файл диссертации в формате (1966 Kb.)
advertisement
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ федеральное государственное бюджетное учреждение «НАУЧНЫЙ ЦЕНТР АКУШЕРСТВА, ГИНЕКОЛОГИИ И ПЕРИНАТОЛОГИИ ИМЕНИ АКАДЕМИКА В.И. КУЛАКОВА» На правах рукописи ПАРСАДАНЯН Нанэ Геворковна ПРОГНОЗИРОВАНИЕ АКУШЕРСКИХ ОСЛОЖНЕНИЙ И ИСХОДОВ БЕРЕМЕННОСТЕЙ У ЖЕНЩИН С ПРИВЫЧНЫМ ВЫКИДЫШЕМ НА ОСНОВАНИИ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ 14.01.01 – акушерство и гинекология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук, Тетруашвили Нана Картлосовна доктор биологических наук, Трофимов Дмитрий Юрьевич Москва – 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВЕДЕНИЕ……………………………………………………………...4 Глава 1. НЕИНВАЗИВНАЯ ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ПО УРОВНЯМ СВОБОДНОЙ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ ДНК (СЭ-ДНК) У ЖЕНЩИН С ПРИВЫЧНЫМ ВЫКИДЫШЕМ И ОСЛОЖНЕННЫМ ТЕЧЕНИЕМ БЕРЕМЕННОСТИ (обзор литературы)……………………12 1.1 Генетические причины привычного выкидыша………...….12 1.2 Неинвазивная пренатальная диагностика по уровням сэ-ДНК в прогнозировании гестационных осложнений……….…………….……15 1.3 Возможности неинвазивной пренатальной диагностики по сэ-ДНК в выявлении анеуплоидий…..………...……………………20 Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…………..28 2.1 Критерии включения и исключения пациенток в группы исследования………………………………………………………………..28 2.2 Методы исследования………………………...………………31 2.3 Специальные методы исследования….…………..………….33 2.4 Статистическая обработка материала………….…………....42 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ………………………………………….…….....44 3.1 Определение уровней сэ-ДНК независимо от пола плода для прогнозирования гестационных осложнений……………………….……44 3.1.1. Клиническая характеристика женщин исследуемых групп..44 3.1.2. Результаты клинико-лабораторного обследования супружеских пар с привычным выкидышем на ранних сроках беременности……………………..……………………...............................51 3.1.3. Течение беременностей у пациенток исследуемых групп....54 3.1.4.Определение общей и сэ-ДНК в динамике с 6 до 22 недели беременности…………………………………………………………….....58 3.1.5. Исходы наблюдаемых беременностей у женщин основной и контрольной групп….……………………………………….……………..71 3 3.1.6. Анализ течения родов, послеродового периода и состояния новорожденных……………………..………………………………..…..80 3.2 Диагностика анеуплоидий по сэ-ДНК у пациенток высокого риска по развитию хромосомной патологии……………….…………...87 Глава 4.ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ…….99 ВЫВОДЫ………………………………………………..….............120 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ……..…………………….123 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ………………………………………..127 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………….…………..…..129 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Проблема невынашивания беременности, имеющая не только медицинское, но и социальное значение, остается одной из наиболее актуальных в современном акушерстве. Невынашивание беременности - самопроизвольное прерывание беременности в срок от зачатия до 37 недель беременности, считая от первого дня последней менструации. В Российской Федерации с 2012 года осуществлен переход на международную систему регистрации перинатальной смертности, начиная со срока 22 недели беременности и массы плода более 500 г. Прерывание беременности от зачатия до 22 недель беременности называют самопроизвольным выкидышем, с 22 по 28 неделю ранними преждевременными родами, с 28 до 37 недели – преждевременными родами. Ранние потери беременности (до 22 недель) составляют практически 85% от всех самопроизвольных гестационных потерь и чем меньше срок беременности, тем чаще выкидышу предшествует гибель эмбриона/плода [2]. Многие исследователи полагают, что спорадические самопроизвольные выкидыши в I триместре являются инструментом естественного отбора, так как при кариотипировании абортусов регистрируются до 60% эмбрионов с хромосомными аномалиями. Для привычных выкидышей, в тех случаях, когда у супружеской пары прерывается более 2 беременностей, хромосомные потери не столь часты, а прерывания беременности обусловлены в большей мере родительскими причинами [48]. Этиологические факторы, приводящие к привычным выкидышам, чрезвычайно разнообразны и помимо генетических причин включают: эндокринные, анатомические, инфекционные, аллоиммунные, аутоиммунные, тромбофилические нарушения [15, 21, 128]. 5 В большинстве случаев в основе привычного выкидыша лежит сочетание нескольких причинных факторов. Поэтому при обследовании и подборе терапии нужно учитывать все факторы, приводящие к прерыванию беременности. В настоящее время получены убедительные данные, свидетельствующие о том, что у женщин с повторными ранними прерываниями беременностей достоверно чаще встречаются такие осложнения беременности как угрожающий выкидыш, плацентарная недостаточность, задержка роста плода, кровотечения во втором и третьем триместрах беременности, преждевременные роды [3, 11, 12, 23, 38]. Это свидетельствует о реализации плацентарных нарушений с самых ранних сроков беременности, что приводит к развитию поздних гестационных осложнений [39, 152]. При проведении исследований было установлено, что апоптотические изменения трофобласта во время беременности находят отражение в повышении уровней свободной эмбриональной ДНК (сэДНК) [71], что было описано при последующем развитии различных гестационных осложнений, таких как угроза выкидыша, задержка роста плода (ЗРП), преэклампсия, преждевременные роды [60, 76]. При этом происходит высвобождение сэ-ДНК в плазму крови беременной до концентраций значительно превышающих таковую при физиологической беременности задолго до появления клинических признаков осложнений [93, 97, 159]. Предполагается, что сэ-ДНК попадает в кровь матери несколькими путями: из фетальных клеток, переходящих плацентарный барьер и разрушающихся иммунной системой, в результате лизиса клеток плаценты и прямого выброса ДНК плода в кровь матери [102, 106]. Сэ-ДНК обнаруживается уже на первых неделях развития плода, более того у 80% беременных женщин она обнаруживается на 28-й день после зачатия. Эти данные свидетельствуют о том, что сэ-ДНК появляется в крови матери раньше 6 времени формирования системы кровообращения плода. В настоящее время многие работы подтверждают, что источником ДНК плода в материнском кровотоке являются клетки трофобласта. Другая важная задача при угрожающем и привычном выкидыше – оценка состояния эмбриона и диагностика хромосомных аномалий, которые наследуются от родителей или возникают de novo. Хромосомные аномалии являются наиболее частыми генетическими нарушениями, встречающимися при привычных выкидышах [141]. В настоящее время, пренатальная диагностика заключается в проведении биохимического и ультразвукового скрининга [14, 42, 45], а также по показаниям - инвазивных процедур. При проведении хориоцентеза материалом для исследования является ткань хориона между 10 и 12 неделями или с помощью плацентоцентеза, амниоцентеза между 14 и 16 неделями гестации – клетки плаценты или амниотической жидкости [13, 72]. При проведении инвазивной пренатальной диагностики отмечается риск потери беременности почти 0,5 – 2%, а у женщин с выкидышами в анамнезе до 5%. Сэ-ДНК может быть полезным маркером для прогнозирования самопроизвольного выкидыша, как в случаях анеуплоидии, так и при нормальном кариотипе плода [7]. В настоящее время не ясно достаточной ли точностью обладают методы неинвазивной пренатальной диагностики, для того чтобы заменить кариотипирование. Многие авторы указывают, что методы неинвазивной пренатальной диагностики до сих пор не могут быть альтернативой или заменить инвазивные процедуры, особенно в случаях мозаицизма, когда число анеуплоидных клеток уступает нормальным [55, 79, 148]. Однако, определение свободных нуклеиновых кислот может быть использовано для скрининга и определения риска у всех беременных независимо от возраста до постановки окончательного диагноза, как самостоятельный метод, так и в дополнение к существующим методам [66, 131]. Исследователи полагают, что 7 определение свободной ДНК эмбрионального происхождения может заменить или усовершенствовать существующие скрининговые тесты [74, 91, 155]. Существующие в настоящее время в нашей стране методы неинвазивной пренатальной диагностики позволяют выявить сэ-ДНК в крови матери при вынашивании плода мужского пола, либо резусположительного плода при условии, что мать резус-отрицательная [10, 98, 114, 130]. Такое значительное ограничение возможностей методов не позволяет использовать подобные методики, как скрининговые в прогнозировании осложнений беременности или патологии плода. Исходя из вышеизложенного, определение уровней сэ-ДНК во время беременности, независимо от пола плода, будет значимым в прогнозировании гестационных осложнений и исходов беременностей и в ряде случаев позволит избежать ненужных инвазивных диагностических и лечебных мероприятий [46, 103, 145]. Все вышеперечисленное определило цель предстоящего исследования. Целью настоящего исследования является оптимизация программы неинвазивной пренатальной диагностики и прогнозирования исходов беременностей у супружеских пар с привычным выкидышем. Задачи исследования 1. Провести анализ нарушений репродуктивной функции у супружеских пар с привычным выкидышем на основании комплексного клинико-лабораторного обследования. 2. Определить уровни сэ-ДНК независимо от пола плода в периферической крови женщин в динамике при нормальной и осложненной беременности. 3. На основании анализа течения и исходов наблюдаемых беременностей провести оценку эффективности прогнозирования 8 гестационных осложнений и исходов беременностей по уровням сэ-ДНК в сроках до 22 недель. 4. хромосом, Оценить возможность выявления анеуплоидий 21, 18 копийности половых хромосом X и Y методом высокопроизводительного секвенирования до 18 недель беременности по периферической крови беременных женщин высокого риска. 5. Разработать алгоритм обследования и пренатальной диагностики пациенток с привычным выкидышем для оптимизации акушерской тактики. Научная новизна Впервые в стране определены ДНК маркеры для оценки уровней сэ-ДНК вне зависимости от пола плода в периферической крови беременных женщин на когорте супружеских пар с ненарушенной репродуктивной функцией, с угрожающим и привычным выкидышем. Установлено, что апоптотические выбросы сэ-ДНК трофобластического происхождения, поступающие в материнский кровоток, имеют место при угрожающем и начавшемся выкидыше, как универсальный механизм, возникающий при отслойке хориона. Оценка уровней сэ-ДНК у пациенток с угрожающим, привычным выкидышем, нормальным течением гестационного процесса позволила расширить понимание патогенетических механизмов реализации самопроизвольного прерывания беременности. Установлена возможность неинвазивного определения сэ-ДНК в периферической крови женщин до 18 недель беременности для диагностики анеуплоидий – трисомии 21, 18 а также копийности половых хромосом (X и Y) методом высокопроизводительного секвенирования. Динамическое определение уровней сэ-ДНК у женщин с 6 по 22 неделю беременности независимо от пола плода позволило оценить уровень апоптоза клеток трофобласта, что послужило критерием 9 успешности процессов имплантации и эффективности проводимого лечения. Практическая значимость Проведена оценка клинической значимости выявления анеуплоидий по 21 и 18 хромосомам, а также копийности половых хромосом (X и Y) с помощью высокопроизводительного секвенирования по сравнению с общепринятым скринингом беременных. Проведенная валидация метода высокопроизводительного секвенирования показала высокую точность тестов неинвазивного определения трисомий 21, 18, копийности половых хромосом (X и Y), что дает основание рекомендовать данную методику для включения в систему скрининга беременных. Неинвазивное пренатальное определение анеуплоидий у женщин с клинической картиной угрожающего / начавшегося выкидыша позволяет оптимизировать тактику ведения беременности с отказом от ненужных терапевтических мероприятий в случае хромосомной патологии плода. Разработан алгоритм мониторинга течения беременности и контроля за эффективностью проводимой терапии на основании оценки уровней сэ-ДНК до 22 недель. Согласно полученным данным, высокие уровни сэ-ДНК являются маркерами предикторами самопроизвольного прерывания беременности до 22 недель, анеуплоидий, плацентарной недостаточности. Показано, что нормализация уровней сэ-ДНК в процессе терапии у женщин с начавшимся выкидышем является положительным прогностическим признаком и коррелирует с пролонгированием беременности. Внедрение предложенного алгоритма позволит прогнозировать осложнения и исходы беременностей и оценить эффективность проводимой терапии. 10 Положения диссертации, выносимые на защиту 1. У беременных с угрожающим и начавшимся выкидышем отмечаются апоптотические выбросы в материнский кровоток сэ-ДНК трофобластического происхождения, как универсальный механизм, возникающий при отслойке хориона. 2. При отсутствии клинических проявлений угрозы прерывания беременности у женщин с привычным выкидышем уровни общей и сэ-ДНК достоверно превышают аналогичные показатели пациенток с неотягощенным акушерским анамнезом, что создает предпосылки к формированию плацентарной недостаточности. 3. Установленная высокая точность тестов неинвазивного определения трисомий 21, 18, копийности половых хромосом (X и Y), методом высокопроизводительного секвенирования дает основание рекомендовать данную методику для включения в систему скрининга беременных высокого риска развития хромосомной патологии. 4. Определение периферической крови высоких уровней беременных общей позволяет и сэ-ДНК в прогнозировать угрожающий, начавшийся выкидыш, самопроизвольное прерывание беременности за 2 недели до реализации клинических симптомов. Личный вклад автора Автором проведена систематизация литературных данных по теме диссертации, лично разработана анкета для сбора анамнеза, проведен анализ клинико-анамнестических данных и результатов обследования 256 женщин в проспективном исследовании, удовлетворяющих критериям включения в исследование. Автор лично участвовал в ведении беременности и родоразрешении женщин, включенных в исследование. Автором осуществлялись: забор, подготовка, хранение биологического материала на преаналитическом этапе, участие в молекулярно-биологических и генетических исследованиях. Анализ, статистическая обработка полученных данных проведены автором 11 самостоятельно в соответствии с правилами и обеспечивают достоверность результатов и сформулированных выводов. Написание и публикация результатов выполнены автором лично. Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.01 – «акушерство и гинекология». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, а именно пунктам 1, 2, 3, 4. Апробация диссертации Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференции отделения профилактики и терапии невынашивания беременности совместно с лабораторией молекулярно-генетических методов 16.12.2014 года и на заседании апробационной комиссии ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России 22.12.2014 г. Внедрение результатов работы в практику Основные рекомендации, вытекающие из результатов исследования, используются во 2-м отделении акушерском патологии беременности при обследовании и лечении супружеских пар с привычными потерями плода. Публикации По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, все в рецензируемых научных изданиях. Структура работы Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, изложена на 145 страницах компьютерного текста. Работа содержит 31 таблицу и 12 рисунков. Библиографический указатель включает 159 литературный источник, из них 45 отечественных и 114 иностранных авторов. 12 Глава 1 НЕИНВАЗИВНАЯ ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ПО УРОВНЯМ СЭ-ДНК У ЖЕНЩИН С ПРИВЫЧНЫМ ВЫКИДЫШЕМ И ОСЛОЖНЕННЫМ ТЕЧЕНИЕМ БЕРЕМЕННОСТИ (обзор литературы) 1.1. Генетические причины привычного выкидыша Проблема неинвазивной пренатальной диагностики интересует исследователей и клиницистов в связи с необходимостью своевременной постановки диагноза с минимальным риском для состояния матери и плода. При осложненном течении беременности возможности назначения инвазивных методов диагностики ограничены и сопряжены с высоким риском потери желанной беременности [64, 95]. В то же время одной из важнейших задач именно в условиях угрожающего выкидыша является оценка состояния плода и диагностика хромосомных аномалий, наследуемых от родителей или возникающих de novo. Наиболее вероятны генетические причины при привычных потерях беременности в следующих клинических ситуациях: Очень ранние потери беременности (анэмбрионии). Семейный анамнез – данные о наличии в семье детей с хромосомной патологией или точечными генными мутациями. Наличие у супружеской пары случаев анеуплоидий [85, 138, 139]. У исследователей нет единого мнения относительно вопроса, улучшает ли прогноз для последующей беременности анеуплоидии абортуса при цитогенетическом исследовании. наличие 13 Около 50-70% спорадических ранних потерь беременности обусловлены хромосомными анеуплоидиями, чаще всего это моносомия по X хромосоме, трисомии по 16, 13, 18, 21 хромосомам [85]. При этом в большинстве случаев у родителей имеется нормальный кариотип. В ходе проведенных исследований сделан вывод, что женщины с выкидышами плодом с анеуплоидией находятся в группе повышенного риска для рецидива анеуплоидии при последующих беременностях. Кроме того, было отмечено [138, 139], что анеуплоидии чаще встречаются при спонтанных выкидышах (частота около 50%), чем у женщин с привычным выкидышем (10%-25%). Если один из партнеров оказывается носителем сбалансированной хромосомной перестройки, прогноз в большей мере зависит от вида хромосомной перестройки [101]. Исходы беременностей у пар со сбалансированной транслокацией, как правило, благоприятные. В таблице 1 приведен общий риск аномального рождения и привычного невынашивания беременности у пар, которые являются носителями сбалансированной транслокации. В 2-5% случаев у пар с повторными выкидышами, один из партнеров является носителем Робертсоновской транслокации. При этом вероятность рождения живого ребенка достигает 70%, особенно если только один из партнеров является носителем сбалансированной транслокации [56]. В этой связи парам со сбалансированными хромосомными перестройками необходимо предлагать инвазивную пренатальную диагностику (хориоцентез или амниоцентнез), что занесено в клинические рекомендации ведения подобных пациентов [49, 70]. Хромосомные аномалии эмбриона при спорадических выкидышах присутствуют у 50% абортусов. Многие исследователи связывают это со старшим репродуктивным возрастом женщины и преждевременным истощением яичников. Однако повторяющиеся потери беременностей, в 14 результате анеуплоидии встречаются гораздо чаще. Одиночные дефекты генов и неслучайная инактивация Х-хромосомы могут быть причиной повторных выкидышей, которые нельзя обнаружить при рутинном кариотипировании. Исходы беременностей при носительстве сбалансированных перестроек представлены в таблице 1. Таблица 1 Исходы беременностей при носительстве сбалансированных перестроек Перестройка Родились живыми До 10 % Перестройка у одного из родителей - Робертсоновская (D;G&G;G), отец, мать - по 21 хромосоме у одного из родителей Инверсия (перицентрическая) - парацентрическая - у одного из родителей Риск Неразвивающиеся беременности 30-50% 10-15% До 30% 5-10% 5-10% 0,1-0,5 % 50% В отдельных исследованиях получены данные о том, что в случае выявления анеуплоидии абортуса прогноз вынашивания следующей беременности лучше, чем у пар с привычным выкидышем и нормальным кариотипом погибшего эмбриона [77, 100]. В другом исследовании, напротив, показано, что у пар с привычным выкидышем и наличием подтвержденной анеуплоидии в исходе беременности вероятность повторения подобной ситуации выше, чем при нормальном кариотипе абортуса [153]. Во всех случаях, подобные ситуации нечасто обусловлены сбалансированными хромосомными перестройками у матери или отца, как правило, кариотип родителей нормальный. Вместе с тем, частота сбалансированных хромосомных перестроек в парах с привычным выкидышем составляет 4,1 – 11%, по сравнению с популяционными данными - 0,6%. Наиболее часто встречаются 15 сбалансированные транслокация, реципрокные реже транслокации инверсии и и мозаицизм. Робертсоновская В этой связи кариотипирование пар с привычным выкидышем входит в стандарт обследования в программе предгестационной подготовки [104, 144]. Кариотипирование родителей и дальнейшее консультирование генетика является важной частью обследования пар с повторными потерями беременности, в результате чего ставится вопрос о возможности планирования беременности и в необходимости инвазивной пренатальной диагностики во время беременности. 1.2. Неинвазивная пренатальная диагностика по уровням сэ-ДНК в прогнозировании гестационных осложнений Открытие свободной (внеклеточной) эмбриональной ДНК (сэДНК), циркулирующей в плазме крови матери, положило начало новым возможностям неинвазивной пренатальной диагностики во время беременности [129, 134]. Пионерами в данной области были группа авторов под руководством Dennis Lo, с 1997 года непрерывно совершенствующие методы выявления сэ-ДНК [105]. Тем не менее, детальные исследования в неинвазивной пренатальной диагностике были проведены в течение последних пятнадцати лет, что связано с прогрессивным развитием технологии секвенирования. Доля сэ-ДНК в плазме крови матери составляет 1-2% от всей циркулирующей ДНК [76, 98], что ограничивало ее выявление и диагностические возможности методов. Задача, стоящая перед исследователями состоит в количественном определении ДНК плода на фоне большого количества ДНК матери. Некоторые локусы, такие как Y хромосома или ген RHD (Rhesus D), у беременной с резус-отрицательной принадлежностью крови, позволяют 16 детектировать количество ДНК в плазме матери методом ПЦР. Определение наличия Y хромосомы и гена RHD описано в мировой литературе и применяется в клинической практике. Однако таким образом можно определить ДНК плода только у 50% беременных женщин. На данный момент сэ-ДНК используется для неинвазивного пренатального определения пола плода при сцепленных с полом заболеваниях и резус-принадлежности плода у резус-отрицательных беременных женщин [68, 87, 120, 158]. Новые открытия в эпигеномике сделали возможным использовать определения сэ-ДНК в течение беременности вне зависимости от пола плода [53, 73, 108, 90, 118]. Существует несколько способов определения доли свободной эмбриональной ДНК в крови матери вне зависимости от пола и Rh-фактора плода. Все они основаны на обнаружении различий между ДНК принадлежащей матери и ДНК плода. Одним из методов является определение ДНК плода на основании профиля метилирования. Данный метод основан на эпигенетических различиях между плодовой и материнской ДНК, а именно на различиях в метилировании плодовой ДНК и ДНК матери. В качестве мишеней используются гены гипометилированные гиперметилированные у матери, что у позволяет плода и использовать чувствительные к метилированию рестриктазы. Подобные ферменты специфично разрушают неметилированную ДНК матери и оставляют только гиперметилированную ДНК плода. После этого становится возможной специфичная детекция свободной ДНК плода методом ПЦР в режиме реального времени [ 132, 135, 137]. К другим методикам унаследованных от активированная лазерная тандемных повторов. отца относятся методом определение MALDI-TOF десорбция/ионизация, мутаций MS, матрично- анализ коротких Клиническое применения данных методик 17 описано для неинвазивной пренатальной диагностики талассемии, ахондроплазии, миодистрофии, муковисцидоза и врожденной гиперплазии коры надпочечников. Внедрение массивного параллельного геномного секвенирования в научные и клинические исследования открыло новую эру в неинвазивной пренатальной диагностике, как в исследовательском, так и в практическом направлении [157]. Клиническое использование количественного измерения сэ-ДНК в настоящее время активно развивается. Еще в 1999 году было обнаружено почти 5-кратное повышение сэ-ДНК плода в кровотоке матери при преэклампсии по сравнению с группой женщин с нормально протекающей беременностью [136]. Было установлено, что при преэклампсии происходит выброс в материнский кровоток клеток синцитиотрофобласта, микрочастиц, ДНК и РНК молекул. Анализ данного материала может расширить понимание вклада плацентарных факторов в этиологию преэклампсии. При дальнейшем изучении этой патологии выявлен не только рост уровней сэ-ДНК, но и значительное повышение общего уровня ДНК матери, причем увеличение обоих показателей соответствовало степени тяжести преэклампсии [127]. Кроме того, было показано, что концентрация сэ-ДНК возрастает задолго до появления первых клинических симптомов. Так как ДНК плазмы является маркером клеточной гибели, повышенный уровень фетальной ДНК может быть результатом некроза и апоптоза клеток плаценты. С другой стороны, нарушение функции почек и печени, наблюдаемое при преэклампсии, ослабляет выведение циркулирующей ДНК из материнской крови. Кроме преэклампсии, были описаны и другие акушерские осложнения, при которых имеет место повышение уровня сэ-ДНК: преждевременные роды, тяжелая рвота беременных, плотное прикрепление плаценты или ее врастание, ЗРП, 18 внутриматочные гематомы, многоводие, плацентарная