СЕПАРАТОР БИОЛОГИЧЕСКИХ КЛЕТОК НА ОСНОВЕ

СЕПАРАТОР БИОЛОГИЧЕСКИХ КЛЕТОК НА ОСНОВЕ
ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ В ПРОТИВОТОКЕ ЖИДКОСТИ
Ю.В. Андриянов, Johann Bauer, М.В. Голованов, А.А. Московцев
ГНЦ РФ ТРИНИТИ, andryu@gcnet.ru, SIHATHO GmbH, D-35201 Biedenkopf, Germany,
ЭДИТО РАМН, НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН
Описан настольный клеточный сепаратор. Разработанный сепаратор обеспечивает скорость
вращения до 3000 об/мин и обеспечивает разделение частиц имеющих удельный вес <1,3 кГ/л и
объем в диапазоне 50 – 4000 фемтолитров. Рассмотрены области применения сепаратора в биологии
и медицине
Впервые метод центрифугирования в противотоке был предложен Линдалом
в 1947 году (Lindahl P.E. Nature 161 (1947), 648-649.). Однако, лишь в 80-х годax
этот метод был реализован Бауэром и Ханнигом из биохимического подразделения
Института Макса Планка в Германии применительно к разделению биологических
клеток (J. Bauer and K. Hannig. Journal of Immunological Methods, 112 (1988), 213218.), а также фирмой Бекман (Германия). Фирма Бекман выпустила опытную
партию таких центрифуг. Основной недостаток этих центрифуг – большие потери
клеточного материала и необходимость загрузки в машину достаточно большого
количества клеток, что в ряде диагностических применений недопустимо.
В ГНЦ РФ ТРИНИТИ разработан макетный образец настольного клеточного
сепаратора в противотоке жидкости в поле центробежных сил. Фотографии
сепаратора и разделительной камеры, в которой создается противоток клеточной
суспензии показаны на рис.1.
Рис.1. Слева – сепаратор, справа – разделительная камера, состоящая из двух частей,
выполненных литьем из паладура.
19
В состав установки входят: ротор с разделительной камерой, система
подвода жидкости к ротору, насос, система ввода клеточной культуры в поток
жидкости, система вывода сепарированных клеток в пробирки, электропривод и
блок энергоснабжения, управления и контроля электроприводом. Сепаратор
выполнен в виде отдельного блока, размещаемого на лабораторном столе. В
качестве электропривода и блока энергоснабжения в макетном образце
использована лабораторная центрифуга ОПН-8.
Сепаратор обеспечивает хорошее разделение различных клеток при
сравнительно малом количестве клинического материала (достаточно около 50 млн.
клеток). В макетном образце сепаратора ротор центрифуги с разделительной
камерой установлен на оси двигателя, поэтому ввод и вывод потока жидкости с
биологическими клетками в разделительную камеру осуществляется с одной
стороны ротора через осевые каналы (входной канал на оси ротора, а выходной
смещен на несколько миллиметров). В экспериментах с использованием такого
герметичного вращающегося соединения с двумя раздельными каналами удалось
достичь удовлетворительной работы центрифуги при скоростях до 3000 об/мин.
В клеточном сепараторе поток жидкости с биологическими клетками входит
через вращающееся сочленение в канал на оси вращения, который в средней части
ротора переходит в радиальный канал. На периферии ротора этот канал развернут
на 180 градусов вверх и входит в разделительную камеру, имеющую специальный
профиль поперечного сечения. Выход разделительной камеры соединен с
продолжением радиального канала, который на оси ротора переходит в канал
смещенный от оси ротора для вывода жидкости через вращающееся сочленение.
Разделение клеток по размерам происходит по длине разделительной камеры за
счет уравнивания центробежной силы и силы со стороны потока жидкости,
действующих на каждую клетку. После установления режима течения клетки
разного объема собираются в потоке на различных расстояниях от входа в
разделительную камеру. Для вывода клеток определенного объема (размера)
используется резкое изменение скорости потока и переключение вывода потока
жидкости на различные сборные пробирки.
