulum, Methylomarinum, Methylogaea и Methylococcus. К ним также относятся не полученные пока в чистых культурах необычные нитчатые метанотрофы ‘Crenothrix polyspora’ (Stoecker et al., 2006) и ‘Clonothrix fusca’ (Vigliotta et al., 2007). Метанотрофы II типа принадлежат к классу Alphaproteobacteria и представлены пятью родами в пределах семейств Methylocystaceae (роды Methylocystis и Methylosinus) и Bejerinckiaceae (роды Methylocella, Methylocapsa и Methyloferula) (Табл.1). Интересно, что метанотрофы Bejerinckiaceae существенно отличаются от метанотрофов II типа организацией ВЦМ. Так, ВЦМ в клетках Methylocapsa располагаются всегда лишь на одной стороне клетки, в то время как у метанотрофов Methylocella и Methyloferula они вовсе отсутствуют. 16 Ключевым свойством всех метанотрофных организмов является способность к использованию метана, что реализуется благодаря наличию специализированной ферментной системы, рассмотрению которой посвящен следующий раздел. 1.3. Энергетический метаболизм метанотрофов. Метанотрофы окисляют метан через образование формальдегида и формиата в качестве интермедиатов до углекислого газа и воды (Рис. 3). Поэтапное окисление метана и метанола до СО2 происходит с образованием энергии в форме, доступной для использования в метаболических реакциях – НАДН2 и восстановленных цитохромов, при последующем окислении которых в дыхательной цепи образуется АТФ. Рис. 3. Пути окисления метана и ассимиляции формальдегида аэробными метанотрофными бактериями (цитировано по Троценко, Хмеленина, 2008). Окисление метана. Первичную атаку молекулы СН4 катализирует уникальный мультикомпонентный комплекс – метанмонооксигеназа (ММО), существующий в двух формах – растворимой (рММО), локализованной в цитоплазме, и мембранной (мММО), связанной с мембранами. Последняя имеется у всех изученных метанотрофов, за исключением представителей родов Methylocella и Methyloferula (Dedysh et al., 2000; Vorobev et al., 2011). Лишь немногие метанотрофы имеют оба фермента, причем 17 Таблица 1. Современная таксономия аэробных метанотрофов. Gammaproteobacteria Alphaproteobacteria Метанотрофы I типа Метанотрофы II типа Methylococcaceae Beijerinckiaceae Methylobacter Methylomonas aurantiaca Methylococcus mobilis Methylocapsa Methylobacter albus Methylomonas fodinarum Methylococcus thermophilus Methylocapsa acidiphila Methylobacter luteus Methylomonas koyamae Methylogaea Methylocapsa aurea Methylobacter marinus Methylomonas methanica Methylogaea oryzae Methylocella Methylobacter pelagicus Methylomonas scandinavica ‘Clonothrix’ Methylocella palustris Methylobacter psychrophilus Methylosarcina ‘Crenothrix’ Methylocella silvestris Methylobacter tundripaludum Methylosarcina fibrata Methylocella tundrae Methylobacter whittenburyi Methylosarcina lacus Methyloferula Methylomicrobium Methylosarcina quisquiliarum Methyloferula stellata Methylomicrobium alcaliphilum Methylosphaera Methylomicrobium buryatense Methylosphaera hansonii Methylocystis Methylomicrobium japanense Methylovulum Methylocystis bryophila Methylomicrobium kenyense Methylovulum miyakonense Methylocystis echinoides Methylohalobius Methylomarinum Methylocystis heyeri Methylohalobius crimeensis Methylomarinum vadi Methylocystis hirsutа Methylosoma Methylocaldum Methylocystis parvus Methylosoma difficile Methylocaldum gracile Methylocystis rosea Methylothermus Methylocaldum szegediense Methylosinus Methylothermus subterraneus Methylocaldum tepidum Methylosinus sporium Methylothermus thermalis Methylococcus Methylosinus trichosporium Methylomonas Methylococcus capsulatus Verrucomicrobiae ‘Methylacidiphilaceae’ ‘Methylacidiphilum’ Methylocystaceae Психрофиллы , термофилы , галофилы, ацидофилы, термоацидофилы. 18 присутствие рММО является штаммовым признаком этих бактерий. Причины ограниченного распространения рММО у метанотрофов, возможно, связаны со специфической функцией фермента. рММО не является конститутивным ферментом, при этом единственным фактором, определяющим его активность в клетках, является отношение содержания иона меди к биомассе (Murrell et al., 2000). При высоком соотношении меди к биомассе (> 2.5 µмоль/г клеток) синтезируется мембранная форма фермента – мММО, при низком – рММО (Троценко, Хмеленина, 2008). Растворимая метанмонооксигеназа (рММО). Фермент катализирует пиридиннуклеотидзависимое окисление метана молекулярным кислородом до метанола: CH4 + НАД(Ф)Н + Н+ + О2 = СН3ОН + Н2О + НАД(Ф)+ рММО детально изучена у Mc. capsulatus Bath и Methylosinus trichosporium OB3b (Stafford et al., 2003; Сsaki et al., 2003). Фермент состоит из трех компонентов: гидроксилазы (MmoA), редуктазы (MmoC) и регуляторного белка (MmoB) (Green, Dalton, 1985). Гидроксилазный комплекс (MmoA) представляет собой негемовый гексамерный металлопротеин (250 кДа), состоящий из трех субъединиц – α, β, и γ (65, 45 и 20 кДа, соответственно). Содержащий два атома железа негемовый центр α-субъединицы катализирует образование метанола из метана и кислорода (Fox et al., 1989; Green, Dalton, 1985). Редуктаза (MmoC) представляет собой Fe-S флавопротеин (39 кДа), при восстановлении которого происходит внутримолекулярный перенос двух электронов от НАДН2 к Fe2S2 центру, имеющему одноэлектронную емкость. Затем электроны передаются от Fe2S2 центра редуктазы к гидроксилазе, имеющей сайт окисления метана и восстановления кислорода (Троценко, Хмеленина, 2008). Регуляторный белок (MmoB) представляет собой небольшой полипептид (16 кДа). Он абсолютно необходим для гидроксилазной активности у Mc. capsulatus Bath (Green, Dalton, 1985)и у Ms. trichosporium OB3b (Fox et al., 1989), несмотря на отсутствие в своем составе атомов металла и простетической группы. Все компоненты рММО образуют стабильный ферментный комплекс, для которого предложен следующий механизм реакции (Fox et al., 1989). Метан связывается с активным центром окисленного фермента, возможно, растворяясь в гидрофобном кармане, поскольку не выявлено его непосредственное связывание с атомом железа. 19 Затем один из атомов железа восстанавливается с образованием смешанной валентности (Fe2+/Fe3+) фермента. Второе одноэлектронное восстановление активного центра приводит к полному восстановлению (Fe2+/Fe3+) фермента (Троценко, Хмеленина, 2008). Связывание молекулы кислорода с биядерным железным центром приводит к образованию активного пероксида (Fox et al., 1989; Woodland, Cammack, 1985) и его последующему разложению. рММО катализирует включение кислорода не только в метан, но также в широкий спектр субстратов, включая алканы, алкены, ароматические углеводороды, галогенированные алканы и галогенированные ароматические углеводороды. Как следствие этого, метанотрофы, имеющие рММО, выполняют важную экологическую функцию и перспективны для использования в биотехнологии (Троценко, Хмеленина, 2008). Мембранная метанмонооксигеназа (мММО). В отличие от рММО, мММО крайне нестабильна, что существенно сдерживает ее изучение. Лишь относительно недавно была выделена и охарактеризована мММО из Mc. capsulatus Bath (Nguyen et al., 1994, 1998; Kitmitto et al., 2005). В отличие от рММО, она способна окислять субстраты более ограниченного спектра (алканы и алкены с длиной цепи до С5). Однако ее присутствие повышает эффективность конверсии метана в биомассу на 34%, по сравнению с клетками, содержащими только рММО. Как правило, фермент локализован во внутрицитоплазматической мембране (ВЦМ) и составляет до 60-80% общего содержания мембранных белков (Nguyen et al., 1998). Фермент мММО представляет собой тример (αβγ)3 и состоит из 3 субъединиц с молекулярной массой 45, 27 и 23 кДа. Активная форма мММО содержит 2 атома железа и около 15 атомов меди на молекулу фермента, что, однако, лишь частично подтверждено и требует дальнейших уточнений (Zahn, Dispirito, 1996; Choi et al., 2003; Lieberman, Rosenzweig, 2004). С мММО ассоциированы медь-связывающие соединения (метанобактины), которые синтезируются при исчерпании меди в среде и, очевидно, ответственны за ее транспорт, являясь своеобразным «медным челноком» (DiSpirito et al., 1998; Kim et al., 2004; Graham, Kim, 2011). В хромосоме Mc. capsulatus Bath имеется 2 копии гена мММО (pmoCAB) и дополнительная копия pmoC (Stolyar et al., 1999). У нитрифицирующих бактерий установлено подобная дупликация гена amoCAB, кодирующего аммоний монооксигеназу 20 (АМО). Сравнение последовательностей pmo и amo генов свидетельствует в пользу их эволюционной связи (Троценко, Хмеленина, 2008). Недавно у Methylocystis sp. SC2 были обнаружены две изоформы мММО, имеющие разные кинетики окисления метана – ранее известную форму PmoA, или PmoA1 и новую форму PmoA2 (Dunfield et al., 2002; Baani, Liesack, 2008). При концентрации метана выше 600 ppm Напротив, при происходила экспрессия гена pmoCAB1, кодирующего мММО1. следовых количествах метана (до 100 ppm) конститутивно экпрессировался кластер генов pmoCAB2, кодирующий мММО2. Примечательно, что гены pmoCAB2 в большинстве своем присутствуют у метанотрофов II типа, в то время как у метанотрофов I типа они пока не обнаружены (Yimga et al., 2003). Возможность использовать метан в широком диапазоне его концентрации, очевидно, объясняет доминирование метанотрофов II типа в автоморфных почвах и их выживание за счет потребления атмосферного метана. Несмотря на общий механизм реакции окисления метана, рММО и мММО существенно различаются между собой. Для работы мММО необходимо большое количество меди (15 атомов на 1 молекулу фермента). Данный фермент имеет высокое сродство к СН4 (Km=1-2 µM) и О2 (Km=0.1 µM), но обладает узкой субстратной специфичностью, окисляя лишь короткие алканы и алкены. С другой стороны, рММО имеет пониженное сродство к метану (Km=3 µM) и О2 (Km=16.8 µM). Поскольку для функционирования рММО необходим НАД(Ф)Н2, этот фермент энергетически менее эффективен (Троценко, Хмеленина, 2008). Окисление метанола. Метанол образуется при окислении метана, а также доступен из экзогенных источников, например, будучи продуктом деградации пектина и лигнина. Метанотрофы окисляют метанол посредством периплазматической метанолдегидрогеназы (МДГ). Детальное строение и активность данного фермента была изучена на примере грамотрицательных метилотрофных бактерий (Anthony, Williams, 2003). МДГ представляет собой тетрамер α2β2, включающий две большие (67 кДа) и две малые (8.5 кДа) субъединицы (Anthony, 1992; Anthony et al., 1994). Две α-субъединицы, сцепленные характерным мотивом, образуют радиально-симметричную структуру в виде «пропеллера». β-субъединица не составляет структурно выраженного домена в молекуле фермента и функция ее пока не выяснена (Anthony, Ghosh, 1998). 21 Ген, кодирующий большую субъединицу МДГ, mxaF, крайне консервативен у метано- и метилотрофов, что позволяет использовать его в исследованиях молекулярной экологии (Anthony, Williams, 2003). Окисление формальдегида. Формальдегид является ключевым интермедиатом в процессе окисления метана до СО2. Большая часть восстановительных компонентов, необходимых для оксигенирования метана, образуется при окислении ФА через формиат до СО2. Метанотрофы имеют несколько ферментов, окисляющих ФА. В соответствии с природой акцептора электронов, ФА-окисляющие ферменты разделены на 2 группы: НАД(Ф)+-специфичные и связанные с цитохромами. В свою очередь, НАД(Ф)+специфичные ФАДГ подразделяются на основе зависимости от вторичных кофакторов, таких как тиольные соединения (GSH), тетрагидрофолат (ТГФ) или тетрагидрометаноптерин (ТГМП) (Троценко, Хмеленина, 2008). Окисление формиата до СО2 является конечной стадией в полиферментной цепи окисления метана. За данный процесс отвечает присутствующая у всех изученных метанотрофов НАД+-зависимая формиатдегидрогеназа (ФДГ), которая у Ms. trichosporium OB3b состоит из двух субъединиц (53 и 102 кДа, соответственно), локализованных в цитоплазме. ФДГ содержит негемовое железо и сульфидные группы и наиболее активна в диапазоне pH (6.5-7.5), обладая низкими значениями Km к формиату и НАД+ (Yoch et al., 1990). В геноме Mc. capsulatus Bath были обнаружены три последовательности генов, гомологичных ФДГ, роль которых еще предстоит выяснить (Ешинимаев, 2006). 1.4. Конструктивный метаболизм метанотрофов. Метанотрофы используют окисленные и замещенные производные метана, строя клеточные компоненты из С1-субстратов. Благодаря исследованием Квейла известно, что метанотрофы реализуют два основных пути первичной С1-ассимиляции – рибулозомонофосфатный и сериновый. В этих циклах фосфотриозы синтезируются из формальдегида – ключевого интермедиата центрального метаболизма (Троценко, Хмеленина, 2008). Ассимиляция углерода возможна также на уровне СО2 (посредством анаплеротического карбоксилирования (фосфоенол)пирувата или РБФ путем (Quayle, 1980; Anthony, 1982)). Рибулозомонофосфатный цикл. 22 Ассимиляция формальдегида через РМФ путь осуществляется у метанотрофов I типа. В данном цикле синтезируется одна молекула триозы из трех молекул формальдегида (Anthony, 1982). В первой части РМФ-пути фомальдегид конденсируется с рибулозо-5фосфатом с образованием 3-гексулозо-6-фосфата в реакции, катализируемой гексулофосфатсинтазой (ГФС). Далее 3-гексуло-6-фосфат изомеризуется во фруктозо-6фосфат фосфогексулоизомеразой (ФГИ). С участием этих ферментов происходит образование С-С связи и центральных метаболитов у метанотрофов класса Gammaproteobacteria (Троценко, Хмеленина, 2006). Во второй части РМФ-цикла фосфогексозы распадаются до (фосфо)триоз. В дальнейшем из (фосфо)триоз образуется рибулозо-5-фосфат, т.е цикл завершается регенерацией акцептора ФА (Троценко, Хмеленина, 2006). ГФС – индикаторный фермент РМФ пути (Рис. 4). Рис. 4. Схематическое изображение пути ассимиляции формальдегида метанотрофами I типа. ГФС – гексулофосфатсинтаза - индикаторный фермент РМФ пути (цитировано по Троценко, Хмеленина, 2008). РМФ путь, первоначально обнаруженный у аэробных метилотрофов, достаточно широко распространен и у неметилотрофных бактерий, где он выполняет функцию детоксикации формальдегида (Ешинимаев, 2006). Сериновый путь. 23 Метанотрофы II типа ассимилируют ФА через сериновый путь, в котором первичным акцептором ФА является тетрагидрофолат (ТГФ). В первой части две молекулы ФА, конденсируясь ТГФ, реагируют с двумя молекулами глицина, с образование серина и оксипирувата. Последующие превращения включают образование и изомеризацию фосфоглицерата, карбоксилирование фосфоенолпирувата в оксалоацетат и образование малата с дальнейшей активацией до малил-КоА. Последний в дальнейшем распадается на глиоксилат и ацетил-КоА, который является первичным продуктом серинового пути. Во второй части серинового пути ацетил-КоА окисляется в глиоксилат, из которого впоследствии регенерируется глицин – первичный акцептор ФА. Серин- глиоксилатаминотрансфераза (СГАТ), оксипируватредуктаза (ОПР) и малил-КоА-лиаза являются индикаторными ферментами серинового пути (Рис. 5). Рис. 5. метанотрофами Схематическое II изображение типа. пути Показаны ассимиляции индикаторные формальдегида ферменты: серинглиоксилатаминотрансфераза (СГАТ), оксипируватредуктаза (ОПР), малил-КоАлиаза (цитировано по Троценко, Хмеленина, 2008). Ассимиляция СО2. У метанотрофов I типа от 5 до 15% углерода биомассы происходит из углекислоты, тогда как у метанотрофов II типа – до 50%. За анаплеротическую фиксацию СО2 у этих бактерий ответственна ФЕП-карбоксилаза 24 (Шишкина, Троценко, 1986). Интересно, что у представителей рода Methylococcus в ассимиляции СО2 также участвует рибулозобисфосфат-карбоксилаза/оксигеназа (РБФК/О) (Taylor et al., 1981). Гены РБФК/О (cbbl) выявлены у Methylococcus и Methylocaldum и также доказана способность у Mc. capsulatus Bath расти автотрофно (Baxter et al., 2002). Эти факты подтверждают ранее постулированную эволюционную связь путей первичного С1 метаболизма у метанотрофов и автотрофов (Quayle, Ferenci, 1978; Whittenbury, 1980; Троценко, Хмеленина, 2008). 1.5. Известное разнообразие аэробных метанотрофов. Метанотрофы относятся к наиболее широко распространенным микроорганизмам. Они населяют самые разнообразные экосистемы: болота, разнообразные почвы, озера, моря, осадки, сточные воды, рисовые чеки, полигоны ТБО. Кроме прямого окисления вновь образованного в анаэробных зонах этих местообитаний метана, некоторые метанотрофы способны использовать атмосферный СН4, что делает их высоко приспособленными к обитанию в разнообразных эконишах (Semrau et al., 2010). Термофильные и термотолерантные метанотрофы. Как упоминалось выше, большинство метанотрофов являются умеренными организмами и предпочитают обитать в условиях около-нейтрального значения рН при 25-30 °С. Тем не менее, известен ряд метанотрофных бактерий, оптимально растущих при повышенных температурах. Все известные на настоящий момент метанотрофы-термофилы относятся к классу Gammaproteobacteria. Первый описанный из них - Methylococcus capsulatus предпочитает расти при температуре 45°С и является одним из наиболее изученных метанотрофных организмов. Чуть позже был описан еще один род термофильных метанотрофов – род Methylocaldum. Виды Methylocaldum tepidium и Methylocaldum gracile характеризуются, скорее как термотолерантные бактерии, с оптимумом роста при температуре 42 °С. В отличие от них, Methylocaldum szegendiense является истинным термофилом, поскольку температура 55 °С является для него оптимальной (диапазон 37 65°С). Другими представителями метанотрофов-термофилов среди Proteobacteria являются метанотрофы рода Methylothermus. На настоящий момент описано два представителя данного рода - Methylothermus thermalis и Methylothermus subterraneus. Первый из них был выделен из термальных источников Японии, и был способен расти в диапазоне температур 37 – 67°С (Tsubota et al., 2005). Другой вид рода Methylothermus, M. 25 subterraneus, был выделен относительно недавно, в 2011 году, из горячих шахтных вод Японии. В отличие от M. thermalis, он предпочитает расти в более кислых и менее соленых условиях. Рост культуры наблюдался в диапазоне температур 37 - 65°С (Hirayama et al., 2011). Необходимо отметить, что верхняя планка температуры в 65°С показана лишь для описанных видов термофильных метанотрофов, однако, ныне утерянный штамм Methylothermus sp. HB, выделенный из термальных источников Венгрии, был способен к росту и при температуре 72 °С (Bodrossy et al., 1997). Таким образом, возможность существования экстремально-термофильных метанотрофов не исключена. Необходимо отметить, что метанотрофы-термофилы имеют ряд отличий от остальных метанотрофов класса Gammaproteobacteria. Так, для представителей родов Methylococcus и Methylocaldum показано наличие генов, кодирующих некоторые ферменты серинового пути ассимиляции формальдегида, что характерно для метанотрофов II типа. А у метанотрофов рода Methylothermus в клетке присутствуют в равной доле жирные кислоты с 16-ю и 18-ю атомами углерода, индикаторные для метанотрофов I и II типов, соответственно (Троценко, Хмеленина, 2008; Hirayama et al., 2011) . Как уже было сказано выше, к термофильным метанотрофам относятся также метанотрофные представители Verrucomicrobia, выделенные недавно из различных геотермальных местообитаний – грязевых вулканов Южной Италии, геотермальных полей Новой Зеландии, а также кислых горячих источников Камчатки (Op den Camp et al., 2009). Независимо друг от друга разными исследователями были получены в чистую культуру три представителя таких метанотрофов: ‘Acidomethylosilex fumarolicum’ штамм SoiV (Pol et al., 2007), ‘Methyloacida kamchatkenesis’ штамм Kam1 (Islam et al., 2008) и ‘Methylokorus infernorum’ штамм V4 (Dunfield et al., 2007), ни один из которых на настоящий момент не описан таксономически. Дальнейшие исследования физиологии, биохимии и генетического потенциала новых метанотрофов показали что они очень близки между собой, вследствие чего были отнесены к роду ‘Methylacidiphilum’. О метаболических особенностях метанотрофных веррукомикробий пока известно мало. Показано, что у них отсутствуют гены ключевых ферментов РМФ пути ассимиляции формальдегида – гексулофосфатсинтазы и гексулофосфатизомеразы (Hou et al., 2008). В то же время, некоторые ферменты серинового пути (глицераткиназа и малил-КА-лиаза) также не обнаружены у новых метанотрофов, что ставит под сомнение возможность 26 использования данных путей в процессах ассимиляции углерода. У метанотрофов Verrucomicrobia присутствуют гены глиоксилатного шунта – изоцитратлиаза и малатсинтаза, а добавление CO2 стимулирует рост, что может быть следствием использования в процессах ассимиляции углерода ферментов цикла Кальвина-Бенсона (Hou et al., 2008; Op den Camp et al., 2009). Психрофильные и психротерантные метанотрофные организмы. Природные экосистемы, где господствуют низкие температуры, являются одними из наиболее распространенных на Земле. К крупнейшим из них относятся обширные тундровые и северные болотные экосистемы, а также большая часть мирового океана, где средняя температура воды держится на уровне +5 – 7°С. Несмотря на низкие температуры, данные экосистемы, за счет обширных анаэробных зон, являются мощными источниками метана. Следовательно, метанотрофы являются одними из ключевых организмов в микробном сообществе этих местообитаний. Истинно психрофильных метанотрофов пока описано мало. Все они принадлежат к классу Gammaproteobacteria и предпочитают расти при температурах ниже 15°С. К метанотрофам-психрофилам относятся Methylobacter psychrophilus (Омельченко и др., 1996), выделенный из почв тундровой зоны России, а также Methyloshaera hansoni и Methylomonas scandinavica, изолированные из антарктического озера и холодных глубоководных вод вблизи побережья Балтийского моря (Bowman et al., 1997; Kalyuzhnaya et al., 1999). Эти метанотрофы несколько отличаются в температурных предпочтениях, однако температура 10°С для большинства из них является оптимальной. Метанотрофы соленых и щелочных экосистем. Экосистемы с повышенным содержанием солей достаточно широко распространены в природе. К ним относятся моря, эстуарии, некоторые арктические почвы, соленые водоемы, а также содовые озера. За исключением содовых озер, в большинстве своем, они характеризуются нейтральными значениями рН среды. По отношению к солености среды метанотрофные организмы разделяются на галотолерантов и галофилов. Последние облигатно зависят от присутствия NaCl в среде. Среди галлофилов следует отдельно выделить экстремальных галлофилов, способных расти при очень высокой концентрации NaCl в среде. Например, Methylohalobius 27 crimeensis, выделенный из гиперсоленого озера полуострова Крым, предпочитает развиваться при 5.8 – 8.7 % NaCl в среде. Максимальная же концентрация соли, при которой наблюдался рост, составляет около 15%, что является верхним пределом для известных на настоящий момент метанотрофных бактерий (Heyer et al., 2005). В большинстве своем, галофильные и галотолерантные метанотрофные организмы, принадлежат к классу Gammaproteobacteria. К ним относятся представители родов Methylobacter и Methylomicrobium, выделеные из различных соленых местообитаний (Bowman et al., 1993; Khmelenina et al., 1997, 1999; Kaluzhnaya et al., 2001, 2008; Wartiainen et al., 2006). К галофильным метанотрофам относится также описанная ранее психрофильная метанотрофная бактерия Methylosphaera hansoni, требующая для роста присутствия в среде культивирования морской воды, что соответствует около 3.5 % NaCl (Bowman et al., 1997). Недавно из морской гидротермы был выделен еще один представитель галофильных метанотрофов – Methylomarinum vadi, растущий оптимально при 3% NaCl (Hirayama et al., 2013). Большинство морских метанотрофов являются нейтрофилами. Из содовых озер был выделен также ряд галофильных метанотрофов, растущих при высоких значениях рН. Содовые озера представляют собой уникальные экстремальные природные экосистемы. В щелочных средах большинство катионов металлов переходят в осадок, тем самым обеспечивая доступность фосфата, который в содовых озерах перестает быть лимитирующим фактором. Для эукариотных организмов, в том числе высших, щелочные и соленые условия содовых озер являются малопригодными для существования. Микробное разнообразие в данных экосистемах представлено многочисленными алкалофильными прокариотами, относящимся практически ко всем известным физиологическим группам микроорганизмов. Благодаря способности большинства из них фиксировать атмосферный азот, для активного развития микроорганизмов в содовых озерах практически отсутствуют лимитирующие факторы (Заварзин, 2006; Троценко, Хмеленина, 2008). Из содовых озер были выделены представители рода Methylomicrobium – M. alcaliphilum, M. buryatense и M. kenyense (Kaluzhnaya et al., 2008). M. kenyense, выделенный из содовых озер Кении, был способен расти при рН 10, являясь тем самым истинным алкалофильным метанотрофом (Sorokin et al., 2000). 