МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТОДЫ (ГИБРИДИЗАЦИЯ С ДНК

1
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТОДЫ
(ГИБРИДИЗАЦИЯ С ДНК-ЗОНДАМИ)
ДЛЯ УСКОРЕННОГО СКРИНИНГА
ПАЦИЕНТОВ
С ПОВЫШЕННОМ РИСКОМ РАЗВИТИЯ
МУЛЬТИРЕЗИСТЕНТНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА
ОФИЦИАЛЬНЫЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ВОЗ
Женева, 27 июня 2008 г.
2
1. Основные предпосылки
Туберкулез
с
множественной
лекарственной
устойчивостью
(МЛУ
ТБ)
представляет собой серьезную проблему для здравоохранения в связи со сложностью
его диагностики и лечения. Согласно оценкам ВОЗ, заболеваемость МЛУ ТБ составляет
около 490 000 случае в год по всему миру, что составляет около 5% всех случаев
туберкулеза. Проблема, однако, состоит в том, что вследствие различных проблем в
лабораторной диагностике, в настоящее время, диагностируются лишь менее 5%
случаев МЛУ ТБ.
Значительный рост распространенности МЛУ ТБ и возникновение
сверхустойчивых штаммов микобактерий (XDR TB), риск распространения устойчивых
штаммов среди пациентов лечебных учреждений, а также очень высокие уровни
смертности среди пациентов, инфицированных одновременно ВИЧ и МЛУ ТБ (либо XDRTB) привели к необходимости скорейшей разработки и внедрения методов ускоренного
скрининга лекурственной устойчивости (ЛУ).
Существуюшие тесты на лекарственную чувствительность (ТЛЧ), основанные на
применении бактериологических методов, включают в себя процедуры выделения
культур микобактерий из клинического материала, их идентификации с последующей
диагностикой лекарственной чувствительности in vitro, что является весьма сложным и
длительным процессом. Длительность лабораторных исследований ведет к назначению
неадекватной терапии и, как следствие, развитию лекарственной устойчивости и
продолжению распространения ЛУ штаммов микобактерий. В настоящее время идет
активная разработка новых ускоренных молекулярно-генетических методов диагностики
ЛУ. Среди последних наиболее эффективными признаны методы, основанные на
гибридизации с ДНК-зондами (MLPA).
Технология MLPA включает следующие этапы:
- ВыделениеДНК из культур M.tuberculosis либо непосредственно клинического
материала;
- Полимеразная цепная реакция (ПЦР) с применением праймеров, меченых
биотином, для амплификации фрагментов генов, ассоциированных с лекарственной
устойчивостью;
-
Гибридизация
биотин-меченых
ПЦР-продуктов
с
ДНК-зондами,
иммобилизированными на мембранах (полосках, изголовленных их нейлона либо
аналогичных материалов).
3
- визуализация
результатов гибридизации, при этом детектируется наличие
микобактерий комплекса M.tuberculosis, а также наличие либо отсутствия мутаций в
исследуемых генах. Учет резальтатов проивзодится по наличие либо отсутствию
цветных полосок на мембранах, соответствующих зондам дикого типа либо мутантным.
В состав ДНК-зондов включены зонды «дикого типа» (без мутаций), а также зонды
для детекции наиболее часто встречающихся мутаций. Если в исследуемых фрагментах
генов присутствует мутация, то «мутантный» ПЦР-продукт не свяжется с зондом «дикого
типа», присутствующим на мембране. Таким образом, детекция мутаций производится
по отсутствию сигнала одного или нескольких зондов дикого типа, а также,
дополнительно, по присутствию сигнала от одного или нескольких «мутантных» зондов.
2. Обоснование применения методов MLPA
2.1 Процесс.
Экспертная группа по оценке эффективности использования MLPA и выработке
официальных рекомендаций ВОЗ была создана в марте 2008 г. под эгидой ВОЗ и
Специальной Программы ЮНИСЕФ и Всемирного Банка по Исследованиям в области
Тропических Болезней. В процессе работы группы были изучены имеющиеся
публикации, а также результаты демонстрационных проектов в различных странах, и
проектов по оптимизации и валидации результатов исследований с целью оценки
чувствительности, специфичности и эффективности применения MLPA в различных
условиях. В ходе работы также оценивались требования к оснащению лабораторий, и
квалификации персонала, необходимые для внедрения указанных тест-систем, а также
выявлялись недостатки и недоработки.
