Генерирование дендритных клеток in vitro из моноцитов и
advertisement
Îðèãèíàëüíûå èññëåäîâàíèÿ ÃÅÍÅÐÈÐÎÂÀÍÈÅ ÄÅÍÄÐÈÒÍÛÕ ÊËÅÒÎÊ IN VITRO ÈÇ ÌÎÍÎÖÈÒÎÂ È CD34+ ÃÅÌÎÏÎÝÒÈ×ÅÑÊÈÕ ÏÐÅÄØÅÑÒÂÅÍÍÈÊΠÏÐÎÄÓÊÒÀ ËÅÉÊÀÔÅÐÅÇÀ ÏÀÖÈÅÍÒΠÑÎ ÇËÎÊÀ×ÅÑÒÂÅÍÍÛÌÈ ÍÎÂÎÎÁÐÀÇÎÂÀÍÈßÌÈ ß.È. Èñàéêèíà1, Î.Â. Êëèìåíêîâà1, È.À. Ñåìàê2, Â.Ï. Ñàâèöêèé1 ÃÓ ÐÍÏÖ ÄÎÃ, ã. Ìèíñê ÐÍÏÖ ÎÌÐ èì. Í.Í. Àëåêñàíäðîâà, ã. Ìèíñê 1 2 Ключевые слова: дендритные клетки, моноциты, CD34+ клетки, иммунофенотип, опухоль. Целью исследования было сравнение таких клеточных популяций продукта афереза, как моноциты и CD34+ клетки, в качестве предшественников для получения дендритных клеток (ДК), являющихся основой для создания противоопухолевой вакцины. Анализ полученных результатов показал, что морфологически как незрелые, так и зрелые ДК, генерированные из обоих источников, не отличались. Тем не менее, степень экспрессии иммунофенотипических маркеров, характерных для незрелых ДК: CD86 и HLA-DR и зрелых ДК: CD209, CD83, CD80, CD11c и CD1a, достоверно выше при их генерировании из моноцитов. Так, при дифференцировке из моноцитов мы не только получили культуру ДК высокой чистоты (до 85,5(55,0–99,0) % зрелых ДК по сравнению с 5,2 (4,3–6,1) % из CD34+ клеток) (р < 0,05), но и абсолютное число ДК на выходе было в 30 раз выше. Таким образом, наша работа позволяет сделать заключение, что для генерирования ДК in vitro предпочтительнее применять моноциты, выделенные из продукта лейкафереза пациента, в связи с высокой чистотой получаемой культуры ДК. EX VIVO GENERATION OF DENDRITIC CELLS FROM MONOCYTES AND CD34+PRECURSORS FROM LEUKAPHERESIS PRODUCT OF CANCER PATIENTS Y.I. Isaikina, O.V. Klimenkova, I.A. Semak, V.P. Savitski Key words: dendritic cells, monocytes, CD34+cells, immune-phenotype, cancer. This research was done to evaluate different cells sources from leukapheresis product of patients with cancer for dendritic cells (DCs) generation. For this purpose we evaluated the number and phenotype of immature and mature DCs generated from monocytes and CD34+precursors were selected from ten leukapheresis products. Our study demonstrated that not morphological differences between DCs were produced both methods. But method of DCs generation from monocytes was more effective and allowed to get 30 times more of DCs then from CD34+ cells. Analysis of immature DCs markers expression: CD86, HLA-DR and mature DCs markers expression: CD209, CD11c, CD80 and CD83, evidenced that method of DCs generation from CD34-precusors gives a lower number both the immature and the mature of DCs (p < 0.05). The percentage of CD83+CD209+cells that were generated from monocytes was 85.5(55.0–99.0) % and only 5.2 (4.3–6.1) % from CD34+precursors. So, the method of DCs generation from monocytes is more preferable for getting highest number of mature DCs, which are characterized by high expression of co-stimulating molecules of lymphocyte activation for creating the antitumor vaccine for cancer patient treatment. Н ÂÂÅÄÅÍÈÅ есмотря на определенные успехи современной онкологии, крайне трудной задачей является лечение химиорезистентных, далеко зашедших злокачественных опухолей. Основная проблема в лечении онкологических заболеваний состоит в том, что прогрессирующая злокачественная опухоль представляет собой высоко изменчивое образование, способное адаптироваться ко многим