недостаточность [84, 89, 94, 147]. Связь повышенных уровней сэ-ДНК с развитием плацентарной недостаточности была продемонстрирована в нескольких исследованиях. Так во Франции, определены уровни сэ-ДНК у женщин с задержкой роста плода (ЗРП) в связи с преэклампсией (группа А, 19 женщин), при ЗРП вследствие других причин (группа В, 31 пациентка). Контрольная группа состояла из 28 женщин (группа С). В результате исследования были сделаны выводы, что уровни как общей, так и сэДНК были достоверно выше при плацентарной недостаточности и ЗРП [151]. В Бристольском университете проводили оценку уровней сэ-ДНК в плазме крови матери во время нормальной беременности и сравнивали с осложненной беременностью (плацентарная недостаточность, преэклампсия и / или ЗРП). В исследование вошли 138 женщин, вынашивающих плод мужского пола, из них у 77 женщин беременность протекала нормально, у 49 – осложнилась преэклампсией, у 12 – были признаки ЗРП. Уровни сэ-ДНК были значительно выше у женщин с преэклампсией и с ЗРП, чем у женщин с нормальной беременностью, а также наблюдалась взаимосвязь высоких уровней сэ-ДНК со степенью тяжести преэклампсии. Группой ученых из Копенгагена было проведено исследование, в котором проанализирована взаимосвязь повышенных уровней сэ-ДНК у женщин с высоким риском преждевременных родов [92]. Была обнаружена значительная связь между преждевременными родами и повышенным уровнем сэ-ДНК, точность метода составляла 95%. Другое исследование было посвящено определению взаимосвязи между уровнями сэ-ДНК в крови матери и сроками родоразрешения [89]. Установлена взаимосвязь высоких уровней сэ-ДНК в крови у 19 женщин с развитием спонтанных преждевременных родов. Это наблюдение требует дальнейшего исследования для понимания патогенетических механизмов, лежащих в основе данного состояния. Кроме того, сэ-ДНК и общая ДНК матери были предложены в качестве потенциальных маркеров для неинвазивной пренатальной диагностики во время беременности. Тем не менее, соотношение изменений уровней сэ-ДНК и материнской ДНК при самопроизвольном выкидыше плодом с анеуплоидией еще не до конца изучены. Так в Корее было проведено исследование, где определялись уровни свободной эмбриональной ДНК и общей ДНК в кровотоке женщин с самопроизвольным выкидышем плодом с анеуплоидией [61]. В исследование вошло 268 женщин в первом триместре беременности, из них 41 женщина с самопроизвольным выкидышем и нормальным кариотипом плода, 26 женщин с самопроизвольным выкидышем плодом с анеуплоидией, и 201 женщина контрольной группы. Неметилированный PDE9A ген был использован для измерения уровней свободной эмбриональной ДНК в материнской плазме. Уровни свободной эмбриональной ДНК и общей ДНК были значительно выше у женщин с самопроизвольным выкидышем, как с нормальным кариотипом плода, так и с анеуплоидиями по сравнению с контрольной группой ( P <0,001 в обеих группах). В результате был сделан вывод, что высокие уровни сэ-ДНК и общей ДНК матери были выявлены у женщин с самопроизвольным выкидышем плодом с анеуплоидией [96, 154]. Эти результаты показывают, что свободная эмбриональная ДНК может быть полезным маркером выкидыша, как кариотипе плода. для прогнозирования самопроизвольного в случаях анеуплоидии, так и при нормальном 20 1.3. Возможности неинвазивной пренатальной диагностики по сэ-ДНК в выявлении анеуплоидий Общепринятая пренатальная диагностика у женщин без отягощенного семейного анамнеза состоит из двух шагов: оценка степени риска у всех беременных и последующая пренатальная диагностика в группе высокого риска. “Золотым стандартом” диагностики любой анеуплоидии является получение клеток плодового происхождения путем хориоцентеза или амниоцентеза с последующим классическим кариотипированием и реже молекулярными технологиями. Инвазивные методы пренатальной диагностики, обладая высокой информативностью, тем не менее, повышают риск прерывания беременности, особенно у женщин с наличием гестационных осложнений. Наиболее распространенными являются трисомии по 21, 18 и 13 хромосомам. Существующая система пренатального скрининга основана на оценке сочетания возраста матери, толщины воротникового пространства (измеренного при УЗИ) и биохимического исследования крови на свободный β-хорионический гонадотропин человека (β-ХГЧ) и PAPP-A в срок 11-13 недель беременности. При достижении порога отсечки в 1:100 и более по какой либо анеуплоидии женщина направляется к врачу генетику для решения вопроса об инвазивной пренатальной диагностике (Приказ Минздрава России от 12 ноября 2012г. № 572н). Частота выявления трисомий по 21 и 18 хромосоме при данном методе скрининга достигает 85-90%, уровень ложноположительных результатов до 5%. Показано, что при комбинированном тесте около 15% женщин, вынашивающих плоды с синдромом Дауна, не попадут в группу риска. Между тем, только в 15-28% случаев у женщин, попадающих в группу риска, по результатам цитогенетического анализа 21 (кариотипирование) у плода обнаруживаются хромосомные аномалии [75]. В связи с тем, что при общепринятом скрининге оцениваются только косвенные маркеры, метод имеет недостаточно высокую чувствительность и специфичность. В то же время, проведение инвазивной диагностики, обеспечивающей необходимый уровень достоверности, связано с риском осложнений и потери беременности, особенно у женщин с осложненным ее течением и отягощенным акушерским анамнезом. Недавние исследования показали, что наиболее эффективным методом скрининга анеуплоидий по 21 и 18 хромосомам, с частотой выявления более чем 99% и уровнем ложноположительных результатов около 0,1%, является исследование сэ-ДНК (cell-free DNA, cfDNA) выделенной из периферической крови матери [78, 152]. Доля сэДНК, достаточная для проведения подобных исследований, достигается уже к 10-11 неделе беременности [47]. Внедрение нового неинвазивного теста для диагностики анеуплоидий 21 и 18 хромосом поможет предотвратить рождение детей с наиболее частыми хромосомными синдромами, сопровождающимися высокой летальностью и/или тяжелой инвалидизацией и избежать излишних инвазивных процедур [54]. Главным различимым фактором при диагностике анеуплоидий является снижение или увеличение специфического хромосомного материала. В целях неинвазивной пренатальной диагностики важно не только определить количество хромосомного материала, но и соотнести его с определенной хромосомой. В настоящее время исследователи не пришли к единому мнению относительно наилучшего метнеинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий, обсуждение различных методик продолжаются. Несмотря на то, что некоторые исследователи полагают, что при анеуплоидиях происходит 2-х – 3-х кратное повышение уровней как сэДНК, так и общего уровня свободной ДНК (материнской и 22 эмбриональной), это утверждение подтверждается не во всех работах. Ряд исследований показали отсутствие достоверных различий в уровнях свободной ДНК эмбрионального происхождения и общего уровня свободной ДНК при трисомиях по 21, 13 и 18 хромосомам [142, 158]. Уровни сэ-ДНК колеблются в широких пределах, во многом зависят от характера течения беременности, в связи с чем более перспективными являются определение хромосомных и маркеров, количественная которые оценка обязательно специфических меняются при анеуплоидиях. В настоящее время методы неинвазивной пренатальной диагностики не могут быть альтернативой или заменить инвазивные процедуры, особенно в случаях мозаицизма, когда число анеуплоидных клеток уступает нормальным. Однако, определение свободных нуклениновых кислот может быть использовано для скрининга и определения риска у всех беременных независимо от возраста до постановки окончательного диагноза, как самостоятельный метод, так и в дополнение к существующим методам. Зарубежные авторы полагают, что определение сэ-ДНК может заменить или усовершенствовать существующие скрининговые тесты. Подобные выводы были сделаны, основываясь на результатах нескольких проспективных исследований, во всех случаях подтвержденных классическим кариотипированием. Исследование, проведенное в Калифорнии, было посвящено выявлению сэ-ДНК методом массивного параллельного секвенирования у женщин группы высокого риска по реализации трисомий 21, 18 и 13, направленным на инвазивную пренатальную диагностику. В общей сложности было проанализировано 3430 пациентов, из них 137 плодов с трисомией 21, 39 с трисомией 18 и 16 с трисомией 13. Для трисомии 21 не было отмечено ложноотрицательных результатов, выявлены 3 ложноотрицательных результата для трисомии 18 и 2 для трисомии 13. 23 Все 3 ложноположительных результата относились к трисомии 21. Положительная прогностическая ценность тестов для трисомий 18 и 13 были 100%, для трисомии 21 - 97,9%. В исследовании участвовало 8,6% женщин со сроком беременности больше 21 недели, у которых не было никаких анеуплоидий плодов. Выявлено 15 анеуплоидий по половым хромосомам, несмотря на то, что в 11 из 15 этих наблюдений были ложноположительные результаты для 45Х. В совокупности положительная прогностическая ценность для анеуплоидий половых хромосом отмечена в 48,4%, а отрицательная прогностическая проспективного ценность составила 100%. В результате этого исследования было показано, что неинвазивная пренатальная диагностика по сэ-ДНК может являться новым скринингтестом с очень высокой чувствительностью и специфичностью для трисомии 21 (> 99%), но с меньшей чувствительностью для трисомий 18 и 13 [121]. Аналогичные данные были получены в исследовании немецких авторов относительно трисомии по 21 хромосоме [117]. Группа ученых под руководством D.Bianchi, лидера в области работ, посвященных неинвазивной пренатальной диагностике (США) провела многоцентровое проспективное ослепленное исследование, целью которого явилось: сравнить результаты общепринятого скрининга на анеуплоидии с результатами массивного параллельного геномного секвенирования у беременных низкого риска. Включено 2042 женщины, из которых 128 выбыли из исследования в связи с различными причинами, 1914 проб подвергнуто первичному анализу, из них 1909 на трисомию 21, 1905 ложноположительные секвенирования и на трисомию результаты, общепринятого 18. полученные скрининга. Проанализированы в результате При проведении исследования на трисомию 21, в первом и втором триместрах 24 ложноположительный результат получен в 4 – х случаях, тогда как при общепринятом скрининге в 51 случае. В третьем триместре эти результаты составили 2 и 18 соответственно. При исследовании на трисомию 18 получены аналогичные результаты, однако различия были значимы при анализе проб первого и второго триместров. Полученные результаты были достоверными для трисомий 18 и 21, ложноположительные результаты были достоверно ниже при проведении секвенирования по сравнению с общепринятым скринингом. Отрицательный предиктивный результат секвенирования составил 100%. Положительный предиктивный результат при секвенировании превосходил анологичный показатель при общепринятом скрининге в 10 для трисомии 21, в 5 раз для трисомии 18 [75]. Несмотря на обнадеживающие результаты, у профессиональных сообществ нет единого мнения относительно возможности использования данной технологии для скрининга беременных. Два профессиональных сообщества – Великобритании и США высказали различные мнения о необходимости внедрения методов неинвазивной пренатальной диагностики по определению сэ-ДНК для беременных низкого риска по реализации хромосомной патологии. В настоящее время тестирование применяется у беременных высокого риска, однако существует мнение, что подобное расширенное обследование необходимо рекомендовать и для женщин низкого риска. Так, Королевское общество акушеров – гинекологов Великобритании (RCOG) полагает, что в настоящее время неинвазивная пренатальная диагностика должна стать первичным звеном скрининга хромосомных аномалий во время беременности. В противоположность этому мнению, американская ассоциация по фетальной медицине Society for Maternal Fetal Medicine (SMFM) осторожно заявляет, что неинвазивная пренатальная диагностика является многообещающим 25 методом, который демонстрирует прекрасные результаты, но этого недостаточно, чтобы изменить существующие в настоящее время рекомендации Американского общества акушеров-гинекологов (ACOG) и специалистов по фетальной медицине (SMFM). RCOG утверждает, что тестирование дает убедительные результаты, приближающиеся к точности 100%, однако, метод имеет ограничения в некоторых случаях, к которым относятся: очень ранние сроки беременности, когда низкий уровень сэ-ДНК не позволяет исключить ложно отрицательный результат; ожирение беременной, когда фракция сэ-ДНК является крайне низкой; исследование при дихориальной двойне, когда интерпретация данных затруднена, что особенно важно, если речь идет о самопроизвольной редукции одного эмбриона из дихориальной двойни; мозаицизм тканей женщины или плацентарный мозаицизм (около 1% случаев); материнские факторы, например, онкологическое заболевание, сопровождающееся массивным выбросом опухолевой ДНК. Согласно опубликованным комментариям в New England Journal of Medicine, RCOG предусматривает 3 модели, при которых неинвазивная пренатальная диагностика по сэ-ДНК дает наилучшие результаты и может быть внедрена в национальную клиническую практику Великобритании: в качестве резервного метода после проведения скрининга, включающего в себя тройной тест и УЗИ (по предварительным данным около 20% женщин будут направлены на дополнительное тестирование) 26 как часть комбинированного скрининга; как самостоятельный метод первой линии у всех женщин. Касаясь возможности проведения такого расширенного тестирования, RCOG утверждает, что материальные средства могут быть переведены в пользу внедрения нового метода взамен существующего исследования биохимических экономической эффективности маркеров. методов, Обсуждая авторы вопросы полагают, что стоимость исследования, скорее всего, упадет, так как в последние годы расходы на секвенирование ДНК существенно снижаются. Авторы полагают, что в целом, замена определения биохимических маркеров, которые часто указывают на повышенные риски, на тестирование сэДНК, позволит повысить точность исследования. Кроме того, новый метод тестирования, позволит уменьшить количество инвазивных диагностических процедур у пациенток, вынашивающих плодов без хромосомной патологии. Оппонент RCOG, которым является SMFM, подчеркивает необходимость получения большего объема данных особенно среди групп беременных низкого риска и обращает внимание на ограничение возможностей новых методов. Например, профессор Vincenzo Berghella, президент SMFM, полагает, что уровень трисомии 21, выявленный в нескольких последних исследованиях методом НПД по сэ-ДНК существенно выше, чем обычно выявляется в группе женщин низкого риска, что является важным, если это исследование служит основой для расширения инвазивного тестирования. Кроме того, SMFM указывает на следующие ограничения проведенных исследований: Ложно позитивные тесты, которые особенно срабатывают при тестировании трисомии 13 и половых хромосом. 27 Некоторые образцы в проведенных исследованиях были взяты у женщин в третьем триместре беременности, когда уровень сэ-ДНК является высоким и обусловливает большую точность исследования. В некоторых вышеуказанных случаях подобный скрининг не даст результата (двойни, мозаицизм, ожирение и т.д.). В исследовании выявлено только 8 анеуплоидных плодов, что слишком мало для оценки эффективности тестов. Таким образом, в условиях отсутствия новых клинических рекомендаций, по-прежнему проводится рутинный биохимический и УЗ скрининг, однако, в ближайшем будущем, по-видимому, изменения в НПД будут внесены с учетом существующих ограничений метода определения сэ-ДНК. Неинвазивные клиническую пренатальные значимость беременности, когда у с методы женщин одной с стороны, приобретают осложненным есть особую течением ограничения и противопоказания к проведению инвазивных методов диагностики, с другой стороны обусловлена угроза прерывания вынашиванием консервативную тактику плода ведения с беременности может анеуплоидией, беременности что быть делает бесполезной и неэффективной. Требуются дальнейшие исследования в данной области для определения возможностей клинического применения описанных методов, как у беременных женщин групп риска, так и в качестве скрининговых методик. 28 Глава 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Критерии включения и исключения пациенток в группы исследования В соответствии с поставленными задачами, исследование сэ-ДНК проводилось двум категориям женщин. Первая часть диссертационной работы посвящена определению уровней сэ-ДНК и общей ДНК вне зависимости от пола плода у женщин с нормальной и осложненной беременностью для раннего прогнозирования гестационных осложнений и исходов беременностей. Во второй части работы проведена оценка клинической значимости выявления анеуплоидий по 21 и 18 хромосомам, а также копийности половых хромосом (X и Y) с помощью неинвазивной пренатальной диагностики по сэ- ДНК по сравнению с общепринятым скринингом беременных. Для выполнения первой части диссертационной работы обследование проведено 93 беременным женщинам. Из них на основании критериев включения и исключения в исследование вошли 67 пациенток. В связи с техническими возможностями метода выделения сэ-ДНК на основании выявления различных последовательностей у партнеров дальнейшее измерение уровней сэ-ДНК стало возможным провести у 56 супружеских пар (83,6%). Основную группу составили 32 беременные с привычным выкидышем, контрольную группу – 24 беременных с неотягощенным акушерским и гинекологическим анамнезом. Забор крови проводился, начиная со срока 5-6 недель беременности с интервалом 2 недели до 22 недель беременности вне зависимости от пола эмбриона/плода, далее ежемесячно. 29 Критериями включения в основную группу являлись: возраст женщин от 20 до 40 лет; три и более самопроизвольных прерываний беременности от одного и того же партнера или два и более, если в каждом случае был доказан нормальный кариотип эмбриона/плода; самопроизвольное наступление беременностей (отсутствие бесплодия); регулярный менструальный цикл, предшествующий беременности; нормальный кариотип партнеров; срок беременности 5-6 недель от первого дня последней менструации, подтвержденный данными УЗИ; подписанное информированное согласие на проведение исследования. Критерии исключения: многоплодная беременность; наличие генетических факторов привычных потерь беременности; гормональные нарушения, сопровождающиеся олигоменореей, аменореей; анатомические причины привычного выкидыша; наличие хронических инфекционных, онкологических, системных аутоиммунных заболеваний; резус-сенсибилизация; ожирение (ИМТ более 30 кг/м2). Пациентки основной группы составляли группу риска по реализации ранних и поздних гестационных осложнений. 30 Критериями включения в контрольную группу являлись: возраст женщин от 20 до 40 лет; физиологическое течение беременности на момент обследования; неотягощенный акушерский и гинекологический анамнез; подписанное информированное согласие на проведение исследования. Критериями исключения являлись: многоплодная беременность; наличие хронических инфекционно-воспалительных, онкологических, системных аутоиммунных заболеваний; тяжелая экстрагенитальная патология; резус-сенсибилизация; ожирение (ИМТ более 30 кг/м2). Для выполнения второй части исследования, посвященной неинвазивной пренатальной диагностике анеуплоидий, было проведено исследование сэ-ДНК плода методом высокопроизводительного секвенирования в крови 200 беременных женщин до 20 недель гестации и классическое кариотипирование 200 образцов, полученных путем инвазивной пренатальной диагностики (ткань хориона, плаценты, клетки амниотической жидкости). Все 200 женщин входили в группу риска реализации хромосомной патологии плода по результатам общепринятого скрининга первого триместра (биохимических маркеров, данных УЗИ и возраста). Критерии включения: срок беременности от 10 до 20 недель; 31 высокий риск хромосомной патологии плода (трисомии 21, 18, моносомии Х) по результатам общепринятого скрининга беременных; согласие на проведение инвазивной пренатальной диагностики (биопсия ворсин хориона, плаценты, амниоцентез); информированное согласие на забор крови из вены для проведения исследования; Критерии исключения: отказ или невозможность проведения инвазивной пренатальной диагностики (биопсия ворсин хориона, плаценты, амниоцентез); невозможность проведения пункции периферической вены; отказ от участия в исследовании. 2.2. Методы исследования Перед включением в исследование все пациентки прошли обследование по определенной схеме, состоящей из следующих клинических и лабораторных методов: Сбор данных анамнеза (характер менструаций, число беременностей, выкидышей, родов и абортов, особенности их течения, наличие осложнений; сведения о наследственности, перенесенных ранее заболеваниях, наличии вредных привычек). Объективный осмотр (тип телосложения, степени развития подкожной жировой клетчатки, характер оволосения, определение наличия видимых отеков, состояния кожных покровов и слизистых оболочек, молочных желез). Гинекологический осмотр (осмотр наружных половых органов, влагалищное исследование, осмотр в зеркалах: определение состояние слизистой влагалища и шейки матки, выявление эктопии 32 шейки матки, воспалительные заболевания влагалища и шейки матки, наличие опухолей). Ультразвуковое исследование матки (выяснение жизнеспособности эмбриона (сердцебиения на ранних сроках беременности), соответствия развития гестационному сроку, определение характера имплантации/плацентации, диагностика наличия ретрохориальной и / или заоболочечной гематомы). Общепринятое лабораторное обследование: клинический анализ крови, биохимический анализ крови, общий анализ мочи, анализ крови на ВИЧ, сифилис, гепатиты, группу крови, резус-фактор. Бактериологический посев из цервикального канала и мазок из влагалища на степень чистоты. Исследование отделяемого влагалища и цервикального канала на наличие патогенных и условно-патогенных микроорганизмов методом ПЦР («фемофлор16», «фемофлор-комплекс»). Гемостазиологическое исследование крови. Анализ крови на наличие аутоиммунных антител (антитела к β 2гликопротеину, аннексину, протромбину, кардиолипину, фосфатидилсерину). Проба на ВА. Оценка врожденных факторов, предрасполагающих к развитию тромбофилии. Проведено проспективное наблюдение за течением и исходами беременностей женщин всех групп. В динамике беременности проводилась оценка фетоплацентарного комплекса: ультразвуковая фетометрия, допплерометрия в 24-25, 30-31 недели беременности (при наличии показаний), после 33 недель еженедельно. кардиотокография 33 2.3. Специальные методы исследования К специальным методам исследования относились методы определения сэ-ДНК в периферической крови женщин. Для молекулярно-генетических исследований использовали периферическую кровь, собранную в пробирки с ЭДТА. Определение сэ-ДНК, независимо от пола плода, проводилось методом ПЦР в режиме реального времени (real time PCR). В качестве «мишени» выбирались участки генома, содержащие делеционные полиморфизмы, что позволяло отличить геном плода от генома беременной женщины на основании отцовских полиморфизмов. В работе определялись уровни представленности в образце общей ДНК и ДНК плода методом ПЦР в реальном времени. Уровень представленности общей ДНК определяли с помощью детекции участка гена цитокератина (KRT9), для которого не наблюдается вариабельности числа копий. Уровень представленности в образце ДНК плода определяли с помощью детекции одного из 16-ти вариабельных участков, которые могут отсутствовать в геноме матери, но присутствовать в геноме плода. В 91% случаев удалось обнаружить участки, которые отсутствовали в геноме у матери, но присутствовали в геноме плода, и определить долю плодовой ДНК. Взятие материала Забор крови проводился в пробирки объёмом 5 мл с ЭДТА. Подготовка плазмы к выделению Пробирки с кровью в течение 2 часов доставлялись в лабораторию. Плазму получали по следующему протоколу: 1. Пробирки с кровью центрифугировать 10 мин при 1200 об/мин при комнатной температуре. 34 2. Промаркировать 2 пластиковые пробирки объёмом 1,5 мл для каждого образца крови. 3. Не задевая нижнюю (клеточную) фракцию отобрать по 1100 мкл верхней фракции (плазмы) и перенести в соответствующим образом промаркированные пробирки. 4. Пробирки с плазмой центрифугировать 10 мин при 13200 об/мин при комнатной температуре. 5. Промаркировать 2 пластиковые пробирки объёмом 1,5 мл для каждого образца крови. 6. Не задевая осадок отобрать по 1000 мкл верхней фракции и перенести в соответствующим образом промаркированные пробирки. 