Люминесцентный анализ клеток
advertisement
В.Н. Карнаухов Люминесцентный анализ клеток Пущино 2002 Электронная версия учебного пособия В.Н.Карнаухова «Люминесцентный анализ клеток» подготовлена в Электронном издательстве «Аналитическая микроскопия» под редакцией проф. А.Ю.Буданцева (рег. № издательства в Министерстве РФ по делам печати, телерадиовещания и средств массовой информации Эл №6072 от 4 февраля 2002 г.) Техническая работа: редактор 1 категории Т.М.Бондарь Администратор Сервера http://cam.psn.ru : Р.В.Гуркин © Электронное издательство “Аналитическая микроскопия” Карнаухов Валерий Николаевич 1939 г. рождения, окончил Физический факультет Московского Государственного университета им. М.В.Ломоносова, кандидат биологических наук, Зам. Директора Института биофизики клетки РАН (Пущино), заведующий Лабораторией микроспектрального анализа клеток и клеточных систем, член Научного совета по биофизике РАН, член редколлегии журнала «Биофизика», вицепрезидент Академии проблем сохранения жизни. Область научных интересов: биология клетки, аналитическая микроскопия, спектральный анализ, клеточный мониторинг окружающей среды. Автор более 400 научных работ, в том числе 7 монографий. Карнаухов Николай Иванович Г.Каунас, 1944 Сергеева (Бобринская)Тамара Александровна и автор. г. Сталиногорск, 1945 Светлой памяти родителей своих, отца – Карнаухова Николая Ивановича (1913-1971) и мамы – Сергеевой Тамары Александровны (1916-1987) с любовью и благодарностью посвящаю От автора… Об учебном пособии В.Н.Карнаухова “Люминесцентный анализ клеток” Учебное пособие В.Н.Карнаухова “Люминесцентный анализ клеток” представляет краткое изложение второй части большой учебной Программы «Спектральный анализ клеток» (полностью Программа приведена в составе данного пособия) посвященной Спектральному анализу клеток, внутриклеточных органелл и популяции клеток. В целом Программа «Спектральный анализ клеток» предназначена для ознакомления студентов с методами спектрального анализа внутриклеточных органелл, одиночных клеток и клеточных популяций как в живых, так и в фиксированных препаратах. Необходимость использования этих методов обусловлена большими достижениями биохимии в исследованиях выделенных из клеток и тканей физиологически активных макромолекул. Эти достижения во многом базируются на использовании методов классического спектрального анализа чистых (нерассеивающих) растворов. Для дальнейшего движения в понимании принципов функционирования живых клеток, данные биохимии, полученные методами классического спектрального анализа, необходимо “привязать” к функционирующим одиночным клеткам, и их популяциям, используя методы спектрального анализа для изучения таких многокомпонентных и гетерогенных систем, как клетка. Эти особенности клетки как объекта спектральных исследований создают определенные ограничения и особенности и методов регистрации и способов интерпретации полученных результатов. В то же время использование методов спектрального анализа клеток представляет уникальные возможности решения как фундаментальных проблем биологии, так и прикладных задач в области медицины, биотехнологии и экологии, что иллюстрируется оригинальными примерами. В предлагаемом курсе должно быть показано соотношение результатов спектрального анализа клеток с результатами методов классической биохимии, цитохимии и электронной микроскопии. Особое внимание уделено задачам, решение которых невозможно без применения спектрального анализа клеток. В основу данного учебного пособия легла монография В.Н.Карнаухова «Люминесцентный спектральный анализ клетки», опубликованная в Серии «Теоретическая и прикладная биофизика» в Издательстве «Наука», М., в 1978 г. В течение 30 лет книга В.Н.Карнаухова сыграла важную роль в подготовке специалистов в области клеточной биофизики связанной с использованием микроспектрального анализа клеток. Мы надеемся, что данное издание учебного пособия будет также необходимо и полезно для магистрантов, аспирантов и молодых специалистов в их освоении этого важного и интересного раздела экспериментальной биофизики клетки. Учебное пособие, посвященное первой части Программы «Спектральный анализ клеток», в котором будут обсуждены вопросы абсорбционного спектрального анализа клеток, внутриклеточных органелл и клеточных популяций в настоящее время готовится автором и будет выпущена в нашем Электронном издательстве. Январь-декабрь 2002 г. А.Ю.Буданцев ПРЕДИСЛОВИЕ Бурное развитие биохимии и молекулярной биологии за последние два десятилетия выдвинуло на передний план задачу изучения молекулярной организации функциональных механизмов живой клетки и процессов регуляции, интегрирующих их в единую живую систему. Именно эти механизмы обеспечивают возможность выполнения плеткой функций: рост, смену поколений, приспособление к меняющимся условиям среды и к взаимодействию клеток. Огромное количество ферментных процессов, протекающих в клетке, координируется системами регуляции, и потому они строго разграничены не только в пространстве в специальных структурных элементах клетки (ядро, митохондрии, эндоплазматический ретикулум, лизосомы, пероксисомы и т. д.), но достаточно четко распределены также и во времени. Таким образом, число реакций, одновременно протекающих в том или ином органоиде клетки, не настолько велико, чтобы отказаться от попыток установить их последовательность и взаимосвязь в живой системе. Это тем более необходимо, что нарушения в системах регуляции, обеспечивающих временную и пространственную организацию биохимических реакций в клетке, являются, по-видимому, причиной различных патологических явлении, включая сердечно-сосудистые заболевания и рак. Постановка задачи об изучении внутриклеточной регуляции обмена веществ и энергии требует, естественно, развития и внедрения в значительной мере новых методов и новой техники эксперимента. Важнейшими из них являются методы спектрального анализа, позволяющие изучать физико-химические процессы, протекающие непосредственно в живой клетке и ее органоидах. Возможности спектрального анализа связаны, прежде всего, с тем обстоятельством, что многие молекулы, входящие в состав функциональных механизмов клетки, обладают весьма характерными спектрами поглощения, а зачастую — и люминесценции. В ряде случаев эти спектральные характеристики подвергаются значительным изменениям, отражая те изменения в структуре данной молекулы и ее окружения, которые служат физико-химической основой биологической функции. Например, регистрация люминесцентных характеристик таких ключевых компонентов окислительного метаболизма, как НАД⋅Н и флавопротеины, открывает возможность тонкого слежения за состоянием энергетического аппарата клетки. В тех же представляющих случаях, интерес когда собственные компонентов клетки спектральные характеристики оказываются недостаточно выразительными, имеется возможность использования специфических красителей-меток. В их числе оказываются как старые, хорошо известные в люминесцентной микроскопии и цитохимии флуорохромы-метки нуклеиновых кислот, белков, липидов и др., так и класс относительно новых меток-флуорохромов, тонко реагирующих на изменение структуры помеченных ими молекул, входящих в состав полимолекулярных комплексов, осуществляющих элементарные функции в живой системе. Все эти вопросы в той или иной мере представлены в соответствующих разделах данной монографии. Однако при относительно большом объеме ее не может быть сделана попытка одинаково подробного рассмотрения всех возможных аспектов применения столь широкого и перспективного по своим возможностям метода, как люминесцентный спектральный анализ. Поэтому представлялось полезным в каждой главе выделить для иллюстрации основных положений, методических подходов, проблем и перспектив метода одну из задач молекулярной физиологии клетки за счет краткого, по необходимости, рассмотрения остальных. Реализация широких возможностей метода во многом зависит от наличия рационально построенных систем регистрации. Поэтому техническому и приборному обеспечению уделено достаточно большое внимание не только в специальной главе, где рассматриваются вопросы общего характера, но и в остальных главах, где оказывается уместным обсудить некоторые технические и методические приемы более узкого назначения. Монография не ставит своей задачей описание развития различных идей в историческом плане, и потому в ней цитированы только те из известных автору работ, знакомство с которыми, по его мнению, будет полезно читателю в практической деятельности. Автор сотрудникам, считает приятным участвовавшим люминесцентного анализа долгом в клеток, выразить создании глубокую описываемой проводившим ряд благодарность техники и своим методов различных экспериментов и помогавшим при оформлении рукописи: В.А. Яшину, В.И. Кулакову, В.В. Дудареву, Е.В. Мельниковой, В.П. Зинченко, О.Е. Лебедеву, П. П. Марценюку и многим другим, совместная работа с которыми позволила накопить опыт, предлагаемый вниманию читателя. В.Н.Карнаухов Оглавление Предисловие Глава 1. Определения и общие закономерности люминесценции 1.1. Физические основы люминесценции 1.2. Возбуждение и измерение интенсивности люминесценции клетки Глава 2. Собственная люминесценция клеток 2.1. Спектральные характеристики собственной люминесценции клеток 2.2. Функциональная активность клетки и регуляция энергетического аппарата Глава 3. Люминесцентные красители. 1. Изучение внутриклеточного обмена веществ 3.1. Двухволновые методы определения соотношения концентрации нуклеиновых кислот 3.2. Определение соотношений различных веществ в клетке 3.3. Анализ спектральных характеристик Глава 4. Люминесцентные красители. 2. Исследование динамики функциональной организации клеточных структур 4.1. Взаимодействие контрактильных белков в процессе мышечного сокращения 4.2. Изучение динамики кальция при функционировании клеток 4.3. Исследование структуры мембраны при генерации потенциала действия 4.4. Взаимодействие белков и нуклеиновых кислот ПРИЛОЖЕНИЕ Приборы и техника люминесцентного спектрального анализа клеток Введение Приложение 1 П1. Микроспектрофлуориметры П1.1. Микроспектрофлуориметр на базе стандартных деталей и узлов П1.2. Микроспектрофлуориметр для морфологических исследований на базе стандартных узлов П1.3. Малогабаритный инвертированный микроспектрофлуориметр П1.4. Экспедиционный микроспектрофлуориметр с интерференционным светофильтром переменной длины волны П1.5. Бесщелевой микроспектрофлуориметр с фоторегистрацией П1.6. Высокоапертурный бесщелевой спектрофлуориметр П1.7. Микроспектрофотометр для изучения фосфоресценции клеток Приложение 2 П2. Микрофлуориметры П2.1. Трехканальный микрофлуориметр П2.2. Двухканальный импульсный микрофлуориметр П2.3. Двухканальные поляризационные микрофлуоримегры П2.4. Двухканальный микрофлуориметр с раздельным возбуждением Приложение 3 П3. Приборы и методы автоматического анализа клеточных популяций Приложение 4 Энергетическая яркость в отдельных линиях ртутных ламп [мВт/см2ср⋅нм] Приложение 5 Энергетическая яркость ламп со сплошным спектром и фона ртутных ламп [362]. Список первоисточников Приложение 6 Программа курса «СПЕКТРАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ КЛЕТОК» Список рекомендуемой литературы Глава 1. Определения и общие закономерности люминесценции 1.1. Физические основы люминесценции В монографии небольшого объема нет ни возможности, ни необходимости подробно рассматривать физические основы люминесценции, которым посвящены большие разделы солидных учебников и монографий [1—16]. Однако некоторые сведения общего характера, полезные для дальнейшего изложения, следует, по-видимому, напомнить. В стационарных условиях молекула вещества обладает конфигурацией электронных орбит с наиболее низкой из возможных потенциальной энергией и находится, как принято говорить, в основном, состоянии. Тепловое движение приводит к колебаниям атомов внутри молекулы и вращению ее как целого, что сопровождается флуктуациями потенциальной энергии основного состояния. Для иллюстрации удобно воспользоваться примером двухатомной молекулы, допускающей еще двухмерное изображение (рис.1). Низший энергетический уровень или основное состояние описывается кривой So, на которой горизонтальными линиями схематически показаны энергетические подуровни, соответствующие разным колебательным состояниям молекулы в основном состоянии (So) ее электронной орбиты. Рис. 1. Зависимость потенциальной энергии двухатомной молекулы от расстояния между атомами для разных энергетических уровней. Если теперь молекула сможет получить извне дополнительную порцию энергии, то она переходит в состояние с избытком потенциальной энергии и оказывается, как принято говорить, в возбужденном состоянии. Это состояние является неустойчивым, и через некоторое время (10-8 с), отдав тем или иным способом избыточную энергию, система возвращается в исходное основное состояние. Излучение света молекулой вещества при переходе ее из возбужденного состояния в основное называется люминесценцией. Хотя с теоретической точки зрения способ передачи молекуле дополнительной энергии и перевод ее в возбужденное состояние не имеет особого значения, на практике по этому признаку различают фотолюминесценцию (возбуждение световым излучением), рентгенолюминесценцию (возбуждение рентгеновыми лучами), катодолюминесценцию (возбуждение пучком ускоренных электронов) и т. д. Несколько особняком стоят химические способы возбуждения. Различают хемилюминесценцию, характеризующуюся тем, что молекула оказывается в возбужденном состоянии в результате экзотермической химической реакции. Частным случаем хемилюминесценции является биолюминесценция, наблюдаемая в живой природе. Возможен также случай, когда возбуждение молекулы (А) происходит в результате безызлучательного переноса электронного возбуждения от другой предварительно возбужденной молекулы-донора (D): D* + A → D + A* Излучение молекулы-акцептора (A*) в этом случае называется сенсибилизированной люминесценцией. Возвращаясь к рассмотрению основных закономерностей явления люминесценции, следует, прежде всего, отметить, что поступающая извне избыточная энергия возбуждения может быть поглощена молекулой с переходом в возбужденное состояние только в том случае, если ее величина равна разнице энергий основного (So) и одного из возбужденных состояний данной молекулы. В частном случае фотолюминесценции, приведенном на рис.1, это означает, что для перехода молекулы с основного уровня So на первый возбужденный уровень S1 (с разницей энергии ΔE1 необходим квант света с такой же энергией: ΔE1 = hν1 (1), где h — постоянная Планка, равная 6,62⋅10-27 эрг⋅с, ν - частота электромагнитных колебаний света (с1 ). Или, учитывая, что ν =c/λ, (2), где с — скорость света в вакууме, а λ — длина волны возбуждающего излучения, ΔE1 = hc/λ1 (3). При соблюдении этих условий молекула может поглотить квант света и за время, равное периоду световых колебаний (10-15 с), переходит из основного состояния So в возбужденное состояние S1 как это показано вертикальной стрелкой «Возбуждение» на рис.1. Ввиду того, что за столь малый отрезок времени (10-15 с) расстояние между составляющими молекулу атомами не успевает существенно измениться, согласно принципу Франка - Кондона, молекула оказывается на одном из высших колебательных подуровней возбужденного состояния S1 и требуется определенное время для рассеяния соответствующей порции энергии ΔEk 1, чтобы молекула оказалась в низшей точке энергетической кривой S1. Как уже упоминалось выше, возбужденное состояние молекулы S1 является нестабильным, и через некоторое время (t ≈ 10-8 с) она возвращается в исходное основное состояние So, излучая избыточную энергию ΔE2 в виде кванта света с длиной волны λ2 , определяемой уравнением ΔE2 = hc/λ2. При возвращении молекулы в основное состояние она вновь оказывается, в соответствии с принципом Франка - Кондона, на одном из высших колебательных подуровней основного состояния и рассеивает порцию энергии ΔEkо, чтобы оказаться в низшей точке энергетической кривой So. Таким образом, излучаемая в виде кванта света энергия ΔE2 оказывается меньше поглощенной при возбуждении энергии ΔE1 на величину ΔEk 1 +ΔEk2 и в соответствии с уравнением (3) длина волны излучения λ2 оказывается больше длины волны возбуждающего кванта λ1. Это характерное для люминесценции соотношение лежит в основе установленного эмпирическим путем закона Стокса. Существуют, однако, случаи, когда за счет внутреннего перераспределения энергии длина волны люминесценции оказывается меньше длины волны возбуждающего кванта. Эта разновидность носит название антистоксовой люминесценции. Рассмотренные переходы между основным So и возбужденным S1 состояниями характеризуются одной весьма важной особенностью, а именно - неизменностью состояния спинов электронов в молекуле. Обычно молекулы в основном состоянии содержат четное число электронов со «спаренными» спинами, т.е. число электронов со спином s = + ½ равно числу электронов со спином s = - ½, и, следовательно, суммарный спин S всех электронов молекулы равен 0. В результате мультиплетность молекулы М = 2S + 1, где S — суммарный спин молекулы, оказывается равной 1, или, как говорят, молекула находится в синглетном состоянии. Наиболее вероятными энергетическими переходами являются переходы без изменения мультиплетности, т. е. cинглет → синглетный (So → S1) переход при поглощении кванта возбуждения и обратный переход S1 → So при дезактивации молекулы. Этот тип люминесценции называется флуоресценцией. Может, однако, оказаться, что в результате некоторого внутреннего энергетического перехода спин одного из электронов молекулы изменит знак и в ее составе появятся два неспаренных электрона. Тогда суммарный спин молекулы S1= ½+ ½ = 1 и мультиплетность М == 2S + 1 = 3. Такое состояние молекулы принято называть триплетным. Внутренняя потенциальная энергия первого триплетного состояния (кривая Т) ниже энергии первого синглетного состояния (S1), и поэтому доля энергии ΔE3 , излучаемой в виде света при переходе молекулы из возбужденного триплетного состояния (T1) в основное синглетное состояние (So), ощутимо уменьшается, а длина волны излучаемого при этом света (см. уравнение 3) увеличивается по сравнению с флуоресцентньм переходом S1 → So (ΔE2 ). Этот тип люминесценции (триплет-синглетный переход) называется фосфоресценцией. Помимо большей длины волны излучаемого света фосфоресценция отличается от флуоресценции и большим временем жизни молекулы в возбужденном состоянии. Это связано с тем обстоятельством, что переходы между энергетическими уровнями с изменением мультиплетности являются «запрещенными», т. е. вероятность их очень мала. Ввиду большой длительности времени жизни возбужденной молекулы в триплетном состоянии (T1) появляется вероятность того, что за счет поглощения тепловой энергии она может возвратиться на возбужденный синглетный уровень S1 и уже с него перейти на основной уровень So , излучая квант света. Поскольку разница энергий в этом случае составляет ΔE2, длина волны излучения остается такой же, как и в обычном случае флуоресценции, и только время жизни возбужденного состояния оказывается большим (за счет пребывания на триплетном уровне T1), и этот тип флуоресценции называется замедленной флуоресценцией. Из изложенного выше становится ясной принципиальная значимость такого параметра люминесценции, как время жизни молекулы в возбужденном состоянии. Для определения этого параметра существуют различные способы, наиболее прямой из которых состоит в том, что после прекращения возбуждения интенсивность люминесценции уменьшается по закону I = Io e-t/τ (4), где I —интенсивность люминесценции в момент времени t после прекращения возбуждения; Io интенсивность люминесценции до прекращения возбуждения; τ - среднее время жизни возбужденного состояния. Из выражения (4) следует, что величина τ представляет собой время, за которое интенсивность люминесценции уменьшится до 1/е от исходного значения. Даже из весьма поверхностного рассмотрения ясно, что флуоресценция и фосфоресценция значительно различаются по своей внутренней природе и, как следствие, по своим закономерностям. Поэтому нежелательно употребление этих терминов без точного установления природы излучения; и более правильным в случаях, когда нет полной уверенности в том, является ли изучаемое свечение флуоресценцией или фосфоресценцией, является употребление термина люминесценция. При этом необходимо отметить, что, хотя, как это упоминалось выше, фосфоресценция в растворах имеет обычно значительно большее время жизни возбужденного состояния τ, знание этого параметра может оказаться недостаточным при изучении люминесценции клеточных структур, так как он отражает только наличие «запрета» на триплет-синглетный переход в растворе. В специальным образом упорядоченной среде клеточных структур стерические взаимодействия люминесцирующей молекулы со средой могут, по-видимому, приводить к снятию запрета и значительному уменьшению времени жизни фосфоресценции, делая ее мало различимой по этому параметру от флуоресценции. Лабильность же биологических структур в процессе их функциональных перестроек может приводить к вариабельности τ фосфоресцирующей молекулы, и это следует иметь в виду. Одним из важнейших параметров люминесценции молекулы является ее квантовый выход k, определяемый как отношение числа квантов люминесценции (nл) к числу поглощенных за то же время молекулой квантов возбуждающего излучения (nп): k = nл /nп (5), При отсутствии каких-либо процессов, кроме люминесценции, число поглощенных квантов равно числу квантов люминесценции и k = 1. Однако молекула может вернуться из возбужденного состояния не только путем излучения избыточной энергии в виде света. Возможны такие процессы, как передача энергии возбуждения другой молекуле, фотохимическая реакция, рассеяние энергии в виде тепла при участии окружающей среды и т. д. Все эти процессы приводят к тому, что доля молекул, дезактивация которых происходит за счет люминесценции, уменьшается, а может и вообще стать близкой к нулю. Следует иметь в виду, что молекула люминесцирующего вещества, взаимодействуя со специфически организованными биологическими макромолекулами и их комплексами, может резко менять свой квантовый выход как в сторону уменьшения (например, за счет миграции энергии возбуждения), так и в сторону увеличения. Например, краситель аурамин 00, практически не люминесцирующий в растворе ввиду исключительной способности к рассеянию энергии безызлучательным путем за счет большой подвижности частей своей молекулы, после взаимодействия с белком приобретает жесткость молекулярной структуры и как следствие - высокий квантовый выход. 1.2. Возбуждение и измерение интенсивности люминесценции клеток Как было упомянуто выше, один из основных способов возбуждения люминесценции состоит в использовании квантов света с более короткой, чем у люминесцентного излучения, длиной волны. При этом существуют различные способы возбуждения люминесценции микрообъекта для последующего микроскопического изучения его. Простейший способ представлен на рис. 2, I и заключается в том, что из суммарного светового потока источника (1), сформированного коллекторной линзой (2), узкополосным фильтром (3) вырезается необходимое для возбуждения излучение, лежащее в узком спектральном интервале. Это излучение конденсором (4) фокусируется на микрообъект (5) и возбуждает его люминесценцию. Свет люминесценции объекта (5) и прошедшее через объект возбуждающее излучение (на 2-3 порядка более интенсивное, чем люминесценция) собирается микрообъективом (6), формирующим изображение микрообъекта в фокальной плоскости окуляра (8), Расположенный между микрообъективом (6) и окуляром (8) запирающий светофильтр (7) предназначен для полного устранения прошедшего через микрообъект (5) возбуждающего излучения, что дает возможность рассматривать через окуляр (8) изображение микрообъекта в свете его люминесценции. Рис. 2. Способы возбуждения и регистрации люминесценции микрообъекта: I – наблюдение в проходящем свете; II – система с темнопольным пораболоидконденсором; III – освещение по методу темного поля с кардиоид-конденсором. Недостатки этого способа, называемого возбуждением люминесценции в проходящем свете, очевидны. Во-первых, наиболее ярко люминесцируют нижние слои микрообъекта, в то время как наиболее удобны для наблюдения верхние слои, т.