Всестороннее
изучение
результатов
опубликованных
работ
позволило
установить, что к настоящему времени доказана эффективность применения ОБОИХ
имеющихся на рынке
коммерческих тест-систем, использующих принцип MLPA.
Детальная информация по данным тест-системам защищена патентами, однако сама
технология MLPA является открытой.
Лабораторные тесты, результаты которых предполагается использовать для
рекомендаций
по
использованием
удовлетворяющих
лечению
тест-систем,
заданным
пациентов,
успешно
критериям
должны
выполняться
прошедших
и
исключительно
всестороннюю
предназначенным
для
с
апробацию,
целевого
использования. Экспертной группой установлено, что обе коммерческие тест-системы
4
сертифицированы по стандарту ISO 13485:2003, качество их компонентов и самих
систем тщательно контролируется, и они предназначены для целевого использования в
определенных
условиях.
Обе
тест-системы
также
одобрены
Европейской
Сертификационной Комиссией (маркировка CE) для использования в Европе и во всем
мире.
Некоммерческие
MPLA
тест-системы,
разработанные
в
ряде
научно-
исследовательских учреждений, не прошли соответствующей апробации и/или внешнего
котроля качества, вследствие чего из использование в клинико-диагностических целях
НЕ РЕКОМЕНДУЕТСЯ.
Экспертная группа предполагает, что в будущем будут разработаны и появятся на
рынке другие (помимо указанных двух) коммерческие MPLA тест-системы. Такие
системы должны будут пройти аналогичную всестороннюю апробацию и валидацию,
прежде чем они могут быть рекомендованы ВОЗ для клинического применения.
2.2 Результаты
Опубликованные данные систематических обзоров и всестороннего анализа
эффективности MPLA по сравнению с традиционными методами ТЛЧ демонстрируют
высокую чувствительность (≥97%) и специфичность (≥99%) данных тестов для
диагностики резистентности либо только к рифампицину либо в сочетании его с
изониазидом (чувствительность и специфичность ≥90% и ≥99% соответственно) на
материале культур M.tuberculosis либо БК+ образцах мокроты. Точность определения
МЛУ ТБ также была высокой (99%) как при определении чувствительности к обоим
препаратам, так и при использовании резистентности к рифампицину как маркера МЛУ
ТБ. Эти данные были подтверждены результатами лабораторных исследований и
демонстрационных проектов в ряде стран мира, прежде всего в ходе крупномасштабного
исследования в ЮАР, проводимого Фондом Инновационных Методов Диагностики (FIND)
в сотрудничестве с Советом по Медицинским Исследованиям и Национальной
Лабораторной Службой ЮАР.
Результаты вышеуказанного проекта также продемонстрировали успешную
применимость и эффективность рутинного использования тест-систем MLPA в крупных
лабораториях
систем
общественного
здравоохранения.
Экономия
средств,
продемонстрированная в ходе детального экономического анализа применения систем
MLPA
в
ЮАР,
составила
от
30
до
50%
по
сравнению
с
традиционными
бактериологическими методами ТЛЧ. Как и предполагалось, наибольшая экономия
5
средств
была
достигнута
при
применении
тест-систем
для
диагностики
ЛУ
непосредственно на клиническом материале (БК+ мокроте).
Экономическая
эффективность
внедрения
систем
ускоренного
скрининга,
естественно, в значительной степени зависит от местных условий и, в частности,
применяемых алгоритмов скрининга пациентов и лабораторной диагностики. Полный
анализ экономической и клинической эффективнjсти внедрения систем MLPA будет
возможен только после окончания крупномасштабных
лабораториях
различных
стран.
Помимо
демонстрационных проектов в
непосредственного
улучшения
эпидемиологических показателей (уменьшения смертности и заболеваемости, а также
предотвращения распространения МЛУ ТБ), включение систем MLPA в алгоритмы
скрининга и диагностики ЛУ
позволит упростить лабораторную инфраструктуру и
снизить затраты на оснащение и оборудование лабораторий.