7. Хранить при температуре -20 C. Выделение ДНК Выделение ДНК из плазмы проводили из 500 мкл плазмы с помощью реагентов «проба НК» (ДНК-технология) согласно протоколу производителя, с предварительной обработкой протеиназой К. Выделение ДНК из крови проводили с помощью реагентов «проба Рапид» (ДНК-технология) согласно протоколу производителя. Генотипирование родителей и определение представленности плодовой ДНК в плазме Генотипирование родителей проводилось методом ПЦР в реальном времени. Одновременно в постановке исследовались все 16 вариабельных участков. Для последующего исследования отбирались вариабельные участки, присутствовали у отца. которые отсутствовали у матери, но 35 Определение представленности плодовой ДНК в плазме проводилось методом ПЦР в реальном времени. Для определения представленности ДНК в постановке одновременно исследовались вариабельные участки, которые отсутствовали у матери, но присутствовали у отца и участок гена цитокератина. Амплификация каждого участка проводилась в 2-х повторах. Регистрация и учет результатов амплификации проводится с помощью детектирующего амплификатора ДТ-384. Регистрация сигнала флуоресценции проводится по каналу FAM, осуществляется прибором автоматически во время амплификации. Оформление протокола (тип анализа «Качественный», метод определения «Геометрический») и анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору («Руководство по эксплуатации» для ДТ-384). Для вычисления уровня экспрессии использовать значения индикаторных циклов (Cp). В таблице 2 приведены результаты генотипирования образцов. М – генотип отца ребенка, Ж – генотип матери. Наличие исследуемого маркера отмечено знаком «+». Цветом отмечены маркеры, которые присутствуют у отца, но отсутствуют у матери (кроме маркера Y хромосомы). 36 Генотипирование образцов Таблица 2 образец 1M 1Ж 2М 2Ж 3М 3Ж 4М 4Ж 5М 5Ж 6М 6Ж 7М 7Ж 8М 8Ж 9М 9Ж 10М 10Ж 11М 11Ж 12М 12Ж 13М 13Ж 14М 14Ж 15М 15Ж 16М 16Ж 17М 17Ж 18М 18Ж 19М 19Ж 20М 20Ж 21М 21Ж 22М 22Ж 24М 24Ж 25М 25Ж 26М 26Ж маркер 19 198 + + + + + + + 48 626 + + + + + + + + + + + + + 267 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 431 631 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 849 + + + + + 530 + + + + + + + + + + + + + + + + 407 + + + + + + + + 378 + + 27М+ 27Ж 30М 30Ж gstm + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 845 id22 Y + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 201 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 37 Таблица 2 (продолжение) образец 31М 31Ж 32м 32ж 33М 33Ж 34М 34Ж 35М 35Ж 36м 36ж 37м 37ж 38м 38ж 39м 39ж 40м 40ж 41М 41Ж 42М 42Ж 43М 43Ж 44М 44Ж 45М 45Ж 47М 47Ж 48м 48ж 49м 49ж 50м 50ж 51м 51ж 52м 52ж 53М 53Ж 55M 55Ж 56М 56Ж 57М 57Ж 61М 61Ж 62М 62Ж 63М 63Ж 65М 65Ж 66М 66Ж 67М 67Ж маркер 19 198 + + gstm 48 626 267 378 + 407 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 530 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 849 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 431 + + + + + 631 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 201 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + id22 + + + + + Y + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 845 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 38 Расчет количества ДНК в образце Количество копий ДНК в образце рассчитывали по формуле: N=10^((45-Cp)/3.4). Долю фетальной ДНК рассчитывали по формуле: Доля = 2*Nfet/Nall, Nfet - количество копий плодовой ДНК в образце; Nall - количество копий общей ДНК в образце. В таблице 3 показаны праймеры и зонды, использованные в работе. Таблица 3 Праймеры и зонды маркер Primer-F Primer-R Probe TCCTCTCGGTTATAGAT GTGTC GCCGAAGCATCTGTAGGTCCCT 19 BhqACCGCTGTGTCGCGGCCC-fam CGTGGGGAGTCGGTCG GGTGCGA AAGCGCGCGTACTCCTCT 198 BhqACCGCTGTGTCGCGGCCC-fam GCCGAAGCATCTGTAG GTCCCT TCTTGGGTTTAACAACTTCAGTC BhqACCGCTGTGTCGCGGCCC-fam 48 AAGCGCGCGTACTCCT CT TGCGGGTCAAAACCTCCAAATT TG BhqACCGCTGTGTCGCGGCCC-fam TCTTGGGTTTAACAACT TCAGTC GGCCGCGGGGAGCCCCG 626 BhqACCGCTGTGTCGCGGCCC-fam 267 TGCGGGTCAAAACCTC CAAATTTG GCGGGTCAAAACCTCCAAATTT G BhqACCGCTGTGTCGCGGCCC-fam 378 GGCCGCGGGGAGCCCC G CTCTAGGACATGTCATTCTTCG G BhqACCGCTGTGTCGCGGCCC-fam 407 TCCTCTCGGTTATAGAT GTGTC CATAACCAGGAGGAGAACGTG CGCT BhqACCGCTGTGTCGCGGCCC-fam CGTGGGGAGTCGGTCG GGTGCGA GCCGAAGCATCTGTAGGTCCCT 530 BhqACCGCTGTGTCGCGGCCC-fam GCCGAAGCATCTGTAG GTCCCT AAGCGCGCGTACTCCTCT 849 BhqACCGCTGTGTCGCGGCCC-fam AAGCGCGCGTACTCCT CT TCTTGGGTTTAACAACTTCAGTC 431 BhqACCGCTGTGTCGCGGCCC-fam 631 TCTTGGGTTTAACAACT TCAGTC TGCGGGTCAAAACCTCCAAATT TG BhqACCGCTGTGTCGCGGCCC-fam TGCGGGTCAAAACCTC CAAATTTG GGCCGCGGGGAGCCCCG Bhq gstm 201 ACCGCTGTGTCGCGGCCC-fam 39 Таблица 3 (продолжение) маркер Primer-F Primer-R Probe GGCCGCGGGGAGCCCCG TCCTCTCGGTTATAGATGTGT C BhqACCGCTGTGTCGCGGCCC-fam id22 GCGGGTCAAAACCTCCA AATTTG CGTGGGGAGTCGGTCGGGTGC GA BhqACCGCTGTGTCGCGGCCC-fam Y CTCTAGGACATGTCATTC TTCGG GCCGAAGCATCTGTAGGTCCC T BhqACCGCTGTGTCGCGGCCC-fam krt CATAACCAGGAGGAGAA CGTGCGCT ATCACCAGGGGGTTGCTGGGT GCCGA BhqACCGCTGTGTCGCGGCCC-fam 845 Методы исследования для проведения высокопроизводительного секвенирования в неинвазивной диагностике анеуплоидий Медицинская технология для неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий 21 и 18 хромосом, а также определения копийности половых хромосом (X и Y) проводится методом высокопроизводительного секвенирования (next-generation sequencingNGS). В аналитическую панель включено определение анеуплоидий 13 и 21 хромосомы и идентификацию хромосом X и Y (пол плода). Перед (биопсия проведением ворсин инвазивной хориона, плаценты, пренатальной амниоцентез) проводили венепункцию с забором 4 мл крови. Дизайн исследования представлен на рисунке 1. диагностики женщинам 40 Рисунок 1. Дизайн исследования. Полученный материал анализировали с помощью цитогенетического и молекулярно-генетического методов. Для оценки наличия или отсутствия анеуплоидий 21,18 хромосом, хромосомы X, а также наличия хромосомы Y у плода из крови матери отделяли плазму, после чего проводили выделение внеклеточной ДНК, содержащей материнскую и фетальную фракции, приготовление библиотек ДНК для полупроводникового секвенирования, эмульсионную ПЦР и высокопроизводительное секвенирование на приборе Ion Proton (Life Technologies, США). В таблице 4 представлены реагенты, использованные для анализа. Результаты оценивали с помощью биоинформатической обработки данных секвенирования ДНК, для сравнение покрытия внутри образца применяли T-test. 41 Таблица 4 Наборов реагентов, использованных для проведения неинвазивной пренатальной диагностики Этап исследования Реагент Производитель QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit Qiagen Proteinase K Qiagen Ion Xpress Plus Fragment Library Kit P/N 4471269 Life Technologies Thermo Fisher Ion Xpress™ Barcode Adapters 1-96 Kit P/N 4474517 Life Technologies Thermo Fisher AMPure XP beads Beckman Qubit dsDNA HS Assay Kit P/N Q32854 Life Technologies Thermo Fisher High Sensitivity DNA Kit P/N 50674626 Agilent NaOH, 10 M раствор, molecular biology grade Sigma Aldrich Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Life Technologies Thermo Fisher Ion PI™ Template OT2 200 Kit v3 Life Technologies Thermo Fisher Ion PI™ Sequencing 200 Kit v3 Life Technologies Thermo Fisher Ion PI™ Chip Kit v2 Life Technologies Thermo Fisher Специфичность определения количества хромосом подтверждали, проводя цитогенетическое исследование – G-окрашивание клеток ворсин хориона, плаценты, амниотической жидкости по стандартному протоколу. Определяли специфичность, как долю правильно определенных анеуплоидий (при получении одинаковых результатов различными методами исследования). 42 Длительность секвенирования: • Получение плазмы крови — 45 мин. • Выделение внеклеточной ДНК, содержащей материнскую и фетальную фракции — 4 часа. • Приготовление библиотек ДНК для полупроводникового секвенирования — 16 часов. • Проведение эмульсионной ПЦР — 10 часов. • Высокопроизводительное секвенирование ДНК — 7 часов. • Первичный анализ данных секвенирования — 7 часов. • Определение и оценка доли 18, 21 и половых хромосом в результатах секвенирования — 5 часов. • Интерпретация полученных результатов — 1 час. Общая длительность процедур — примерно 42 часа /6 полных рабочих дней. Специфичность определения копийности хромосом подтверждают, проводя цитогенетическое исследование – G-окрашивание клеток ворсин хориона, плациенты, амниотической жидкости по стандартному протоколу. Определяют специфичность как долю правильно определенных анеуплоидий (при получении одинаковых результатов различными методами исследования). 2.4. Статистическая обработка материала Все полученные анамнестические данные, анализы и исследования были обработаны с помощью компьютерной программы Statistica for Windows v 8.0. Для всех количественных показателей были определены: среднее значение (M), стандартное отклонение (δ), ошибка среднего (m), 95% доверительный интервал, медиана (Ме), интерквартильный размах, а для номинальных значений рассчитаны частоты (%). Полученные данные 43 были проверены на соответствие нормальному распределению с помощью критерия Шапиро-Уилка. При сравнении средних значений между группами применяли параметрический t-критерий Стьюдента или непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Анализ показателей, изменяющихся в течение беременности, производился с помощью парного t-критерия Стьюдента (при нормально распределенных значениях) или с помощью непараметрического аналога – критерия Вилкоксона. Сравнение распределения показателей (частот) между группами осуществлялось с помощью критерия Хи-квадрат с построением соответствующих таблиц (2х2 или 2х3) или с помощью t-критерия Стьюдента для долей с поправкой Бонфе ррони. Различия считались статистически значимыми при p<0,05. 44 ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Определение уровней сэ-ДНК независимо от пола плода для прогнозирования гестационных осложнений 3.1.1 Клиническая характеристика женщин исследуемых групп В ходе проведенного исследования были проанализированы клинические и анамнестические данные 56 женщин включенных в исследование на основании критериев, изложенных в главе 2. Проведен тщательный сбор анамнеза пациенток исследуемых групп - данные о возрасте, социально-экономическом положении, профессиональных вредностях, наследственности, проанализированы экстрагенитальная и гинекологическая заболеваемость, характер менструальной функции, репродуктивный анамнез. Средний возраст женщин основной группы составил 30,6±4,5 лет, контрольной группы 28,5±4,6 лет. Женщины исследуемых групп были сопоставимы по возрасту, данные представлены в таблице 5. Таблица 5 Распределение обследованных женщин по возрасту Возраст (лет) Основная группа (n=32) абсолютные % значения Контрольная группа (n=24) абсолютные % значения 21-24 - - 1 4,2 25-29 6 18,7 8 33,3 30-34 22 68,8 11 45,8 35-40 4 12,5 4 16,7 (p>0,05 статистически значимых различий между группами не выявлено). 45 Все женщины проживали в одинаковых климатогеографических условиях - преимущественно в городе Москва и Московской области, имели среднее и высшее образование. Профессиональных вредностей при сборе анамнеза не выявлено. При анализе частоты соматических заболеваний, представленных в таблице 6, достоверных различий между пациентами основной и контрольной групп не отмечено. Таблица 6 Структура соматической заболеваемости у женщин исследуемых групп Заболевания Основная группа n=32 абс. % Контрольная группа n=24 абс. % Заболевания сердечно сосудистой системы 4 12,5 3 12,5 пролапс митрального клапана Варикозная болезнь 2 6,2 2 8,3 Заболевания щитовидной 6 15,6 4 17,0 железы (субклинический гипотиреоз) Заболевания желудочно кишечного тракта 3 9,3 2 8,3 Хронический холецистит Хронический гастрит 2 6,2 3 9,7 Язвенная болезнь 121 3,1 2 8,3 перстной кишки Цистит 4 12,5 3 12,5 Заболевания опорно двигательного аппарата 2 6,2 1 3,9 (сколиоз, остеохондроз) (p>0,05 статистически значимых различий между группами не выявлено). Субклинический гипотиреоз, компенсированный во время беременности, был обнаружен у 6 женщин основной группы и у 4 контрольной. Заболевания опорно - двигательного аппарата также 46 достоверно не различались по частоте в основной и контрольной группах и были представлены сколиозом грудного отдела позвоночника и остеохондрозом, преимущественно, поясничного отдела позвоночника. При анализе частоты гинекологических заболеваний, установлен более высокий процент хронических воспалительных заболеваний органов малого таза у пациенток с привычным выкидышем, чаще всего в анамнезе отмечен эндометрит и/или сальпингит, оофорит, пролеченный до наступления данной беременности, что достоверно превышает частоту воспалительных заболеваний в контрольной группе (таблица 7). Таблица 7 Структура гинекологических заболеваний у женщин исследуемых групп Гинекологические Основная группа Контрольная заболевания n=32 группа n=24 Воспалительные заболевания органов малого таза Субсерозная миома матки Эндометриоз абс. % абс. % 23 72,0* 3 12,0 6 19,0 3 12,5 2 6,2 1 4,1 25,0 6 25,0 6,2 - - 12,5 2 8,3 9,4 - - Патология шейки матки 8 -эктопия Патология эндометрия - полип эндометрия 2 (удален при гистерорезектоскопии) - внутриматочные 4 синехии (разделение) Кисты яичников -эндометриоидные 3 *p<0,05(критерий Хи-квадрат) 47 Оперативные вмешательства при эндометриозе, эндометриодных кистах яичников, внутриматочных синехиях и полипах проведены в 8 случаях у женщин основной группы. Эктопия шейки матки и субсерозная миома матки также встречались гораздо чаще у женщин основной группы, чем в контрольной. При анализе менструальной функции, выявлено, что менархе в возрасте 12-14 лет отмечено у 71,8% женщин основной и у 70,8% женщин контрольной группы (таблица 8). Таблица 8 Возраст менархе у обследованных женщин Возраст менархе Основная группа Контрольная группа n=32 n=24 абс. % абс. % 10-11 лет 12-14 лет 5 23 15,6 71,8 4 17 16,7 70,8 15 лет и старше 4 12,6 3 12,5 p> 0,05 (критерий Хи-квадрат) При анализе продолжительности менструального цикла отсутствовали достоверные отличия у пациенток основной группы по сравнению с пациентками контрольной группы (таблица 9). Таблица 9 Продолжительность менструального цикла Длительность Основная группа Контрольная группа менструального цикла n=32 n=24 (дни) абс. % абс. % 21-24 25-35 3 23 9,3 72 4 17 16,7 70,8 более 35 6 18,7 3 12,5 p > 0,05 (критерий Хи-квадрат) 48 Проанализирована репродуктивная функция женщин исследуемых групп. Установлено, что в анамнезе у 32 женщин с привычным выкидышем было 98 беременностей (таблица 10). В контрольной группе 16 (66,7%) женщин было первобеременными, у 5 (20,8%) женщин беременность была второй, у 3 женщин (12,5%) третьей, в анамнезе рождение здоровых доношенных детей. Осложнений в анамнезе у рожавших женщин контрольной группы в виде угрожающего выкидыша, угрозы преждевременных родов не отмечено. В таблице 10 представлены данные о числе беременностей у женщин основной группы. Как видно из представленных данных, у 56,3 % женщин в анамнезе было 3 и более беременностей. Таблица 10 Число беременностей у обследованных женщин основной группы Женщины основной группы (n=32) Число беременностей абс. % 2 3 4 5 Всего 14 7 6 5 98 43,8 21,8 18,8 15,6 100 Чаще всего у женщин с привычным выкидышем отмечались ранние гестационные потери – самопроизвольные выкидыши или неразвивающиеся беременности, данные представлены в таблице 11. 49 Таблица 11 Исходы предыдущих беременностей у женщин с привычным выкидышем Исходы беременностей Всего беременностей Самопроизвольные выкидыши и неразвивающиеся беременности Поздние самопроизвольные выкидыши Искусственный аборт Трубная беременность Преждевременные роды Антенатальная гибель плода Женщины основной группы (n=32) абс. % 98 100 78 6 79,6 6,1 2 2 7 3 2,0 2,0 7,1 3,2 В 2 (2,0%) случаях проведены туботомии лапароскопическим доступом по поводу внематочных беременностей. У 6,1% женщин в анамнезе отмечались поздние выкидыши, причиной которых был хориоамнионит и излитие околоплодных вод. При анализе исходов беременностей женщин основной группы установлены самопроизвольные потери беременности до 22 недель в 85,7% случаев, преждевременные роды (до 37 недель) в 4,1% наблюдений. Сроки самопроизвольного прерывания беременностей представлены в таблице 12. 50 Таблица 12 Сроки самопроизвольного прерывания беременностей и преждевременных родоразрешений (% к общему числу беременностей) Сроки прерывания беременностей и родоразрешения (недели) 5-12 Общее число беременностей n=98 абс. % 78 79,6 13-22 6 6,1 22-28 5 5,1 28-37 2 2,0 Таким образом, при анализе анамнестических данных женщин основной группы, выявлено, что большинство пациенток 56,3% имели 3 и более ранних потерь беременности, во всех случаях первичного характера, 79,6% всех гестационных потерь было в сроках до 12 недель, 85,7% всех беременностей беременностей женщин прервалось основной до 22 группы недель. 7 Из 98 закончились преждевременными родами, 5 из них очень ранние преждевременные роды с 22 по 28 неделю беременности. Следовательно, беременные основной группы составляют группу риска по реализации как ранних, так и поздних гестационных осложнений, исходя из анамнестических данных. 51 3.1.2. Результаты клинико-лабораторного обследования супружеских пар с привычным выкидышем на ранних сроках беременности В соответствии с поставленными задачами у беременных исследуемых групп проводилось обследование и амбулаторное наблюдение в Научно-поликлиническом отделении ФГБУ НЦ АГиП по стандартной схеме, разработанной в отделении профилактики и лечения невынашивания беременности (2-м отделении акушерском патологии беременности). При необходимости в госпитализации лечение проводилось во 2-м стационарное отделении акушерском патологии беременности. Данные объективного обследования. При наружном осмотре было выявлено, что у всех обследованных женщин имеется женский тип телосложения, вторичные половые признаки развиты правильно, средний рост составил 166,3±2,5 см, средний вес 67,4±2,2 кг. Пациентки с ИМТ более 30 кг/м2 не включены в исследование (критерий исключения). Гинекологический статус. При наружном осмотре установлено, что у всех женщин наружные половые органы развиты правильно, преддверие влагалища без анатомических изменений. При бимануальном исследовании у 19,0% обнаружено увеличение размеров матки за счет мелких миоматозных узлов различной локализации, что не потребовало оперативных вмешательств. При осмотре шейки матки в зеркалах обнаружено у 20,0% имеется цервицит, а у 25,0% эктопия шейки матки. 52 Практически наступления у всех данной женщин беременности проведено в обследование до Научно-поликлиническом отделении Центра. Были установлены различные причины потерь беременности у женщин с привычным выкидышем, из них встречались такие как инфекционно-воспалительные, эндокринные, аллоиммунные (таблица 13). Таблица 13 Результаты клинико-лабораторного обследования женщин для выявления вероятных причин привычных выкидышей Осложнения Пациентки основной группы n=32 абс. % Поликистозные яичники 3 9,4 Субклинический гипотиреоз Совместимость супругов по HLA II класса (3 и более аллелей) 4 12,5 8 25,0 Инфекционно - воспалительный фактор Хламидийная инфекция 3 9,4 Стрептококки группы В 6 18,7 Бактериальный вагиноз 10 31,2 Цервицит, вагинит, эндометрит (клинические проявления) 8 25,0 У женщин с привычным выкидышем отмечался более высокий процент инфекционных осложнений, чем у женщин контрольной группы. Был проведен ряд исследований, которые включали в себя микроскопическое, бактериологическое и ПЦР исследование. Согласно полученным результатам, у женщин с привычным выкидышем в 9,4% (3 женщин) хламидийная инфекция, в 18,7% (6 женщин) стрептококк группы В в диагностически значимых титрах, и в 25,0 % (8 женщин) носительство генитальных микоплазм. 53 Во всех вышеуказанных случаях проводилось антибактериальная и противовоспалительная терапия в соответствии с индивидуальной чувствительностью к антибиотикам в программе предгестационной подготовки. Во время беременности проводилось обследование на инфекции, передающиеся половым путем. В случае обнаружения хламидийной инфекции, стрептококка группы В или условно-патогенных микроорганизмов в высоких титрах, была назначена терапия во II или III триместрах с учетом чувствительности выявляемых микроорганизмов. При гемостазиологическом исследовании, у пациенток с привычным выкидышем была обнаружена более частая гиперкоагуляция и гиперфибиногенемия (таблица 14). Таблица 14 Результаты гемостазиологического обследования у женщин исследуемых групп Параметры Основная Контрольная гемостазиограммы группа (n=32) группа (n=24) абс % абс % Гиперфибриногенемия + гиперкоагуляция (ИТП 12 усл.ед.) Гиперкоагуляция + гиперфункция тромбоцитов + маркеры внутрисосудистого тромбообразования Гиперфункция тромбоцитов 7 21,9* 1 4,2 6 19 1 4,2 2 6,3 1 4,2 Повышение РКМФ или уровня Д-димера на фоне изокоагуляции 5 15,6 - - тенденци я (*достоверные различия по отношению к контролю при p<0,05). Проведен анализ параметров гемостазиологического исследования, в результате чего был сделан вывод о том, что нарушение в системе гемостаза отмечено у 62,8% женщин основной группы и 12,6% женщин из группы контроля. 54 В группах беременных женщин с привычным выкидышем и контрольной группе, помимо обследований по стандартной схеме, разработанной в отделении профилактики лечение невынашивания беременности, было произведено определение свободной эмбриональной ДНК методом ПЦР, динамическое наблюдение, анализ осложнений и исходов беременностей. 3.1.3.Течение беременностей у пациенток исследуемых групп Все пациентки основной и контрольной группы наблюдались и родоразрешались в НЦАГиП, где проведен анализ течения беременностей с сопоставлением частоты гестационных осложнений. В 71,8% (23) случаях у женщин основной группы беременность осложнилась угрожающим/начавшимся выкидышем, подтвержденными клиническими признаками и данными УЗ исследования. Признаками угрожающего выкидыша являются кровянистые выделения и тянущие боли внизу живота, у женщин основной группы они встречались в 62,5% (20) случаях. В 9,3% (3) наблюдениях отмечены боли внизу живота и в пояснице без кровянистых выделений из половых путей. При кровянистых выделениях из половых путей, проводилось эхографическое исследование, в результате чего выявлена ретрохориальная гематома в 43,7% (14) случаев. У остальных 9,3% (3) женщин жалоб в течение первого триместра беременности не отмечалось. У пациенток контрольной группы в первом триместре беременности регистрировались следующие осложнения: ОРВИ с субфебрильной температурой беременных 16,6%, - анемия тела – 12,5%, беременных – умеренная 16,6%. рвота Явления угрожающего/начавшегося выкидыша в виде болей внизу живота и в 55 пояснице, скудных кровянистых выделений отмечены в 37,5% (9) случаях. Осложнения беременности I триместра у женщин обеих групп представлены в таблице 15. Таблица 15 Осложнения течения I триместра беременности у женщин исследуемых групп Осложнения Основная группа n=32 % Контрольная группа n=24 % Умеренная рвота беременных ОРВИ 6 18,7 4 16,6 3 9,3 3 12,5 Анемия беременных 6 18,7 4 16,6 Угрожающий / начавшийся выкидыш Отслойка хориона без формирования гематом Ретроамниотические гематомы Ретрохориальные гематомы 23 71,8 9 37,5 3 9,3* - - 6 18,8 - - 14 43,7* - - (*достоверные различия по отношению к контролю при p<0,05) Во всех случаях угрожающего/начавшегося выкидыша была произведена госпитализация пациенток во 2-е отделение акушерское патологии беременности, где проводилась терапия, направленная на пролонгирование беременности, включающаяся в себя гормональные, гемостатические, спазмолитические препараты. Несмотря на проводимую терапию, прерывания беременностей до 22 недель отмечены у 7 женщин основной группы, из них у 5 до 12 недель, у 2 в сроках 15-16 недель. Сроки самопроизвольного прерывания беременности результаты кариотипирования абортусов представлены в таблице 16. и 56 Таблица 16 Результаты обследования женщин с прервавшимися беременностями Фамилия Анамнез Исход беременности Е-ва I ( 1993г) – искусственный аборт в сроке 6 недель II (2000г) – неразвивающаяся беременность в сроке 7 недель, III (2008г) и IV (2009г) -неразвивающаяся 4-5 недель, V (2011г)- неразвивающаяся в 7-8 недель I ( 2010г) самопроизвольный выкидыш II (2011г) - неразвивающаяся в 5недель Неразвивающаяся беременность 9-10 нед., размеры эмбриона 7-8 недель И-н Ж-на К-ва З-ва В-ва М-ра I (2010 г) и II ( 2011 г) – неразвивающиеся беременности в 5-6 недель по типу анэмбрионии III (2012 г) – неразвивающаяся беременность в 6-7 недель IV (2013 г) – неразвивающаяся беременность в 6-7 недель I ( 2008 г) - неразвивающаяся в 7 недель II (2010 г) неразвивающаяся 5-6 недель, abrasion cavi uteri I ( 2009 г) – неразвивающаяся в 7 недель, abrasion cavi uteri II (2012 г) - неразвивающаяся в 7 недель, abrasion cavi uteri I ( 2009 г) – неразвивающаяся в 6 недель, II (2011г) - неразвивающаяся в 7 недель I ( 2005 г) – неразвивающаяся в 6 недель, II (2012 г) - неразвивающаяся в 6 недель, abrasion cavi uteri Кариотип абортуса 69,ХХY Неразвивающаяся беременность в 9-10 недель, размеры эмбриона 7 недель 47, ХY+16 Неразвивающаяся беременность в 6 недель 46, ХY Неразвивающаяся беременность в 6 недель 47,ХY, +18 Неразвивающаяся беременность в 7 недель 47,ХX+21 В 15-16 недель излитие околоплодных вод Кариотип определить не удалось В 15-16 недель излитие околоплодных вод Кариотип определить не удалось 57 Одним из частых осложнений второй половины беременности у женщин с привычным выкидышем была угроза преждевременных родов, которая встречалась в 36,0% случаев (таблица 17), при этом была назначена терапия, направленная на пролонгирование беременности (токолитики, профилактика РДС плода), после чего клинические признаки угрожающих преждевременных родов регрессировали. Таблица 17 Осложнения течения беременности после 22 недель у женщин исследуемых групп Осложнения беременности Основная группа (n=25) Контрольная группа (n=24) абс. % 2 8,3 абс. 9 % 36,0* Плацентарная недостаточность 1 4,0 - - ИЦН, хирургическая коррекция Отслойка предлежащей и низко расположенной плаценты (беременность пролонгирована) 7 28,0 3 12,5 2 8,0 - - Угроза преждевременных родов p > 0,05 (критерий Хи-квадрат) Следующим по частоте осложнений беременности II триместра являлась ИЦН, что потребовала хирургической коррекции у 28,0% женщин с привычным выкидышем, и у 12,5% пациенток контрольной группы. У 2 женщин с привычным выкидышем потребовалась госпитализация в связи с кровянистыми выделениями из половых путей при низко прикрепленной или предлежащей плаценте. Проведен курс лечения включающий в себя гемостатические препараты 58 (антифибринoлитики – транексамовая кислота внутривенно и перорально), беременности были пролонгированы. 