е. способ применим только для достаточно тонких срезов. Вторая особенность, хотя и не носит принципиального характера, тем не менее накладывает серьезные ограничения на применение этого метода и состоит в трудности отделения проходящего через объект интенсивного возбуждающего излучения. Именно с целью отделения возбуждающего излучения от люминесценции объекта и были разработаны системы темнопольного возбуждения с применением параболоидных (рис. 2, II) и кардиоидных. (рис. 2, III) конденсоров. Как видно из приведенных на рис. 2 схем, прямое возбуждающее излучение в этих случаях не попадает в микрообъектив (6), а рассеянное микрообъектом (5) возбуждающее излучение малой интенсивности достаточно легко устраняется запирающим светофильтром (7). К числу недостатков этих схем относится малая толщина микрообъекта и определенные ограничения на возможность использования высокоапертурных конденсоров и микрообъективов, что снижает яркость люминесценции объекта, хотя при работе с тонкими флуорохромированными срезами и микрообъектами они позволяют получить хорошие результаты. Необходимость исследования толстых образцов, а тем более клеток in situ (т.е. лежащих на поверхности органа, не выделенного из организма живого животного), привела к разработке схем фронтального возбуждения падающим на объект излучением (рис. 3). Применение с этой целью эпиобъективов (рис. 3, I), хотя и позволяет решить поставленную задачу исследования толстых препаратов, однако, достигается это достаточно дорогой ценой уменьшением апертур как осветителя конденсора (4), так и микрообъектива (6), что приводит к значительному снижению яркости люминесценции микрообъекта. Рис. 3. Фронтальное возбуждение с эпиобъективом (I) и с применением интерференционной светоделительной пластинки по методу Брумберга (II). В этом отношении, по-видимому, наиболее перспективным является метод возбуждения, при котором один и тот же высокоапертурный микрообъектив (4, 6) (рис. 3, II) используется и для концентрирования возбуждающего излучения на объекте (5) и для сбора люминесцентного излучения этого объекта [17]. Основным преимуществом такой схемы является максимально высокая яркость люминесценции препарата, пропорциональная четвертой степени апертуры микрообъектива [18]. Яркость люминесценции Ф препарата определяется уравнением: Ф = КФо (А12А22 /β2Г 2) (6), где Ф - яркость люминесценции; К - коэффициент, характеризующий особенности прибора и свойства препарата; Фо - яркость источника возбуждающего излучения; А1 - апертура микрообъектива, собирающего люминесцентное излучение препарата; А2 - апертура конденсора, концентрирующего на препарате возбуждающее излучение; β - увеличение объектива; Г - увеличение окуляра. Для случая, когда один и тот же объектив используется и для концентрации возбуждающего излучения на объекте и для сбора люминесцентного излучения объекта, уравнение (6) приобретает вид: Ф = КФо (А14 /β2Г 2) (6’) Из этого уравнения следует, что для достижения максимальной яркости люминесценции необходимо стремиться к увеличению апертуры объектива. Увеличение апертуры микрообъектива Х10 от 0,2 до 0,4, например, увеличивает яркость люминесценции препарата в 16 раз при прочих равных условиях. Именно эта высокая начальная яркость препарата дает возможность достаточно просто осуществлять в дальнейшем спектральный анализ его люминесцентного излучения с хорошим соотношением сигнал/шум. Применение такой (рис. 3, II) системы фронтального возбуждения люминесценции стало целесообразным только после введения Е.М. Брумбергом и А.С.Гершгориным [19] специального опак-иллюминатора (рис. 3, II, 9), представляющего собой светоделительную пластинку с интерференционным покрытием. Спектральные характеристики этих пластинок (см. ниже) таковы, что они избирательно отражают на объект под углом 90° излучение УФ или сине-фиолетовой области спектра, используемое для возбуждения люминесценции препарата (5), и свободно пропускают свет люминесценции препарата, лежащий в видимой области спектра. Наличие этих интерференционных светоделительных пластинок [20] является ценной особенностью отечественных люминесцентных микроскопов [21], позволяющих проводить самые разнообразные исследования клеток. В поле зрения люминесцентного микроскопа перед глазами исследователя открываются изумительные по своей красоте многоцветные картины собственной и вторичной люминесценции клеток (см. вкл.). Однако при всей своей высочайшей чувствительности к слабым световым потокам и к цветовым оттенкам их глаз человека как измерительный прибор обладает одним существенным недостатком - отсутствием объективности. Оснащение микроскопа дополнительными спектральными и электронными устройствами позволяет перевести эти многокрасочные картины на язык объективных цифровых данных об интенсивностях люминесценции в определенных длинах волн. Интенсивность люминесценции Iл вещества определяется выражением Iл = kIп (7), где k - квантовый выход люминесценции данного соединения; Iп - интенсивность поглощенного веществом возбуждающего люминесценцию излучения, определяемая, согласно закону Ламберта Бугера - Бера, уравнением: Iп = Iо(1-10 - εcd) (8) При условии, что доля поглощаемого веществом излучения мала и составляет не более 5% падающего на объект излучения (а это условие практически всегда реализуется, особенно при микроспектральных исследованиях), уравнение (8) упрощается и принимает вид: Iп = Iо ⋅ 2,3εcd (8’), где Iо - интенсивность падающего на объект возбуждающего люминесценцию излучения; ε молярный коэффициент поглощения; с - концентрация поглощающего и люминесцирующего вещества; d - длина оптического пути возбуждающего люминесценцию излучения в объекте. Тогда уравнение (7), определяющее интенсивность люминесценции вещества, с учетом выражения (8') приобретает вид: Iл = kIп = 2,3Iо kεcd (9) При изучении люминесценции гомогенного мономолекулярного раствора какого-либо вещества с постоянным квантовым выходом в кювете толщиной d в правой части уравнения (9) остается только одна переменная величина с — концентрация вещества в растворе. В этом случае интенсивность люминесценции Iл пропорциональна (в определенных пределах) концентрации люминесцирующего вещества с, что и используется в практике люминесцентного анализа растворов. При исследованиях же на клеточном уровне ситуация резко изменяется. Клетка как объект спектральных исследований представляет собой многокомпонентную гетерогенную полидисперсную систему, весьма сложным образом взаимодействующую с люминесцентной меткой и падающим на объект излучением [22—24]. В этом случае в правой части уравнения (9) оказывается по крайней мере три переменных k, c, d, изменение которых будет приводить к изменению интенсивности регистрируемой люминесценции Iл. Объединяя постоянные члены уравнения (9) в постоянный коэффициент А, получаем Iл= Iо А kcd (9’) Это означает, что если, например, в двух участках одной и той же клетки зарегистрированы спектры люминесценции (рис. 4, 1, 2), то в общем случае без привлечения дополнительных данных нет возможности определить, связано ли изменение интенсивности люминесценции ΔIл с изменением концентрации с люминесцирующей молекулы в изучаемых участках клетки, обязано ли оно своим происхождением изменению квантового выхода люминесценции k или изменению длины оптического пути возбуждающего люминесценцию излучения в объекте. Рассмотрение влияния этих переменных на величину измеряемой интенсивности люминесценции удобно начать с последнего из перечисленных параметров, а именно с d - длины оптического пути возбуждающего излучения в препарате, полагая при этом постоянным квантовый выход k. Полидисперсность клетки приводит к возникновению многократного рассеяния и отражения светового луча на внутриклеточных органоидах, таких, как ядро, митохондрии, эндоплазматический ретикулум, рибосомы, аппарат Гольджи, микротельца и т. д. Ввиду большой вариабельности коэффициентов преломления этих органоидов, по-видимому, не существует удовлетворительного теоретического подхода, позволяющего рассчитать рассеяние в столь сложной полидисперсной среде, тем более, что значительная часть рассеивающих частиц лежит за пределами разрешения светового микроскопа и распределение их по форме и размерам остается неизвестным. В то же время размеры, форма и коэффициент преломления этих частиц, меняясь в широком диапазоне, определяют рассеивающие свойства объекта [25, 26]. Это означает, что даже при условии постоянства квантового выхода люминесцирующего вещества получение абсолютных данных о его концентрации в клетке по измеренной интенсивности люминесценции - крайне трудная задача. Учитывая, однако, что в большинстве случаев представляют интерес не столько данные об абсолютной концентрации вещества, сколько сведения о динамике этой концентрации в процессе тех или иных изменений функционального состояния клетки, достаточно было бы потребовать постоянства рассеивающих свойств объекта (а следовательно, и длины оптического пути возбуждающего люминесценцию излучения d) при изучении люминесцентной метки-флуорохрома с постоянным квантовым выходом k, чтобы в правой части уравнения (9') осталась только одна переменная величина с. Тогда изменение интенсивности люминесценции ΔIл, измеренное микрофлуориметром в длине волны λ1, будет определять изменение концентрации флуорохрома (рис. 4). Рис. 4. Схема одноволнового метода регистрации (объяснение в тексте). Такого типа задачи часто возникают при определении содержания в клетке люминесцирующих веществ или при определении таких важнейших компонентов ее обмена, как ДНК, РНК, белки, липиды и т. д., с применением флуорохромов – люминесцентных красителей с постоянным квантовым выходом, специфически связывающихся с изучаемыми веществами. На базе применения флуорохромов с постоянным квантовым выходом [27—31] были созданы классическая люминесцентная гистохимия и цитохимия [32—49]. Измерения интенсивности люминесценции в одной длине волны, совпадающей с максимумом спектра излучения определяемого вещества, могут давать надежные результаты в ряде частных случаев, при большом статистическом усреднении результатов измерения или в тех случаях, когда основную информацию несет именно форма статистического распределения измеряемых величин в популяции клеток. Например, в приведенном на рис.5 случае, когда производилось измерение концентрации ДНК, выявляемой с помощью люминесцентного варианта [48] метода Фелъгена в ядрах фибробластов в культуре ткани, задача дифференциации нормальной (а) и синхронизованной (б) культур легко решается по форме гистограмм распределения ДНК в ядрах. Более того, положение максимумов гистограммы распределения ДНК в нормальной культуре (рис.5, а) служит своего рода «внутренним» стандартом измерения; так, оно соответствует диплоидному (первый максимум) и удвоенному перед делением клетки (второй максимум) количеству ядерной ДНК. В этом нетрудно убедиться, фотометрируя разошедшиеся к полюсам хромосомы в готовых к делению, но еще не разделившихся клетках. Интенсивность люминесценции каждой из групп хромосом соответствует левому склону первого максимума гистограммы, а интенсивность всего ядра – правому склону второго максимума (рис. 5, а). Рис. 5. Гистограммы распределения ДНК в нормальной (а) и синхронной (б) культурах фибробластов, определяемые с помощью люминесцентного варианта реакции Фельгена. По оси ординат – количество клеток, по оси абсцисс – содержание ДНК в отн. ед. Поскольку средняя интенсивность люминесценции окрашенных препаратов может меняться от опыта к опыту в зависимости от условий окрашивания, чувствительности и других случайных, трудно учитываемых условий, с целью повышения точности и сопоставимости данных перед построением гистограммы прибегают к нормированию результатов путем, например, их деления на величину средней интенсивности люминесценции в контроле. Гистограммы распределения (рис. 6) Рис. 6. Гистограммы, характеризующие интенсивность люминесценции ядер интактной печени через 2,5 ч после (а) и до (б) гепатэктомии [49]. По оси абсцисс – отношение интенсивности люминесценции отдельных ядер печени через 2,5 ч после (IОП) и до операции (IК) к средней интенсивности люминесценции ядер до операции в каждом опыте (ĪК); по оси ординат – количество клеток. Окрашено акридиновым оранжевым. нормированных таким образом величин интенсивностей зеленой (λ==530 нм) люминесценции ядер клеток печени, окрашенных акридиновым оранжевым, отражают, по-видимому, распределение концентрации ДНК в данном объекте [49]. Интересно отметить, что по форме гистограмма интактной печени (рис. 6, б) ближе к гистограмме, характерной для синхронизированной культуры клеток (рис. 5, б). Частичная гепатэктомия приводит, по-видимому, к ослаблению тканевой регуляции интенсивности деления клеток, и гистограмма их ядер (рис. 6, а) становится близкой по форме к гистограмме распределения ДНК в ядрах свободно растущей культуры клеток (рис. 5, а). В общем же случае при изучении динамики концентраций веществ в клетке в процессе изменения ее состояния, по-видимому, нельзя пренебречь изменениями ее рассеивающих свойств (а следовательно, d) в этом процессе. Например, увеличение синтетической активности клетки может сопровождаться ростом в ней числа рибосом, что приведет к увеличению интенсивности люминесценции флуорохрома, специфически связывающегося с РНК не только за счет увеличения концентрации РНК в клетке, но и за счет увеличения длины пути возбуждающего излучения d в препарате в результате увеличения в нем количества рассеивающих частиц (рибосомы, мембраны эндоплазматического ретикулума и т. д.). Поэтому учет изменения рассеивающих свойств объекта в общем случае остается необходимым, что методически приводит к переходу на двух- или многоканальную регистрацию интенсивности люминесценции в двух или более спектральных интервалах или на регистрацию спектра люминесценции объекта. Принципиальная схема микроспектрофлуориметра - прибора, предназначенного для регистрации спектров люминесценции одиночных клеток и их участков, - приведена на рис.7. Ее основная часть представляет собой комбинацию люминесцентного микроскопа (рис. 7, 1—10) с интерференционной светоделительной пластинкой (см. рис.3, II), диспергирующей системы (8, 11, 12) и регистрирующего устройства (13, 14), а также не показанных на схеме источников питания. Что касается двух дополнительных систем (15—21), то они предназначены именно для контроля рассеивающих свойств препарата в исследуемой области. Работа микроспектрофлуориметра осуществляется следующим образом. Из сформированного коллекторной линзой (2) излучения источника (1) узкополосным фильтром (3) вырезается возбуждающее излучение в узком спектральном диапазоне λ1. Это излучение отражается интерференционной светоделительной пластинкой (4) и фокусируется микрообъективом (5) на объект исследования (6), вызывая его люминесценцию. Люминесцентное излучение объекта собирается микрообъективом (5) и, проходя через интерференционную пластинку (4), формирует на поверхности сферического зеркала (8) люминесцентное изображение микрообъекта (6), которое визуально изучается с помощью системы, состоящей из окуляра (10) и зеркала (9). Между интерференционной пластинкой (4) и зеркалом (8) размещается широкополосный светофильтр, отрезающий отраженное и рассеянное микрообъектом возбуждающее излучение λ1. На поверхости сферического зеркала (8) имеется свободный от отражающего покрытия участок - зонд. Поэтому люминесцентное излучение, создающее изображение клетки, совмещенное с зондом, свободно проходит через зондовое отверстие в диспергирующую систему (обычно монохроматор) для спектрального анализа. При этом отверстие зонда служит не только полевой диафрагмой микроскопа, ограничивающей размеры анализируемого участка микрообъекта (6), но и входной щелью монохроматора (12). За выходной щелью монохроматора размещается приемник излучения (13) (обычно - фотоэлектронный умножитель), выходной сигнал которого (в случае необходимости - через усилитель-согласователь) подается на ось Y двухкоординатного самописца (14), развертка Х которого тем или иным способом синхронизирована с разверткой монохроматора (12). При включении развертки монохроматора на самописце регистрируется спектр люминесценции участка микрообъекта (6), изображение которого совмещено с зондом в зеркале (8). Рис. 7. Принципиальная схема флюориметра микроспектро- источник возбуждающе- го 11, 16 – плоские зеркала; – окуляр; излучения; 8 – коллекторные лин-зы; – монохроматор; 20 – светофильтры воз- 21 – фотоумножитель; буждения; – двухкоординатный светоделительная пластина самописец; с интерференционным – конденсор; – узкополосный покрытием; микрообъектив; светофильтр препарат; вспомогательного запирающий светофильтр; освещения; 8 – сферическое зеркало 19 – лампа накаливания. зондовой системы; Для учета изменения рассеивающих свойств препарата в такой системе (или в ее упрощенной модификации - микрофлуориметре, когда монохроматор (12) заменен узкополосным светофильтром, пропускающим в максимуме излучения люминесценции) можно воспользоваться измерением интенсивности проходящего через микрообъект (6) возбуждающего излучения λ1. С этой целью прошедшее через объект (6) излучение собирается конденсором (15) и с помощью поворотного зеркала (16) через светофильтр (20), пропускающий излучение с длиной волны λ1, направляется на фотоумножитель (21) для преобразования в электрический сигнал. В дальнейшем этот электрический сигнал может быть использован либо для постоянного контроля как поглощения и рассеяния возбуждающего излучения в объекте (6), так и стабильности источника (1), либо для автоматической компенсации изменения этих величин. Несколько меньших затрат требует другой способ контроля рассеивающих и поглощающих свойств препарата, который заключается в использовании дополнительного стабильного источника света (19) (обычно - лампа накаливания). При этом из светового потока источника (19), сформированного коллекторной линзой (18), узкополосным (обычно интерференционным) светофильтром (17) вырезается узкая полоса, лежащая в свободной от полос люминесценции (λ2 , λ3 на планшете 14, рис.7) области спектра (λ4). С помощью поворотного зеркала (16) и конденсора (15) это дополнительное излучение фокусируется на микрообъект (6) и, проходя через него, примешивается к люминесцентному излучению объекта и потому регистрируется в виде узкой полосы в соответствующей области спектра (λ4). Интенсивность этой полосы характеризует рассеяние и поглощение в объекте (6) и степень стабильности регистрирующей системы (13, 14). Таким образом, учет изменения в препарате длины оптического пути d возбуждающего люминесценцию излучения, причиной которого может быть изменение как рассеивающих свойств препарата, так и его толщины, а также учет возможной нестабильности измерительной системы в целом приводит к значительным усложнениям техники и методики эксперимента, не гарантируя полностью при этом высокую точность измерений. Поэтому представляется заманчивым такое построение эксперимента, при котором перечисленные выше факторы перестают оказывать влияние на точность результатов измерения. Эта возможность возникает, в частности, когда необходимо знать не столько изменение (в относительных единицах) концентрации каких-либо химических компонентов клетки, сколько изменение соотношения концентраций этих соединений при развитии того или иного внутриклеточного процесса. Например, одной из важных характеристик состояния клетки может служить отношение концентраций РНК/ДНК (т.е. количество РНК, синтезируемой на единицу ДНК), которое может рассматриваться как количественная характеристика интенсивности синтетических процессов в клетке. При этом можно независимо измерить концентрации РНК и ДНК и путем деления получить величину искомого параметра. Однако предпочтительнее произвести одновременное измерение в одном и том же препарате непосредственно отношения концентраций двух представляющих интерес внутриклеточных соединений. Преимущества такого построения эксперимента вытекают из анализа уравнения (9'). Действительно, если в одном и том же объекте двумя флуорохромами с достаточно далеко расположенными максимумами излучения пометить два изучаемых биополимера, то спектр люминесценции исследуемого участка такого объекта будет иметь вид двугорбой кривой, приведенной на рис. 8. Рис. 8. Схема двухволнового метода регистрации. При этом интенсивности люминесценции одного из участков клетки в максимумах излучения λ1 и λ2 будут определяться согласно уравнению (9'): Iлλ1 = Iо А1 k1c1d1 ; Iлλ2 = Iо А2 k2c2d2 (10) Тогда, учитывая, что d1 = d2 , отношение интенсивностей люминесценции 1лλ1 / 1лλ2 = А1 k1 / А2 k2 ⋅ c1/ c2 (11) при использовании флуорохромов с постоянным квантовым выходом оказывается пропорциональным отношению концентрации флуорохромов, связанных с биополимерами, и не зависит от интенсивности возбуждающего люминесценцию излучения Iо и длины оптического пути этого излучения в препарате. Изменение любого из этих параметров приведет к одновременному изменению амплитуды обеих полос люменесценпии (рис. 8, 2), однако не скажется на величине их отношения. Только изменение соотношения концентрации красителей (а стало быть, помеченных ими веществ) приведет к изменению соотношения интенсивностей полос люминесценции Iлλ1 и Iлλ2 (рис. 8, 3). Аналогичным образом может быть поставлен эксперимент с тремя и более флуорохромами-метками. При этом вопросы экранирования, реабсорбции и миграции энергии с одного красителя на другой подлежат рассмотрению для конкретной ситуации того или иного метода. Флуорохромы с постоянным квантовым выходом люминесценции являются основными красителями, используемыми обычно в классической люминесцентной цитохимии, когда основная задача заключается в установлении концентрации тех или иных биополимеров клетки. В качестве примера могут быть названы флуоресцеин, акридиновый оранжевый, эозин и т. д. В то же время существуют красители, квантовый выход которых сильно меняется при связывании их с различными компонентами клеточных структур и зависит от окружения. Такого типа люминесцентные метки оказываются наиболее удобными при изучении не столько концентрации биополимера, сколько его структурного состояния и имеют большое значение в исследовании молекулярной организации различных функциональных механизмов клетки. Примером люминесцентных меток с переменным квантовым выходом может служить широкоизвестный АНС (8-анилено-1-нафталено-сульфонат). Свойство этого красителя, заключающееся в резком увеличении квантового выхода люминесценции (в 20 - 100 раз) при абсорбции его на гидрофобную область белков [50], было использовано для изучения конформации молекулы гемоглобина, наблюдения локальных деформаций мышечных белков [51 - 52], определения локализации гидрофобных участков в саркомере поперечно-полосатой мышцы [53, 54] и наблюдения изменения структуры мембран митохондрий [55 - 56] и нервных волокон [57]. Меток этого типа довольно много, и АНС не является единственным в своем роде. Такие красители, как этидиум бромид, тетрациклин, аурамин, мероцианины и др., с успехом применяются при изучении молекулярной организации функциональных механизмов клетки [58 - 63]. Даже красители с постоянным квантовым выходом люминесценции могут приобрести способность к изменению квантового выхода за счет миграции энергии на близко расположенную молекулу - акцептор. При этом перемещение акцептора относительно донора может давать информацию о структурных изменениях макромолекулы, на которой адсорбирована такая пара взаимодействующих меток. В этих случаях естественно стремление к тому, чтобы концентрация красителя с переменным квантовым выходом оставалась постоянной величиной и в правой части уравнения (9') было не более двух переменных k и d. Однако и в этом случае методика эксперимента должна предусматривать контроль постоянства концентрации с люминесцентной метки. Наиболее надежным методом такого контроля является, конечно, измерение концентрации по поглощению света в максимуме полосы поглощения красителя. С этой же целью может быть использована регистрация прошедшего через исследуемый участок объекта возбуждающего его люминесценцию излучения (см. рис.7), хотя длина волны этого излучения не всегда совпадает с максимумом полосы поглощения красителя. Глава 2. Собственная люминесценция клеток Любая клетка живого организма обладает собственной люминесценцией, которая обязана своим происхождением различным компонентам ее структуры и метаболизма [9]. Собственная люминесценция лежит в основе ряда исключительно ценных методов исследования процессов внутриклеточной регуляции [8-10, 64-66]. В то же время она может служить источником помех и ошибок при изучении функциональных механизмов клетки с помощью люминесцентных меток, так как в ряде случаев интенсивность собственной люминесценции оказывается сравнимой по величине с интенсивностью так называемой вторичной люминесценции, вызванной введением в клетку экзогенных красителей-меток. Количество люминесцирующих эндогенных соединений в клетках велико, и в рамках данной монографии нет возможности полно рассмотреть этот вопрос. Представляется, однако, необходимым привести ряд примеров, показывающих, что, по сути дела, в любой области спектра лежат полосы излучения эндогенных люминесцирующих соединений. 