Морфологические критерии стадий дифференцировки клеток
advertisement
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ СТАДИЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КЛЕТОК ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГЕПАТОКАРЦИНОМЫ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ СРЕДСТВ Н.П. Бгатова1, Л.В. Омельянчук2, А.А. Пожидаева1, В.Ф. Семешин2, А.П. Лыков1, О.В. Повещенко1, О.П. Макарова1, Л.Н. Рачковская Л.Н.1, Ю.И. Бородин1, В.И. Коненков1 1 ФГБУ «НИИ клинической и экспериментальной лимфологии» СО РАМН (директор – акад. В.И. Коненков); 2Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН (директор – акад. И.Ф. Жимулев) На основании данных световой, электронной микроскопии, цитофлуориметрии и цитометрии ДНК выявлен структурный полиморфизм и выделены морфологические критерии 5-ти стадий дифференцировки клеток гепатокарциномы-29 из асцитической жидкости. Показано возрастание доли клеток 4 и 5 стадий дифференцировки в структуре опухоли при инокуляции клеток гепатокарциномы в область бедра экспериментальным животным. Введение животным с опухолевым ростом средства, воздействующего на клеточный цикл, обусловливало изменение соотношения клеток различных стадий дифференцировки. Выделенные морфологические критерии 5-ти стадий дифференцировки клеток гепатокарциномы-29 могут быть использованы для тестирования разрабатываемых противоопухолевых средств. Ключевые слова: гепатокарцинома-29, морфологические критерии стадий дифференцировки Адрес для корреспоненции: 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2, ФГБУ «НИИ клинической и экспериментальной лимфологии» СО РАМН. Бгатовой Н.П. e-mail: n_bgatova@ngs.ru Известно, что опухоли могут обладать гетерогенностью клеточного состава [2,10]. Для опухолевой ткани в последнее время стали применять термин – раковые стволовые клетки, полагая, что эти клетки способны к длительному выживанию при различных терапевтических воздействиях, и что именно они должны быть мишенями лекарственных препаратов [9]. В тоже время, согласно стохастической гипотезе развития рака, большую роль в прогрессии опухоли играют микроокружение и опухолевые клетки, не обладающие свойствами стволовых, но модулирующих кинетику стволовых опухолевых клеток и динамику развития опухоли [8]. В связи с этим, важным является не только выявление стволовых раковых клеток, но и фенотипирование всех опухолевых клеток популяции, для выявления маркеров, позволяющих судить об эффектах терапевтических воздействий. 1 Гепатокарцинома является одной из наиболее агрессивных опухолей человека и, несмотря на достигнутые успехи в диагностике и лечении, остается пятой по распространенности и третьей по уровню смертности патологией в мире, обусловленной наличием резистентности к проводимой полихимиотерапии [13]. Подобно другим солидным опухолям гепатокарцинома характеризуется высокой степенью гетерогенности популяции опухолевых клеток [7]. Актуальным является не только выявление генетических маркеров опухолевого разнообразия, но и поиск конкретных морфологических признаков опухоли, использование которых стало бы рутинным методом для оценки прогноза и эффективности лечения [2]. Для выбора тактики воздействия на опухолевый рост, в том числе таргетной терапии, понимания вклада отдельных клеток в процессы метастазирования, необходимы морфологические критерии, характеризующие состав опухоли и дифференцировку опухолевых клеток. При разработке методов таргетной терапии опухолей используются экспериментальные модели. Наиболее удобными моделями для изучения гетерогенности клеток являются асцитные формы опухолей [6]. Экспериментальная опухоль гепатокарцинома-29 (ГК-29), перевиваемый штамм которой поддерживается в асцитной форме на мышах линии CBA/LacYIcgn, является удобной моделью исследования злокачественного роста [3]. Однако, для использования ГК-29 в качестве модели для разработки противоопухолевых препаратов, необходимы знания структурно- функциональных особенностей составляющих ее клеток. Целью исследования было изучение структурной гетерогенности и выявление морфологических критериев стадий дифференцировки клеток ГК-29 in vitro и in vivo – из асцитической жидкости и в условиях трансплантации опухолевых клеток в мышечную ткань бедра экспериментальным животным. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ ГК-29 была получена и верифицирована сотрудниками Института цитологии и генетики СО РАН [3]. Клетки Г-29 перевивали мышам линии СВА в брюшную полость (n=10), через 10 суток производили забор асцитической жидкости. Для исследования морфологии опухолевых клеток взвесь клеток ГК- 29 из асцитической жидкости фиксировали в 10% нейтральном формалине и подвергали стандартной обработке для получения парафиновых блоков. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и по Фельгену для определения плоидности клеток. Окрашивание по Фельгену проводили согласно стандартному протоколу [12]. В работе был использован метод цитофотометрического определения содержания ДНК в ядрах, окрашенных реактивом Шиффа, с применением цифровой микрофотографии [5]. Измерения делали на AxioLab (Zeiss, Германия) в режиме проходящего света с использованием объектива A-plan x40 с апертурой 0,65 и камеры 2 AxioCam ICm1 в 12-битовом динамическом диапазоне. Операции с изображениями проводили с помощью программы Image J с числовой обработкой с помощью оригинальных программ написанных в программной среде Mathcad. Клеточный цикл и уровень апоптоза клеток ГК-29 исследовали методом двуцветной проточной цитофлуориметрии с помощью окрашивания клеток пропидиумом иодида (Propidium Iodide, Becton Dickinson, США) согласно инструкции производителя. Клетки культивировались в 5 мл среды RPMI1640 с добавлением 10% FBS в чашке Петри с концентрацией 1*106 млн/мл в течение 24 часов. Затем после однократной отмывки ЗФР клетки концентрировали и исследовали клеточный цикл и апоптоз. Анализ клеточного цикла проводился по оценке гистограмм ДНК. Относительное содержание клеток с диплоидным (клетки в G0/G1 фазах) и гиперплоидным (клетки в S, G2/M фазах) набором ДНК определяли в гейте опухолевых клеток. Для ультраструктурного анализа, взвесь клеток ГК – 29 из асцитической жидкости фиксировали в 1% растворе ОsO4 на фосфатном буфере (pH=7,4). Дальнейшую обработку образов проводили согласно принятому протоколу для электронной микроскопии [1]. Анализ клеточного полиморфизма ГК-29 in vivo проводили через 20 суток после введения опухолевых клеток из асцитической жидкости, суспендированной в 10-кратном объеме физиологического раствора в мышцу правого бедра по 0,1 мл мышам самцам линии CBA (n=10). Работу с животными проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием использования экспериментальных морфологических животных». критериев Для опухолевых исследования клеток для возможности тестирования препаратов, блокирующих клеточную пролиферацию использовали цитрат лития, в связи с известными данными о влиянии соединений лития на сигнальные пути и регуляцию клеточного цикла [15]. Группе мышей (n=10) после индукции опухолевого процесса внутрибрюшинно по 0,1 мл вводили цитрат лития в дозе 0,92 мг на животное в течение 5 дней. Забор материала для исследований проводили через 20 суток эксперимента. Животных выводили из эксперимента методом кранио-цервикальной дислокации. Для морфологического исследования использовали образцы опухолевой ткани, обработку которых проводили согласно принятому протоколу для электронной микроскопии [1]. Полутонкие срезы толщиной 1 мкм окрашивали толуидиновым синим и изучали под световым микроскопом “LEICA DME”. Ультратонкие срезы толщиной 35-45 нм контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата и цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе JEM 1010. Полученные микрофотографии морфометрировали с помощью компьютерной программы Image J. Определяли объемные плотности ядер и цитоплазмы опухолевых клеток при использовании открытой тестовой 3 системы с шагом 0,7 мкм при увеличении электронограмм 12000 и вычисляли величину ядерно-цитоплазматического соотношения. При использовании закрытой тестовой системы из 154 точек и шагом 100 нм при увеличении 30000 определяли объемную плотность цистерн гранулярной эндоплазматической сети в цитоплазме опухолевых клеток. Цифровые данные обрабатывали с использованием общепринятых методов статистики, вычисляя среднюю арифметическую величину (М), ошибку репрезентативности средней величины (m) и уровень значимости различий средних величин (р) на основании t-критерия Стьюдента для уровня достоверности 95% (p < 0,05). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ При светооптическом исследовании клеток ГК-29 из асцитической жидкости было обнаружено, что клетки различаются по своим размерам, величине ядра и содержанию цитоплазмы (рис. 1А). При измерении количества ДНК в клетках ГК-29, находящихся в интерфазе и метафазе клеточного цикла, было выявлено 2 максимума кривой для метафаз (рис. 1Б). Один пик соответствовал метафазам с содержанием ДНК 8-8.5 пикограмм (п.г.), а второй 15-16.5 п.г. Известно, что метафазы содержат тетраплоидный набор хромосом, следовательно, диплоидный набор в G1 фазе для этих клеток должен составлять 4-4.2 п.г. ДНК. Это значение соответствовало положению первого пика интерфазных клеток наблюдаемого при 4-4.5 п.г. Покрайней мере, часть пика интерфазных клеток, наблюдающегося при 7.5-8.5 п.г. было представлено клетками c диплоидным содержанием ДНК 4-4.2 п.г, находящиеся в стадии G2. Пик метафаз на 15-16 п.г соответствовал G1 диплоидным клеткам с содержанием ДНК 7.5-8.2 п.г., то есть G1 пик этих клеток налагался на G2 пик клеток с содержанием 4-4.5 п.г. Пик на кривой интерфаз при 15.5 п.г. соответствовал G2 фазе этих клеток ( рис. 1Б). Таким образом, вторая фракция пролиферирующих клеток содержала в два раза больше ДНК, чем первая, то есть являлась автополиплоидной относительно первой. В дополнение к рассмотренным пикам на кривой интерфаз, имел место и дополнительный пик клеток с содержанием ДНК 12 п.г. Поскольку не было найдено метафазных клеток с содержанием ДНК равным или в два раза меньшим этого значения, является вероятным существование третьей популяция клеток ГК-29, которая не способна образовывать фигуры деления. Преобладание в популяции ГК-29 диплоидных клеток и распределение их по стадиям клеточного цикла было подтверждено данными метода двуцветной проточной цитофлуориметрии. Было выявлено, что относительное содержание клеток с диплоидным набором хромосом (клетки в G0/G1 фазах) составило 75,2%. Клетки, с гиперплоидным набором ДНК (клетки в S, G2/M фазах) составили 12%. Клетки в состоянии апоптоза, с фрагментированной ДНК, формировали характерный гиподиплоидный пик и составляли 8%. 4 Анализ ядерно-цитоплазматического соотношения и ультраструктурной организации опухолевых клеток выявил гетерогенность популяции ГК-29 по данным параметрам. По величине ядерно-цитоплазматического соотношения и по содержанию внутриклеточных органелл опухолевые клетки были разделены на 5 типов (рис 1В,Г). Изменение ультраструктурной организации опухолевых клеток с возрастанием объемной доли цитоплазмы позволяет характеризовать данные клетки, как имеющие разные стадии дифференцировки и одним из критериев стадии клеточной дифференцировки может быть содержание в цитоплазме цистерн гранулярной эндоплазматической сети [4]. Подсчет количества клеток различной стадии дифференцировки из асцитической жидкости показал, что клетки 1 стадии дифференцировки составляют – 6%, клетки второй стадии – 20%, третьей – 35%, четвертой – 29% и пятой стадии дифференцировки – 10% популяции опухолевых клеток. В цитоплазме клеток, выделенной нами первой стадии дифференцировки, у которых ядерно-цитоплазматическое соотношение составляло 0,797±0,008, отмечали одиночные митохондрии, слабо выраженными были мембраны гранулярного эндоплазматического ретикулума, преобладали свободные полисомальные рибосомы (рис. 1Г,2А). В цитоплазме клеток второй стадии дифференцировки (ядерноцитоплазматическое соотношение составляло 0,681±0,005), наряду с описанными выше органеллами, выявляли отдельные липидные включения, а значение объемной плотности цистерн гранулярной эндоплазматической сети было увеличено в 2,5 раза (рис. 1Г, 2Б, 2Е). В выделенных нами клетках 3-и 4-ой стадии дифференцировки (ядерно-цитоплазматическое соотношение составляло, соответственно 0,596±0,005 и 0,492±0,004), отмечали возрастание доли цитоплазмы, накопление митохондрий, мембран гранулярной эндоплазматической