ограничивающим ее рост воздействиям. Поэтому комбинированное использование различных подходов, включающее применение иммунотерапии после радикально проведенных 40 хирургических операций, может дать значительный эффект при лечения злокачественных новообразований. Известно, что для развития полноценного иммунного ответа, в том числе противоопухолевого, требуется наличие антигенпрезентирующих клеток (АПК). Наиболее важными АПК иммунной системы являются дендритные клетки (ДК), которые преимущественно локализованы в коже, слизистых оболочках, а также в других местах, где ожидается появление чужеродных для организма агентов. В последние годы была разработана технология, позволяющая получить ДК в культуре из клеток-предшественников. Важно, что генерирование ДК ex vivo позволяет избежать опу- Îíêîëîãè÷åñêèé æóðíàë, Ò.4, N¹4 (16), 2010; Ò.5, N¹1 (17), 2011 холеопосредованного супрессивного воздействия на дифференцировку и созревание клеток, которое отмечается у ДК циркулирующих в организме пациента [1]. Многочисленные исследования на разных моделях продемонстрировали, что полученные ex vivo ДК после дальнейшей нагрузки опухолевыми антигенами, способны индуцировать специфический противоопухолевый иммунный ответ [2]. Аналогичные результаты были получены при проведении I и II фазы клинических испытаний вакцин на основе ДК у онкологических больных [3, 4]. За последнее десятилетие проведено большое количество клинических испытаний вакцины на основе ДК при различных онкологических заболеваниях. Результаты II стадии клинического испытания ДК-вакцины с участием больных с IV стадией злокачественной глиомы показали наличие корреляции между иммунным и клиническим ответом у пациентов, в том числе наблюдалось увеличение продолжительности жизни у пациентов, отвечающих на вакцину [5]. Использование вакцины на основе ДК актуально и для лечения детских злокачественных новообразований. Так, Geiger J.D. с соавторами в своей работе по исследованию эффекта действия вакцины ДК отмечали наличие регрессии множественных метастазов у 1 пациента и стабилизации заболевания до 30 месяцев у 5 пациентов из группы 10 детей с солидными опухолями, резистентными к стандартной терапии [6]. Создание вакцины на основе ДК является длительным и трудоемким процессом. Так, на первом этапе производят выбор клеток-предшественников ДК, которые могут быть получены из периферической крови (ПК), костного мозга (КМ) или продукта лейкафереза. До сих пор одним из проблемных вопросов остается выбор источника ДК. Для клинического применения используют ДК двух видов: ДК, полученные в результате культивирования CD34+ -клеток-предшественников (CD34+-ДК) и ДК, полученные при культивировании моноцитов (MoДК). Чаще всего для создания вакцины на основе ДК в качестве источника клеток-предшественников используют CD14+-моноциты. Селекция моноцитов может производиться различными способами: выделением на градиенте плотности, магнитной селекцией CD14+-клеток или адгезией к пластику. Наиболее доступным методом является культивирование адгезированной к пластику фракции мононуклеарных клеток периферической крови в среде содержащей колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF) и интерлейкин 4 (ИЛ-4), фактор некроза опухоли (TNF-α) или ИЛ13 [7]. Так как клетки, культивированные из моноцитов in vitro, обладают незрелым фенотипом и