Экспериментальная модель лекарственно

№ 1 - 2014 г.
14.00.00 медицинские науки
УДК 616-006-092:615.28
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ
ЛЕКАРСТВЕННО-УСТОЙЧИВОЙ
ОПУХОЛИ RLS ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ
МНОГОКРАТНЫХ КУРСОВ
ХИМИОТЕРАПИИ
Е. И. Воронина1, А. В. Сенькова2, Т. А. Агеева1, М. А. Зенкова2
1
ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава
России (г. Новосибирск)
2
ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» СО РАН
(г. Новосибирск)
Авторами разработана модель опухолевого процесса с использованием перевиваемой
лимфомы мышей RLS, характеризующейся устойчивостью к противоопухолевым
средствам и соответствующей статусу опухоли, наблюдаемой у пациентов
с гемобластозами. Разработанные режимы перевивки опухоли и введения комплекса
противоопухолевых препаратов, соответствующих программе СНОР-лечения
гемобластозов, позволяют провести четыре курса полихимиотерапии
на животных-опухоленосителях и решить задачи оценки влияния повторяющихся курсов
введения противоопухолевых средств как на организм опухоленосителя, так
и на опухолевую ткань.
Ключевые слова: опухолевая модель, лимфосаркома с фенотипом МЛУ,
полихимиотерапия, выживаемость.
Воронина Евгения Игоревна — аспирант кафедры патологической анатомии ГБОУ
ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», контактный телефон:
8 (383) 225-07-37, e-mail: e.voronina83@mail.ru
Сенькова Александра Васильевна — кандидат медицинских наук, научный сотрудник
лаборатории нуклеиновых кислотФГБУН «Институт химической биологии
и фундаментальной медицины», г. Новосибирск, e-mail: alsenko@mail.ru
Агеева Татьяна Августовна — доктор медицинских наук, профессор кафедры
патологической анатомии, ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский
университет», рабочий телефон: 8 (383) 225-07-37, e-mail: ageta@mail.ru
Зенкова Марина Аркадьевна — доктор биологических наук, профессор, заведующий
лабораторией нуклеиновых кислот, ФГБУН «Институт химической биологии
и фундаментальной медицины», г. Новосибирск, e-mail: marzen@niboch.nsc.ru
Введение. Экспериментальная онкология включает в себя проведение доклинических
исследований на животных. В ее арсенале существует большое количество опухолевых
моделей, однако лишь немногие опухоли животных могут служить моделями опухолей
человека. Тем не менее, экспериментальные опухоли дают возможность изучать
основные механизмы канцерогенеза и прогрессии опухолей как общебиологического
процесса, а также разрабатывать методы прогнозирования, профилактики и лечения
онкозаболеваний.
Методами экспериментального моделирования опухоли могут являться ее индукция или
трансплантация (перевивание). Известно, что рост агрессивной опухоли в организме
животного сопровождается значительным токсическим повреждением органов, коротким
периодом жизни животных, что ограничивает возможные аспекты изучения проблем
онкопроцесса [1–3]. Одним из сложных направлений в экспериментальной онкологии
является изучение влияния цитостатиков на организм опухоленосителя и опухоль in vivo
по причине высокой токсичности противоопухолевых средств. В литературе описаны
экспериментальные опухолевые модели с проведением либо однократных курсов
полихимиотерапии, либо с введением цитостатиков в режиме монотерапии, чаще
на безопухолевых животных [4–6], в то время как в клинике используются многократные
схемы введения комплекса цитостатиков, и соответственно имеется необходимость
моделирования в эксперименте ситуации, максимально приближенной к клинике.
В литературе имеются единичные работы, представляющие экспериментальные модели
с двух- и трехкратным введением комплекса цитостатиков животным-опухоленосителям
[3, 5, 7], потребовавшие от авторов тщательной отработки режимов и доз перевиваемой
опухоли и доз цитостатиков ввиду низкой выживаемости животных в этих условиях.
В настоящей работе нами была предпринята попытка отработать экспериментальную
модель опухоли, которая позволяла бы провести большее число курсов введения
комплекса цитостатиков животным-опухоленосителям. В качестве опухолевой модели
была выбрана лимфосаркома мышей (RLS), проявляющая лекарственную устойчивость,
соответствующую статусу опухоли, наблюдаемой у пациентов с гемобластозами.