3.1.4. Определение общей и свободной эмбриональной ДНК в динамике с 6 до 22 недели беременности Первичное обследование проведено 93 женщинам, из них на основании критериев включения и исключения в исследование вошли 63 пациентки. Исследование заключалось в заборе периферической крови с 6 по 22 недели, с 2-х недельным интервалом и определением общей ДНК и сэ-ДНК вне зависимости от пола плода. Проведено исследование периферической крови из них 24 женщин контрольной группы и 32 женщин с привычным выкидышем в анамнезе. У беременных женщин с привычным выкидышем и в контрольной группы было произведено определение сэ-ДНК, динамическое наблюдение, анализ осложнений и исходов беременностей до 22 недель. Самым частым осложнением в I триместре у женщин исследуемых групп был угрожающий и начавшийся выкидыш, подтвержденный данными опроса, осмотра, эхографического исследования. Диагноз угрожающий/начавшийся выкидыш выставлялся только в случае наличия кровянистых выделений из половых путей, что свидетельствовало о начавшейся отслойке хориона формирующейся плаценты Определение в периферической крови женщины сэ-ДНК может повлиять в дальнейшем на акушерскую тактику введения беременности и прогнозирование таких акушерских осложнений как угрожающий или начавшийся выкидыш (кровотечение, отслойка хориона), угрожающие преждевременные роды, плацентарная недостаточность, задержка роста плода, преэклампсия. 59 При динамическом определении уровней ДНК установлено нарастание уровней сэ-ДНК во всех группах женщин с увеличением срока беременности. Подобные данные были получены для женщин, вынашивающих плодов мужского пола, что свидетельствует об увеличении доли сэ-ДНК в периферической крови матери с каждой последующей неделей беременности [30]. Этот факт имеет важное практическое значение в определении сроков проведения неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий по уровням сэ-ДНК. Выбор срока для данной диагностической процедуры зависит от необходимого и достаточного уровня сэ-ДНК в периферической крови беременной женщины. У 7 из 32 женщин (21,8%) группы с привычным выкидышем произошли самопроизвольные потери беременности. В 4 из 5 случаев неразвивающихся беременностей отмечены хромосомные нарушения – анеуплоидии – трисомия 18, трисомия 16 и трисомия 21, а также в одном наблюдении триплоидия (кариотип абортуса 69,ХХY). Отдельно были проанализированы данные cэ-ДНК и общей ДНК у 7 женщин с потерями беременностей и 7 женщин контрольной группы с самопроизвольными родами (метод пар). Данные представлены на рисунке 2. 60 Mean; Box: Mean±SE; Whisker: Mean±SD 1,4E5 1,2E5 1E5 80000 * 60000 40000 20000 0 -20000 -40000 6 8 10 12 Контрольная группа Неразвив. бер-ть 14 Недели неделя беременности Рисунок 2. Уровни сэ-ДНК у женщин основной и контрольной групп (метод пар). Как видно из представленных данных, уровни сэ-ДНК в 6 недель беременности достоверно отличались у женщин с неразвивающимися беременностями и пациенток, беременность которых была пролонгирована до срока своевременных родов. Возможно, дальнейшие исследования в данной области позволят предложить уровни общей и сэ-ДНК, как возможный прогностический критерий пролонгирования беременности у женщин дальнейшему исследованию с привычным уровни выкидышем. сэ-ДНК на Подлежат ранних сроках беременности, как прогностический маркер поздних гестационных осложнений. 61 На рисунке 3 демонстрирующие показаны 2 возможность клинических прогнозирования наблюдения, течения беременности. 140000 120000 копий/мл 100000 80000 60000 Ч-на С-ва 40000 20000 0 6 8 10 12 14 16 18 20 недели Рисунок 3. Уровни сэ-ДНК у женщин с и без угрозы прерывания беременности. Пациентка Ч-на И.А. 36 лет, данная беременность 3-я, наступила самопроизвольно. В анамнезе 2 самопроизвольных родов, течение предыдущих беременностей без осложнений. Проводилось определение общей ДНК с 6 по 20 неделю беременности с 2-х недельным интервалом. При сроке 6 недель уровень общей ДНК составил 4391,0 копий/мл. Беременность протекала без осложнений и уровни общей ДНК колебались незначительно, так в 12 недель показатель составлял 6160,0 копий/мл, а в 19-20 недель 12544,28 копий/мл. В 40 недель произошли своевременные самопроизвольные роды, родился мальчик 3400 грамм, 52 см, по шкале Апгар 8/9 баллов. 62 Пациентка С-ва М.Ю. (ИР 476), 36 лет, обратилась в НЦ АГиП в связи с привычным выкидышем. В анамнезе – 2 ранние самопроизвольные потери беременности в сроках 7-8, 9-10 недель. С 6 по 20 неделю беременности, с 2-х недельным интервалом определялись уровни общей ДНК. При сроке 6 недель уровень общей ДНК составил 83617,92 копий/мл, что в 19 раз превышало аналогичный показатель у женщины с неосложненной беременностью. В 7-8 недель отмечались признаки угрожающего выкидыша (кровотечение) и по результатам УЗИ определялась ретрохориальная гематома размерами 4х5 см, пациентка была госпитализирована во 2-е отделение акушерское патологии беременности, где пролонгирование беременности, спазмолитическую, отмечена проводилась терапия, включающая гемостатическую положительная направленная динамика терапию. в на гормональную, В дальнейшем состоянии пациентки, беременность протекала до 17 недель без осложнений, при этом просматривалось снижение уровня общей ДНК до 14869,60 копий/мл. В 18-19 недель отмечены клинические симптомы угрожающего позднего выкидыша, пациентка была повторно госпитализирована в стационар, проводилась гормональная, магнезиальная, спазмолитическая терапия, при этом уровень общей ДНК в сроке 18 недель равнялся 125536,48 копи/мл, что свидетельствует о резком повышении уровня общей ДНК. Следовательно, значения сэ-ДНК в 10 раз превышали аналогичный уровень у женщины контрольной группы. С 20 по 40 недели беременность протекала без осложнений и в сроке 40 недель произошли самопроизвольные роды, родился живой доношенный мальчик массой 3590 грамм, ростом 52 см, оценка состояния по шкале Апгар 8-9 баллов. 63 При анализе уровней сэ-ДНК беременных с угрожающим выкидышем было установлено, что средние значения у женщин с привычным выкидышем и со спорадически возникающей угрозой прерывания беременности без отягощенного анамнеза достоверно не различались на всех гестационных сроках. Возможно, это свидетельствует о едином патогенетическом механизме, возникающем при угрожающем и начавшемся выкидыше у женщин как с отягощенным анамнезом, так и с неосложненной акушерской историей. Согласно полученным результатам, апоптотические выбросы в материнский кровоток сэ-ДНК трофобластического происхождения имеют место при угрожающем и начавшемся выкидыше, как универсальный механизм, возникающий при отслойке хориона. Как видно из таблицы 18 не получено достоверных различий в уровнях общей и сэ-ДНК у женщин с угрожающим/начавшимся выкидышем среди женщин с привычными потерями и спорадической угрозой прерывания беременностей. Отмечена даже тенденция к более высокому уровню сэ-ДНК в группе женщин с неосложненным анамнезом и начавшимся выкидышем в сроке 6 недель, однако данные изменения не были достоверными. 64 Таблица 18 Сравнительный анализ уровней общей и сэ-ДНК у женщин с угрожающим/начавшимся выкидышем Недели 6 8 10 12 14 16 18 20 Уровни общей ДНК Уровни сэ-ДНК Привычный выкидыш (n=20) копии/мл х 103 Quartile Спорадичес -кий выкидыш (n=13) копии/мл х 103 Quartile P Критерий МаннУитни Привычный выкидыш (n=20) копии/мл х 103 Quartile Спорадический выкидыш (n=13) копии/мл х 103 Quartile P Критерий МаннУитни 27,3 33,8 0,5261 0,16 0,63 0,0890 (10,3-50,8) (11,5-49,1) (0,06-0,2) (0,30-4,42) 15,9 11,8 0,13 0,29 (11,7-42,9) (8,2-19,0) (0,06-0,31) (0,06-0,47) 34,6 20,4 0,31 0,54 (19,3-61.6) (13,1-87,3) (0,1-0,52) (0,19-0,95) 47,0 18,4 0,73 0,54 (25,8-81,6) (11,8-57,6) (0,15-1,13) (0,22-0,80) 68,7 35,0 0,58 0,48 (14,2-79,1) (31,2-41,5) (0,25-0,97) (0,41-0,68) 28,3 39,4 0,58 0,44 (15,7-71,9) (26,0-112,5) (0,23-1,81) (0,30-0,54) 59,4 17,8 0,89 0,43 (21,8-71,3) (17,2-71,3) (0,86-2,92) (0,26-1,07) 23,8 35,9 0,33 0,27 (22,5-78,9) (20,1- (0,20-0,51) (0,17-0,48) 0,33 0,27 (0,20-0,51) (0,17-0,48) 0,4687 0,4875 0,0774 0,8170 0,6104 0,5510 0,6434 0,9223 0,1649 0,7513 0,8973 0,6104 0,4561 0,6439 162,0) 22 23,8 35,9 (22,5-78,9) (20,1162,0) 0,6434 0,6439 65 У пациенток с привычным и начавшимся выкидышем уровень общей ДНК был несколько выше в сроке 12 недель и составил 47,0 х 103 (25,8-81,6) копий /мл по сравнению с 18,4 х 103 (11,8-57,6) копий /мл (p=0,0774), что может отражать общие апоптотические процессы в организме в данном сроке беременности. С другой стороны, при неосложненном течении первой половины беременности у женщин с привычным выкидышем и здоровых беременных получены достоверные различия в уровнях сэ-ДНК. При отсутствии клинической картины угрожающего выкидыша, тем не менее, уровни сэ-ДНК пациенток с неоднократными потерями беременностей значительно превышают аналогичный показатель здоровых беременных женщин в сроках 12 и 14 недель (таблица 19). Можно предположить, что подобные «скрытые» апоптотические изменения трофобласта, зарегистрированные несмотря на проводимое лечение, служат основой для формирования в дальнейшем поздних гестационных осложнений: угрозы преждевременных родов, плацентарной недостаточности, ЗРП, преждевременного досрочного родоразрешения. 66 Таблица 19 Сравнительный анализ уровней общей и сэ-ДНК в группах женщин без угрожающего выкидыша Недели 6 8 10 12 14 16 18 20 22 Уровни общей ДНК Уровни сэ-ДНК Привычный выкидыш (n=12) копии/мл х 103 Quartile Контрольная группа (n=11) копии/мл х 103 Quartile P Критерий МаннУитни Привычный выкидыш (n=12) копии/мл х 103 Quartile Контрольная группа (n=11) копии/мл х 103 Quartile P Критерий МаннУитни 13,9 5,4 0,1407 0,43 0,16 0,7751 (5,4-22,2) (4,1-11,8) (0,18-1,03) (0,08-0,39) 17,8 10,6 0,17 0,12 (13,8-20,4) (8,6-11,3) (0,04-0,36) (0,06-0,23) 22,8 10,3 0,42 0,10 (20,3-25,5) (6,3-12,0) (0,24-0,60) (0,07-0,16) 11,5 10,0 0,34 0,13 (10,3-13,6) (7,1-15,4) (0,23-0,53) (0,07-0,37) 28,6 6,6 0,34 0,09 (19,4-30,6) (2,8-9,3) (0,21-0,45) (0,07-0,14) 27,0 11,1 0,24 0,13 (10,0-32,7) (6,0-14,4) (0,16-0,28) (0,04-0,35) 20,4 14,3 0,74 0,17 (16,6-22,2) (13,6-15,0) 0,22-1,03 (0,14-0,21) 11,5 11,3 0,24 0,12 (6,9-21,8) (5,4-12,5) (0,13-0,38) (0,06-0,21) 11,5 11,3 0,24 0,12 (6,9-21,8) (5,4-12,5) (0,13-0,38) (0,06-0,21) 0,0472 0,0209 0,4168 0,0062 0,1161 0,2453 0,4652 0,4652 0,6242 0,1742 0,0416 0,0098 0,1052 0,2453 0,0771 0,0771 67 При проведении анализа внутри группы женщин с привычным выкидышем с и без угрозы прерывания беременности, уровни общей ДНК статистически значимо отличались лишь в сроках 12 и 20 недель. Интересно, общепринятыми что данные сроки беременности совпадают с для биохимического и ультразвукового скрининга (таблица 20). Уровни сэ-ДНК достоверно отличались в сроках 12 и 14 недель, что вероятно отражает апоптотические изменения во время инвазии трофобласта. Полученные данные подлежат дальнейшему изучению и анализу на поздних гестационных сроках. В группе женщин с неотягощенным акушерским анамнезом (контрольной группе) выявлены достоверные различия среди пациенток с начавшимся выкидышем и неосложненным течением данной беременности. Данные изменения касались уровней и общей и сэ-ДНК. По показателям общей ДНК достоверные различия получены в сроках 6,10,12,14,16 недель, по сэ-ДНК – в 10 и 14 недель (таблица 21) 68 Таблица 20 Сравнительный анализ уровней общей и сэ-ДНК у женщин с привычным выкидышем Недели 6 8 10 12 14 16 18 20 22 p<0,05 Уровни общей ДНК Уровни сэ-ДНК Женщины с угрожающи м/начавшмся выкидышем (n=20) Копий/мл х 103 Quartile Женщины с неосложненным течением беременнос -ти (n=12) Копий/мл х 103 Quartile P Критерий МаннУитни Женщины с угрожающи м/начавши мся выкидышем (n=20) Копий/мл х 103 Quartile Женщины с неосложненным течением беременност и (n=12) Копий/мл х 103 Quartile P Критерий МаннУитни 27,3 13,9 0,1317 0,2 0,43 0,7751 (10,3-50,8) (5,4-22,2) (0,06-0,20) (0,18-1,03) 15,9 17,8 0,14 0,17 (11,7-42,9) (13,8-20,4) (0,07-0,32) (0,04-0,36) 34,6 22,8 0,32 0,42 (19,3-61,6) (20,3-25,5) (0,11-0,52) (0,24-0,61) 47,0 11,5 0,74 0,34 (25,8-81,6) (10,3-13,6) (0,16-1,13) (0,23-0,54) 68,7 28,6 0,6 0,34 (14,2-79,1) (19,4-30,6) (0,25-0,98) (0,21-0,45) 28,3 27,0 0,6 0,24 (15,7-71,9) (10,0-32,7) (0,23-1,81) (0,16-0,28) 59,4 20,4 0,89 0,74 (21,8-71,3) (16,6-22,2) (0,86-2,92) (0,22-1,03) 23,8 11,5 0,33 0,24 (22,5-78,9) (6,9-21,8) (0,20-0,52) (0,13-0,38) 23,8 11,5 0,33 0,24 (22,5-78,9) (6,9-21,8) (0,20-0,52) (0,13-0,38) 0,9548 0,2345 0,0055 0,3798 0,3662 0,1745 0,0455 0,0455 0,6242 0,1742 0,0416 0,0098 0,1052 0,2453 0,0771 0,0771 69 Таблица 21 Сравнительный анализ уровней сэ-ДНК у женщин контрольной группы Недели береме нности 6 8 10 12 14 16 18 20 22 p<0,05 Уровни общей ДНК Уровни сэ-ДНК Женщины с начавшимся выкидышем (n=13) х 103Quartile Женщины с нормальным течением беременност и (n=11) х 103Quartile P Критерий МаннУитни Женщины с начавшимся выкидышем (n=13) х 103 Quartile Женщины с нормальным течением беременности (n=11) х 103 Quartile P Критерий МаннУитни 33,8 5,4 0,0070 0,63 0,16 0,0881 (11,5-49,1) (4,1-11,8) (0,30-4,24) (0,08-0,39) 11,8 10,6 0,29 0,12 (8,2-19,0) (8,6-11,3) (0,06-0,47) (0,06-0,23) 20,4 10,3 0,54 0,10 (13,1-87,3) (6,3-12,0) (0,2-0,95) (0,07-0,16) 18,4 10,0 0,54 0,13 (11,8-57,6) (7,1-15,4) (0,22-0,80) (0,07-0,37) 35,0 6,6 0,5 0,09 (31,2-41,5) (2,8-9,3) (0,4-0,7) (0,07-0,14) 39,4 11,1 0,44 0,13 (26,0-112,5) (6,0-14,4) (0,3-0,54) (0,04-0,35) 17,8 14,3 0,43 0,17 (17,2-71,3) (13,6-15,0) (0,27-1,07) (0,14-0,21) 35,9 11,3 0,3 0,12 (20,1-162,0) (5,4-12,5) (0,2-0,5) (0,06-0,21) 35,9 11,3 0,3 0,12 (20,1-162,0) (5,4-12,5) (0,2-0,5) (0,06-0,21) 0,3299 0,0376 0,0350 0,0027 0,0140 0,0833 0,0881 0,0881 0,5698 0,0376 0,0639 0,0250 0,0588 0,0833 0,1967 0,1967 70 При обработке всех данных выявлена взаимосвязь клинических проявлений угрожающего и начавшегося выкидыша с высокими уровнями общей и сэ-ДНК, независимо от анамнеза пациентки (рисунок 4). копий/мл 45 40 35 30 Женщины с начавшимся выкидышем (n=13) 25 20 Женщины с нормальным течением беременности 15 10 5 0 6 8 10 12 14 16 недели беременности 18 20 Рисунок 4. Сравнительный анализ уровней сэ-ДНК женщин с и без явлений угрожающего выкидыша. У женщин с привычным выкидышем и неосложненным течением первой половины беременности уровни сэ-ДНК статистически значимо выше, чем у здоровых беременных, что может предрасполагать к реализации плацента – ассоциированных гестационных осложнений. У женщин с привычным выкидышем при неблагоприятном течении беременности в сроках 12 и 20 недель беременности уровни сэ-ДНК достоверно выше, чем при отсутствии клинической картины угрожающего выкидыша. Полученные данные подлежат дальнейшему анализу для уточнения роли описанных изменений в реализации поздних гестационных осложнений и возможностей их применения в клинической практике. 71 3.1.5. Исходы наблюдаемых беременностей у женщин основной и контрольной групп В ходе работы были проанализированы исходы беременностей у женщин исследуемых групп, выявлено 7 самопроизвольных потерь беременностей (все пациентки из основной группы). Прерываний беременностей по медицинским показаниям в группах не было. В 5 наблюдениях отмечены самопроизвольные выкидыши до 12 недель, во всех случаях по типу неразвивающихся беременностей. При этом проведено инструментальное удаление неразвивающегося плодного яйца с дальнейшим кариотипированием абортуса, ниже указаны результаты кариотипирования и уровни общей и сэ-ДНК (таблица 22). Таблица 22 Результаты общей и сэ-ДНК у женщин с неразвивающейся беременностью Фамилия пациентки Срок беременности при заборе периферической крови Общая ДНК (копий / мл) Сэ-ДНК (копий/ мл) Е-ва 6 недель 8 недель 10 недель 30523 138855 36154 2033,0 257,69 И-н 6 недель 8 недель 10 недель 10000 7127,5 6017,44 163,92 42,08 109,32 Ж-на 6 недель 15852 168,68 К-ва 6 недель 158525 292 З-ва 6 недель 27617 192 Исход беременности Карио тип аборту са Неразвивающаяся беременность 9-10 нед, размеры эмбриона 7-8 недель Неразвивающаяся беременность в 9-10 недель, размеры эмбриона 7 недель Неразвивающаяся беременность в 6 недель Неразвивающаяся беременность в 7 недель Неразвивающаяся беременность в 7 недель 69,ХХ Y 47, ХY+16 46, ХY 47,ХY, +18 47,ХX +21 72 Анеуплоидии отмечены у 4 абортусов, в 1 случае – нормальный кариотип и в 2 наблюдениях кариотип плода определить не удалось. У 2 (9,0%) пациенток отмечены потери беременности в 16-17 недель. В одном случае беременность осложнилась хориоамнионитом, вследствие чего произошло излитие околоплодных вод, в другом случае в сроке 17 недель излитие околоплодных вод без предшествующих клинических проявлений. В обоих случаях не удалось провести кариотипирование. Отдельно были проанализированы уровни общей ДНК у 7 женщин с потерями беременностей и 7 женщин контрольной группы с самопроизвольными родами рисунок 5 и рисунок 6. 14 12 10 8 6 недели 0,00 20000,00 40000,00 60000,00 80000,00 100000,00120000,00140000,00160000,00180000,00 И-н К-а М-на Б-ко В-ва Э-ва копий/мл Ж-на К-ва А-ва Б-н - неразвивающиеся беременности Е-ва М-ва З-ва Ч-на - контрольная группа Рисунок 5. Количественные показатели уровней общей ДНК в динамике у женщин с потерями на ранних сроках и женщин контрольной групп. 73 Median; Box: 25%-75%; Whisker: Min-Max 1,8E5 1,6E5 1,4E5 Копий/мл 1,2E5 1E5 80000 * 60000 40000 20000 0 6 8 10 12 14 Контрольная группа Неразвив. бер-ть неделя Рисунок 6. Сравнительный анализ уровней общей ДНК в динамике у женщин с потерями на ранних сроках и женщин контрольной группы. В результате проведенного сравнительного анализа сделан вывод, что уровни общей ДНК достоверно отличались у женщин с неразвивающимися беременностями от пациенток, беременность которых была пролонгирована до срока своевременных родов. При анализе осложнения второй половины беременности, установлено, что при возникновении угрозы преждевременных родов уровни общей и сэ- ДНК достоверно превышали аналогичные значения у женщин с неосложненным течением беременности. В одном наблюдении у пациентки с тяжелой плацентарный недостаточностью были отмечены высокие апоптотические выбросы общей и сэ- ДНК. Уровни общей ДНК превосходили средние показатели в группе с привычным выкидышем и угрозой преждевременных родов в 74 6,7 раз, в группе с физиологическим течением беременности в 35 раз. Та же тенденция получена при анализе уровней сэ-ДНК: в 2,2 раз выше показателей в группе с привычным выкидышем и угрозой преждевременных родов, и 5,6 раз с неосложненной беременностью (рисунок 7 и 8). Рисунок 7. Уровни общей ДНК у женщин исследуемых групп во второй половине беременности (средние значения) Зеленой линией показан уровень ДНК у беременной с тяжелой плацентарной недостаточностью. Рисунок 8. Уровни сэ - ДНК у женщин исследуемых групп во второй половине беременности. Зеленой линией показан уровень сэ-ДНК у беременной с тяжелой плацентарной недостаточностью 75 Полученные данные открывают новые возможности в прогнозировании плацентарной недостаточности по уровням сэ-ДНК. Клинический случай Пациентка М-ва М.И. 32 лет, обратилась в НЦ АГиП в связи с привычным выкидышем вне беременности. В анамнезе – 2 ранние самопроизвольные потери беременности в сроках 7-8, 9-10 недель. В обоих случаях проводилось кариотипирование тканей абортусов – без патологии. При обследовании супружеской пары: кариотип супругов 46,ХХ, 46ХY; гормональных нарушений не выявлено, менструальный цикл пациентки регулярный с менархе; анатомических факторов привычного выкидыша не отмечалось; при обследовании на антифосфолипидный синдром: проба на волчаночный антикоагулянт отрицательная, антитела к кардиолипину, бетта2-гликопротеину, аннексину, протромбину в пределах нормативных значений; совместимости супругов по системе HLA I и II классов не отмечено тромбофилий высокого риска не выявлено. В связи с наличием клинических и ультразвуковых признаков хронического эндометрита, наличия хламидийной инфекции в анамнезе, проведена противовоспалительная терапия с супругом вне беременности. После лечения по данным УЗИ – адекватный рост и секреторная трансформация эндометрия во второй фазе менструального цикла. 76 Пациентке рекомендована витаминотерапия, гестагенная поддержка со второй фазы предполагаемого фертильного цикла и даны рекомендации о планировании беременности. При наступлении беременности определение сэ-ДНК, независимо от пола плода, проводилось методом ПЦР в режиме реального времени (real time PCR). На ранних сроках, до 20 недель, беременность протекала на фоне гестагенной поддержки без осложнений. При сроке 6 недель уровень общей ДНК составил 5080 копий/мл, в то время как уровень сэ-ДНК составил 19 копий/м. Уровень общей и сэ-ДНК колебался в небольших пределах и достоверно не отличался от средних показателей в группе женщин с привычным выкидышем и контрольной группе с физиологически протекающей беременностью. В сроке 21 неделя беременности при УЗ-исследовании размеры плода соответствовали гестационному сроку, патологии развития плода не выявлено, количество околоплодных вод в пределах нормы. Впервые в сроке 23 недели беременности уровень общей ДНК составил 225393 копий/мл, а уровень сэ-ДНК составил 1968 копий/м. В 25 недель беременности выраженное произведены УЗИ и доплерометрия, выявлено: отставание в показателях фетометрии, снижение кровотока в маточных артериях и артериях пуповины. Размеры плода соответствуют 22 неделям беременности. Выставлен диагноз: Плацентарная недостаточность. Задержка роста плода. Проводилось динамическое наблюдение за состоянием беременной и плода, включая еженедельную допплерометрию и фетометрию, после 27 недель допплерометрия проводилась 1 раз в 3 дня. В сроке 27 недель зарегистрирован «нулевой» диастолический кровоток в артерии пуповины, уровни общей ДНК составили 456000 копий/мл и сэ-ДНК 3500 копий/мл. Пациентка была госпитализирована, проведена профилактика респираторного дистресс синдрома плода, 77 обследована, данных за развитие преэклампсии не получено. Под тщательным контролем беременность была пролонгирована до 29-30 недель. В сроке 30 недель в связи с развитием маловодия, критическим ухудшением состояния плода вследствие тяжелой плацентарной недостаточности произведено досрочное родоразрешение путем операции кесарево сечение. Кесарево сечение проведено без технических трудностей, ребенок извлечен в целом плодном пузыре, отмечалось выраженное маловодие, воды светлые. Родился живой глубоко недоношенный мальчик массой 630 г, ростом 29 см, оценка состояния по шкале Апгар 5-6 баллов. Плацента массой 165 г, размерами 10х12 см. Ребенок длительно получал лечение в условиях отделения в реанимации и интенсивной терапии новорожденных. Проводилась комплексная терапия: респираторная, антианемическая, эффектом. антибактериальная, парентеральное После стабилизации питание с положительным клинического дальнейшего лечения и выхаживания инфузионная, состояния для ребенок был переведен в отделение патологии новорожденных и недоношенных детей центра, в дальнейшем на выписан домой в удовлетворительном состоянии под наблюдение участкового педиатра. Интерес представляют данные об уровнях сэ-ДНК на ранних сроках в периферической крови наблюдаемой пациентки с плацентарной недостаточностью. В отсутствии признаков угрожающего/начавшегося выкидыша до 22 недель, достоверных изменений уровней сэ-ДНК по сравнению с уровнями сэ-ДНК у женщин с неосложненной беременностью не отмечено. Вероятно, это свидетельствует о быстром динамическом изменении уровней сэ-ДНК в зависимости от процессов, происходящих в фето-плацентарном комплексе. Повторяющиеся высокие уровни сэ-ДНК в периферической крови женщины после 22 недели беременности свидетельствуют плацентарной недостаточности. о прогрессировании 78 Представленное возможность клиническое прогнозирования наблюдение плацентарной подтверждает недостаточности по апоптотическим выбросам сэ-ДНК в периферическую кровь беременной женщины. Требуется проведение дальнейших исследований для расширения возможностей диагностики и прогнозирования осложнений второй половины беременности у женщин с отягощенным акушерским анамнезом. В ходе проведенного исследования выявлено, что одним из частых осложнений III триместра у женщин с привычным выкидышем была угроза преждевременных родов, которая осложняла беременность в 36,0% наблюдений. При этом женщины были госпитализированы 2-е отделение акушерское патологии беременности, где проводилась токолитическая терапия (-миметиками внутривенно), профилактика респираторного дистресс синдрома плода, обследование женщин на инфекции, передающие половым путем, лечение при наличии показаний. Анемия легкой степени, как осложнение III триместра у женщин контрольной группы встречалась в 12,5% случаев, у женщин основной группы – в 16,6% наблюдений. Преждевременные оперативные роды произошли у 2-х женщин (6,2%), в одном случае у женщины контрольной группы в связи с несостоятельностью рубца на матке в сроке 36 недель беременности, в другом случае у женщины основной группы в связи с критическим ухудшением состояния плода вследствие тяжелой плацентарной недостаточности в сроке 29-30 недель. Преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты, плацентарной недостаточности и преэклапмсии контрольной группы не отмечено (таблица 23). у беременных 79 Таблица 23 Частота осложнений III триместра беременности у женщин исследуемых групп Осложнения Угрожающие преждевременные роды ЗРП, тяжелая ПН, потребовавшая преждевременного оперативного родоразрешения Преэклампсия Анемия беременных (легкая степень) Преждевременные роды Основная группа (n=25) абс. % 9 36,0 Контрольная группа (n=24) абс. % 2 8,3 1 4,0 - - 4 16,0 6 25 3 9,0 2 8,3 При анализе уровней общей и сэ-ДНК в динамике до 22 недели беременности у женщин основной группы не обнаружено взаимосвязи высокого уровня общей и сэ-ДНК с последующим развитием преждевременных родов. Нами проанализированы исходы беременностей у 56 женщин, в результате чего сделан вывод, что у женщин основной группы ранние потери беременности отмечены чаще, чем у женщин контрольной группы (таблица 24). 