28 Присутствие метанотрофов класса Alphaproteobacteria в щелочных озерах было неоднократно подтверждено с помощью методов молекулярной экологии (Lin et al., 2004, 2005). Однако, попытки выделить алкалофильных метанотрофов II типа в чистую культуру остаются малоэффективными, и, на данный момент, удалось поучить лишь один изолят таких бактерий, принадлежащих к роду Methylocystis и способных расти при высоких значениях рН (6.0 – 9.7) (Ешинимаев и др., 2008). Сведения об ацидофильных метанотрофах детально изложены в главе 3. Как следует из вышеприведенных данных, метанотрофные бактерии чрезвычайно разнообразны по своим экофизиологическим характеристикам. Они населяют аэробные и анаэробные зоны различных экосистем с контрастными характеристиками: от холодных соленых озер до термальных кислых источников. Высоко специализированные метаболитические пути позволяют метанотрофам успешно использовать С1-соединения. Отсутствие конкурентов в борьбе за использование метана в качестве единственного источника углерода и энергии приводит к широкому распространению данных организмов практически во всех экосистемах, где доступен метан. Метанотрофы способны развиваться в самых бедных условиях, не требуя факторов роста и витаминов, а также деградировать широкий спектр органических хлорзамещенных соединений, что делает их перспективными агентами технологий биоремедиации. Тем не менее, многие аспекты метаболизма метанотрофов на настоящий момент остаются изучены слабо. В силу сложностей культивирования метанотрофов и отсутствия универсальных сред и приемов, использование культуральных подходов для исследования метанотрофных сообществ тех или иных экосистем во многих случаях является малоэффективным. Хорошей альтернативой культуральным подходам в исследованиях метанотрофных бактерий являются современные методы молекулярной экологии, краткая характеристика которых дана в главе 2. Глава 2. Молекулярные подходы, используемые в исследовании экологии метанотрофных бактерий. Исследования разнообразия и распространения метанотрофных организмов в различных экосистемах, их участия в глобальных биогеохимических циклах находятся в фокусе внимания международного научного сообщества. Метанотрофы населяют 29 широкий спектр различных местообитаний, таких как почвы, болота, пресноводные и морские осадки, горячие источники, ткани животных, моллюсков, растений, захоронения бытовых отходов и др. (Conrad, 2009). Среди подходов, используемых для изучения экологической роли данной группы микроорганизмов, значительным потенциалом обладают молекулярные методы. Методические сложности культивирования и получения изолятов, трудоемкость изучения особенностей метаболизма метанотрофных бактерий относят их к категории сложных в работе организмов. Попытки выделения новых метанотрофов из какого-либо местообитания могут потребовать годы работы исследователя. Ростовые потребности и кинетические характеристики метанотрофов разных групп настолько различны, что приходится констатировать невозможность введения некой универсальной среды и условий культивирования этих бактерий (Дедыш, 2006). В качестве метода, альтернативного трудоемкому процессу культивирования до недавних пор широко применялся анализ экстрагируемых из нативных образцов жирных кислот. Как отмечалось выше (см. главу 1), клетки метанотрофов содержат необычные жирные кислоты, которые почти не встречаются у других бактерий - кислоты 16:1ɷ8с и 18:1ɷ8с. Их было предложено использовать в качестве ‘индикаторных’ жирных кислот метанотрофов I и II типов, соответственно (Андреев, Гальченко, 1978; Гальченко и др., 1986; Bowman et al., 1991; Guckert et al., 1991). Однако впоследствии был описан ряд метанотрофных организмов, составляющих исключение и нарушающих универсальность такого подхода. Таким образом, как культуральные приемы, так и метод анализа жирных кислот имеют очень значительные ограничения для анализа состава и численности популяций метанотрофных бактерий in situ (Дедыш, 2006). Несравнимо более молекулярные методы, широкие возможности для этих целей предоставляют позволяющие идентифицировать и всесторонне исследовать метанотрофные организмы, ранее не описанные и не культивируемые в лабораторных условиях, а также оценить их разнообразие и роль в различных экосистемах (Murrell et al., 1998, 2000; Wise et al., 1999; Graef et al., 2011; Gupta et al., 2012). 2.1. Амплификация и анализ филогенетических генов. 30 Наиболее оптимальным целевым маркером для создания специфичных праймеров и олигонуклеотидных зондов является ген 16S рРНК, так как рибосома является консервативным компонентом микробной клетки, наименее подверженным эволюционным изменениям (Троценко, Хмеленина, 2008). Применение генов 16S рРНК как маркеров в исследованиях экологии метанотрофных бактерий основано на принадлежности последних к нескольким филогенетически тесным группам. Как упомянуто выше (см. главу 1), все ныне известные аэробные метанотрофные организмы относятся лишь к двум филогенетическим ветвям домена Bacteria - Proteobacteria и Verrucomicrobia (Дедыш, 2006). К двум классам в пределах Proteobacteria – Alphaproteobacteria и Gammaproteobacteria – относятся почти все ныне охарактеризованные и хорошо изученные метанотрофы (Hanson, Hanson, 1996; Гальченко, 2001). Стремительное расширение базы данных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, связанное с выделением и описанием новых родов и видов метанотрофных бактерий, привело к поискам целевых последовательностей, специфичных для метанотрофов I и II типов (Costello, Lidstrom, 1999; Brusseau et al., 1994; McDonald et al., 1996; Aumann et al., 2000). Однако при дальнейшем расширении спектра известных метанотрофов оказалось, что ранее разработанные праймеры теряют свою группо-специфичность, поскольку ни одна из групп не является монофилетичной. Например, в пределах метанотрофов II типа можно выделить группы Methylosinus/Methylocyctis и Methylocella/Methylocapsa, а в пределах метанотрофов I типа - группы Methylococcus и Methylobacter/Methylosarcina (Дедыш, 2004; Kolb et al., 2003). Таким образом, в настоящее время при создании праймерных систем или олигонуклеотидных зондов для гибридизации все больше внимания уделяется поиску целевых последовательностей, имеющих родовую специфичность. Для адекватной оценки численности и разнообразия метанотрофных организмов в природных местообитаниях групповые зонды уже не обладают требуемым уровнем специфичности. Основные целевые последовательности, используемые в исследованиях экологии метанотрофных организмов, приведены в Таблице 2. Одними из первых были созданы праймерные системы 1035-RuMp, 1041-5 и 1034-Ser, позволяющие селективно амплифицировать фрагменты нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК метанотрофов I и II типов (Brusseau et al., 1994). Однако последующее расширение базы данных за счет описания новых метанотрофов показало, что данные праймерные 31 системы, к сожалению, не являются универсальными и выявляют лишь небольшую часть известных метанотрофов. В дальнейшем усилия исследователей были направлены на создание родо- и видоспецифичных праймерных систем. Так появилась целая группа праймеров, специфически амплифицирующих нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК родов Methylobacter (Holmes et al., 1995; Gulledge et al., 2001), Methylococcus и Methylomonas (Gulledge et al., 2001), Methylosphaera (Калюжная и др., 2004), Methylocaldum (Gulledge et al., 2001), Methylosinus (Holmes et al., 1995). С расширением базы данных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК метанотрофных организмов были разработаны более совершенные праймерные системы, позволяющие эффективно идентифицировать метанотрофов I и II типов в экосистемах (Chen et al., 2007). 2.2. Амплификация и анализ функцинальных генов. Анализ гена 16S рРНК является достаточно быстрым и точным способом установить филогенетическое положение искомых организмов. Однако он не дает возможности сделать точное заключение о принадлежности исследуемых бактерий к метанотрофам в случае, если они занимают достаточно отдаленное филогенетическое положение от известных метанотрофных организмов. Дополнительную информацию, в таком случае, дает анализ функциональных генов. Функциональные гены метанотрофных бактерий кодируют ключевые ферменты метаболизма этих микроорганизмов – мембранную и растворимую формы метанмонооксигеназы (гены pmoA и mmoX, соответственно), а также метанолдегидрогеназу (ген mxaF). Основные праймерные системы, используемые для амплификации фрагментов этих генов, приведены в таблице 2. Наиболее универсальным молекулярным маркером метанотрофов является ген pmoA, который кодирует белок, несущий активный центр мембранной ММО. Филогенетические деревья, построенные на основе последовательностей данного гена, в большинстве своем, когерентны филогенетическим деревьям, постоенным на основе гена 16S рРНК (Kolb et al., 2003; Holmes et al., 1995; McDonald, Murrell, 1997b; Heyer et al., 2002). Изначально считалось, что мембранная ММО присутствует в клетках всех метанотрофов. Недавно, однако, были описаны ацидофильные метанотрофы родов Methylocella и Methyloferula, которые обладают лишь растворимой формой ММО. Ген pmoA у данных метанотрофов отсутствует. Тем самым, существование подобных метанотрофных организмов несколько ограничивает использование гена pmoA в качестве универсального маркера. 32 На настоящий момент существует несколько праймерных систем, используемых для амплификации гена pmoA у метанотрофов. Самая универсальная пара праймеров, A189f/A682r, была разработана довольно давно, в середине 90-x годов прошлого века (Holmes et al., 1995). Она обладает широким спектром детекции, однако амплифицирует не только ген pmoA, но и ген amoA, кодирующий аммоний-монооксигеназу (АМО На настоящий момент существует несколько праймерных систем, используемых для амплификации гена pmoA у метанотрофов. Самая универсальная пара праймеров, A189f/A682r, была разработана довольно давно, в середине 90-x годов прошлого века (Holmes et al., 1995). Она обладает широким спектром детекции, однако амплифицирует не только ген pmoA, но и ген amoA, кодирующий аммоний-монооксигеназу (АМО) – фермент, эволюционно родственный ММО. Тем не менее, данная праймерная система широко используется при изучении состава метанотрофных сообществ различных местообитаний (Bourne et al., 2001; Heyer et al., 2002; Holmes et al., 1999; Horz et al., 2002; Kalyuzhnaya et al., 2002; Radajewski et al., 2002) и способна выявлять новые группы метанотрофов (Holmes et al., 1999; Knief et al., 2003; Pacheco-Oliver et al., 2002). Большинство праймеров более позднего поколения не амплифицируют ген amoA, однако они либо менее универсальны (Kolb et al., 2003), либо позволяют амплифицировать слишком короткий фрагмент гена pmoA (Cheng et al., 1999; Дедыш, 2006). Так, сравнение наиболее используемых на настоящий момент праймерных пар A189f/A682r, A189f/mb661r и A189f/A650r на примере исследования метанотрофного сообщества почв показало существенное различие полученных результатов (Bourne et al., 2001). Праймерная система A189f/mb661r наиболее широко охватывала метанотрофное разнообразие в исследуемой экосистеме, в то время как две другие пары праймеров былименее специфичны, однако позволяли улавливать потенциально новые группы метанотрофных организмов. В настоящее время широко используется комбинирование данных праймерных пар (Hutchens et al., 2004; Knief et al., 2005; Lin et al., 2005; Morriset al., 2002). Например, при использовании метода «вложенной» ПЦР праймеры A189f/A682r используются в ПЦР на первом этапе, в то время как последующая, более селективная ре-амплификация полученных ПЦР-продуктов осуществляется с помощью праймерных пар A189f/mb661r или A189f/A650r (Horz et al., 2005). Такой подход позволяет максимально полно охватить разнообразие метанотрофов в природных экосистемах. 33 Таблица 2. Праймеры, используемые для специфической амплификации фрагментов филогенетических и функциональных генов метанотрофных бактерий. Праймер или зонд Нуклеотидная последовательность (5´-3´) Мишень Ссылка 16S рРНК 1035-RuMp GATTCTCTGGATGTCAAGGG Метанотрофы I типа Brusseau et al., 1994 1041-5 CTCCGCTATCTCTAACAGATT 1034-Ser CCATACCGGACATGTCAAAAGC Метанотрофы II типа Brusseau et al., 1994 MethT1bR/MethT2R GATTCYMTGSATGTCAAGG Метанотрофы I типа Wise et al., 1999 CATCTCTGRCSAYCATACCGG Type 1b GTCAGCGCCCGAAGGCCT Метанотрофы I типа Aumann et al., 2000 Type 2b CATACCGGRCATGTCAAAAGC Метанотрофы II типа Costello, Lidstrom, 1999 fm 64 GAACGGTAACAGGCCTTCGG Метанотрофы I типа McDonald et al., 1996 fm 142 GTTCGGAATAACTCAGGG Метанотрофы II типа McDonald et al., 1996 Type IF ATGCTTAACACATGCAAGTCGAACG Type IR CCACTGGTGTTCCTTCMGAT Метанотрофы I типа Chen et al., 2007 Mlb482/ Mlb662 GGTGCTTCTTCTAAAGGTAATGT Methylobacter Gulledge et al., 2001 Methylococcus Gulledge et al., 2001 Метанотрофы I типа Eller et al., 2001 Метанотрофы II типа Eller et al., 2001; CCTGAAATTCCACTCTCCTCTA Mlc123/ Mlc1436 CACAACAAGGCAGATTCCTACG CCCTCCTTGCGGTTAGACTACCTA Mγ983/ Mγ993 TGGATGTCAAGGGTAGGT ACAGATTCTCTGGATGTC 27f/MethT2R AGAGTTTGATYMTGGCTCAG 34 CATCTCTGRCSAYCATACCGG Snaidr et al., 1997 pmoA GGNGACTGGGACTTCTGG Все метанотрофы, кроме GAASGCNGAGAAGAASGC Methylocella A189f/mb661r CCGGMGCAACGTCYTTACC то же Costello, Lidstrom, 1999 A189f/A650 TGGAAGCCATTCCTGCA то же Bourne et al., 2001 то же Cheng et al., 1999 GGCTCCAAGTTCAAGGTCGAGC Метанотрофы, обладающие McDonald et al., 2001 TGGCACTCGTAGCGCTCCGGCTCG растворимую ММО CGGTCCGCTGTGGAAGGGCATGAAGCGCGT то же Miquez et al., 1997 то же Hutchnes et al., 2004 то же Aumann et al., 2000 то же Horz et al., 2001 A189f/A682r pmof1/pmor GGGGGAACTTCTGGGGITGGAC GGGGGRCIACGTCITTACCGAA Holmes et al., 1995 mmoX mmoX882f/mmoX1403r mmoX1f/mmoX2r GGCTCGACCTTGAACTTGGAGCCATACTCG mmoX206f/mmoX886r ATCGCBAARGAATAYGCSCG ACCCANGGCTCGACYTTGAA A166f/B1401r ACCAAGGARCARTTCAAG TGGCACTCRTARCGCTC 534f/1393r CCGCTGTGGAAGGGCATGAA CACTCGTAGCGCTCCGGCTC mxaF mxaF1003f/mxaF1561r mxaF769f/mxaF1690r GCGGCACCAACTGGGGCTGGT Все грамотрицательные GGGCAGCATGAAGGGCTCCC метилотрофы TGGGAGGGCGAYGCCTGGAA CCCGGCCARCCGCCGAC Метилотрофы Alphaproteobacteria McDonald et al., 1996 Dedysh et al., 2005 35 Другим важным функциональным геном метанотрофных бактерий является ген mmoX, кодирующий α-субчастицу гидроксилазного компонента растворимой ММО. Филогенетические деревья, построенные на основе нуклеотидных последовательностей данного гена, также формируют два различных кластера, соответствующие метанотрофам I и II типов, что позволяет использовать их для идентификации этих бактерий. На настоящий момент существуют разнообразные праймерные системы, позволяющие амплифицировать гены mmoX метанотрофов как в экологических исследованиях, так и при изучении чистых культур (Auman, Lidstrom, 2002; Baker et al., 2001; Fuse et al., 1998; Horz et al., 2001; McDonald et al., 2006; Shigematsu et al., 1999). Однако, использование генов mmoX для детекции метанотрофных организмов в природных образцах существенно ограничено как недостаточной универсальностью данных праймеров, так и относительно редкой встречаемостью рММО у метанотрофов. Ген mxaF кодирует главную субчастицу метанолдегидрогеназы, второго фермента в цепочке окисления метана. Использование его в качестве маркера в исследованиях экологии метанотрофов ограничено, так как он присутствует не только у метанотрофов, но и у грамотрицательных метилотрофных организмов. Гены mxaF метанотрофов и метилотрофов часто образуют общие кластеры, что затрудняет идентификацию организмов. Тем не менее, многие исследователи успешно используют данные гены в исследованиях метанотрофных сообществ различных экосистем (McDonald, Murrell, 1997a; Neufeld et al., 2007). 2.3. Количественная ПЦР. Количественная оценка метанотрофных организмов в природных экосистемах является достаточно сложной задачей. Одним из традиционных способов определения численности различных групп микроорганизмов является метод определения наиболее вероятного числа - most probable number (MPN). Однако, в случае с метанотрофными организмами он малоэффективен. Так как на настоящий момент не существует универсальной для всех метанотрофов среды культивирования, то результаты количественного учета данной группы микроорганизмов методом MPN напрямую зависят от условий культивирования (Bussmann et al., 2007; Воробьев, Дедыш, 2008). Альтернативный способ оценки численности метанотрофов в природных экосистемах предполагает использование метода количественной ПЦР - кПЦР (Knief et al., 2006; Kolb 36 et al., 2003, 2005; Halet et al., 2006). Особенностью данного метода является возможность наблюдения процесса амплификации в режиме реального времени, что позволяет оценить численность целевых организмов в образцах. Количественная ПЦР, однако, дает информацию лишь о количестве копий целевого гена в полученных экстрактах, а не о количестве клеток исследуемых организмов. Было показано, что в геномах Methylococcus capsulatus Bath, Methylosinus trichosporium OB3b и Methylocystis sp. M содержится по две копии гена pmoА (Semrau et al., 1995; Stoylar et al., 1999; Murrell et al., 2000). Также, при исследовании метанотрофов, обитающих в озерных осадках было показано, что количество копий генов pmoA варьировало от одного до трех (Aumann et al., 2000). Таким образом, применение метода кПЦР для количественной оценки метанотрофов в природных или лабораторных образцах способно вносить существенную ошибку в оценку численности, поскольку не существует каких-либо фиксированных коэффициентов пересчета. Известно также, что клетки метанотрофов I и II типов лизируются с различной эффективностью (Meyer et al., 1986; Лысенко и др., 1998; Bowman et al., 1993), что в результате приводит к неадекватной представленности ДНК данных групп метанотрофов в полученных экстрактах, используемых для дальнейших молекулярных исследований. Подтверждением этому служит исследование по разработке метода кПЦР на основе гена pmoA (Kolb et al., 2003). В качестве апробации разработанной методики авторами была предпринята попытка оценки численности внесенных в почву популяций метанотрофов I и II типов. Применительно к метанотрофам I типа – Methylococcus capsulatus и Methylomicrobium album – метод показал 100% эффективность, однако в опыте с метанотрофами II типа – Methylosinus trichosporium, удалось зарегистрировать лишь 20% внесенных клеток (Дедыш, 2006). Необходимо отметить, что недавно описанные ацидофильные метанотрофы рода Methylocapsa требуют еще более жестких условий для эффективного лизиса клеток (Дедыш, 2004). Таким образом, методы, подразумевающие экстракцию ДНК из образца, вряд ли могут служить источником строго количественной информации в исследованиях экологии метанотрофных бактерий (Дедыш, 2006). 2.4. Микрочипы. Технология микрочипирования позволяет одновременно анализировать большое количество образцов, и в настоящее время активно используется в диагностике. 37 Например, в медицине, ветеринарии, растениеводстве, при контроле качества воды и пищи с помощью микрочипов возможна быстрая детекция патогенов или контаминантов. В качестве мишеней могут выступать как филогенетические, так и функциональные гены микроорганизмов. Микрочипы представляют собой нейлоновые или нитроцеллюлозные мембраны, с нанесенными на них рядами олигонуклеотидных проб, количеством до нескольких тысяч (Bodrossy et al., 2003). Американскими исследователями было проанализировано бактериальное разнообразие некоторых природных образцов с использованием микрочипов с более чем 30 тысячами вариантами 16S рРНК олигонуклеотидных проб (Wilson et al., 2002). Кроме использования микрочипов на основе нуклеотидных последовательностях генов 16S рРНК, позволяющих детектировать лишь известные организмы, широко применяются микрочипы с различными функциональными генами в качестве мишеней. В случае метанотрофных организмов основой для разработки таких «функциональных зондов» служат последовательности генов pmoA и mmoX. Так, на основе базы данных последовательностей гена pmoA недавно был создан диагностический микрочип, состоящий из 68 проб и позволяющий быстро оценить разнообразие метанотрофов в различных экосистемах (Bodrossy et al., 2003). Уровень специфичности данных проб варьирует от штаммовой до родовой и групповой, что обеспечивает широкий спектр детекции и высокую разрешающую способность анализа (Дедыш, 2006). Однако, данный метод имеет ряд недостатков, связанных, в основном, с невозможностью оптимизировать условия гибридизации для всех проб, что может привести к неспецифическому связыванию и, как следствие, неверным результатам качественного и количественного анализа. 2.5. Метод FISH. Метод FISH (fluorescent in situ hybridization) совмещает в себе возможности идентификации и определения численности целевой популяции микроорганизмов в любых природных средах (Дедыш, 2006). Он основан на гибридизации клеток с 16S рРНК-специфичными флуоресцентно-меченными олигонуклеотидными зондами и дальнейшей детекции связавшихся клеток. Достоинством метода FISH является непосредственная визуализация целевых объектов, оценка их морфологии и локализации в нативных образцах. Данный метод позволяет проводить прямую количественную оценку искомых групп микроорганизмов в природных образцах, что делает его по-своему 38 уникальным. Из недостатков метода FISH следует отметить невозможность детекции покоящихся форм микроорганизмов из-за низкого содержания молекул 16S рРНК в этих клетках, вероятность неспецифической детекции и недоучет клеток неизвестных организмов. Интенсивность сигнала FISH связана с количеством копий гена 16S рРНК в клетке. Когда их численность меньше порогового уровня, что часто бывает в случае мелких форм бактерий или при стагнации роста, сигнал не может быть детектирован. В этом случае используют модифицированный вариант данного метода – метод CARD-FISH (catalyzed reporter deposition fluorescence in situ hybridization), который предусматривает значительное (до 20 раз) усиление сигнала (Teira et al., 2004). Ряд FISH-зондов различного уровня специфичности (от видо- до родо- и группоспецифичных) был разработан и для метанотрофных бактерий. Спектр их пока относительно невелик (Таб. 3). Область применения этих «метанотрофных» зондов до недавнего времени ограничивалась лишь анализом смешанных и накопительных культур (Holmes et al., 1995; Bourne et al., 2000). Примером первого количественного исследования состава метанотрофной популяции с использованием метода FISH является детальный анализ метанотрофов кислых сфагновых болот России (Dedysh et al., 2001, 2003), который показал доминирование в кислых торфах ацидофильных метанотрофов родов Methylocystis, Methylocella и Methylocapsa, принадлежащих к Alphaproteobacteria. Напротив, численность метанотрофных представителей Gammaproteobacteria в данных образцах не превышала 1% общей численности метанотрофного сообщества сфагновых болот (Дедыш, 2006). 2.6. Метод стабильных изотопов (SIP). Отдельного упоминания заслуживает метод SIP, позволяющий связать организм с его биологической ролью в природных образцах без выделения в чистую культуру. Суть метода заключается в кратковременной инкубации анализируемых нативных образцов с отдельными субстратами, содержащими стабильный изотоп углерода 13С, последующим выделением 13 С-меченной ДНК и ее ПЦР-анализом (Dumont, Murrell, 2005; Friedrich, 2006). Так как природное обогащение образцам >99% 13 С не превышает 1%, то добавление к нативным 13 С-меченного субстрата приводит к его встраиванию в метаболически активные клетки. В дальнейшем 13 С-ДНК отделяют от 12 С-ДНК бактерий, которые не 39 Таблица 3. 16S рРНК-специфичные олигонуклеотидные зонды, разработанные для специфической детекции метанотрофных бактерий (цитировано по Dedysh et al., 2003). Зонд Мишень Нуклеотидная Целевой участок Формамид Т, °Сб последовательность (5´-3´) 16S рРНК % а NaCl, Ссылка мМольв М-450 Метанотрофы II типа ATCCAGGTACCGTCATTATC 450-470 30 46 112 Eller et al., 2001 М-84 Метанотрофы I типа CCACTCGTCAGCGCCCGA 84-103 20 46 225 - CTGGTGTTCCTTCAGATC 705-724 M-705 - Mcell-1026 Methylocella palustris GTTCTCGCCACCCGAAGT 1026-1043 0 45-50 900 Dedysh et al., 2001 Mcaps-1032 Methylocapsa acidiphila CACCTGTGTCCCTGGCTC 1032-1049 0 45-50 900 Dedysh et al., 2003 Mcells-1024 Methylocella silvestris TCCGGCCAGCCTAACTGA 1024-1041 0 50 900 - Mcellt-143 Methylocella tundra TTCCCCGAGTTGTTCCGA 143-160 0 50 900 - Msint-1268 Methylosinus trichosporium TGGAGATTTGCTCCGGGT 1268-1285 20 46 226 - Msins-647 Methylosinus sporium TCTCCCGGACTCTAGACC 647-664 30 46 112 - Mcyst-1432 Все Methylocystis spp. CGGTTGGCGAAACGCCTT 1432-1449 0 50 900 - а - концентрация формамида в гибридизационном буфере, б - температура гибридицазии, в - концентрация NaCl в буфере для промывки. 