Таким образом, Экспертная группа пришла к выводу о том, что имеющиеся к
настоящему времени данные позволяют рекомендовать широкомасштабное внедрение
коммерческих тест-систем для диагностики МЛУ ТБ, основанных на принципе MLPA, на
национальном уровне. В дальнейшем, на основе вновь полученных данных, для
отдельных стран рекомендации могут быть дополнены с учетом национальной
специфики.
Молекулярные MLPA тест-системы не могту полностью заменить существующие
традиционные методы диагностики ЛУ, так как последние необходимы для выявления
микобактерий у пациентов с отрицательным мазком, а также для выявления XDR TB. В
то же время, внедрение систем MLPA позволит значительно снизить потребность в
культивировании
микобактерий
и
выполнении
ТЛЧ
с
помошью
традиционных
бактериологических методов.
3. Рекомендации по внедрения молекулярно-генетических методов
Внедрение
MLPA
тест-систем,
равно
как
и
любого
другого
нового
диагностического метода, не может быть успешным без соблюдения ряда условий.
Таковые включают в себя:
3.1 Забор клинических образцов, их хранение и транспортировка:
Качество образцов мокроты является чрезвачайно важным фактором для
получения надежных результатов при тестировании с помошью MLPA тест-систем
6
(равно как и других методов). Хотя, в противоположность бактериологическим методам,
молекулярные методы не столь чувствительны к контаминации образцов (вследствие
неправильного/длительного хранения и транспортировки), необходимо стремиться к
максимально быстрой доставке образца в лабораторию, что позволяет сократить время
до получения результата и, таким образом, в полной мере использовать преимущества
экспресс-диагностики.
В связи с рекомендациями ВОЗ относительно необходимости тестирования
ЛЮБОГО МЛУ-ТБ штамма на чувствительность к резервным препаратам (с целью
идентификации XDR TB), при заборе, транспортировке и хранении образцов мокроты
необходимо в любом случае придерживаться стандартных рекомендаций относительно
предотвращения контамиации. Таким образом, если в лаборатории предполагается
производить бактериологические ТЛЧ к препаратам второго-третьего рядов на образцах
мокроты, в которых были обнаружены МЛУ-ТБ, необходимо обеспечить хранение
мокроты и ускоренную доставку образцов мокроты в в условиях охлаждения.
3.2 Техника безопасности
Использование молекулярных методов включает разжижение, деконтаминацию и
концентрацию
клинического
материала,
с
последующим
выделением
ДНК.
Гомогенизирование и центрифугирование мокроты представляют потенциальный риск
образования аэрозолей, содержащих микобактерии, что ведет к риску инфицирования, а
также возможности перекрестной контаминации образцов. Таким образом, первичная
обработка
мокроты
должна
проводиться
ИСКЛЮЧИТЕЛЬНО
в
лабораториях,
оснащенных в соответствии с тербованиям техники безопасности.
Существующие
рекомендации
ВОЗ
требуют,
чтобы
обработка
мокроты
производилась в ламинар-боксах в лабораториях, оснащенных по меньшей мере по
категории 2, в то время как любый манипуляции с культурами микобактерий
(идентификация, инокуляция на питательные среды, выделение чистых культур,
выполнение ТЛЧ) разрешаются только в лабораториях категории 3. Применительно к
тест-системам MLPA это означает, что обработка мокроты и выделение ДНК для
выполнения теста на мокроте должны производиться в лаборатории категории 2, в то
времч как выполнения теста на материале культур должно проивходиться в лаборатории
категории 3.
Получены предварительные данные о том, что молекулярные тесты могут
выполняться и давать воспроизводимые результаты на ДНК экстрактах, выделенных из
7
предварительно
инактивированных
(дезинфицированных)
образцпх
мокроты;
преимуществом такого подхода является, безусловно, отсутствие необходимости в
оборудовании лаборатории по меньшей мере по стандартам категории 2. Тем не менее,
в настоящее время отсутствуют данные, позволяющие однозначно рекомендовать
практику инактивации мокроты перед отправкой ее в лабораторию. Кроме того, такая
обработка мокроты делает невозможным дальнейшее выполнение бактериологических
исследований, выделение микобактерий из образцов БК- мокроты и тестирование МЛУТБ изолятов на чувствительность к резервным препаратам, как того требуют
существующие рекомендации ВОЗ (см. выше).