Цель: разработать экспериментальную модель опухоли с возможностью проведения
многократных курсов введения комплекса цитостатиков для оценки влияния
противоопухолевых средств на организм опухоленосителя и опухолевую ткань.
Методика исследования. Эксперимент проводили на 3—4-месячных мышах-самцах линии
CBA развода вивария Института цитологии и генетики СО РАН. Животных содержали
в виварии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН
группами по 5 особей в пластиковых боксах при естественном режиме освещения
и свободном доступе к воде и пище. Все экспериментальные исследования были
выполнены в соответствии с методическими рекомендациями «Деонтология
медико-биологического эксперимента» (1987) и с соблюдением правил гуманного
обращения с животными (Report of the AVMA Panel on Euthanasia JAVMA, 2001).
В качестве опухолевой модели использовали перевиваемую лимфосаркому мыши RLS
с фенотипом множественной лекарственной устойчивости [5, 6]. Эксперимент выполняли
в 2 этапа. На 1-м этапе животным имплантировали различное количество опухолевых
клеток, полученных из асцита. Для получения асцита опухолевые клетки RLS
в концентрации 5 × 104 клеток/мл в 0,3 мл физиологического раствора были пересажены
внутрибрюшинно мышам линии CBA. На 10-й день развития опухоли животным
внутрибрюшинно вводили физиологический раствор (0,5 мл); асцит собирали с помощью
шприца (0,5–0,8 мл). Полученную асцитную жидкость разбавляли до 5 мл фосфатным
солевым буфером (PBS-буфером) и центрифугировали через 3 мл LSM (Lymphocyte
Separation Medium) при 1500 об/мин в течение 15 мин. Фракцию мононуклеарных клеток,
находящуюся на границе раздела LSM и супернатанта, переносили в чистую пробирку,
содержащую 5–7 мл PBS-буфера, суспендировали, центрифугировали при 1000 об/мин
в течение 5 мин. Получившийся осадок клеток ресуспендировали в PBS, подсчитывали
концентрацию клеток с помощью камеры Горяева, разбавляли PBS до нужной
концентрации и имплантировали экспериментальным животным.br /> Животные были
поделены на 4 группы по 5 мышей в каждой. Мышам 1-й группы перевили суспензию
клеток опухоли RLS в физиологическом растворе объемом 0,1 мл в дозе 100 тыс.
клеток/особь; животным 2-й группы — 80 тыс. клеток/особь, 3-й группы — 50 тыс.
клеток/особь, 4-й группы — 30 тыс. клеток/особь. Во всех группах опухоль
трансплантировали внутримышечно в правое бедро для формирования солидной опухоли.
Для оценки динамики роста опухолевого узла через день измеряли размеры пораженной
лапки штангенциркулем. Объем опухоли рассчитывали по формуле V = (p/6 × длина ×
ширина × высота) путем перемножения трех взаимно перпендикулярных размеров
опухоли. В этом же эксперименте оценивали продолжительность жизни
животных-опухоленосителей в зависимости от количества перевитых опухолевых
клеток.>
На 2-м этапе эксперимента животным внутримышечно в правое бедро трансплантировали
суспензию клеток опухоли RLS в физиологическом растворе (2 × 104 клеток/особь)
в объеме 0,1 мл для формирования солидной опухоли. Животные были разделены
на 2 группы: 1-й группе животных (80 особей) вводили комбинацию цитостатиков,
аналогичную схеме CHOP для лечения гемобластозов [9–10], животным 2-й группы
(20 особей) лекарственные препараты не вводили (контроль). Препараты вводили
в дозировках, соответствующих 1/5 ЛД50: циклофосфан — 50 мг/кг массы тела,
доксорубицин — 4мг/кг и винкристин — 0,1 мг/кг однократно в хвостовую вену,
преднизолон — 5 мг/кг — внутрибрюшинно.
На 7-е сутки после проведения 1-го курса полихимиотерапии (ПХТ) (что соответствует
14-м суткам роста опухоли) проводили 2-й курс химиотерапии. Затем животным по той же
схеме с интервалом в 7 суток проводили последовательно 3-й и 4-й курсы ПХТ.