40 ассимилировали меченый субстрат, ультрацентрифугированием в градиенте плотности CsCl (Троценко, Хмеленина, 2008). Одним из преимуществ метода SIP является возможность использовать в качестве ПЦР-мишеней не только филогенетические, но и функциональные гены. В качестве 13 соединения (13СН4, СО2), но и ряд других субстратов, в числе которых 13 С-метанол и С-меченных субстратов используют не только С1- 13 загрязнители окружающей среды, такие как бензоат, нафталин и др. (Jeon et al., 2003; Singleton et al., 2007). Впервые эффективность метода ДНК-SIP удалось продемонстрировать на аэробных метано- и метилотрофных бактериях (Radajewski et al., 2000). В качестве мишени в таких экспериментах, помимо ДНК, может быть использована и РНК (РНК-SIP). Такая модификация метода, однако, является болеетрудоемкой и технически сложной, чем ДНК-SIP (Whiteley et al., 2006). Выделение РНК из нативных образцов является достаточно сложным процессом ввиду ее нестабильности, однако метод РНК-SIP имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с методом ДНК-SIР. Во-первых, РНК-SIP позволяет выявить метаболически активные, но неделящиеся клетки, в то время как меченый углерод встраивается в молекулу ДНК только в процессе репликации, что происходит при делении клетки. Вовторых, несвязанное с процессом репликации накопление копий РНК позволяет оценить степень активности того или иного метанотрофа в процессе окисления метана при кратковременной инкубации с 13 СН4 (Manefield et al., 2002; Dumont et al., 2011). Еще одной разновидностью данного подхода является метод PLFA-SIP, который позволяет идентифицировать активный компонент метанотрофного сообщества на основании анализа состава жирных кислот (Bodelier et al., 2009). Данные PLFA анализа, однако, не всегда можно однозначно интерпретировать, что несколько ограничивает его применение. Различные варианты метода SIP широко востребованы ныне для выявления и идентификации метаболически активного метанотрофного компонента микробных сообществ различных природных экосистем – от кислых лесных почв и торфяников до осадков пресноводных и содовых озер (Radajewski et al., 2002; Lin et al., 2004; Maxfied et al., 2006; Cebron et al., 2007; Bodelier et al., 2009; Dumont et al., 2011). В целом, необходимо признать, что прогресс в понимании роли и разнообразия метанотрофных организмов в микробных сообществах связан, прежде всего, с развитием и усовершенствованием методов молекулярной экологии. Сложности получения метанотрофов в чистых культурах стимулировали активный поиск косвенных методов 41 изучения этих бактерий. Эти методы позволяют не только визуально оценить локализацию метанотрофов в природных местообитаниях, но и определить вклад отдельных организмов в процесс окисления метана, а также выявить потенциально новые группы метанотрофов. В настоящее время все больше внимания уделяется исследованию роли метанотрофных организмов в природных экосистемах, а также их влияния на микробное сообщество и экосистему в целом. Глава 3. Метанотрофы как компонент микробных сообществ северных сфагновых болот. Одним из наиболее распространенных типов северных болотных экосистем являются верховые сфагновые болота. Это типичные представители автономных ландшафтов. Верховые болота развиваются на водоразделах и в своем питании ограничены тем, что поступает к ним из воздуха с атмосферными осадками и пылью. От минерального грунта они отделены слоем торфа. Вода в верховых болотах отличается низкой минерализацией, составляющей 5-100 мг/л, низкой электропроводностью, низким значением рН 3-5, обусловленным органическими кислотами, углекислотой и ионным обменом на поверхности растений (Заварзин, 2004). Большую часть вегетационного сезона уровень воды находится вблизи или на поверхности почвы, что приводит к стагнации процессов аэробного разложения растительных остатков. В результате, северные сфагновые болота представляют собой глобальный сток CO2, со скоростью процессов захоронения углерода около 10-30 мг С в год на один квадратный метр. Северные торфяники занимают около 3-5% общей площади поверхности суши и содержат в себе одну треть мирового запаса органического углерода (Gorham, 1991). В то же время, сфагновые болота являются одними из важнейших источников парникового газа метана (Matthews, Fung, 1987; Gorham, 1991; Panikov, 1999; Friborg, 2003). Конечный этап разложения органических веществ в глубоких анаэробных слоях болотного профиля приводит к образованию значительных количеств метана, который диффундирует сквозь торфяную толщу и попадает в атмосферу. Эмиссию метана из болот контролируют метанотрофные организмы, формирующие своеобразный бактериальный фильтр. Эти бактерии, развитие которых приурочено к уровню стояния болотных вод, способны эффективно перехватывать метан на его пути в атмосферу (Dedysh, 2009). 42 Начиная с момента их открытия, метанотрофные организмы превратились в объекты активного изучения для целого поколения исследователей. Поиск новых метанотрофов осуществлялся во всех экосистемах, где имеет место образование метана. Несмотря на то, что первая метанотрофная бактерия была описана в далеком 1906 году, прорыв в массовом культивировании новых метанотрофов произошел только в 1970 годах (Whittenbury et al., 1970). В последующие 40 лет было получено большое количество изолятов, среди которых встречались представители различных экофизиологических типов: термофилы, психрофилы, алкалофилы (См. табл. 1, стр.18). В этом перечне, однако, долгое время отсутствовали ацидофильные метанотрофы, населяющие кислые сфагновые болота. Первое сообщение о молекулярной детекции метанотрофных организмов в кислых торфяниках было опубликовано около 20-ти лет назад (McDonald et al., 1996). Полученные из сфагнового торфа нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК и ряда функциональных генов принадлежали метанотрофам II типа, однако представляли филогенетически обособленную подгруппу без охарактеризованных организмов. Параллельно с этими первыми молекулярными анализами предпринимались попытки выделения неизвестных болотных метанотрофов в чистую культуру. Однако эти попытки долгое время они оставались безрезультатными. Тщательное изучение физикохимических особенностей болотной экосистемы привело к созданию новой селективной среды, на которой впоследствии и были выделены первые ацидофильные метанотрофы (Dedysh et al., 1998), которые оказались приспособлены к существованию в экстремальных условиях кислых сфагновых болот (см. раздел 3.2). Основные этапы в изучении метанотрофов кислых сфагновых болот условно можно разделить на две большие группы: данные, полученные с помощью молекулярных методов и данные, полученные с помощью культуральных подходов. 3.1. Исследование экологии и разнообразия метанотрофов в болотах с помощью молекулярных методов. В середине 1990 годов был впервые проведен молекулярный анализ состава сообществ метанотрофов в ряде сфагновых торфяников Великобритании (McDonald et al., 1996). В этой работе на основании анализа последовательностей генов 16S рРНК, 43 амплифицированных из экстрактов ДНК образцов кислых торфов, удалось показать присутствие метанотрофов, филогенетически близких родам Methylosinus и Methylocystis, но формирующих отдельную ветвь в пределах Alphaproteobacteria. Дополнительное доказательство наличия метанотрофов в кислых торфах было получено при использовании в качестве ПЦР-мишеней функциональных генов метанотрофов, таких как pmoA и mmoХ, кодирующих мембранную и растворимую формы метанмонооксигеназы, а также гена mxaF, кодирующего большую субъединицу метанолдегидрогеназы. Результаты этих исследований подтвердили гипотезу о существовании в кислых болотах неизвестной группы метанотрофов (McDonald et al., 1995а; 1995b, 1997). Как мы знаем сейчас, данные последовательности принадлежали метанотрофам новых видов рода Methylocystis, типичным обитателям сфагновых болот (Dedysh et al., 2007; Belova et al., 2013). До определенного времени, исследования разнообразия метанотрофного сообщества болот с помощью молекулярных методов были в значительной степени ограничены лишь кругом известных на тот момент метанотрофов. Однако первые успехи в выделении ацидофильных метанотрофов и описание представителей новых родов Methylocapsa и Methylocellа существенно расширили спектр праймерных систем и зондов, доступных для успешной идентификации основных групп болотных метанотрофов (Dedysh et al., 2001; 2003). Было также показано, что представители рода Methylocella не содержат мембранную ММО, а имеют лишь ее растворимую форму. Следовательно, при исследовании разнообразия метанотрофного сообщества на основании анализа гена pmoA как минимум одна группа метанотрофов оставалась неучтенной. Применение метода FISH для анализа ряда кислых олитотрофных болот Северной Германии и Западной Сибири показало, что общая численность метанотрофных бактерий в них достигала 106 – 107 клеток на грамм сырого торфа (Dedysh et al., 2001, 2003). Болотные метанотрофы были представлены родами Methylocapsa, Methylocella и Methylocystis. Представители рода Methylocystis составляли абсолютное большинство 60-90% от общей численности метанотрофов. Метанотрофы класса Gammaproteobacteria, выявленные в торфе с помощью специфичных для метанотрофов I типа олигонуклеотидных зондов М84 и М705, не представляли численно значимого компонента и составляли не более 0.1-1.0% от всех болотных метанотрофов. Было также 44 отмечено, что численность и разнообразие болотных метанотрофов существенно варьировали в зависимости от особенностей болотных экосистем. Например, в кислых сфагновых болотах (рН 3.9 – 4.2) доминировали метанотрофы класса Alphaproteobacteria, достигая в некоторых случаях 107 клеток в грамме торфа (Dedysh, 2009). В то же время, в менее кислых (рН 5.0 - 6.0) и более холодных болотах тундры численная представленность метанотрофов I и II типов была приблизительно одинакова, что неудивительно, поскольку среди метанотрофов класса Gammaproteobacteria имелись психрофильные представители - например, Methyloshaera hansoni и Methylobacter psychrophilus - но до последнего времени ацидофилы известны не были. Метод стабильных изотопов (SIP) также был использован для идентификации метаболически активных метанотрофов в кислых болотах. Так, в исследованиях метанотрофного сообщества мезотрофного болота на основе анализа выделенной из нативных образцов торфа после их инкубирования с 13 13 С-ДНК, СН4 был выявлен ряд последовательностей гена 16S рРНК, принадлежащих представителям родов Methylocella, Methylocystis/Methylosinus, а также Methylobacter (Morris et al., 2002). Анализ последовательностей фрагментов гена pmoA, амплифицированных из этого же образца ДНК, подтвердил преобладание метанотрофных альфапротеобактерий. Из разновидностей метода SIP при исследовании болот применялся также метод PLFA-SIP, позволяющий оценить активную составляющую метанотрофоного сообщества на основании анализа выделенных жирных кислот. Так, группой голландских исследователей при анализе кислого торфа были идентифицированы жирные кислоты 16:1ɷ7, 18:1ɷ9 и 18:1ɷ7 (Chen et al., 2008). Последняя являлась индикаторной для болотных метанотрофов Methylocella, Methylocapsa и Methylocystis (Dedysh et al., 2000, 2002, 2004а, 2007). Присутствие кислоты 16:1ɷ7 достаточно сложно интерпретировать. Она является индикаторной для метанотрофов I типа, однако, недавние исследования показали, что она присутствует и у некоторых представителей рода Methylocystis. Например, в клетках ацилофильных M. heyeri и M. bryophila данная кислота является одной из доминирующих (Dedysh et al., 2007; Belova et al., 2013). Таким образом, оценка метанотрофного сообщества сфагновых болот на основании анализа жирных кислот не является методически безупречной, хотя и косвенно подтверждает доминирование метанотрофов класса Alphaproetobacteria. 45 Еще один подход, примененный для анализа разнообразия метанотрофов кислых торфяников, это метод микрочипирования (Bodrossy et al., 2003). Так, при исследовании осокового (рН 4.6) и сфагнового (рН 4.6 – 4.8) болот было обнаружено существенное различие в составе населяющих их метанотрофных организмов. В сфагновом болоте доминировали Methylocystis spp., а также присутствовали представители Methylocella и Methylocapsa. Болото же с преобладанием осоковых растений населяли как Methylocystis и Methylocella, так и неизвестные представители метанотрофов I типа (Сhen et al., 2008). Таким образом, использование метода микрочипов также подтверждает численное доминирование присутствие в сфагновых болотных экосистемах метанотрофов класса Alphaproteobacteria. Как видно, результаты исследования метанотрофного сообщества кислых болот с использованием перечисленных выше молекулярных методов однозначно свидетельствовали в пользу доминирующей роли метанотрофов II типа в процессах окисления метана в этих экосистемах. Тем не менее, первое же использование метода высокопроизводительного пиросеквенирования гена pmoA показало необычайно высокую долю метанотрофов класса Gammaproteobacteria в метанотрофном сообществе сфагновых болот. Так, в работе голландских исследователей было показано равноценное присутствие представителей родов Methylocystis и Methylomonas в микробном сообществе сфагнового болота (Kip et al., 2011). Интерпретация данного факта до последнего времени оставалась затруднительной, так как ацидофильные представители метанотрофов I типа были ранее неизвестны. 3.2. Культуральные приемы и характеристика полученных болотных метанотрофов. Ключевым приемом, позволившим успешно выделить первых метанотрофов из кислых болот, стало применение кислых (4.5 – 5.8), разбавленных культуральных сред, содержащих 100-500 мг солей в литре и обладающих низкой буферной емкостью (Dedysh et al., 1998). При использовании метана в качестве единственного источника углерода и энергии на данной среде удалось получить стабильные накопительные культуры, присутствие в которых метанотрофных бактерий было подтверждено с помощью метода FISH со специфическими для метанотрофов II типа зондами. Для получения изолятов 46 использовали либо метод рассева на плотные среды, либо метод предельных разведений (Dedysh et al., 1998, 2002, 2004a, 2007; Dedysh, 2009). К моменту начала настоящей работы все доступные в культурах болотные метанотрофы принадлежали к классу Alphaproteobacteria. Первые из них были выделены в начале 2000 годов и представляли собой новый род метанотрофов – Methylocella. На настоящий момент этот род насчитывает три вида – M. palustris, M. silvestris и M. tundra (Dedysh et al., 2000, 2003, 2004). Они представляют собой грамотрицательные короткие палочки, отличительным признаком которых является наличие на полярных концах клетки гранул полигидрооксибутирата, что позволяет легко идентифицировать их в накопительных культурах. Метанотрофы рода Methylocella являются уникальными организмами. Это первые известные метанотрофы, у которых отсутствует мембранная форма ММО. Гены, кодирующие мММО, в геноме Methylocella отсутствуют. В отличие от всех остальных метанотрофов, представители рода Methylocella не обладают развитой системой ВЦМ, а имеют лишь слабовыраженные везикулярные мембраны (Dedysh et al., 2000, 2002, 2004). Первоначально, представители рода Methylocella были описаны как облигатные метанотрофы, однако позже оказалось, что они способны утилизировать не только метан, но и ацетат, пируват, сукцинат, малат и этанол (Dedysh et al., 2005б). Более того, скорость роста на ацетате у этих бактерий значительно выше скорости роста на метане. Таким образом, представители рода Methylocella являются первыми истинно факультативными метанотрофными организмами. По своим физиологическим характеристикам метанотрофы рода Methylocella относятся к мезофилам (диапазон температур 4-30°С) и умеренным ацидофилам (диапазон рН 4.2-7.5). Они чувствительны к высокой концентрации низкоминерализованных солей средах в среде (200-500 мг и предпочитают солей на характеристикам представители рода Methylocella сходны с литр). развиваться По в остальным метанотрофами II типа (Dedysh, 2009). Вслед за метанотрофами рода Methylocella из нативных образцов сфагновых болот Западной Сибири были получены новые болотные метанотрофы. Они представляли собой короткие изогнутые палочки, образующие клеточные конгломераты, покрытые плотным полисахаридным матриксом. Филогенетически данные метанотрофы были наиболее близки роду Methylocella, однако, в отличие от последних, содержали мММО и 47 являлись облигатными метанотрофами. Данные организмы были описаны впоследствии как первые представители нового рода Methylocapsa - Methylocapsa acidiphila (Dedysh et al., 2002). Интересной особенностью новых метанотрофов явилось уникальное расположение ВЦМ, при котором они сгруппированы на одной половине клетки. M. acidiphila способна к активной фиксации N2. Последовательность гена nifH, кодирующего один из компонентов нитрогеназного комплекса у M. acidiphila практически идентична таковой у гетеротрофов-азотфиксаторов рода Beijerinckia (Dedysh et al., 2004б). По основным физиологическим характеристикам M. acidiphila сходна с представителями рода Methylocella: эта бактерия является мезофилом и умеренно ацидофильным организмом, предпочитающим низкоминерализованные среды. Позже, из образцов кислой лесной почвы был изолирован другой представитель рода Methylocapsa, M. aurea (Dunfield et al., 2010). В отличие от M. acidiphila он был способен к факультативному росту на ацетате и предпочитал более нейтральные значения рН среды (рН 6.0 – 6.5). Позже, еще один болотный метанотроф, Methyloferula stellata, был получен из образцов сфагнового болота севера России (Vorobev et al., 2011). Клетки этой бактерии представляли собой тонкие палочки, собирающиеся в процессе роста в розетки или крупные конгломераты. Подобно Methylocella, клетки нового метанотрофа обладали лишь рММО и не образовывали ВЦМ. Однако, в отличие от метанотрофов рода Methylocella, M. stellata была неспособна к факультативному росту. Примечательно, что этот микроорганизм являлся более ацидофильным, чем все выделенные до него болотные метанотрофы, и был способен расти при рН 3.5, имея оптимум рН 4.8 – 5.2. Необходимо отметить, что представители родов Methylocella, Methylocapsa и Methyloferula впервые были выделены из сфагновых болот. Как уже было отмечено выше, Methylocellа и Methyloferula не обладают мММО, а большая часть исследований метанотрофного разнообразия болот была выполнена на основе анализа последовательностей гена pmoA, кодирующего мММО. Очевидно, что в таких работах метанотрофы родов Methylocella и Methyloferula не фигурировали в качестве ключевых агентов процессов окисления метана в болотах. Основной же группой метанотрофов, выявленных в кислых торфах путем анализа гена pmoA, были представители рода Methylocystis. Эти болотные метанотрофы впоследствии также были успешно выделены в чистую культуру и описаны в качестве двух новых видов рода Methylocystis – M. heyeri и 48 M. bryophila (Dedysh et al., 2007; Belova et al., 2013). Первым, из сфагнового болота на севере Германии был изолирован M. heyeri штамм H2T. Клетки данного штамма представляли собой короткие прямые или слегка изогнутые палочки, покрытые обширной полисахаридной капсулой. По основным характеристикам он являлся типичным представителем метанотрофов II типа, за исключением одной особенности. В составе жирных кислот клетки в большую долю составляла кислота 16:1ɷ8c, которая ранее была предложена в качестве «маркерной» для метанотрофов I типа (Dedysh et al., 2007). Таким образом, данные сообщений о находке этой кислоты в общем пуле жирных кислот, выделенных из кислого торфа, может быть потенциально быть объяснено не присутствием в болотах неизвестных болотных метанотрофов I типа, а вкладом M. heyeri. Другой вид рода Methylocystis – M. bryophila - был выделен из образцов сфагнового торфа болот северной Германии и центральной России (Belova et al., 2013). Морфология клеток этого вида типична для представителей рода Methylocystis. Одной из ключевых особенностей M. bryophila явилось присутствие у него двух изоформ мММО, обладающих высоким и низким сродством к метану, а также и кодирующих их генов pmoA и pmoA2. M. heyeri и M. bryophila – это первые и пока единственные известные ацидотолерантные представители рода Methylocystis, растущие в диапазоне рН 4.4 – 7.6. Это мезофилы (диапазон температур 5 - 30°С), способные кроме метана и метанола использовать также ацетат. В отличие от представителей рода Methylocella, однако, предпочтительным субстратом болотных Methylocystis spp. является метан (Belova et al., 2010). Ацетат используется для поддержания жизнеспособности этих бактерий в периоды отсутствия метана. Таким образом, все выделенные и описанные к моменту начала настоящей работы болотные метанотрофы относились к классу Alphaproteobacteria и представляли собой умеренно ацидофильные и психротолерантные организмы, хорошо адаптированные к существованию в кислых и холодных северных сфагновых болотах. Они имели ряд особенностей, отличающих их от ранее известных метанотрофов II типа. В числе этих особенностей - отсутствие мММО у представителей родов Methylocella и Methyloferula, присутствие индикаторной для метанотрофов I типа жирной кислоты 16:1ɷ8c у Methylocystis heyeri и существование двух изоформ мММО у Methlocystis bryophila. 49 Главной же особенностью большинства (хотя и не всех) болотных метанотрофов является факультативность по отношению к метану. За исключением Methylocapsa acidiphila и Methyloferula stellata все болотные метанотрофы при отсутствии СН4 способны переключаться на использование ацетата, а в некоторых случаях и других субстратов (например, этанола). Метанотрофы рода Methylocella являются исключением, так как предпочитают расти на ацетате, хотя и способны к росту на метане в отсутствие ацетата. По всей видимости, факультативная метанотрофия является специфической адаптацией именно болотных метанотрофов, которые населяют экосистему, богатую сложным органическим веществом и продуктами его анаэробной деградации. 3.3. Пробелы в знаниях о метанотрофных сообществах сфагновых болот. В общей картине состава метанокисляющего сообщества болотных экосистем, тем не менее, остается ряд существенных пробелов. Первый из них, это нерешенный вопрос о присутствии в кислых болотах и вкладе в процесс окисления метана метанотрофов I типа. До недавнего времени, среди метанотрофов I типа ацидофилов известно не было. По данным анализа кислых торфов с помощью флуоресцентной in situ гибридизации (FISH), метанотрофы I типа в них немногочисленны и составляют не более нескольких процентов от общей численности метанотрофных бактерий (Dedysh et al., 2001; 2003). Тем не менее, нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК, а также некоторых функциональных генов метанотрофов класса Gammaproteobacteria, принадлежащие родам Methylobacter, Methylomonas и Methylococcus, были неоднократно выявлены в экстрактах тотальной ДНК, полученных из сфагнового торфа (Morris et al., 2002; Jaatinen et al., 2005; Слободова и др., 2006; Chen et al., 2008; Dumont et al., 2008). Привлечение метода высокопроизводительного пиросеквенирования для анализа разнообразия метанотрофов в болотах дало неоднозначные результаты. Так, при использовании в качестве мишени гена 16S рРНК метанотрофы I типа в торфе были выявлены в крайне низком количестве (Serkebaeva et al., 2013), тогда как при анализе пула генов pmoA метанотрофы класса Gammaproteobacteria и Alphaproteobacteria были представлены практически в равном соотношении (Kip et al., 2011а; Bragina et al., 2012). Подавляющее большинство ампликонов генов pmoA последовательности, близкие к таковым у метанотрофов I типа составили представителей рода Methylonomas. Интерпретация этих результатов до последнего времени оставалась затруднительной, так 50 как отсутствовали культуры ацидофильных Methylonomas spp., равно как и других метанотрофов I типа, способных расти в кислых средах. Единственный изолят болотных метанотрофов рода Methylomonas был получен недавно из сфагнового болота Нидерландов (Kip et al., 2011б). Этот изолят, однако, был лишь частично охарактеризован, и его роль в процессе окисления метана в болотах оставалась неясной. Вторым нерешенным вопросом является природа организмов, идентифицированных голландскими микробиологами в качестве «симбиотических» метанотрофов, населяющих гиалиновые клетки сфагновых мхов (Raghoebarsing et al., 2005). Последовательности генов 16S рРНК этих пока некультивируемых бактерий принадлежат к обширному кластеру клонов, полученных из болотных экосистем различного географического положения и почв различного генезиса. Этот кластер относится к Alphaproteobacteria и филогенетически равноудален от семейств Methylocystaceae и Beijerinckiaceae. Голландским микробиологам удалось доказать тесную метаболическую связь между метанотрофами и мхами (Raghoebarsing et al., 2005). Они постулировали симбиоз потенциально метанотрофных организмов со сфагновым мхом, однако в чистую культуру эти бактерии выделены не были. Как следствие, физиологические характеристики представителей этого филогенетического кластера до последнего времени оставались неизвестны. Выделение этих бактерий, филогенетически родственных метанотрофам II типа, и изучение их метаболического потенциала представляло особый интерес для установления их роли в болотных экосистемах. Таким образом, настоящая работа была предпринята для восполнения вышеупомянутых пробелов в знаниях о метанотрофных бактериях северных болотных экосистем. 