80 Таблица 24 Исходы беременностей у женщин исследуемых групп Основная группа Исходы беременностей n=32 % Контрольная группа n=24 % Потери беременности до 22-х недель ВСЕГО - до 12 недель - с 12 до 22 недель 7 21,9 5 15,6 2 6,3 Преждевременные роды ВСЕГО 3 9,4 2 самопроизвольные 2 6,3 1 кесарево сечение 1 3,1 1 Своевременные роды ВСЕГО 22 68,8* 22 самопроизвольные 12 37,5* 16 кесарево сечение 10 31,3 6 (*достоверные различия по отношению к контролю при p<0,05). Частота оперативного родоразрешения 8,4 4,2 4,2 91,7 66,7 25,0 при доношенном сроке беременности, была выше у женщин основной группы по сравнению с женщинами контрольной группы. Таким образом, данные проведенного исследования позволяют утверждать, что высокие уровни общей и сэ-ДНК ассоциированы с развитием угрозы прерывания беременности, потерь беременности до 22 недель. Требуются дальнейшие исследования для определения прогностической значимости данных показателей в реализации поздних гестационных осложнений. 3.1.6. Анализ течения родов, послеродового периода и состояния новорожденных В результате анализа исходов беременностей у женщин исследуемых групп установлено, что у женщин основной группы в 3 (9,4%) случаях произошли преждевременные роды, из них в 2 наблюдениях самопроизвольные роды, а в 1-м случае произведено 81 экстренное кесарево сечение в связи с тяжелой плацентарной недостаточностью в сроке 30 недель. Своевременных родов произошло 22 (68,8%), из них 10 (31,3%) оперативным путем и 12 (37,5%) через естественные родовые пути. У женщин контрольной группы произошли 1 (4,2%) преждевременные оперативные роды в связи с несостоятельностью рубца на матке после предыдущей операции кесарево сечение в сроке 36 недель и 1 (4,2%) преждевременные самопроизвольные роды в сроке 34-35 недель. У 22 женщин (91,7%) произошли своевременные роды, из них 6 путем операции кесарево сечение и 16 через естественные родовые пути. Анализ родоразрешений у женщин основной группы У женщин основной группы в одном случае показанием для досрочного оперативного родоразрешения было прогрессирование плацентарной недостаточности, ухудшение состояния плода в сроке 2930 недель беременности. Родился живой глубоко недоношенный мальчик массой 630 г, ростом 29 см, оценка состояния по шкале Апгар 5-6 баллов в связи с критическим ухудшением состояния плода вследствие тяжелой плацентарной недостаточности в сроке 29-30 недель. В 2 случаях произошли преждевременные самопроизвольные роды в сроках 35 и 36 недель. Женщины неоднократно во время беременности были госпитализированы во 2-ое отделение акушерской патологии беременных, где проводилась хирургическая коррекция ИЦН и терапия, направленная на пролонгирование беременности, включающая токолитическую терапию. Всем детям, рожденным преждевременно на 29-36 неделях гестации, проводилась интенсивная терапия в отделении реанимации и интенсивной терапии новорожденных. 82 Вес недоношенных новорожденных при рождении колебался от 630 до 2120 г, в среднем составляя 1375±410,3 г. Длина тела от 29 до 45 см., среднее значение 37,7±4,2 см. Оценка состояния по шкале Апгар от 5-6 баллов на 1 минуте до 7-9 баллов на 5 минуте жизни. Своевременные роды у пациенток основной группы произошли у 22 женщин, из них через естественные родовые пути в 12 случаях (54,5%), кесарево сечение выполнено у 10 женщин (45,5%) (таблица 25). Показанием к оперативному родоразрешению в плановом порядке в 3 случаях был возраст первородящей, осложненное течение данной беременности, отягощенный акушерско-гинекологический анамнез, в 3 случаях рубец на матке после операции кесарева сечения в предыдущих родах. Таблица 25 Показания к оперативному родоразрешению у женщин основной группы при доношенном сроке беременности Показания Родоразрешения при доношенном сроке беременности (основная группа) n=22 абс. % Плановое кесарево сечение – 27,3% (n=6) Возраст первородящей, отягощенный акушерский анамнез, осложненное 3 13,6 течение беременности Рубец на матке после операции кесарева сечения 3 13,6 Кесарево сечение в экстренном порядке (в родах) –18,2% Клинически узкий таз II степени 2 несоответствия Излитие околоплодных вод, начало родовой деятельности, осложненная 1 миопия Упорная слабость родовой деятельности 1 (n=4) 9,0 4,5 4,5 83 У 4 женщин кесарево сечение произведено в родах, причиной явился клинически узкий таз в 2 случаях, в 1 наблюдении упорная слабость родовой деятельности, не поддающаяся медикаментозной терапии. В 1 случае произошло излитие околоплодных вод и начало родовой деятельности при осложненной миопии, в связи с чем беременная была родоразрешена путем операции кесарева сечения, согласно заключению окулиста. Анализ родоразрешений у женщин контрольной группы В 66,7% (16) наблюдений у женщин контрольной группы беременность закончилась своевременными родами через естественные родовые пути. У 25,0% (6) женщин контрольной группы произведено кесарево сечение при доношенном сроке беременности. экстренные родоразрешения в родах: Превалировали в 1 случае в связи с упорной слабостью родовой деятельности, не поддающейся медикаментозной терапии, в 1 случае – клинически узкий таз (II степень несоответствия), в 2 наблюдениях в связи с острой гипоксией плода, в 1 случае причиной экстренного оперативного родоразрешения послужила несостоятельность рубца на матке после предшествующей операции кесарева сечения. Массо-ростовые показатели новорожденных достоверно не различались в обеих группах (p>0,05) (таблица 26). Масса доношенных новорожденных у женщин основной группы варьировала от 2154 г до 4238 г, средний показатель составил 3251,6±404,4 г, длина тела - 47,52,4 см. В контрольной группе масса детей колебалась от 2500 г до 4250 г, средний показатель 3502,2±357,9 г, длина тела соответствовала 50,51,9 см. Оценка состояния новорожденных по шкале Апгар на 1 и 5 минутах жизни приведены в таблице 27. 84 Таблица 26 Массо - ростовые показатели доношенных новорожденных Показатели Основная группа Контрольная (n=22) группа (n=22) абс. Масса тела средняя (г) абс. % 3251,6±404,4 г 2100-2499 2500-2999 3000-3499 3500 - 3999 2 5 8 5 Более 4000 г Длина тела новорожденных средняя (см) 45-49 см 50 и выше 2 3502,2±357,9 9,1 22,7 36,4 22,7 тенденция р=0,06 9,1 2 6 11 9,1 27,3 50,0 3 13,6 47,52,4 3 19 13,6 86,4 % 50,51,9 2 20 9,0 91,0 Таблица 27 Оценка доношенных новорожденных по шкале Апгар Баллы 5 и менее 6 7 8 9 *p<0,05 На 1 минуте рождения Основная Контрольная группа группа n=22 % n=22 % 1 4,5 2 9,1 2 9,0 19 86,4 20 91,0 - На 5 минуте рождения Основная Контрольная группа Группа n=22 % n=22 % 1 4,5 13 59,0* 2 9,1 8 36,5* 20 90,9 В послеродовом периоде чаще всего встречались осложнения в виде анемии у 14,0% пациенток основной группы и 9,0% пациенток контрольной группы. Осложнений послеродового периода в виде 85 лохиометры, эндометрита, тромбофлебита в ходе проведенного исследования не наблюдалось. На рисунке представлены исходы беременностей у женщин исследуемых групп. Как следует из представленных данных, своевременные роды произошли в 68,8% случаев, преждевременные роды у 9,4% наблюдаемых женщин, в 15,6% наблюдений имели место ранние потери беременности до 12 недель, в 6,2% выкидыши с 12 по 22 неделю беременности. У женщин контрольной группы в 91,7% случаев произошли своевременные роды и в 8,3% преждевременные роды. На рисунке 9 изображены исходы беременностей у женщин исследуемых групп. 15,6% 6,2% 9,4% Ранние потери беременности до 12 нед. Потери беременности с 12 по 22 нед. Преждевременные роды 68,8% Основная группа 8,3 % 91, 7% Контрольная группа Рисунок 9. Исходы беременностей у женщин исследуемых групп. 86 Таким образом, в результате проведенного исследования было установлено, что на ранних сроках беременности у женщин с привычным выкидышем регистрируются достоверно более высокие уровни общей и сэ-ДНК, даже в отсутствии клинических проявлений угрожающего выкидыша. В 15,6% случаев произошло самопроизвольное прерывание беременностей в сроках до 12 недель, при этом в 12,5% случаев выкидыши были обусловлены анеуплоидиями. Полученные данные диктуют необходимость разработки новых методов неинвазивного определения анеуплоидий для выбора правильной терапевтической тактики ведения беременности. При возникновении осложнений в виде начавшегося выкидыша у беременных контрольной группы отмечались высокие «пиковые» значения общей и сэ-ДНК, что позволило нам предположить единый патогенетический механизм при начавшемся выкидыше, реализующийся у всех женщин, независимо от анамнеза. В результате проведения патогенетической терапии у женщин с привычным выкидышем беременность была пролонгирована, что сопровождалось снижением уровней общей и сэ-ДНК, при этом не достигавших значений в контрольной группе. Проведение динамического контроля и терапевтических мероприятий позволило пролонгировать беременности у женщин с привычным выкидышем: своевременные роды произошли в 68,8% случаев, преждевременные роды у 9,4% наблюдаемых женщин. В одном наблюдении с тяжелой плацентарной недостаточностью потребовалось досрочное оперативное родоразрешение в сроке 30 недель, при этом уровни общей ДНК превосходили средние показатели в группе с привычным выкидышем в 6,7 раз, в группе с физиологическим течением беременности в 35 раз. Та же тенденция получена при анализе уровней сэ-ДНК: в 2,2 раза выше показателей в группе с привычным выкидышем и угрозой преждевременных родов, и 5,6 раз с неосложненной беременностью. Возможно, дальнейшие исследования позволят включить определение 87 общей и сэ-ДНК в скрининговые обследования женщин в сроках 12 и 20 недель беременности, что предоставит возможность своевременно прогнозировать гестационные осложнения. 3.2. Диагностика анеуплоидий по сэ-ДНК у пациенток высокого риска по развитию хромосомной патологии Предыдущее исследование показало, что у женщин с привычным выкидышем прервалось 21,9% желанных беременностей, при этом в 12,5% случаев имели место анеуплоидии. При ведении беременностей пациенток с угрожающим и привычным выкидышем своевременное проведение неинвазивной пренатальной диагностики позволит выработать правильную тактику ведения беременности с отказом от ее дальнейшего пролонгирования в случае хромосомной патологии плода. Снижение частоты проведения инвазивных процедур позволит избежать осложнений, имеющих место в 2-5% случаев, когда происходит самопроизвольное прерывание желанных беременностей. Для решения поставленных задач проведена валидация метода неинвазивной диагностики анеуплоидий в группе женщин, проходивших инвазивную пренатальную диагностику. Обследование в сроке беременности от 10 до 20 недель включало: скрининг I – II триместра беременности – эхография, определение содержания сывороточных маркеров (β-ХГЧ и PAPP-A), компьютерный анализ; цитогенетическое исследование; инвазивные процедуры. Внутриматочные вмешательства с целью получения хориона, плаценты, амниотической жидкости выполняли в 11-14 недель или в 17-20 недель в связи с противопоказаниями к проведению в более ранние сроки беременности или поздним обращением женщины. У всех женщин было получено согласие на инвазивную пренатальную диагностику (биопсия ворсин хориона, плаценты, амниоцентез) и забор крови из вены для молекулярного анализа. 88 Отбор пациенток в группу исследования проводился по результатам общепринятого скрининга. В установленные сроки (11-14 недель беременности) по проведенному ультразвуковому исследованию и результату определения β-ХГЧ и PAPP-А в крови беременных женщин рассчитан индивидуальный риск хромосомных аномалий плода в программе ASTRAIA. Также проводилось ультразвуковое исследование для определения поздно манифестирующих пороков развития плода. При выявлении у беременной повышения риска хромосомных аномалий (ХА) – трисомии 21, 18 и моносомии Х и получения согласия женщины на инвазивную пренатальную диагностику (биопсию ворсин хориона, плаценты, амниоцентез), до ее начала производился забор крови из вены для последующего выделения внеклеточной ДНК, секвенирования, подсчета покрытия хромосом 21, 18, X и Y. Таким образом, группу исследования составили 200 беременных женщин, на сроках беременности от 10 до 20 недель (mediana – 14 недель), возраст женщин колебался от 30 до 45 лет (mediana-34 года) с высоким риском трисомии 21 и/или трисомии 18 и моносомии X (>1:100) по данным комбинированного пренатального скрининга. В таблице 28 представлено распределение исследуемых женщин по возрасту. Таблица 28 Возраст женщин исследуемой группы Возраст (лет) Женщины высокого риска по ХА (n=200) Абсолютные значения % 20-24 15 7,5 25-29 38 19,0 30-34 60 30,0 35-39 58 29,0 40-45 29 14,5 89 Превалировали женщины в возрасте от 30 до 39 лет, составляющие 59,0% от числа всех женщин группы. Беременные возрастной группы старше 40 лет составляли 14,5%. Однако, необходимо обратить внимание на тот факт, что женщины молодого возраста от 20 до 29 лет составили 26,5%. Средний возраст наступления менархе у женщин исследуемой группы составил 13,4±1,5 лет, менархе наступило своевременно в возрасте 12-14 лет у 80,0% женщин. У подавляющего большинства женщин 85,6% менструальный цикл был регулярным с менархе, длительностью 29,51,5 дней. У 5,0 % женщин в родословной наследственной и врожденной патологии отмечены случаи у близких родственников. При анализе исходов предыдущих беременностей установлено, что в 11,0% случаев отмечалось рождение детей с генетическими нарушениями, а также неразвивающиеся беременности с установленной анеуплоидией плода. В анамнезе у женщин исследуемой группы в 7,0% случаев отмечался привычный выкидыш, в 13,0% наблюдений беременность наступила в результате программы ЭКО, проведенной в связи с бесплодием. Донорства яйцеклетки не было ни в одном случае. При анализе гинекологических заболеваний установлено, что операции на органах малого таза лапароскопическим доступом проведены у 26 женщин, из них в 6 случаях с диагностической целью для выяснения причин бесплодия, в 7 случаях по поводу объемных образований яичников, в 3 случаях выполнены миомэктомии, в 5 случаях туботомии при внематочной беременности и в 4 случаях проведена коагуляция очагов наружного генитального эндометриоза. Были проанализированы причины направления на инвазивную диагностику женщин с диагностированной впоследствии анеуплоидией плода (таблица 29). 90 Таблица 29 Причины направления на инвазивную процедуру Анеуплоидии УЗ-признаки Биохимические маркеры абс. % Возраст старше 40 лет абс. % абс. % 13 76,5 2 11,1 2 11,8 6 75,0 2 25,0 - - 5 100,0 - - - - Трисомия 21 n=17 Трисомия 18 n=8 Моносомия Х n=5 Как видно из представленных данных, у женщин с впоследствии диагностированной анеуплоидией плода в большинстве случаев причиной направления на инвазивную диагностику являлись результаты УЗИ (толщина воротникового пространства, отек мягких тканей, гипоплазия носовых костей). У 170 женщин, у которых не было определено хромосомной патологии, причиной направления на инвазивную процедуру в 20,6% случаев был старший репродуктивный возраст, в 35,3% наблюдениях данные УЗИ и в 44,1% результат исследования биохимических маркеров. Во всех 200 происхождения наблюдениях в образцах тканей плодового - хорион, плацента, амниотическая жидкость, был определен кариотип плода, а в периферической крови женщины – отсутствие или наличие анеуплоидий и Y-хромосомы. В последующем цитогенетической и сопоставляли результаты неинвазивной инвазивной молекулярно-генетической диагностики. Оценка диагностической ценности неинвазивной пренатальной диагностики проведена в соответствии с «Правилами оценки 91 клинической информативности лабораторных тестов. ГОСТ Р 53022.32008. Из 200 наблюдений у 167 плодов установлен нормальный хромосомный набор, у 33 (16,5%) - патологический. Патология кариотипа при проведении инвазивной цитогенетической диагностики была представлена следующими анеуплоидиями: трисомия 21 – 19 наблюдений, трисомия 18 – 8 наблюдений, трисомия 13 – 1 наблюдение, трисомия 16 -1 наблюдение, моносомия Х – 4 наблюдения. В 196 – 98,0% случаев полученные данные были идентичны при анализе как цитогенетическим, так и молекулярно-генетическим методом. Далее подробно проанализированы полученные при неинвазивной пренатальной диагностике результаты. Среднее содержание доли фетальной ДНК в образцах составило 11,6% (90% CI: 6.6%-17.5%). В двух образцах мужского пола уровень фетальной ДНК был менее 4,0%, что делало невозможным корректное проведение молекулярно-генетического исследования. Все клинические образцы при определении Y-хромосомы были оценены, как принадлежащие к мужскому полу, все отрицательные по Y-хромосоме образцы - как относящиеся к женскому полу. Следует отметить, что в исследовании не выявляли увеличение количества хромосом Х и Y ввиду отсутствия таких образцов. Также не определялась копийность по Y-хромосоме, а только ее наличие или отсутствие, что не является ограничением исследования из-за невысокой клинической значимости определения увеличения копийности хромосомы Y. Моносомия Х была определена в 5 наблюдениях и подтверждена данными цитогенетического анализа в 4 случаях. В одном случае был получен результат, трактуемый как моносомия по X при наличии у плода хромосом XY в кариотипе. Таким образом, чувствительность определения пола плода составила более 0,99599,5%, что 92 свидетельствует о возможности использования метода для определения статуса половых хромосом, в том числе для определения моносомии по Х-хромосоме. 0.10 0.05 все хромосмы - X 0.15 0.10 0.00 0.00 0.05 доля Y 0.20 0.15 X хромосома 0.25 доля Y хромосомы 46,XX 46,XY 45,X 46,XX кариотип 46,XY 45,X кариотип Рисунок 10. Неинвазивная пренатальная диагностика: определение статуса половых хромосом у плодов. При проведении неинвазивной молекулярно-генетической диагностики всего было выявлено 28 анеуплоидий по 21, 18, 13 и 16 хромосомам, из них трисомия по 21 хромосоме – 17 наблюдений, трисомия по 18 хромосоме – 8 наблюдений, трисомия по 16 хромосоме – 1 наблюдение, трисомия по 13 хромосоме – 2 наблюдения. Результаты определения анеуплоидий в клинических образцах представлены на рисунке 11. 93 Рисунок 11. Неинвазивная пренатальная диагностика: определение анеуплоидий по 21, 18, 16 и 13 хромосомам. Ложноотрицательных результата было 2 – оба по трисомии 21. При анализе доли сэ- ДНК в этих образцах обнаружено, что она составляла менее 4,0%. Получен один ложноположительный результат по трисомии 13. Результаты определения анеуплоидий молекулярногенетическим и цитогенетическим методам представлены в таблице 30. 94 Таблица 30 Количество анеуплоидий по 21, 18, 16 и 13 хромосомам, моносомии Х хромосомы, диагностированных цитогенетическим и молекулярно-генетическим методами Патология кариотипа Нормальн Метод исследования ый Трисомия Моносомия кариотип хромосом Х 21 18 16 13 хромосомы Всего Цитогенетический 167 19 8 1 1 4 33 Молекулярногенетический 167 17 8 1 2 5 33 Анализ данных литературы показывает, что результат нельзя считать валидным при доле фетальной ДНК менее 4-5%. На снижение доли фетальной ДНК могут оказывать влияние такие факторы, как: срок беременности – рекомендованный срок не менее 10-11 недель беременности и повышение материнского веса (>70 кг) [82]. При получении доли фетальной ДНК менее 4-5% рекомендовано произвести повторный забор материала в более поздний срок беременности. Некоторые авторы рекомендуют при получении низкой доли фетальной ДНК произвести повторный забор материала примерно через 2 недели от первого забора [69, 115, 156]. Оценка диагностической ценности неинвазивной пренатальной диагностики представлена в таблице 31. В проведенном исследовании при анализе анеуплоидий по аутосомам (не половым хромосомам) при сравнении с референс-методом были получены совпадающие результаты у 197 образцов из 200. 95 Таблица 31 Оценка диагностической ценности «Неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий по 21, 18, 16 и 13 хромосомам методом высокопроизводительного секвенирования (NGS)» (сравнение с кариотипированием) Результат Подлинный статус исследования Патология Норма Сумма Патология a - истинно b – ложно а + b = 29 положительный – положительный - 28 наблюдений 1 наблюдение c – ложно d – истинно отрицательный – 2 отрицательный – наблюдения 169 а + с = 30 b + d = 170 Норма Сумма ___ a+b+c+d = 200 Чувствительность - доля истинно положительных результатов в группе больных: Чувствительность = a /(a + c) =0,93 93% Специфичность - доля истинно отрицательных результатов в группе здоровых: Клиническая специфичность = d /(b + d) = 0,9999% По результатам испытаний выявлены 28 анеуплоидий по 21, 18, 16 и 13 хромосомам, получено два ложноотрицательных результата по хромосоме 21 и один ложноположительный результат по хромосоме 13. При сравнении с существующим скринингом беременных, основанном на включении беременных женщин в группу риска по хромосомной патологии плода на основе определения биохимических 96 маркеров, данных УЗИ и возраста, нами показано, что только у 29 женщин из 200 (14,5%), попавших в группу риска на основе этих критериев, имелись анеуплоидии. Между тем у 171 женщины, попавшей в группу риска по трисомии 21 и 18 и моносомии Х (85,5%) хромосомной патологии у плода выявлено не было. В случае проведения неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий (NIPT) методом высокопроизводительного секвенирования (NGS) на основе биоинформатической обработки данных секвенирования потребность в инвазивной пренатальной диагностики для верификации результата понадобилась бы в 30 случаях против 200. В проведенном исследовании с помощью неинвазивной пренатальной диагностики установлено 28 истинно положительных анеуплоидий по аутосомам и 4 моносомии Х, только в одном случае имелся ложноположительный результат по 13 хромосоме и один - по моносомии X, возможно из-за плацентарного мозаицизма, и два ложноотрицательных результата по трисомии 21 с долей фетальной ДНК менее 4,0%. Внедрение неинвазивной пренатальной диагностики для скрининга беременных высокого риска перед проведением инвазивной пренатальной диагностики экономически обосновано уже на современном этапе и активно проводится в некоторых странах. Чувствительность и специфичность определения наиболее часто встречающихся трисомий - 21 и 18 достигает наибольших значений, поэтому технология их определения наиболее отработана. В проведенном исследовании достоверно определена трисомия по 16 хромосоме, но единичный случай не позволять сделать однозначный вывод о чувствительности и специфичности ее определения. Получен один истинный результат по трисомии 13 и один ложноположительный результат. В литературе описываются ложноположительные результаты по данной хромосоме, возможно, связанные с плацентарным 97 мозаицизмом. В связи с этим, включать данную трисомию в рутинный скрининг также нецелесообразно. Метод также имеет ограничения и особенности, в частности невозможность определения данным методом микроаномалии хромосом, мозаицизм по отдельным хромосомам, полиплоидию. По результатам проведенного исследования можно сделать вывод о необходимости применения данного метода для скрининга беременных высокого риска по анеуплоидии 21, 18 и моносомии Х при отсутствии грубых пороков развития плода по данным УЗИ, при которых целесообразно направлять беременную на инвазивную диагностику. В результате проведённых исследований установлено, что набор реагентов для неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий (NIPT) 21 и 18 хромосом и оценки копийности половых хромосом (X и Y) методом высокопроизводительного секвенирования (NGS) продемонстрировал удовлетворительную эффективность и может быть рекомендован к использованию в учреждениях здравоохранения, по профилю «акушерство и гинекология», институтах планирования семьи, диагностических центрах, занимающихся пренатальной диагностикой нарушений развития плода, для неинвазивной диагностикианеуплоидий по 21, 18 хромосомам и определения копийности половых хромосом плода (X и Y) плода. Одним из немногих ограничений на сегодняшний день является высокая стоимость теста, достигающая €460 (£373) за одно исследование [113]. Однако, использование метода высокопроизводительного секвенирования (Next-Generation Sequencing NGS), при котором параллельно происходит «прочитывание» тысяч или даже миллионов последовательностей [78] с разработкой отечественных тест-систем может существенно удешевить исследование. Внедрение метода неинвазивной пренатальной диагностики методом высокопроизводительного секвенирования для скрининга 98 беременных высокого риска может быть обосновано уже в настоящее время [61]. Международное общество пренатальной диагностики рекомендует принять этот современный тест вместе с генетическим консультированием, в случаях, когда существующие стратегии скрининга показывают у плода высокий риск развития хромосомных аномалий. Применение неинвазивной пренатальной диагностики в качестве скрининга первой или второй линии позволило бы предотвратить потери здоровых детей и оптимизировать затраты на проведение высокотехнологичной помощи беременным женщинам. 