2.1. Спектральные характеристики собственной люминесценции клеток Ультрафиолетовая люминесценция. Утверждение о наличии собственной люминесценции у любых клеток связано, прежде всего, с составляющими их основу белками, обладающими люминесценцией в ультрафиолетовой области спектра [10, 67]. При воздействии на клетку излучения с длиной волны в области 280 нм (полоса поглощения белков) наблюдается полоса излучения, максимум интенсивности которой лежит в области 330-350 нм (рис. 9). Как было Рис. 9. Спектры УФ-люминесценции клеток мышцы (1), нейронов (2), клеток печени (3), эритроцитов (4) [68]. установлено [68-72], ответственными за ультрафиолетовую люминесценцию белков являются входящие в их состав ароматические аминокислоты - триптофан, тирозин и фенилаланин. Индивидуальный спектр люминесценции каждой из этих аминокислот различается по положению максимума излучения (рис. 10). Поэтому можно было бы ожидать, что спектры УФ-люминесценции различных белков также будут иметь несколько различающиеся по положению максимумов спектры люминесценции в соответствии с относительным содержанием той или иной ароматической аминокислоты. Однако то обстоятельство, что квантовый выход люминесценции триптофана намного выше квантового выхода тирозина и фенилаланина, приводит обычно к преобладанию полосы излучения триптофана в суммарном спектре ультрафиолетовой люминесценции клетки. Рис. 10. Спектры люминесценции аминокислот в нейтральном водном растворе при комнатной температуре [72]. 1 – триптофан; 2 – тирозин; 3 – фениланин. Наиболее яркой УФ-люминесценцией в клетке характеризуются сократительный аппарат [73, 74], митохондрии [75-77], ядрышки [78] и некоторые другие структуры цитоплазмы. Интенсивность УФ-люминесценции зависит от физиологического состояния клеток и меняется при различных воздействиях, в том числе и при ионизирующем облучении животных [79-82]. Специально проведенные исследования с применением специфических ингибиторов дыхания показали, что характер ультрафиолетовой люминесценции митохондрии в значительной мере определяется соотношением восстановленной и окисленной форм дыхательных ферментов и отражает функциональное состояние митохондрии [83, 84]. Учитывая, что квантовый выход люминесценции ароматических аминокислот не остается постоянным, а довольно сильно зависит от свойств окружения [10, 15, 16], исследования Уфлюминесценции могут служить основой для разработки разнообразных методов слежения за изменениями структуры белковых молекул при их функционировании в клетке [85]. Весьма перспективным оказалось, в частности, применение поляризованной УФ-люминесценции при изучении особенностей конформационных изменений белков в структуре саркомера поперечнополосатой мышцы в покое и при сокращении. Была установлена [86-88] существенная анизотропия в расположении триптофановых остатков сократительных белков в А- и -зонах саркомера. Оказалось, что в А-зоне триптофановые остатки белков преимущественно ориентированы вдоль оси мышечного волокна, в то время как в I-зоне они ориентированы преимущественно перпендикулярно. При сокращении мышцы уменьшается поляризационная анизотропия обеих зон. Это свидетельствует о существенном уменьшении степени ориентации триптофановых остатков белков мышечного волокна при сокращении. Синяя и желтая область спектра. Количество веществ, люминесцирующих в этой области, достаточно велико [9], но только с некоторыми из них мы неизбежно сталкиваемся при изучении любых клеток. К числу этих веществ следует, прежде всего, отнести такие важнейшие, встречающиеся у любых представителей живой природы компоненты систем энергетического обмена, как восстановленные пиридиннуклеотиды (НАД⋅Н, НАДФ⋅Н) и окисленные флавопротеины (ФП). Как следует из приведенной на Схеме метаболизма [89], пиридиннуклеотиды и флавопротеины находятся в различных участках энергопроизводящих систем клетки: гликолизе, пентозофосфатном цикле, цикле Кребса, системе окисления жирных кислот и различных путях терминального окисления. Восстановленные формы НАД и НАДФ обладают характерными спектрами поглощения, состоящими из двух полос в УФ-области (260 и 340 нм), и полосой собственной люминесценции, максимум которой лежит в интервале 465÷480 нм (рис. 11). При переходе НАД и НАДФ в окисленное состояние они теряют полосу поглощения 340 нм и способность к люминесценции (Схема метаболизма), как это было установлено Варбургом [90]. При связывании НАД и НАДФ с их дегидрогеназами максимум полосы люминесценции сдвигается в сторону более коротких длин волн до 440 нм, и ее интенсивность возрастает [91]. Производные рибофлавина - флавинмононуклеотид (ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД) [9] - являются простетическими группами многих флавопротеиновых компонентов (Схема метаболизма). систем терминального окисления. Окисленные формы ФМН и ФАД обладают характерными спектрами поглощения (рис. 12) и собственной люминесценции [92]. При переходе этих групп в восстановленное состояние они теряют полосы поглощения 450 нм и собственной люминесценции [93]. Присоединение ФМН и ФАД к белковой части молекулы фермента приводит к изменению спектра поглощения, различному для разных флавопротеинов. Наиболее часто, однако, в видимой области происходит сдвиг полосы поглощения от 450 до 455÷ 465 нм и появляется характерное плечо на кривой поглощения в области 480÷490 нм (рис. 13, б). При этом флавиновая группа может утратить способность к аутоокислению и потерять полностью или частично собственную люминесценцию. Примером не люминесцирующих или слабо люминесцирующих флавопротеинов могут служить глюкозооксидаза и ксантиноксидаза. Интенсивность люминесценции ФМН и ФАД уменьшается при связывании их с апоферментами таких флавопротеинов, как оксидаза D-аминокислот (Фп6), электронно-транспортные флавопротеины (Фп4 и Фп5) и цитохром b5 -редуктаза (Фп7) (Схема метаболизма). Рис. 11. Спектры поглощения (а) и люминесценции (б) НАД. А – спектры поглощения водного раствора НАД в окисленной (1) и восстановленной (2) формах [91]; б – нормированный спектр люминесценции НАД в восстановленной форме в этиловом спирте. Исключением является ЛДГ - липоилдегидрогеназа (Фп1), в которой на одну молекулу апофермента приходятся две простетические группы типа ФАД. Интенсивность люминесценции этого флавопротеина примерно в три раза превышает интенсивность люминесценции эквивалентного количества свободного ФАД (рис.13, в) и отличается характерным спектром люминесценции, обладающим помимо основного максимума (530 нм) плечом (540 нм) [92]. Физико-химические характеристики флавопротеинов усиленно исследовались в последние годы [94-98] в связи с возможностью использования их, а также пиридиннуклеотидов в качестве внутриклеточных меток активности энергетического аппарата [65, 98-110]. Этот вопрос будет подробнее рассмотрен в следующем разделе данной главы. Следует, однако, остановиться здесь на том обстоятельстве, что, как это следует из приведенных на Схеме метаболизма данных, множественность входящих в разные участки общей энергетической системы пиридиннуклеотидов и флавопротеинов создает ряд методических трудностей. При люминесцентных спектральных исследованиях клетки в поле зрения прибора оказываются различные органоиды, и поэтому в общем случае регистрируется суммарный спектр, состоящий из полос люминесценции нескольких флавопротеинов и пиридиннуклеотидов, относящихся к разным системам, одна из которых обычно вносит основной вклад. В этих условиях люминесцентный спектральный анализ перестает быть чисто физическим методом и используется скорее как индикаторный инструмент при проведении своего рода функциональной диагностики спектра по результатам действия на исследуемую клетку различными биохимическими и физическими факторами, такими, как перевод клетки из аэробного в анаэробное состояние, действие на нее специфических субстратов и ингибиторов окислительных систем, изменение физиологического состояния и т. д. [65]. Рис. 12. Спектры поглощения (а, б) и люминесценции (в) флавинов и флавопротеинов. а: 1 – окисленная форма ФАД, 2 – восстановленная форма ФАД; б, в: 1 – окисленная форма ФАД, 2 – окисленная форма липоилдегидрогеназы (ЛДГ). Это означает, что если даже мы полностью уверены (электронно-микроскопический контроль, морфология и т.д.), что в поле зрения микроспектрофлуориметра локализованы в основном митохондрии и зарегистрированный спектр люминесценции соответствует ожидаемому для митохондриальной системы терминального окисления (Схема метаболизма), то только после изучения изменения этого спектра при действии специфических именно для этой (митохондрии) системы ингибиторов (амитал, ротенон, цианистый калий и т.д.) и субстратов (например, сукцинат) можно идентифицировать структуру как митохондриальную. Некоторые приемы такого типа будут также рассмотрены ниже. Среди других, люминесцирующих в синей и желто-зеленой областях спектра соединений при исследовании клеток животных можно встретить различные витамины и продукты метаболизма, в том числе пиридоксали, фолиевую кислоту и ее производные и т.д. [9]. Яркой люминесценцией, например с максимумом излучения 480 нм [111], обладает витамин А (рис.13). Характерной особенностью этого соединения является быстрое фотовыцветание - снижение интенсивности люминесценции под действием возбуждающего ее УФ-излучения, что может быть использовано для его индентификации в ткани. Рис. 13. Спектры возбуждения (а) и люминесценции (б) раствора ацетата витамина А до (1) и после (2) УФ-облучения и изменение интенсивности люминесценции при УФ-облучении (в). Спектр возбуждения регистрировался в длине волны 480 нм, спектр люминесценции – при возбуждении излучения 340 нм. Гранулы внутриклеточного пигмента старения - липофусцина (которые в последнее время предложено называть каротиноксисомами [65]) - обладают собственной люминесценцией, цвет которой может варьировать от желтого до оранжевого. Спектры люминесценции срезов коры головного мозга молодых крыс (рис.14, а, 1) содержат два максимума излучения. Один из них (480 нм) принадлежит восстановленным пиридиннуклеотидам, в то время как другой (520 нм) обязан своим происхождением окисленным флавопротеинам. Цвет люминесценции срезов голубоватобелесый без каких-либо включений. В отличие от этого на срезах коры головного мозга старых крыс на голубовато-белесом фоне люминесценции наблюдаются липофусциновые гранулы разного размера и формы, люминесцирующие ярко-желтым светом. Рис. 14. Спектр собственной люминесценции: а – срезов коры головного мозга молодых (1) и старых (2-4) крыс; б – клеток корня моркови (1); нулевая линия препарата (2). Соответственно этому в спектрах люминесценции ткани старых животных, кроме полос излучения восстановленных пиридиннуклеотидов (480 нм) и окисленных флавопротеинов (520 нм), появляется дополнительная полоса излучения с максимумом 560-565 нм (рис. 14, а, 2). В том случае, когда липофусцин занимает значительную часть поля зрения, этот максимум увеличивается (рис.14, а, 3) и становится преобладающим в спектре (рис.14, а, 4) [112-116]. Возможно, что люминесценция липофусциновых гранул обязана своим происхождением каротиноидам [115], являющимися важнейшей составной частью этих гранул [65, 114, 117]. Сходные по форме и положению максимумов излучения спектры люминесценции регистрируются и у каротиноидсодержащих гранул клеток корня моркови (рис.14, б) и нейронов моллюска большого прудовика [115]. Спектры люминесценции отдельных гранул липофусцина (рис.15) состоят из полос люминесценции нескольких соединений. Вариации относительных интенсивностей этих полос определяют форму Рис. 15. Спектры собственной люминесценции. 1, 2 – гранулы липофусцина в нейронах головного мозга коровы (8-10 лет); 3 – каротиноидсодержащие гранулы (каротиноксисомы) в нейронах моллюска; 4 - β-каротин в масле (аптечный препарат). Длина волны возбуждения 365 нм. результирующего спектра люминесценции и цвет свечения самих гранул, который может изменяться от ярко-желтого (рис.15, 1) до красновато-бурого (рис.15, 2). Основной максимум при этом совпадает с максимумом спектра люминесценции раствора β-каротина в масле (рис.15, 4) [112—113]. При этом не исключена возможность, что среди входящих в состав липофусциновых гранул люминесцирующих соединений имеются и переокисленные ненасыщенные жирные кислоты [118]. При проведении исследований на фиксированных препаратах с применением флуорохромов не следует забывать, что действие фиксатора приводит к появлению в препарате люминесценции, интенсивность которой может оказаться сравнимой с интенсивностью излучения используемого флуорохрома и явиться, таким образом, источником методических ошибок. Например, при использовании фиксирующих смесей, содержащих формалин, возникает достаточно яркая люминесценция клеток в желто-зеленой области спектра. Это, с одной стороны, создает помехи для применения флуорохромов с невысоким квантовым выходом, а с другой - может служит основой для разработки специальной люминисцентно-цитохимической реакции, выявляющей биогенные моноамины, продукты взаимодействия которых с формальдегидом и являются причиной появления люминесценции в области 480-520 нм. Такую реакцию можно проводить на лиофилизированном материале в парах формальдегида (известный метод Фалька [119-120]) либо непосредственно при фиксации живых клеток водными растворами формальдегида [121]. Красная область спектра. В тканях животных люминесценция в красной области спектра чаще всего связана с присутствием порфиринов [122, 123] в живых клетках. Порфириновая структура, обладающая яркой и характерной люминесценцией (рис.16), лежит в основе простетических групп таких широко распространенных соединений, как цитохромы, пероксидаза, каталаза, гемоглобин и миоглобин. В гемопротеинах люминесценция «погашена» присутствием атома железа. Однако в клетках с высокой скоростью синтеза этих соединений могут присутствовать значительные количества порфиринов, являющихся промежуточным продуктом в синтезе гема. С другой стороны, патологические нарушения в обмене гемосодержащих соединений, например в результате некоторых отравлений [124, 125], также могут приводить к появлению характерной люминесценции порфиринов в клетках и служить, таким образом, важным диагностическим тестом. Рис. 16. Спектр люминесценции гематопорфирина в эритроцитах, обработанных концентрированной кислотой. Длина волны возбуждения 436 нм. Интересные возможности слежения за физиологическим состоянием некоторых микроорганизмов открываются при изучении в них обмена порфиринов. Прямой регистрацией спектров люминесценции порфиринов в популяции дрожжей Candida quilliermondii было установлено [126], что в процессе основного цикла ферментации, когда в аппарат (ферментер) поступает необходимое количество субстрата (нормальные углеводороды, соли и микроэлементы), в дрожжах накапливаются порфирины с основным максимумом люминесценции около 625 нм (рис. 17, а). Во второй же стадии процесса ферментации, характеризующейся прекращением поступления субстрата, в дрожжах синтезируются порфирины с основным максимумом люминесценции около 580 нм. Параллельный подсчет мертвых клеток в популяции показал, что количество их пропорционально интенсивности флуоресценции порфиринов в области 580 нм (рис.17, б). Авторы пришли к выводу, что в нормально растущих дрожжах накапливаются свободные формы копропорфирина III и протопорфирина IX (табл.1). При этом концентрация копропорфирина III в 5-10 раз превышает концентрацию протопорфирина IX (рис.17, а). При повреждении же дрожжевых клеток в условиях голодания, инактивирующего действие нагревания, блокирования дыхательной цепи и т. д., происходит накопление хелатных комплексов копропорфирина III и протопорфирина IX с цинком, содержащимся в среде культивирования в качестве микроэлемента, что и приводит к наблюдаемому изменению спектра люминесценции клеток (рис.17, б) [127]. Обнаруженная закономерность послужила основой способа определения жизнеспособности дрожжей - продуцентов в микробиологическом синтезе [128]. Рис. 17. Спектры люминесценции нормально растущих (а) и голодающих (б) дрожжей [127]. Таблица 1 Спектральные характеристики некоторых порфиринов Соединение Раство -ритель Копропорфирин III Эфир Протопорфирин IX » Копропорфирин III 0,1н.НС дикатион l Протопорфирин IX 1,5н.НС дикатион 1 Zn-Копропорфирин III Zn-Протопорфирин IX Положение максимумов, нм люминесценция возбуждение 401, 531, 498, 573 625, 690 635, 700 408, 538, 506, 580 595, 651 400, 548 поглощение 392, 568, 495, 623, 528, 403, 575, 504, 633, 535, 400, 547, 590 606, 662 410, 560 407, 554, 600 578, 628 588, 638 409, 542 418, 550 407, 540, 576 417, 548, 585 Необходимо отметить, что при обработке тканей животных некоторыми фиксаторами может происходить отрыв атома железа от простетической группы ряда внутриклеточных гемопротеинов (например, миоглобина). В результате на месте локализации этих соединений появляется характерная люминесценция порфиринов [122], что необходимо учитывать при работе с флуорохромами, люминесцирующими в этой области спектра. Реакция может быть использована также и для разработки цитохимического метода выявления некоторых гемопротеинов в клетках животных. Именно этот прием используется, например, в криминалистике для обнаружения отдельных эритроцитов по их порфириновой люминесценции после обработки объекта серной кислотой. Особенно широко распространены люминесцирующие в красной и желто-оранжевой областях спектра соединения (хлорофиллы и фикобилины) в клетках растений и водорослей. При этом представители разных типов имеют различающийся набор хлорофиллов и фикобилинов [129-131] (рис.18). Учитывая, что каждое из этих соединений имеет характерное для него положение максимумов в спектрах поглощения и люминесценции [132-135] (табл. 2), можно ожидать, что и суммарные спектры люминесценции клеток (например, водорослей), относящихся к разным типам, будут различаться между собой. Действительно, спектры люминесценции одиночных клеток красной водоросли Ceratium rubrum (рис.19, 2) отличаются от спектров зеленой (рис.19, 3) и бурой (рис.19, 1) водорослей прежде всего присутствием двух дополнительных полос излучения с максимумами 585 и 640-660 нм, принадлежащих характерным для этих растений фикоэритрину и фикоцианинам, отсутствующим у бурых и зеленых водорослей. В то же время положения основного максимума люминесценции хлорофиллов у них совпадают, отражая то обстоятельство, что хлорофилл а является общим основным пигментом этих растений (рис.18). a b c c1 c2 d Clorophyceae V Euglenophyceae VI Xanthophyceae IIIb Eustigmatophyceae IIIa Chrysophyceae IIIb Haptophyceae IIIb Pheophyceae IIIb Bacillariophyceae IIIb Dinophyceae IIIa Cryptophyceae II Rhodophyceae I Cyanophyceae I Рис. 18. Пигментный состав и структурная организация тилакоидов хлоропластов у водорослей разных типов C- фикоцианин C-фикоэритрин Аллофикоцианин R-фикоцианин Хлорофилл R-фикоэритрин Тип тилакоида Тип Таблица 2 Положение полос люминесценции (в нм) пигментов растений в растворе [132—135] и в плетке Соединение Хлорофилл а Хлорофилл b Хлорофилл с Хлорофилл Бактериохлорофилл Хлоробиум-хлорофилл . R-фикоэритрин С-фикоэритрин R-фикоцианин С-фикоцианин Аллофикоцианин Раствор 669, 723 649, 708 629, 690 696, 752 805 653 578 575 565, 637 647 660 Клетка 678 — — — — — 572 — 640 643 660 Примечание рис. 21, 3 — — — — — рис. 21,2; 22, 2 — рис. 22, 3 рис. 23,б, 2 рис. 22, 2 Хлорофиллы – раствор в этиловом эфире: фикобилины – водный раствор По-видимому, пигментный состав, а следовательно, и спектральные, в том числе люминесцентные, характеристики одноклеточных водорослей являются более вариабельными, чем у клеток многоклеточных водорослей (рис.19), и в большей степени зависят от условий обитания, возраста и т. д. Однако по приведенным на рис.20 спектрам люминесценции одиночных клеток одноклеточных зеленых, синезеленых, красных и диатомовых водорослей можно, пользуясь сравнением с данными рис.18, установить положение полос люминесценции в живых клетках только некоторых пигментов. Наиболее четко при этом выделяется полоса излучения 572 нм (рис.20, 2), принадлежащая R-фикоэритрину, характерному для красных водорослей (рис.18). Что касается полос излучения хлорофиллов, лежащих в области 670÷690 нм, то кривая 3 (синезеленые) должна отражать присутствие только хлорофилла а, в то время как спектры 1 (зеленые), 2 (красные) и 4 (диатомовые) должны содержать полосы излучения смеси хлорофиллов: a+b, a+d, a+c1+c2 соответственно (рис.18). Поэтому можно полагать, что основная полоса излучения хлорофилла а в относительно «чистом» виде наблюдается в спектре синезеленых водорослей (рис.21, 3) и ее максимум лежит в области 678 нм. Для определения максимумов других хлорофиллов требуется более тонкий анализ. Рис. 19. Спектры люминесценции клеток бурой (1 – Cystoseira barbata), красной (2 – Ceratium rubrum) и зеленой (3 – Ulva lactuca) морских водорослей. Длина волны возбуждения 365 нм. Рис. 20. Спектры люминесценции одиночных клеток зеленых (1 – Scenedesmus quadricauda), красных (2 – Porphyridium cruentum), синезеленых (3 – Microcystis aeruginosa) и диатомовых (4 – Biddulphia mobiliensis) одноклеточных водорослей. Длина волны возбуждения 436 нм. Дополнительные сведения могут быть получены при изучении изменений спектральных характеристик клеток под действием тех или иных факторов. Простейшим в методическом отношении случаем, по-видимому, является изменение спектров во времени под действием интенсивного светового облучения. Приведенные на рис.21 данные позволяют по мере «выгорания» части компонентов спектра установить положение максимумов излучения, маскировавшихся ранее. Так, например, по спектру 2 можно определить максимум люминесценции аллофикоцианина (660 нм) и уточнить положение максимума R-фикоэритрина (572 нм). Дальнейшее облучение приводит к «выгоранию» аллофикоцианина, и положение максимума излучения R-фикоцианина (640 нм) становится доступным для определения (рис. 21, 3). Рис. 21. Изменение спектра люминесценции одиночной клетки красной водоросли Porphyridium cruentum (1) через 1 (2), 2 (3) и 3 (4) мин облучения светом с длиной волны 436 нм. Длина волны возбуждения 436 нм. Динамика спектров люминесценции синезеленой водоросли в процессе старения популяции (рис. 22) указывает на значительные изменения пигментного состава клеток и позволяет определить положение максимума люминесценции С-фикоцианина (643 нм) в спектре клеток, относящихся к 8месячной популяции (рис. 22, б, 2), в котором исчезают близко расположенные полосы люминесценции других пигментов. Следует обратить внимание и на то обстоятельство, что по мере уменьшения интенсивности люминесценции хлорофилла а (678 нм) наблюдается увеличение интенсивности люминесценции пиридиннуклеотидов (470 нм) и флавопротеинов (520 нм), что указывает, по-видимому, на происходящую по мере старения культуры смену аутотрофного (фотосинтетического) способа энергообеспечения на гетеротрофный. Рис. 22. Спектры люминесценции одиночных клеток синезеленой водоросли Microcystis aeryginosa в разные сроки культивирования: а – 3 (1), 15 (2) и 120 (3) суток культивирования; б – 6 (1), 8 (2) и 9 (3) месяцев культивирования. Длина волны возбуждения 365 нм. Приведенные примеры в какой-то мере показывают перспективность применения люминесцентного спектрального анализа в исследовании физиологии растительных клеток. Следует отметить также, что благодаря чрезвычайно яркой люминесценции (высокий квантовый выход) хлорофиллы используются иногда в люминесцентной цитохимии в качестве специфического красителя - метки жиров. Биолюминесценция. Хотя биолюминесценция (способность клеток некоторых видов животных и микроорганизмов генерировать свет) встречается не очень часто, это явление требует, тем не менее, пристального внимания по ряду причин. 