В системе разделения в противотоке на клетки, входящие в разделительную
камеру действуют центробежные силы в сторону от оси вращения ротора и силы со
стороны потока жидкости, направленные к оси вращения ротора. При заданной
скорости вращения ротора центробежные силы больше на периферии и
уменьшаются к центру вращения. Геометрия камеры разделения проектируется так,
чтобы сила Стокса на клетки со стороны потока жидкости была больше вначале
камеры и уменьшалась на расстоянии примерно 80% длины камеры к оси
вращения, а затем опять увеличивались на остальных 20% длины камеры. Это
обеспечивается переменным поперечным сечением камеры – в направлении оси
камера имеет достаточно протяженный участок с плавно расширяющимся
сечением, а затем резко сужающийся участок до диаметра канала вывода жидкости.
В процессе разделения при постоянной скорости вращения и скорости прокачки
жидкости клетки останавливаются (скапливаются) в определенном сечении камеры
в зависимости от их размера, удельного веса, а также от скорости вращения и
скорости потока жидкости. Пока центробежные силы и силы Стокса остаются
постоянным клетки находятся в определенных сечениях камеры. Если скорость
прокачки жидкости возрастает или скорость вращения уменьшается, клетки
выводятся из камеры. Обычно, возрастание скорости прокачки обеспечивает более
качественное разделение, чем изменение скорости вращения поскольку быстрое
уменьшение скорости вращения затруднительно осуществить из-за инерционности
ротора.
20
Клетки останавливаются в сепарационной камере, если (ρp – ρm) ω2 a V = k1
η a d; или (ρp – ρm) ω2 a k2 d2 = k1 η v. Клетки покидают сепарационную камеру,
если (ρp – ρm) ω2 a V < k1 η a d; или (ρp – ρm) ω2 a k2 d2 < k1 η v. Клетки не входят в
сепарационную камеру, если (ρp – ρm) ω2 a V > k1 η a d; или (ρp – ρm) ω2 a k2 d2 > k1
η v. Здесь ρp – плотность клетки, ρm – плотность жидкости, ω - скорость вращения
центрифуги, a – расстояние от центра вращения до радиального положения клетки
в сепарационной камере, V – объем клетки, k1 и k2 – коэффициенты, учитывающие
форму клетки, d – диаметр клетки, η - вязкость жидкости, v – скорость противотока
жидкости.
Устройство спроектировано под параметры, характерные для биологических
клеток животных и человека. Выбор параметров разделительной камеры (профиль
и размеры), скорости вращения, размеров ротора и скорости потока определен для
клеток объемом в диапазоне 50 - 4000 фемтолитров с возможностью разделения в
одной процедуре 10 – 100 млн. клеток при скорости вращения до 3000 об/мин. и
объеме жидкости 70 миллилитров.
Сепаратор может быть использован для выделения лимфоцитов из
моноцитов и фагоцитов и является более предпочтительным, т.к. в используемом
методе разделения не используются матрицы и антитела и, следовательно,
исключается нежелательная активизация клеток.
Далее, возможно разделение клеток одной популяции, находящихся на
разных этапах цикла клетки. Разделение клеток из здоровой ткани или
злокачественной опухоли методом центрифугирования в противотоке более
предпочтительно для получения однородной клеточной популяции ткани для
биологических, токсикологических и фармакологических исследований.
Возможно обогащение подходящих стволовых клеток для целей
трансплантации.
Метод центрифугирования в противотоке жидкости можно также
использовать для разделения простейших от бактерий. Кроме того метод может
быть приложен к фракционированию частиц в океанской воде в исследовательских
целях. Различные неорганические частицы с объемами в диапазоне 50 – 4000
фемтолитров также могут быть фракционированы с использованием предлагаемого
сепаратора.
Дальнейшие работы по совершенствованию макетного образца клеточного
сепаратора направлены на оптимизацию процесса разделения, автоматизацию
процесса и повышение точности и качества разделения, в частности, в таких
задачах как выделение клеток, в которых был осуществлен процесс трансфекции
при электропорации и ударно-волновой сонопорации.
COUNTERCURRENT CENTRIFUGAL CELLS ELUTRIATOR
Yu.V. Andriyanov, J. Bauer, M.V. Golovanov, A.A. Moscovcev
GSC RF TRINITI, andryu@gcnet.ru, SIHATHO GmbH, D-35201 Biedenkopf, Germany,
Oncology Center RAMS, SII General pathology and pathophysiology RAMS
The table top cells elutriator is described. The developed table top elutriator may be run at speeds up to
3000 rpm and is capable to separate particles according to size, if they have a specific weight <1.3 kg/L and
volumes between 50 and 4000 fL. The applications of table top elutriator are consided.
21