99 ГЛАВА 4 ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ Привычный выкидыш является одной из сложных проблем современного акушерства. Реализация репродуктивной функции в старшем репродуктивном возрасте, полиэтиологичность данной патологии, усугубление нарушений с увеличением числа неудач создают предпосылки к формированию синдрома привычной потери плода, который встречается у 3-5% супружеских пар [5, 7]. Причины, приводящие к привычным выкидышам, чрезвычайно разнообразны и включают в себя эндокринные, анатомические, инфекционные, аллоиммунные, аутоиммунные, тромбофилические нарушения [35]. Особенно обсуждаемыми являются генетические причины привычного выкидыша. Известно, что хромосомные аномалии являются наиболее частыми генетическими нарушениями, встречающимися и при спорадических и при привычных выкидышах. До настоящего времени остается дискуссионным вопрос являются ли анеуплоидии абортусов, выявленные в исходе предыдущих беременностей у женщин с привычным выкидышем, положительным либо отрицательным фактором вынашивания настоящее время последующей беременности. Существующий в протокол скрининга беременных включает определение белковых маркеров материнского происхождения в совокупности с данными УЗИ. Однако, у женщин с привычным выкидышем, с отягощенным акушерским и гинекологическим анамнезом, относящимся к старшей возрастной группе, получающих гормональные методы поддержки беременности, результаты скрининга могут быть ложнопозитивными. При отклонении от нормативов предлагается инвазивный метод пренатальной 100 диагностики, что в свою очередь несет определенный риск потери беременности, в особенности у женщин с привычным выкидышем. Проведение инвазивных процедур, как формы получения образцов ворсин хориона между 10 и 12 неделями гестации или с помощью амниоцентеза между 14 и 16 неделями гестации, с последующим классическим кариотипированием является «золотым стандартом» постановки диагноза. Однако, существует риск потери беременности в результате проведения инвазивных процедур, составляющий 0,5 – 2% [72], а у женщин с выкидышами в анамнезе он достигает 5,0%. С другой стороны, при ведении беременностей у женщин с привычным выкидышем, протекающих с выраженной угрозой прерывания в первой половине беременности, встает вопрос о целесообразности проведения сохраняющей терапии. Известно, что хромосомные аномалии остаются одной из наиболее частых причин потери беременности на ранних сроках и отсутствие данных о кариотипе развивающегося эмбриона/плода осложняет выбор правильной акушерской тактики [65]. Внедрение методов высокопроизводительного секвенирования открыло новые возможности в неинвазивной пренатальной диагностике анеуплоидий и определении уровней сэ-ДНК для прогнозирования течения и исходов беременностей [6]. В то же время, основным источником сэ-ДНК плода, как полагают, является апоптоз клеток трофобласта, который может служить отражением неадекватной плацентации и развития анеуплоидного плода [63, 140]. В дальнейшем, при определении анеуплоидий методом высокопроизводительного секвенирования и одновременном измерении уровней сэ-ДНК открываются возможности не только диагностики ХА плода, но и прогнозирования гестационных осложнений. Оба этих аспекта являются исключительно актуальными у женщин с привычными 101 выкидышами, преждевременными родами, плацентарной недостаточностью в анамнезе. В исследованиях показано, что резкое повышение уровня сэ-ДНК в крови матери связано с гипоксией и некрозом плаценты, что можно обнаружить задолго до появления симптомов осложнений беременности [63]. Повышение уровней сэ-ДНК и общей ДНК может быть прогностическим маркером различных осложнений беременности, в том числе преэклампсии, плацентарной недостаточности, задержки роста плода, преждевременных родов, врастания плаценты, антенатальной гибели плода [56, 59, 62, 88, 94, 109, 126]. Попытки прогнозирования преэклампсии и плацентарной недостаточности по резким выбросам сэ-ДНК в материнский кровоток проводились отдельными группами зарубежных ученых [57, 67, 137]. Установлено, что увеличение уровней сэ-ДНК и общей ДНК происходит задолго до клинических проявлений преэклампсии и плацентарной недостаточности. Аналогичные исследования в области привычных потерь беременностей, а также прогнозирования поздних гестационных осложнений на ранних сроках беременности в доступной литературе найти не удалось. В этой связи целью настоящего исследования является оптимизация программы неинвазивной пренатальной диагностики и прогнозирования исходов беременностей у супружеских пар с привычным выкидышем. Результаты диссертационной работы основаны на динамическом обследовании 256 женщин, обратившихся в Научно-поликлиническое отделение Центра за период 2011-2014 гг. Для достижения поставленной цели исследование проведено по двум направлениям. В первом проспективном когортном исследовании проводилось динамическое измерение уровней сэ-ДНК в течение всей беременности у женщин с привычным выкидышем (основная группа) и беременных с неотягощенным акушерским анамнезом (контрольная 102 группа). Исследование проводилось у всех пациенток, начиная со срока 6 недель беременности с интервалом 2 недели до 22 недель беременности ежемесячно вне до зависимости родоразрешения. от пола Новизна эмбриона/плода, данного далее исследования состояла в разработке метода, позволяющего измерить уровень сэ-ДНК у женщин, вынашивающих плоды как мужского, так и женского пола. Предыдущие исследования в данной области в основном касались женщин, вынашивающих мальчиков, когда уровень сэ-ДНК определялся на основании фрагментов Y хромосомы SRY и DYS-14, отсутствующих у беременной женщины и отражающих апоптотические изменения в трофобласте. В проведенном исследовании методом ПЦР оценивались делеционные полиморфизмы, присутствующие у отца, но отсутствующие у матери, а следовательно имеющие эмбриональное / плодовое происхождение. сравнительный анализ В данном уровней исследовании сэ-ДНК в проведен различные сроки беременности, при возникновении акушерских осложнений у женщин с отягощенным и неосложненным анамнезом, проанализированы исходы беременностей и родов, состояние новорожденных. Вторым направлением работы была валидация метода неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий, исключительно важного при осложненном течении беременности у женщин с отягощенным акушерским анамнезом. В исследование включено 200 женщин в сроках беременности от 10 до 20 недель с высоким риском трисомии 21 и/или трисомии 18 и моносомии X по данным комбинированного пренатального скрининга, которым была предложена инвазивная пренатальная диагностика. Критерии исключения: отказ или невозможность проведения инвазивной пренатальной диагностики (биопсия ворсин хориона, плаценты, амниоцентез), невозможность проведения пункции периферической вены, отказ от участия в исследовании. 103 В совокупности, продемонстрировали пренатальной оба направления современные диагностики, данного возможности основанной на исследования неинвазиной определении ДНК эмбрионального / фетального происхождения. Исходное обследование проведено 93 беременным женщинам. Из них на основании критериев включения и исключения в исследование вошли 67 пациенток. В связи с техническими возможностями метода выделения сэ-ДНК на основании выявления различных последовательностей у партнеров дальнейшее измерение уровней сэДНК стало возможным провести у 56 супружеских пар (83,6%). Основную группу составили 32 беременные с привычным выкидышем, контрольную группу – 24 беременных с неотягощенным акушерским и гинекологическим анамнезом. Дизайн исследования представлен на рис. 12. Обследовано 93 женщины Проверка на соответствие критериям включения Включено в исследование 67 женщин Исключено 11 женщин в связи с невозможностью определения сэ-ДНК На основании исследования делеционных полиморфизмов отца и матери дальнейшее исследование стало возможным у 56 супружеских пар Основная группа – 32 беременные женщины с привычным выкидышем Контрольная группа – 24 беременные с неосложненным акушерским и гинекологическим анамнезом Динамическое определение уровней общей и сэ-ДНК с 6 по 22 нед. беременности с 2 недельным интервалом, далее ежемесячно Анализ течения беременности, гестационных осложнений, исходов беременностей и родов Рисунок 12. Дизайн первого этапа исследования 104 Критериями включения в основную группу являлись: нормальный кариотип партнеров, привычный выкидыш (наличие в анамнезе 3 и более потерь беременности до 22 недель от одного и того же партнера или 2 и более потерь, если в каждом случае был подтвержден нормальный кариотип плода), информированное согласие женщины на проведение исследования. Критерии исключения: многоплодная беременность, наличие генетических факторов привычных потерь беременности, анатомические причины привычного выкидыша, наличие хронических инфекционных, онкологических, системных аутоиммунных заболеваний, резус-сенсибилизация, ожирение (ИМТ более 30 кг/м2). Контрольную группу составили женщины с неотягощенным акушерским и гинекологическим анамнезом, физиологическим течением беременности на момент обследования, подписавшие информированное согласие на проведение исследования. Критериями исключения явились: многоплодная беременность, воспалительных, заболеваний, наличие онкологических, тяжелые хронических системных экстрагенитальные инфекционноаутоиммунных заболевания, резус- сенсибилизация, ожирение (ИМТ более 30 кг/м2). Средний возраст женщин основной и контрольной групп достоверно не отличался и составил 30,6±4,5 лет и 29,5±4,6 лет соответственно. Перед включением в исследование все пациентки прошли обследование по определенной схеме, состоящей из сбора данных анамнеза, объективного и гинекологического осмотров, инструментальных исследований, включающих в себя ультразвуковое исследование беременности. для подтверждения развивающейся маточной 105 В соответствии с поставленными задачами, у всех беременных проводилось обследование и амбулаторное наблюдение в Научнополиклиническом отделении НЦАГиП по стандартной схеме, разработанной в отделении профилактики и лечения невынашивания беременности (2-м отделении акушерском патологии беременности). При необходимости в госпитализации стационарное лечение проводилось во 2-м отделении акушерском патологии беременности. Клинико-лабораторное исследование включало: клинический анализ крови, биохимический анализ крови, общий анализ мочи, бактериологический посев из цервикального канала и мазок из влагалища на степень чистоты; гемостазиологическое исследование крови; анализ крови на наличие аутоиммунных антител, проба на ВА, оценка врожденных факторов, предрасполагающих к развитию тромбофилии. При анализе частоты гинекологических заболеваний, установлен более высокий процент хронических воспалительных заболеваний органов малого таза у пациенток с привычным выкидышем. Так, в сериях исследований была доказана высокая частота воспалительных процессов у женщин с привычным выкидышем, что скорее всего связано с генетической предрасположенностью к реализации воспалительной реакции [24, 25, 31, 34, 43]. Кроме того, у женщин с привычным выкидышем в анамнезе отмечалась более высокая частота оперативных вмешательств по поводу различных гинекологических заболеваний, чем у женщин контрольной группы. При анализе менструальной функции отсутствовали достоверные отличия у пациенток основной группы по сравнению с пациентками контрольной группы. При анализе репродуктивной функции установлено, что превалировали ранние гестационные потери – самопроизвольные 106 выкидыши или неразвивающиеся беременности в 79,6% поздние выкидыши в 6,1%, преждевременные роды в 7,1% наблюдениях. Согласно современным литературным данным, женщин основной группы можно отнести в группу высокого риска по реализации ранних и поздних гестационных осложнений, таких как угрожающий выкидыш, преэклампсия, плацентарная недостаточность, задержка роста плода и угрозы преждевременных родов [18, 19, 22, 28, 29, 33, 36]. Совместимость супругов по антигенам HLA II класса (3 и более аллелей) была отмечена у 25,0% (8) пар. Проведен анализ параметров гемостазиологического исследования, в результате чего выявлено что нарушение в системе гемостаза у женщин основной группы намного выше, чем у женщин из группы контроля. Проанализировав результаты гемостазиограммы, выявлено превалирует гиперфибриногенемия в 22,0% случаев. Согласно полученным результатам, у женщин с привычным выкидышем отмечался более высокий процент инфекционно- воспалительных нарушений, чем у женщин контрольной группы. Нормоценоз влагалища отмечался чаще у женщин контрольной группы по сравнению с пациентками с привычным выкидышем 76,6% и 27,9% соответственно. Причиной подобного высокого процента инфекционно- воспалительных осложнений у женщин с привычным выкидышем согласно данным литературы может быть не только восходящее инфицирование, но и неоднократные оперативные вмешательства, проводимые с диагностической и лечебной целью, а также генетическая предрасположенность к воспалительным процессам [24, 37, 43]. Из эндокринных причин привычного выкидыша отмечены в 9,4% случаев поликистозные яичники и субклинический гипотиреоз в 12,5% наблюдениях. Гормональные нарушения были скоррегированы до наступления планируемой беременности. 107 У беременных с привычным выкидышем и в контрольной группе было произведено определение уровней общей и сэ-ДНК, дальнейшее динамическое наблюдение за беременностью, анализ осложнений и исходов беременностей. Самым частым осложнением I триместра беременности у женщин исследуемых групп был угрожающий и начавшийся выкидыш. Определение сэ-ДНК, независимо от пола плода, проводилось методом ПЦР в режиме реального времени (real time PCR). В качестве «мишени» выбирались участки генома, содержащие делеционные полиморфизмы, что позволяло отличить геном плода от генома беременной женщины на основании отцовских полиморфизмов. Из 56 женщин у 7 произошли самопроизвольные потери беременностей (все пациентки с привычным выкидышем из основной группы). Из них в 5 наблюдениях (15,6%) отмечены самопроизвольные выкидыши до 12 недель, во всех случаях по типу неразвивающихся беременностей. Произведено кариотипирование абортусов при этом отмечены хромосомные нарушения – анеуплоидии – трисомия 18, трисомия 16 и трисомия 21, а также в одном наблюдении триплоидия (кариотип абортуса 69,ХХY). Полученные данные подтверждают тот факт, что на ранних сроках превалируют потери беременности в связи с хромосомными нарушениями. У 2 (6,3%) пациенток отмечены потери беременности в 16-17 недель, причинами которых являлось излитие околоплодных вод. В обоих случаях не удалось провести кариотипирование. Нами был проведен сравнительный анализ уровней общей и сэДНК у 7 женщин с потерями беременности и 7 женщин контрольной группы. У женщин контрольной группы уровни общей ДНК колебались от 4391 копий/мл – (минимальные значения) до 14858,5 копий/мл (максимальные значения), тогда как у женщин с потерями беременности уровни общей ДНК были в пределах 3620,0 - 138855,55 копий/мл. 108 Следовательно, средний показатель уровней общей ДНК у женщин с неразвивающимися беременностями в 7,5 раз превосходил аналогичный показатель у пациенток, беременность которых была пролонгирована до срока своевременных родов. Также проведен сравнительный анализ уровней общей ДНК женщин с привычным выкидышем при неблагоприятном течении беременности в сроках 12 и 20 недель беременности, и при этом выявлено, что уровни общей ДНК достоверно выше, чем у женщин с привычным выкидышем без клинической картины угрожающего выкидыша. В 12 недель беременности у женщин с привычным выкидышем и клинической картиной угрожающего выкидыша средние значения уровней общей ДНК равнялись 47,0 копий/мл х 103 , тогда как без угрожающего выкидыша - 11,5 копий/мл х 103 (p=0,0055). В 20 недель беременности также отмечались достоверные различия: у женщин с угрозой выкидыша средний показатель уровня общей ДНК составлял 23,8 копий/мл х 103, тогда как без угрозы 11,5 копий/мл х 103 (p=0,0455). В результате сравнительного анализа уровней сэ-ДНК у женщин с привычным выкидышем при неблагоприятном течении беременности в сроках 12 недель выявлено, что уровни сэ-ДНК достоверно выше, чем у женщин с привычным выкидышем без клинической картины угрожающего выкидыша, (средние значения уровней сэ-ДНК составили 0,74 копий/мл х 103 по сравнению с 0,34 копий/мл х 103 (p=0,0416)). В 14 недель беременности также отмечались достоверные различия: у женщин с угрозой выкидыша средний показатель уровня сэ-ДНК составлял 0,34 копий/мл х 103, тогда как без угрозы 0,6 копий/мл х 103, (p=0,0098). Полученные данные согласуются с результатами исследований зарубежных коллег. В американском журнале NIH Public Access была опубликована статья, целью которой являлась оценка взаимосвязи 109 между уровнями сэ-ДНК и скрининговыми сывороточными маркерами в первом (PAPP-A, β-ХГЧ) и втором (β-ХГЧ, АФП) триместрах. У 50 женщин был определен уровень сэ-ДНК плода методом ПЦР в режиме реального времени, а также проводился биохимический скрининг I и II триместра, после чего эти результаты были сопоставлены с течениями и исходами беременностей. В результате исследования сделан вывод, что имеется взаимосвязь между уровнями PAPP-A и сэ-ДНК в первом триместре. РАРР-А представляет собой гликопротеин плацентарного происхождения, и его взаимосвязь с сэ-ДНК в крови матери предполагает общий источник их происхождения, а именно путем апоптоза клеток плаценты. В результате проведенного исследования сделан вывод, что низкие значения РАРР-А и высокий уровень сэ-ДНК связаны с неблагоприятными исходами беременности (преэклампсия, плацентарная недостаточность преждевременные роды) [81]. Вышеизложенные данные подлежат дальнейшему анализу для уточнения роли гестационных описанных осложнений изменений и в реализации возможностей их поздних применения в клинической практике. Обнаружение высокого уровня сэ-ДНК в первом триместре, может применяться также как ранний маркер неблагоприятного течения беременности и последующих гестационных осложнений [96, 107, 109, 133]. В проведенном нами исследовании выявлена взаимосвязь клинических проявлений угрожающего и начавшегося выкидыша с высокими уровнями общей и сэ-ДНК, независимо от анамнеза пациентки. В отдельных исследованиях, проведенных зарубежными коллегами, получены данные о взаимосвязи клинических проявлений угрожающего выкидыша с высокими уровнями общей и сэ-ДНК [80]. 110 В проведенном исследовании установлено, что уровни сэ - ДНК и общей ДНК у женщин с привычным выкидышем были в 4 раза выше, чем у женщин, чьи беременности протекали без осложнений. У женщин с привычным выкидышем при неблагоприятном течении беременности в сроках 12 и 20 недель беременности уровни сэ-ДНК достоверно выше, чем при отсутствии клинической картины угрожающего выкидыша. Выявлена взаимосвязь клинических проявлений угрожающего и начавшегося выкидыша с высокими уровнями общей и сэ-ДНК, независимо от анамнеза пациентки. У женщин с привычным выкидышем и неосложненным течением первой половины беременности уровни сэ-ДНК статистически значимо выше, чем у здоровых беременных, что может предрасполагать к реализации плацента – ассоциированных гестационных осложнений. Согласно результатам систематического обзора, обобщившего данные 22 исследований, уровень сэ-ДНК может быть надежным маркером преэклампсии. Выявлен высокий уровень сэ-ДНК в крови матери во время преэклампсии [106], а также в некоторых из этих исследований, высокие уровни сэ-ДНК предшествовали клиническим проявлениям преэклампсии. Приведенные данные свидетельствуют о том, что уровни сэ-ДНК могут нести потенциальную информативность для ранней диагностики такого опасного акушерского осложнения, как преэклампсия [4, 58, 67, 84, 143, 149]. Нами были проанализированы течение и исходы беременностей женщин всех исследуемых групп. У женщин с привычным выкидышем наиболее частым осложнением I и II триместра была угроза прерывания беременности, что встречалась в 71,8% случаев в I триместре и в 38% наблюдениях во II триместре, в результате чего была назначена терапия, направленная на пролонгирование беременности. При необходимости в стационарном лечении, проведена госпитализация во 2-е отделение акушерское 111 патологии беременности. Вторым по частоте осложнением II триместра являлась ИЦН в 21,8% наблюдениях, проводилась госпитализация и хирургическая коррекция ИЦН. Осложнения течения III триместра беременности у женщин с привычным выкидышем были представлены угрозой преждевременных родов, плацентарной недостаточностью, то есть состояниями, в основе которых лежит нарушение плацентации [1, 17, 20, 41]. Многие исследователи считают, что истоки данных состояний лежат в первом триместре беременности, когда происходит инвазия трофобласта [26, 27, 32, 40, 44, 83]. При анализе исходов беременностей выявлено, что у женщин основной группы в 3 случаях произошли преждевременные роды. Из них в 1 случае показаниями для досрочного оперативного родоразрешения было прогрессирование плацентарной недостаточности, задержка роста плода в сроке беременности 29-30 недель. Этот клинический случай сопровождался экстремально высокими уровнями общей и сэ-ДНК в периферической крови матери за 2 недели до клинических проявлений плацентарной недостаточности. Уровни общей ДНК превосходили средние показатели в группе с привычным выкидышем и угрозой преждевременных родов в 6,7 раз, в группе с физиологическим течением беременности в 35 раз. Та же тенденция получена при анализе уровней сэ-ДНК: в 2,2 раз выше показателей в группе с привычным выкидышем и угрозой преждевременных родов, и 5,6 раз с неосложненной беременностью. Интерес представляют данные об уровнях сэ-ДНК на ранних сроках в периферической крови наблюдаемой пациентки с плацентарной недостаточностью. В отсутствии признаков угрожающего/начавшегося выкидыша до 22 недель, достоверных изменений уровней сэ-ДНК по сравнению с уровнями сэ-ДНК у женщин с неосложненной беременностью не отмечено. Вероятно, это свидетельствует о быстром 112 динамическом изменении уровней сэ-ДНК в зависимости от процессов, происходящих в фето-плацентарном комплексе. Повторяющиеся высокие уровни сэ-ДНК в периферической крови женщины после 22 недели беременности свидетельствуют о прогрессировании плацентарной недостаточности. В 2 случаях у женщин основной группы произошли самопроизвольные преждевременные роды: у 1 женщины - излитие околоплодных вод в сроке 36 недель и в 1 наблюдении начало регулярной родовой деятельности в 34 недели. Все недоношенные дети проходили стационарное лечение в отделение реанимации и интенсивной терапии и выписаны в удовлетворительном состоянии. В ходе исследования не удалось установить связь между высокими уровнями сэ-ДНК на ранних сроках беременности и осложнениями III триместра беременности, что, возможно, связано с проведением патогенетической терапии, направленной на пролонгирование беременности [119]. Своевременные роды у пациенток с привычным выкидышем произошли в 68,8% наблюдений, самопроизвольные в 54,5% случаев, кесарево сечение в 45,5%. Как показал первый этап работы, несмотря на проводимую терапию прервалось 15,6% желанных беременностей в сроках до 12 недель, из них 12,5% было обусловлено анеуплоидиями. В этой связи, сэ-ДНК в крови матери были предложены также в качестве потенциальных маркеров для неинвазивной пренатальной диагностики [52, 74, 90, 146]. Неинвазивная пренатальная диагностика (NIPD) имеет существенное медицинское значение, она нацелена на развитие более безопасных и эффективных методов, с помощью которых можно избежать рисков угрозы выкидыша и потери плода, возникающих при проведении инвазивной пренатальной диагностики [8, 16, 82] . 113 Неинвазивная пренатальная высокопроизводительного диагностика секвенирования (NIPT) методом является новым многообещающим методом, необходимость внедрения которого для клинического использования активно обсуждается специалистами ведущих мировых сообществ по пренатальной диагностике [9]. Около 5,0-10,0% ДНК в периферической крови матери имеют эмбриональное/плодовое происхождение [51, 110], что дает возможность определить уровни сэ-ДНК и использовать полученные данные в диагностике анеуплоидий. В период с «04» февраля 2013 г. по «30» июня 2014г коллективами лаборатории молекулярно-генетических методов и клинической генетики была проведена валидация медицинской технологии «Неинвазивная пренатальная диагностика анеуплоидий методом высокопроизводительного секвенирования (next-generation sequencing-NGS)». Было исследовано 200 образцов плазмы крови беременных женщин высокого риска по реализации трисомий 21, 18 и 13, забранной перед проведением инвазивной пренатальной диагностики (биопсия ворсин хориона, плаценты, амниотическая жидкость). Превалировали женщины в возрасте от 30 до 39 лет, составляющие 59,0% от числа всех женщин группы. Средний возраст наступления менархе у женщин исследуемой группы составил 13,4±1,5 лет, менархе наступило своевременно в возрасте 12-14 лет у 80,0% женщин. У подавляющего большинства женщин 85,6% менструальный цикл был регулярным с менархе, длительностью 29,51,5 дней. У женщин с анеуплоидией плода в большинстве случаев причиной направления на инвазивную процедуру являлись результаты УЗИ (толщина воротникового пространства, отек мягких тканей, гипоплазия носовых костей). 