способны индуцировать толерантность к опухоле- ассоциированным антигенам, то перед введением вакцины пациенту проводят этап дозревания ДК, для чего используют провоспалительные цитокины ИЛ-1, ИЛ-6, TNF-α, простагландин Е2 (PGE2), а также вещества бактериального происхождения, например, липополисахарид [1]. Результаты проведенных клинических исследований по использованию МоДК у онкологических больных демонстрируют эффективность их использования для создания противоопухолевой вакцины. В ряде работ показана эффективность применения МоДК, нагруженных аутологичным опухолевым лизатом, у больных с различными злокачественными новообразованиями. У большинства больных отмечается иммунный ответ на вакцинацию и 1/3 пациентов наличие клинического ответа [8, 9]. Использование МоДК представляется перспективным также и в области детской онкологии [6]. Дифференцировка ДК из CD34+-клеток является более трудоемким и дорогостоящим процессом. Для его осуществления требуется значительное количество факторов роста: фактор стволовых клеток (SCF), Flt3L, ИЛ-3 и ИЛ-6, которые необходимы для экспансии клеток-предшественников и ИЛ-4, TNF-α и ГМ-КСФ, стимулирующие дифференцировку CD34+ клеток первоначально в моноциты, и лишь затем — в ДК. Кроме того, необходима предварительная мобилизация CD34+- клеток колониестимулирующим фактором гранулоцитов (G-CSF) и последующая селекция их из продукта лейкафереза [10]. Именно с трудоемкостью и затратностью связано малое количество клинических исследований, в которых для создания вакцины используются CD34+-ДК. При этом иммунный ответ наблюдался реже, чем в исследованиях с применением при иммунотерапии МоДК. Так, Titzer S в клиническом испытании вакцины на основе CD34+-ДК с участием 11 пациентов с множественной миеломой отметил наличие специфического иммунного ответа у 40% пациентов, а полный клинический ответ у 10 [11]. Mackensen в своем исследовании показал, что вакцинотерапия больных с меланомой на IV стадии с использованием CD34-ДК способствовала индукции иммунного ответа также только у 40 % пациентов [12]. Существующие данные по сравнению способности ДК, полученных из разных источников, активировать Т лимфоциты и индуцировать антиген-специфическую пролиферацию Т клеток весьма противоречивы. Таким образом, вопрос о том, какой источник клеток-предшественников для получения наиболее эффективной противоопухолевой вакцины на основе ДК остается открытым и требует проведения дальнейших исследований. В своем исследовании мы провели сравнительный анализ эффективности получения ДК из 41 Îðèãèíàëüíûå èññëåäîâàíèÿ фракции моноцитов и фракции стволовых гемопоэтических клеток продукта лейкафереза пациентов со злокачественными новообразованиями. Критерием эффективности в обоих случаях служило количество получаемых в результате дифференцировки незрелых и зрелых ДК. ÌÀÒÅÐÈÀË È ÌÅÒÎÄÛ Выделение фракции мононуклеарных клеток. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из продукта лейкафереза пациентов с различными злокачественными новообразованиями на градиенте плотности Гистопак (плотность 1,077 г/мл) («Sigma-Aldrich», США) при 400g 30 минут и двукратная отмывка выделенных мононуклеарных клеток в растворе Хенкса при режиме центрифугирования — 250g в течение 10 мин. Получение ДК из моноцитов. Для получения ДК из моноцитов использовали метод, описанный L. Burkhard [13]. МНК в количестве 20×106 клеток в 1 мл культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) в СО2 инкубаторе во влажной атмосфере 5 % СО2 при +37 °С в течении 2 часов. По окончании культивирования фракцию неадгезированных к пластику клеток удаляли и к клеткам добавляли полную среду RPMI-1640, содержащую 10 % ЭТС и провоспалительные цитокины — ГМ-КСФ (100 нг/мл) и ИЛ4 (25 нг/мл). Для получения незрелых ДК клетки культивировали 7 суток со сменой ½ объема полной среды и цитокинов на 3 и 5 дни культивирования. Для получения зрелых ДК на 7-ой день культивирования добавляли коктейль провоспалительных цитокинов, стимулирующих созревание ДК: TNF-α (20 нг/мл), ИЛ-1β (10 нг/мл), PGE2 (1 мкг/мл) и ИЛ-6 (3 нг/мл). Культивировали 2 дня. Рост клеток контролировали с помощью инвертированного микроскопа. При завершении культивирования клеток проводили подсчет их количества и жизнеспособности. Получение ДК из CD34+ гемопоэтических клеток. СD34+-клетки выделяли из МНК методом иммуномагнитной селекции с использованием набора EasySep (Stemcell Technologies, Канада), согласно прилагаемой инструкции. Дифференцировку CD34+ 34+ клеток в ДК проводили методом, описанным Banchereau J et al [1]. CD34+ 34+ клетки культивировали в количестве 2×106 в 5 мл среды RPMI-1640, содержащей 10 % ЭТС, 2 мМ L-глутамина и 100 U/ml пенициллина-стрептомицина с добавлением SCF (50 нг/мл) и Flt-3L (50 нг/мл) для стимуляции клеточного деления. Клетки культивировали 7 дней во влажной атмосфере 5 % СО2 при +37 °С. Для последующей дифференцировки CD34+ 34+ клеток в незрелые ДК клетки культивировали в течение 7 дней в среде, содержащей ГМ-КСФ (50 нг/мл) и TNF-α (10 нг/мл). Для осуществления процесса созревания не- 42 зрелых ДК проводили смену культуральной среды с добавлением LPS (100 ng/ml). По окончании каждого этапа культивирования осуществляли подсчет клеток и оценку их жизнеспособности с красителем трипановым синим. Оценка жизнеспособности клеток. Жизнеспособность клеток определяли добавлением к 20 мкл клеточной суспензии 20 мкл трипанового синего, инкубацией клеток с красителем в течение 5 минут и последующим подсчетом количества живых клеток (не окрашенных) и мертвых (окрашенных) в гемоцитометре под световым микроскопом. Общее количество подсчитанных клеток составляло не менее 100. Иммунофенотипический анализ. Для иммунофенотипического анализа клетки после культивирования двукратно отмывали в фосфатно-солевом буфере, осаждая клетки центрифугированием в течение 5 минут при 300g. Затем 1×105 клеток инкубировали со специфическими моноклональными антителами (20 мкл/1 образец) к CD14, HLA DR, CD80, CD86, CD11c, CD1a, CD83, CD209 и изотипическим контролем («Becton Dickinson», США; «Beckman Coulter», США) в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин. После инкубации с антителами клетки дважды отмывали в фосфатном буфере, центрифугируя 5 минут при 300g. Исследования выполняли на проточном лазерном цитофлуориметре FС 500 («Beckman Coulter», США). Проводили регистрацию прямого светорассеяния (под углами 1–10°), бокового светорассеяния (под углами 90°). Для каждого образца анализировали не менее 104 клеток. Обработка полученных результатов проводилась с использованием статистического пакета цитофлуориметра CXP CXP. ÐÅÇÓËÜÒÀÒÛ Морфологическая характеристика популяции ДК. На этапе приготовления противоопухолевой