1. Биолюминесценция, несомненно, связана с интимными химическими процессами, протекающими в клетке и ее органоидах, и может быть использована после соответствующего изучения для тонкого анализа физиологического состояния клеток обладающего способностью к биолюминесценции организма. 2. Между молекулярными механизмами ярко выраженной у некоторых рыб, беспозвоночных и микроорганизмов биолюминесценции и так называемым сверхслабым свечением клеток теплокровных животных [136-139] существует, по-видимому, некоторая общность, и изучение биолюминесценции может способствовать более глубокому пониманию процессов, лежащих в основе сверхслабого свечения тканей и клеток животных. 3. Наконец, биолюминесцентные реакции характеризуются высокой специфичностью и участвующие в них вещества могут быть выделены и использованы в качестве хемилюминесцентных меток некоторых химических компонентов метаболизма. Примером тому может служить биолюминесцентная реакция экстракта из светлячков, позволяющая определять концентрацию АТФ в среде [140-142]. По-видимому, наиболее убедительные данные о динамике кальция в процессе мышечного сокращения были получены Эшли и Риджуэем [143], использовавшими фотопротеин медузы Aequorea в качестве хемилюминесцентного реагента на кальций [144-147]. Поиск подобного типа хемилюминесцентных флуорохромов-меток является одним из наиболее перспективных направлений развития люминесцентного анализа функциональных механизмов живой клетки. Явление биолюминесценции широко распространено у организмов самого разного уровня филогенеза [148—153]. Биолюминесцентное излучение может лежать в ультрафиолетовой, синей, зеленой и красной областях спектра [151, 152]. Следует, правда, отметить, что ультрафиолетовая и красная биолюминесценции встречаются редко среди описанных видов. В частности, только у колониальных кишечнополостных Renilla [154] обнаружена ультрафиолетовая компонента в спектре излучения. В видимой области спектра биолюминесценция этих кишечнополостных характеризуется наличием двух максимумов излучения, один из которых (509 нм) является основным. Вторая полоса излучения меньшей интенсивности расположена в области 540-570 нм и регистрируется (рис.23, а, б) в виде плеча [155, 156]. Аналогичная форма спектров биолюминесценции сохраняется и при проведении реакции in vitro с выделенным [157] из тканей фотопротеином. При этом в процессе реакции потребляется О2 и выделяется СО2 [158]. Реакция протекает по схеме, приведенной на рис.24. Рис. 23. Биолюминесценция Renilla reniformis. а – спектры люминесценции целого животного (1) и люминесценции люциферазы (2), выделенной из этого животного [155]; б – зависимость Са2+индуцируемой люминесценции люмисом, изолированных из R reniformis, от кислорода [159]. Рис. 24. Генерация света (hν) при хемолюминесцентном и биолюминесцентном окислении синтетического люциферина [158]. В клетках кишечнополостных биолюминесценция локализована в специальных внутриклеточных гранулах, названных люмисомами [159, 160]. Выделенные люмисомы генерируют свет при добавлении к ним Са2+ в присутствии кислорода (рис.24, б). Следует при этом отметить, что и другие ионы помимо кальция способны стимулировать биолюминесцентное излучение люмисом, хотя и с несколько меньшей эффективностью (см. ниже). Добавленный ион Биолюминесценция, % Са2++ Sr2++Ва2++Со2++Cu2++ Mn2++Zn2++Fe2++La2++Pb2++Mg2++NH4+ +K+ 100 26 1 22 24 31 20 21 6 2 <1 <1 <1 Приведенные на рис.23, б данные указывают на возможность использования биохемилюминесценции фотопротеинов кишечнополостных (в том числе и известного экворина [161-163] и его синтетических аналогов [161]) в качестве реагента не только на внутриклеточный кальций [143], но и на кислород. Желто-зеленая биолюминесценция (рис.23, а) наиболее распространена, хотя у некоторых видов животных, например «железнодорожный червь» и фотофоры на теле кальмара Lycoteuthis diadema, наблюдается биолюминесцентное свечение в красной области. Можно полагать, что биолюминесценция на уровне организма и популяции несомненно имеет определенные поведенческие функции [164]. Однако эти функции являются, вероятно, вторичными, и способность клеток организма к генерации света определяется в первую очередь биохимическими потребностями их энергопроизводящих систем. Экскреция избыточной энергии в виде светового излучения и предупреждение таким образом нежелательных химических реакций в клетке или теплового нагрева ее в некоторых ситуациях может оказаться решающим фактором вообще в существовании клеток и организмов данного типа. Многие системы терминального окисления (Схема метаболизма) имеют своим конечным продуктом перекись водорода Н2О2, которая обычно разлагается до воды с помощью гемсодержащих пероксидаз (рис.25, 4). Рис. 25. Связь биолюминесценции с энергопроизводящими системами окислительного метаболизма клеток Однако дезактивация Н2О2 может происходить и с помощью негемовой пероксидазы, излучающей избыток энергии в виде биолюминесцентного кванта света (рис.25, 2). Реакция типа люцифераза LH2 + Н2О2 ⎯⎯⎯⎯→ L + 2Н2О2 + hν обнаружена у представителя кишечнодышащих Balanoglossus himinesis [165] и у земляного червя Diplocardia longa [166]. Системы терминального окисления этого типа (рис.25, 2, 3, 4) обладают низким КПД и, повидимому, не используются клетками в нормальном режиме, когда энергообеспечение осуществляется за счет работы основной высокоэкономичной, но обычно маломощной системы (рис.25, 1) терминального окисления. Только в условиях напряженного энергетического обмена, когда скорость выработка энергии в основной цепи терминального окисления перестает удовлетворять энергетическим запросам клетки (действие различных физических и химических раздражителей), происходит переключение путей переноса электронов в систему терминального окисления с большей мощностью, но и с меньшим КПД, и может возникнуть необходимость в экскреции неиспользуемой части энергии в виде биолюминесцентного излучения. По-видимому, именно это обстоятельство и является причиной того, что биолюминесценция возникает у многих видов животных как реакция на то или иное раздражение или сопровождает возбуждение животного. В настоящее время трудно определить, обязательно ли присутствие специальной негемовой пероксидазы в системе (рис.26, 2) или эту роль могут выполнять непосредственно сами флавопротеины (рис. 26, 3) и перекись водорода вообще не образуется в этом случае. Красное биолюминесцентное излучение может, по-видимому, возникать, если экскреция энергии происходит с более низкого энергетического уровня цепи переноса электронов, например с уровня цитохромов (рис. 25, 1). При изучении внутриклеточных механизмов биолюминесценции особый интерес в связи с изложенным выше представляет сравнение биолюминесцентных и люминесцентных характеристик клетки с целью установления взаимосвязи механизмов генерации света с окислительным обменом. Такое исследование было выполнено на примере фотогенных клеток гребневика Bolinopsis infundibulum [167] с использованием микроспектрофлуориметра [168] с улучшенными спектральными характеристиками [169]. Возбуждение люминесценции объекта производилось линией излучения 365 нм ртутной дуговой лампы ДРШ-250, выделяемой светофильтром УФС-6. Размеры фотометрируемого участка 20×100 мкм. Во время регистрации спектров биолюминесценции полностью отключался источник ультрафиолетового излучения (ДРШ-250) и на объект подавались прямоугольные импульсы электрической стимуляции c частотой 0,5-1 Гц, вызывавшие световые вспышки той же частоты (рис. 26). Рис. 26. Установка для регистрации спектров биолюминесценции и люминесценции фотогенных клеток гребневника Bolinonsis infundibulum. 1 – микроспектрофлуориметр; 2, 5 – фотоумножители; 3 , 6 – промежуточные усилители; 4, 7 – одноканальные регистраторы. Ввиду того, что при малой частоте (0,5-1 Гц) и длительности (1-5 мс) импульсов электрической стимуляции биолюминесцентные вспышки характеризуются малой дисперсией амплитуды, при включении развертки микроспектрофлуориметра в интервале длин волн от 400 до 700 нм регистрировалась последовательность световых импульсов, огибающая которой представляет собой спектр импульсной биолюминесценции (рис.27, а, 2). В ряде экспериментов применялся параллельный контроль стабильности амплитуды световых вспышек с помощью второго фотоумножителя (рис.26). Для исследования использовали небольшие кусочки фотогенной ткани (1-3 мм), вырезанные из меридиональных рядов гребных пластинок. Препараты приготавливали обычно накануне экспериментов и хранили в чашках Петри при t = 0° 8-12 ч. К началу опытов из этих вырезанных кусочков ткани образовывались сферические агрегации клеток, окруженные венчиком бьющихся гребных пластинок. В отличие от целого животного такие агрегации отвечают на раздражение более или менее стандартными по форме одиночными световыми импульсами. Особенностью биолюминесценции гребневика (и хемилюминесценции выделенного из него фотопротеина) является то, что достаточно интенсивный белый свет полностью инактивирует ее и открывается возможность сравнивать спектральные характеристики фотогенных клеток в двух состояниях - способных к биолюминесценции и не способных (инактивированных белым светом). Биолюминесценция целых гребневиков и агрегаций их фотогенных клеток возникает в ответ на электрическое, механическое или иное стрессирующее раздражение и имеет импульсный характер. При этом форма и длительность световых импульсов более или менее стандартны и не определяются характером стимуляции. При электрическом раздражении животного появление биолюминесцентного импульсного ответа запаздывает (рис.28, а) относительно начала стимуляции, биолюминесцентные импульсы наблюдаются также и после окончания раздражения (рис.28, б). Только при использовании для электростимуляции импульсов достаточно высокой амплитуды и малой частоты их следования (0,5-1 Гц) можно получить биолюминесцентный ответ на каждый стимулирующий импульс. Рис. 27. Спектры биолюминесценции и люминесценции фотогенных клеток гребневника. а – статическая (1) и импульсная (2) биолюминесценция; б – сравнение спектра импульсной биолюминесценции фотогенных клеток (1) со спектрами люминесценции тех же клеток, адаптированных к темноте (2, 3) и после облучения видимым светом в течение 40 мин (4). По оси ординат – интенсивность излучения в отн. ед. по оси абсцисс – длина волны в нм. Длина волны возбуждения люминесценции 365 нм. Рис. 28. Взаимоотношение биолюминесценции (1) и электрической стимуляции (2) фотогенных тканей гребневника. Оказалось, что, как и у многих кишечнополостных (см. рис.23), основной максимум спектра биолюминесценции гребневика лежит в области 505±5 нм и имеется дополнительный максимум излучения 540—570 нм (рис.27, б, огибающая 1). Спектры люминесценции (возбуждаемой УФ-излучением) фотогенных участков агрегаций, находившихся в темноте и способных к биолюминесценции, характеризуются максимумом излучения 490 нм .(рис.27, б, 3). Освещение этих агрегаций ярким видимым светом (15000 люкс) приводит к потере ими способности высвечиваться в ответ на раздражение и сопровождается, как оказалось, изменением спектра люминесценции таким образом, что одновременно с уменьшением полосы с максимумом 490 нм наблюдается увеличение интенсивности полосы с максимумом 465 нм и последний максимум становится основным в спектре (рис.27, б, 4). В ряде случаев на свежеприготовленных препаратах адаптированных к темноте агрегаций регистрируются спектры люминесценции, отличающиеся большой интенсивностью излучения в области 505 нм (рис. 27, б, 2) и совпадающие по положению максимума со спектрами биолюминесценции. Амплитуда таких спектров быстро уменьшается, их максимум смещается в область 490 нм, и сами спектры приобретают обычно регистрируемую форму (рис.27, б, 3). Продолжающееся действие возбуждающего люминесценцию УФ-излучения приводит к дальнейшим изменениям спектра и приближению его к характерной для неспособных к биолюминесценции агрегаций форме (рис.27, б, 4). В то же время ритмические биения ресничек агрегаций не только не подавляются видимым светом в ходе опытов, но, напротив, ускоряются на свету. При добавлении нескольких капель дистиллированной воды в камеру с объектом наблюдается серия вспышек и последующая статическая биолюминесценция, максимум спектра которой совпадает с максимумом спектра импульсного высвечивания (рис.27, а, 1). После прекращения статической биолюминесценции объект длительное время сохраняет способность отвечать импульсами высвечивания, на электрическую стимуляцию. Приведенные данные указывают на то, что биолюминесценция, представляющая собой излучение в пространство определенных порций энергии, развивается параллельно с усилением энергетического обмена клеток в ответ на раздражение. Об изменении энергетического обмена клеток, точнее - терминальной стадии его, свидетельствует значительное изменение их спектров люминесценции под действием света. Веществами, ответственными за полосы люминесценции клеток с максимумами 460-470 и 520-530 нм, относительная интенсивность которых зависит от функционального состояния тканей, являются обычно восстановленные пиридиннуклеотиды (460-470 нм) и окисленные флавопротеины (520-530 нм) систем терминального окисления. Совпадение максимумов спектра биолюминесценции и, по-видимому, полосы люминесценции окисленного флавопротеина, а также резкое уменьшение интенсивности люминесценции этого флавопротеина при световой инактивации биолюминесценции указывает на возможность того, что именно окисленная форма флавопротеина является веществом, ответственным за генерацию биолюминесцентного излучения, и тогда предположительно реализуется система 3 (рис.25). Однако несколько необычное для флавопротеинов положение максимума (505-509 нм) не позволяет исключить существования некоего промежуточного соединения, функцией которого является трансформация химической энергии в световое излучение, аналогичного негемовой пероксидазе системы 2 (рис. 25). Видимый свет подавляет биолюминесценцию клеток, не влияя при этом на их жизнеспособность (о чем свидетельствует нормальное или даже несколько ускоренное биение ресничек). Это позволяет предполагать, что биолюминесценция связана именно с вспомогательной (рис.25, 2, 3), а не с основной (рис.25, 1) системой терминального окисления. Микроскопические наблюдения биолюминесценции и люминесценции агрегаций при увеличениях ×100 - ×1000 показывают, что при электрическом раздражении происходит импульсное высвечивание отдельных внутриклеточных гранул, обладающих участками с интенсивной желтозеленой люминесценцией. Такие овальные гранулы, достигающие 6-8 мкм в диаметре, наблюдаются в клетках, расположенных под гребными пластинками в области меридиональных гастроваскулярных каналов [170-172]. Интересно отметить, что биолюминесцентная система с импульсным высвечиванием представляет собой, по-видимому, систему, аналогичную лазеру с химической накачкой излучающих молекул на возбужденный энергетический уровень. По мере увеличения заселенности возбужденного уровня повышается вероятность перехода одной из молекул в основное состояние с излучением кванта света, который индуцирует развитие лавинообразного процесса перехода остальных молекул в основное состояние, что и приводит к появлению биолюминесцентного импульса. Освещение белым светом подавляет только способность к импульсному высвечиванию, постоянно стимулируя переход молекул с возбужденного уровня на основной. При этом излучается то же, что и ранее, общее количество энергии, но за счет равномерного распределения ее во времени интенсивность непрерывного излучения резко падает. 2.2. Функциональная активность клетки и регуляция энергетического аппарата Среди проблем, решаемых методами микроспектрального анализа, особое место занимают вопросы регуляции энергетического аппарата клетки [23, 64, 65, 173]. Энергетическое обеспечение важнейшая сторона жизнедеятельности живых систем. Любое функциональное проявление от сокращения мышечной клетки и транспорта ионов через мембрану против градиента концентрации до синтеза специализированных белков или нуклеиновых кислот должно быть оплачено поставками энергии из соответствующих энергопроизводящих систем. Биологической основой применения спектральных методов к изучению взаимосвязи энергетических систем клетки с ее функциональными механизмами являются два важных обстоятельства. 1. Спектры поглощения и люминесценции многих ферментов и коферментов сильно зависят от того, в какой (окисленной или восстановленной) форме находятся эти компоненты систем окислительного метаболизма (Схема метаболизма). 2. Благодаря действию соответствующих систем регулирования, соотношение окисленных и восстановленных форм компонентов окислительного метаболизма (т.е. скорость выработки энергии) определяется функциональной активностью клетки. В качестве иллюстрации этого положения на рис.30 представлено соотношение окисленных и восстановленных форм компонентов наиболее хорошо изученной м:итохондриальной системы [174] окислительного фосфорилирования: цитохром с — цитохромоксидаза (Схема метаболизма) для разных функциональных состояний митохондрий. Из этого рисунка следует, в частности, что переход из состояния покоя (состояние 4) в состояние активного обмена (состояние 3) сопровождается увеличением концентрации окисленных форм пиридиннуклеотида (НАД), флавопротеинов (Фп) и цитохромов (а + а3, с1, с, в) и соответствующим уменьшением концентрации их восстановленных форм. Такая же закономерность характерна и для других систем терминального окисления. Как уже отмечалось выше, такие компоненты окислительного метаболизма, как пиридиннуклеотиды и флавопротеины, обладают характерными спектрами люминесценции. Причем, если пиридиннуклеотиды люминесцируют только в восстановленном состоянии (460-480 им) и теряют способность люминесцировать при переходе в окисленное состояние (рис.11), то флавопротеины, наоборот, люминесцируют только в окисленном состоянии, (520-530 нм) и теряют способность к люминесценции при переходе в восстановленную форму (рис.12). Поэтому каждое из приведенных на рис.29 метаболических состояний митохондрий может быть охарактеризовано Рис. 29. Соотношение окисленных (светлые столбики) и восстановленных (темные столбики) форм компонентов дыхательной цепи митохондрий (рис. 11, система 2) в разных функциональных состояниях. Действие ингибиторов приводит к восстановлению компонентов цепи, расположенных левее точки действия ингибиторов, и окислению компонентов, расположенных справа от точки действия ингибитора. спектром люминесценции с различным соотношением интенсивностей полос излучения восстановленных пиридиннуклеотидов (460-480 нм) и окисленных флавопротеинов (520-530 нм). Для иллюстрации возможностей применения метода люминесцентного спектрального анализа при изучении взаимосвязи энергетики и функций живой клетки могут быть рассмотрены результаты исследования рецептора растяжения ракообразных [175]. Особый интерес представляет при этом наличие в препарате рецептора растяжения нервных и мышечных клеток двух типов, значительно различающихся по скорости адаптации их к нагрузке. В состав препарата (рис.30, а) входят два крупных (70-100 мк) механорецепторных нейрона, медленно и быстро адаптирующихся к раздражению. Короткие дендриты этих нейронов оканчиваются на тонких пучках мышц, медленно и быстро адаптирующихся к нагрузке. Аксоны нейронов направляются в соответствующий ганглий брюшной цепочки [176-181]. При спектральных люминесцентных исследованиях такого препарата оказалось, что клетки (нервные и мышечные), различающиеся по скорости адаптации их к нагрузке, характеризуются различными по форме спектрами люминесценции (рис.30, б-г). Положение полос излучения в спектрах и изменение их амплитуды при действии на препарат ингибитора гликолиза моноиодуксусной кислоты (рис.30, д) - и разобщителя окисления с фосфорилированием - 2,4динитрофенола (рис.30, в, г) - позволяет полагать, что люминесценция нейронов и мышц обязана своим происхождением восстановленным пиридиннуклеотидам (470—460 нм) и окисленным флавопротеинам (520 нм) систем окислительного метаболизма. Соотношение интенсивностей полос люминесценции пиридиннуклеотидов и флавопротеинов в спектрах свидетельствует о разном метаболическом состоянии энергосистем исследованных клеток. Медленно адаптирующиеся нервные (рис.30, б) и мышечные (рис.30, в) клетки характеризуются спектрами с примерно одинаковыми интенсивностями полос восстановленных пиридиннуклеотидов (460-470 нм) и окисленных флавопротеинов (520 нм). Такое соотношение окисленных и восстановленных форм компонентов дыхательных систем характерно для тканей, находящихся в состоянии активного обмена (рис.29, 3). Скорость переноса электронов по дыхательной цепи при этом максимально высока, и действие разобщителя окисления с фосфорилированием 2,4динитрофенола практически не меняет соотношения интенсивностей полос ПН — Н2 и ФП (рис.30, в). Наблюдаемое уменьшение амплитуды спектра связано со значительным поглощением возбуждающего люминесценцию излучения слоем раствора 2,4-динитрофенола. Рис. 30. Схема рецептора и спектры люминесценции нейронов и мышц рецептора растяжения речного рака. а – медленно (1) и быстро (2) адаптирующиеся нейроны, медленно (3) и быстро (4) адаптирующиеся мышцы, аксоны (5); б – медленно (1) и быстро (2) адаптирующиеся нейроны; в – медленно адаптирующаяся мышца до (1) и после (2) действия 2,4-динитрофенола в течение 4 мин; г – быстро адаптирующаяся мышца до (1) и после (2) действия 2,4-динитрофенола в течение 4 мин; д – изменение спектра люминесценции быстро адаптирующегося нейрона (1) после действия на препарат моноиодуксусной кислоты в течение 15 (2), 13 (3) и 16 (4) мин. Длина волны возбуждения 365 нм; размер фотометрируемого участка 10×40 мкм. В отличие от этого спектры быстро адаптирующихся нервных (рис.30, б) и мышечных (рис.30, г) клеток характеризуются ярко выраженным преобладанием полос люминесценции восстановленных пиридиннуклеотидов. Такое соотношение окисленных и восстановленных форм компонентов дыхательной цепи характерно для тканей, находящихся в состоянии покоя (рис.29, 4). Введение в препарат 2,4-динитрофенола приводит, как это и должно быть при разобщении окисления с фосфорилированием, к резкому изменению формы спектра люминесценции клеток. Преобладающими при этом становятся полосы люминесценции окисленных флавопротеинов (рис.30, г), а сами спектры приобретают форму, аналогичную форме спектров медленно адаптирующихся тканей (рис.30, б, в), т.