Во второй группе наблюдали развитие и прогрессирование опухолевого процесса без
лечения, таким образом, используя эту группу в качестве контроля эффективности ПХТ.
В ходе эксперимента оценивали продолжительность жизни животных-опухоленосителей
в зависимости от количества проведенных курсов ПХТ, а также размеры опухолевого узла.
Результаты исследования. В данном эксперименте в качестве перевиваемой опухоли
использовали лимфосаркому мыши RLS, изначально устойчивую к циклофосфану,
которая была получена из лимфосаркомы LS путем многократных перевивок рецидивов
этой опухоли, возникающих после воздействия низких доз циклофосфана при
их постепенном повышении (10–200 мг/кг) [5, 6, 8]. В клинике опухоль RLS может
соответствовать опухоли пациентов, которая формируется после нескольких проведенных
курсов ПХТ. Опухоль LS в свою очередь ранее была получена у мышей линии СВА путем
однократной инъекции нитрозометилмочевины и проявляла высокую чувствительность
к действию циклофосфана, который является основным компонентом многих схем ПХТ
[8–10].
Эксперимент выполняли в 2 этапа. На 1-м этапе изучали продолжительность жизни
животных с перевитой опухолью RLS без воздействия ПХТ, причем разным группам
животных имплантировали различное количество опухолевых клеток — 100, 80,
50 и 30 тыс. клеток. Задачей 2-го этапа эксперимента явилось проведение повторяющихся
курсов ПХТ на обоснованно подобранной дозе опухолевых клеток с учетом ранее
установленной продолжительности жизни животных-опухоленосителей.
При проведении 1-го этапа эксперимента в месте трансплантации клеток опухоли RLS
в мышцы бедра было отмечено формирование солидного опухолевого узла на 7-е сутки
после трансплантации опухолевых клеток у животных из 1-й группы и на 9-е сутки
в остальных экспериментальных группах (рис. 1).
Рис. 1. Динамика роста опухолевого узла после имплантации 30, 50, 80 и 100 тыс. клеток
на особь
У животных с опухолью, перевитой в количестве 100 тыс. клеток, средняя
продолжительность жизни составила 25,5 суток, в количестве 80 тыс. клеток — 26,8 суток,
в группе с опухолью, перевитой в количестве 50 тыс. клеток, — 28,8 суток, а в количестве
30 тыс. клеток — 32,4 суток. Гибель животных из 1-й группы с опухолью, перевитой
в количестве 100 тыс. клеток, начиналась с 23-х суток роста опухоли. Максимальная
продолжительность жизни животных в данной группе составила 28 суток, а опухолевый
узел достигал максимальных размеров 2,4 см3. Во 2-й группе (перевито 80 тыс. клеток)
гибель животных отмечали также с 23-х суток после перевивки опухоли, максимальная
продолжительность жизни достигала 31-х суток, а опухолевый узел достигал
максимальных размеров 3 см3. При трансплантации опухолевых клеток в количестве
50 тыс. клеток гибель мышей начиналась несколько позже — с 24-х суток,
а максимальная продолжительность жизни увеличилась до 34-х суток, размеры
опухолевого узла достигли 2,9 см3. В группе мышей с перевитыми 30 тыс. клеток опухоли
RLS гибель животных начиналась еще позже — с 31-х суток, максимальная
продолжительность жизни составила 34 дня, а опухолевый узел достигал максимальных
средних размеров 2,1 см3.
Таким образом, опухоль RLS, перевитая в количестве 30 тыс. клеток/мл, растет
достаточно медленно, что позволяет провести несколько курсов ПХТ
на мышах-опухоленосителях и максимально приблизиться к клинической картине
у пациентов с гемобластозами.