вакцины на основе ДК важно использование их в 2-х стадиях существования этих клеток, как в стадии незрелых, так и в стадии зрелых, так как созревание дендритных клеток является важнейшим моментом для индукции иммунного ответа. Исследования функциональных способностей ДК на разных стадиях созревания показали, что только незрелые ДК, благодаря морфологическим особенностям мембраны и наличию внутри эндосомальных вакуолей, имеют возможность захватывать антиген. Это свидетельствует о чрезвычайной важности получения достаточной популяции жизнеспособных, функционально активных незрелых ДК, с высоким адсорбирующим потенциалом для утилизации опухолевых антигенов. Мы исследовали морфологию ДК на различных стадиях зрелости при направленном культи- Îíêîëîãè÷åñêèé æóðíàë, Ò.4, N¹4 (16), 2010; Ò.5, N¹1 (17), 2011 вировании моноцитов и CD34+-клеток. Изменение морфологии клеток при их дифференцировке представлено на рис. 1. ДК представляли собой крупные клетки размером от 10 до 20 мкм неправильной формы, с неправильной формы ядром, смещенным к периферии с трубчатыми выростами или длинными тонкими тяжами цитоплазмы. По нашим наблюдениям практически все клетки, получаемые из фракции моноцитов, на 2–3 сутки полностью меняют свою морфологию, становясь амебовидными и оставаясь прикрепленными к пластику флакона. После 3 суток культивирования значительная часть этих клеток отделяются от поверхности флакона в суспензию, где они имеют вид круглых крупных клеток с тонкими цитоплазматическими отростками. Таким образом, практически все моноциты под действием провоспалительных цитокинов уже на 7-е сутки дифференцируются в незрелые ДК с характерной морфологией (рис. 1, б). При культивировании CD34+ до 7 суток включительно наблюдается пролиферация стволовых гемопоэтических клеток, что обеспечивает значительный прирост клеток, и только к 14 суткам ряд клеток дифференцируется в незрелые ДК, приобретая характерную морфологию (рис. 1, д). Зрелые МоДК и CD34+-ДК морфологически не различимы. В тоже время, популяция клеток, по- лученных из CD34+ предшественников после проведения экспансии и дифференцировки в ДК является морфологически значительно более гетерогенной, чем популяция клеток, полученная при дифференцировке в ДК моноцитов. Анализ жизнеспособности показал, что после культивирования популяция зрелых ДК, полученных из моноцитов, содержит >94 % живых клеток, а ДК, полученных из CD34+клеток >93 % живых клеток. Иммунофенотипический анализ популяции ДК Для сравнения количественного выхода неДК. зрелых ДК, дифференцированных из моноцитов и CD34+-клеток было проведено исследование степени экспрессии CD14-FITC, CD86-PE, HLA-DRPC5 клетками при культивировании в дифференцировочной среде обоих видов предшественников. Таким образом, проанализировано 10 образцов при генерации незрелых МоДК из моноцитов и 8 образцов незрелых CD34+-ДК. Полученные данные представлены в табл. 1. Как показали результаты нашего исследования, незрелых ДК, экспрессирующих на своей поверхности антигены CD86 и HLA DR значительно больше, когда предшественниками являются моноциты, чем CD34+-клетки. Наблюдалось значительное содержание клеток, экспрессирующих CD14 антиген в культуре при дифференцировке ДК из CD34+-клеток (до 43 % (41–45)). Ðèñóíîê 1 – Ìîðôîëîãèÿ ÄÊ â çàâèñèìîñòè îò ñòàäèè äèôôåðåíöèðîâêè êëåòîê â êóëüòóðå. Ôîòî à, á, â — äèíàìèêà ñîçðåâàíèÿ ÄÊ, ïîëó÷åííûõ èç ìîíîöèòîâ, ãäå à — ìîíîöèòû, á — íåçðåëûå ÌîÄÊ, â — çðåëûå ÌîÄÊ. Ôîòî ã, ä, å — äèíàìèêà ñîçðåâàíèÿ ÄÊ, ïîëó÷åííûõ èç CD34+ êëåòîê, ãäå ã — CD34+-êëåòêè, ä — íåçðåëûå CD34+-ÄÊ, å — çðåëûå CD34+-ÄÊ. Ñòðåëêàìè óêàçàíû íåçðåëûå è çðåëûå ÄÊ, ïîëó÷åííûå èç îáîèõ èñòî÷íèêîâ. Óâåëè÷åíèå ×600 43 Îðèãèíàëüíûå èññëåäîâàíèÿ Для сравнения эффективности генерации зрелых ДК из моноцитов и CD34+-клеток идентификацию ДК проводили по результатам анализа степени экспрессии СD209 антигена, характерного для ДК и макрофагов [14]. Популяцию миелоидных ДК оценивали по наличию антигена CD11c. Степень зрелости ДК определяли по экспрессии антигена CD1a, который относится к семейству протеинов CD1, структурно подобных протеинам MHC класса I и экспрессия которого присуща ДК в промежуточной фазе зрелости при генерировании клеток in vitro, антигена CD83, характерного для терминальной степени созревания ДК, а также по изменению уровня экспрессии клетками антигена CD80. Полученные данные представлены в табл. 2. Анализ результатов показал, что относительное содержание клеток промежуточной степени зрелости, экспрессирующих CD1а антиген и зрелых ДК в терминальной стадии дифференцировки, экспрессирующих на своей поверхности антиген CD83, значительно больше, когда предшественниками являются моноциты, чем CD34+-клетки (р ( < 0,05). Относительное число миелоидных ДК также достоверно выше при генерировании ДК из моноцитов, о чем свидетельствует процентное содержание клеток, экспрессирующих CD11с антиген (р ( < 0,05). Как и при анализе популяции незрелых ДК наблюдается высокое содержание в культуре клеток, экспрессирующих CD14 антиген при дифференцировке ДК из CD34+-клеток. Это свидетельствует о том, что значительная часть ГСК при культивировании в условиях, обеспечивающих пролиферацию стволовых клеток, первоначально направленно дифференцируется в моноциты (до 66,5 ± 1,5 %), и лишь потом в ДК, в то время как остаточное количество клеток, несущих CD14 антиген при дифференцировке ДК из моноцитов периферической крови составляет всего 8,34 ± 6,84 % ((р < 0,05). Нами была так же исследована динамика изменения уровня экспрессии основных маркеров зрелых МоДК, генерируемых in vitro, для оценки степени зрелости ДК до и после добавления в среду провоспалительных цитокинов индуцирующих созревание ДК. Результаты отображены в табл. 3. Òàáëèöà 1 Ýêñïðåññèÿ èììóíîôåíîòèïè÷åñêèõ ìàðêåðîâ â êóëüòóðå íåçðåëûõ ÄÊ, ïîëó÷åííûõ èç ðàçëè÷íûõ êëåòîê ïðåäøåñòâåííèêîâ Иммунофенотипические маркеры МоДК, (%) (n = 10) CD34+-ДК, (%) (n = 8) Достоверность различий CD14 CD86 HLA DR 5 (1–7) 61 (6–99) 79 (51–78) 43 (41–45) 26 (13–36) 15 р < 0,05 р < 0,05 р < 0,05 Òàáëèöà 2 Ýêñïðåññèÿ èììóíîôåíîòèïè÷åñêèõ ìàðêåðîâ â êóëüòóðå çðåëûõ ÄÊ, ïîëó÷åííûõ èç ðàçëè÷íûõ êëåòîê ïðåäøåñòâåííèêîâ Иммунофенотипические маркеры МоДК (%) (n = 10) CD34+-ДК (%) (n = 8) Достоверность различий CD14 CD83 CD83/HLA-DR CD1а/HLA-DR CD1а CD11с/HLA-DR 8,34 ± 6,84 71 ± 6,4 72,4 ± 4,87 42,7 ± 8,6 70 ± 12,8 75,3 ± 14,1 66,5 ± 1,5 6,5 ± 3,2 5 ± 1,4 11,8 ± 3,7 12,7 ± 5,7 28,3 ± 11,1 р < 0,05 р < 0,05 р < 0,01 р < 0,01 р < 0,05 р < 0,05 Òàáëèöà 3 Èçìåíåíèå óðîâíÿ ýêñïðåññèè èììóíîôåíîòèïè÷åñêèõ ìàðêåðîâ ÌîÄÊ â ðàçëè÷íîé ñòàäèè çðåëîñòè Иммунофенотипические маркеры Незрелые ДК (%) Зрелые ДК (%) Достоверность различий CD86/CD209 (n = 8) CD86/HLA-DR (n = 10) CD80/CD209 (n = 8) CD80/HLA-DR (n = 8) CD83/CD209 (n = 8) CD83/HLA-DR (n=10) 66, 7 ± 5,1 58,4 ± 7,1 7,8 ± 2,8 8,8 ± 3,2 3,8 ± 0,9 9,1±4,6 98,3 ± 0,4 83,5 ± 5,8 83,5,4 85,2 ± 5,5 85 ± 4,7 80,4±4,8 р < 0,05 р < 0,05 р < 0,01 р < 0,01 р < 0,01 р < 0,01 44 Îíêîëîãè÷åñêèé æóðíàë, Ò.4, N¹4 (16), 2010; Ò.5, N¹1 (17), 2011 Как видно из приведенных данных, после добавления в среду провоспалительных цитокинов TNF-α, ИЛ-1β, PGE2 и ИЛ-6 количество клеток, генерированных из моноцитов и экспрессирующих на своей поверхности молекулы CD209, HLA-DR, CD83, CD80 составляет более 80 %, что свидетельствует о получении in vitro культуры терминально дифференцированных ДК высокой чистоты. Оценка количественного выхода ДК, ДК генерированных из различных клетокклеток предшественников. Было проведено сравнение абсолютного числа зрелых ДК, экспрессирующих CD83 и CD209 антигены, получаемых при направленной дифференцировке в ДК как популяции моноцитов, так и популяции CD34+-клеток, выделенных из 20 мл продукта лейкафереза 5 пациентов. Количество мононуклеарных клеток, выделенных из 20 мл мобилизованной крови, в среднем составляло 3,81 (1,0–5,53) ×109. Фракции моноцитов и CD34+-клеток, выделенные из каждого образца, культивировали параллельно согласно соответствующим протоколам для генерирования ДК in vitro и подсчитывали общее число клеток после завершения дифференцировки каждого образца. 85,5(55,0–99,0) % клеток были CD83+CD209+ при получении зрелых ДК из фракции моноцитов, тогда как только 5,2 (4,3– 6,1) % при дифференцировке ДК из фракции CD34+клеток (р < 0,05). Все данные представлены в табл. 4. Òàáëèöà 4 Êîëè÷åñòâî ÄÊ, ïîëó÷àåìîå ïðè äèôôåðåíöèðîâêå in vitro èç ðàçëè÷íûõ ôðàêöèé ïðîäóêòà ëåéêàôåðåçà ïàöèåíòà Количество CD83+CD209+ ДК Источники ДК Число МНК до дифференцировки ×109 (%) ×107 Моноциты (n = 5) 3,81 (1,0–5,53) 85,5(55,0–99,0) 3,32 (0,44–6,40) CD34+ клетки (n = 5) 3,81 (1,0–5,53) 5,2 (4,3–6,1) 0,11 (0,01–0,18) р < 0,05 р < 0,05 Достоверность различий Результаты свидетельствуют, что при дифференцировке из моноцитов мы не только получили культуру МоДК высокой чистоты (до 85,5 % зрелых ДК), но и абсолютное количество ДК на выходе более чем в 30 раз превысило количество CD34+-ДК (р < 0,05) и является достаточным для создания противоопухолевой вакцины на основе дендритных клеток. Так, из 200 мл мобилизованной крови, используя применяемый нами протокол дифференцировки, можно генерировать более 3×109 зрелых ДК. Работы других исследователей также показали, что использование моноцитов из продукта лейкафереза позволяет получить необходимое количество ДК (до 1×109 клеток) для проведения курса специфической иммунотерапии [15]. ÇÀÊËÞ×ÅÍÈÅ Зрелые дендритные клетки, генерированные in vitro как из моноцитов, так и из CD34+-клеток продукта лейкафереза пациента, морфологически не отличаются. При проведении протокола дифференцировки CD34+-клеток в ДК in vitro общий выход гемопоэтических клеток был значительно выше и клеточная популяция была более гетерогенной, чем в случае, когда предшественниками ДК являлись моноциты, что объясняется активной пролиферацией гемопоэтических стволовых клеток. В тоже время, абсолютное количество незрелых ДК, оцененное по экспрессии поверхностных иммунофенотипических маркеров CD86 и HLA-DR, и зрелых ДК, экспрессирующих CD209, CD83, CD80, CD11c и CD1a антигены, достоверно выше при их получении из моноцитов в связи с высокой чистотой получаемой культуры ДК. Ñïèñîê èñïîëüçîâàííûõ èñòî÷íèêîâ 1. Banchereau J., Palucka A.K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer // Nat. Rev. Immunol. 