е. скорость переноса электронов по дыхательной цепи становится максимально высокой. Приведенные на рис.30, д спектры люминесценции показывают динамику изменения быстро адаптирующегося нейрона (рис.30, а, 2) при введении в препарат ингибитора гликолиза моноиодуксусной кислоты. Наблюдающееся при этом увеличение концентрации окисленных флавопротеинов по отношению к концентрации восстановленных пиридиннуклеотидов свидетельствует, по-видимому, о снижении скорости восстановления флавопротеинов дегидрогеназами цикла Кребса за счет блокирования гликолиза моноиодуксусной кислотой при оставшейся неизменной скорости поступления кислорода в дыхательную цепь. Основываясь на спектрах люминесценции (рис.31), получаемых при возбуждении излучением Рис. 31. Определение параметра ξ. – спектр люминесценции внутриклеточных митохондрий; – нормированный спектр люминесценции раствора НАД Н (1.5⋅10-4 М) в этаноле для определения его вклада в максимуме люминесценции окисленных флавопротеинов (530 нм). Длина волны возбуждения 365 нм; диаметр зонда 10 мкм. с длиной волны 365 нм, удобно количественно внутриклеточных митохондрий параметром [65]. ξ = Ιфп /Ιпн == В/А охарактеризовать степень активности (12) В этом выражении А представляет собой интенсивность люминесценции восстановленных пиридиннуклеотидов (НАД⋅Н) в длине волны 465 нм, а В - интенсивность люминесценции окисленных флавопротеинов, для определения которой необходимо из общей интенсивности люминесценции в длине волны 530 нм (рис.31, 1) вычесть вклад полосы излучения НАД⋅Н в этой длине волны. Поскольку интенсивность люминесценции раствора НАД⋅Н (рис.31, 2) в длине волны 530 нм составляет 0,47 от интенсивности люминесценции этого соединения в максимуме (465 нм) излучения (см. рис.11, б), для определения величины В с достаточной степенью точности можно из общей интенсивности в длине волны 530 нм (Ι530 ) вычитать ½ интенсивности люминесценции НАД⋅Н в максимуме (Ι465). Тогда выражение (12) для определения параметра ξ приобретает вид: ξ= B/A = (Ι530 - 0,5Ι465) /Ι465 , (12’), в котором все величины могут быть измерены по спектру люминесценции внутриклеточных митохондрий (рис.31, 1). Полученный таким образом безразмерный параметр характеризует степень активности митохондрий и, как было показано выше (см. уравнение 11, гл.1), не зависит ни от изменения рассеивающих свойств микрообъекта, ни от изменения таких аппаратурных факторов, как чувствительность регистрирующей системы, интенсивность возбуждающего излучения и т. п. Описываемый препарат рецептора растяжения интересен и в другом отношении. Оказалось [182], что в его механорецепторных нейронах присутствует два пула митохондрий, различающихся по своей энергетической активности. Действительно, при микроскопическом излучении нейронов в свете их собственной люминесценции наиболее высокая плотность люминесцирующих частиц наблюдается в областях, расположенных вокруг ядер механорецепторных нейронов (рис.32, 1, 2). Несколько меньшая плотность таких частиц характерна для областей цитоплазмы, прилегающих к наружноной мембране нейронов. По данным электронной микроскопии, в околоядерной области и в примембранных областях цитоплазмы располагаются скопления митохондрий [183]. При проведении микроспектрофлуориметрических исследований оказалось, что митохондрии, расположенные в различных участках приядерной области, обладают почти идентичными спектрами люминесценции (рис.33, 1-3) и значительно отличаются по форме спектра от митохондрий, локализованных в примембранных областях цитоплазмы (рис. 33, 4-6). Эти примембранные митохондрии, в свою очередь, характеризуются почти одинаковыми по форме (соотношение максимумов излучения) спектрами люминесценции. Присутствие в одной и той же клетке скоплений митохондрий, характеризующихся в один и тот же момент времени разными по форме спектрами люминесценции, указывает на существование в этих клетках отдельных пулов митохондрий, находящихся в разных по своей функциональной активности состояниях. В частности, для медленно адаптирующегося нейрона, приведенного в качестве примера на рис.33, характерна более высокая активность приядерного пула митохондрий по сравнению с митохондриями примембранных областей (рис.33, 3, 5). Не менее часто наблюдается и противоположная ситуация, когда более активными оказываются митохондрии примембранного пула. Рис.32 Рис.33 Рис. 32. Рецептор растяжения речного рака в свете собственной люминесценции. 1-5 – то же, что на рис. 31, а; микроскоп МЛ-4, «синяя» пластинка. Длина волны возбуждения 365 нм светофильтр УФС-6); запирающий светофильтр – (ЖС-3 + БС-8). Рис. 33. Спектры люминесценции приядерной области (1-3) и периферических участков (4-6) цитоплазмы медленно адаптирующего нейрона. Длина волны возбуждения 365 нм; диаметр зонда 7 мкм. Используя введенный выше безразмерный параметр, характеризующий степень активности митохондрий, можно проследить как за распределением степени активности митохондрий в одиночном механорецепторном нейроне, так и за изменением этого распределения при умеренных физиологических воздействиях на клетку. Приведенные на рис.34, а данные показывают, что в то время как митохондрии приядерного пула находятся в состоянии малой активности (ξ=0,6), митохондри примембранного пула аксона характеризуются высокой активностью (ξ = 0,9÷1,3). Умеренное растяжение мышц приводит к увеличению активности как приядерных (ξ == 0,8), так и примембранных (ξ = 1,5÷1,6) митохондрий (рис.35, а, 2). Однако исходное распределение активностей между двумя упомянутыми пулами митохондрий остается в общем неизменным: примембранные митохондрии более активны, чем митохондрии приядерной зоны. Рис. 34. Распределение состояний митохондрий (ξ) в двух клетках (а, б) в норме (1), после растяжения (2) и введения бескальциевой среды (3) в медленно адаптирующем нейроне рецептора растяжения речного рака. Диаметр зонда 7 мкм. По оси ординат – безразмерный индекс ξ состояния митохондрий. Резкое изменение соотношений активностей митохондрий разных пулов наблюдается при замене раствора Харевельда на бескальциевую среду той же тоничности (рис.34, а, 3). При этом степень активности приядерных митохондрий (ξ == 1,7) становится выше, чем у примембранных (ξ = 1,5÷1,6). Еще более четко изменение соотношения активностей митохондрий двух пулов прослеживается в случае, приведенном на рис.34, б. Если в исходном состоянии (рис.34, б, 1) митохондрии приядерного пула (ξ = 0,4) были менее активны, чем митохондрии примембранного пула (ξ ==0,8÷0,85), то после замены среды на бескальциевую наблюдается обратное соотношение. Активность у приядерных митохондрий (ξ = 1,6) становится выше, чем у примембранных (ξ = 0,8÷1,0). По-видимому, именно такое состояние нейронов и зафиксировано на рис. 32. Приведенные данные указывают на существование в одной клетке двух (приядерного и примембранного) пулов митохондрий, обеспечивающих энергией, по-видимому, разные функциональные механизмы, локализованные в области ядра и в примембранных областях нейрона соответственно. В настоящее время нет возможности высказать экспериментально аргументированные суждения о механизме синхронизации активности митохондрий, относящихся к какому-либо из этих пулов. Неясно, обеспечивается ли эта синхронизация только за счет повышения скорости потребления энергии соответствующим функциональным механизмом или в основе наблюдаемого явления лежит наличие связи между митохондриями одного и того же пула. Такая связь может быть как прямой, объединяющей наблюдаемые на электронно-микроскопических срезах митохондрий в единый митохондриальный сросток [184], так и опосредованной через взаимодействие отдельных митохондрий с какой-либо другой системой. В этой связи следует отметить, что имеются данные [185] о непосредственной связи примембранных митохондрий с протяженной системой септального ретикулума, наличие которого является характерной особенностью исследованных механорецепторных нейронов речного рака [183]. Возможно также, что все перечисленные механизмы в той или иной мере вносят свой вклад в наблюдаемую синхронизацию состояния митохондрий, относящихся к одному и тому же пулу. Как видно из приведенных выше данных, параметр активности ξ митохондрий достаточно хорошо описывает поведение системы. Поэтому представляется полезным попытаться более подробно разобраться в биологическом (биохимическом) смысле этого параметра. Согласно уравнению (9), интенсивность люминесценции окисленных флавопротеинов в длине волны 520 нм равна ΙФ = 2,31 ΙоdоεФkФcФ , (13) в то время как интенсивность люминесценции восстановленных пиридиннуклеотидов в длине волны 465—470 нм, измеренная в то же время и в том же участке клетки, составляет ΙПН = 2,31ΙоdоεПНkПНcПН. (14) Тогда выражение для определения ξ принимает вид: ξ = ΙФ / ΙПН = εФkФ / εПНkПН ⋅ cФ / cПН , (15) где ε - молярные коэффициенты экстинкции; k - квантовые выходы люминесценции; cФ концентрация восстановленных концентрация окисленных флавопротеинов; cПН пиридиннуклеотидов. По данным Чанса и Вильямса [174], степень окисленности и восстановленности флавопротеинов и пиридиннуклеотидов меняется в зависимости от функционального состояния митохондрий (рис.30), и потому концентрация окисленных флавопротеинов в уравнении (15) для каждого состояния митохондрий может быть определена как cФi = ηФi СФ , (16) где ηФi — степень окисленности флавопротеинов в данном (i) состоянии; СФ - полная концентрация флавопротеинов в митохондриях, составляющая 0,72 нмоль/1 мг белка [174]. Аналогичным образом определяется и концентрация восстановленных пиридиннуклеотидов для определенного функционального состояния митохондрий: сПНi = ηПНi СПН , (17) где ηПНi - степень восстановленности пиридиннуклеотидов в данном (i) состоянии; СПН - полная концентрация пиридиннуклеотидов в митохондриях, составляющая 3,8 нмоль/1 мг белка [174]. Тогда уравнение (15) для определенного (i) состояния митохондрий принимает вид: ξ = ΙФ / ΙПН = εФkФ / εПНkПН ⋅ 0,72/3,8 ⋅ ηФi /ηПнi (15') или ξi = P ⋅ ηФi /ηПнi, (15'') где Р = 0,2 ⋅ εФkФ / εПНkПН - в первом приближении постоянный множитель. Из сопоставления данных Чанса и Вильямса о соотношении окисленных и восстановленных форм компонентов дыхательной цепи митохондрий и результатов определения ξ для митохондрий нейрона рецептора растяжения (рис.34), приведенных в табл.3, можно видеть, что ξ оказывается практически равным отношению степени окисленности флавинов к степени восстановленности пиридиннуклеотидов и постоянный множитель в уравнении (15'') близок к 1: Р = 0,2εФkФ / εПНkПН ≈ 1, при возбуждении люминесценции излучением с длиной волны 365 нм. Таблица 3 Количественные отношения окисленных пиридиннуклеотидов в митохондриях Функциональное состояние митохондрий [174] 1 Истощение (2) Активное состояние (3) Покой (4) Анаэробиоз (5) флаеопротеинвв и восстановленных ηФ [174] ηПН [174] ηФ / ηПН ξ = ΙФ / ΙПН 0,79 1,0 0,8 0,4 0 0,9 0 0,53 0,99 1,0 0,88 - 1,51 0,6 0 1,6-1,8 0,4-0,6 - Таким образом, регистрация спектров люминесценции одиночных клеток и их органоидов позволяет не только качественно, но и количественно следить за работой энергосистем клетки. Одним из наиболее «простых» объектов для изучения регуляции энергоаппарата клетки ее физиологической активностью [186] являются, по-видимому, клетки поперечно-полосатой скелетной мускулатуры, основная функция которых в организме заключается в преобразовании энергии химических связей питательных веществ в механическую работу. Возможность одновременно с измерением интенсивности люминесценции пиридиннуклеотидов и флавопротеинов регистрировать и функциональную активность мышцы (силу натяжения) значительно облегчает трактовку результатов. В принципе, например, ответственным за изменение интенсивности люминесценции клетки в длине волны 465—470 нм мог бы являться не только митохондриальный НАД⋅Н, но и НАД⋅Н из системы гликолиза, а также и НАДФ⋅Н, как это следует из Схемы метаболизма. Однако в случае мышечной ткани, где концентрация НАДФ составляет только около 3% от общего количества пиридиннуклеотидов [188], учитывая, что квантовый выход НАДФ⋅Н в 3-4 раза ниже такового НАД⋅Н, вкладом НАДФ⋅Н в изменение люминесценции в области 465-470 нм можно пренебречь [101, 102]. Вопрос же о необходимости учета влияния гликолитического НАД⋅Н на люминесцентный сигнал [103, 104] является более сложным. Хотя определенная синхронность разнонаправленного изменения интенсивности люминесценции пиридиннуклеотидов и флавопротеинов (рис.30, г) указывает на митохондриальную природу регистрируемых таким образом пиридиннуклеотидов мышцы (НАД⋅Н), для выяснения этого вопроса потребовались специальные опыты, результаты которых приведены на рис. 35 [189]. Сила натяжения, развиваемая мышцей лягушки при калиевой контрактуре регистрировалась с помощью тензодатчика из электропроводной бумаги [190]. Развитие натяжения (рис.35, а, 1) при калиевой контрактуре в интактной мышце сопровождается двухфазным изменением интенсивности люминесценции пиридиннуклеотидов (рис.35, а, 2). При ингибировании гликолиза моноиодуксусной кислотой изменение люминесценции пиридиннуклеотидов (рис.35, б, 2) сохраняется, в то время как ингибирование цитохромоксидазы цианистым калием полностью устраняет их люминесцентную реакцию (рис.35, в, 2) на натяжение (рис.35, в, 1) при калиевой контрактуре. Эти экспериментальные данные позволяют полагать, что изменение люминесценции мышечных клеток в области 4650-470 нм отражает изменение концентрации именно митохондриального НАД⋅Н. Клетки разных тканей, по-видимому, отличаются особенностями механизмов энергетической регуляции. Поэтому для построения общих представлений необходимы исследования широкого плана. Однако изучение мышечных клеток вызывает особый интерес в связи с тем, что их основной функцией является именно преобразование химической энергии в механическую работу, которое характеризуется при этом и наиболее широким диапазоном развиваемых мощностей. Рис. 35. Изменение натяжения (10 и интенсивности люминесценции пиридиннуклеотидов (2) мышцы лягушки при калиевой контрактуре [189]. а – нативная мышца, 122 мМ КCl; Р – отмывка раствором Рингера; б – мышца после предварительной инкубации (50 мин) в растворе моноиодуксусной кислоты (5 мМ); 200 мМ KCl; в – мышца после предварительной инкубации (40 мин) в растворе цианистого калия (5 мМ); 122 Мм KCl. Измерение люминесценции в длине волны 465 нм, длина волны возбуждения 365 нм. Исследование люминесцентной реакции НАД⋅Н мышечной клетки в ответ на единичное сокращение и кратковременную стимуляцию к выполнению работы разной мощности [191] позволяет полагать, что в скелетных мышцах связь между энергетикой и функцией является достаточно мягкой благодаря наличию мощных демпфирующих систем-аккумуляторов (запасы АТФ и креатинфосфата). Запасов макроэргов в этих аккумулирующих системах достаточно для энергообеспечения одиночного сократительного цикла и короткой серии (5-10) сокращений. При этом активация системы окислительного фосфорилирования происходит в течение одной или нескольких секунд после окончания сократительного цикла и направлена на восполнение запасов макроэргов в аккумулирующих системах. Таким образом, при нагрузках малой мощности система окислительного фосфорилирования не принимает непосредственного участия в осуществлении сократительного цикла. При более мощных нагрузках (калиевая контрактура), величины которых превышают мощность аккумулирующих систем, митохондриальная система окислительного фосфорилирования оказывается непосредственно вовлеченной в осуществление сократительной функции, обеспечивая развитие фазы расслабления. Сравнение приведенных на рис.36, а, в данных показывает, что выключение системы окислительного фосфорилирования цианидом (рис.35, в) не препятствует быстрому развитию контрактуры, хотя амплитуда натяжения при этом уменьшается, по-видимому, в связи с уменьшением запасов макроэргов в аккумулирующих системах. Фаза же расслабления оказывается сильно затянутой в связи с прекращением выработки АТФ в митохондриальной системе окислительного фосфорилирования. При этом единственным источником АТФ становится, повидимому, анаэробный гликолиз. Резкое замедление расслабления (рис.35, в) указывает на то, что мощность гликолиза (скорость выработки АТФ) в несколько раз ниже, чем у митохондриальной системы терминального окисления (рис.35, а). Учитывая также и малый КПД гликолитической системы по сравнению с окислительной (в 20 раз ниже), можно полагать, что гликолиз представляет собой в мышце не столько альтернативный механизм производства АТФ, сколько основную систему поставки субстратов в цикл Кребса для обеспечения работы систем окислительного фосфорилирования. Действительно, выключение гликолиза моноиодуксусной кислотой (рис.35, б) приводит к тому, что расслабление, будучи энергетически не полностью обеспеченным, происходит не до конца, после чего следует новая фаза сокращения, сопровождающаяся окислением митохондриального НАД⋅Н в связи с прекращением поставки водорода из цикла Кребса, который, в свою очередь, не получает субстратов из системы гликолиза, причем в скелетных мышцах в норме гликолиз является, по-видимому, основным поставщиком субстратов в цикл Кребса. Как упоминалось выше, способность мышечных клеток осуществлять функционирование в широком диапазоне мощностей представляет особый интерес, и потому служила объектом специальных исследований [169, 192]. Было установлено, что при длительной работе мышцы лягушки с большой мощностью (высокая частота стимуляции) происходит изменение путей выработки энергии, включение, по-видимому, менее экономичных систем с более высокой мощностью. Приведенные на рис.36 данные показывают, что в первой фазе процесса наблюдается обычная для дыхательной системы митохондрий [174] реакция увеличения окисленных (рис.36, 1) и уменьшения восстановленных (рис.36, 2) форм компонентов цепи терминального окисления НАД⋅Hцитохромоксидаза. Однако максимальная мощность этой системы оказывается, по-видимому, не достаточной для обеспечения сократительного аппарата в этом режиме и потому в фазе II наблюдается переход на иной путь терминального окисления. По окончании переходного процесса (фаза II) энергообеспечение сократительного аппарата уже полностью осуществляется энергосистемой высокой мощности (фаза III), т.е. происходит своего рода адаптация энергетики клетки к наложенной на нее нагрузке. Одним из указаний на наличие такой адаптации является колебательная реакция окисленных флавопротеинов (рис.35, 1) на снятие нагрузки (фаза IV). Описанная реакция энергетической системы мышечных клеток проявляется только при относительно высоких мощностях (частотах стимуляции) нагрузки. При малой мощности (до 1-1,5 Гц) переключения путей терминального окисления не происходит и наблюдается только описанный Чансом и Вильямсом [174] переход митохондриальной системы из состояния покоя в состояние активного обмена. Ввиду того, что данные эксперименты проводились на мышечных клетках in situ, наблюдаемые эффекты не могут быть отнесены за счет каких-либо нарушений жизнеобеспечения тканей. Рис. 36. Изменение концентрации окисленных флавопротеинов (1) и восстановленных пиридиннуклеотидов (2) мышечной клетки при длительной стимуляции с частотой 10 Гц. Длина волны возбуждения 365 нм. I – V – фазы адаптации энергоаппарата клетки. Полезно при этом напомнить одну из работ Хилла [193], в которой, сравнивая скорость потребления кислорода и выполняемую мышцей работу, он показал, что коэффициент полезного действия преобразования мышцей химической энергии в механическую оказывается наиболее высоким (≈25%) при частотах сокращения 1—2 Гц. При частотах выше 1 Гц КПД резко падает. Несомненно, что исследования регуляции энергоаппарата мышечных клеток находятся в настоящее время еще в стадии феноменологического накопления сведений. Однако значение этого этапа нельзя недооценивать, так как при изучении живой клетки в целом выявляются те особенности систем, которые обычно элиминируются при деструкции клеток в соответствии с требованиями методов классической биохимии. Большой интерес, в частности, представляют сведения о регулирующей роли кислорода, в работе энергосистем клеток разного типа [187, 194]. При параллельной регистрации концентрации НАД⋅Н и дыхания [195] мышц был обнаружен любопытный феномен задержки дыхания (рис.37, 2) и быстрого восстановления митохондриального НАД⋅Н (рис. 37, 1) в момент включения стимуляции мышц с относительно высокой (более 1,5 Гц) частотой. Величина эффекта растет с увеличением частоты. По-видимому, в этом случае мы сталкиваемся с проявлением действия неизвестной нам обратной связи между активностью системы окислительного фосфорилирования и скоростью потребления ею кислорода. Увеличение скорости потребления кислорода в момент выключения нагрузки делает предположения о наличии обратной связи в достаточной мере обоснованными для дальнейших экспериментальных исследований природы этой связи. Рис. 37. Изменение люминесценции НАД Н (460 нм) (1) и скорости потребления кислорода (2) мышцей лягушки при стимуляции с частотой 1 (а), 2 (б) и 5 (в) Гц [195]. Заканчивая главу, следует подчеркнуть особые преимущества люминесцентного спектрального анализа в изучении физико-химических процессов, протекающих непосредственно в живой, функционирующей клетке. Возможность возбуждать люминесценцию излучением, фокусируемым на объект исследования тем же микрообъективом, который используется и для сбора света люминесценции, позволяет изучать клетки, лежащие на поверхности или на глубине 200—300 мкм от нее, не выделяя их из организма животного. Таким образом, в отличие от метода абсорбционной спектрофотометрии, где толщина объекта не может быть более 100—150 мкм, метод люминесцентного спектрального анализа позволяет производить исследования клеток in situ. При этом отпадает необходимость в наиболее сложной части экспериментов по физиологии клетки, а именно в поддержании адекватных условий внешней среды для выделенной из организма клетки. Эта задача возлагается на само подопытное животное [169, 196-198]. Именно такой подход был использован, например, при изучении адаптации энергоаппарата мышечных клеток, обсуждавшейся выше (рис.36). Живую лягушку помещали в препаровальную камеру и закрепляли в ней в таком положении, чтобы ее конечности, закрепленные лигатурами к бортикам камеры в слегка растянутом состоянии, оказались в удобном для дальнейшей работы положении. На уровне голени и бедра разрезали кожу и оголяли мышцу. Стеклянными палочками раздвигали мышцы бедра и обнажали седалищный или большой берцовый нерв, к которому подводили электроды электростимулятора. Затем препаровальную камеру с животным помещали на предметный столик микроспектрофлуориметра [105, 168] и с помощью контактного микрообъектива производили регистрацию люминесценции (спектр или кинетика в определенной длине волны) участка одиночной мышечной клетки. Применение контактной оптики [199], по-видимому, особенно необходимо при исследовании такого подвижного объекта, как скелетная [169] или гладкая [198] мускулатура. Другим методическим приемом, который может быть рекомендован при изучении периодических процессов в объектах, отличающихся высокой степенью подвижности, является метод стробоскопического микроспектрального анализа (схема которого приведена на рис.38), отличающийся тем, что источник возбуждающего излучения поджигается только в заранее заданной фазе периодического процесса (рис.39). Если объектом исследования является скелетная или гладкая мышца, то поджиг источника (1) осуществляется стимулирующим импульсом электростимулятора (4), задержанным линией задержки (5) относительно начала сокращения на требуемый интервал времени. Если же объект обладает способностью к поддержанию автоколебательного режима (сердце), то вместо стимулятора (4) используется усилитель биопотенциалов, управляющий источником (I) через ту же линию задержки (5). Рис. 38. Блок-схема стробоскопического микроспектрофлуориметра. 