51 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Глава 4. Объекты и методы исследования. 4.1. Образцы нативного торфа, использованные в исследовании. В работе использовали образцы торфа, отобранные в июне-июле 2011-2012 г. на границе аэробной и анаэробной зон (глубина 5-10 см) профилей болотных массивов Шумново и Тарлаковский мох Тверской области, болота Обуховское Ярославской области, а также трех болот Архангельской области - Шоля, Солза и Цигломень (Табл.4). Объекты исследования представляли собой типичные верховые олиготрофные болота бореальной и тундровой зон России, с величиной рН болотной воды 3.9-4.2. Болото Шумново граничило с участком горелого леса, что привело к повышению рН болотной воды до величины 4.7 за счет внесения зольного компонента. Отобранные образцы транспортировали в лабораторию в пакетах с охлаждением и немедленно использовали для определения метанокисляющей активности торфа, а также фиксации для последующего анализа методом FISH и экстракции ДНК для молекулярных исследований. 4.2. Определение активности окисления метана образцами торфа. Навески по 10 г сырого торфа измельчали до фрагментов размера 10-15 мм, помещали в стерильные стеклянные флаконы объемом 160 мл, герметично закрывали флаконы и вводили метан до концентрации около 1000 ppm. Флаконы инкубировали при комнатной температуре. В периодически отбираемых из газовой фазы флаконов пробах (0.5 мл) определяли концентрацию метана на хроматографе Кристалл 5000 («ЗАО Хроматек», Россия) с пламенно-ионизационным детектором. Измерения проводили до полного исчезновения метана во флаконах. На основании полученных данных рассчитывали скорость окисления метана исследуемыми образцами торфа. 4.3. Оценка численности метанотрофных бактерий с помощью метода FISH. 4.3.1. Процедура фиксации образцов торфа. Перед фиксацией образцы торфа подвергали процедуре экстракции клеток микроорганизмов, которую проводили с использованием гомогенизатора BagMixer 100 “MiniMix” (Interscience, Франция) и прилегающих к нему стерильных пакетов BagFilter®. Каждый пакет имеет две части, 52 Таблица 4. Болотные экосистемы, исследованные в настоящей работе. Болото, расположение, время отбора образцов рН Трофность болота Солза, Архангельская обл., N 64°48´, E 39°56´ 07.2012 3.9 Олиготрофное Цигломень, Архангельская обл., N 64°52´, E 40°32´ 07.2012 3.9 Олиготрофное Шоля, Архангельская обл., N 64°53´, E 40°16´ 07.2012 Шумново, Тверская обл., N 56°42’, E 36°52’ 06.2012 Тарлаковский мох, Тверская обл., N 56°37’, E 36°52’ 06.2012 Обуховское, Ярославская обл., N 57°, E 39° 06. 2011 Тасин Бор, Владимирская обл., N 55о36’, E 40о06’ 06.2013 4.1 4.7 Состав растительности Sphagnum fuscum, Eriophorum latifolium, Drosera rotundifolia, Oxycoccus palustris, Vaccinium uliginosum, Rubus chamaemorus, Carex spp., Pinus silvestris Sph. fuscum, E. latifolium, D. rotundifolia, Empetrum nigrum, O. palustris, V. myrtillus, V. uliginosum, R. chamaemorus, Carex spp., Andromeda polifolia, Betula pendula Олиготрофное Sph. fuscum, Sph. angustifolium, V. uliginosum, R. chamaemorus, C. calyculata, A. polifolia, P. silvestris, Equisetum fluviatile. Олиготрофное, в районе горелого леса Sph. аngustifolium, Carex spp., P. silvestris, B.pendula, Eq. fluviatile, A. polifolia, Vaccinium sp. 3.9 Олиготрофное Sph. angustifolium, Sph .fuscum, Carex spp., Oxicoccus sp., Vaccinium sp. 4.2 Олиготрофное Sph. angustifolium, Sph. fuscum, Carex spp., Oxicoccus sp., A. polifolia Олиготрофное Sph. angustifolium, Sph. fuscum, Carex spp., B.pendula, Eq. fluviatile, Vaccinium sp 3.9 53 разделенные внутренней фильтрующей вставкой. Последняя позволяет отделить торфяную суспензию от крупных частиц неразложившегося растительного материала (≤1 мм). 2 г сырого торфа помещали в одно из отделений пакета, добавляли 10-20 мл стерильной дистиллированной воды и обрабатывали в гомогенизаторе в течение 10 минут. 0.5 мл суспензии, обогащенной микробными клетками отбирали из другого отделения и центрифугировали для осаждения клеток при 8000 об/мин в течении 5 минут. Осадок ресуспендировали в 0.5 мл фосфатного буфера (NaCl – 8.0 г, KCl – 0.2 г, Na2HPO4 – 1.44 г, NaH2PO4 – 0.2 г, H2O – 1 л, pH 7.0). К полученной суспензии добавляли 1.5 мл раствора 4%-ого раствора формальдегида в фосфатном буфере и инкубировали в течение 1.5 часов. Образец осаждали центрифугированием (8000 об/мин в течение 5 минут) и дважды промывали фосфатным буфером. Фиксированные образцы ресуспендировали в смеси 100% этанола и фосфатного буфера (1:1, об:об) и до анализа хранили при -20ºС. 4.3.2. Процедура гибридизации фиксированных образцов с зондами. 1-5 мкм суспензии фиксированных образцов наносили на обработанные в 0.1% растворе желатина предметные стекла с окошками, разделенными тефлоновым покрытием. Препараты выдерживали 24 часа при комнатной температуре для лучшего связывания клеток со стеклом. Стекла с нанесенными образцами последовательно проводили через серию растворов этанола (50%, 80%, 100%), оставляя по 3 мин в каждом. Для гибридизации использовали как предложенные ранее, так и разработанные в настоящем исследовании рРНК-специфичные олигонуклеотидные зонды (Табл. 5). Гибридизацию препаратов с зондами проводили в соответствии с методикой Stahl и Amann (1991) при температуре 46ºС. После завершения процедуры гибридизации препараты в течении 10 минут докрашивали 1 мкМ раствором универсального, ДНК-специфичного флуресцентного красителя – ДАФИ (4’,6’-диамидино-2-фенилиндол), промывали дистиллированной водой и высушивали. 4.3.3. Использование ранее разработанных олигонуклеотидных зондов для детекции метанотрофов. Учет численности клеток метанотрофов I типа осуществляли путем гибридизации с эквимолярной смесью Су3-меченых зондов М705+М84, а метанотрофов II типа – с зондом М450. Общую численность клеток бактерий определяли гибридизацией с эквимолярной смесью зондов Eub338-mix. 54 Таблица 5. 16S рРНК-специфичные олигонуклеотидные зонды, использованные в работе для детекции метанотрофных бактерий. Зонд М-450 Methylocystis Methylosinus M-84 M-705 Метанотроф ы I типа EUB338mix (EUB338 I+ EUB338 I+ EUB338 III) Bacteria Sp206 Sp845 Candidatus Methylospira palustris a b Нуклеотидная последовательность (5’-3’) Целевые организмы Целево й участок 16S рРНК АTCCAGGTACCGTCATTATC 450-470 CCACTCGTCAGCGCCCGACT CTGGTGTTCCTTCAGATC 84-103 705-724 Т\ Форм амид, %a Ссылка , (°С)b 30 46 Eller et al., 2001 20 46 Eller et al., 2001 GCTGCCTCCCGTAGGAGT GCAGCCACCCGTAGGTGT GCTGCCACCCGTAGGTGT 338-355 20 46 Amann et al., 1990; Daims et al., 1999 CCGGCGGGAGGTCTTGCG GCTGCGCCACTGACAGCT 206-224 845-863 30 30 46 46 Настоящая работа – концентрация формамида в гибридизационном буфере, – температура. 4.3.4. Разработка новых зондов и проверка их специфичности. Поиск уникальных последовательностей в 16S рРНК представителей нового рода метанотрофов-спирилл Candidatus Methylospira palustris и создание олигонуклеотидных зондов для специфической детекции этих бактерий осуществляли с использованием функции “Probe Design” пакета ARB. Специфичность полученных зондов проверяли путем тестирования в базе данных Ribosomal Database Project (http://rdp.cme.msu.edu). Синтез зондов, меченных флуоресцентным красителем Cy3, осуществлялся компанией “Синтол” (Москва, Россия). Оптимизацию условий гибридизации проводили в диапазоне рабочих концентраций формамида в гибризационом буфере от 0 до 40%. 55 4.3.5. Микроскопический анализ. Препараты анализировали с использованием эпифлуоресцентного микроскопа Zeiss Axioplan 2 (Йена, Германия) со светофильтрами Zeiss 20 для Cy3-меченных зондов и Zeiss 02 для окраски ДАФИ. 4.3.6. Детекция и учет клеток микроорганизмов в образцах торфа. Определение численности целевых групп бактерий в образцах торфа осуществляли путем подсчета количества гибридизованных с зондами клеток в 100 (метанотрофы II типа и эубактерии) и 400 (метанотрофы I типа) полях зрения, с последующих расчетом численности популяций на 1 грамм влажного торфа по следующей формуле: численность клеток в 1 г торфа = (среднее число целевых клеток в поле зрения микроскопа × площадь анализируемого окошка × общий объем фиксированного образца × общий объем торфяного экстракта × разведение) / (площадь поля зрения микроскопа × объем нанесенного на окошко фиксированного образца × объем торфяного экстракта, использованный для фиксации × масса образца торфа). Общую численность бактерий в образцах определяли путем учета клеток, выявленных смесью зондов EUB338-mix (Табл. 5). Статистическую обработку результатов проводили с использованием таблиц MS Excel 2010. 4.4. Молекулярная идентификация болотных метанотрофов с помощью ПЦРанализа. 4.4.1. Экстракция тотальной ДНК из образцов торфа. Для анализа использовали 1 г свежеотобранного торфа. Выделение тотальной ДНК из торфа производили с использованием набора «FastDNA SPIN kit for soil» (Biol 101, США) в соответствии с рекомендацией производителя. Концентрацию ДНК в полученных экстрактах определяли с помощью флуориметра Qibit®2.0 (Invitrogen, США). Экстракты ДНК использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР). 4.4.2. Экстракция ДНК из микробных клеток. Для выделения ДНК из клеток изолятов и смешанных культур использовали модификацию ранее описанного метода (Zhou et al., 1995; Dedysh et al., 1998), основанного на применении додецил сульфата натрия (SDS) в качестве лизирующего агента. Клетки культуры осаждали 56 центрифугированием при 8000 об/мин 5 минут. Осадок ресуспендировали в 400 мкм буфера S (100мМ Трис-НСl (pH 8.0), 100 мМ Na2-ЭДТА (рН 8.0), 1.5 М NaCl, 1% СТАВ). Добавляли 5 мкл свежеприготовленного раствора протеиназы К (10мкг/мкл) и тщательно перемешивали образец на вортексе. В полученную суспензию добавляли 80 мкл 10% раствора додецил сульфатат натрия и инкубировали на водяной бане при +70°С и 250 об/мин в течении 2 часов. Далее образцы охлаждали до комнатной температуры и добавляли 350 мкл фенола и 350 мкл смеси хлороформа и изопропанола (24:1, по объему). Полученную смесь встряхивали в течение 5 минут и центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10 минут. Верхнюю, водную фазу отбирали в чистую пробирку Эппендорф. К ней добавляли 700 мкл смеси хлороформа и изопропанола (24:1, по объему). Полученную смесь также встряхивали в течение 5 минут и центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10 минут. Верхнюю фазу также переносили в чистую пробирку Эппендорф и добавляли 0.6 – 1 объема изопропанола для осаждения ДНК. Смесь аккуратно перемешивали и оставляли при -20°С от 2 до 12 часов. Затем смесь центрифугировали при 14000 об/мин 30 мин при +4 °С. Супернатант отбрасывали, а осадок промывали 1 мл 70% этанола, охлажденного до +4°С. Осадок растворяли в стерильной дистиллированной воде и полученные растворы ДНК хранили при -20°С. 4.4.3. ПЦР-амплификация филогенетических и функциональных генов исследуемых культур. Полученные из сфагнового торфа экстракты тотальной ДНК использовали в качестве матрицы в реакции ПЦР. В ходе работы проводили амплификацию фрагментов следующих филогенетических и функциональных генов метанотрофов (Табл. 6): а) гена 16S рРНК с использованием универсальных праймеров (размер продукта около 1450 пар нуклеотидов) (Weisburg et al., 1991); б) гена 16S рРНК метанотрофов I типа с использованием специфических праймерных систем typeIF – typeIR и MethT1dF – MethT1bR, амплифицирующих фрагменты (~ 660 и 900 пар нуклеотидов, соответственно) (Chen et al., 2007; Wise et al., 1999); в) гена pmoA, кодирующего полипептид, несущий активный центр мембраной метанмонооксигеназы (мММО), размером около 550 пар оснований (Holmes et al., 1995); г) гена mmoX, кодирующего α-субчастицу растворимой ММО (Auman et al., 2000); д) гена mxaF, кодирующего большую субъединицу МДГ (McDonald, Murrell, 1997); е) гена nifH, кодирующего редуктазный компонент нитрогеназного комплекса (Булыгина и др., 2002; Zehr, McReynolds, 1989). В качестве положительного контроля использовали экстракты 57 Таблица 6. Праймеры, использованные в работе для ПЦР-амплификации филогенетических и функциональных генов метанотрофных бактерий. Генмишень 16S рРНК Праймер GAGTTTGATCMTGGCTCAG 1492r ACGGYTACCTTGTTACGACTT typeIR Meth1dF MethT1bR pmoA mmoX mxaF nifH (5’-3’) 9f typeIF 16S рРНК метанотрофов I типа Нуклеотидная последовательность Ссылка Weisburg et al., 1991 ATGCTTAACACATGCAAGTCGAACG CCACTGGTGTTCCTTCMGAT CCTTCGGGAGCCGACGAGT Chen et al., 2007; Wise et al., 1999 GATTCYMTGSATGTCAAG A189f GGNGACTGGGACTTCTGG A682r GAASGCNGAGAAGAASGC A166f ACCAAGGARCARTTCAAG B1401r TGGCACTCRTARCGCTC mmoX1 CGGTCCGCTGTGGAAGGGCATGAAGCGCGT mmoX2 GGCTCGACCTTGAACTTGGAGCCATACTCG mmoX206f ATCGCBAARGAATAYGCSCG mmoX886r ACCCANGGCTCGACYTTGAA mxaF1003f GCGGCACCAACTGGGGCTGGT mxaF1561r GGGCAGCATGAAGGGCTCCC F1 TAYGGNAARGGNGGNATYGGNAARTC nifHr ADNGCCATCATYCTNCC Holmes et al., 1995 Auman et al., 2000; Miguez et al., 1997; Hutchens et al., 2004 McDonald, Murrell, 1997 Булыгина и др., 2002; Zehr, McReynolds, 1989 ДНК, полученные из культур метанотрофов Mеthylocystis bryophila H2sT, Methylocella tundrae, Methyloferula stellata AR4T, Rhodoblastus sphagnicola RST. Амплификацию проводили на термоциклере PE GeneAmp PCR System 9700 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, США). Проверку продуктов осуществляли путем электрофореза в 1.2% 58 агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием и визуализацией продуктов амплификации с помощью УФ-трансиллюминатора. В качестве маркера длины фрагментов ДНК использовали 1kb DNA Ladder (Promega). 4.4.4. Получение библиотек клонов генов pmoA болотных метанотрофов и генов 16S рРНК метанотрофов I типа. Клонирование полученных ампликонов проводили с помощью набора «pGem-T Easy Vector System II» (Promega) в соответствии с рекомендацией фирмы-производителя. Отбор рекомбинантных клонов осуществляли Bluscreen методом, путем отбора клонов, образующих белые колонии на среде с Хгалактозой. Проверку отобранных клонов на присутствие вставки проводили путём амплификации клонированных фрагментов с вектор-специфичными праймерами Т7 (5’TAATACGACTCACTATAGGG-3’) и SP6 (5’-TATTTAGGTGACACTATAG-3’). Температурный профиль реакции был следующим: начальная денатурация (1 мин при 94°С); затем 25 циклов, включающих денатурацию ДНК (1 мин при 94°С), отжиг праймеров (1 мин при 52°С) и элонгацию (1.5 мин при 72°С); за которыми следовала конечная элонгация (7 мин при 72°С). Полученные продукты амплификации проверяли на вставку фрагментов ДНК нужного размера путем электрофореза в 1.2% агарозном геле. 4.4.5. Выделение плазмидной ДНК, очистка, секвенирование. Полученные клоны выращивали на жидкой среде LB (NaCl – 5 г/л, дрожжевой экстракт – 5 г/л, триптон – 10 г/л) на качалке при 150 об/мин в течение 24 часов. Суспензию клеток осаждали центрифугированием (8000 об/мин, 2 мин) и выделяли из них плазмидную ДНК с использованием набора “Plasmid Miniprep” (Евроген). Концентрацию ДНК в полученных препаратах определяли на спектрофотометре Eppendorf Biophotometer (Германия). Определение нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ДНК было проведено с использованием праймерной системы M13F (5’GTTTTCCCAGTCACGAC-3’) – M13R (5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’) на секвенаторе Applied Biosystems DNA Analyzer xl 3730 («Perkin-Elmer Applied Biosystems», США). 4.4.6. Филогенетический анализ. Редактирование полученных нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы SeqMan (Laser Gene 7.0; DNA Star Package). Сравнение полученных последовательностей с таковыми в базе данных GenBank осуществляли с использованием программы Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). 59 Построение филогенетических программного дендрограмм производили с использованием пакета ARB (http://www.arb-home.de). Статистическую достоверность дендрограмм рассчитывали с использованием программного пакета Phylip с помощью “bootstrap”- анализа путем построения 1000 альтернативных деревьев. 4.5. Культивирование болотных бактерий. 4.5.1. Получение накопительных культур метанотрофов I типа. Для получения накопительных культур болотных метанотрофов использовали жидкую модифицированную минеральную среду N (Kip et al., 2011b) следующего состава (г/л): K2HPO4 -0.01; KNO3 – 0.02; MgSO4 × 7H2O – 0.02; CaCl2 ×2H2O – 0.02; NaCl – 0.03; 1.5 мл раствора микроэлементов для метанотрофов (Гальченко, 2001), рН 6.0-6.3. 1 г торфа вносили во флаконы общим объемом 500 мл со 50-100 мл жидкой среды вышеописанного состава. В газовую фазу флаконов вводили метан до 10-20 об. % и инкубировали их либо в статических условиях, либо на шейкере (120 об./мин) при 20°С в течение 2-3-х недель. Скрининг присутствия метанотрофов I типа в полученных накопительных культурах осуществляли с помощью метода FISH, путем гибридизации исследуемых суспензий клеток с эквимолярной смесью зондов М84 + М705 (см. выше). 4.5.2. Получение изолятов метанотрофов. Накопительные культуры, в которых были выявлены клетки метанотрофов I типа, рассевали на модифицированную среду N с агар-агаром (1.5%) или фитагелем (0.9%) в качестве гелеобразующих агентов. Скрининг колоний, образованных метанотрофами I типа, осуществляли также путем гибридизации отобранных из колоний клеток с зондами М84 + М705. Отобранные таким образом колонии подвергали многократным рассевам с целью получения чистых культур метанотрофов. Для дальнейшего культивирования полученных изолятов использовали жидкую среду М2 (рН 5.0-5.5) следующего состава (г/л): K2HPO4 - 0.1; MgSO4 × 7H2O – 0.05; KNO3 – 0.15, CaCl2 ×2H2O – 0.01; NaCl – 0.02, раствор микроэлементов для метанотрофов – 1 мл. В некоторых случаях добавляли раствор витаминов (Wolin et al., 1963). В качестве источника углерода в газовую фазу флаконов вводили метан до 25 об% и инкубировали их в статических условиях или на шейкере (120 об./мин.). 60 4.5.3. Выделение других бактерий - компонентов метанотрофных сообществ. Полученные накопительные метанотрофные культуры использовали также для выделения неметанотрофных компонентов сообщества. Для этого использовали глубинный посев суспензий в пробирки со средой М2 (Dedysh et al., 1998), содержащей 0.1% PhytaGel. Пробирки затем инкубировали в эксикаторах с 20% метана в газовой фазе. Рассев колоний, сформировавшихся под поверхностным разрастанием метанотрофов, производили на чашки Петри с аналогичной средой. Чашки с посевами инкубировали в течение 4-5 недель при 20°С в эксикаторах с 20% метана в газовой фазе. Сформированные на агаре колонии анализировали с использованием фазово-контрастной микроскопии и отсевали на новые чашки. Полученные изоляты поддерживали на жидкой среде М3 (рН 5.8-6.0) следующего состава (г/л): KH2PO4 - 0.1; NH4Cl - 0.2; MgSO4 × 7H2O - 0.1; CaCl2× 2H2O - 0.02; дрожжевой экстракт - 0.1; глюкоза (или малат) - 0.5; раствор микроэлементов для фототрофов ‘SLA’ (Imhoff, 2006). Культуру выращивали в заполненных на 9/10 объема флаконах в статических условиях на свету или в темноте. 4.6. Изучение свойств изолятов болотных бактерий. 4.6.1. Методы изучения морфологических и физиологических характеристик. Размеры и морфологию вегетативных клеток, а также покоящихся форм оценивали в начале, середине и конце экспоненциальной и стационарной фаз роста. Определение ростового диапазона и оптимума рН культур проводили в жидкой среде М2 или модифицированной среде N, соотнося удельную скорость роста в регистрируемым значением рН. Варьирование рН среды осуществляли путем смешивания 0.1 М растворов H3PO4, KH2PO4, K2HPO4, K3PO4 без изменения ионной силы. Оценка физиологических характеристик культур включала также оценку их роста в диапазоне температур от 4 до 37 и концентраций NaCl в среде от 0 до 1%. Рост культур оценивали путем измерения оптической плотности на биофотометре Eppendorf Biophotometer AG при длине волны 600 нм. Для определения спектра субстратов, используемых изолятами в качестве источников углерода и энергии, оценивали рост на жидкой среде М2 (в случае метанотрофов) или М3 (в случае неметанотрофных организмов) со следующими соединениями (в концентрации 0.05%): метанол, этанол, формиат, глюкоза, фруктоза, сахароза, ксилоза, целлобиоза, трегалоза, ксилан, пектин, ацетат, пропионат, пируват, малат, сукцинат, оксоглутарат, цитрат, галактуроновая и глюкуроновая кислоты, 61 фитагель. Оценку роста на метаноле и этаноле осуществляли в диапазоне концентраций от 0.01 до 5 об. %. Способность к сбраживанию сахаров определяли путем культивирования в микроаэробных условиях на среде М3 с добавлением глюкозы и фруктозы в концентрации 0.05%. Протекание процесса оценивали по увеличению оптической плотности суспензии клеток, снижению концентрации фруктозы или глюкозы, а также увеличению продуктов брожения в культуральной среде. Использование различных соединений в качестве источников азота проводили на средах М2 и М3, замещая нитрат следующими соединениями (в концентрации 0.015%): NH4Cl, NaNO2, мочевина, формамид, метиламин, глутамин, глицин, аланин, аспарагин, лизин, гистидин, пептон, дрожжевой экстракт и казаминовые кислоты. Для проверки способности культур к фиксации атмосферного азота использовали безазотистую среду. Рост оценивали после 3 недель роста при комнатной температуре в статических условиях. 4.6.2. Аналитические методы. Концентрацию метана определяли на газовом хроматографе Кристалл 5000 (“ЗАО Хроматэк”, Россия) с пламенно-ионизационным детектором. Концентрацию субстратов (глюкозы и фруктозы) и продуктов брожения в культуральной среде неметанотрофных изолятов определяли на HPLC-Стайер (ОАО «Аквилон», Россия). 4.6.3. Электронная микроскопия. Исследования ультратонкого строения клеток новых изолятов были проведены совместно с к.б.н. Сузиной Н.Е. (ИБФМ РАН, Пущино). Для анализа использовали клетки, отобранные в середине экспоненциальной фазы роста культур. Клетки осаждали центрифугированием и отмывали от среды 0.05М какодилатным буфером (рН 7.2). Осадок клеток фиксировали в течение 2 часов в 2% растворе глютарового альдегида при 4°С и затем, после трехкратной отмывки в какодилатном буфере, дофиксировали в течение 12 часов в 1% растворе OsO4 в том же буфере при 4°С. Материал обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации, завершая процесс обезвоживания двумя сменами ацетона по 15 минут. Полученный материал заключали в смолу в ЭПОН-812. Срезы изготавливали на микротоме LKB-4800, контрастировали 2% раствором уранил-ацетата в 70% растворе этанола в течение 309-45 мин. при 37°С и дополнительно окрашивали цитратом свинца (Reynolds, 1963) при 20°С. Полученные препараты анализировали с помощью электронного микроскопа JEM-100B. 62 4.6.4. Энзимологические исследования. Анализ ферментов углеродного метаболизма метанотрофных бактерий осуществлялся к.б.н. Розовой О.Н. в лаборатории проф. Троценко Ю.А. (ИБФМ РАН, Пущино). Клетки осаждали центрифугированием (4000 g 30 мин), отмывали 0.05M K-Na-фосфатным (рН 6.8) или Трис-HCl-буфером (рН 7.2), ресуспедировали в том же буфере и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора MSE (Англия) мощностью 150 Вт при 20 кГц (4×30 с) использованием охлаждаемых кювет объемом 10 мл. Для осаждения неразрушенных клеток и их обломков гомогенат центрифугировали при 6000 g 30 мин. Полученный супернатант повторно центрифугировали (30000 g 1 ч) для осаждения фракции мембран. По описанным ранее методикам (Shishkina, Trotsenko, 1979, 1982) определяли активности следующих ферментов: гидроксипируватдегидрогеназы, метанолдегидрогеназы, формиатдегидрогеназы, серинглиоксилатаминотрансферазы, рибулозо-1.5- бисфосфаткарбоксилазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, 6-фосфофруктокиназы, 3гексулозо-6-фосфатсинтазы. 