2005. № 5(4). P. 296 296–306; 2. Ardavin C., Amigorena S., Sousa C. R. Dendritic cells: Immunobiology and cancer immunotherapy // Immunity 2004. № 20(1). P. 17 17–23; 3. Schuler G., Schuler-Thurner B., Steinman R.M. The use of dendritic cells in cancer immunotherapy // Curr. Opin. Immunol. 2003. № 15(2). P. 138 138–147; 4. Morse M.A., Lyerly H.K. Clinical applications of dendritic cell vaccines // Curr. Opin. Mol. The. 2000. № 2(1). P. 20 20–28; 5. Wheeler C J., Black K L. Elicits Correlated Immune and Clinical Responses in Glioblastoma Multiforme Patients // Cancer Res. 2008. Vol 15, № 68(14). P. 5955–64. 6. Geiger JD, Hutchinson RJ, Hohenkirk LF. Vaccination of pediatric solid tumor patients with tumor lysate-pulsed dendritic cells can expand specific T cells and mediate tumor regression // Cancer Res. 2001. № 61. P. 8513–8519; 7. Cao H., Verge V., Baron C., In vitro generation of dendritic cells from human blood monocytes in experimental conditions compatible for in vivo cell therapy // J. Hematother. Stem Cell. Res., 2000. № 9(2). P. 183–194; 8. Ridolfi R., Petrini M.. Fiammengh L. Improved overall survival in dendritic cell vaccination-induced immunoreactive subgroup of advanced melanoma patients // Journal of Translational Medicine 2006. № 16(4). P. 36; 36 45 Îðèãèíàëüíûå èññëåäîâàíèÿ 9. Kugler A. Regression of human metastatic renal cell carcinoma after vaccination with tumor cell-dendritic cell hybrids // Nat Med. 2000. № 6. P. 332–336; 10. Lonial S., Hicks M.,Rosenthal H. A randomized trial comparing the combination of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor plus granulocyte colony-stimulating factor versus granulocyte colony-stimulating factor for DC Immunotherapy. Mobilization of dendritic cell subsets in hematopoietic progenitor cell products // Biol. Blood Marrow Transplant. 2004. № 10(12). P. 848 848–857; 11. Titzer S. Vaccination of multiple myeloma patients with idiotype-pulsed dendritic cells: immunological and clinical aspects // Br J Haematol. 2000. № 108. P. 805–816; 12. Mackensen A., Herbst B, Chen JL, K Köööhler hler G, Noppen C, Herr W, Spagnoli GC, Cerundolo V, Lindemann A. Phase I study in melanoma patients of a vaccine with peptide-pulsed den- 46 dritic cells generated in vitro from CD34(+) hematopoietic progenitor cells. Int J Cancer. 2000. Vol 1, № 86(3). P. 385 385––392; –392; 13. Burkhard L, Adoptive Immunotherapy Methods and Protocols Protocols, 2005. Humana Press, USA; 14. Soilleux EJ, Morris LS, Leslie G, Chehimi J, Luo Q, Levroney E, Trowsdale J, Montaner LJ, Doms RW, Weissman D, Coleman N, Lee B. Constitutive and Induced Expression of DC-SIGN on Dendritic Cell and Macrophage Subpopulations in Situ and in Vitro // Journal of Leukocyte Biology. 2002. № 71. P. 921–931; 15. Gabrilovich D.I., Nadaf S., Corak J., Berzofsky J.A., Carbone D.P. Dendritic cells in antitumor immune responses. II. Dendritic cells grown from bone marrow precursors, but not mature DC from tumor-bearing mice, are effective antigen carriers in the therapy of established tumors // Cell. Immunol1996. № 170(1). P. 111–119.