В связи с тем, что в процессе денатурации нагреванием происходит полная
инактивация образца, после окончания выделения ДНК образец мокроты не содержит
жизнеспособных микроорганизмов и дальнейшие манипуляции с ним могут проводиться
вне
ламинар-боксов.
Тем
не
менее,
особое
внимание
должно
уделяться
предотвращению контаминации образцов ампликонами (продуктами ПЦР предыдущих
реакций)
путем
тщательной
обработки
специальными
реактивами
и
строгому
следованию протоколам исследований.
3.3 Устройство лаборатории
Критически важным для эффективности использования систем MLPA является
предотвращение
перекрестной
контаминации
ампликонами.
Эффективное
предотвращение контаминации может быть достигнуто разделением помещения на
отдельные зоны для 1) выделения ДНК, 2) приготовления ПЦР-смеси, 3) выполнения
ПЦР-амплификации и гибридизации, и 4) интерпретации результатов.
Ограниченный
доступ в эти помещения и обеспечение однонаправленного потока образцов и
персонала
через
помещения
также
значительно
снижает
риск
контаминации.
Тщательная уборка помещений после каждого использования является абсолютно
необходимой.
Вследствие недостаточной площади лаборатории разделения помещения на 4
зоны может оказаться невозможным. В таком случае минимальным требованием
является разделение трех зон, соответствующих различным этапам ПЦР-диагностики:
одной для выделения ДНК, одной для приготовления ПЦР-смеси (пре-ПЦР) и одной для
амплификации и интерпретации результатов (пост-ПЦР). Эти помещения необязательно
должны быть большими, так как размеры оборудования для молекулярно-генетической
диагностики невелики. В этом случае разграничение доступа в помещения, соблюдение
8
правильного направления движения образцов и персонала, а также тщательная уборка
помещения является критически важным для получения надежных результатов
диагностических тестов.
В большинстве лабораторий внедрение систем MLPA может потребовать
модернизации и/или изменения устройства и организации работы лаборатории.
Вследствие этого, перед внедрением молекулярных методов, необходимо тщательное
планирование и обсуждение всех вопросов, связанных в материальными ресурсами,
персоналом, рабочим временем и наличием соответствующих помещений.
3.4 Электроснабжение и устройства бесперебойного электропитания
Компоненты MLPA тест-систем должны храниться в холодильнике либо в
замороженном виде; точное соблюдение температурных параметров также является
критическим для этапов амплификации и гиьридизации. Вследствие этого наличие
источников бесперебойного электропитания является необходимым условием при
выполнении ПЦР и гибридизации с использованием автоматических систем для
предотвращения сбоев в работе аппаратуры и получения качественных результатов.
Таким образом, сбои в электроснабжении лаборатории могут негативно сказаться
на использовании MLPA тест-систем. В этой связи настоятельно рекомендуется
подключение электроснабжения с использованием электрогенераторов либо других
источников бесперебойного питания.
3.5 Качество реагентов и сроки хранения
Для
необходимо
обеспечения
применение
высокого
воды
качества
высокой
молекулярно-генетических
степени
чистоты
(«для
анализов
молекулярных
исследований») и высококачественной Taq полимеразы. Качество данных реагентов
может влиять на результаты работы MLPA тест-систем, в связи с чем настоятельно
рекомендуется проверка качества указанных реактивов перед использованием их в
анализе.
Относительно короткие сроки хранения тест-систем являются потенциальной
проблемой, особенно для лабораторий расположенных в удаленных областях и в
странах, где таможенное оформление импортируемых тест-систем может занять
длительное время. В связи с этим необходимо внедрение систем учета поставок и
контроля использования реагентов, с тем, чтобы новые реагенты заказывались
заблаговременно.
9
3.6 Оборудование
Помимо оборудования, необходимого для первоначальной обработки образцов
мокроты, т.е. разжижения и деконтаминации (ламинар-боксы и центрифуги), для
выполнения
тестов
с
применением
систем
MLPA
необходимо
специальное
оборудование, включающее амплификаторы, шейкеры (вращающиеся платформы),
водяные бани, источник ультразвука, настольные микроцентрифуги, гибридизационные
печи,
холодильники
и
морозильные
камеры,
микропипетки;
необходимы
также
расходные материалы, например, лабораторный пластик, наконечники для пипеток и
микропробирки. Как правило, это оборудование и расходные материалы можно заказать
у местных компаний.