При проведении 2-го этапа эксперимента у всех животных на 7-е сутки после
трансплантации опухолевых клеток формировался солидный опухолевый узел,
достигавший объема около 0,16 см3, далее размеры узла поступательно увеличивались
(рис. 2). У животных с перевитой опухолью в группе контроля (опухоль без воздействия
ПХТ) начало гибели животных отмечали на 18-е сутки после трансплантации опухолевых
клеток, и их средняя продолжительность жизни составила 26,6 суток. В группе
животных-опухоленосителей с проведением 4-х последовательных курсов ПХТ
с интервалом в 7 дней гибель животных начиналась к 25-м суткам после трансплантации
опухоли, и их средняя продолжительность жизни составила 29 суток. Таким образом,
предварительная оценка клеточной нагрузки при трансплантации опухолевых клеток
позволила провести 4 последовательных курса введения комплекса цитостатиков
с интервалом в 7 дней и максимально приблизиться к клинической картине у больных
с гемобластозами.
Рис. 2. Динамика роста опухоли RLS у животных контрольной группы (без лечения)
и у животных, получавших 4 курса ПХТ по схеме СНОР. Опухоль была сформирована
путем перевивки 20 тыс. опухолевых клеток в правую бедренную мышцу животного
Таким образом, разработанная схема эксперимента также может быть использована при
проведении исследований и на других опухолевых моделях, позволяет варьировать
количество перевиваемых опухолевых клеток и производить подбор оптимальных условий
для проведения необходимого количества курсов химиотерапии.
Список литературы
1. Попова Н. А. Модели экспериментальной онкологии / Н. А. Попова // Соросовский
общеобразовательный журн. — 2000. — № 8. — С. 33–38.
2. Tillmann T. Incidence and spectrum of spontaneous neoplasms in male and female CBA / Т.
Tillmann, K. Kamino, U. Mohr // J. mice. Exp. Toxicol. Pathol. — 2000. — Vol. 52. — Р.
221–225.
3. Экспериментальная модель опухоли головы и шеи для потенциальной таргетной
терапии / И. В. Решетов, Н. А. Дайхс [и др.] // Сиб. онкол. журн. — 2009. — № 5 (35).
4. Гольдберг В. Е. Современные достижения лекарственной терапии злокачественных
5.
6.
7.
8.
9.
10.
новообразований / В. Е. Гольдберг, М. Г. Матяш // Бюл. СО РАМН. — 2004. — № 2
(112). — С. 38–42.
Каледин В. И. Изучение эффективности моно- и полихимиотерапии на модели
перевиваемой мышиной лимфосаркомы, нечувствительной к индукции апоптоза / В. И.
Каледин, H. A. Попова, Е. М. Андреева // Вопр. онкологии. — 2006. — Т. 52, № 1. — С.
70–73.
Циклофосфамид — индуцированный апоптоз клеток мышиной лимфосаркомы
в условиях in vivo / В. И. Каледин, В. П. Николин, Т. А. Агеева [и др.] // Вопр.
онкологии. — 2000. — Т. 46, № 5. — С. 588–593.
Animal model of drug-resistant tumor progression / N. Mironova, O. Shklyaeva, E.
Andreeva [et al.] // Ann. N.Y. Acad. Sci. — 2006. — Vol. 1091. — Р. 490–500.
Участие генов mdr1a, mdr1b, p53 и bcl-2 в формировании устойчивости клеток
лимфосаркомы RLS мышей к терапевтическому действию циклофосфана / Е. М.
Андреева, Н. Л. Миронова, О. А. Шкляева [и др.] // Вестн. НГУ. Серия : Биология, клин.
медицина. — 2006. — Т. 4, вып. 1. — С. 21–26.
Введение в химиотерапию злокачественных опухолей / М. Л. Гершанович, В. А. Филов,
М. А. Акимов [и др.]. — СПб., 1999. — 152 с.
CHOP-like chemotherapy plus rituximab versus CHOP-like chemotherapy alone in young
patients with good prognosis diffuse large-B-cell lymphoma : a randomised controlled trial
by the MabThera International Trial (MinT) Group / М. Pfreundschuh, L. Trumper, А.
Оsterborg [et al.] // Lancet Oncol., 2006. — Vol. 7. — Р. 379–391.
EXPERIMENTAL MODEL
OF DRUG-RESISTANT RLS TUMOUR FOR
PERFORMING REPEATED COURSES
OF CHEMOTHERAPY
Е. I. Voronina1, А. V. Senkova2, Т. А. Ageeva1, М. А. Zenkova2
SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University» of Ministry of Health (Novosibirsk c.)
FSBSE «Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine» SB RAS (Novosibirsk c.)