1 – ртутная дуговая лампа ДРШ-250 (НВО-50); 2 – поджигающий высоковольтный трансформатор; 3 – управляемый контакт; 4 – электростимулятор (или усилитель биопотенциала); 5 – линия задержки; 6 – мышца; 7 – источник питания; 8 – микрообъектив; 9 – интерференционная светоделительная пластинка; 10 – зеркало; 11 – монохроматор; 12 – фотоумножитель; 13 – регистрирующее устройство. При включенной развертке монохроматора (11) на самописце или осциллографе с памятью (13) регистрируется последовательность импульсов, огибающая которой представляет собой спектр люминесценции объекта в выбранной фазе сокращения. При этом момент измерения соответствует вполне определенному геометрическому положению объекта, что устраняет погрешности, связанные Рис. 39. Фазовые соотношения между сокращением мышцы (а), стимулирующим импульсом (б), световым импульсом возбуждающего излучения (в) и импульсом люминесценции мышечной клетки (г). с его перемещением в плоскости фокусировки. В качестве примера регистрируемых таким образом данных на рис.40 приведен спектр люминесценции мышечной клетки в фазе максимального сокращения. Иногда, в особенности при изучении клеток и тканей теплокровных животных, возникают опасения, что поглощение гемоглобином крови люминесцентного излучения клеток может затруднить трактовку получаемых результатов. При использовании микрофлуориметрической техники (измерения кинетики люминесценции в одной или нескольких длинах волн) эти опасения являются в достаточной степени основательными. Применение же спектральной техники позволяет не только избавиться от помех, создаваемых гемоглобином крови, но и извлечь из них дополнительную полезную информацию. Рис. 40. Спектр люминесценции одиночной мышечной клетки лягушки, зарегистрированный в стробоскопическом режиме. Длина волны 365 нм. Возможности и особенности такого подхода могут быть проиллюстрированы на примере изучения спектров люминесценции ткани коры головного мозга живых крыс [197]. Регистрируемый при этом спектр люминесценции участка нервной ткани (20×100 мкм) (рис.41, 1) отличается от спектра люминесценции среза коры головного мозга крысы [200, 201] двумя особенностями, связанными с присутствием гемоглобина крови. Пульсация капилляров мозга приводит к появлению периодических импульсов на кривой спектра люминесценции нервной ткани, составляющих 2—5% от общей интенсивности люминесценции. Такие пульсации не только не мешают анализу спектра люминесценции, но и позволяют постоянно контролировать в процессе эксперимента количество крови, циркулирующей через излучаемый участок мозга. Рис. 41. Спектры люминесценции участка (20×100 мкм) коры головного мозга крысы до (1) и после (2) гибели животного. По оси ординат справа – интенсивность люминесценции в отн. ед, слева – интенсивность поглощения в %; по оси абсцисс – длина волны в нм. Длина волны возбуждения 365 нм. Для сравнения приведены спектры поглощения оксигенированного (3) и деоксигенированного (4) гемоглобина. Второй особенностью этого спектра является наложение полос поглощения гемоглобина (показано стрелками) на спектры люминесценции ткани. Поскольку спектры поглощения гемоглобина крови как в оксигенированном, так и в деоксигенированном состояниях хорошо известны (рис.41), это наложение полос поглощения гемоглобина не только не создает непреодолимых трудностей при анализе спектров люминесценции, но и позволяет постоянно контролировать в процессе эксперимента качество (степень насыщения кислородом) крови, циркулирующей в излучаемом участке мозга. Спектр люминесценции нервной ткани живой крысы (рис.41, 1) свидетельствует о нормальном сердцебиении животного и о том, что пульсирующая в капиллярах исследуемого участка мозга кровь содержит в основном оксигемоглобин, α- и β-полосы поглощения которого образуют два минимума в спектре люминесценции при 580 и 540 нм соответственно. Коротковолновая полоса поглощения оксигемоглобина оказывает малое влияние на спектр люминесценции ткани (рис.41, 1), а сам этот спектр имеет характерную форму с примерно одинаковой интенсивностью как в области восстановленных пиридиннуклеотидов (460-480 нм), так и в области окисленных флавопротеинов (520-530 нм). Остановка кровообращения при гибели животного приводит к прекращению пульсации интенсивности на кривой спектра люминесценции (рис.41, 2) и исчезновению минимумов в области 580 и 540 нм, что свидетельствует о переходе гемоглобина в изучаемом участке ткани в деоксигенированное состояние. Этот переход сопровождается заменой α- и β-полос в спектре поглощения гемоглобина на одну более широкую полосу с максимумом 560 нм (рис.41, 3, 4). О том же свидетельствует и сужение спектра люминесценции (рис.41, 2) в области 430—450 нм, так как это сужение обусловлено поглощением люминесценции пиридиннуклеотидов полосой гемоглобина, смещающейся при деоксигенации в 430 нм. Прекращение кровоснабжения и деоксигенация гемоглобина крови приводит к развитию тканевой гипоксии исследуемого участка мозга, что сопровождается увеличением интенсивности люминесценции восстановленных пиридиннуклеотидов в 470 нм и уменьшением интенсивности люминесценции окисленных флавопротеинов в 520 нм (рис.41, 2). Глава 3. Люминесцентные красители. 1. Изучение внутриклеточного обмена веществ Люминесцентные красители-метки являются весьма тонким и чувствительным инструментом исследования и, как всякий инструмент такого типа, требуют тщательного определения времени, места и условий их применения. В особенности это справедливо в случае использования люминесцентных меток для изучения столь сложного многокомпонентного объекта, как клетка. В руках вдумчивого и осторожного исследователя метод, разработанный им для решения конкретной задачи применительно к определенному объекту, дает обычно ценные и надежные результаты. Однако в дальнейшем недостаточно критическое копирование этого метода для решения иных задач на других объектах приводит зачастую к противоречиям. В результате возникают сомнения относительно самого метода и достоверности полученных ранее с его помощью данных. Повидимому, было бы правильным (для люминесцентных красителей) рассматривать в основном общую идею метода, его суть. Конкретный же рецепт-пропись должен разрабатываться заново на основе общей идеи применительно к конкретной задаче и объекту исследования. Поэтому в данной главе (а также и в следующей) на примере некоторых, достаточно произвольно выбранных задач рассматриваются общие соображения и те методические приемы, которые позволяют экспериментатору, владеющему соответствующей техникой, самому обосновать и выбрать конкретные условия применения этих общих соображений для решения стоящих перед ним задач. Имея в виду изложенное во введении относительно методов люминесцентного определения концентрации веществ в клетке, в данной главе будут рассмотрены только примеры определения соотношений концентрации по двух- и трехволновым методам, так как одноволновые методы широко применяются и подробно описаны в литературе [36, 37, 41, 44, 45]. 3.1. Двухволновые методы определения соотношения концентрации нуклеиновых кислот Рассмотрение удобно начать с хорошо известного и подробно описанного метода с использованием метахроматического люминесцентного красителя - акридинового оранжевого, так как двухволновая регистрация применялась именно для этого случая [202-206]. АКРИДИНОВЫЙ ОРАНЖЕВЫЙ Хлоргидрат 3,6-бидиметиламиноакридина Препарат отечественного производства Представляет собой соль с хлористым цинком. C17H20N3Cl + ZnCl2 м.в. 301,83 + 136,29 Характерной особенностью акридинового оранжевого, спектр поглощения которого приведен на рис. 42, является его способность существовать в растворе как в мономерной, так и в димерной форме. Максимум люминесценции мономеров лежит в зеленой области спектра (530 нм), в то время как димерная форма характеризуется красной люминесценцией с максимумом излучения 640 нм (рис. 43). Соотношение концентраций мономеров и димеров зависит от концентрации красителя в растворе. Рис. 42. Спектр поглощения акридинового оранжевого в концентрации 10-4 (1) и 2⋅10-6 г/мл (2). Рис. 43. Спектры поглощения люминесценции акридинового оранжевого. Концентрации раствора: 1 – 1:30000; 2,2’ – 1:10000; 3 – 1:1000. Чувствительность прибора при записи кривых 2’ и 3 уменьшена в 4 раза. Длина волны возбуждения 365 нм. Подробные исследования акридинового оранжевого [207-209] позволили установить [210], что мономерная форма, существующая в сильно разбавленных растворах, характеризуется следующими оптическими свойствами: максимум поглощения 494 нм, максимум люминесценции 530 нм, время жизни возбужденного состояния τ = 2⋅10-9 с. В концентрированных растворах акридиновый оранжевый существует в димерной форме с иными оптическими характеристиками: максимум поглощения 465 нм, максимум люминесценции 640 нм, время жизни возбужденного состояния τ = 20 ⋅ 10-9 с. При обработке акридиновым оранжевым гистологических препаратов возникает красная и зеленая люминесценция различных клеточных структур. Эта метахроматичность люминесценции акридинового оранжевого на гистологических препаратах была впервые обнаружена независимо Штруггером [211-213] и Букачем и Хайтингером [214]. Позднее, экспериментами in vitro в работах М.Н. Мейселя [215] и М.Н. Мейселя и В.Б. Корчагина [216] было показано, что зеленая люминесценция характерна для комплекса акридинового оранжевого с ДНК, в то время как красная для комплекса с РНК. Эти работы послужили основанием к широкому использованию акридинового оранжевого для определения соотношения ДНК и РНК в клетке по соотношению интенсивностей люминесценции в зеленой и красной областях спектра соответственно. Хотя для большинства случаев на практике получаемые таким образом данные в достаточной мере точно отражают суть дела, при строгом рассмотрении это утверждение оказывается некорректным. В действительности зеленая люминесценция (530 нм) характерна для комплексов мономеров с двухспиральной нуклеиновой кислотой (ДНК, двухспиральная РНК некоторых вирусов и двухспиральные участки клеточной РНК), в то время как красная (640 нм) - обязана своим происхождением комплексам димеров с односпиральными нуклеиновыми кислотами (РНК, односпиральные ДНК некоторых вирусов и бактериофагов, деполимеризованная ДНК) [203, 217221]. В ряде случаев оказывается невозможным пренебречь вкладом односпиральных ДНК и двухспиральных РНК и правильнее рассматривать соотношение зеленой и красной компонент спектра люминесценции как параметр, определяющий соотношение двух- и односпиральных нуклеиновых кислот соответственно. Вопрос интерпретации решается относительно легко, если объектом исследования служит одна из нуклеиновых кислот, например ДНК in vitro [205, 207 - 220] или локализованная в хромосомах [203]. В этом случае результаты естественно интерпретируются в терминах упорядоченности вторичной структуры и определяется соотношение односпиральных и двухспиральных участков в изучаемой молекуле. Примером такого подхода является фундаментальная работа Риглера [203], в которой степень спирализации ДНК определялась по спектрам люминесценции отдельных клеток и их частей. В качестве показателя степени упорядоченности вторичной структуры ДНК автором использовался коэффициент α, представляющий собой отношение интенсивностей красной (димерной 590 нм [не корректировано на спектральную чувствительность прибора]) и зеленой (мономерной 530 нм) люминесценции акридинового оранжевого α = I590 / I530. Другим примером применения двухволнового метода может служить определение биспиральной ДНК в смеси с денатурированной по люминесценции комплекса с акридиновым оранжевым in vitro [205]. В этом случае идея двухволнового метода была осуществлена с помощью специального двухволнового микрофлуориметра, использующего интерференционную пластинку для разделения зеленой (530 - 550 нм) и красной (630-650 нм) люминесценции по двум каналам регистрации. Авторы отмечают более высокую чувствительность двухволнового метода [205] по сравнению с одноволновым [204]. В общем случае при исследовании одиночных клеток и их групп вопрос об интерпретации наблюдаемого соотношения зеленой и красной люминесценции становится сложным и должен решаться исследователем применительно к конкретному объекту изучения и поставленной задаче. К рассмотрению возникающих при этом трудностей имеет смысл обратиться несколько позже, предварительно обсудив некоторые вопросы методики окраски препаратов. При этом весьма важно соблюсти ряд условий обработки препарата красителем, такие, как рН, ионная сила, время окраски, концентрация флуорохрома и т.д. Вопросы технологии окрашивания подробно рассмотрены в исчерпывающих монографиях Риглера [203] и А. В. Зеленина [36, 221]. При обработке фиксированных клеток акридиновым оранжевым в определенных условиях в интервале рН = 4-5 возникает двухцветная люминесцентная окраска (рис. 44), обязанная своим происхождением, в основном, комплексам мономеров с двухспиральными (полоса излучения в зеленой области спектра с максимумом 530 нм) и димеров с односпиральными (полоса излучения в красной области спектра с максимумом 640 нм) нуклеиновыми кислотами [203]. Помимо двухспиральных нуклеиновых кислот комплексы с мономерами (максимум излучения 530 нм) могут образовывать и белки. Однако при рН окрашивающего раствора, равном 4-4,6, вклад комплексов мономеров акридинового оранжевого с белками в общую интенсивность люминесценции клетки в длине волны 530 нм пренебрежимо мал. В частности, по данным Риглера [203], при рН 4,1 98% акридинового оранжевого связывается с нуклеиновыми кислотами и только 2% - с белками. Рис. 44. Спектры люминесценции окрашенных акридиновым оранжевым клеток крови и костного мозга здорового человека. а – нейтрофилы: сегментоядерный (1), палочкоядерный (2), юный (3); б – лимфоциты (1-3) и моноцит (4). Длина волны возбуждения 465 нм. В свою очередь, димеры акридинового оранжевого могут образовывать комплексы не только с односпиральными нуклеиновыми кислотами (максимум излучения 640 нм), но и с мукополисахаридами. Однако для клеток, не содержащих мукополисахаридов в цитоплазме, а тем более для ядер клеток вкладом комплексов димеров с мукополисахаридами в общую интенсивность полосы люминесценции с максимумом 640 нм можно пренебречь, хотя, по-видимому, целесообразно при этом убедиться в отсутствии в изучаемой клетке мукополисахаридов, например, окрашивая препарат акридиновым оранжевым при рН 2, когда комплексы димеров могут образовываться только с мукополисахаридами в случае их присутствия в клетке [36]. Необходимо отметить, однако, что существует несколько прописей-рецептов обработки препарата акридиновым оранжевым, значительно различающихся между собой [36]. Некритическое использование методики, дававшей хорошие результаты на объекте, для которого она была разработана, может привести к серьезным ошибкам, что можно видеть на примере определения таких достаточно простых параметров реакции, как концентрация красителя и время обработки им препарата. Действительно, по-видимому, у каждого, кто начинает применять акридиновый оранжевый для окраски фиксированных препаратов, возникает ощущение некоторой неуверенности в результатах ввиду того, что неясно, как определить наиболее подходящую концентрацию красителя и время окрашивания с тем, чтобы соотношение зеленой и красной люминесценции соответствовало соотношению двух- (ДНК) и односпиральных (РНК) нуклеиновых кислот в изучаемом препарате. Варьируя время и концентрацию, нетрудно получить «недокрашенный» препарат почти без красной люминесценции или, наоборот, «перекрасить» препарат так, что зеленая люминесценция оказывается почти незаметной на фоне красной люминесценции препарата. Даже в том случае, когда получена метахроматическая окраска, остаются сомнения в том, что препарат не перекрашен. Конечно, длительный опыт работы может помочь решить этот вопрос при визуальном наблюдении препарата [36], однако и в этом случае предпочтительнее иметь какой-то более объективный метод оценки. По-видимому, такой способ может быть найден при рассмотрении спектров люминесценции окрашиваемых препаратов. Если, например, воспользоваться раствором акридинового оранжевого в разведении 1:30000 (рН 4, 6, цитрат-фосфатный буфер) для окрашивания срезов мозга крыс (фиксация по Карнуа, заливка в парафин), то в зависимости от времени окрашивания спектр люминесценции определенного участка препарата будет меняться, как это показано на рис. 45, а. Кривая интенсивности люминесценции в зеленой (530 нм) и красной (640 нм) областях спектра (рис. 45, б, 1, 2) выходит на плато после 8-7,5 мин окрашивания. Увеличение длительности окрашивания (более 8 мин) не приводит к существенным изменениям интенсивности люминесценции в обеих длинах волн. Из рассмотрения рис. 45, а, б можно сделать вывод, что для изучаемых срезов головного мозга крыс оптимальное время окрашивания составляет примерно 8—10 мин при разведении акридинового оранжевого 1: 30000. Рис. 45. Определение оптимального времени окраски акридиновым оранжевым в разведении 1:30000 среза головного мозга крысы. а – длительность окраски (мин): 1 – 2; 2 – 4; 3 – 6; 4 – 8; 5 – 12; б – область спектра: 1 – зеленая (530 нм), 2 - красная (640 нм). Длина волны возбуждения 365 нм. Известно, что ультрафиолетовое облучение окрашенного препарата приводит к его «выгоранию» - уменьшению интенсивности люминесценции. Изменение спектров люминесценции среза головного мозга крысы, окрашенного акридиновым оранжевым в разведении 1 : 30 000, приведено на рис. 46 и дает возможность вычислить ошибку в определении коэффициента α, представляющего собой отношение интенсивности люминесценции в 640 им к таковой в 530 нм (α = I640 / I530). Для начального спектра (рис. 46, 1) α = 0,364 и при воздействии на препарат УФ-излучения с длиной волны 365 нм уменьшается (табл. 5). При этом трехминутное облучение приводит к допустимому отклонению значения α на 2,5%. Рис. 46. Изменение спектров люминесценции среза головного мозга крысы, окрашенного в течение 8 мин акридиновым оранжевым в разведении 1:30000, в зависимости от длительности облучения препарата УФ-излучением (365 нм). Время облучения (мин): 1 – 1; 2 – 2; 3 – 3; 4 - 4; 5 - 5; 6 – 6. Ситуация резко меняется, если при всех остальных неизменных параметрах применять для окрашивания того же препарата краситель в большей (1:10000) концентрации (рис. 43, 2 и 2'). Приведенные на рис. 47 спектры люминесценции показывают, что уже при двухминутной окраске препарат сильно перекрашен и интенсивность ни зеленой, ни красной люминесценции не выходит на плато. Более того, избыточная концентрация акридинового оранжевого уже на второй минуте окрашивания приводит к образованию димеров на местах локализации мономеров, что проявляется в уменьшении люминесценции в зеленой области при возрастании люминесценции в красной (640 нм) области спектра по мере увеличения времени окрашивания. Уже на третьей минуте почти весь связанный препаратом краситель представлен димерной формой. Таблица 4 Выцветание препарата, окрашенного акридиновым оранжевым, под действием ультрафиолетового облучения (длина волны 365 нм) в зависимости от условий обработки Время облучения, мин. 0 1 3 5 1:30 000, 8 мин окрашивания α ∆α (∆α/α)100% 0,364 0 0,363 0,001 0,3 0,355 0,009 2,5 0,338 0,026 7 1:10 000, 2 мин окрашивания α ∆α (∆α/α)100% 1,12 0 0 1,10 0,02 2 0,96 0,16 16 0,88 0,24 24 Рис. 47. Спектры люминесценции среза головного мозга крысы, окрашенного акридиновым оранжевым в разведении 1:10000 в течение 1 (1), 2 (2) и 3 (3) мин. Присутствие в препарате избытка димерной формы красителя сказывается не только на величине коэффициента α, но и на кинетике выцветания препарата под действием УФ-излучения. При сравнении рис. 46 и 48 нетрудно видеть, что фотодеструкции подвергаются в первую очередь димеры. Уже в первую минуту облучения α изменяется на 2%, а к третьей минуте это изменение достигает 16% (табл.4). Приведенные данные показывают, что даже относительно небольшое (примерно в 3 раза) увеличение концентрации красителя может сделать его непригодным для решения поставленной задачи. Рис. 48. Изменение спектра люминесценции среза головного мозга крысы, окрашенного акридиновым оранжевым в разведении 1:10000 в течение 2 мин, в зависимости от длительности облучения препарата УФ-излучением (365 нм). Время облучения (мин): 1 – 0; 2 – 1; 3 – 2; 4 – 3; 5 – 4; В ряде методов, использующих акридиновый оранжевый в высоких концентрациях, одним из обязательных этапов является достаточно длительная промывка перекрашенного препарата в воде или в растворе хлористого кальция [36]. Цель этой операции ясна - удалить избыточный краситель. Это действительно может происходить, как следует из рис. 49, где видно, что отмывка в течение 4 мин в дистиллированной воде препарата, окрашенного акридиновым оранжевым в разведении 1:10 000 в течение 3 мин, приводит к возвращению соотношения интенсивностей люминесценции в зеленой и красной областях спектра к такому значению, которое характерно для этого препарата при двухминутной окраске (рис. 49, 4, 5). Однако вряд ли следует рекомендовать перекрашивать препарат для того, чтобы затем с помощью длительной процедуры попытаться возвратить его к оптимуму. Правильнее, по-видимому, с самого начала подобрать время окраски и концентрацию по выходу кривых интенсивности люминесценции в красной и зеленой областях на плато, как в случае, приведенном на рис. 45. Однако визуальное наблюдение препарата [36] остается важным, хотя и в этом случае предпочтительнее воспользоваться сопоставлением спектров люминесценции отдельных участков и органоидов клетки, размеры которых могут быть доведены до 1-2 мкм в диаметре. Те же самые соображения относительно необходимости тщательного спектроскопического контроля можно было бы повторить и для дополнительных методик, используемых при изучении нуклеиновых кислот с помощью акридинового оранжевого. Важное место среди них занимает избирательная экстракция РНК с целью проверки соответствия получаемых результатов истинному положению вещей. Хорошим примером подхода такого типа является цитофотометрический анализ различных способов избирательной экстракции РНК из срезов [222], который позволил авторам обоснованно выбрать условия экстракции, наиболее адекватные объекту исследования. Аналогичный подход [223] необходим и при использовании люминесцентных методов. Рис. 49. Изменение спектра люминесценции среза головного мозга крысы, окрашенного акридиновым оранжевым в разведении 1:10000 в течение 3 мин (1). Длительность промывки в дистиллированной воде (мин): 1 – 0; 2 – 1; 3 – 2; 4 – 3; 5 – 4; 6 – спектр люминесценции того же препарата, окрашенного акридиновым оранжевым в разведении 1:10000 в течение 2 мин. Таким образом, применение спектральной техники позволяет получать достаточно надежные и воспроизводимые результаты измерения интенсивности красной и зеленой люминесценции окрашенного акридиновым оранжевым препарата. Однако даже если соблюдены необходимые предосторожности вопрос интерпретации полученных данных в терминах физиологии клетки и ткани остается достаточно трудным. Клетка. Наиболее просто вопрос решается, по-видимому, при исследовании целых дифференцированных одиночных клеток. Как следует из рис. 44, клетки разного типа обладают спектрами люминесценции с разным соотношением полос излучения димерной и мономерной форм красителя. По соотношению полос излучения димеров и мономеров в спектре люминесценции, т.