Перед
оформлением
производителями
заказа
тест-систем
MLPA
рекомендуется
по
поводу
проконсультироваться
совместимости
с
заказанного
оборудования и используемыми тест-системами. При внедрении систем необходимо
учитывать время, необходимое для доставки и установки оборудования в лаборатории.
Определенные
приборы,
например
инкубаторы
и
автоматизированные
гибридизационные системы, были разработаны специально для имеющихся на рынке
коммерческих MLPA тест-систем. Такие приборы были разработаны для обеих
рекомендуемых в данном руководстве тест-систем.
Ручная обработка мембран рекомендуется для лабораторий, в
выполняется
относительно
Автоматизированные
небольшое
системы
для
количество
лабораторных
гибридизации
требуют
которых
исследований.
значительных
капитовложений, однако они позволяют обрабатывать до 48 мембран одновременно и
значительно (до 2-3,5 часов) сократить время, требуемое для гибридизации. Таким
образом, такие приборы могут с успехом использоваться в крупных оабораториях,
обрабатывающих значительное количество образцов.
3.7 Обучение персонала
Успех внедрения молекулярно-генетических тест-систем в лаборатории во
многом зависит от квалификации ее сотрудников и построения успешной системы
руководства лабораторными исследованиями. Результаты демонстрационных проектов
в ЮАР показали, что MLPA тест-системы могут быть успешно внедрены в крупных
лабораториях с большим количеством сотрудников; однако успех работы в значительной
степени будет зависеть от квалификации персонала, их обучения, строгого соблюдения
10
персоналом рекомендуемых протоколов исследований и методических рекомендаций,
включая тщательную уборку помещений и однонаправленное движение материала и
персонала в молекулярной лаборатории.
В связи с высокими требованиями, предъявляемыми к квалификации сотрудников
лаборатории, выполняющей молекулярно-генетические исследования, перед началом
внедрения указанных систем необходимо рассмотреть все вопросы, связанные с
набором новых и обучением имеющихся сотрудников. Следует отметить, что в
большинстве
опубликованных
исследованиями
работ
руководство
молекулярно-генетическими
осуществлялось сотрудниками с высшим образоваием, имеющими
опыт работы в молекулярно-генетической лаборатории.
Интерпретация результатов молекулярно-генетических тестов требует особого
внимания в связи со сложностью чтения и расшифровки картины гибридизации (полос)
на мембранах. Особые трудности может представлять чтение результатов образцов с
редкими мутациями, а также при наличии смешанных популяций микобактерий в
исследуемом образце. Определенные навыки для чтения результатов гибридизации
могут быть получены при первоначальном обучении, однако сложные случаи (редкие
мутации, смешанные популяции микроорганизмов) могут потребовать консультации
(технической поддержки) производителем либо руководителя лаборатории. В связи с
этим залогом успешной работы является регулярное повышение квалификации
сотрудников лаборатории и наблюдение за качеством выполняемых исследований со
стороны руководителя, имеющего значительный опыт работы с молекулярными тестсистемами.
3.8 Техническая поддержка.
Чрезвачайно
важным
фактором
обеспечения
бесперебойной
поставки
оборудования, реактивов и расходных материалов является координация действий
лаборатории с фирмами-поставщиками тест-систем. Кроме того, такое взаимодействие
позволяет минимизировать или избежать задержек груза на таможне; в связи с тем, что
чаще всего таможенные склады не оборудованы холодильниками, любая задержка
может вызвать порчу дорогостоящих реактивов.
Перед началом использования MLPA тест-систем в лаборатории должен быть
разработан план тренинга персонала с учетом специфики страны и уровня подготовки
персонала.
Обучение
национальных
может
быть
фирм-дистрибьютеров,
организовано
либо
иных
силами
фирмы-производителя,
аккредитованных
компаний,
в
11
зависимости от месторасположения лаборатории и иных местных условий. Тренинг
персонала должен быть организован и проведен заранее, до начала поставок
оборудования и реактивов.