4.6.5. Определение состава хинонов выполнено совместно с к.х.н. Баскуновым Б.П. (ИБФМ РАН, г. Пущино). Идентификация изопреноидных хинонов была осуществлена в соответствии с методикой Collins (1985). Масс-спектры определяли на тандемном массспектрометре LCQ ADVANTAGE MAX, с использованием источника химической ионизации при атмосферном давлении (APCI) и на масс-спектрометре Finnigan Mat 8430 в стандартных условиях электронного удара. 4.6.6. Анализы состава жирных кислот и липидов были выполнены в лаборатории P.L.E. Bodelier (Netherlands Institute of Ecology, Голландия). Липиды были экстрагированы из клеток изолятов по модифицированной методике Bligh & Dyer (Boschker et al., 1998, 2001). Для анализа состава жирных кислот экстракт фракционировали с использованием кремниевой кислоты, с последовательным элюированием хлороформом, ацетоном и метанолом. Идентификацию жирных кислот проводили с использованием системы GC-FID (Termo Finnigan TRACE GC), снабженной капиллярной колонкой (SGE, BPX-70; 50 м × 0.32 мм × 0.25 мкм). Определение положения двойной связи мононенасыщенных жирных кислот проводили согласно методике Nichols et al. (1985). Определение состава нейтральных липидов было проведено по методике, описанной Sinninghe Danste et al. (2004). 63 4.6.7. Анализ пигментов. Для определения пигментного состава культуру исследуемого микроорганизма выращивали в микроаэробных условиях на свету. Суспензию клеток центрифугировали и отбрасывали супернатант. Для определения спектра поглощения пигментов в составе белковых комплексов осадок клеток ресуспендировали в 50% растворе глицерина. Спектральные профили чистых пигментов определяли в ацетон/метанольных экстрактах (7/1, об/об). Анализ пигментов проводили на УВИ-спектрофотометре СФ56 («Ломо», Россия). Состав каротиноидов анализировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии как описано Sidorova et al. (1998). 4.6.8. Определение нуклеотидного состава ДНК новых изолятов было выполнено совместно с к.б.н. Детковой Е.Н. (ИНМИ РАН). Нуклеотидный состав ДНК определяли методом термической денатурации на спектрофотометре Pye Unicam SP1800 (Англия) при скорости нагрева 0.5 град/мин. Содержание суммы нуклеотидных оснований Г+Ц рассчитывали по уравнению Оуэна (Owen et al., 1969): Г+Ц (мол. %) = (2.08×Епл) – 106.4, где Тпл – температура плавления. В качестве стандарта использовали ДНК E.coli штамм К-12. 4.6.9. Фотодокументирование материалов и обработка данных. Фотографии накопительных культур, новых изолятов, а также фотографии гибридизованных с олигонуклеотидными зондами образцов торфа получали с помощью микроскопа Zeiss Axioplan 2 и цифровой фотокамеры Zeiss с матрицей 6 Мпкс, с использованием программного пакета AxioVision v. 4.2. Статистические анализы выполнены при помощи программного пакета MS Excel 2003. 64 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Глава 5. Оценка активности окисления метана и дифференцированный учет клеток метанотрофов в кислых сфагновых болотах. 5.1. Активность окисления CH4 сфагновым торфом. Скорость окисления метана образцами торфа исследованных болот варьировала в диапазоне 0.04-0.60 мкг СН4 г-1 сырого торфа ч-1 (Табл. 7). Наибольшая метанокисляющая активность была зарегистрирована в торфе болота Обуховское (рН 4.2). Прямой зависимости активности окисления метана от величины рН торфа не наблюдалось. Так, скорость окисления метана торфом болота Шумново (рН 4.7) была близка таковой в более кислых болотах Солза (рН 3.9) и Тарлаковский мох (рН 3.9). 5.2. Учет клеток метанотрофов I и II типов в сфагновых болотах различного географического положения. Для детекции метанотрофных представителей классов Gammaproteobacteria и Alphaproteobacteria в составе микробного сообщества сфагновых болот был использован метод in situ гибридизации с 16S рРНК-специфичными флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами (метод FISH) (Stahl, Amann, 1991). Учет клеток метанотрофов I типа осуществляли путем гибридизации фиксированных образцов торфа со специфичными к данной группе бактерий зондами М84+М705, в то время как для детекции метанотрофов II типа применяли зонд М450 (Eller, Frenzel, 2001). Эти зонды были ранее успешно использованы для выявления метанотрофных бактерий в различных местообитаниях (Eller, Frenzel, 2001; Dedysh et al., 2003; Carini et al., 2005). Для учета общего количества бактериальных клеток использовали смесь универсальных зондов EUB338mix, состоящую из трех индивидуальных зондов EUB338I, EUB338II, EUB338III (Daims et al., 1999). Анализ фиксированных образцов сфагнового торфа путем in situ гибридизации со смесью флуоресцентно-меченых зондов М84+М705, позволил обнаружить лишь единичные клетки целевых организмов (Рис. 6). 65 Таблица 7. Активность окисления метана и численность метанотрофов в торфе исследованных болотных экосистем. Болото, расположение, время отбора образцов Солза, Архангельская обл., N 64°48´, E 39°56´ 07.2012 Цигломень, Архангельская обл., N 64°52´, E 40°32´ 07.2012 Шоля, Архангельская обл., N 64°53´, E 40°16´ 07.2012 Шумново, Тверская обл., N 56°42’, E 36°52’ 06.2012 рН Активность окисления метана торфом, мкг CH4 г-1 ч-1 Число клеток, выявленных гибридизацией с зондами на метанотрофов I (M705+M84) и II (M450) типов, г-1 сырого торфа EUB338-mix (N×108) M705+M84 (N×105) 3.9 0.25 4.09 ± 1.53 0.96 ± 0.32 3.9 0.47 0.64 ± 0.10 0.96 ± 0.31 4.1 0.04 1.12 ± 0.16 0.05 ± 0.03 0.23 3.38 ± 0.86 3.9 0.20 0.54 ± 0.08 4.2 0.60 7.23 ± 1.72 3.9 0.09 4.21 ± 1.23 4.7 M450 (N×106) 2.02 ± 1.54 2.13 ± 1.24 1.18 ± 0.84 0.57 ± 0.23 2.46 ± 1.51 2.16 ± 0.73 1.73 ± 0.92 1.01 ± 0.42 21.40 ± 5.60 1.12 ± 0.45 2.20 ± 1.13 Тарлаковский мох, Тверская обл., N 56°37’, E 36°52’ 06.2012 Обуховское, Ярославская обл., N 57°, E 39° 06. 2011 Тасин Бор, Владимирская обл., N 55о36’, E 40о06’ 06.2013 66 Рисунок 6. Детекция клеток метанотрофов I типа в микробном сообществе образца сфагнового торфа болота Шумново: (А) – торфяной конгломерат с адсорбированными на нем микробными клетками в фазовом контрасте; (Б) – флуоресцентная микрофотография гибридизации со смесью Сy3-меченых зондов М705+М84, выявляющих клетки метанотрофов I типа; (В) – окраска ДАФИ. Маркер – 5 мкм. Численность метанотрофов I типа в исследованных болотах была низка и варьировала в диапазоне 0.05 - 2.16×105 клеток г-1 сырого торфа, достигая максимального значения в торфе олиготрофного болота Тарлаковский мох (рН 3.9) (Табл. 7). Численность метанотрофов II типа, выявленных в исследованных образцах зондом М450, на несколько порядков превышала популяционную плотность метаноторофных представителей Gammaproteobacteria и составляла 1.18 -21.40×106 клеток на г-1 сырого торфа. Общая численность бактериальных клеток в торфах изучаемых болот, выявленных гибридизацией со смесью зондов EUB338-mix составляла 0.54 - 7.23×108 клеток на г-1 сырого торфа, с суммарной долей метанотрофов I и II типа - 0.52 - 3.60%. Эти величины 67 согласуются с опубликованными ранее данными о численности метанотрофов в сфагновых болотах (Dedysh et al., 2001, 2003). Глава 6. Оценка филогенетического разнообразия метанотрофов в сфагновых болотах. 6.1. Состав метанотрофного сообщества по данным анализа генов pmoA. Для более детального анализа разнообразия метанотрофов в сфагновом торфе была использована ДНК, выделенная из образца торфа болота Шумново. ПЦР-продукты, полученные с использованием праймерной системы А189f – A682r, были клонированы и секвенированы. Сформированная библиотека включала 52 клона, четыре из которых представляли нуклеотидные последовательности гена amoA (кодирующего аммониймонооксигеназу) и были исключены из дальнейшего анализа. Оставшиеся 48 клонированных последовательностей метанмонооксигеназы (мММО), причем представляли подавляющее ген большинство мембранной их (92%) принадлежали метанотрофам рода Methylocystis (Рис. 7). Из них, 28 клонов представляли ген pmoA, а 16 клонов - ген pmoA2, кодирующий мММО высокого сродства к метану (Baani, Liesack, 2008). Значительная часть этих последовательностей обнаруживала высокое сходство и формировала общие кластеры с генами pmoA и pmoA2 Methylocystis bryophila H2sT - типичного обитателя верховых болот (Belova et al., 2013). Метанотрофы I типа были представлены четырьмя клонированными последовательностями pmoA (8% всех клонов), формирующими компактный и филогенетически обособленный кластер (Рис. 7). Они обнаруживали лишь отдаленное родство (66-84% сходства транслированных аминокислотных последовательностей гена pmoA) с известными метанотрофными гаммапротеобактериями и, по всей видимости, представляли новый род метанотрофов. Наибольшее сходство (93-95%) последовательности pmoA этой группы обнаруживали с рядом клонов, полученных ранее из болотных экосистем и осадков пресноводных озер (КС817710, AY488074, AY488072, FN597134). 6.2. Оценка разнообразия метанотрофов I типа с помощью анализа генов 16S рРНК. Для проверки предположения о существовании в исследуемом торфе метанотрофов I типа, формирующих отдельный родовой кластер в пределах семейства 68 Рис. 7. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа 48 аминокислотных последовательностей фрагментов PmoA метанотрофов I (выделены красным цветом) и II типа (отмечены зеленым цветом), полученных из торфа сфагнового болота Шумново, а также некоторых известных метанотрофных представителей классов Gamma- и Alphaproteobacteria. Маркер - 0.1 замещений на аминокислотную позицию. 69 Methylococcaceae, нами была сформирована библиотека клонов гена 16S рРНК этих бактерий с использованием праймерной системы typeIF-typeIR. Эта библиотека насчитывала 53 клонированных фрагмента генов 16S рРНК, однако лишь три из них (6% всех клонов) принадлежали метанотрофам I типа. Две последовательности представляли роды Methylomonas и Methylovulum (клоны Sm1D и Sm6D, соответственно) (Рис. 8). Третья клонированная последовательность, Sm8D, представляла собой отдельную филогенетическую ветвь родового уровня и обнаруживала лишь отдаленное сходство (87– 93%) с последовательностями генов 16S рРНК известных метанотрофов I типа. Остальные 52 клонированные последовательности генов 16S рРНК, полученные ПЦРамплификацией с праймерами typeIF-typeIR, принадлежали неметанотрофным гаммапротеобактерям родов Legionella, Coxiella, Steroidobacter и Pseudomonas (35 Рис. 8. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа клонированных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК метанотрофов I типа, полученных из торфа сфагнового болота Шумново и некоторых охарактеризованных метанотрофных представителей Gammaproteobacteria. В качестве внешней группы использованы нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК метанотрофов II типа. Маркер - 0.05 замещений на нуклеотидную позицию. 70 клонов), ацидобактериям (11 клонов) и некоторым представителям Firmicutes (6 клонов). По всей видимости, данная праймерная система обладает малой специфичностью и малоэффективна для анализа разнообразия метанотрофов I типа в болотных экосистемах. Попытка использования альтернативной праймерной системы для выявления метанотрофов I типа - MethT1dF и MethT1bR – была нерезультативной в случае нашего исследования, так как в ПЦР с этими праймерами и ДНК из торфа продукта получено не было. Глава 7. Выделение метанотрофных представителей Gammaproteobacteria из сфагновых болот. Хотя FISH-анализ выявил низкую численность метанотрофов I типа в сфагновом торфе, нами были предприняты попытки выделения этих микроорганизмов. Получение накопительных метанотрофных культур на среде М2 и модифицированной среде N показало, что последняя является более благоприятной для развития метанотрофов I типа. Присутствие в полученных на этой среде накопительных культурах клеток метанотрофных гаммапротеобактерий было подтверждено in situ-гибридизацией с зондами М84+М705. Связавшиеся с зондами клетки были представлены тремя морфотипами: собранными в цепочки палочками, крупными кокками и спириллоподобными клетками (Рис. 9А-В). В результате дальнейшей работы по выделению чистых культур были получены изоляты метанотрофов I типа с аналогичной морфологией клеток (Рис. 9Г-Е). 7.1. Представители рода Methylomonas. 7.1.1. Морфология. Первым морфотипом выявленных в торфе целевых организмов были крупные палочки (Рис. 9Г, Рис. 10А). Изоляты этих бактерий, штаммы MG30Т и SН10, были получены из образцов торфа болот Германовское (рН 3.9) и Шумново (рН 4.7). Клетки представляли собой неподвижные грамотрицательные палочки, одиночные или собранные в цепочки, покрытые хорошо развитой слизистой капсулой. Размер клеток 71 Рис. 9. Идентификация метанотрофов I типа в накопительной культуре образца торфа болота Шумново (А-В) и морфология клеток полученных изолятов (Г-Е): (А) фазовый контраст клеток накопительной культуры; (Б) флуоресцентная микрофотография гибридизации со смесью зондов М84+М705, (В) – окраска ДАФИ; (Г-Е) фазовоконтрастные имиджи изолятов метанотрофов I типа из сфагнового торфа. Маркер – 5 мкм. достигал 1.0 - 4.0 мкм в длину и 1.0 - 1.5 мкм в ширину. Клетки размножались бинарным делением и содержали хорошо развитую систему внутрицитоплазматических мембран (ВЦМ) I типа. На агаризованной среде эти изоляты формировали крупные округлые слизистые колонии бледно-розового цвета. Рост культур в жидких средах был гомогенный, без формирования поверхностной пленки. 7.1.2. Физиологические характеристики. Штаммы MG30T и SH10 являлись ацидотолерантными организмами, способными к росту в диапазоне рН 3.8 – 7.3, с оптимумом при 5.8 – 6.4. Примечательно, что это первые 72 Рис. 10. Морфология и ультратонкое строение клеток штамма MG30Т. (А) Фазовоконтрастная фотография клеток в экспоненциальной фазе роста. Для визуализации капсул использован раствор туши. Маркер – 10 мкм; (Б) Электронная микрофотография ультратонкого среза клетки, демонстрирующая расположение внутрицитоплазматических мембран, характерное для метанотрофов I типа. Маркер – 1 мкм. представители рода Methylomonas, способные расти при низких значениях рН, поскольку все описанные ранее виды являются нейтрофилами с оптимумом роста в пределах рН 6.07.0. Новые изоляты росли в диапазоне температур от 8 до 30°С, с оптимумом – 20 25°С.NaCl подавлял рост в концентрациях выше 0.1%. Штаммы MG30T и SH10 были способны использовать в качестве источника углерода и энергии только метан и метанол. Метанол использовался в концентрации не выше 2% (об/об), при оптимуме 0.25% (об/об). В качестве источника азота изоляты использовали нитрат и аммоний. Также штаммы MG30T и SH10 обладали способностью к фиксации молекулярного азота в микроаэробных условиях. Анализ нуклеотидных последовательностей гена nifH новых метанотрофов показал высокое сходство (91%) с последовательностью соответствующего гена у метанотрофоной бактерии Methylomonas methanica S1T. Анализ состава жирных кислот выявил высокое содержание кислот с 16 атомами углерода, что является характерной особенностью метанотрофов Gammaproteobacteria (Табл. 8). В целом, жирнокислотный профиль новых штаммов был сходен с таковым у 73 представителей рода Mеthylomonas, за исключением относительно высокого количества кислоты C16:15t, составляющей около 35% всех клеточных жирных кислот. Таблица 8. Сравнение состава клеточных жирных кислот штамма MG30T и представителей рода Methylomonas. Основные жирные кислоты выделены жирным цветом. Кислота Штамм MG30T Представители рода Methylomonas* C14:0 11.8 18.9 ‒ 24.6 Iso-C15:0 ‒ 0 ‒ 2.5 Anteiso-C15:0 ‒ 0 ‒ 2.4 C15:0 0.5 0 ‒1.2 C16:1ɷ8c 22.1 18.7 ‒ 41.3 13.9 4.35 ‒ 15.3 5.0 4.5 ‒ 13.3 C16:1ɷ6c 1.8 1.9 ‒ 16.7 C16:1ɷ5c 34.8 7.9 ‒ 16.6 5.6 4.3 ‒ 8.7 ‒ 0 ‒ 0.7 ‒ 0 ‒ 0.3 C17:1ɷ7c ‒ 0 ‒ 2.1 C17:1ɷ7t 0.3 0.2 ‒ 2.5 ‒ 0 ‒ 1.7 1.2 0 ‒ 0.7 ‒ 0 ‒ 0.5 ‒ 0.2 ‒ 0.4 C16:1ɷ7c C16:1ɷ5t C16:0 cyC17:0 C18:1ɷ7c C18:1ɷ5c C18:0 brC19:1 cyC19:0 * Обобщенные данные для Methylomonas methanica ACM 3307T, Methylomonas fodinarium ACM 3268T, Methylomonas aurantiaca ACM 3406T (данные Bowman et al., 1993) и Methylomonas koyamae Fw12E-YT (данные Ogiso et al., 2011). 74 7.1.3. Пути ассимиляции углерода. С целью определения путей метаболизма С1 соединений новыми изолятами были измерены активности ферментов в экстрактах клеток, выращенных на метане в среде М2. Результаты анализа представлены в таблице 9. Таблица 9. Активность ферментов (нмоль × мин-1 × (мг белка-1)) в экстракте клеток штамма MG30T, выращенного на метане. Фермент Кофактор(s) Активность Метанолдегидрогеназа ФМС 66 Формиатдегидрогеназа НАД+ 146 Гидроксипируватдегидрогеназа НАДН 0 НАДФН 0 НАДН 0 НАДФН 0 Серинглиоксилатаминотрансфераза Рибулозо-1.5-бисфосфаткарбоксилаза Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа 6-Фосфофруктокиназа 0 НАД+ 0 НАДФ+ 4.3 АТФ 0 ФФi 94 3-Гексулозо-6-фосфатсинтаза 56 Новые изоляты содержали классическую PQQ-содержащую метанолдегидрогеназу, активную in vivo с феназин метасульфатом (ФМС) в качестве искуcственного акцептора электронов и требующую высокие значения рН среды и ионы NH4+. 75 В клеточных экстрактах был обнаружен ключевой фермент рибулозомонофосфатного пути ассимиляции С1 соединений - 3-гексулозо-6-фосфатсинтаза. Данный путь ассимиляции формальдегида является отличительным для метанотрофов I типа. В клеточных экстрактах была детектирована НАД+-зависимая формиатдегидрогеназа, осуществляющая окисление полученного формальдегида до CO2, что обеспечивает клетки необходимой энергией. Штаммы MG30Т и SH10 содержали глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу и пирофосфатзависимую фосфофруктокиназу – ключевые ферменты углеродного метаболизма. Присутствие пирофосфат-зависимой фосфофруктокиназы, наряду с отсутствием ее АТФзависимой формы, также широко распространенно среди метанотрофов. Ферменты, специфические для серинглиоксилатаминотрансфераза и серинового пути фиксации формальдегида, гидроксипируватдегидрогеназа, у изолятов выявлены не были. Также у данных организмов отсутствовал ключевой фермент цикла Кальвина, рибулозо-1.5-бисфосфаткарбоксилаза, что свидетельствует об их неспособности к автотрофному метаболизму. 7.1.4. Анализ филогенетических и функциональных генов. Анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S pPHK штаммов MG30Т и SH10 показал их идентичность и принадлежность к семейству Methylococcaceae (Рис. 11). Ближайшими филогенетическими родственниками новых метанотрофов были представители рода Methylomonas (94.7-96.9% сходства последовательностей гена 16S pPHK). Фрагмент PmoA штамма MG30Т и SH10 обнаруживал 92.9-95% идентичности с аналогичными фрагментами PmoA видов рода Methylomonas (Рис. 12). Попытки обнаружить у штаммов MG30Т и SH10 ген mmoX, кодирующий α – субъединицу растворимой формы метанмонооксигеназы, не принесли успеха. Ни одна из использованных праймерных систем (A166f/B1401r, mmoX1/mmoX2 и mmoX206f/mmoX886r; см. табл. 2, с. 34-35) не дала соответствующего продукта амплификации. Содержание оснований Г+Ц в ДНК новых изолятов составило 48.5 мол%. Таким образом, новые штаммы MG30Т и SH10 отличались от остальных охарактеризованных представителей рода Methylomonas рядом морфологических, хемотаксономических и генотипических характеристик, что позволило выделить их в новый вид – Methylomonas paludis sp. nov. (Danilova et al., 2013) (Табл. 10). 76 Рис. 11. Дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, показывающая филогенетическое положение Methylomonas paludis MG30T относительно других метанотрофных представителей класса Gammaproteobacteria. В качестве внешней группы использованы нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК метанотрофов II типа. Маркер - 0.05 замещений на нуклеотидную позицию. Рис. 12. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа 146 аминокислотных последовательностей фрагментов PmoA Methylomonas paludis MG30T и некоторых известных метанотрофов I и II типов. Маркер - 0.10 замещений на аминокислотную позицию. 77 Таблица 10. Основные дифференцирующие характеристики Methylomonas paludis sp. nov. и других представителей рода Methylomonas. Штамм MG30T Methylomona methanicaa Methylomonas fodinarumb Methylomonas aurantiacac Methylomonas scandinavicad Methylomonas koyamaee палочки палочки палочки палочки эллипс палочки 1.0-1.5×1.0-4.0 0.5-1.0×1.0-2.0 0.7-1.0×0.8-1.2 0.5-0.8×0.8-1.5 0.6-0.8×1.5-1.7 0.8-1.1×1.2-2.5 Бледно-розовые Розовые или красные Оранжевые Оранжевые Розовые Розовые или оранжевые Подвижность - + + + + + Формирование цепочек + - + + + - Капсула + + + + + НД Диапазон температур (°C) 8 - 30 10 - 37 10 - 35 15 - 40 5 - 30 10 - 40 Оптимум температур (°C) 20 - 25 25 - 30 25 35 17 30 Диапазон рН 3.8 - 7.3 5.5 - 9.0 5.5 - 9.0 5.0 - 9.0 5.0 - 9.0 5.5 - 7.0 Оптимум рН 5.8 - 6.4 7.0 7.0 6.5 6.8 - 7.6 6.5 Рост при 1.0% NaCl - + + + - - Рост при 37 ºC Фиксация азота Содержание Г+Ц в ДНК (моль %) + + +* НД + НД НД + НД 48.5 51 - 53 58 - 59 55 - 56 53.8 57.1 Характеристика Морфология Размер клеток (мкм) Пигментация колоний НД - не определен; * – основано лишь на присутствии гена nifH; а – данные Bowman et al., 1993; b – данные Bowman et al., 1990; c – данные Bowman et al., 1990; d – данные Kalyuzhnaya et al., 1999; e – данные Ogiso et al., 2012 78 Характеристика Methylomonas paludis sp. nov. Methylomonas paludis sp. nov. (pa.lu´dis. L. gen. n. paludis – болотный). Клетки представляют собой неподвижные палочки, длиной 1.0 - 4.0 мкм и шириной 1.0 - 1.5 мкм, одиночные или собранные в цепочки, покрытые хорошо развитой слизистой капсулой. Размножаются бинарным делением. Клетки содержат ВЦМ I типа. На агаризованной среде формируют крупные округлые слизистые колонии бледно-розового цвета. Способны расти в диапазоне температур от 8 до 30°С с оптимумом при 20 - 25°С, и в диапазоне рН 3.8 – 7.3, с оптимумом при 5.8 – 6.4. Метан и метанол – единственные используемые субстраты. Метанол используется в концентрации не выше 2% (об/об), при оптимуме 0.25% (об/об). Ассимилируют С1 соединения через рибулозомонофосфатный путь. Источники азота – нитрат, аммоний и N2. NaCl подавляет рост в концентрациях выше 0.1%. Основные жирные кислоты - C16:15t, C16:18c, C16:17c и C14:0. Типовой штамм MG30T (=DSM 24973T = VKM B-2745T) изолирован из образца торфа кислого сфагнового болота Германовское, остров Валаам, Карелия (61° 22´ N; 31° 07´ E). 7.2. Представители рода Methylovulum. Второй морфотип метанотрофов I типа, выявленный в накопительных культурах, был представлен крупными неподвижными кокками диаметром 1.5-3.5 мкм (Рис. 9А, Д). Изолят соответствующего морфотипа, штамм 83А5, был получен из торфа болота Шумново (Рис. 13А). Рис. 13. (А) Морфология клеток штамма 83А5. Маркер - 5 мкм; (Б) Зависимость удельных скоростей роста (µ) штаммов MG30T (1) и 83А5 (2) от величины рН среды. 79 Анализ нуклеотидной последовательности гена 16S pPHK штамма 83А5 показал 99% сходства с таковой у нейтрофильного метанотрофа Methylovulum miyakonense HT12T (AB501287), выделенного ранее из образца лесной почвы (Iguсhi et al., 2011). Клетки штамма 83А5 формировали на агаризованной среде М2 плотные округлые слизистые колонии розового цвета. Рост культуры в жидких средах был гомогенный, без образования поверхностной пленки. Штамм 83А5 использовал метан и метанол в качестве источников углерода и энергии. Метанол использовался в концентрации не выше 2% (об/об), при оптимуме 0.25% (об/об). Новый изолят активно рос в диапазоне температур от 10 до 30°С, с оптимумом при 25°С. Изучение скорости роста в зависимости от рН выявило существенную разницу в отношении Methylovulum miyakonense 83А5 и Methylomonas paludis MG30T к кислотности среды (Рис. 13Б). M. paludis MG30T был способен развиваться при достаточно низких значениях рН (3.8-4.5) и имел оптимум роста при рН 5.8-6.4. Штамм 83А5, напротив, был неспособен расти при рН ниже 5.5 и имел оптимум роста при рН 6.5-7.0. Факт выделения этого метанотрофа из сфагнового торфа можно объяснить лишь возможностью его локального развития в отдельных слабокислых или около-нейтральных микро-нишах болотного профиля. 7.3. Новые метанотрофы спирилло-подобной морфологии. 