1
2
Authors developed model of tumoral process with usage of intertwined lymphoma of RLS mice
ofbeing characterized with resistance to antineoplastic means and corresponding the tumor
status that was observed at patients with hemoblastosis. The developed modes
of transplantation of tumor and introduction of a complex of antineoplastic preparations
corresponding to the program of SNOR-treatment of hemoblastosis, allow to conduct four
courses of polychemotherapy of animals-tumor carriers and to solve problems on assessment
of influence concerning repeating courses of antineoplastic drugs introduction both for
an organism of tumor carriers, and for tumoral fabric.
Keywords: tumoral model, lymphosarcoma with MDR phenotype, polychemotherapy, survival.
About authors:
Voronina Evgenia Igorevna — post-graduate student of pathological anatomy chair at SBEI
HPE «Novosibirsk State Medical University» of Ministry of Health, contact phone: 8 (383)
225-07-37, e-mail: e.voronina83@mail.ru
Senkova Aleksandra Vasilyevna — candidate of medical sciences, research associate
of nucleinic acids laboratory at FSBSE «Institute of Chemical Biology and Fundamental
Medicine» SB RAS, e-mail: alsenko@mail.ru
Ageeva Tatyana Avgustovna — doctor of medical sciences, professor of pathological anatomy
chair at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University» of Ministry of Health, office phone:
8 (383)-225-07-37, e-mail: ageta@mail.ru
Zenkova Marina Arkadyevna — doctor of biological sciences, professor, head of nucleinic
acids laboratory at FSBSE «Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine» SB RAS,
e-mail: marzen@niboch.nsc.ru
List of the Literature:
1. Popova N. A. Models of experimental oncology / N A. Popova // Sorosovsky general
education journal. — 2000. — № 8. — P. 33-38.
2. Tillmann T. Incidence and spectrum of spontaneous neoplasms in male and female CBA / Т.
Tillmann, K. Kamino, U. Mohr // J. mice. Exp. Toxicol. Pathol. — 2000. — Vol. 52. — Р.
221–225.
3. Experimental model of tumor of the head and neck for potential target therapy / I. V.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Reshetov, N. A. Daykhs [etc.] // Sib. oncol. журн. — 2009. — № 5 (35).
Goldberg V. E. Modern achievements of medicinal therapy of malignant tumors / V. E.
Goldberg, M. G. Matyash // Bulletin of the RAMS. — 2004. — № 2 (112). — P. 38-42.
Kaledin V. I. Studying of efficiency mono- and polychemotherapy on model intertwined
mouse lymphosarcoma, tolerant to apoptosis induction / V. I. Kaledin, H. A. Popova, E. M.
Andreyeva // Questions of oncology. — 2006. — V. 52, № 1. — P. 70-73.
Cyclophosphamide as induced apoptosis of mouse cells of lymphosarcoma in the conditions
in vivo / V. I. Kaledin, V. P. Nikolin, T. A. Ageeva [etc.] // Questions of oncology. — 2000.
— V. 46, № 5. — P. 588-593.
Animal model of drug-resistant tumor progression / N. Mironova, O. Shklyaeva, E.
Andreeva [et al.] // Ann. N.Y. Acad. Sci. — 2006. — Vol. 1091. — Р. 490–500.
Participation of mdr1a, mdr1b, p53 and bcl-2 genes in formation of stability of cages RLS
lymphosarcoma at mice to therapeutic action of cyclophosphan / E. M. Andreeva,
N. L. Mironova, O. A. Shklyaeva [etc.] // Bulletin of NSU. Series: Biology, clin. medicine.
— 2006. — V. 4, iss. 1. — P 21-26.
Introduction in chemotherapy of malignant tumors / M. L. Gershanovich, V. A. Filov, M. A.
Akimov [etc.]. — SPb. 1999. — 152 P.
CHOP-like chemotherapy plus rituximab versus CHOP-like chemotherapy alone in young
patients with good prognosis diffuse large-B-cell lymphoma : a randomised controlled trial
by the MabThera International Trial (MinT) Group / М. Pfreundschuh, L. Trumper, А.
Оsterborg [et al.] // Lancet Oncol., 2006. — Vol. 7. — Р. 379–391.