е. по величине параметра, клетки периферической крови могут бить разделены на две группы [224]. К первой группе относятся гранулоциты, отличающиеся в норме узким диапазоном изменения α, величина которого связана со степенью зрелости клетки. Если для зрелых сегментоядерных нейтрофилов характерны низкие (0,14-0,2) значения α (рис. 44, а, 1), то у палочкоядерных нейтрофилов (рис. 44, а, 2) величина этого параметра возрастает до 0,35-0,45. Юные нейтрофилы характеризуются более высоким (0,55-0,6) значением параметра α (рис. 44, а, 3). Еще более высокие значения параметра α наблюдаются у промиелоцитов (0,75-0,8) и миелобластов (0,80,9). Таким образом, созревание лейкоцитов, характеризующееся прогрессирующим снижением их синтетической активности, сопровождается снижением величины параметра α и у зрелых сегментоядерных нейтрофилов, достигает значений, характерных для комплексов акридинового оранжевого с нативной ДНК (0,178) и ДНП (0,196) [203]. Другую группу клеток периферической крови представляют собой лимфоциты, отличающиеся чрезвычайно широким диапазоном изменения параметра α. Приведенные на рис. 44, б спектры люминесценции показывают, что в мазках крови и костного мозга одного и того же практически здорового человека присутствуют лимфоциты с высоким (рис. 44, б, 1), средним (рис. 44, б, 2) и низким (рис. 44, б, 3) значениями параметра α, изменяющегося соответственно от 1,7 до 0,3. Имея в виду особенности методики окрашивания (рН 4,6) и отсутствие в клетках мукополисахаридов, можно полагать, что в общем случае параметр α отражает характерное для клетки отношение односпиральных (НК1) к двухспиральным (НК2) нуклеиновым кислотам: α = I640 /I530 = A1 НК1 /НК2, (19) где A1— коэффициент пропорциональности. В пул односпиральных нуклеиновых кислот НК1, помимо РНК, входят и односпиральные («расплетенные») участки ДНК, а к пулу двухспиральных нуклеиновых кислот НК2, помимо собственно ДНК, относятся и двухспиральные участки РНК. Поэтому в общем случае по величине параметра α невозможно определить отношение РНК/ДНК в клетке. В простейшем случае дифференцированных клеток, отличающихся той особенностью, что только 5-10% (в зависимости от типа клетки) их ядерной ДНК может находиться в активной форме, допустимо пренебречь вкладом односпиральных участков ДНК в общую интенсивность люминесценции в красной области спектра. Тогда, с достаточной для практических целей точностью можно полагать, что величина параметра α характеризует отношение РНК/ДНК в клетке: α = I640 /I530 = A1 НК1 /НК2 = A2 РНК/ДНК, (20) где A2 — коэффициент пропорциональности, учитывающий, в частности, и то обстоятельство, что определенная часть РНК находится в двухспиральной форме. Примером подобного типа клеток могут служить клетки периферической крови (рис. 44), нервные и глиальные клетки и т. д. Таким образом, в случае зрелых дифференцированных клеток параметр α приобретает достаточно ясный физиологический смысл. Действительно, поскольку можно полагать содержание ДНК в неделящейся клетке постоянным, параметр α показывает содержание РНК на единицу ДНК, и его изменение отражает, таким образом, изменение функциональной и синтетической активности данной клетки, сопровождающееся изменением содержания в ней РНК [225-227]. Наиболее полно взаимосвязь между функциональной и синтетической активностью была изучена Хиденом методами количественной ультрамикрохимии на примере нервных клеток. Показано [228, 229], что синтез РНК и белков в нейронах находится в прямой зависимости от функциональной активности этих клеток. Спектры люминесценции окрашенных акридиновым оранжевым клеток крови человека показывают, что в зрелых сегментоядерных нейтрофилах (рис. 44, а, 1) практически отсутствует РНК (α = 0,18), синтетическая активность, клеток подавлена и они, по-видимому, полностью сформированы для выполнения функций в периферической крови в течение относительно короткого (4-6 сут) времени их жизни. В отличие от этого в юных нейтрофилах (являющихся предшественниками зрелых) обнаруживается (рис. 44, а, 3) относительно высокое содержание РНК (α = 0,6), свидетельствующее о высокой активности синтетических процессов. Мнение о снижении синтетической активности клеток миелоидного ряда по мере их созревания до сегментоядерной формы подтверждается как биохимическими данными об уменьшении количества РНК в этих клетках [230], так и результатами электронно-микроскопических исследований, показывающих прогрессирующее уменьшение числа рибосом в их цитоплазме [231]. Таким образом, изменение параметра α в случае, если в поле зрения прибора находится одиночная дифференцированная клетка, указывает на соответствующее изменение в ней интенсивности синтеза РНК. При этом, по-видимому, нет необходимости заботиться о точном выяснении величины постоянного коэффициента А2 в уравнении (20), так как интерес представляет не столько абсолютное значение отношения РНК/ДНК, сколько его относительные изменения. Необходимо отметить, что получаемые таким способом данные об изменении содержания РНК по величине параметра α при развитии какого-либо внутриклеточного процесса могут оказаться несколько неточными в связи с возможным изменением интенсивности зеленой люминесценции (530 нм) за счет изменения вклада внеядерной ДНК [232-235]. Однако величина этого вклада, повидимому, в большинстве случаев невелика по сравнению с изменениями α за счет изменения содержания РНК в клетке и может быть проконтролирована методами избирательной экстракции нуклеиновых кислот. Интересные результаты были получены при изучении лимфоцитов в норме и при лейкемии [236]. В частности, оказалось, что если распределение α в популяции лимфоцитов здоровых животных характеризуется малой дисперсией относительно низкого (0,16) значения α (рис. 50, а), то в популяции лимфоцитов, животных в стадии лейкемии наблюдается уширение гистограммы распределения величин α за счет числа клеток с высоким (0,6-0,8) значением α (рис. 50, в). Было бы соблазнительным относить увеличение параметра α лимфоцитов при лейкозе за счет увеличения в них содержания РНК. Трудность, однако, заключается в том, что в этом случае степень дифференцированности клеток заранее не известна, а стало быть, нет возможности воспользоваться допущениями, приводящими к уравнению (20), и можно рассматривать α только как параметр, отражающий отношение односпиральных и двухспиральных нуклеиновых кислот в клетке в соответствии с уравнением (19). Рис. 50. Гистограммы распределения α в лимфоцитах тимуса мышей [236]. а – здоровые животные; б – в предлейкозной стадии; в – в стадии лейкемии. По оси ординат – число клеток; по оси абсцисс - α. Тем не менее с точки зрения физиологии клетки параметр α и в этом общем случае представляет значительную ценность, характеризуя уровень синтетической активности клетки. Действительно, двухспиральные молекулы нуклеиновых кислот (ДНК), обладающие большей, чем односпиральные, устойчивостью к повреждающим факторам и предназначенные для хранения информации, неактивны в синтетическом отношении. Процесс реализации информации в виде синтеза тех или иных внутриклеточных соединений всегда сопряжен с появлением активных в синтетическом отношении односпиральных нуклеиновых кислот, которые могут быть представлены как «расплетенными» односпиральными участками молекул ДНК, так и молекулами РНК. Таким образом, в полностью неактивной в синтетическом отношении клетке нуклеиновые кислоты представлены, в основном, двухспиральными нуклеиновыми кислотами (ДНК) и характеризуются низким значением параметра α, близким по величине к таковому для нативной ДНК или ДНП. Зрелые сегментоядерные нейтрофилы (рис. 44, а) представляют собой, по-видимому, пример клеток именно такого типа. Активация синтетических процессов в клетке неизбежно приводит к повышению величины параметра α либо за счет появления «расплетенных» участков ядерной ДНК при активации генома клетки, либо за счет накопления различных форм РНК, либо за счет обоих этих факторов. Хотя, как следует из сказанного выше, параметр α и в общем случае характеризует синтетическую активность клетки, остается, однако, заманчивым прецезировать долю односпиральных участков ДНК в общей массе односпиральных нуклеиновых кислот. Это позволило бы определить стадии развивающегося процесса активации синтеза в клетке и установить, имеем ли мы дело с начальной стадией активации генома, в которой вклад односпиральных участков ДНК в общую массу НК1 велик, или со второй стадией, когда односпиральные нуклеиновые кислоты представлены, в основном, различными видами РНК и в большинстве своем - рибосомальной РНК. В этом отношении специальный интерес, по-видимому, представляет особенность фотодеструкции акридинового оранжевого, характерная для бластных клеток, костного мозга, находящихся на той или иной стадии дифференцировки [224]. В дифференцированных клетках фотодеструкция («выгорание») связанного с ними акридинового оранжевого происходит таким образом (тип I), что одновременно уменьшается интенсивность обеих, мономерной и димерной, полос излучения, хотя и не обязательно в одинаковой степени (рис. 46, табл. 4). Совершенно по-иному протекает процесс фотодеструкции красителя, связанного с упомянутыми выше бластными клетками в препарате костного мозга. Приведенное на рис. 51 семейство спектров люминесценции гемоцитобласта свидетельствует о том, что фотодеструкции в первую очередь подвергаются димеры акридинового оранжевого (тип II). При этом на месте димера оказывается мономер и потому одновременно с уменьшением интенсивности полосы изучения димеров (640 нм) наблюдается рост интенсивности полосы излучения мономеров (530 нм) акридинового оранжевого с четко выраженной изобестической точкой, положение которой в спектральном диапазоне (565-605 нм) зависит от исходного соотношения интенсивностей полос излучения димеров и мономеров в спектре люминесценции клетки. Рис. 51. Действие облучения с длиной волны 436 нм на окрашенный акридиновым оранжевым гемоцитобласт. 1 – исходный спектр; 2 - 6 – спектры, регистрируемые с интервалом времени 1мин. Длина волны возбуждения 436 нм. Степень выраженности эффекта зависит от степени дифференцированности клетки. Сравнение динамики изменения спектров люминесценции нормобластов в препарате костного мозга практически здорового человека показывает, что эффект фотодеструкции красителя с проявлением изобестической точки (тип II) в большей степени выражен у базофильных нормобластов (рис. 52, а) по сравнению с более дифференцированными оксифильными нормобластами (рис. 52, б). Интересно отметить, что мало отличающиеся между собой по величине параметра α узко- и широкоплазменные лимфоциты из лимфоузла селезенки четко различаются по типу фотодеструкции связанного с ними акридинового оранжевого. В то время как у широкоплазменных лимфоцитов наблюдается фотодеструкция (рис 53 б) типа I (характерная для зрелых дифференцированных клеток), узкоплазменным лимфоцитам свойственна, хотя и в малой степени (рис.53, а), фотодеструкция типа II с выраженной изобестической точкой семейства последовательно регистрируемых спектров люминесценции. При более длительном облучении клеток фотодеструкция типа II переходит в тип I, когда уменьшение интенсивности излучения димеров не сопровождается увеличением интенсивности излучения мономеров. Это указывает на существование в данных клетках двух типов комплексов димеров с односпиральными нуклеиновыми кислотами, один из которых - комплекс с РНК, другой — комплекс с односпиральными участками ДНК, для которого, по-видимому, и является характерной фотодеструкция типа II. Рис. 52.Действие облучения с длиной волны 436 нм на окрашенный акридиновым оранжевым базофильные (а) и оксифильные (б) нормобласты из костного мозга здорового человека. 1 – исходный спектр: 2 – 10 – спектры, регистрируемые с интервалом времени 1 мин. Длина волны возбуждения 436 нм. Рис. 53. Изменение спектров люминесценции окрашенных акридиновым оранжевым узкоплазменных (а) и широкоплазменных (б) лимфоцитов из лимфоузла селезенки человека. 1 – исходный спектр; 2 – 6 – спектры с интервалом времени 1 мин. Длина волны облучения и возбуждения 436 нм. На обоснованность такого предположения указывает то обстоятельство, что фотодеструкция типа II наиболее ярко выражена у бластных форм клеток крови (гемоцитобласты, проэритробласты, нормобласты), и уменьшается параллельно увеличению степени дифференцированности клетки. Аналогичный эффект наблюдается и у делящихся клеток печени в стадии удвоения числа хромосом. Ядро. Избежать погрешностей, связанных с влиянием внеядерной ДНК, можно, переходя к характеристике состояний синтетической активности клетки по активности ее ядерного аппарата. При этом измеряются величины α только в ядре клетки или, если это представляется интересным, в ядрышке. Тогда смысл параметра α соответственно меняется и α становится характеристикой либо активности генома (ядро) клетки, либо активности только ядрышкового аппарата. Таким образом, открывается возможность прослеживать временные взаимоотношения внутриклеточных синтетических процессов и органоидов. Геометрическое разрешение и чувствительность современных микроспектрофлуориметров вполне достаточны для этой цели. Приведенные на рис. 54 гистограммы распределения α ядер идентифицированных гигантских нейронов моллюска показывают, что зависимость от физиологического состояния выражается тем более четко, чем выше разрешающая способность метода. Изменения активности ядерного аппарата ясно выражены, и для трактовки физиологического смысла наблюдаемого увеличения α могут быть использованы все приведенные выше соображения относительно α для целой одиночной клетки. Рис. 54. Гистограммы распределения α в ядрах идентифицированных нейронов БП2 и БП4 моллюска Lymnaea stagnalis на холоду (4 0С) и при комнатной (20 0С) температуре. По оси ординат – число ядер; по оси абсцисс - α. Ткань. Еще более сложная ситуация возникает, если объектом исследования служит не одиночная клетка, а целая группа клеток, находящаяся в поле зрения прибора. Такие измерения представляют зачастую большой интерес, так как они могут позволить сравнить соотношение концентраций РНК и ДНК в ткани, определяемое оптическими (люминесцентными) методами и методами классической биохимии. Однако физиологический смысл изменения параметра α в этом случае теряет ясность и однозначность. Действительно, при измерениях такого типа входная щель микроспектрофлуориметра, оставаясь постоянной, выделяет из препарата участок, площадь которого соответствует оптическому изображению щели (например, 80 × 20 мкм, рис. 55), а объем определяется толщиной среза (5 мкм, рис. 55). В результате измеряемое отношение интенсивностей красной и зеленой люминесценции оказывается отнесенным всегда к определенному объему ткани или при соответствующих пересчетах к определенному весу ее, т. е. измеренное отношение интенсивностей люминесценции отражает отношение концентрации веществ. Рис. 55. Оптическое вычленение определенного объема нервной ткани при микроспектрофлуориметр ическом определении соотношения концентраций веществ. Размеры в мкм. Однако в этом случае возникают те же трудности в физиологической трактовке получаемых результатов, как и при классических биохимических исследованиях отношений концентраций ДНК и РНК в различных тканях животных [237, 238]. Суть этих трудностей заключается в том, что переменным становится не, только числитель (концентрация РНК), но и знаменатель (концентрация ДНК) в выражении для параметра α, так как количество клеток и их ядер в оптически выделенном постоянном объеме (18000 мкм3, рис. 55) может быть различным. Более того, может изменяться и соотношение клеток разного типа. В соответствии с этим будет изменяться и концентрация ДНК, отражающая количество клеток (ядер) в изучаемом объеме [239, 240]. Поэтому без привлечения дополнительных сведений, трудно определить, что означает, например, уменьшение параметра α. Оно может означать как снижение функциональной активности клеток в данном участке, сопровождающееся снижением концентрации РНК в них при неизменном количестве клеток и, следовательно, неизменной (в первом приближении) концентрации ДНК, так и резкое повышение синтетической активности ткани, сопровождаемое делением клеток и соответствующим ростом их количества в изучаемом объеме ткани. Связанное с этим увеличение концентрации ДНК, находящейся в знаменателе, может приводить к уменьшению параметра даже в случае умеренного роста концентрации РНК в тех же клетках. В наиболее ярком виде эти закономерности могут наблюдаться, по-видимому, при изучении участков корешка растения [241], находящихся на разных расстояниях от зоны роста, в которой параметр α принимает относительно низкое значение ввиду того, что поле зрения занято большим количеством мелких, только что разделившихся клеток. Увеличение размеров клеток, а стало быть, уменьшение количества их в поле зрения прибора является основной причиной увеличения параметра α по мере удаления от зоны роста, хотя интенсивность синтеза при этом становится меньше. Как было упомянуто выше, измерения такого типа дают возможность определить соотношение концентраций РНК и ДНК в исследуемых участках ткани. По-видимому, целесообразно рассмотреть подробнее некоторые аспекты интерпретации результатов. Отношение интенсивностей красной и зеленой люминесценции препарата, окрашенного акридиновым оранжевым, связано с концентрацией димеров и мономеров, а следовательно, в рамках сделанных допущений, с концентрацией РНК и ДНК уравнением α = I640 /I530 = ϕ ε2k2/ ε1k1 ⋅ сРНК/ сDНК = ϕ A2 ⋅сРНК/сDНК = В ⋅сРНК/ сDНК, (20') где I640 - интенсивность люминесценции в длине волны 640 нм (димеры); I530 -интенсивность люминесценции в длине волны 530 нм (мономеры); k1, k2 - квантовые выходы связанных с субстратом мономеров и димеров соответственно; ε1, ε2 - коэффициенты экстинкции связанных с субстратом мономеров и димеров соответственно; (ϕ - коэффициент распределения, характерный для данной ткани. Нетрудно видеть, что уравнение (20') отличается от аналогичного выражения для случая одиночной клетки (20) наличием коэффициента распределения ϕ. Смысл этого коэффициента достаточно очевиден (рис. 55) и отражает тот факт, что в состав изучаемой ткани могут входить клетки разного типа и размера, например, в случае нервной ткани - нейроны и глиальные клетки. В результате изменения соотношения количества клеток разного типа может меняться соотношение интенсивностей зеленой и красной люминесценции. Если полагать средний объем пирамидного нейрона V слоя коры равным 1600 мкм3, а объем глиальной клетки — около 160 мкм3 [242, 243], то замена одного нейрона на 10 глиальных клеток приведет к увеличению содержания ДНК в объеме, ранее занятом одним нейроном. Такое изменение соотношения типов клеток отразится на оптических свойствах объекта, а, следовательно, и на результатах измерения. Чтобы учесть это, оказывается необходимым ввести в уравнение (20) коэффициент распределения ϕ, отражающий соотношение всех клеток в данном объеме. Тогда для соотношения концентраций РНК и ДНК из уравнения (20') имеем с РНК/ сDНК = α/A2ϕ = α/В (21) Отсюда следует, что для определения отношения концентраций сРНК/ сДНК, зная отношение интенсивностей люминесценции α = I640 /I530 , необходимо определить коэффициент A2, зависящий только от физических параметров, связанных с субстратом мономеров и димеров красителя, и коэффициент ϕ , характеризующий соотношение клеток разного типа в изучаемой ткани. Это можно сделать двумя способами. Первый из них заключается в прямом измерении физических параметров (квантовых выходов и коэффициентов экстинкции) и последующем вычислении коэффициента A2. Однако даже для такого достаточно хорошо изученного красителя, как акридиновый оранжевый, имеющиеся в литературе данные вызывают сомнения относительно возможности их прямого использования для подобных расчетов. Не меньшие трудности могут возникнуть и при попытке рассчитать коэффициент распределения ϕ , хотя и это может быть осуществлено. Второй способ заключается в том, чтобы результаты люминесцентных измерений «прокалибровать» по результатам прямого биохимического определения отношения РНК/ДНК в исследуемой ткани. При этом сразу определяется суммарный коэффициент В в уравнении (21). Такая «калибровка» может, быть произведена либо по результатам собственного биохимического определения, либо по литературным данным. Некоторые аспекты этого подхода можно рассмотреть на примере ткани мозга крысы, подробно изученной биохимическими методами. Для подобного рода «калибровки» определенный интерес представляют данные о концентрации ДНК и РНК в различных отделах головного мозга крысы [237, 238]. В табл. 5 приведено сравнение биохимических данных о концентрации нуклеиновых кислот и их соотношений в некоторых отделах головного мозга крысы с результатами определения соотношения РНК/ДНК методом измерения интенсивности люминесценции в длинах волн 640 и 530 им. Срезы головного мозга крысы (возраст 120 дней, фиксация по Карнуа, заливка в парафин) окрашивались акридиновым оранжевым в разведении 1:30 000 на цитратфосфатном буфере с рН 5,6 в течение 10 мин (см. рис. 45) с последующей промывкой (2 мин) и заключением в нелюминеспирующую среду. Измерения проводили при возбуждении люминесценции в длине волны 365 нм. Размер фоюметрируемого участка 20×80 мкм, толщина - 5 мкм. Таблица 5 Сопоставление аоотношения нуклеиновых кислот, определяемых биохимически [238] и методом окрашивания акридиновым оранжевым Отдел мозга Большой мозг Серое вещество Белое вещество Таламус Гипоталамус Гиппокамп Содержание (мкг/1г РНК/ДНК сырого веса) РНК ДНК 65 45 48 59 60 36 40 32 45 38 1,72 1,1 1,5 1,25 1,64 Интенсивность люминесценции (отн. ед.) 640 нм 530 нм 10 24 8 7 1,3 62 17 36 29 8,4 α В 0,16 0,14 0,22 0,24 0,15 0,09 0,13 0,14 0,19 0,09 Сопоставление приведенных в табл. 5 данных показывает, что, действительно, величина коэффициента В в уравнении (21), представляющего собой произведение постоянного множителя А2 и коэффициента распределения ϕ, является переменной и зависит от соотношения клеток разного типа в изучаемом участке ткани. При этом близкие по своему клеточному составу ткани, такие, как, например, кора мозга и гиппокамп, имеют равные коэффициенты В. Необходимо отметить два обстоятельства, которые важно иметь в виду при проведении такого рода «калибровки» люминесцентного метода. Первое из них заключается в том, что биохимические методы дают весьма усредненные сведения о содержании и соотношении веществ в достаточно большом объеме ткани, необходимом для проведения химического анализа. Люминесцентный же метод позволяет проводить определения в очень малых объемах, регистрируя при этом те локальные вариации концентраций, которые обычно усредняются при биохимическом анализе ткани. Поэтому, производя сравнение результатов для определения коэффициента В, в качестве получаемого люминесцентным методом параметра α необходимо использовать результат, усредненный по большему числу измерений. Некоторые представления о локальной вариабельности соотношений интенсивности люминесценции в 530 и 640 нм можно получить, сопоставляя спектры (рис.56) разных клеток и их участков. Часть пирамидных клеток обладает довольно интенсивной красной люминесценцией цитоплазмы. Соответственно этому полоса с максимумом в 640 нм преобладает в спектре люминесценции цитоплазмы этих клеток, показывая высокое содержание РНК в них (рис. 56, 1). В то же время в спектре ядра этой клетки (рис. 56, 2) преобладающей уже является полоса излучения 530 нм, указывая на высокое содержание ДНК. В случае, если в поле зрения попадает ядро и цитоплазма, то регистрируется спектр с промежуточным соотношением интенсивностей полос 530 и 640 нм. Хотя красная люминесценция преобладает по интенсивности только в спектрах цитоплазмы некоторых нейронов, находившихся, по-видимому, в момент фиксации в состоянии повышенной функциональной активности, тем не менее она достаточно заметна и в цитоплазме других пирамидных нейронов. В отличие от этого в спектре люминесценции целой клетки олигодендроглии, большую часть которой занимает ядро, преобладающей является полоса люминесценции с максимумом излучения 530 нм, в то время как излучение в области 640 нм относительно невелико (рис. 56, 4). Поскольку количество глиальных клеток значительно превышает количество нейронов в поле зрения микроспектрофлуометра, при регистрации спектров люминесценции достаточно больших участков ткани (рис.55) ясно, что именно глиальные клетки будут определять форму спектра люминесценции в этом случае. Спектральные характеристики, подобные приведенным на рис.56, могут быть использованы также и для качественного определения специфичности реакций по распределению красной и зеленой люминесценции в разных внутриклеточных структурах, как это было отмечено ранее. Рис. 56. Спектры люминесценции отдельных участков (∅12 мкм) пирамидных клеток (1 – 3) и клетки олигодендроглии (4) срезов головного мозга крысы, окрашенных акридиновым оранжевым. 