Наиболее
эффективным
условием
обеспечения
бесперебойных
поставок
оборудования, реактивов и расходных материалов одновременно со своевременной
технической поддержкой является заключение формального сервисного котракта с
фирмой-производителем. Рекомендуется, чтобы котракт включал в себя следующие
пункты:
- регулярное техническое обслуживание приборов, включая ремонт и замену
неисправного оборудования в сжатые сроки;
- бесперебойную поставку тест-систем и расходных материалов со сроком
хранения не менее 6 месяцев на момент поставки;
- подробный план предоставления технической поддержки, включая способы
такой поддержки (через местного дистрибьютора, по телефону, через Интернет и т.д.)
3.9 Система контроля качества
Исключительно высокая чувствительность молекулярно-генетических методов
диагностики, основанных на применении ПЦР делает их также очень чувствительными к
ДНК-контаминации,
так
как
даже
ничтожные
количества
ДНК
могут
быть
амплифицированы. В связи с этим, работа с MLPA тест-системами требует строгого
соблюдения определенных правил, разработанных с целью минимизировать риск
контаминации, потенциально ведущей к получению ложноположительных результатов.
Контаминация чаще всего происходит при внесении посторонней ДНК в тестсистему, а именно при загрязнении ею воды, реагентов, оборудования либо расходных
материалов. Кроме того, источником контаминации может быть внешняя среда, включая
привнесение
ампликонов
из
зон
амплификации
либо
других
лабораторий,
расположенных неподалеку.
Риск контаминации может быть существенно снижен путем принятия следующих
мер:
- наличие отдельных комплектов оборудования и расходных материалов в каждой
из комнат молекулярной лаборатории;
- регулярной и тщательной очисткой и обработкой рабочих зон, оборудования и
всех прочих поверхностей, которых касаются сотрудники (дверные ручки, телефонные
12
трубки, ручки холодиотников, морозильников и т.д.) с использованием соответствующих
реагентов и процедур;
- тщательно продуманными процедурами удаления и уничтожения мусора.
С клинической точки зрения одинаково важным является избежание как
ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов. Чаще всего причиной
последних является наличие различного рода ингибиторов в ПЦР-смеси (источником
которых часто служат рабочие поверхности), неоптимальные условия проведения
реакций либо пропуск определенных стадий тестирования, а также неиспользование
положительных контролей и внутренних контролей реакции.
Помимо
строгого
соблюдения
лабораторных
протоколов,
рекомендаций
относительно уборки помещений и очистки рабочих поверхностей, использования
положительных и отрицательных контролей, очень полезным является регулярный
мониторинг
результатов
ожидаемыми.
Такой
исследований
мониторинг
в
и
сравнение
совокупности
с
полученных
учетом
результатов
известных
с
уровней
распространенности МЛУ ТБ в популяции позволяет быстро выявлять систематические
ошибки
и
предотвратить
выдачу
ложноположительных
и
ложноотрицательных
результатов.
Ограниченные имеющиеся к настоящему времени данные, полученные в ходе
многоцентровых исследований по контролю качества, свидетельсвуют о том, что
уровень ложноположительных результатов является весьма высоким; причинами такой
ситуации являются главным образом ошибки персонала, а не недостатки самих тестсистем. Залогом получения точных результатов является как внедрение и регулярное
исполнение систем внутреннего контроля качества в лабораториях, так и разработка и
внедрение системы внешнего контроля качества. Последний должен включать «слепые»
перепроверки
части
тестируемых
образцов
и
проверку
квалификации
и
профессиональзма сотрудников лаборатории внешней независимой организацией.
Стандартизированные системы внешнего контроля качества для MLPA тестсистем в настоящее время не разработаны. Таким образом, разработка их является
приоритетным направлением работы.
3.10
Выдача результатов исследований
Для того, чтобы в полной мере использовать преимущества молекулярных систем
ускоренного скрининга ЛУ, в лаборатории долдна быть разработана и использоваться
система экстренного оповещения клиницистов о результатах исследования с целью
13
скорейшего
начала
традиционных
соответсвующей
бактериологических
терапии.
методов
Кроме
для
того,
при
использовании
подтверждения
результатов
молекулярной диагностики долждна быть предусмотрена возможность обсуждения с
клиницистами
возможных
причин
возникновения
несовпадающих
результатов
и
рекомендуемых при этом действий.
4. Приоритетные направления дальнейших исследований
Среди
приоритетных
направлений
научно-исследовательской
работы
по
изучению эффективности MLPA тест-систем можно выделить нижеследующие. При этом
следует отметить, что дальнейшие исследования необходимо проводить одновременно
со скорейшим внедрением указанных систем.