7.3.1. Морфология. Третьим морфотипом клеток, выявленных в метанотрофных накопительных культурах гибридизацией с зондами М84+М705, были спириллы шириной 0.5-1.5 мкм и длиной 2.0-15.0 мкм (Рис. 9А-В, Е; Рис. 14). Эти клетки были подвижны за счет жгутика, расположенного на одном из полюсов клетки (Рис. 14А). До настоящего времени, метанотрофы подобной морфологии описаны не были. Смешанная культура микроорганизмов с преобладанием (60-80%) спирилло-подобных клеток была способна к устойчивому росту на минеральной среде с метаном в качестве единственного источника углерода и энергии. В контроле без метана рост данных клеток 80 Рис. 14. (А) Электронные микрофотографии клеток, полученные методом негативного контрастирования. Виден полярный жгутик. (Б) Ультратонкое строение клеток спирилловидных метанотрофов. Видны внутрицитоплазматические мембраны I типа. Маркер - 1 мкм. не наблюдался. Присутствие СО2 в газовой фазе (3%), а также добавление раствора витаминов (0.1%, об/об; Wolin et al., 1963) было необходимым условием для устойчивого развития спирилл в смешанной культуре. При анализе ультратонких срезов спирилло-подобных клеток были выявлены стопки внутрицитоплазматических мембран, характерные для метанотрофов I типа (Рис. 14Б). Попытки выделить спирилл в чистую культуру с помощью стандартных методов рассева на плотные среды и предельных разведений в жидких средах успеха не имели, так как эти бактерии не формировали колоний и имели низкую скорость роста по сравнению с неметанотрофными спутниками, присутствующими в культурах. 7.3.2. Анализ филогенетической принадлежности. Для установления филогенетической принадлежности новых метанотрофов-спирилл была сформирована библиотека клонов генов 16S pPHK из образца ДНК, выделенного из исследуемой смешанной культуры бактерий. Нуклеотидные последовательности более половины полученных клонов представляли собой филогенетически обособленную ветвь родового уровня в пределах семейства Methylococcaceae (Рис. 15). К этой ветви принадлежал также ряд клонов, полученных ранее в ходе молекулярных исследований из 81 Рис. 15. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК нового метанотрофа Candidatus Methylospira palustris и представителей метанотрофов I типа. В качестве внешней группы использованы нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК метанотрофов II типа. Маркер - 0.05 замещений на нуклеотидную позицию. болотных экосистем, почв и осадков пресноводных озер (HQ220622, JN397719, JN038836, EU335155, JX434189, НМ243844). 7.3.3. Разработка и применение зондов для детекции нового метанотрофа спирилло-подобной морфологии. Для проверки принадлежности полученной уникальной последовательности гена 16S рРНК организмам спирилло-подобной морфологии были разработаны флуоресцентномеченые зонды. Путем анализа базы данных, сформированной с использованием программного пакета ARB, был произведен поиск уникальных участков в пределах клонированных последовательностей генов 16S рРНК, формирующих отдельную филогенетическую ветвь внутри семейства Methylococcacea. Специфичность вновь разработанных зондов 82 Sp206 и Sp845 (см табл. 2) проверяли путем тестирования в базе данных Ribosomal Database Project. Гибридизация смешанной культуры с этими зондами показала специфическое связывание последних исключительно с клетками спирилло-подобной морфологии (Рис. 16). Рис. 16. Идентификация спирилло-подобных клеток в накопительной культуре образца торфа болота Тасин бор помощью метода FISH: (А) фазовый контраст клеток смешанной культуры; (Б) флуоресцентная микрофотография гибридизации со смесью Су3-меченых зондов Sp206+Sp845; (В) – окраска ДАФИ. Маркер – 5 мкм. 7.3.4. Анализ функциональных генов. Для подтверждения метанотрофной природы нового спирилло-подобного организма была сформирована библиотека клонов генов pmoA, кодирующих ключевой фермент первого этапа окисления метана. Все полученные последовательности принадлежали к филогенетически обособленному кластеру клонов pmoA, полученных из торфа болота Шумново (Рис. 7, 17). К данному кластеру принадлежал также ряд клонов, полученных ранее в ходе молекулярных исследований из различных мест обитаний: почв, болот и осадков пресноводных озер (AJ317926, AJ884524, EF623770, AY488077, AY662387). Последовательностей pmoA, принадлежащих другим метанотрофам, в исследованной ДНК смешанной культуры выявить не удалось. Таким образом, метанокисляющие бактерии, выявленные в ходе молекулярного анализа исходного торфа, были идентифицированы в качестве новых метанотрофов спирилло-подобной морфологии. 83 Рис. 17. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа 146 аминокислотных последовательностей фрагментов PmoA нового метанотрофа Candidatus Methylospira palustris и некоторых представителей метанотрофов I типа. В качестве внешней группы использованы аминокислотные последовательности фрагментов PmoA метанотрофов II типа. Маркер - 0.10 замещений на аминокислотную позицию. 7.3.5. Физиологические характеристики. Изучение ростовых характеристик нового метанотрофа-спириллы в составе смешанной культуры показало его принадлежность к мезофильным (оптимум роста в диапазоне 18-30°С) и ацидотолерантным организмам. Хотя оптимум рН и лежал в околонейтральном диапазоне рН (6-6.5), эти бактерии были способны к росту и при достаточно низких значениях рН (4.2-5.5). В качестве источника азота метанотрофы-спириллы использовали не только KNO3, но также NH4Cl и дрожжевой экстракт (0.02 г/л). На основании данных филогении pmoA и 16S рРНК генов, а также уникальной морфологии клеток, выявленные в болотах организмы спирилло-подобной морфологии предложено описать в качестве кандидата в новый род и вид метанотрофов I типа Candidatus Methylospira palustris. 84 Глава 8. Выделение первого представителя нового филогенетического кластера организмов в пределах Alphaproteobacteria, родственного метанотрофам II типа. 8.1. История выделения и первичный анализ. Штамм Pf56Т был получен в ходе анализа метанотрофного сообщества образца торфа сфагнового болота Старосельский мох (рН 3.8, 56o34’ N, 32o46’ E, Тверская область, Россия). Накопительная культура, полученная из этого образца торфа на среде М2 под метаном, в дальнейшем была использована в качестве посевного материала при глубинном посеве в пробирки с высокоочищенным Phytagel (Sigma) в качестве желирующего агента (0.2%). После этого пробирки были закрыты paraphilm M и помещены в эксикатор с 30% (об/об) метана в газовой фазе. Спустя 1,5 месяца в пробирках был замечен значительный рост микроорганизмов. В поверхностной бактериальной пленке доминировали метанотрофы, некоторые из которых были впоследствии выделены в чистых культурах. Один из таких изолятов - штамм S284, описанный в дальнейшем как Methylocystis bryophila H2sT (Belova et al., 2013), широко распространенный в микробном сообществе сфагновых болот. На глубине 1-3 см под биопленкой метанотрофов, однако, были выявлены изолированные колонии красно-коричневого цвета. Клетки, формирующие данные колонии, гибридизовались с зондом М-450, специфичным для метанотрофов II типа (Рис. 18), вследствие чего данный организм был предварительно идентифицирован как представитель семейства Methylocystaceae. Дальнейшие попытки выделения этой бактерии в чистую культуру осуществлялись путем посева ряда разведений на плотную среду М2 с фитагелем (0.9%) в качестве желирующего агента и инкубации в эксикаторах с 30% метана. Искомые колонии отбирались путем FISH-скрининга со специфичным для метанотрофов II типа зондом М-450 и повторно рассевались на чашки. После 3 месяцев последовательных рассевов штамм Pf56Т был получен в чистой культуре (Рис. 18). Клетки штамма Pf56Т представляли собой неподвижные изогнутые палочки 0.7-4.0 мкм в длину и 0.6-1.2 мкм в ширину и были морфологически сходны с клетками метанотрофа Methylocystis heyeri - типичного обитателя сфагновых болот (Dedysh et al., 85 Рис. 18. (А) Фазово-контрастная фотография клеток штамма Pf56. Маркер – 10 мкм. (Б) флуоресцентная микрофотография гибридизации Су3-меченым зондом М-450; (В) – окраска ДАФИ. Маркер – 5 мкм. 2007). Видимую капсулу клетки штамма Pf56T не формировали. Размножение происходило путем бинарного деления. На чашках клетки изолята образовывали мелкие белые колонии. Анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК штамма Pf56T показал ее принадлежность к отдельному кластеру в пределах Alphaproteobacteria, филогенетически равноудаленному от семейств Methylocystaceae и Beijerinckiaceae (93.6-94.7 и 92.7-93.7% сходства, соответственно) (Рис. 19). Этот кластер сложен последовательностями некультивируемых организмов, полученными ранее из болотных экосистем различного географического положения и почв различного генезиса. Примечательно, что к этой группе некультивируемых микроорганизмов принадлежат также бактерии, описанные голландскими микробиологами в качестве «симбиотических» метанотрофов, населяющих гиалиновые клетки сфагновых мхов (последовательность AY163571) (Raghoebarsing et al., 2005). 8.2. Изучение морфо-физиологических особенностей. Дальнейшие исследования физиологических характеристик штамма Pf56T показали, однако, что он неспособен к росту на метане в стандартных для метанотрофов условиях. Ни в жидких минеральных средах, ни на агаризованных вариантах этих сред под метаном роста штамма Pf56T не наблюдалось. Факт выделения этой бактерии под метаном на чашках с фитагелем может объясняться лишь возможностью использования последнего в 86 Рис. 19. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК штамма Pf56Т и представителей семейств Methylocystaceae и Beijerinckiaceae. В качестве внешней группы использованы нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК метанотрофов I типа. Маркер - 0.05 замещений на нуклеотидную позицию. 87 качестве субстрата. Для проверки этой гипотезы штамм Pf56Т был посеян на жидкую среду М2 с фитагелем (0.05%) в качестве единственного источника углерода. Стабильный рост культуры в данных условиях подтвердил нашу догадку. В дальнейшем, была подобрана оптимальная для нового изолята среда М3 с глюкозой в качестве источника углерода и энергии. ПЦР-тесты на присутствие в ДНК штамма Pf56Т генов, кодирующих мембранную и растворимую метанмонооксигеназы (pmoA и mmoX) – ключевого фермента реакции метанокисления, также дали отрицательные результаты. Анализ спектра используемых субстратов показал, что штамм Pf56Т также неспособен к росту на метаноле, однако использует широкий спектр сахаров и органических кислот. Наилучший рост нового изолята наблюдался на глюкозе, фруктозе и ксилозе, достигая максимума оптической плотности OD600 0.6. Добавление небольшого количества (0.005%) дрожжевого экстракта являлось необходимым условием роста. Кроме сахаров в качестве субстратов роста штамм Pf56Т использовал малат, пируват, соли галактуроновой кислоты, и, в меньшей степени, трегалозу. На пропионате, формиате, αкетоглутарате, сахарозе, целлобиозе, а также солях глюкуроновой кислоты роста не происходило. Штамм Pf56Т рос в аэробных условиях, однако оптимальный рост (со временем генерации 30-35 час) наблюдался в микроаэробных условиях, во флаконах, наполненных жидкой средой до 9/10-х общего объема. При микроскопическом анализе клеток, выращенных в аэробных условиях, были выявлены значительные морфологические изменения, связанные, очевидно, с реакцией клеток на неблагоприятные условия культивирования (Рис. 20). Рис. 20. Морфология клеток штамма Pf56Т, выращенных в аэробных (А) и микроаэробных (Б) условиях. Маркер - 10 мкм. 88 Инкубация на свету вызывала некоторую (около 30%) стимуляцию роста штамма Pf56Т (Рис. 21). Рис. 21. Динамика роста штамма Pf56Т на глюкозе и малате в качестве субстратов роста при инкубации на свету и в темноте. На ультратонких срезах клеток, выращенных на свету, были выявлены внутрицитоплазматические мембраны везикулярного типа, характерные для ряда пурпурных бактерий (Рис. 22). Кроме того, в клетках присутствовали гранулы полигидроксибутирата, типичного запасного вещества альфапротеобактерий. Рис. 22. Электронные микрофотографии ультратонкого среза клетки штамма Pf56Т, демонстрирующие присутствие внутрицитоплазматических мембран везикулярного типа, а также гранул полигидроксибутирата. Маркер – 1 мкм. 89 При росте на свету клетки штамма Pf56Т синтезировали красно-коричневый пигмент (Рис. 23А). Спектральный анализ ацетон/метанольного экстракта показал наличие бактериохлорофилла а (Рис. 23Б). В темноте образования бактериохлорофилла а не происходило. Основные каротиноиды нового изолята были представлены спириллоксантином, родопином и 3,4-дидегидрородопином. Рис. 23. (А) Синтез пигмента при росте штамма Pf56Т на свету и отсутствие его при росте в темноте; (Б) Спектр поглощения ацетон-метанольного экстракта клеток, выращенных на свету. Пики 363 и 770 nm соответствуют бактериохлорофиллу а. Хотя по характеру ВЦМ и образованию бактериохлорофилла а на свету штамм Pf56Т обнаруживал сходство с пурпурными бактериями, он кардинально отличался от последних неспособностью к фототрофному росту в анаэробных условиях. Клеточные суспензии штамма Pf56Т, выращенные на свету в микроаэробных условиях были бледнорозового, а не пурпурного цвета, как это характерно для пурпурных бактерий. Анализ культуральной жидкости этих суспензий показал наличие продуктов брожения - ацетата и пропионата, а в газовой фазе флаконов происходило накопление Н2 (Рис. 24). Аналогичный спектр продуктов брожения был выявлен в культурах, выращенных в микроаэробных условиях в темноте. Фототрофного роста на ацетате и сукцинате не наблюдалось. Таким образом, несмотря на синтез бактериохлорофилла а, рост штамма Pf56Т в микроаэробных условиях происходил за счет брожения. Штамм Pf56Т был способен к росту при рН от 4.0 до 7.0, с оптимумом при рН 5.5-6.5 (Рис. 25), и диапазоне температур от 15 до 30oC с оптимумом при 22–28 °C. Ингибирование роста происходило при содержании NaCl в среде более 0.5%. 90 Рис. 24. Динамика убыли фруктозы (1) и роста концентрации пропионата (2) и ацетата (3) в процессе роста штамма Pf56Т в микроаэробных условиях. Рис. 25. Зависимость удельной скорости роста (µ) штамма Pf56T от величины рН среды. Таким образом, по основным физиологическим характеристикам штамм Pf56Т относился к умеренно ацидофильным и мезофильным микроорганизмам. Новый изолят был способен к фиксации N2. Нуклеотидная последовательность фрагмента гена nifH этой бактерии была наиболее близка (90-92% сходства) к таковым у представителей Rhodopseudomonas palustris. Помимо N2, новый изолят был способен 91 использовать в качестве источника азота аммоний, гистидин, глутамат и дрожжевой экстракт. Основными жирными кислотами (ЖК) штамма Pf56Т были 19:0 CYCLO ω8c и 18:1ω7c (Табл. 11). Последняя ЖК типична для многих альфапротеобактерий. ЖК 19:0 CYCLO ω8c, однако, отсутствует у представителей Methylocystaceae (Bodelier et al., 2009) и была обнаружена лишь у одного представителя Beijerinckiaceae – Metylocella tundra (Dedysh et al., 2004). Содержание пар Г+Ц в ДНК штамма Pf56T составило 70.0 молl%, что выше такового у известных представителей Methylocystaceae и Beijerinckiaceae (55-65 мол%). Таблица 11. Состав клеточных жирных кислот штамма Pf56T. Основные жирные кислоты выделены жирным цветом. Fatty acid Strain Pf56T 12:0 0.3 13:0 0.4 14:0 0.5 15:0 0.7 16:1ω7c 0.3 16:0 9.3 17:1ω8c 1.4 17:0 6.5 18:1ω9c 0.8 18:1ω7c 26.3 18:1ω5c 0.6 11 methyl 18:1ω7c 0.9 17:0 3OH 0.6 19:0 CYCLO ω8c 38.9 18:0 3OH 2.5 20:2ω6,9c 0.5 92 Таким образом, фенотипические характеристики штамма Pf56T отличались от таковых у филогенетически родственных представителей Alphaproteobacteria. Отсутствие способности к метанотрофии не позволяет отнести его к семейству Methylocystaceae. Способность к росту в микроаэробных условиях за счет брожения отличает его от строго аэробных представителей семейства Beijerinckiaceae. От наиболее близких фототрофных организмов – пурпурных бактерий Rhodoblastus - штамм Pf56T отличается способностью к брожению и неспособностью к фототрофному росту в анаэробных условиях. На основании вышеперечисленных отличий было предложено выделить штамм Pf56 T в отдельный род и вид - Roseiarcus fermentans gen. nov., sp. nov., принадлежащий к новому семейству – Roseiarcaceae fam. nov. Характеристика Roseiarcus gen. nov. Roseiarcus (Ro.se.i.ar’cus. M.L. adj. roseus, роза, розовый; L. masc. n. arcus, свод, дуга; M.L. masc. n. Roseiarcus, розовая дуга). Грамотрицательные неподвижные изогнутые палочки. Размножаются бинарным делением. При росте на свету содержат везикулярные мембраны, характерные для пурпурных бактерий, и бактериохлорофилл а. Способны использовать широкий спектр органических субстратов, в том числе сахара и органические кислоты. Факультативные анаэробы. В микроаэробных условиях растут за счет брожения. Свет стимулирует рост. С1 соединения не используют. Умеренные ацидофилы и мезофилы. Фиксируют N2. Основные жирные кислоты - 19:0 CYCLO ω8c и 18:1ω7c. Полярные липиды фосфатидилэтаноламином, представлены фосфатидилглицеролом, фосфатидилхолином, кардиолипином и сфингогликолипидами. Основной хинон - Q10. Принадлежат к семейству Roseiarcaceae, классу Alphaproteobacteria. Места обитания - болота и почвы. Типовой вид - Roseiarcus fermentans. Roseiarcus fermentans sp. nov. Roseiarcus fermentans (fer.men’tans. L. part. adj. fermentans ферментирующий). Основные характеристики указаны при описании рода. Клетки размером 2.7-4.0 мкм в длину и 0.6-1.2 мкм в ширину. Жидкая культура имеет бледно-розовый цвет при росте на свету. В темноте культура бесцветна. Спектр поглощения живых клеток имеет максимумы поглощения при 455, 489, 528, 593, 806 и 865 нм. Бактериохлорофилл а 93 синтезируется только на свету. Основные каротиноиды представлены спириллоксантином, родопином и 3,4-дидегидрородопином. В качестве источников углерода используют глюкозу, фруктозу, ксилозу, трегалозу, малат, пируват, соли галактуроновой кислоты, а также фитагель. Не утилизируют метан, метанол, пропионат, ацетат и формиат. В качестве источников азота используют соли аммония, N2, дрожжевой экстракт, а также ряд аминокислот. Растут в диапазоне рН 4.0-7.0 (оптимум 5.5-6.5) и температуры 15-30°С (оптимум 22-28°С). NaCl подавляет рост в концентрации выше 0.5%. Содержание пар Г+Ц в ДНК 70.0 моль %. Типовой штамм Pf56T (=DSM 24875T=VKM xxT) выделен из кислого сфагнового болота Старосельский мох Тверской обл. (56o34´ N, 32o46´ E). Характеристика Roseiarcaceae fam. nov. Roseiarcaceae (Ro.se.i.ar.ca’ce.ae. N.L. masc. n. Roseiarcus типовой род семейства; aceae окончание, указывающее семейство; N.L. fem. pl. n. Roseiarcaceae – семейство рода Roseiarcus). Грамотрицательные неспорообразующие бактерии. Факультативные анаэробы. Мезофиллы, умеренные ацидофилы. Семейство Roseiarcaceae принадлежит к классу Alphaproteobacteria. Типовой род - Roseiarcus. 94 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Результаты настоящего исследования подтверждают опубликованные ранее данные о низкой популяционной численности метанотрофов I типа в сфагновых болотах (Dedysh et al., 2001, 2003). В пользу этого факта свидетельствуют как данные учета клеток этих бактерий с помощью метода FISH, так и относительно малая доля последовательностей метанотрофов I типа в библиотеках клонов генов pmoA. В некотором противоречии с этими данными находятся результаты нескольких недавних исследований разнообразия метанотрофов в сфагновых болотах Европейских стран, выполненные с помощью высокопроизводительного пиросеквенирования генов pmoA (Kip et al., 2011; Bragina et al., 2012). В этих работах, существенная доля идентифицированных в торфе последовательностей pmoA принадлежала метанотрофам I типа. По всей видимости, в структуре метанотрофных сообществ болот густонаселенных стран могут происходить существенные изменения вследствие высокого антропогенного влияния на эти экосистемы. Такое предположение подтверждается данными сравнительного анализа состава сообществ метанотрофов в сфагновых болотах различного географического положения, выявивших значительную долю метанотрофов I типа в сообществах европейских болот и их практическое отсутствие в болотах Сибири (Kip et al., 2011). Это позволяет рассматривать метанотрофов I типа в качестве индикаторов антропогенных нарушений сфагновых болотных экосистем. В настоящей работе были получены и детально охарактеризованы культуры болотных метанотрофов I типа, способные расти при низких значениях рН. Два штамма этих бактерий были описаны в качестве представителей нового вида рода Methylomonas, Methylomonas paludis sp. nov. Это первые таксономически охарактеризованные ацидотолерантные метанотрофы в пределах Methylococcaceae. Другой метанотрофный организм, имеющий клетки спиралевидной формы и способный к росту в кислых средах был описан в качестве кандидата в новый род и вид метанотрофов - Candidatus Methylospira palustris. Последовательности генов pmoA, сходные с таковой у метанотрофа-спириллы, были ранее выявлены в экстрактах тотальной ДНК, полученных из различных местообитаний (Pester et al., 2004; Kip et al., 2011). Факт присутствия клеток метанотрофов I типа в гиалиновых клетках сфагновых мхов впервые был установлен в лаборатории академика Г.А. Заварзина (Васильева и др., 95 1999). Голландским микробиологам удалось доказать тесную метаболическую связь между метанотрофами и мхами (Raghoebarsing et al., 2005). По результатам молекулярной идентификации «метанотрофы-симбионты» были определены как принадлежащие к группе ранее некультивируемых бактерий, филогенетически близких семействам Methylocystaceae и Beijerinckiaceae. Полученный в настоящей работе первый изолят этой группы бактерий, вопреки ожиданиям, оказался факультативным аэробом-бродильщиком, синтезирующим бактериохлорофилл а и неспособным к росту на метане. Он был описан в качестве нового рода и вида Roseiarcus fermentans gen. nov., sp. nov, Природу остальных организмов данной группы еще предстоит выяснить, однако очевидно, что в ее составе имеются неметанотрофные представители. 96 ВЫВОДЫ 1. Численность клеток метанотрофов I типа, выявленных в торфе сфагновых болот гибридизацией с флуоресцентно-мечеными зондами М84+М705, составила 0.05 - 2.16×105 клеток г-1 сырого торфа, что соответствовало 0.4-12.5% от общего числа метанотрофов или 0.004-0.4% общей численности бактерий. 2. Нуклеотидные последовательности pmoA метанотрофов I типа составляли лишь 8% общего пула этих генов, выявленного в сфагновом торфе. Оценка разнообразия метанотрофов I типа с помощью анализа генов 16S рРНК выявила присутствие представителей родов Methylomonas и Methylovulum, а также метанотрофов новой филогенетической ветви родового уровня (87 – 94% сходства с последовательностями генов 16S рРНК известных метанотрофов I типа). 3. Выделенные из кислого торфа изоляты метанотрофов рода Methylomonas описаны в качестве нового вида, Methylomonas paludis sp. nov. Представители этого вида являются ацидотолерантными бактериями, способными развиваться в средах с достаточно низкими значениями рН (около 3.8-4.5), но имеющими оптимум роста в слабокислых средах с рН 5.8-6.4. Это первые таксономически охарактеризованные ацидотолерантные метанотрофы в пределах Methylococcaceae. 4. В болотах выявлены метанотрофы I типа с необычной, спиралевидной формой клеток, обнаруживающие отдаленное родство (92-94% сходства генов 16S рРНК) с ветвью родов Methylococcus-Methylocaldum. Последовательности PmoA этих бактерий формируют филогенетически обособленный кластер и обнаруживают лишь 66-84% сходства с таковыми у ранее охарактеризованных метанотрофных гаммапротеобактерий. Новые метанотрофы-спириллы условно отнесены к таксону Candidatus Methylospira palustris. 5. Описан новый род и вид умеренно ацидофильных, факультативно анаэробных бактерий-бродильщиков, обладающих бактериохлорофиллом а, но не способных к фототрофному росту в анаэробных условиях, Roseiarcus fermentans gen. nov., sp. nov. Несмотря на филогенетическую близость к метанотрофам семейств Methylocystaceae и Beijerinckiaceaе, эти болотные бактерии не способны к росту на С1 соединениях. 97 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Андреев Л.В., Гальченко В.Ф. Жирнокислотный состав и идентификация метанотрофных бактерий// Доклады АН СССР. 1978. Т. 239. С. 1465-1468 2. Быкова Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Марусина А.И., Турова Т.П., Кравченко И.К., С.А., Колганова последовательностей nifH Т.В., генов Гальченко у В.Ф. предмтавителей Изучение нуклеотидных метанотрофных бактерий// Микробиология. 2002. Т. 71. №4. С. 1-9. 3. Васильева Л.В., Берестовская Ю.Ю., Заварзин Г.А. Психрофильные ацидофильные метанотрофы из сфагнеты зоны вечной мерзлоты// Доклады Академии Наук. 1999. Т.368. №1. С. 125-128. 4. Воробьев А.В., Дедыш С.Н. Использование накопительных культур для оценки структуры сообществ метанотрофов в торфяной почве: проблема репрезентативности результатов// Микробиология. 2008. Т. 77. №4. С. 566-569. 5. Гальченко В.Ф., Андреев Л.В., Троценко Ю.А. Таксономия и идентификация облигатных метанотрофных бактерий// Пущино: Изд-во НЦБИ. 1986. 96с. 6. Гальченко В.Ф. Метанотрофные бактерии// М.:ГЕОС. 2001. 500c. 7. Гальченко В.Ф., Андреев Л.В., Троценко Ю.А. Таксономия и идентификация облигатных метанотрофных бактерий// Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1986. 