сети, прикрепленных и свободных полисомальных комплексов, лизосом и липидных включений (рис. 1Г,2В,Г). Величина объемной плотности цистерн гранулярной эндоплазматической сети в клетках 3-й и 4-ой стадии дифференцировки была больше, чем в клетках первой стадии в 3 и 4 раза, соответственно (рис. 2Е). Клетки, отнесенные к 5-й стадии дифференцировки, у которых ядерно-цитоплазматическое соотношение имело значение 0,384±0,006, отличались значительным объемом цитоплазмы, с небольшим содержанием мембран гранулярного эндоплазматического ретикулума и митохондрий, наличием липидных включений и повышенным количеством свободных полисомальных комплексов (рис. 1Г,2Д, 2Е). Нами была исследована структура опухолевой ткани через 20 суток после инокуляции клеток ГК-29 в мышечную ткань бедра экспериментальным животным. Было отмечено, что опухоль состоит из крупных клеток, образующих подобие печеночных «балок», которые окружены сосудами, сходными с синусоидами печени (рис. 3А). Клетки в пределах «балок» 5 располагались плотно и образовывали в зонах контакта многочисленные микроворсинки (рис. 3Б). По-видимому, дифференцировка популяции клеток ГК-29, так же, как и гепатоцитов в печени, идет по пути возрастания плоидности и снижения способности к пролиферации. В результате в перевиваемой в область бедра опухоли накапливаются крупные клетки 4 и 5-й стадии дифференцировки (рис. 3В). Причем клетки 5-й стадии дифференцировки можно рассматривать, как высокоспециализированные с ограниченной потенцией к пролиферации. В их цитоплазме в большом количестве присутствуют свободные полисомальные комплексы и липидные включения, обеспечивающие структурнофункциональное постоянство опухолевых клеток. Нами была сделана попытка анализа популяции опухолевых клеток ГК-29 на основании определенных нами морфологических критериев в условиях воздействия на опухоль in vivo средства, влияющего на клеточный цикл. Известно, что соединения лития, действуя через подавление активности гликоген-синтетазы киназы-3β, приводят к нарушению репликации ДНК и экспрессии генов S-стадии, что ведет к торможению пролиферации, выхода клеток из клеточного цикла и накоплению их в стадии G0 [15]. У животных, которым после инокуляции клеток ГК-29 внутрибрюшинно вводили цитрат лития, наблюдали меньшую «зрелость» опухолевой ткани. Опухолевые клетки располагались рыхло, не образовывали печеночных «балок» и имели преимущественно мелкие размеры (рис. 3Г). Менялось соотношение морфологических типов клеток. В 2 раза возрастало количество клеток 1 и 2-й стадии дифференцировки, на 40% увеличивалось количество клеток 3-ей стадии дифференцировки, по сравнению с популяциями клеток в опухолевой ткани бедра без введения цитрата лития. В то же время на 30% уменьшалось число клеток 4-й стадии дифференцировки и на 84% снижалось количество клеток 5-й стадии дифференцировки, по сравнению с их содержанием в опухоли без воздействия лития (рис. 3В). На основании использованных морфологических критериев можно говорить о подавлении дифференцировки клеток гепатокарциномы-29 при использовании цитрата лития. Вывод о влиянии солей лития на дифференцировку клеток были получены и другими авторами, которые показали действие лития на экспрессию генов, участвующих в дифференцировке стволовых клеток [14]. Таким образом, экспериментальная гепатокарцинома-29 является гетерогенной по клеточному составу по опухолью. Гетерогенность ее клеток определяется размерами, объемной долей цитоплазмы и насыщенностью органеллами. Сопоставляя эти параметры, было выявлено, что по величинам ядерно-цитоплазматического соотношения клетки ГК-29 можно разделить на 5 типов. И этим 5-ти типам клеток соответствуют данные по величинам насыщенности цитоплазмы органеллами: свободных полисомальных и прикрепленных 6 рибосом, митохондрий, цистерн гранулярной эндоплазматической сети и липидных включений. Все эти параметры отражают функциональную активность и разные стадии дифференцирования и жизнедеятельности клеток. Таким образом, стадия дифференцировки может быть определена ядерно-цитоплазматическим соотношением и концентрацией внутриклеточных органелл. Однако в связи с тем, что согласно полученным данным, определенному ядерно-цитоплазматическому соотношению соответствует определенная концентрация внутриклеточных цитоплазматического органелл, соотношения для то достаточно отнесения клеток определения к ядерно- конкретной стадии дифференцировки. Следовательно, использование выделенного морфологического критерия 5-ти стадий дифференцировки клеток ГК-29, а именно их ядерно-цитоплазматическое соотношение, позволит в эксперименте с большой вероятностью определять клетки-мишени воздействующего на опухоль агента. ЛИТЕРАТУРА 1. Бгатова Н.