-
оценка
даигнотстических
эффективности
программах
использования
в
регионах
с
тест-систем
различными
в
скрининговых
и
эпидемиологическими
показателями;
- оценка экономической эффективности и экономии средств при внедрении
систем MLPA в различных программах по борьбе с ТБ;
- эффективность применения систем MLPA в сочетании с бактериологическими
методами при проведении даигностики у больных с отрицательным мазком;
- влияние процедур инактивации и дезинфекции мокроты на чувствительность
тест-систем MLPA;
- разработка и оптимизация методов выделения ДНК, особенно при исследовании
образцов мокроты с низкой концентрацией кислотоустойчивых бактерий;
5. Основные принципы использования молекулярно-генетических тест-систем
на основе MLPA
ВОЗ рекомендует использование MLPA тест-систем с учетом следующих
основных принципов:
5.1
диагностики
Вопрос о практическом применении таких систем для ускоренной
МЛУ
Здравоохранения
в
ТБ
должен
контексте
решаться
существующих
Национальными
национальных
Министерствами
программ,
включая
выработку или оптимизацию существующих диагностических и скрининговых программ,
а также бесперебойное снабжение препаратами второго и третьего рядов;
14
5.2 Высокая эффективность тест-систем MLPA была доказана при тестировании
образцов БК+ мокроты и изолятов микобактерий комплекса M.tuberculosis, выращенных
при посеве БК+ мокроты и БК- мокроты. Выполнение диагностики непосредственно на
образцах БК- мокроты не рекомендуется;
5.3 Для диагностических целей рекомендуется использование коммерческих тестсистем, основанных на принципе MLPA, что позволяет получить стабильные и
воспроизводимые результаты. Некоммерческие тест-системы, основанные на тех же
принципах, не прошли необходимых процедур оценки и внешнего контроля качества.
Любые вновь разработанные тест-системы, основанные на принципе MLPA, должны
пройти многократное и всестороннее тестирование, результаты которого должны быть
опубликованы и доступны для систематического анализа, включая оценку качества
представленных данных. Такие данные могут быть получены, например, в ходе
демонстрационных проектов, в которых будет произволится сравнение результатов,
полученных с использованием новых тест-систем, с результатами традиционных
бактериологических методов, а также результатами уже одобренных коммерческих
молекулярных
тестов.
Вновь
разрабатываемые
тест-системы
должны
обладать
следующими основными характеристиками:
5.3.1 Включать специфический зонд для идентификации микобактерий
комплекса M.tuberculosis
5.3.2 Несколько проб для для выявления наиболее часто встречающихся
мутаций в гене rpoB (кодоны 531, 526, и 516);
5.3.3 Несколько перекрывающихся зондов «дикого типа» охватывающих
весь специфический регион (81 п.н) гена rpoB для детекции участков без мутаций;
5.3.4 Предпочтительно, также несколько зондов для выявления высоких
и низких уровней устойчивости к изониазиду (детекция мутаций в генах katG и
inhA соответственно);
5.3.5
ДНК-зонды должны быть скомпонованы на полосках мембран, с
включением проб для соответствующих контролей; цветная реакция должна
позволять визуальное чтение результатов;
5.3.6
Тест-системы должны сертифицироваться по стандарту ISO
13485:2003;
5.3.7 Чувствительность и специфичность должны быть не хуже, чем у
традиционных бактериологических методов;
15
5.3.8 Чувствительность и специфичность должны быть не хуже, чем у
уже одобренных к применению молекулярно-генетических тестов.
5.4
Внедрение MLPA тнст-систем не устраняет необходимости проведения
культуральных
исследований
Бактериологические
и
исследования
определения
остаются
ЛУ
на
питательных
необходимыми
для
средах.
подтверждения
диагноза туберкулеза у больных с отрицательным мазком, в то время как ТЛЧ с
использованием бактериологических методов используются для диагностики XDR TB.