96с. 8. Дедыш С.Н. Ацидофильные метанотрофные бактерии// руды Ин-та Микробиологии РАН. 2004. Т. 12. С. 109-125. 9. Дедыш С.Н. Исследование экологии метанотрофных бактерий с использованием молекулярных подходов// Труды института микробиологии им. С.Н. Виноградского / Ред. Гальченко В.Ф. М.: Наука. 2006. Т. 13. С. 192-224. 10. Ешинимаев Б.Ц. Новые умеренно галоалкалофильные ки термофильные метанотрофы. Дис. канд. биол. наук. Пущино. 2006. 143 с. 11. Ешинимаев Б.Ц., Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. Метанотроф II типа, выделенный впервые из содового озера// Микобиология. 2008. Т. 77. №5. С. 704-707. 98 12. Заварзин Г.А. Лекции по природоведческой микробиологии// Ред. Колотилова Н.Н. М.: Наука. 2004. 348 с. 13. Иванов М.В., Вайнштейн М.Б., Гальченко В.Ф. и др. Распространение и геохимическая деятельность бактерий в осадках западного сектора Черного моря// Нефтегазогенетические исследования болгарского сектора Черного моря. София, 1984. С. 150-180. 14. Калюжная М.Г., Макутина В.А., Русакова Т.Г., Никитин Д.В., Хмеленина В.Н., Дмитриев В.В., Троценко Ю.А. Метанотрофные сообщества почв северной тайги и субарктической тундры России// Микробиология. 2002. Т. 71. №2. С. 264-271. 15. Лысенко А.М., Гальченко В.Ф., Черных Н.А. Таксономическое изучение облигатных метанотрофных бактерий методом ДНК-ДНК гибридизации// Микробиология. 1998. Т. 57. №5. С. 816-822. 16. Омельченко М.В., Васильева Л.В., Заварзин Г.А., Савельева Н.Д., Лысенко А.М., Митюшина Л.Л. Новый психрофильный метанотроф рода Methylobacter// Микробиология. 1996. Т. 65. №3. С.384-389. 17. Пименов Н.В., Русанов И.И., Бсупов С.К. и др. Микробиологические процессы на границе аэробных и анаэробных вод в глубоководной зоне Черного моря// Микробиология. 2000. Т. 69. С. 527-540. 18. Слободова Н.В., Колганова Т.В., Булыгина Е.С., Кузнецов В.В., Турова Т.Р, Кравченко И.К. Характеристика метанотрофных накопительных культур из почв сфагнового болота с помощью серологических и молекулярных методов// Микробиология. 2006. Т. 75. №3, С. 397-403. 19. Троценко Ю.А., Хмеленина В.Н. Особенности метаболизма облигатных метанотрофов// Труды института микробиологии им. С.Н. Виноградского / Ред. Гальченко В.Ф. М.: Наука. 2006. Т. 13. С. 24-45. 20. Троценко Ю.А., Хмеленина В.Н. Экстремофильные метанотрофы// Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН. 2008. 206 с. 99 21. Шишкина В.Н., Троценко Ю.А., Уровни ассимиляции углекислоты метанотрофными бактериями// Микробиология. 1986. Т. 55. №3. С. 377-382. 22. Amann R.I., Krumholz L., Stahl D.A. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic, and environmental studies in microbiology.// J. Bacteriol. 1990. V. 172. P. 762-770. 23. Anthony C. The strucrure of bacterial quinoprotein dehydrogenases// Int. J. Biochem. 1992. V. 24. P. 29-39. 24. Anthony C., Ghosh M., Blake C.C.F. The structure and function of methanol dehydrogenases and related quinoproteins containing pyrrolo-quinoline quinone// Biochem. J. 1994. V. 304. P. 5-674. 25. Anthony C., Ghosh M. The structure and function of PQQ-containing quinoprotein dehydrogenases// Prog. Biophys. Mol. Biol. 1998. V. 69. P. 1-21. 26. Anthony C., Williams P. The structure and mechanism of methanol dehydrogenase// Biochim. Biophys. Acta. 2003. V. 1647. P. 18–23. 27. Auman A.J., Lidstrom M.E. Analysis of sMMO-containing type I methanotrophs in Lake Washington sediment//Environ. Microbiol. 2002. V. 4. P. 517-524. 28. Auman A.J., Stolyar S., Costello A.M., Lidstrom M.E. Molecular characterization of methanotrophic isolates from freshwater lake sediment// Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P. 5259-5266. 29. Baani M., Liesack W. Two isozymes of particulate methane monooxygenase with different methane oxidation kinetics are found in Methylocystis sp. strain SC2//Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2008. V. 105. P. 10203-8. 30. Baker P.W., Futamata H., Harayama S., Watanabe K. Molecular diversity of pMMO and sMMO in a TCE-contaminated aquifer during bioremediation// FEMS Microbiol. Ecol. 2001. V. 38. P. 161–167. 31. Baxter N.J., Hirt R.P., Bodrossy L., Kovacs K.L., Embley T.M., Prosser J.I., Murrell J.C. The ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase gene cluster of Methylococcus capsulatus (Bath)// Arch. Microbiol. 2002. V. 177. P. 279–289. 100 32. Beal E.J., House C.H., Orphan V.J. Manganese- and iron-dependent marine methane oxidation// Science. 2009. V. 325. P. 184–187. 33. Belova S.E., Baani M., Suzina N.E., Bodelier P.L.E., Liesack W., Dedysh S.N. Acetate utilization as a survival strategy of peat-inhabiting Methylocystis spp.// Environ. Microbiol. Rep. 2011. V. 3. P. 36-46. 34. Belova S.E., Kulichevskaya I.S., Bodelier P.L.E., Dedysh S.N. Methylocystis bryophila sp. nov., a facultatively methanotrophic bacterium from acidic Sphagnum peat, and emended description of the genus Methylocystis (ex Whittenbury et al., 1970) Bowman et al. 1993// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2013. V. 63. P. 1096–1104. 35. Bodelier P.L.E., Gillisen M.-J.B., Hordijk K., Damste J.S.S., Rijpstra W.I.C., Geenevasen J.A.J., Dunfield P.F. A reanalysis of phospholipid fatty acid as ecological biomarkers for methanotrophic bacteria// ISME Journal. 2009. V. 3. P. 606-617. 36. Bodrossy L., Holmes E.M., Holmes A.J., Kovács K.L., Murrell J.C. Analysis of 16S rRNA and methane monooxygenase gene sequences reveals a novel group of thermotolerant and thermophilic methanotrophs, Methylocaldum gen. nov.// Arch. Microbiol. 1997. V. 168. P. 493-503. 37. Bodrossy L., Kov´acs K.L., McDonald I.R., Murrell J.C. A novel thermophilic methane-oxidising g-Proteobacterium// FEMS Microbiol. Lett. 1999. V. 170. P. 335–341. 38. Bodrossy L., Stralis-Pavese N., Murrell J.C., Radajewski S., Weilharter A., Sessitsch A. Development and validation of a diagnostic microbial microarray for methanotrophs.// Environ. Microbiol. 2003. V. 5. P. 566-582. 39. Boetius A., Ravenschlag K., Schubert C.J., Rickert D., Widdel F., Gieseke A., Amann R., Jorgensen B.B., Witte U., Pfannkuche O. A marine microbial consortium apparently mediating anaerobic oxidation of methane.// Nature. 2000. V. 5. P. 623-626. 40. Boschker H.T.S., Nold S.C., Wellsbury P., Bos D., de Graaf W., Pel R., Parkers R.J., Cappenberg T.E. Direct linking of microbial populations to specific biogeochemical processes by 13C-labelling of biomarkers// Nature. 1998. V. 392. P. 801-805. 101 41. Boschker H.T.S., de Graaf W., Koster M., Meyer-Reil L.A., Cappenberg T.E. Bacterial populations and processes involved in acetate and propionate consumption in anoxic brackish sediment// FEMS Microbiol. Ecol. 2001. V. 35. P. 97-103. 42. Bourne D.G., Holmes A.J., Iversen N., Murrell J.C. Fluorescent oligonucleotide rDNA probes for specific detection of methane oxidising bacteria.// FEMS Microbiol. Ecol. 2000. V. 1. P. 29-38. 43. Bourne D.G., McDonald I.R., Murrell J.C. Comparison of pmoA PCR primer sets as tools for investigating methanotroph diversity in three Danish soils// Ibid. 2001. V. 67. P. 38023809. 44. Bowman J.P., Sly L.I., Cox J.M., Hayward A.C. Methylomonas fodinarum sp. nov. and Methylomonas aurantiaca sp. nov.: two closely related type I obligate methanotrophs// Syst. Appl. Microbiol. 1990. V. 13. P. 278-286. 45. Bowman J.P., Skerratt J.H., Nichols P.D., Sly L.I. Phospholipid fatty acid and lipopolysaccharide fatty acid signature lipids in methane-utilizing bacteria//FEMS Microbiol. Ecol. 1991. V. 85. P. 15-22. 46. Bowman J.P., Sly L.I., Nichols P.D., Hayward A.C. (1993). Revised taxonomy of the methanotrophs: description of Methylobacter gen. nov., emendation of Methylococcus, validation of Methylosinus and Methylocystis species, and a proposal that the family Methylococcaceae includes only the group I methanotrophs//Int. J. Syst. Bacteriol. 1993. V. 43. P. 735-753. 47. Bowman J.P., McCammon S.A., Skerratt J.H. Methylosphaera hansonii gen. nov., sp. nov., a psychrophilic, group I methanotroph from Antarctic marine-salinity, meromictic lakes.// Microbiology. 1997. V. 143. P. 1451-1459. 48. Bragina A., Maier S., Berg C., Müller H., Chobot V., Hadacek F., Berg G. Similar diversity of alphaproteobacteria and nitrogenase gene amplicons on two related sphagnum mosses.// Front. Microbiol. 2012. V. 2. P. 275. 49. Brusseau G.A., Bulygina E.S., Hanson R.S. Phylogenetic analysis and development of probes for differentiating methylotrophic bacteria.// Appl. Environ. Microbiol. 1994. V. 60. P. 626-636. 102 50. Bussmann I., Pester M., Brune A., Schink B. Preferential cultivation of type II methanotrophic bacteria from littoral sediments (Lake Constance)// FEMS Microbiol. Ecol. 2004. V. 47. P. 179–189. 51. Cadillo-Quiroz H., Yashiro E., Yavitt J.B., Zinder S.H. Characterization of the archaeal community in a minerotrophic fen and terminal restriction fragment length polymorphismdirected isolation of a novel hydrogenotrophic methanogen// Appl. Environ. Microbiol. 2008. V. 74. P. 2059-2068. 52. Castro H., Ogram A., Reddy K.R. Phylogenetic characterization of methanogenic assemblages in eutrophic and oligotrophic areas of the Florida Everglades// Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. P. 6559-6568. 53. Carini S., Bano N., LeCleir G., Joye S.B. Aerobic methane oxidation and methanotroph community composition during seasonal stratification in Mono Lake, California (USA)// Environ. Microbiol. 2005. V. 7. P. 1127–1138. 54. Cebron A., Bodrossy L., Stralis-paveseM., Singer A.C., Yhompson I.P., Prosser J.I., Murrell J.C. Nutrient amendments in soil DNA stable isotope probing experiments reduce the observed methanotroph diversity// Appl. Environ. Microbiol. 2007. V. 73. P. 798-807. 55. Chen Y., Dumont M.G., Cebron A., Murrell J.C. Identification of active methanotrophs in a landfill cover soil through detection of expression of 16S rRNA and functional genes// Environ. Microbiol. 2007. V. 9. P. 2855-2869. 56. Chen Y., Dumont M.G., McNamara N.P., Chamberlain P.M., Bodrossy L., StralisPavese N., Murrell J.C. Diversity of the active methanotrophic community in acidic peatlands as assessed by mRNA and SIP-PLFA analyses//Environ. Microbiol. 2008. V. 10. P. 446–459. 57. Cheng Y.S., Halsey J.L., Fode K.A., Remsen C.C., Collins M.L.P. Detection of methanotrophs in groundwater by PCR// Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 648–651. 58. Choi D.W., Kunz R.C., Boyd E.S., Semrau J.D., Antholine W.E., Han J.I., Zahn J.A., Boyd J.M., de la Mora A.M., DiSpirito A.A. The membrane-associated methane monooxygenase pMMO and pMMO-NADH:quinone oxidoreductase complex from Methylococcus capsulatus Bath// J. Bacteriol. 2003. V. 185. P. 5755–5764. 103 59. Cicerone R.J., Oremland R.S. Biogeochemical aspects of atmospheric methane// Global. Biogeochem. Cycles. 1988. V. 2. P. 299–327. 60. Collins M.D. Analysis of isoprenoid quinones// Methods Microbiol. 1985. V. 18. P. 329-366. 61. Conrad R. The global methane cycle: recent advances in understanding the microbial processes involved// Environ. Microbiol. Rep. 2009. V. 1. №5. P. 285-292. 62. Costello A.M., Lidstrom M.E. Molecular characterization of functional and phylogenetic genes from natural populations of methanotrophs in lake sediments.// Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 5066-5074. 63. Daims H., Brühl A., Amann R., Schleifer K.-H., Wagner M. The domain-specific probe EUB338 is insufficient for the detection of all Bacteria: development and evaluation of a more comprehensive probe set// Syst. Appl. Microbiol. 1999. V. 22. P. 434-444. 64. Danilova O.V., Kulichevskaya I.S., Rozova O.N., Detkova E.N., Bodelier P.L., Trotsenko Y.A., Dedysh S.N. Methylomonas paludis sp. nov., the first acid-tolerant member of the genus Methylomonas, from an acidic wetland//Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2013. V. 63. P. 2282-2289. 65. Dedysh S.N., Panikov N.S., Tiedje J.M. Acidophilic methanotrophic communities from Sphagnum peat bogs// Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. P. 922–929. 66. Dedysh S.N., Liesack W., Khmelenina V.N., Suzina N.E., Trotsenko Y.A., Semrau J.D., Bares A.M., Panikov N.S., Tiedje J.M. Methylocella palustris gen. nov., sp. nov., a new methaneoxidizing acidophilic bacterium from peat bogs, representing a novel subtype of serine-pathway methanotrophs//Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V. 50. P. 955-969. 67. Dedysh S.N., Derakshani M., Liesack W. Detection and enumeration of methanotrophs in acidic sphagnum peat by 16S rRNA fluorescence in situ hybridization, including the use of newly developed oligonucleotide probes for Methylocella palustris// Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 4850–4857. 68. Dedysh S.N., Khmelenina V.N., Suzina N.E., Trotsenko Y.A., Semrau J.D., Liesack W., Tiedje J.M. Methylocapsa acidiphila gen. nov., sp.nov., a Novel Methane-Oxidizing and 104 Dinitrogen-Fixing Acidophilic Bacterium from Sphagnum Bog// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. V. 52. P. 251-261. 69. Dedysh S.N., Dunfield P.F., Derakshani M., Stubner S., Heyer J., Liesack W. Differential detection of type II methanotrophic bacteria in acidic peatlands using newly developed 16S rRNA-targeted fluorescent oligonucleotide probes// FEMS Microbiol. Ecol. 2003. V. 43. P. 299-308. 70. Dedysh S.N., Berestovskaya Y.Y., Vasylieva L.V., Belova S.E., Khmelenina V.N., Suzina N.E., Trotsenko Y.A., Liesack W., Zavarzin G.A., Methylocella tundrae sp. nov., a Novel Methanotrophic Bacterium from Acidic Peatlands of Tundra// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004a. V. 54. P. 151–156. 71. Dedysh S.N., Ricke P., Liesack W. NifH and NifD phylogenies: a molecular basis for understanding nitrogen fixation capabilities of methanotrophic bacteria// Microbiology. 2004б. V. 150. P. 1301-1313. 72. Dedysh S.N., Smirnova K.V., Khmelenina V.N., Suzina NE, Liesack W, Trotsenko YA. Methylotrophic autotrophy in Beijerinckia mobilis.// J. Bacteriol. 2005а. V. 187. P. 38843888. 73. Dedysh S.N., Knief C., Dunfield P.F. Methylocella species are facultatively methanotrophic// J. Bacteriol. 2005б. V. 187. P. 4665–4670. 74. Dedysh S.N., Belova S.E., Khmelenina V.N., Chidthaisong A., Trotsenko Y.A., Liesack, W., Dunfield P.F. Methylocystis heyeri sp. nov., a novel type II methanotrophic bacterium possessing ‘signature’ fatty acids of type I methanotrophs// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. V. 57. P. 472–479. 75. Dedysh S.N. Exploring methanotroph diversity in acidic northern wetlands: molecular and cultivation-based studies// Microbiology. 2009. V. 78. P. 655-669. 76. Dianou D., Ueno C., Ogiso T., Kimura M., Asakawa S. Diversity of cultivable methane-oxidizing bacteria in microsites of a rice paddy field: investigation by cultivation method and fluorescence in situ hybridization (FISH).// Microb. Environ. 2012. V. 27(3). P. 278-87. 105 77. DiSpirito A.A., Zahn J.A., Graham D.W., Kim H.J., Larive C.K., Derrick T.S., Cox C.D., Taylor A. Copper-binding compounds from Methylosinus trichosporium OB3b.// J Bacteriol. 1998. V. 180. P. 3606-3613. 78. Dumont M.G., Murrell J.C. Stable isotope probing: linking microbial identity to function// Nat. Rev. Microbiol. 2005. V. 3. P. 499–504. 79. Dumont M.G., Pommerenke B., Casper P., Conrad R. DNA-, rRNA- and mRNAbased stable isotope probing of aerobic methanotrophs in lake sediment.// Environ. Microbiol. 2011. V. 13. P. 1153-1167. 80. Dunfield P.F., Khmelenina V.N., Suzina N.E., Trotsenko Y.A. Dedysh S.N. Methylocella silvestris sp. nov., a novel methanotroph isolated from an acidic forest cambisol// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 1231–1239. 81. Dunfield P.F., Tchawa Yimga M., Dedysh S.N., Berger U., Liesack W., Heyer J. Isolation of a Methylocystis strain containing a novel pmoA-like gene// FEMS. Microbiol. Ecol. 2002. V. 41. P. 17–26. 82. Dunfield P.F., Yuryev A., Senin P., Smirnova A.V., Stott M.B., Hou S., Ly B., Saw J.H., Zhou Z., Ren Y., Wang J., Mountain B.W., Crowe M.A., Weatherby T.M., Bodelier P.L., Liesack W., Feng L., Wang L., Alam M. Methane oxidation by an extremely acidophilic bacterium of the phylum Verrucomicrobia.// Nature. 2007. V. 6. P. 879-882. 83. Dunfield P.F., Belova S.E., Vorob’ev A.V., Cornish S.L., Dedysh S.N. (2010) Methylocapsa aurea sp. nov., a facultatively methanotrophic bacterium possessing a particulate methane monooxygenase// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2010. V. 60. P. 2659-2664. 84. Dworkin M., Foster J.W. Studies on Pseudomonas methanica (Söhngen) nov. comb// J. Bacteriol. 1956. V. 72. P. 646-59. 85. Eller G., Frenzel P. Changes in Activity and Community Structure of MethaneOxidizing Bacteria over the Growth Period of Rice// Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. № 6, P. 2395-2403. 106 86. Eller G., Stubner S., Frenzel P. Group-specific 16S rRNA targeted probes for the detection of type I and type II methanotrophs by fluorescence in situ hybridization// FEMS Microbiol. Lett. 2001. V. 198. P. 91-97. 87. Ettwig K.F., van Alen A.T., van de Pas-Schoonen K.T., Jetten M.S., Strous M. Enrichment and molecular detection of denitrifying methanotrophic bacteria of the NC10 phylum// Appl. Environ. Microbiol. 2009. V. 75. P. 3656–3662. 88. Ettwig K.F., Butler M.K., Le Paslier D., Pelletier E., Mangenot S., Kuypers M.M., Schreiber F., Dutilh B.E., Zedelius J., de Beer D., Gloerich J., Wessels H.J., van Alen T., Luesken F., Wu M.L., van de Pas-Schoonen K.T., Op den Camp H.J., Janssen-Megens E.M., Francoijs K.J., Stunnenberg H., Weissenbach J., Jetten M.S., Strous M. Nitrite-driven anaerobic methane oxidation by oxygenic bacteria// Nature. 2010. V. 464. P. 543–548. 89. Felsenstein J. PHYLIP – phylogeny inference package (version 3.2)// Cladistics. 1989. V. 5. P. 164-166. 90. Fjellbirkeland A., Torsvik V., Ovreas L. Methanotrophic diversity in an agricultural soil as evaluated by denaturing gradient gel electrophoresis profiles of pmoA, mxaF, and 16S rDNA sequences// Antonie van Leeuwenhoek. 2001. V. 79. P. 209–217. 91. Fox B.G., Froland J.E., Dege J., Lipscomb J.D. Methane monooxygenase from Methylosinus trichosporium OB3b: Purification and properties of a three component system with high specific activity from a type II methanotroph// J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 10023– 10033. 92. Friborg T., Soegaard H., Christensen T.R., Lloyd C.R., Panikov N.S. Siberian Wetlands: Where a Sink is a Source// Geophys. Res. Lett. 2003. V. 30. P. 2129–2132 93. Friedrich M.W. Stable-isotope probing of DNA: insights into the function of uncultivated microorganisms from isotopically labeled metagenomes// Curr. Opin. Biotechnol. 2006. V. 17. P. 59–66. 94. Fuse H., Ohta M., Takimura O., Murakami K., Inoue H., Yamaoka Y., Oclarit J.M., Omori T. Oxidation of trichloroethylene and dimethyl sulfide by a marine Methylomicrobium 107 strain containing soluble methane monooxygenase// Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998. V. 62. P. 1925–1931. 95. Geymonat E., Ferrando L., Tarlera S.E. Methylogaea oryzae gen. nov., sp. nov., a mesophilic methanotroph isolated from a rice paddy field// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2011. V. 61. P. 2568-2572. 96. Gorham E. Northern Peatlands: Role in the Carbon Cycle and Probable Response to Climatic Warming// Ecol. Appl. 1991. V. 1. P. 182–195. 97. Graef C., Hestnes A.G., Svenning M.M., Frenzel P. The active methanotrophic community in a wetland from the High Arctic// Environ. Microbiol. Rep. 2011. V. 3. P. 466– 472. 98. Graham D.W., Kim H.J. Production, isolation, purification, and functional characterization of methanobactins.// Methods Enzymol. 2011. V. 495. P. 227-245. 99. Graham D.W., Korich D.G., LeBlanc R.P., Sinclair N.P., Arnold R.G. Applications of a colorimetric plate assay for soluble methane monooxygenase activity// Appl. Environ. Microbiol. 1992. V. 58. P. 2231-2236. 100. Green J., Dalton H. Protein B of soluble methane monooxygenase from Methylococcus capsulatus Bath// J. Biol. Chem. 1985. V. 260. P. 15795–15801. 101. Grossman E.L., Cifuentes L.A., Cozzarelli I.M. Anaerobic methane oxidation in a landfill-leachate plume// Environ. Sci. & Techn. 2002. V. 36. P. 2436-2442. 102. Guckert J.B., Ringelberg D.B., White D.C., Hanson R.S., Bratina B.J. Membrane fatty acids as phenotypic markers in the polyphasic taxonomy of methylotrophs within the Proteobacteria.// J. Gen. Microbiol. 1991. V. 137. P. 2631-2641. 103. Gulledge J., Ahmad A., Steudler P.A., Pomerantz W.J., Cavanaugh C.M. Family- and genus-level 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes for ecological studies of methanotrophic bacteria.//Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 4726-4733. 104. Gupta V., Smemo K.A., Yavitt J.B., Basiliko N. Active Methanotrophs in Two Contrasting North American Peatland Ecosystems Revealed Using DNA-SIP// Microb. Ecol. 2012. V. 63. P. 438–445. 108 105. Halet D., Boon N., Verstraete W. Community dynamics of methanotrophic bacteria during composting of organic matter// J. Biosci. Bioeng. 2006. V. 101. P. 297–302. 106. Hanson R.S., Hanson T.E. Methanotrophic bacteria// Microbiol. Rev. 1996. V.60. № 2. P. 439-471. 107. Heyer J., Berger U., Hardt M., Dunfield P.F. Methylohalobius crimeensis gen. nov., sp. nov., a moderately halophilic, methanotrophic bacterium isolated from hypersaline lakes of Crimea// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. V. 55. P. 1817-1826. 108. Heyer J., Galchenko V.F., Dunfield P.F. Molecular phylogeny of type II methaneoxidizing bacteria isolated from various environments.// Microbiology. 2002. V. 148. P. 28312846. 109. Hirayama H., Suzuki Y., Abe M., Miyazaki M., Makita H., Inagaki F., Uematsu K., Takai K. Methylothermus subterraneus sp. nov., a moderately thermophilic methanotroph isolated from a terrestrial subsurface hot aquifer.// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2011. V. 61. P. 2646-2653. 110. Hirayama H., Fuse H., Abe M., Miyazaki M., Nakamura T., Nunoura T., Furushima Y., Yamamoto H., Takai K. Methylomarinum vadi gen. nov., sp. nov., a methanotroph isolated from two distinct marine environments// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2013. V. 63. P. 1073-1082. 111. Hoehler T.M., Alperin M.H., Albert D.B., Martens C.S. Field and laboratory studies of methane oxidation in an anoxic marine sediment: Evidence for a methanogen-sulfate reducer consortium// Glob. Biogeochem. Cycles. 1994. V. 8. P. 451-463. 112. Holmes A.J., Costello A., Lidstrom M.E., Murrell J.C. Evidence that particulate methane monooxygenase and ammonium monooxygenase may be evolutionarily related// FEMS Microbiol. Lett. 1995. V. 132. P. 203-208. 113. Holmes A.J., Owens N.J., Murrell J.C. Detection of novel marine methanotrophs using phylogenetic and functional gene probes after methane enrichment.// Microbiology. 1995. V. 141. P. 1947-1955. 114. Holmes A.J., Roslev P., McDonald I.R., Iversen N., Henriksen K., Murrell J.C. Characterization of methanotrophic bacterial populations in soils showing atmospheric methane uptake// Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 3312–3318. 109 115. Horz H.P., Rich V., Avrahami S., Bohannan B.J.M. Methaneoxidizing bacteria in a California upland grassland soil: diversity and response to simulated global change// Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. P. 2642–2652. 116. Horz H.P., Yimga M.T., Liesack W. Detection of methanotroph diversity on roots of submerged rice plants by molecular retrieval of pmoA, mmoX, mxaF, and 16S rRNA and ribosomal DNA, including pmoAbased terminal restriction fragment length polymorphism profiling// Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 4177–4185. 117. Horz H.P., Raghubanshi A.S., Heyer J., Kammann C., Conrad R., Dunfield P.F. Activity and community structure of methane-oxidizing bacteria in a wet meadow soil// FEMS Microbiol. Ecol. 2002. V. 41. P. 247–257. 118. Hou S., Makarova K.S., Saw J.H., Senin P., Ly B.V., Zhou Z., Ren Y., Wang J., Galperin M.Y., Omelchenko M.V., Wolf Y.I., Yutin N., Koonin E.V., Stott M.B., Mountain B.W., Crowe M.A., Smirnova A.V., Dunfield P.F., Feng L., Wang L., Alam M. Complete genome sequence of the extremely acidophilic methanotroph isolate V4, Methylacidiphilum infernorum, a representative of the bacterial phylum Verrucomicrobia.// Biol Direct. 2008. V.1. P. 3-26. 119. Hutchens E., Radajewski S., Dumont M.G., McDonald I.R., Murrell J.C. Analysis of methanotrophic bacteria in Movile Cave by stable-isotope probing// Environ. Microbiol. 