114 У 170 женщин, у которых не было определено хромосомной патологии, причиной направления на инвазивную процедуру в 20,6% случаев был старший репродуктивный возраст, в 35,3% наблюдениях данные УЗИ и в 44,1% результат исследования биохимических маркеров. Проведена оценка наличия или отсутствия анеуплоидий, а также пола плода (хромосомы X и Y), с помощью биоинформатической обработки данных секвенирования. Во всех 200 происхождения наблюдениях в образцах тканей плодового - хорион, плацента, амниотическая жидкость, был определен кариотип плода, а в периферической крови женщины – отсутствие или наличие анеуплоидий и Y-хромосомы. В последующем цитогенетической и сопоставляли результаты неинвазивной инвазивной молекулярно-генетической диагностики. Оценка диагностической ценности неинвазивной пренатальной диагностики проведена в соответствии с «Правилами оценки клинической информативности лабораторных тестов. ГОСТ Р 53022.32008». Из 200 наблюдений у 167 плодов установлен нормальный хромосомный набор, у 33 (16,5%) - патологический. Патология кариотипа при проведении инвазивной цитогенетической диагностики была представлена следующими анеуплоидиями: трисомия 21 – 19 наблюдений, трисомия 18 – 8 наблюдений, трисомия 13 – 1 наблюдение, трисомия 16 -1 наблюдение, моносомия Х – 4 наблюдения. В 196 – 98,0% случаев полученные данные были идентичны при анализе как цитогенетическим, так и молекулярно-генетическим методом. Среднее содержание доли фетальной ДНК в образцах составило 11,6% (90% CI: 6.6%-17.5%). В двух образцах мужского пола уровень фетальной ДНК был менее 4,0%, что делало невозможным корректное 115 проведение молекулярно-генетического исследования. Учитывая ограничение метода, при неинвазивной пренатальной диагностике не были определены 2 образца с триплоидией 69,ХХХ. Все клинические образцы при определении Y-хромосомы были оценены, как принадлежащие к мужскому полу, все отрицательные по Y-хромосоме образцы - как относящиеся к женскому полу. Следует отметить, что в исследовании не выявляли увеличение количества хромосом Х и Y ввиду отсутствия таких образцов. Также не определялась копийность по Y-хромосоме, а только ее наличие или отсутствие, что не является ограничением исследования из-за невысокой клинической значимости определения увеличения копийности хромосомы Y. Моносомия Х была определена в 5 наблюдениях и подтверждена данными цитогенетического анализа в 4 случаях. В одном случае был получен результат, трактуемый как моносомия по X при наличии у плода хромосом XY в кариотипе. Таким образом, чувствительность определения пола плода составила более 0,99599,5%, что свидетельствует о возможности использования метода для определения статуса половых хромосом, в том числе для определения моносомии по Х-хромосоме. Проведенное исследование является одним из первых отечественных опытов валидации метода неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий путем высокопроизводительного секвенирования. Вместе с тем, специалисты ведущих мировых клиник опубликовали результаты валидации данного метода в течение последних 3 лет. В Калифорнийском университете генетики в Сан-Диего с мая по декабрь 2012 года проведена оценка эффективности неинвазивной пренатальной диагностики, при помощи определения сэДНК у женщин старшего репродуктивного возраста. За этот период в институт обратились 206 пациенток, из них 155 женщин (75,0%) были 116 старшего репродуктивного возраста, далее были отобраны 70 женщин, средний возраст которых составлял 37,7 ± 2,5 лет. Всем женщинам проводилась неинвазивная пренатальная диагностика. Только в одном случае был положительный результат для трисомии 21, после чего проведен хориоцентез и диагноз подтвердился. У остальных 69 женщин (98,6%), был нормальный кариотип плода, и от дальнейшей инвазивной диагностики пациентки отказались. При рождении все 69 новорожденных имели нормальный кариотип. Авторами сделан вывод не только о точности метода, но и предпочтениях женщин, так как после проведения неинвазивной пренатальной диагностики имел место отказ от проведения инвазивных методов, несмотря на подписание женщинами формы информированного согласия, в которой разъяснено, что метод имеет свои ограничения [123]. Неинвазивная пренатальная диагностика не является 100% методом диагностики анеуплоидии плода и требуются дальнейшие исследования для определения возможности клинического применения описанного метода, как у беременных женщин групп риска, так и в качестве скрининговых методик [99, 125]. В Американском институте генетики была предложена неинвазивная пренатальная диагностика, как скрининг - тест для выявления беременных с высоким риском анеуплоидии по 21,18 и 13 хромосомам. Хотя эти исследования являлись многообещающими и демонстрировали высокую чувствительность и специфичность при низких ложноположительных результатах, существуют определенные ограничения для неивазивной пренатальной диагностики. Специфичность и чувствительность не являются одинаковыми для всех хромосом; это обусловлено, тем, что имеются различные содержания нуклеотидов - цитозина и гуанина [111]. 117 Поскольку 80,0% редких заболеваний являются генетически обусловленными, неинвазивная пренатальная диагностика имеет потенциал, для обнаружения редких генетических заболеваний на ранней стадии и он используется во многих странах и регионах. Так как в Китае самое большое в мире количество пациентов с редкими генетическими заболеваниями, неинвазивная пренатальная диагностика (NIPT) была реализована в Китае с 2010 года, однако, правила, регулирующие правовые основы NIPT в Китае слабы. В Китае проведена неинвазивная пренатальная диагностика у 212 беременных женщин на 8-12 неделях беременности. Были проанализированы данные женщин с высоким риском развития генетических нарушений. Произведено массивное параллельное геномное секвенирование ДНК плода для обнаружения анеуплоидий, а именно трисомий 21, 18, 13, Х и Y. Инвазивная пренатальная диагностика путем хориоцентеза и амниоцентеза была также предложена всем женщинам, для подтверждения как положительных, так и отрицательных результатов NIPT. С помощью неинвазивной пренатальной диагностики у 2 женщин выявлены трисомия по 21, у 1 трисомия по 18, а также в 1 случае трисомия по 13 хромосомам, что также было подтверждено результатами кариотипирования, после хориоцентеза и амниоцентеза. Был один ложно-положительный результат моносомия (45 X) и 2 ложноотрицательных результата. Также наблюдается повышение доли сэ-ДНК со сроком беременности от 8 до 12 недель. Методом неинвазивной пренатальной диагностики обнаружено, что у 95% исследуемых женщин уровень сэ-ДНК в крови был более 4,0%, что является достаточным для точного определения анеуплоидии плода. Было доказано, что доля сэДНК является крайне низкой при ожирении и на очень ранних сроках беременности. В результате исследования был сделан вывод, что применение неинвазивной пренатальной диагностики для выявления 118 анеуплоидий у женщин в сроках беременности 8-12 недель, является весьма надежным и точным методом [122]. Журнал Molecular Cytogenetics за июль 2014 года, опубликовал два исследования, где проводилась валидация метода неинвазивной диагностики анеуплоидии плода у женщин проходивших инвазивную пренатальную диагностику (хориоцентез, амниоцентез). В частности в 2013 году учеными под руководством профессора Nicolaides, со 100% чувствительностью и 100% специфичностью, без ложно-положительных и ложно-отрицательных результатов выявлена трисомия 21 в 32 случаях из 242 женщин. В 2012 году по руководством профессора Zimmerman, проведено исследование 166 беременных женщин высокого риска, также проведена валидация метода неинвазивной диагностики анеуплоидии у женщин проходивших инвазивную пренатальную диагностику. Согласно полученным результатам, у 11 женщин обнаружена трисомия 21, в 3 наблюдениях трисомия 18, в 2 случаях трисомия 13, у 2 женщин обнаружена моносомия по Х хромосоме (45 X), и у 2 женщин кариотип плода - 47XXY [138]. В существующем на данный момент скрининге ХА плода оцениваются только косвенные маркеры, из-за чего он имеет недостаточно высокую чувствительность и специфичность [57]. Из-за увеличения среднего возраста женщин, планирующих деторождение, количество выявляемой хромосомной патологии может существенно увеличиваться [86]. В то же время, проведение инвазивной диагностики, обеспечивающей необходимый уровень достоверности связано с риском осложнений и потери беременности. В последние несколько лет активно развиваются методы неинвазивной пренатальной диагностики основанные на анализе внеклеточной ДНК плода в крови матери [5, 78, 152] . В ряде исследований показано, что частота выявления плодов с хромосомными 119 аномалиями достигает 99,5 – 100%, с частотой ложно – положительных результатов не более 0,1% [50]. Эти исследования демонстрируют, что неинвазивная пренатальная диагностика является эффективным методом скрининга для хромосомных аномалий с частотой обнаружения более 99,0% при ложноположительных результатах менее 0,1% [112, 116, 124, 150]. Результаты проведенного исследования подлежат дальнейшему анализу для уточнения роли апоптотических выбросов сэ-ДНК в реализации поздних гестационных осложнений и возможностей их применения в клинической практике. Внедрение метода неинвазивной пренатальной диагностики для скрининга беременных высокого риска как теста второй линии перед проведением инвазивной пренатальной диагностики обосновано уже на современном этапе. В настоящее время широко дискутируется вопрос о внедрении данной методики в рутинный скрининг всех беременных. Проведение неинвазивной пренатальной диагностики беременных позволит значительно снизить перинатальные потери и случаи рождения ребенка с тяжелым инвалидизирующим заболеванием во всех возрастных группах и предотвратить потери здоровых плодов при проведении инвазивной пренатальной диагностики. Необходима национальная валидация методов неинвазивной пренатальной диагностики и разработка нормативных документов, определяющих их место в обследовании беременных женщин в условиях системы Российского здравоохранения. 120 ВЫВОДЫ При анализе клинико-анамнестических данных установлено, 1. что пациентки с привычным выкидышем и женщины без отягощенного анамнеза сопоставимы по возрасту, характеру менструальной функции, частоте соматических заболеваний. Отмечено статистически значимое различие в частоте воспалительных заболеваний органов малого таза в анамнезе у женщин с привычным выкидышем (72,0%) по сравнению с пациентками контрольной группы (12,0%) – p<0,05. Отмечена высокая частота осложнений первого триместра беременности в виде угрожающего и начавшегося выкидыша у женщин основной группы (72,0%). 2. Определение уровней сэ-ДНК независимо от пола плода в периферической крови женщины возможно с 6 недели беременности. Установлено, что при угрожающем и начавшемся выкидыше, независимо от предшествующего анамнеза пациентки, происходит резкое повышение уровней общей и сэ-ДНК, что может служить патогенетическим механизмом в реализации прерывания беременности. Высокие уровни общей и сэ-ДНК на ранних сроках беременности ассоциированы с угрожающим/начавшимся выкидышем и являются неблагоприятным прогностическим маркером развития беременности до 22 недель. 3. Установлено, что у женщин с привычным выкидышем за 2 недели до возникновения угрозы прерывания беременности уровни общей ДНК статистически значимо превышали аналогичные показатели женщин с привычным выкидышем и неосложненным течением 121 беременности в сроках 12 и 20 недель, что совпадает с общепринятыми сроками проведения биохимического и ультразвукового скрининга. При 4. неосложненном течении первой половины беременности у женщин с привычным выкидышем и здоровых беременных получены достоверные различия в уровнях общей и сэДНК. При отсутствии клинических проявлений угрожающего выкидыша, уровни общей и сэ-ДНК пациенток с неоднократными потерями беременностей значительно превышают аналогичный показатель здоровых беременных женщин, особенно в сроках 12 и 14 недель. 5. Отмечено достоверное повышение уровней общей и сэ-ДНК при начавшемся спорадическом выкидыше у женщин без отягощенного акушерского анамнеза по сравнению с женщинами с неосложненным течением данной беременности. По показателям общей ДНК достоверные различия получены в сроках 6,10,12,14,16 недель, по сэДНК – в 12 и 14 недель. 6. В проведенном исследовании, посвященном валидации метода неинвазивной пренатальной диагностики беременных женщин установлено 29 анеуплоидий у 200 истинно положительных анеуплоидий по аутосомам и 4 моносомии Х. В одном случае имелся ложноположительный результат по 13 хромосоме и один - по моносомии X, возможно, из-за плацентарного мозаицизма, и два ложноотрицательных результата по трисомии 21 с долей фетальной ДНК менее 4,0%. Установлено, что метод неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий 21, 18 хромосом, копийности половых хромосом X и Y методом высокопроизводительного секвенирования по 122 периферической крови беременных женщин обладает чувствительностью 93,0% и специфичностью 99,0%. 7. У женщин с отягощенным акушерским анамнезом, угрожающим и начавшимся выкидышем неинвазивная пренатальная диагностика анеуплоидий методом высокопроизводительного секвенирования является методом выбора в выявлении хромосомной патологии плода, позволяющим избежать осложнений, обусловленных инвазивными диагностическими процедурами дальнейшую тактику ведения беременности. и оптимизировать 123 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Неинвазивная методом пренатальная высокопроизводительного диагностика анеуплоидий секвенирования является эффективным методом скрининга хромосомных аномалий плода с чувствительностью метода 93,0% и специфичностью 99,0%. Рекомендовано проведение данного метода, как скринингового в популяции женщин с одноплодной беременностью при высоком риске реализации хромосомной патологии плода (возрастной и анамнестический факторы, беременность, протекающая с выраженной угрозой прерывания, УЗ маркеры хромосомных аномалий плода). 2. Рекомендуется использование неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий методом высокопроизводительного секвенирования с 11 до 18 недель у беременных с угрожающим и привычным выкидышем, отягощенным акушерским анамнезом для выработки рациональной тактики ведения беременности и определения целесообразности ее пролонгирования. Предлагаемый подход позволит избежать ненужных инвазивных диагностических процедур при отсутствии хромосомной патологии плода и снизить риск гестационных осложнений. 3. Высокие значения уровней сэ-ДНК в I триместре беременности являются неблагоприятным прогностическим фактором ранних гестационных осложнений (самопроизвольного прерывания беременности, начавшегося выкидыша, анеуплоидии) и должны служить основанием для расширенного клинико-лабораторного обследования, углубленного мониторинга и подбора терапии. 124 4. Рекомендуется исследование уровней общей и сэ-ДНК в скрининговые сроки 12 и 20 недель для прогнозирования акушерских осложнений у групп беременных высокого риска. Высокие уровни сэДНК у женщин с привычным выкидышем и отсутствием клинических проявлений угрозы последующим прерывания развитием беременности плацентарной ассоциированы с недостаточности, преждевременных родов, элективного досрочного родоразрешения. 5. Нормализация уровней сэ-ДНК в динамике беременности у женщин с угрожающим и привычным выкидышем свидетельствует об эффективности проводимой терапии и может служить благоприятным прогностическим маркером пролонгирования беременности. 125 АЛГОРИТМ ОБСЛЕДОВАНИЯ ПАЦИЕНТОК С ПРИВЫЧНЫМ ВЫКИДЫШЕМ С ОПРЕДЕЛЕНИЕМ ОБЩЕЙ И СЭ-ДНК В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ В ТЕЧЕНИЕ БЕРЕМЕННОСТИ Тщательный сбор и анализ анамнестических данных (генетическое консультирование, выявление наследственной патологии, соматических, гинекологических заболеваний, числа и характера прерывания предыдущих беременностей) Клинико-лабораторное обследование, назначение базовой терапии (гестагены, фолиевая кислота) + определение уровней общей и сэ –ДНК в 6-7 недель беременности Нормативный результат Результат значительно превышает нормативные значения для данного срока беременности Повышен риск гестационных осложнений Расширенное клинико-лабораторное обследование, тщательный мониторинг за течением беременности, подбор терапии Возможна потеря беременности за счет анеуплоидии Продолжить наблюдение согласно общепринятому алгоритму ведения женщин с привычным выкидышем Оценка уровней общей и сэ-ДНК в 12-14 недель беременности наряду с проведением УЗ и биохимического скрининга Результат значительно превышает нормативные значения для данного срока беременности Повышен риск гестационных осложнений и анеуплоидии. Направление на неинвазивную или инвазивную пренатальную диагностику в зависимости от результатов УЗ и биохимического скрининга, выбора женщины и наличия или отсутствия противопоказаний Направление на неинвазивную или инвазивную диагностику в зависимости от Нормативный результат Продолжить наблюдение согласно общепринятому алгоритму ведения женщин с привычным выкидышем 126 АЛГОРИТМ ОБСЛЕДОВАНИЯ ПАЦИЕНТОК С ПРИВЫЧНЫМ ВЫКИДЫШЕМ С ОПРЕДЕЛЕНИЕМ УРОВНЕЙ ОБЩЕЙ И СЭ-ДНК В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ В ТЕЧЕНИЕ БЕРЕМЕННОСТИ (продолжение) Нормальный результат при проведении УЗИ и неинвазивной пренатальной диагностики Выявлена анеуплоидия, подтверждение при проведении амниоцентеза и кариотипирования –консультативное решение вопроса о прерывании беременности до 20 недель Повторное определение уровней общей и сэ-ДНК в срок с 20 по 22 неделю беременности Результат значительно превышает нормативные значения для данного срока беременности Повышен риск гестационных осложнений (плацентарной недостаточности, задержки роста плода, преждевременных родов) Расширенное клинико-лабораторное обследование, тщательный мониторинг за течением беременности, подбор терапии Нормативный результат Продолжить наблюдение согласно общепринятому алгоритму ведения женщин с привычным выкидышем 127 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АГС – адреногенитальный синдром АФС – антифосфолипидный синдром ВА – волчаночный антикоагулянт ВЗОМТ – воспалительные заболевания органов малого таза ВПГ – вирус простого герпеса ВПР – врожденные пороки развития ГБН – гемолитическая болезнь новорожденного ДВС – синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ЗРП – задержка роста плода ИЦН – истмико-цервикальная недостаточность МГЦ – медико-генетический центр НПД – неинвазивная пренатальная диагностика ПД – пренатальная диагностика ПНБ – привычное невынашивание беременности ПЦР – полимеразная цепная реакция РНК – рибонуклеиновая кислота СПКЯ – синдром поликистозных яичников сэ-ДНК – свободная эмбриональная ДНК ТДФ – тестис-детерминирующий фактор УЗИ – ультразвуковое исследование ФНО-α, β – фактор некроза опухоли-α, β β-ХГЧ – бета-субъединица хорионического гонадотропина человека ХА – хромосомные аномалии ЦМВ – цитомегаловирус DYS-14 – ген Y-хромосомы HLA – лейкоцитарные антигены человека NIPT – неинвазиваная пренатальная диагностика 128 NK – натуральные киллеры РАРР-А - ассоциированный с беременностью протеин-А плазмы SRY – пол-детерминирующий район Y-хромосомы Th1, Th2 – Т хелперы I класса, Т хелперы II класса 129 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ: 1. Айламазян, Э. К. Гестоз : теория и практика / Э. К. Айламазян, Е. В. Мозговая. – М. : Медпресс-информ, 2008. 2. Акушерство. Национальное руководство / Под ред. Э.К. Айламазяна, В.И. Кулакова, В.Е. Радзинского, Г.М. Савельевой. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2009. – 1218 с. 3. Александрова, Н. В. Ранние этапы становления системы мать – плацента – плод / Н. В. Александрова, О. Р. Баев // Акушерство и гинекология. – 2011. – № 8. – С. 4-10. 4. Баев, О. Р. Особенности состояния венозной гемодинамики плода при нарушениях артериального кровотока в фетоплацентарной системе / О. Р. Баев // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. – 2004. – Т.3, № 1. – С. 30-36. 5. Баранов, B. C. Цитогенетика эмбрионального развития человека / B. C. Баранов, Т. В. Кузнецова. – СПб. : Изд-во Н-Л, 2007. – 620 с. 6. Баранов, B. C. Новое в пренатальной диагностике и профилактике наследственных и врожденных болезней у плода человека / В. С. Баранов // Акушерство и гинекология. – 2007. – № 5. – С. 45-50. 7. Баранов, B. C. Экологические и генетические причины нарушения репродуктивного здоровья и их профилактика / В. С. Баранов, Э. К. Айламазян // Журнал акушерства и женских болезней. – 2007. – Т. LVI, вып.1. – С. 3 - 10. 8. Баранов, В. С. Прикладное и фундаментальное направления пренатальной диагностики / В. С. Баранов, Э. К. Айламазян. – // Журнал акушерства и женских болезней. – 2012. – Т. LХI, вып.1. – С. 54-61. 9. Бахарев, В.А. Неинвазивный скрининг беременных / В.А. Бахарев, Н.А. Каретникова, А.М. Стыгар // Акушерство и гинекология. – 2012. – № 4. – С. 26-31. 10. Благодатских, Е. Г. Использование циркулирующих ДНК и мРНК для неинвазивного пренатального определения пола, резус фактора и 130 диагностики синдрома Дауна у плода : автореф. дис. … канд.биол. наук / Е. Г. Благодатских. – М., 2010. – 23 с. 11. Ведение беременности у женщин с невынашиванием в анамнезе : пособие для врачей / В.И. Краснопольский, О.Ф. Серова, Л.И. Титченко [и др.]. – М., 2007. - 24 с. 12. Зайнулина, М. С. Тромбофилия: этиологический фактор или патогенетический аспект осложненного течения беременности? / М. С. Зайнулина, Е. А. Корнюшина, Д. Р. Бикмуллина // Журнал акушерства и женских болезней. – 2010. – Т. LIX, №1. – С. 18-30. 13. Золотухина, Т.В. Пренатальная цитогенетика: вчера, сегодня, завтра / Т. В. Золотухина // Медицинская генетика. – 2007. – Т. 6, №10 (64). – С.17-20. 14. Кащеева, Т.К. Биохимический скрининг маркерных белков в сыворотке крови беременных / Т.К. Кащеева // Клиническая лабораторная диагностика. – 2008. – №2. – С.25-32. 15. Клиническое значение морфофункционального состояния эндометрия при нарушениях репродуктивной функции / О.Ф. Серова, Г.В. Тамазян, Н.И. Соваев [и др.] // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии . – 2010. –Т. 9, № 4. – С. 43 - 48. 16. Малышева, О. В. Неинвазивная пренатальная диагностика / О. В. Малышева, В. С. Баранов // Проблемы, подходы и перспективы. – 2012. – Т. LXI, № 3. – С. 83-93. 17. Нарушения внутриматочного кровообращения и их прегравидарная коррекция у пациенток с тяжелым гестозом в анамнезе / Г. М. Савельева, Е. Ю. Бугеренко, О. Б. Панина [и др.] // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. – 2010. – № 3. – С. 5-10. 18. Особенности продукции простагландинов у пациенток с невынашиванием беременности / О. Ф. Серова, С. Ю. Марченко, И. М. Айларова [и др.] // Российский вестник акушера – гинеколога. – 2007. – № 5. – С. 5-8. 131 19. Оценка перинатальных факторов риска у недоношенных с экстремально низкой и очень низкой массой тела / М. В. Нароган, Л. В. Малютина, О. Ф. Серова [и др.] // Российский вестник перинатологии и педиатрии. – 2011. – № 3. – С. 20-24. 20. Оценка функции адгезии к эндотелиальным клеткам различных субпопуляций мононуклеаров периферической крови беременных женщин в норме и при гестозе / Д. И. Соколов, М. В. Лесничия, А. В. Селютин [и др.] // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. – 2008. – Т. 7, № 4. – С. 3441. 21. Оценка цитокинового профиля при химиосенсибилизированной фотомодификации крови у пациенток с привычным невынашиванием беременности вирусного генеза в анамнезе / О. В. Макаров, А. З. Хашукоева, О. А. Свитич [и др.] // Акушерство и гинекология. – 2014. – № 8. – С. 19-26. 22. Радзинский, В. Е. Преждевременные роды / В. Е. Радзинский, И. Н. Костин // Акушерство и гинекология. – 2009. – № 4. – С. 16-19. 23. Роль ангиогенных факторов роста в патогенезе преэклампсии и плацентарной недостаточности / О. В. Макаров, Е. В. Волкова, Е. Ю. Лысюк [и др.] // Акушерство и гинекология. – 2014. – № 12. – С. 64-70. 24. Роль хронического эндометрита в генезе ранних репродуктивных потерь / В. Н. Юдаев, О. Ф. Серова, И. А. Трифонова [и др.] // Вестник последипломного медицинского образования. – 2010. – № 1. – С. 36-38. 25. Роль хронического эндометрита в ранних репродуктивных потерях / О. Ф. Серова, Т. Б. Добровольская, Н. В. Зароченцева [и др.] // Репродуктивные технологии сегодня и завтра : материалы XV международной конференции. – Чебоксары, 2005. – С. 86 - 87. 26. Роль цитокинов в контроле развития плаценты в норме и при гестозе / Д. И. Соколов, М. В. Лесничия, А. В. Селютин [и др.] // Иммунология. – 2009. – № 1. – С. 22-27. 132 27. Румянцева, В. П. Роль лейкоцитов и цитокинов в развитии и регуляции родовой деятельности / В. П. Румянцева, О. Р. Баев, В. Н. Верясов // Акушерство и гинекология. – 2011. – № 8. – С. 11-15. 28. Савельева, Г. М. Какой классификации гестозов (преэклампсии) должен придерживаться врач в повседневной работе? / Г. М. Савельева, В. И. Краснопольский, А. Н. Стрижаков // Российский вестник акушера-гинеколога. ‒ 2013. ‒ № 2. ‒ С. 73-76. 29. Савельева, Г. М. Материнская смертность и пути ее снижения / Г. М. Савельева, М. А. Курцер, Р. И. Шалина // Акушерство и гинекология. ‒ 2009. ‒ № 3. ‒ С. 11-15. 30. Свободная эмбриональная ДНК в плазме крови как предиктор самопроизвольных потерь беременности у женщин с привычным выкидышем / Н. И. Федорова, Н. К. Тетруашвили, Л. З. Файзуллин [и др.] // Акушерство и гинекологии. – 2012. – № 6. – С. 4-8. 