Тем не менее, количество необходимых бактериологических исследований может
варьировать в зависимости от эпидемиологической ситуации в данном регионе и
использования молекулярных тестов в национальных скрининговых программах;
5.5 Разработанные к настоящему времени MLPA тест-системы определяют
только чувствительность к рифампицину и/или изониазиду. В странах и регионах, где
зарегистрированы пациенты с XDR TB, лаборатории должны быть оборудованы и
дооснащены с целью качественного выполнения ТЛЧ к препаратам второго и третьего
рядов, как это рекоменловано текущими положениями ВОЗ.
5.6. Внедрение тест-систем MLPA для ускоренной диагностики МЛУ ТБ на
национальном уровне должно проводиться поэтапно, начиная с центральных (референс)
лабораторий или же иных лабораторий с соотвествующим опытом в проведении
молекулярных исследований. Расширение сети лабораторий, выполняющих тесты MLPA
может быть рассмотрено только после успешного внедрения тестов в центральных
лабораториях, в соответствии с национальными планами расширения и укрепления
лабораторной
службы.
При
этом
следует
принимать
во
внимание
наличие
квалифицированных кадров в периферических лабораториях, возможность успешной
транспортировки образцов, а также возможности лечения пациентов с установленным
диагнозом МЛУ ТБ в масштабах страны.
5.7
Внедрение
указанных
тест-систем
должно
предваряться
совершенствованием лабораторной инфраструктуры и наличием соответствующего
оборудования для обеспечения техники безопасности, защиты здоровья персонала и
предотвращения контаминации:
5.7.1
Первичная
обработка
клинического
материала
должна
проводиться в ламинар-боксах в помещениях, серифицированных по крайней
мере по Категории 2;
16
5.7.2
Бактериологические
исследования,
включая
выделение
и
идентификацию культур, пересевы на питательные среды, ТЛЧ должны
выполняться только в условиях лаборатории Категории 3;
5.7.3
В
молекулярно-генетической
лаборатории
должны
быть
разделены по меньшей мере три зоны, используемые для 1) выделения ДНК, 2)
пре-амплификационных
процедур,
и
3)
амплификации
и
пост-
амплификационных манипуляций. Для предотвращения контаминации образцов
ампликонами предыдущих ПЦР, ведущей к получению ложноположительных
результатов, необходимо внедрение комплекса мер, включая ограничение
доступа к определенным зонам, однонаправленное движение материалов и
персонала, а также тщательная уборка и обработка рабочих поверхностей;
5.7.4 Необходимым условием является правильная организация труда,
руководство
лабораториями
поддержание
оборудования
квалифицированного
(Кат.2,
в
персонала.
Кат3,
молекулярная
работоспособном
лаборатория),
состоянии
Усовершенствования
и
наличие
лаборатории
перед
началом выполнения молекулярных тестов должны тщательно планироваться и
адекватно финансироваться.
5.8 Для успешного выполнения исследований с применением систем MLPA
персонал лаборатории должен пройти соответствующее обучение, причем особое
внимание должно быть уделено проведению амплфикации и чтению и интерпретации
результатов.
Настоятельно
рекомендуется,
чтобы
выполнение
исследований
происходило под наблюдением руководителя со значительным опытом молекулярногенетической диагностики.
5.9 Перед началом внедрения MLPA тест-систем должен быть подготовлен и
согласован подробный контракт с фирмой-производителем, включающий гарантии
бесперебойной поставки расходных материалов и реактивов, условия и сроки поставки и
таможенного оформления, установку оборудования, его обслуживание, ремонт и замену
при необходимости, а также условия проведения обучения и обеспечения техническойф
поддержки;
5.10
Перед
началом
работы
должны
быть
подготовлены
протоколы
(стандартные операционные процедуры) выполнения исследования с применением
систем MLPA, а также разработаны и внедрены процедуры внутреннего контроля
качества. Программы внешнего контроля качества работы лабораторий, выполняющих
17
исследования с применением систем MLPA, должны быть разработаны в кратчайшие
сроки.
5.11 В лаборатории должны быть разработаны и применяться системы
экстренного оповешения клиницистов о результатах диагностики ЛУ возбудителей ТБ с
применением молекулярно-генетических методов с тем, чтобы пациенты и врачи смогли
воспользоваться преимуществами ускоренной диагностики;
5.12 ВОЗ и ее партнеры должны оказывать помощь странам в разработке
планов по внедрению систем MLPA в практику с учетом эпидемиологических,
экономических и и ных условий в данном регионе.