П., Бородин Ю.И., Макарова В.В. и др. Бюл. экспер. биол. 2014. Т. 157, № 1. С. 102-108. 2. Геращенко Т.С., Денисов Е.В, Литвяков Н.В. и др. Биохимия. 2013. Т. 78, № 11. С. 1531 – 1549. 3. Каледин В.И., Жукова Н.А., Николин В.П. и др. Бюл. экспер биол. 2009. Т. 148, № 12. С. 664-669. 4. Овсянко Е.В., Ефремов А.В., Мичурина С.В. и др. Бюлл. эксперим. биол. мед. 2009. Т. 148, № 9. С. 337-342. 5. Омельячук Л.В., Семешин В.Ф., Алексеева А.Л. и др. Цитология. 2010. Т. 52, № 4. С. 349-353. 6. Тюряева И.И., Филатова Н.А., Розанов Ю.М. и др. Цитология. 2010. Т. 52, № 10. С. 817-826. 7. Colombo F., Baldan F., Mazzucchelli S. et al. PLoS One. 2011. Vol. 6, № 6. P. e21369. 8. Gatenby R.A., Silva A.S., Gillies R.J. Frieden B.R. Cancer Res. 2009. Vol. 69, N 11. P. 4894-4903. 9. Kusumbe A.P., Bapat S.A. Cancer Res. 2009. Vol. 69, № 24. P. 9245-9253. 10. Marjanovic N.D., Weinberg R.A., Chaffer C.L. Clin Chem. 2013. Vol. 59, № 1. P. 168179. 11. Meacham C.E., Morrison S.J. Nature. 2013. Vol. 501, № 7467. P. 328-337. 12. Rasch E.M., Lee C.E., Wyngaard G.A. Genome. 2004. Vol. 47, № 3. P. 559-564. 13. Shen Y., Cao D. Front Biosci (Elite Ed). 2012. Vol. 1, № 4. P. 1157-1169. 7 14. Walasek M.A., Bystrykh L., Boom V. et al. Blood. 2012. Vol. 119, N 13. P. 3050 – 3059. 15. Zhu Q., Yang J., Han S. et al. Prostate. 2011. Vol. 71, № 8. P. 835-845. 8 Гистограмма содержания ДНК в интерфазных и метафазных клетках 40 Число клеток 35 30 25 Интерфазы 20 Метафазы 15 10 5 0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 Содержание ДНК (п.г.) Б А В Г Рисунок 1. Гетерогенность популяции опухолевых клеток ГК-29. А- Различные размеры клеток ГК-29.Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 10х40 Б - Содержание ДНК в интерфазных и метафазных клетках перевиваемой ГК-29, определенное методом цифровой цитометрии. Ось абсцисс - содержание ДНК в пикограммах, рассчитанное с помощью уравнения регрессии. Ордината - число клеток c данным содержанием ДНК. В - Морфологические типы клеток гепатокарциномы-29 в зависимости от стадии дифференцировки. I,II,III,IV,V – стадии дифференцировки. Окраска толуидиновым синим. Увеличение 10х90. Г- Ультраструктурная организация клеток ГК-29 в зависимости от стадии дифференцировки. I,II,III,IV,V – стадии дифференцировки. Увеличение х4000. 9 А Б В Г Гранулярная эндоплазматическая сеть Vv 20 % * * 15 10 * * 5 0 1 2 3 4 5 Стадии дифференцировки Д Е Рис. 2. Содержание цистерн гранулярной эндоплазматической сети в цитоплазме опухолевых клеток Г-29 различных стадий дифференцировки. А- первая стадия дифференцировки; Б – вторая стадия дифференцировки; В – третья стадия дифференцировки, Г – четвертая стадия дифференцировки, Д – пятая стадия дифференцировки Увеличение х10000: Е- объемная плотность (Vv) цистерн гранулярной эндоплазматической сети в клетках Г-29. * - p < 0,05 по сравнению с клетками ГК-29 первой стадии дифференцировки. 10 А Б В Г Рис. 3. Структура ГК-29 через 20 суток после инокуляции опухолевых клеток в мышечную ткань бедра экспериментальным животным. А- образование опухолевыми клетками «печеночных балок» и «синусоидов». Окраска толуидиновым синим. Увеличение 10х40; Б- Плотное расположение опухолевых клеток и образование микроворсинок в зонах контакта. Увеличение х4000. В- Соотношение опухолевых клеток различных стадий дифференцировки в опухоли бедра и при внутрибрюшинном введении цитата лития животным, с привитой ГК-29. * - p < 0,05 по сравнению с ГК-29 бедра без введения цитрата лития. Г - Рыхлое расположение клеток, преобладание мелких по размеру клеток ГК-29 при введении цитрата лития. Окраска толуидиновым синим. Увеличение 10х40. 11