2004. V. 6. P. 111–120. 120. Iguchi H., Yurimoto H., Sakai Y. Methylovulum miyakonense gen. nov., sp. nov., a type I methanotroph isolated from forest soil// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2011. V. 61. P. 810– 815. 121. Im J., Lee S.W., Yoon S., Dispirito A.A., Semrau J.D. Characterization of a novel facultative Methylocystis species capable of growth on methane, acetate and ethanol.// Environ. Microbiol. Rep. 2011. V. 3. P. 174-181. 122. Imhoff J. F. The phototrophic Alpha-Proteobacteria// Prokaryotes. 2006. V. 5. P. 4164. 110 123. Islam T., Jensen S., Reigstad L.J., Larsen O., Birkeland N.K. Methane oxidation at 55 degrees C and pH 2 by a thermoacidophilic bacterium belonging to the Verrucomicrobia phylum.// Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2008. V. 8. P. 300-304. 124. Jaatinen K., Tuittila E-S., Laine J., Yrjälä K., Fritze H. Methane-oxidizing bacteria in a Finnish raised mire complex: effects of site fertility and drainage// Microb. Ecol. 2005. V. 50. P. 429–439. 125. Jeon C.O., Park W., Padmanabhan P., DeRito C., Snape J.R., Madsen E.L. Discovery of a bacterium, with distinctive dioxygenase, that is responsible for in situ biodegradation incontaminated sediment// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 13591-13596. 126. Kalyuzhnaya M.G., Khmelenina V.N., Kotelnikova S., Holmquist L., Pedersen K., Trotsenko Y.A. Methylomonas scandinavica sp. nov., a new methanotrophic psychrotrophic bacterium isolated from deep igneous rock ground water of Sweden// Syst. Appl. Microbiol. 1999. V. 22. P. 565-572. 127. Kaluzhnaya M., Khmelenina V., Eshinimaev B., Suzina N., Nikitin D., Solonin A., Lin J-L., McDonald I., Murrell C., Trotsenko Y. Taxonomic characterization of new alkaliphilic and alkalitolerant methanotrophs from soda lakes of the Southeastern Transbaikal region and description of Methylomicrobium buryatense sp. nov.// Syst. Appl. Microbiol. 2001. V. 24. P. 166–176. 128. Kalyuzhnaya M.G., Makutina V.A., Rusakova T.G., Nikitin D.V., Khmelenina V. N., Dmitriev V.V., Trotsenko Y. A. Methanotrophic communities in the soils of the Russian Northern Taiga and Subarctic tundra// Mikrobiologiya. 2002. V. 71. P. 227–233. 129. Kalyuzhnaya M.G., Khmelenina V.N., Eshinimaev B., Sorokin D., Fuse H., Lidstrom M.E., Trotsenko Y.A. (2008) Classification of halo(alkali)philic and halo(alkali)tolerant methanotrophs provisionally assigned to the genera Methylomicrobium and Methylobacter and emended description of the genus Methylomicrobium// Int. J. Syst. Evol. Micr. 2008. V. 58. P. 591–596. 130. Khadem A.F., Pol A., Jetten M.S., Op den Camp H.J. Nitrogen fixation by the verrucomicrobial methanotroph ‘Methylacidiphilum fumariolicum’ SolV// Microbiology. 2010. V. 156. P. 1052–1059. 111 131. Khadem A.F., Pol A., Wieczorek A., Mohammadi S.S., Francoijs K.J., Stunnenberg H.G., Jetten M.S., Op den Camp H.J. Autotrophic methanotrophy in verrucomicrobia: Methylacidiphilum fumariolicum SolV uses the Calvin-Benson-Bassham cycle for carbon dioxide fixation.// J. Bacteriol. 2011. V. 193. P. 4438-3346. 132. Khadem A.F., van Teeseling M.C., van Niftrik L., Jetten M.S., Op den Camp H.J., Pol A. Genomic and physiological analysis of carbon storage in the verrucomicrobial methanotroph “Ca. Methylacidiphilum fumariolicum” SolV// Front. Microbiol. (2012a). 10.3389/fmicb.2012.00345. 133. Khadem A.F., Pol A., Wieczorek A.S., Jetten M.S., Op den Camp H.J. Metabolic regulation of ‘Ca. Methylacidiphilum Fumariolicum’ SolV cells grown under different nitrogen and oxygen limitations// Front. Microbiol. 2012b. V. 3. P. 266. 134. Khadem A.F., Wieczorek A.S., Pol A., Vuilleumier S., Harhangi H.R., Dunfield P.F., Kalyuzhnaya M.G., Murrell J.C., Francoijs K.J., Stunnenberg H.G., Stein L.Y., DiSpirito A.A., Semrau J.D., Lajus A., Médigue C., Klotz M.G., Jetten M.S., Op den Camp H.J. Draft genome sequence of the volcano-inhabiting thermoacidophilic methanotroph Methylacidiphilum fumariolicum strain SolV// J. Bacteriol. 2012c. V. 194. P. 3729–3730. 135. Khmelenina V.N., Kalyuzhnaya M.G., Starostina N.G., Suzina N.E., Trotsenko Y.A. Isolation and characterization of halotolerant alkaliphilic methanotrophic bacteria from Tuva Soda Lakes// Curr. Microbiol. 1997. V. 35. P. 257–261. 136. Khmelenina V.N., Kalyuzhnaya M.G., Sakharovsky V.G., Suzina N.E., Trotsenko Y.A., Gottschalk G. Osmoadaptation in halophilic and alkaliphilic methanotrophs// Arch. Microbiol. 1999. V. 172. P. 321–329. 137. Kim H.J., Graham D.W., DiSpirito A.A., Alterman M.A., Galeva N., Larive C.K., Asunskis D., Sherwood P.M. Methanobactin, a copper-acquisition compound from methaneoxidizing bacteria.// Science. 2004. V.10. P. 1612-1615. 138. Kip N., van Winden J., Pan Y., Bodrossy L., Reichart G.-J., Smolders A.J.P., Jetten M.S.M., Sinninghe Damsté J.S., Op den Camp H.J.M. Global prevalence of methane oxidation by symbiotic bacteria in peat-moss ecosystems// Nature. Geoscience. 2010. V. 3. P. 617-621. 139. Kip N., Dutilh B.E., Pan Y., Bodrossy L., Neveling K., Kwint M.P., Jetten M.S., Op den Camp H.J. Ultra-deep pyrosequencing of pmoA amplicons confirms the prevalence of 112 Methylomonas and Methylocystis in Sphagnum mosses from a Dutch peat bog// Env. Microb. Rep. 2011a. V. 3. P. 667–673. 140. Kip N., Ouyang W., van Winden J., Raghoebarsing A., van Niftrik L., Pol A., Pan Y., Bodrossy L., van Donselaar E.G., Reichart G.-J., Jetten M.S.M., Sinninghe Damsté J.S., Op den Camp H.J.M. Detection, isolation and characterization of acidophilic methanotrophs from Sphagnum mosses// Appl. Environ. Microbiol. 2011b. V. 77. P. 5643-5654. 141. Knief C., Kolb S., Bodelier P.L.E., Lipski A., Dunfield P.F. The active methanotrophic community in hydromorphic soils changes in response to changing methane concentration// Environ. Microbiol. 2006. V. 8. P. 321–333. 142. Knief C., Lipski A., Dunfield P.F. 2003. Diversity and activity of methanotrophic bacteria in different upland soils// Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 6703–6714. 143. Knief C., Vanitchung S., Harvey N.W., Conrad R., Dunfield P.F., Chidthaisong A. Diversity of methanotrophic bacteria in tropical upland soils under different land uses// Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. P. 3826–3831. 144. Knittel K., Boetius A. Anaerobic oxidation of methane: progress with an unknown process// Annu. Rev. Microbiol. 2009. V. 63.P. 311–334. 145. Kolb S., Knief K., Stubner S., Conrad R. Quantitative detection of methanotrophs in soil by novel pmoA-targeted real-time PCR assays.// Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 2423-2429. 146. Kolb S., Knief C., Dunfield P.F., Conrad R. Abundance and activity of uncultured methanotrophic bacteria involved in the consumption of atmospheric methane in two forest soils// Environ. Microbiol. 2005. V. 7. P. 1150–1161. 147. Leadbetter E.R., Foster J.W. Studies on some methane-utilizing bacteria.// Arch. Mikrobiol. 1958. V. 30. P. 91-118. 148. Lelieveld J., Crutzen P.J., Dentener F.J. Changing concentrations, lifetime and climate forcing of atmospheric methane// Tellus 50B. 1998. P. 128–150. 113 149. Lieberman R.L., Rosenzweig A.C. Biological methane oxidation: regulation, biochemistry, and active site structure of particulate methane monooxygenase// Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2004. V. 39. P. 147-164. 150. Lin J.L., Radajewski S., Eshinimaev B.T., Trotsenko Y.A., McDonald I.R., Murrell J.C. Molecular diversity of methanotrophs in Transbaikal soda lake sediments and identification of potentially active populations by stable isotope probing.// Environ. Microbiol. 2004. V. 6. P. 1049-1060. 151. Lin J.L., Joye S.B., Scholten J.C.M., Scha¨fer H., McDonald I.R, Murrell J.C. Analysis of methane monooxygenase genes in Mono Lake suggests that increased methane oxidation activity may correlate with a change in methanotroph community structure// Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. P. 6458–6462. 152. Lloyd K.G., Alperin M.J., Teske A. Environmental evidence for net methane production and oxidation in putative ANaerobic MEthanotrophic (ANME) archaea// Environ. Microbiol. 2011. V. 13. P. 2548–2564. 153. Ludwig W., Strunk O., Westram R., Richter L., Meier H., Yadhukumar Buchner A., Lai T., Steppi S., Jobb G., other authors. ARB: a software environment for sequence data// Nucleic. Acids. Res. 2004. V. 32. P. 1363-1371. 154. Lüke C., Krause S., Cavigiolo S., Greppi D., Lupotto E., Frenzel P. Biogeography of wetland rice methanotrophs// Environ. Microbiol. 2010. V. 12. P. 862–872. 155. Maclean L.C.W., Pray T.J., Onstott T.C., Brodie E.L., Hazen T.C., Southam G. Mineralogical, chemical and biological characterization of an anaerobic biofilm collected from a borehole in a deep gold mine in South Africa// Geomicrob. J. 2007. V. 24. P. 491-504. 156. Manefield M., Whiteley A.S., Griffiths R.I., Bailey M.J. RNA stable isotope probing, a novel means of linking microbial community function to phylogeny// Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. P. 5367-73. 157. Matthews E., Fung I. Methane emissions from natural wetlands: global distribution, area, and environmental characteristics of sources// Global. Biogeochem. Cycles. 1987. V. 1. P. 61-86. 114 158. Maxfield P.J., Hornibrook E.R.C., Evershed R.P. Estimating high-affinity methanotrpohic bacterial biomass, growth, and turnover in soil by phospholipid fatty acid 13Clabeling// Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72. P. 3901-3907. 159. McDonald I.R., Bodrossy L., Chen Y., Murrell J.C. Molecular ecology techniques for the study of aerobic methanotrophs.// Appl Environ Microbiol. 2008. V. 74. P. 1305-1315. 160. McDonald I.R., Hall G.H., Pickup R.W., Murrell J.C. Methane oxidation potential and preliminary analysis of methanotrophs in blanket bog peat using molecular ecology techniques// FEMS Microbiol. Ecol. 1996. V. 21. P. 197-211. 161. McDonald I.R., Kenna E.M., Murrell J.C. Detection of methanotrophic bacteria in environmental samples with the PCR// Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 61. P. 116-121. 162. McDonald I.R., Miguez C.B., Rogge G., Bourque D., Wendlandt K.D., Groleau D., Murrell J.C. Diversity of soluble methane monooxygenase-containing methanotrophs isolated from polluted environments// FEMS Microbiol. Lett. 2006. V. 255. P. 225–232. 163. McDonald I.R., Murrell J.C. The methanol dehydrogenase structural gene mxaF and its use as a functional gene probe for methanotrophs and methylotrophs// Appl. Environ. Microbiol. 1997a. V. 63. P. 3218-3224. 164. McDonald I.R., Murrell J.C. The particular methane monooxygenase gene pmoA and its use as a functional gene probe for methanotrophs// FEMS Microbiol. Lett. 1997b. V. 156. P. 205-210. 165. Meyer J., Haubold R., Heyer J., Böckel W. Contribution to the taxonomy of methanotrophic bacteria: Correlation between membrane type and GC-value// J. Basic. Microb. 1986. V. 26. P. 155–160. 166. Miguez C.B., Bourque D., Sealy J.A., Greer C.W., Groleau D. Detection and isolation of methanotrophic bacteria possessing soluble methane monooxygenase (sMMO) genes using the polymerase chain reaction (PCR)// Microb. Ecol. 1997. V. 33. P. 21–31. 167. Morris S.A., Radajewski S., Willison T.W., Murrell J.C. Identification of the functionally active methanotroph population in a peat soil microcosm by stable-isotope probing// Appl. Environ. Microbiol . 2002. V. 68. P. 1446–1453. 115 168. Murrell J.C., Gilbert B., McDonald I.R. Molecular biology and regulation of methane monooxygenase.// Arch. Microbiol. 2000. V. 173. P. 325-332. 169. Neufeld J.D., Schafer H., Cox M.J., Boden R., McDonald I.R., Murrell J.C. Stableisotope probing implicates Methylophaga spp. and novel Gammaproteobacteria in marine methanol and methylamine metabolism// ISME J. 2007. V. 1. P. 480–491. 170. Nguyen H.H., Shiemke A.K., Jacobs S.J., Hales B.J., Lidstrom M.E., Chan S.I. The nature of the copper ions in the membranes containing the particulate methane monooxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath)// J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 14995–15005. 171. Nguyen H.T., Elliott S.J., Yip J.H., Chan S.I. The particulate methane monooxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath) is a novel copper-containing three-subunit enzyme// J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 7957–7978. 172. Ogiso T., Ueno C., Dianou D., Van Huy T., Katayama A., Kimura M., Asakawa S. Methylomonas koyamae sp. nov., a type I methane-oxidizing bacterium from floodwater of a rice paddy field in Japan// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2012. V. 62. P. 1832-1837. 173. Op den Camp H.J.M., Islam T., Stott M.B., Harhangi H.R., Hynes A., Schouten S., Jetten M.S.M., Birkeland N-K., Pol A., Dunfield P.F. Minireview: Environmental, genomic, and taxonomic perspectives on methanotrophic Verrucomicrobia// Environ. Microbiol. Rep. 2009. V. 1. P. 293-306. 174. Owen R.J., Lapage S.P., Hill L.R. Determination of base composition from melting profiles in dilute buffers// Biopolymers. 1969. V. 7. P. 503-516. 175. Pacheco-Oliver M., McDonald I.R., Groleau D., Murrell J.C., Miguez C.B. Detection of methanotrophs with highly divergent pmoA genes from Arctic soils// FEMS Microbiol. Lett. 2002. V. 209. P. 313–319. 176. Panikov N.S. Fluxes of CO2 and CH4 in High Latitude Wetlands: Measuring, Modeling and Predicting Response to Climate Change// Polar Res. 1999. V. 18. P. 237–244. 177. Patt T.E., Cole G.C., Bland J., Hanson R.S. Isolation and characterization of bacteria that grow on methane and organic compounds as sole sources of carbon and energy// J. Bacteriol. 1974. V. 120 (2). P. 955–964. 116 178. Pester M., Friedrich M.W., Schink B., Brune A. pmoA-based analysis of methanotrophs in a littoral lake sediment reveals a diverse and stable community in a dynamic environment.// Appl. Environ. Microbiol. 2004. V.70. P. 3138-3142. 179. Pol A., Heijmans K., Harhangi H.R., Tedesco D., Jetten M.S., Op den Camp H.J. Methanotrophy below pH 1 by a new Verrucomicrobia species.// Nature. 2007. V. 6. P. 874878. 180. Radajewski S., Ineson P., Parekh N.R., Murrell J.C. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology// Nature. 2000. V. 403. P. 646-649. 181. Radajewski S., Webster G., Reay D.S., Morris S.A., Ineson P., Nedwell D.B., Prosser J.I., Murrell J.C. 2002. Identification of active methylotroph populations in an acidic forest soil by stable-isotope probing// Microbiology. 2002. V. 148. P. 2331–2342. 182. Raghoebarsing A.A., Pol A., van de Pas-Schoonen K.T., Smolders A.J., Ettwig K.F., Rijpstra W.I., Schouten S., Damsté J.S., Op den Camp H.J., Jetten M.S., Strous M. (2006) A microbial consortium couples anaerobic methane oxidation to denitrification// Nature. 2006. V. 440. P. 918–921. 183. Rahalkar M., Bussmann I., Schink B. Methylosoma difficile gen. nov., sp. nov., a novel methanotroph enriched by gradient cultivation from littoral sediment of Lake Constance.// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. V. 57. P. 1073-1080. 184. Reeburgh W.S. Methane consumption in cariaco trench waters and sediments// Earth and Planet. Sci. Lett. 1976. V. 28. P. 337-344. 185. Reeburgh W. Anaerobic methane oxidation: Rate depth distributions in Skan Bay sediments// Earth. Planet. Sci. Lett. 1980. V. 4. P. 345-352. 186. Reynolds E. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy// J. Cell. Biol. 1963. V. 17. P. 208-212. 187. Shigematsu T., Hanada S., Eguchi M., Kamagata Y., Kanagawa T., Kurane R. Soluble methane monooxygenase gene clusters from trichloroethylene-degrading Methylomonas sp. strains and detection of methanotrophs during in situ bioremediation// Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 5198–5206. 117 188. Shishkina V.N., Trotsenko Y.A. Multiple methabolic lesions in obligate methanotrophic bacteria// FEMS Microbiol. Lett. 1982. V. 13. № 2. P. 237-242. 189. Shishkina V.N., Trotsenko Y.A. Pathways of ammonia assimilation in obligate methane-utilizers// FEMSMicrobiol. Lett. 1979. V. 5. № 2. P. 187-191. 190. Semrau J.D., Chistoserdov A., Lebron J., Costello A., Davagnino J., Kenna E., Holmes A.J., Finch R. Particulate methane monooxygenase genes in methanotrophs.// J. Bacteriol. 1995. V. 177. P. 3071-3079. 191. Semrau J.D., DiSpirito A.A., Yoon S. Methanotrophs and copper.// FEMS Microbiol. Rev. 2010. V. 34. P. 496-531. 192. Serkebaeva Y.M., Kim Y., Liesack W., Dedysh S.N. Pyrosequencing-based assessment of the bacteria diversity in surface and subsurface peat layers of a northern wetland, with focus on poorly studied phyla and candidate divisions.// PLoS One. 2013. V. 8. e63994. 193. Sidorova T.N., Makhneva Z.K., Puchkova N.N., Gorlenko V.M., Moskalenko A.A. Characteristics of photosynthetic apparatus of Thiocapsa strain BM3 containing okenone as the main carotenoid// Microbiology (English translation of Mikrobiologiia). 1998. V. 67. P. 199– 206. 194. Singleton D.R., Powell S.N., Sangaiah R., Gold A., Ball L.M., Aitken M.D. Stableisotope probing of bacteria capable of degrading salicylate, naphthalene, or phenanthrene in a bioreactor treating contaminated soil// Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. P. 1202-1209. 195. Sinninghe Damste J.S., Strous M., Rijpstra W.I.,Hopmans E.C., Geenevasen J.A., van Duin A.C., van Niftrik L.A., Jetten M.S. Linearly concatenated cyclobutane lipids form a dense bacterial membrane// Nature. 2002. V. 419 (6908). P. 708-712. 196. Snaidr J., Amann R., Huber I., Ludwig W., Schleifer K.-H. Phylogenetic analysis and in situ identification of bacteria in activated sludge// Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 2884–2896. 197. Sorokin D.Y., Jones B.E., Kuenen J.G. An obligate methylotrophic, methaneoxidizing Methylomicrobium species from a highly alkaline environment.// Extremophiles. 2000. V. 4. P. 145-155. 118 198. Söhngen N.L. Uber bakterien, welche methan ab kohlenstoffnahrung and energiequelle gebrauchen// Parasitenkd. Infectionskr. 1906. V. 15. P. 513–517. 199. Stahl D.A., Amann R. Development and application of nucleic acid probes// In E. Stackebrandt and M. Goodfellow (ed.), Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. 1991. Wiley, New York, N.Y. P. 205-248. 200. Stoecker K., Bendinger B., Schöning B., Nielsen P.H., Nielsen J.L., Baranyi C., Toenshoff E.R., Daims H., Wagner M. Cohn's Crenothrix is a filamentous methane oxidizer with an unusual methane monooxygenase// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 7. P. 23632367. 201. Stolyar S., Costello A.M., Peeples T.L., Lidstrom M.E. Role of multiple gene copies in particulate methane monooxygenase activity in the methane-oxidizing bacterium Methylococcus capsulatus Bath.// Microbiology. 1999. V. 145. P. 1235-1244. 202. Taylor S.C. Evidence for the presence of ribulose-1.5-bisphosphate carboxylase and phosphoribulokinase in Methylococcus capsulatus (Bath)// FEMS Microbiol. Lett. 1977. V. 2. P. 305-307. 203. Taylor S., Dalton H., Dow C. Ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase and carbon assimilation in Methylococcus capsulatus (Bath)// J. of Gen. Microbiol. 1981. V. 122. P. 89-94. 204. Teira E., Reinthaler T., Pernthaler A., Pernthaler J., Herndl G.J. Combining catalyzed reporter deposition-fluorescence in situ hybridization and microautoradiography to detect substrate utilization by bacteria and Archaea in the deep ocean.// Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. P. 4411-4414 205. Thauer R.K., Kaster A.K., Seedorf H., Buckel W., Hedderich R. Methanogenic archaea: ecologically relevant differences in energy conservation.// Nat. Rev. Microbiol. 2008. V. 6. P. 579-591. 206. Thauer R.K., Shima S. Methane as fuel for anaerobic microorganisms.// Ann. N.Y. Acad. Sci. 2008. V. 1125. P. 158–170. 119 207. Tsubota J., Eshinimaev B.Ts., Khmelenina V.N., Trotsenko Y.A. Methylothermus thermalis gen. nov., sp. nov., a novel moderately thermophilic obligate methanotroph from a hot spring in Japan// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. V. 55. P. 1877-84. 208. Vigliotta G., Nutricati E., Carata E., Tredici S.M., De Stefano M., Pontieri P., Massardo D.R., Prati M.V., De Bellis L., Alifano P. Clonothrix fusca Roze 1896, a filamentous, sheathed, methanotrophic gamma-proteobacterium// Appl. Environ. Microbiol. 2007. V.73. P. 3556-3565. 209. Vorobev A.V., Baani M., Doronina N.V., Brady A.L., Liesack W., Dunfield P.F., Dedysh S.N. Methyloferula stellata gen. nov., sp. nov., an acidophilic, obligately methanotrophic bacterium that possesses only a soluble methane monooxygenase// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2011. V. 61. P. 2456-2463. 210. Ward N., Larsen Ø., Sakwa J., Bruseth L., Khouri H., Durkin A.S., Dimitrov G., Jiang L., Scanlan D., Kang K.H., Lewis M., Nelson K.E., Methé B., Wu M., Heidelberg J.F., Paulsen I.T., Fouts D., Ravel J., Tettelin H., Ren Q., Read T., DeBoy R.T., Seshadri R., Salzberg S.L., Jensen H.B., Birkeland N.K., Nelson W.C., Dodson R.J., Grindhaug S.H., Holt I., Eidhammer I., Jonasen I., Vanaken S., Utterback T., Feldblyum T.V., Fraser C.M., Lillehaug J.R., Eisen J.A. Genomic insights into methanotrophy: the complete genome sequence of Methylococcus capsulatus (Bath).// PLoS Biol. 2004. V. 2. P. 303. 211. Wang J.S., Logan J.A., McElroy M.B., Duncan B.N., Megretskaia I.A., Yantosca R.M. A 3-D model analysis of the slowdown and interannual variability in the methane growth rate from 1988 to 1997// Global Biogeochem Cycles. 2004. V. 18. B3011. doi:10.1029/ 2003GB002180. 212. Wartiainen I., Hestnes A.G., McDonald I.R., Svenning M.M. Methylobacter tundripaludum sp. nov., a methane-oxidizing bacterium from Arctic wetland soil on the Svalbard islands, Norway (78 degrees N).// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. V. 56. P. 109-113. 213. Weisburg W.G., Barns S.M., Pelletier D.A., Lane D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study// J. Bacteriol. 1991. V. 173. P. 697–703. 120 214. Whiteley A.S., Manefield M., Lueders T. Unlocking the 'microbial black box' using RNA-based stable isotope probing technologies// Curr. Opin. Biotechnol. 2006. V. 17. P. 67-71. 215. Wilson K.H., Wilson W.J., Radosevich J.L., DeSantis T.Z., Viswanathan V.S., Kuczmarski T.A., Andersen G.L. High-density microarray of small-subunit ribosomal DNA probes.// Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. P. 2535-2541. 216. Wise M.G., McArthur J.V., Shimkets L.J. Methanotroph diversity in landfill soil: isolation of novel type I and type II methanotrophs whose presence was suggested by cultureindependent 16S ribosomal DNA analysis// Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 48894897. 217. Whittenbury R., Phillips K.C., Wilkinson J.F. Enrichment, isolation and some properties of methane-utilizing bacteria// J. Gen. Microbiol. 1970. V. 61. P. 205-218. 218. Whittenbury R., Krieg N.R. (1984). Genus II. Methylomonas, In Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology 1st ed. vol.1, pp. 260-261. Edited by N. R. Krieg & J. G. Holt. Baltimore: Williams & Wilkins Co. 219. Wolin E.A., Wolin M.G., Wolfe R.S. Formation of methane by bacterial extracts// J. Biol. Chem. 1963. V. 238. P. 2882–2886. 220. Wu M.L., Ettwig K.F., Jetten M.S., Strous M., Keltjens J.T., van Niftrik L. (2011) A new intra-aerobic metabolism in the nitrite-dependent anaerobic methane-oxidizing bacterium Candidatus ‘Methylomirabilis oxyfera’// Biochem. Soc. Trans. 2011. V. 39. P. 243–248. 221. Wu M.L., van Teeseling M.C., Willems M.J., van Donselaar E.G., Klingl A., Rachel R., Geerts W.J., Jetten M.S., Strous M., van Niftrik L. Ultrastructure of the denitrifying methanotroph ‘Candidatus Methylomirabilis oxyfera,’ a novel polygon-shaped bacterium// J. Bacteriol. 2012. V. 194. P. 284–291. 222. Yimga Т.M., Dunfield P.F., Ricke P., Heyer J., Liesack W. Wide distribution of a novel pmoA-like gene copy among type II methanotrophs, and its expression in Methylocystis strain SC2.// Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 5593-5602. 121 223. Zahn J.A., DiSpirito A.A. Membrane-associated methane monooxygenase from Methylococcus capsulatus (Bath)// J. Bacteriol. 1996. V. 178. P. 1018-1029. 224. Zehr J.P., McReynolds L.A. Use of degenerate oligonucleotides for amplification of the nifH gene from the marine cyanobacterium Trichodesmium thiebautii// Appl. Environ. Microbiol. 1989. V. 55. P. 2522-2526. 122