31. Серов, В. Н. Клинико-иммунологические факторы в формировании аутоиммунной овариальной недостаточности воспалительного генеза / В. Н. Серов, М. В. Царегородцева, А. А. Кожин // Акушерство и гинекология. ‒ 2007. ‒ № 6. ‒ С. 28-33. 32. Серов, В. Н. Пути снижения акушерской патологии / В. Н. Серов // Акушерство и гинекология. ‒ 2007. ‒ № 5. ‒ С. 8-12. 33. Серов, В. Н. Эффективность профилактики преждевременных родов / В. Н. Серов, О. И. Сухорукова // Акушерство и гинекология. – 2013. ‒ № 3. – С. 48-53. 34. Серова, О. Ф. Иммунотропная терапия урогенитальных инфекций у беременных / О. Ф. Серова, Н. В. Зароченцева, Н. С. Меньшикова // Вестник последипломного медицинского образования. ‒ 2009. ‒ № 1. ‒ С. 23-27. 35. Серова, О. Ф. Новые аспекты генеза ранних репродуктивных потерь / О. Ф. Серова, Н. В. Зароченцева, С. Ю. Марченко // АГ-Инфо. ‒ 2007. ‒ № 1. ‒ С. 12-14. 133 36. Сидельникова, В. М. Преждевременные роды. Недоношенный ребенок / В. М. Сидельникова, А. Г. Антонов. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2006. – 448 с. 37. Сидельникова, В. М. Невынашивание беременности / В. М. Сидельникова, Г. Т. Сухих. – М. : МИА, 2010. – 536 с. 38. Сидельникова, В. М. Привычная потеря беременности / В. М. Сидельникова. – М. : Триада-X, 2005. ‒ 304 с. 39. Сидорова, И. С. Особенности плацентации при преэклампсии и эклампсии / И. С. Сидорова, А. П. Милованов, Н. А. Никитина // Российский вестник акушера-гинеколога. – 2014. – № 3. – C. 4 - 10. 40. Сидорова, И. С. Патоморфологические особенности повреждений мозга при тяжелой преэклампсии и эклампсии / И. С. Сидорова, А. П. Милованов, Н. А. Никитина // Акушерство и гинекология. – 2013. - № 3. – С. 44-48. 41. Сидорова, И. С. Роль плода в развитии преклампсии / И. С. Сидорова, М. А. Курцер, Н. А. Никитина // Акушерство и гинекология ‒ 2012. ‒ № 5. ‒ С. 23-28. 42. Тимошевский, В. А. Технологии молекулярного кариотипирования в практике быстрой пренатальной диагностики клинически значимых анеуплоидий / В. А. Тимошевский, И. Н. Лебедев // Медицинская генетика. – 2010. – Т. 9, № 8. – С. 13 - 23. 43. Шуршалина, А. В. Хронический эндометрит у женщин с патологией репродуктивной функции : автореф. дис. … д-ра мед. наук / А. В. Шуршалина. – М., 2006. – 38 с. 44. Экстраэмбриональные и околоплодные структуры при нормальной и осложненной беременности: монография / В.Е. Радзинский, А.П. Милованов, И.М. Ордиянц [и др.] / Под ред. В.Е. Радзинского, А.П. Милованова. – М. : Медицинское информационное агентство, 2004. – 393 с. 45. Юдина, Е. В. Основы пренатальной диагностики / Е. В. Юдина, М. В. Медведев. – М. : РАВУЗДПГ, Реальное Время, 2002. – 184 с. 134 46. A new non-invasive prenatal diagnosis of Down syndrome through epigenetic markers and real-time qPCR / P. C. Patsalis, E. Tsaliki, G. Koumbaris [et al.] // Expert Opin. Biol. Ther. – 2012. – Vol. 12 (Suppl. 1). – P. 155-161. 47. ACMG statement on noninvasive prenatal screening for fetal aneuploidy / A. R. Gregg, S. J. Gross, R. G. Best [et al.] // Genet. Med. – 2013. – Vol. 15. – P. 395-398. 48. Allison, J. L. Recurrent first trimester pregnancy loss: revised definitions and novel causes / J. L. Allison, D. J. Schust // Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. – 2009. – Vol. 16, № 6. – P. 446 - 450. 49. American College of Obstetricians and Gynecologists. Invasive prenatal testing for aneuploidy : ACOG Practice Bulletin № 88 // Obstet. Gynecol. – 2007. – Vol. 110. – P. 1459-1467. 50. Ashoor, G. Trisomy 13 detection in the first trimester of pregnancy using a chromosome-selective cell-free DNA analysis method / G. Ashoor // Ultrasound Obstet. Gynecol. – 2013. – Vol. 41, № 1. – P. 21-25. 51. Avent, N. D. Non-invasive diagnosis of fetal sex; utilisation of free fetal DNA in maternal plasma and ultrasound / N. D. Avent, L. S. Chitty // Prenat. Diagn. – 2006. – Vol. 26. – P. 598-603. 52. Avent, N. D. RHD genotyping from maternal plasma: guidelines and technical challenges / N. D. Avent // Methods in Molecular Biology. – 2008. – Vol. 444. – P. 185-201. 53. Barrett, A. N. Stability of cell-freeDNA from maternal plasma isolated following a single centrifugation step / A. N. Barrett, H. A. Thadani, C. LaureanoAsibal // Prenat. Diagn. – 2014. – Vol. 34. – P. 1283-1288. 54. Benn, P. Non-invasive prenatal testing for aneuploidy: current status and future prospects / P. Benn, H. Cuckle, E. Pergament // Ultrasound Obstet. Gynecol. – 2013. – Vol. 42. – P. 15-33. 55. Bianchi, D. W. Integration of noninvasive DNA testing for aneuploidy into prenatal care: what has happened since the rubber met the road? / D. W. Bianchi, L. Wilkins-Haug // Clin. Chem. – 2014. – Vol. 60. – P. 78-87. 135 56. Branch, W. D. Recurrent Miscarriage / W. D. Branch, M. Gibson, M. Silver // Engl. J. Med. – 2010. – Vol. 363. – P. 1740-1747. 57. Can detection of late-onset PE at triage by sflt-1 or PlGF be improved by the use of additional biomarkers? / I. Kaufmann, C. Rusterholz, I. Hösli [et al.] // Prenat. Diagn. – 2013. – Vol. 32. – P. 1288–1294. 58. Can the quantity of cell-free fetal DNA predict preeclampsia: a systematic review / A. Martin, I. Krishna, B. Martina [et. al.] // Prenat. Diagn. – 2014. – Vol. 34. – P. 685-691. 108 59. Cell free DNA is more sensitive than cell-free mRNA as a marker for evaluation of fetal-maternal hemorrhage / K. Miura, K. Yoshiura, S. Miura [et al.] // Clin. Chem. – 2006. – Vol. 52. – P. 2121-2123. 60. Cell-free fetal DNA (SRY locus) concentration in maternal plasma is directly correlated to the time elapsed from the onset of PET to the collection of blood / A. Farina, A. Sekizawa, N. Rizzo [et al] // Prenatal Diagnostic. – 2004. – Vol. 24. – P. 293-297. 61. Cell-free fetal DNA and cell-free total DNA levels in spontaneous abortion with fetal chromosomal aneuploidy / J. H. Lim, M. H. Kim, Y. J. Han [et al.] // PLoS One. – 2013. – Vol. 8, № 2. – P. e56787. 62. Cell-free fetal DNA concentration in plasma of patients with abnormal uterine artery Doppler waveform and intrauterine growth restriction–a pilot study / E. Caramelli, N. Rizzo, M. Concu [et al.] // Prenat. Diagn. – 2003. – Vol. 23. – P. 367371. 63. Cell-free nucleic acids as potential markers for preeclampsia / S. Hahn, C. Rusterholz, I. Hosli [et al.] // Placenta. – 2011. – Vol. 32. – P. 17-20. 64. Characterization of first trimester fetal erythroblasts for non-invasive prenatal diagnosis / M. Choolani, K. O’Donoghue, D. Talbert [et al.] // Molecular Human Reproduction. – 2003. - Vol. 9, № 4. – P. 227 – 235. 65. Chromosome abnormalities identified in 347 spontaneous abortions collected in Japan / M. Nagaishi, T. Yamamoto, K. Iinuma [et al.] // J. Obstet. Gynaecol. Res. – 2004. – Vol. 30. – P. 237–241. 136 66. Clinical application of fetal sex determination using cell-free fetal DNA in pregnant carriers of X-linked genetic disorders / K. Miura, A. Higashijima, T. Shimada [et. al.] // J Human Genetic. – 2011. – Vol. 56, № 4. – P. 296 - 299. 67. Clinical evaluations of cell-free fetal DNA quantities in preeclamptic pregnancies / Y. G. Zeybek, T. Gunel, A. Benian [et al.] // J. Obstet. Gynaecol. Res. – 2013. – Vol. 39. – P. 632–640. 68. Costa, J. M. New strategy for prenatal diagnosis of X-linked disorders / J. M. Costa, A. Benachi, E. Gautier // N. Engl. J. Med. – 2002. – Vol. 346. – P. 1502. 69. Dan, S. Clinical application of massively parallel sequencing-based prenatal noninvasive fetal trisomy test for trisomies 21 and 18 in 11,105 pregnancies with mixed risk factors / S. Dan // Prenat. Diagn. – 2012. – Vol. 32, №13. – P. 12251232. 70. DEGUM guidelines for amniocentesis and chorionic villus sampling / C. Kahler, U. Gembruch, K. S. Heling [et. al.] // Ultrasound Med. – 2013. – Vol. 34. – P. 435 – 440. 71. Derivation of a prediction rule for posttraumatic organ failure using plasma DNA and other variables / T. H. Rainer, Y. M. Lo, L.Y. Chan [et al.] // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 2001. – Vol. 945. – P. 211-220. 72. DNA identification of fetal cells isolated from cervical mucus: potential for early non-invasive prenatal diagnosis / G. Mandy, D. Mantzaris, S. David [et al.] // Br. J. Obstet. Gynecol. – 2005. – Vol. 112. – P. 595 – 600. 73. DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome: an international collaborative study / G. E. Palomaki, C. Deciu, E. M. Kloza [et al.] // Genet. Med. – 2012. – Vol. 14. – P. 296 – 305. 74. DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an international clinical validation study / G.E. Palomaki, E.M. Kloza, G.M. LambertMesserlian [et al.] // Med. Genet. – 2011. – Vol. 13. – P. 913-920. 137 75. DNA sequencing versus standard prenatal aneuploidy screening / D. W. Bianchi, R.L. Parker, J. Wentworth [et al.] // N. Engl J Med. – 2014. – Vol. 370. – P. 799-808. 76. Elevation of both maternal and fetal extracellular circulating deoxyribonucleic acid concentrations in the plasma of pregnant women with PET / X. Y. Zhong, H. Laivuori, J.C. Livingston [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. – 2001. – Vol. – 184. – P. 414 – 419. 77. Embrionic karyotype of abortuses in relation to the number of previous miscarriages / M. Ogasawara, K. Aoki, S. Okada [et. al.] // Fertil Steril. – 2000. – Vol. 73. – P. 300-304. 78. Fauzdar, A. Non-invasive prenatal testing (NIPT): a better option for patients / A. Fauzdar // Mol. Cytogenet. – 2014. – Vol. 7. – P. 17. 79. Feasibility of noninvasive prenatal testing for common fetal aneuploidies in an early gestational window / X. Shi, Z. Zhang, D.S. Cram [et al.] // Clin. Chim. Acta. – 2015. – Vol. 439. – P. 24-28. 80. Fetal DNA in maternal plasma in preeclamptic pregnancies / B. Vlkova, J. Turna, P. Celec [et.al.] // Hypertens Pregnancy. – 2014. – Vol. 7. – P. 1-14. 81. Fetal fraction in maternal plasma cell-free DNA at 11–13 weeks’ gestation : effect of maternal and fetal factors / G. Ashoor, L. Poon, A. Syngelaki [et al.] // Fetal. Diagn. Ther. – 2012. – Vol. 31. – P. 237-243. 82. Fetal fraction in maternal plasma cell-free DNA at 11–13 weeks’ gestation : relation to maternal and fetal characteristics // G. Ashoor, A. Syngelaki, L. C. Y. Poon [et al.] // Ultrasound Obstet. Gynecol. – 2013. – Vol. 41. – P. 26-32. 83. Fetal fraction of cell-free DNA in maternal plasma in the prediction of spontaneous preterm delivery / M.S. Quezada, C. Francisco, D. Dumitrascu-Biris [et al.] // Ultrasound Obstet. Gynecol. – 2015. – Vol. 45. – P. 101-105. 84. First-trimester maternal plasma cell-free fetal DNA and preeclampsia / S. Sifakis, A. Zaravinos, N. Maiz [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. – 2009. – Vol. 201, № 5. – P. 472-477. 138 85. Gardner, R. Chromosome abnormalities and Genetic Counseling / R. Gardner, G. Sutherland. – Oxford University Press Inc., 2011. 86. Genetic counseling, prenatal screening and diagnosis of Down syndrome in the second trimester in women of advanced maternal age: a prospective study / Q.W. Qi [et al.] // Chin. Med. J. Engl. – 2007. – Vol. 126, № 11. – P. 10. 87. Hall, A. Non-invasive prenatal diagnosis using cell-free fetal DNA technology: applications and implications / A. Hall, A. Bostanci, C.F. Wright // Public Health Genomics. – 2010. – Vol. 13, № 4. – P. 246-255. 88. High levels of circulatory erythroblasts and cell-free DNA prior to intrauterine fetal death / X. Y. Zhong, A. Steinborn, C. Sohn [et al.] // Prenat. Diagn. – 2006. – Vol. 26. – P. 1272–1273. 89. High levels of fetal cell-free DNA in maternal serum: a risk factor for spontaneous preterm delivery / A. Farina, S. E. Leshane, R. Romero [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. – 2005. – Vol. 193 – P. 421-425. 90. High-Throughput Massively Parallel Sequencing for Fetal Aneuploidy Detection from Maternal Plasma / T. J. Jensen, T. Zwiefelhofer, R.C. Tim [et al.] // PLoS ONE. – 2013. – Vol. 8, № 3. – P. e57381. 91. How do women of diverse backgrounds value prenatal testing outcomes? / M. Kuppermann, R. Nease Jr., E. Gates [et al.] // Prenat. Diagn. – 2004. – Vol. 24. – P. 424-429. 92. Identifying mild and severe preeclampsia in asymptomatic pregnant women by levels of cell-free fetal DNA / T. R. Jakobsen, F.B. Clausen, L. Rode [et. al.] // Prenat. Diagn. – 2012. – Vol. 32. – P. 840– 845. 93. Increased apoptosis in the syncytiotrophoblast in human term placentas complicated by either PET or intrauterine growth retardation / N. Ishihara, H. Matsuo, H. Murakoshi [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. – 2002. – Vol. 86. – P. 158 – 166. 94. Increased cell-free fetal DNA in plasma of two women with invasive placenta / A. Sekizawa, M. Jimbo, H. Saito [et al.] // Clin. Chem. – 2002. – Vol. 48. – P. 353-354. 139 95. Increased fetal DNA concentrations in the plasma of pregnant women carrying fetuses with trisomy-21 / Y.M.D. Lo., T.K. Lau, J. Zhang [et al.] // Clinical Chem. – 1999. – Vol. 45, № 10. – P. 1747 - 1751. 96. Increased free fetal DNA levels in early pregnancy plasma of women who subsequently develop preeclampsia and intrauterine growth restriction / S. Illanes, M. Parra, R. Serra [et al.] // Prenat. Diagn. – 2009. – Vol. 29, № 12. – P. 1118 – 1122. 97. Increased maternal plasma fetal DNA concentrations in women who eventually develop PET / T.N. Leung, J. Zhang, T.K. Lau [et al.] // Clinical Chem. – 2001. – Vol. 47. – P. 137 – 139. 98. Incremental cost of non-invasive prenatal diagnosis versus invasive prenatal diagnosis of fetal sex in England / M. Hill, S. Taffinder, L.S. Chitty [et al.] // Prenatal Diagnostic. – 2011. – Vol. 31. – P. 267 - 273. 99. Kagan, K. O. Combined first trimester screening and cell-free fetal DNA - “next generation screening” / K. O. Kagan, B. Eiben, P. Kozlowski // Ultrasound Med. – 2014. – Vol. 35. – P. 229 – 236. 100. Karyotype of the abortus in recurrent miscarriage / J. Carp, V. Toder, A. Aviram [et al.] // Fertil. Steril. – 2001. – Vol. 75. – P. 678-682. 101. Langman, S. Medical Embryology / Ed. T. W. Sadler. – Lippincott Williams and Wilkins, 2009. - 414 p. 102. Leung, T. N. Thalassaemia screening in pregnancy / T. N. Leung, T. K. Lau, T. K. Chung // Curr. Opin. Obstet. Gynecol. – 2005. – Vol. 17, № 2. – P. 129 134. 103. Li, Y. Recent developments in the detection of fetal single gene differences in maternal plasma and the role of size fractionation / Y. Li, S. Hahn, W. Holzgreve // Ann. NY Acad. Sci. – 2006. – Vol. 1092. – P. 285 - 292. 104. Lichtenbelt, K. D. From karyotyping to array-CGH in prenatal diagnosis / K. D. Lichtenbelt, N. V. Knoers, G. H. Schuring-Blom // Cytogenetic Genome Res. – 2011. – Vol. 135, № 4. – P. 241 - 250. 140 105. Lо, Y. PCR-Based Noninvasive Prenatal Diagnosis Using Fetal Cells in Maternal Circulation / Y. Lо // Methods Mol. Med. – 1998. – Vol. 16. – P. 265 – 274. 106. Masuzaki, H. Detection of cell free placental DNA in maternal plasma: direct evidence from three cases of confined placental mosaicism / H. Masuzaki, K. Miura // J. Med. Genet. – 2004. – Vol. 41. – P. 289 – 292. 107. Maternal plasma cell-free DNA in the prediction of pre-eclampsia / D. L. Rolnik, N. O’Gorman, M. Fiolna, [et al.] // Ultrasound Obstet. Gynecol. – 2015. – Vol. 45. – P. 106-111. 108. Maternal plasma cell-free fetal and maternal DNA at 11-13 weeks’ gestation: relation to fetal and maternal characteristics and pregnancy outcomes / L. C. Poon, T. Musci, K. Song [et al.] // Fetal. Diagn. Ther. – 2013. – Vol. 33, № 4. – P. 215-223. 109. Melamed, N. Fetal gender and pregnancy outcome / N. Melamed, Y. Yogev, M. Glezerman // J. Matern. Fetal. Neonatal Med. – 2010. – Vol. 23, № 4. – P. 338 – 344. 110. Microfluidics digital PCR reveals a higher than expected fraction of fetal DNA in maternal plasma / F. M. Lun, R. W. Chiu, K. C. Allen Chan [et al.] // Clin. Chem. – 2008. – Vol. 54. – P. 1664–1672. 111. Mujezinovic, F. Procedure-related complications of amniocentesis and chorionic villous sampling: a systematic review / F. Mujezinovic, Z. Alfirevic // Obstet. Gynecol. – 2007. – Vol. 110, № 3. – P. 687-694. 112. Musci, T. J. Non-invasive prenatal testing with cell-free DNA: US physician attitudes toward implementation in clinical practice / T. J. Musci, G. Fairbrother, A. Batey // Prenat Diagn. – 2013. – Vol. 33. – P. 424-428. 113. Neyt, M. Introducing the non-invasive prenatal test for trisomy 21 in Belgium: a cost-consequences analysis / M. Neyt, F. Hulstaert, W. Gyselaers // Br. Med. J. – 2014. – Vol. 4. – P. e005922. 114. Non-invasive fetal sex determination in maternal plasma: a prospective feasibility study / F. J. Fernández-Martínez, A. Galindo, A. Garcia-Burguillo [et al.] // Genet. Med. – 2012. – Vol. 14. – P. 101-106. 141 115. Non-invasive prenatal chromosomal aneuploidy testing—clinical experience: 100,000 clinical samples / R. M. McCullough [et al.] // PLoS One. – 2014. – Vol. 9. – №10. – P. e109173. 116. Non-invasive prenatal detection of achondroplasia in size-fractionated cell-free DNA by MALDI-TOF MS assay / Y. Li, G. C. Page - Christiaens, J. J. Gille [et al.] // Prenat. Diagn. – 2007. – Vol. 27, № 1. – P. 11 - 17. 117. Non-invasive prenatal detection of chromosomal aneuploidies using different next generation sequencing strategies and algorithms / M. Entezami, N. Trunk, M. Beck [et al.] // Prenat. Diagn. – 2012. – Vol. 32. – P. 569-577. 118. Non-invasive Prenatal Detection of Sex Chromosomal Aneuploidies by Sequencing Circulating Cell-Free DNA from Maternal Plasma / A. R. Mazloom , Z. Dzakula, P. Oeth [et al.] // Prenat. Diagn. – 2013. – Vol. 33. – P. 591-597. 119. Non-invasive prenatal determination of fetal sex: translating research into clinical practice / M. Hill, K. Finning, P. Martin [et. al.] // Clinical Genet. – 2011. – Vol. 80. – P. 68-75. 120. Non-invasive prenatal exclusion of congenital adrenal hyperplasia by maternal plasma analysis: a feasibility study / R. W. K. Chiu, T. K. Lau, P. T. Cheung [et al.] // Clin. Chem. – 2002. – Vol. 48. – P. 778-780. 121. Non-invasive prenatal screening for fetal trisomies 21, 18, 13 and the common sex chromosome aneuploidies from maternal blood using massively parallel genomic sequencing of DNA / R. P. Porreco, T. J. Garite, K. Maurel [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. – 2014. – Vol. 211. – P. 1-12. 122. Non-invasive prenatal testing for fetal aneuploidies in the first trimester of pregnancy / Y. Song, S. Huang, X. Zhou [et. al.] // Ultrasound Obstet. Gynecol. – 2015. – Vol. 45, № 1. – P. 55-60. 123. Non-invasive prenatal testing : a replacement for chorionic villus sampling and amniocentesis for advanced maternal age? / K. E. Pettit, A. D. Hull, L. Korty [et al.] // Obstet. Gynecol. – 2014. – Vol. 123. – P. 165-166. 142 124. Non-invasive tool for fetal sex determination in early gestational age / M. Mortarino, I. Garagiola, L.A. Lotta [et al.] // Haemophilia. – 2011. – Vol. 17, № 6. – P. 952 - 956. 125. Ohno, M. The role of noninvasive prenatal testing as a diagnostic versus a screening tool—a cost-effectiveness analysis / M. Ohno, A. Caughey // Prenat. Diagn. – 2013. – Vol. 33. – P. 630-635. 126. Placenta increta : postpartum monitoring of plasma cell-free fetal DNA / M. Jimbo, A. Sekizawa, Y. Sugito [et al.] // Clin. Chem. – 2003. – Vol. 49. – P. 1540–1541. 127. Placental microparticles, DNA, and RNA in preeclampsia / C. Rusterholz, M. Messerli, I. Hoesli [et al.] // Hypertens Pregnancy. – 2011. – Vol. 30. – P. 364–375. 128. Porter, T.F. Evidence-based care of recurrent miscarriage / T.F. Porter, J.R. Scott // Best Practice Res Clinal Obstetrics Gynaecology. – 2005. – Vol. 19., №. 1. - P. 85 - 101. 129. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum / Y. Lo, N. Corbetta, F. Chamberlain [et al.] // Lancet. – 1997 – Vol. 350. – P. 485 – 487. 130. Prospective register of outcomes of free fetal DNA testing (PROOF)— results of the first year’s audit / L. Chitty, G. Daniels, K. Finning [et al.] // J Med Genetic. – 2007. – Vol. 44. – P. 28. 131. Puszyk, W. M. Non-invasive prenatal diagnosis of aneuploidy using cellfree nucleic acids in maternall blood: promises and unanswered questions / W. M. Puszyk, F. Crea, R. W. Old // Prenatal Diagnostic. – 2008. – Vol. 28. – P. 1-6. 132. Quantification and application of the placental epigenetic signature of the RASSF1A gene in maternal plasma / Z. Fuxi, L. Runhua, Y. Jing [ et. al.] // Prenat. Diagn. – 2010. – Vol. 30. – P. 778-782. 133. Quantification of circulating fetal DNA as a tool for potential monitoring of pregnant patients with antiphospholipid antibodies / M. Korabecna, Z. UlcovaGallova, A. Horinek [et al.] // Autoimmunity. – 2014. – Vol. 47. – P. 473-477. 143 134. Quantification of fetal and total circulatory DNA in maternal plasma samples before and after size fractionation by agarose gel electrophoresis / I. Hromadnikova, L. Zejskova, J. Doucha [et. al.] // DNA Cell Biology. – 2006. – Vol. 25. – P. 635 – 640. 135. Quantification of Fetal DNA by Use of Methylation-Based DNA Discrimination / A. O. Nygren, J. Dean, T. J. Jensen [et al.] // Clin. Chem. – 2010. – Vol. 56. – P. 1627 – 1635. 136. Quantitative abnormalities of fetal DNA in maternal serum in preeclampsia / Y. Lo, T. N. Leung, M. S. C. Tein [et al.] // Clin. Cem. – 1999. – Vol. 45. – P. 184 – 188. 137. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma in gestational diabetes mellitus, iron deficiency anemia and gestational hypertension pregnancies / M. Zamanpoor, R. Rosli, M. N. Yazid [ et al.] // J. Matern. Fetal. Neonatal. Med. – 2013. – Vol. 26. – P. 960–966. 138. Recurrent fetal aneuploidy and recurrent miscarriage / A. E. Sullivan, R. M. Silver, Y. la Coursiere [et al.] // Obstet. Gynocol. – 2004. – Vol. 104. – P. 784788. 139. Recurrent miscarriage : aetiology, management and prognosis / T. C. Li, M. Markis, M. Tomsu [et al.] // Hum. Reprod. Update. – 2002. – Vol. 104. – P. 784 788. 140. Redman, C. W. Placental debris, oxidative stress and preeclampsia / C. W. Redman, I. L. Sargent // Placenta. – 2000. – Vol. 21. – P. 597–602. 141. Reindollar, R. H. Contemporary issues for spontaneous abortion. Does recurrent abortion exist? / R. H. Reindollar // Obstet. Gynecol. Clin. NA. – 2000. – Vol. 27. – P. 541. 142. Relationships between Cell-Free DNA and Serum Analyses in First and Second Trimesters of Pregnancy / L. Neeta, M.D. Vora, L. Kirby [et al.] // NIH Public Access. – 2010. – Vol. 116. – P. 673 – 678. 144 143. Role of circulating cell-freeDNA levels in patients with severe preeclampsia and HELLP syndrome / M. L. Miranda, H. C. Macher, R. MuñozHernández [et al.] // Am. J. Hypertens. – 2013. – Vol. 26. – P. 1377-1380. 144. Royal College of Obstetricians and Gynecologists Guideline / Ed. L. Regan, M. J. Backos, R. Rai. – London, 2003. – № 17. 145. SAFE—The Special Non-invasive Advances in Fetal and Neonatal Evaluation Network: aims and achievements / S. Lyn, I. C. Chitty, E. van der Schoot [et al.] // Prenatal Diagnostic. – 2008. – Vol. 28. – P. 83 – 88. 146. Scheffer, P. G. Noninvasive fetal blood group genotyping of rhesus D, C, E and of K in alloimmunised pregnant women: evaluation of a 7-year clinical experience / P. G. Scheffer, C. E. Schoot, M. Haas // Br. J. Obstet. Gynaecol. – 2011. – Vol. 118. – P. 1340–1348. 147. Sifakis, S. Cell-freefetalDNA and pregnancy-related complications / S. Sifakis, Z. Koukou, D.A. Spandidos // Mol. Med. Rep. – 2015. – Vol. 11. – P. 23672372. 148. Six consecutive false positive cases from cell-free fetal DNA testing in a single referring centre / N. Dugo, F. Padula, L. Mobili [et al.] // J. Prenat. Med. – 2014. – Vol. 8. – P. 1-2. 149. Taglauer, E. S. Review: cell-free fetal DNA in the maternal circulation as an indication of placental health and disease / E. S. Taglauer, L. Wilkins-Haug, D. W. Bianchi // Placenta. – 2014. – Vol. 35. – P. 64-68. 150. The Balance of the Immune System between T Cells and NK Cells in Miscarriage. / A. Nakashima, T. Shima, K. Inada [et al.] // Am. J. Reprod. Immunol. – 2012. –Vol. 67, № 4. – P. 304-310. 151. Total and fetal cell-free DNA analysis in maternal blood as markers of placental insufficiency in intrauterine growth restriction / М. Al Nakib, R. Desbriere, N. Bonello [et al.] // Fetal. Diagn. – 2009. – Vol. 26. – P. 24-28. 152. Translational utility of next-generation sequencing / F. S. Ong, J. C. Lin, K. Das [et al.] // Genomics. – 2013. – Vol. 102. – P. 137-139. 145 153. Trisomy recurrence: a reconsideration based on North American data / D. Warburton, L. Dallaire, M. Thangavelu [et al.] // Am. J. Hum. Genet. – 2004. – Vol. 75. – P. 376 – 385. 154. Trophoblast deportation in pre-eclamptic pregnancy / S. Chua, T. Wilkins, I. Sargent [et al.] // Br. J. Obstet. Gynaecol. – 1991. –Vol. 98. – P. 973 979. 155. Wagner, A. J. Use of Cell-Free Fetal DNA in Maternal Plasma for Noninvasive Prenatal Screening / A. J. Wagner, M. E. Mitchell, A. Tomita-Mitchell // Clin. Perinatol. – 2014. – Vol. 41. – P. 957-966. 156. Wang, E. Gestational age and maternal weight effects on fetal cell-free DNA in maternal plasma / E. Wang // Prenat. Diagn. – 2013. – Vol. 33, № 7. – P. 662-666. 157. Wapner, R. J. The impact of new genomic technologies in reproductive medicine / R. J. Wapner, B. Levy // Discov. Med. – 2014. – Vol. 17. – P. 313-318. 158. Wright, C. F. The use of cell-free fetal nucleic acids in maternal blood for non-invasive prenatal diagnosis / C. F. Wright, H. Burton // Hum. Reprod. Update. – 2009. – Vol. 5, № 1. – P. 139 – 151. 159. Zhong, X. Y. The levels of circulatory cell free fetal DNA in maternal plasma are elevated prior to the onset of PET / X. Y. Zhong, W. Holzgreve, S. Hahn // Hypertens Pregnancy. – 2002. – Vol. 21. – P. 77 – 83.