1 – цитоплазма; 2 – ядро; 3 – ядро с прилегающим участком цитоплазмы; 4 – клетка олигодендроглии целиком. Длина волны возбуждения 436 нм. Второе обстоятельство связано с точным учетом возраста животного ввиду того, что как сами концентрации определяемых соединений, так и их отношения испытывают значительные изменения в процессе развития животного. Это можно видеть на примерах изменения содержания РНК, ДНК и белков в мозжечке и в двигательной области коры больших полушарий мозга крысы (рис.57, по данным Гейто [238]). Рис. 57. Изменение концентрации РНК (1), ДНК (2), отношения РНК/ДНК (3) и белков (4) в мозжечке (а) и двигательной зоне коры больших полушарий (б) мозга крысы с возрастом. Такие значительные возрастные изменения концентрации РНК, ДНК и белков связаны как с изменением внутриклеточного содержания этих соединений, так и с изменением плотности клеток в ткани. Резкое повышение количества ДНК в мозжечке в течение 0-15 сут может быть связано с тем, что мозжечок в этот период очень быстро растет, увеличивая свои размеры. Это обстоятельство в сопоставлении с тем, что количество ДНК служит показателем числа клеток в данном объеме ткани [240], позволяет предполагать быстрое увеличение числа клеток в мозжечке после рождения животного [238]. В течение 15—50 сут наблюдается уменьшение содержания как РНК, так и ДНК в мозжечке, не означающее, однако, снижения содержания этих веществ в пересчете на одну клетку. Повидимому, количество ДНК в клетке остается постоянным, а количество РНК несколько возрастает. Причины наблюдаемого снижения состоят, вероятно, в том, что величины содержания ДНК и РНК приведены в пересчете на 1 г ткани. Поэтому быстрый рост клеток, сопровождающийся увеличением количества белка в них (рис. 57, 4), приводит к тому, что относительная доля РНК и ДНК в ткани становится меньше. Кроме того, уменьшение содержания РНК и ДНК может быть связано и с уменьшением количества клеток в фиксированном объеме ткани. Бриззи и соавт. [244] приводят данные о том, что у белых крыс в возрасте 50 сут отмечается наименьшая плотность клеток в коре мозга. На 10-е сут насчитывается примерно 100000 клеток в 1 мм3, на 50-е сут - 70000, а на 100-е сут число их снова возрастает до 90000. Возможно, что именно этим объясняется повторный рост содержания ДНК в мозжечке в возрасте от 50 до 100 сут (рис. 57, а, 2). В то же время рост содержания других, не учтенных здесь компонентов нервной ткани (например, липиды) также может вносить свой вклад в наблюдаемые (рис. 57) закономерности, особенно в период 50-100 сут (падение содержания белков), в случае представления содержания веществ в пересчете на 1 г ткани. Учитывая изложенное выше, для «калибровки» люминесцентных методов по данным биохимического анализа необходимо использовать животных одного и того же возраста. В этой связи могут представить интерес результаты определения содержания нуклеиновых кислот и белков в различных участках нервной ткани и в почке белой крысы в возрасте 100 сут (табл. 6.) Приведенные на рис. 57 соотношения показывают всю сложность интерпретации таких данных в терминах физиологии ткани и клетки вне зависимости от того, каким методом - прямым биохимическим или косвенным люминесцентным - они получены. При этом ясно обнаруживается необходимость иметь более полные, чем соотношение РНК/ДНК, сведения. Уже наличие данных о содержании белка в изучаемом участке ткани (рис. 57) позволяет резко повысить достоверность суждения о протекающих в данной ткани процессах. Это лишний раз подчеркивает важность разработки методов, в том числе и люминесцентных, определения соотношения в клетке и ткани других компонентов, таких, как белки и липиды. Некоторые из них будут обсуждены ниже. Таблица 6 Содержание нуклеиновых кислот и белков в тканях крыс в возрасте 100 сут (по [238]) Ткань Передняя вентральная кора Медиальная вентральная кора Задняя вентральная кора Передняя дорзальная кора (двигательная область) Медиальная дорзальная кора (область соматиче-ской чувствительности) Задняя дорзальная кора (зрительная зона) Задняя дорзальная кора (слуховая зона) Мозжечок Большие полушария Верхний отдел ствола Нижний отдел ствола Почка Содержание (мгк/1 г ткани РНК ДНК РНК/ДНК Белок, мг 1 г ткани 0,94 9,4 1,47 9,7 1,60 12,8 1,47 15,0 407 390 443 390 491 274 309 274 422 345 1,31 17,1 495 584 443 397 376 340 850 504 456 2346 448 455 386 1176 1,30 1,49 0,19 0,92 0,87 0,94 0,73 11,8 15,1 17,8 17,9 17,8 13,5 27,3 Возвращаясь к рассмотрению метода определения соотношения РНК/ДНК с помощью акридинового оранжевого и имея в виду приведенные на рис. 57 сведения о соотношении содержания белков и нуклеиновых кислот, необходимо отметить способность этого красителя к неспецифическому связыванию путем электростатического взаимодействия с отрицательно заряженными группами белковой молекулы. Хотя величина люминесценции (530 нм) таких комплексов мономеров красителя с белком и невелика, тем не менее, учитывая, что содержание белка на 1-2 порядка может превышать содержание ДНК, следует считаться с возможностью получения завышенных данных о содержании ДНК в ткани за счет вклада неспецифически связанных с белком мономеров акридинового оранжевого. Существуют различные способы учета этого обстоятельства. Контрольные эксперименты по избирательной экстракции исключительно полезны в этом случае. Определенная оценка ситуации может быть сделана и на основании сравнительного анализа спектров люминесценции отдельных участков и органоидов клетки (рис. 56). Способ устранения люминесценции акридинового оранжевого, неспецифически связанного с белком, путем предварительного ацетилирования полярных групп белков был предложен Риглером [203]. Другой способ, аналогичный по идее предыдущему, заключается в предварительной обработке препарата каким-либо красителем, прочно связывающимся с отрицательно заряженными полярными группами белков и делающим их неспособными к взаимодействию с акридиновым оранжевым [245]. Если при этом краситель обладает люминесценцией, то, очевидно, такая реакция, кроме блокирования нежелательных групп белковых молекул, может служить для одновременного определения соотношения РНК:ДНК:белок в клетке и ткани люминесцентным методом [246, 247]. В заключение этого раздела полезно еще раз отметить ценность метахроматических красителей, позволяющих не только получить цветовой контраст наблюдаемых в люминесцентном микроскопе картин, но и достаточно просто воспользоваться преимуществами двух и более волновых методов регистрации при возбуждении одного красителя излучением подходящей длины волны. Акридиновый оранжевый - только наиболее изученный из них. По-видимому, многие из красителей акридинового ряда обладают метахромазией. А.В.Зеленин [36] отмечает, что столь же яркие и контрастные картины, как и с акридиновым оранжевым, были получены при окраске корифосфином О и эухризином 2GNX. Причем последний имеет по сравнению с акридиновым оранжевым то преимущество, что он более стоек к выцветанию под действием УФ-облучения и может быть использован для окрашивания препаратов, фиксированных осмиевой кислотой [248]. КОРИФОСФИН О Отечественные препараты выпускаются в виде соли с хлористым цинком м.в. 287,8 + х136,29 Другие акридиновые красители, такие, как аурофосфин, акрифлавин (трипафлавин) и акриди новый желтый, дают меньшее цветовое различие одно- и двухспиральных нуклеиновых кислот. Учитывая, однако, большую чувствительность аппаратурных методов, было бы полезно изучить эти соединения, тем более, что, имея различающиеся по положению полос спектры поглощения (рис. 58), они могут быть более удобны для комплексного окрашивания. Рис. 58 Спектры поглощения красителей акридинового ряда. 1 – эухризин 2 GNX; 2 – аурофосфин; 3 – акридиновый оранжевый. 3.2. Определение соотношения различных веществ в клетке К сожалению, пока неизвестны надежные метахроматаческие люминесцентные красители, которые могли бы связываться одновременно как с белками, так и с нуклеиновыми кислотами, давая комплексы с разным цветом люминесценции. Поиск такого типа красителей является, по-видимому, одним из наиболее перспективных направлений развития люминесцентной количественной цитохимии. В первую очередь, вероятно, могут быть исследованы красители, метахроматичность которых уже использовалась ранее в классической гистохимии или в молекулярной биологии. Известно, например, под фирменным (Serva) названием «Stains all» соединение 4,5,4',5'-дибензо-3,3'-диэтил-9метилтиакарбоцианинбромид, используемое для метахроматической окраски акриламидных гелевых столбиков. При этом белки окрашиваются в красный, ДНК - в синий, РНК — в розовый цвет. Кислые мукополисахариды приобретают голубую окраску [249]. В качестве селективного красителя это соединение применялось в гистохимии [250] с использованием классической микроскопии в проходящем свете. Можно было ожидать, что если этот краситель обладает способностью к люминесценции, то его люминесцентное излучение будет обладать метахромазией и положение полос излучения окажется зависящим от того, с молекулами какого (белки, ДНК, РНК) внутриклеточного вещества связан краситель. Проведенные исследования (рис. 59) показали, что «Stains all» обладает достаточно яркой метахроматической люминесценцией, но не дает, по-видимому, четкого спектрального разделения ДНК, РНК и белков и имеет только две характерные полосы в спектре люминесценции (490 и 615 нм). Рис. 59. Спектры люминесценции срезов головного мозга крысы, обработанных красителем “Stains all” (10 –4 М раствор в этиловом спирте). 1 – зубчатая фасция гиппокампа; 2 – мозолистое тело; 3 – кора (1-й и 2-й слои); 4 – кора (молекулярный слой). Длина волны возбуждения 365 нм. В качестве другого примера, еще недостаточно хорошо изученного метахроматического люминесцентного красителя, может быть назван тиазиновый красный. ТИАЗИНОВЫЙ КРАСНЫЙ С24Н15N3O7S3Na2 м.в. 599,59 Прежде всего, следует отметить, что он совершенно по-разному взаимодействует с живыми и фиксированными клетками. При окрашивании срезов мозга, фиксированных по Карнуа, наблюдается удовлетворительная по своей яркости метахроматическая люминесценция ткани (рис. 60), характеризующаяся наличием трех полос излучения (454, 515, 580 нм), только одна из которых (454 нм) совпадает по положению с полосой люминесценции раствора (10-3 М) тиазинового красного, в то время как две другие (515 и 580 нм) появляются после взаимодействия красителя с объектом. Рис. 60. Спектры люминесценции водного раствора (10 –3 М) тиазинового красного (1) и окрашенных им срезов головного мозга крысы (2 – 4). Длина волны возбуждения 365 нм. Совсем иной вид спектра характерен для тиазинового красного после его взаимодействия с живыми клетками (рис. 61). И в этом случае у препарата сохраняется имеющаяся у раствора (рис. 60, 1, 61, 1) полоса излучения 454 нм, а вместо характерных для фиксированных клеток полос 515 и 580 нм (рис. 60) появляются широкие неразрешенные полосы с максимумом в области 630-640 нм. Соотношение интенсивностей полос люминесценции 454 и 630 нм зависит от функциональных особенностей клетки (рис. 61, 3, 4). Однако, пожалуй, самым интересным свойством тиазинового красного является способность окрашенных им клеток резко менять спектр люминесценции при их гибели. Добавление к препарату нескольких капель этилового спирта вызывает гибель клетки и сопровождается исчезновением полосы люминесценции 454 нм и увеличением полосы люминесценции с максимумом 670-680 нм (рис. 61, 2, 5). Механизм этого явления пока не ясен и представляет интерес скорее для следующей, чем для данной главы. Рис. 61. Спектры люминесценции водного раствора тиазинового красного (10 –2 М) и окрашенных им живых клеток рецептора растяжения речного рака. 1 - раствор тиазинового красного; 2 – приядерная область медленно адаптирующегося нейрона; 3 – быстро адаптирующаяся мышца; 4 – медленно адаптирующаяся мышца; 5 – приядерная область нейрона через 2 мин после добавки к препарату 0,5 мл этилового спирта. Длина волны возбуждения 365 нм. Отсутствие метахроматических люминесцентных красителей, которые уже сейчас можно было бы рекомендовать для определения в клетке соотношения различных компонентов ее обмена, определяет другой путь решения той же задачи - поиск пары красителей-меток, специфически связывающихся с изучаемыми компонентами клетки. При этом входящие в пару соединения должны удовлетворять нескольким условиям. 1. Максимумы их спектров люминесценции должны достаточно далеко (60-100 нм) отстоять друг от друга для раздельной регистрации интенсивности люминесценции каждого из них. 2. Соотношение квантовых выходов должно быть таково, чтобы интенсивности люминесценции обоих красителей в клетке были одного порядка. 3. Полосы поглощения обоих красителей в видимой области спектра должны совпадать или быть близкими (20-30 нм) с тем, чтобы уменьшить возможность миграции энергии возбуждения с молекулы, люминесцирующей в коротковолновой области спектра, на молекулу, люминесценция которой лежит в области более длинных волн. 4. Естественно, что оба красителя должны количественно связываться с макромолекулами объектами изучения. На практике обычно выбирается один из компонентов пары и к нему в соответствии с изложенными выше требованиями подбирается второй компонент. Иллюстрацией такого подхода может служить разработка ряда методов определения соотношения веществ в клетке, описываемых ниже. ДВУХВОЛНОВЫЕ МЕТОДЫ Белки и нуклеиновые кислоты. В качестве метки на нуклеиновые кислоты может быть использован люминесцентный краситель этидиум бромид. ЭТИДИУМ БРОМИД 2,7-диамино-10-этил-9-фенилфенантридиум бромид C21 H20 N3 Br м.в. 394,3 Строго говоря, этидиум бромид относится к разряду красителей с переменным квантовым выходом, величина которого зависит от субстрата связывания и окружения. Однако, будучи связан с макромолекулой, этидиум бромид имеет, по-видимому, постоянный квантовый выход. В растворах квантовый выход люминесценции этидиум бромида крайне мал и потому интенсивность люминесценции его слаба. При связывании этидиум бромида с нуклеиновыми кислотами наблюдается резкое увеличение квантового выхода [251-252], и структуры клетки, содержащие нуклеиновые кислоты, приобретают яркую малиново-красную люминесценцию с максимумом излучения 590-610 нм. Специфичность эффекта увеличения интенсивности люминесценции этидиум бромида при взаимодействии с нуклеиновыми кислотами крайне высока, о чем свидетельствуют приведенные ниже данные [251]: Нативная ДНК 100 ДНК, гидролизованная ДНКазой 2 Гепарин 0,05 Плазма крови (кролик) Поли-L-глутаминовая кислота 0 dАМФ, dГМФ 0,03 dТМФ, dЦМФ 0 Общая РНК печени 46 0,01 28s-фракция РНК 46 17s-фракция РНК 46 4s-фракция РНК 46 Дрожжевая РНК 46 РНК гидролизованная РНК,азой 0,7 Хондриотин сульфат 0,07 Гиалуроновая кислота 0,1 Если взаимодействие с ДНК приводит к возрастанию люминесценции в 100 раз, а с РНК - в 46 раз, то изменение люминесцениии этого красителя при взаимодействии его с другими соединениями незначительно или полностью отсутствует. Относительно высокий (2 и 0,7) эффект при добавлении гидролизованных ДНК и РНК связан, по-видимому, с неполным гидролизом, так как эффект при взаимодействии с основаниями либо полностью отсутствует (ТМФ, ЦМФ), либо очень мал (0,03 для АМФ и ГМФ). Ввиду того, что интенсивность люминесценции этидиум бромида оказалась пропорциональной концентрации нуклеиновых кислот в препарате, было предложено использовать его в качестве удобного и чувствительного реагента на нуклеиновые кислоты [251]. В дальнейшем на основе применения этидиум бромида был разработан метод автоматического определения ДНК и РНК [253]. Чувствительность люминесценции этидиум бромида к окружению послужила причиной широкого применения его в молекулярной биологии для определения изменений вторичной и третичной структуры нуклеиновых кислот [59, 251-256]. Изучая взаимодействие этидиум бромида с живыми клетками, Бурнс установил [257], что большая часть люминесценции (примерно 80%) этого красителя в клетке обязана своим происхождением комплексам этидиум бромида с РНК и исчезает после обработки клеток РНКазой. Остальная часть (20%) приходится, по-видимому, на комплексы с ДНК. Отмечается высокая специфичность взаимодействия именно с нуклеиновыми кислотами. Этидиум бромид был использован также в качестве реактива Шиффа в люминесцентном варианте реакции Фельгена на ДНК [258]. Поэтому использование этидиум бромида в качестве метки, количественно связывающейся с нуклеиновыми кислотами (условие 4), представляется достаточно обоснованным. Спектр поглощения этого красителя приведен на рис. 62, 3 и имеет максимум в области 480 нм. Максимум люминесценции его находится в красной области спектра (590-610 нм). Таким образом, учитывая спектральные характеристики метки нуклеиновых кислот, необходимо подобрать в пару к ней метку для белка. По-видимому, наиболее удобными в этом случае будут красители с люминесценцией в синей или зеленой области спектра. В качестве такой метки для белка может быть использован, например, активный [259] проционовый краситель ДХТАФ [260, 261]. Рис. 62. Спектры поглощения водных растворов. 1- ДХТАФ (10 –6 М); 2 – этидиум бромид (5⋅10 –6 М); 3 – смесь ДХТАФ (10 –6 М) и этидиум бромида (5⋅10 –6 М). ДХТАФ Дихлор-симм-триазиниламинофлуоресцеин-1 Мелкокристаллический порошок светложелтого цвета. Растворим в этиловом спирте и водных растворах бикарбоната натрия, двузамещенного фосфата натрия м.в. 531,76 Предложенные В.Б. Ивановым [262] в качестве метки на белок проционовые красители были изучены разными методами [263-266] и показано, что они количественно связываются с белком (условие 4). Красители этого типа состоят из двух частей: хромофора, определяющего спектральные характеристики проциона, и реакционной группы, представляющей собой дихлортриазиновое кольцо, атомы хлора которого в высокой степени реакционно активны. Было установлено [263], что при рН 5,6 проционы реагируют с амино- и имино-группами белков, присоединяясь к ним посредством ковалентной связи. При рН 8,0 они реагируют еще и с гидроксильными группами белков и углеводов. Связанный краситель не извлекается не, только спиртом, но и другими, более сильными органическими растворителями, обесцвечивающими обычно препараты, окрашенные кислотными и основными красителями [264]. Спектр поглощения ДХТАФ в водном растворе бикарбоната натрия приведен на рис. 62, 3. Он имеет максимум поглощения 500 нм и максимум люминесценции 527 нм (рис. 63). Таким образом, расстояние между максимумами люминесценции ДХТАФ и этидиум бромида составляет 70-80 нм (условие 1). Рис. 63. Спектры люминесценции водного раствора ДХТАФ. 1 – свежеприготовленный раствор; 2 – после 2 суток хранения при комнатной температуре. Длина волны 365 нм. Следует особо отметить, что водные растворы активных красителей, в том числе проционовых, малостабильны, такие соединения достаточно быстро гидролизуются и распадаются на две части - активную группу и хромофор. Поэтому водные растворы следует применять только в свежеприготовленном виде. Целесообразно также производить спектральный контроль этих растворов. Появляющийся при распаде проциона хромофор (например, флуоресцеин в случае ДХТАФ) имеет максимум люминесценции, отличающийся по положению в спектральном диапазоне от максимума люминесценции, который он имел, входя в состав активного красителя (рис. 63). Это обстоятельство может быть использовано для определения степени сохранности водного раствора активного красителя. Спиртовые растворы могут храниться достаточно долго. Что касается условия 3, то хотя формально оно и выполнено, сопоставление спектров поглощения (рис. 62) и спектров люминесценции (рис. 64) указывает на возможность реабсорбции или некоторого гашения люминесценции ДХТАФ за счет поглощения ее длинноволновым склоном широкой полосы поглощения этидиум бромида. Однако влияние этого эффекта, а также соответствие избранной пары красителей требованиям условия 2 при экспериментальной проверке оказались допустимыми. Методика выбора времени окраски и концентрации красителя применительно к объекту исследования и задаче, подробно описанная выше, также применялась и в этом случае. Срезы (5 мкм) головного мозга крысы (фиксация по Карнуа, заливка в парафин) окрашивали последовательно спиртовым раствором ДХТАФ (10-4 М) в течение 2 мин с последующей промывкой в дистиллированной воде (2 мин). Срезы подвергали дополнительной окраске водным раствором этидиум бромида (10-5 М) в течение 2 мин с последующей промывкой в дистиллированной воде (1 мин). Спектры люминесценции обработанного таким образом препарата содержат два максимума излучения (рис. 64). Один из них (527-530 им), обязан своим происхождением ДХТАФ, связанному с белком, в то время как другой (600-610 нм) - этидиум бромиду, находящемуся в комплексе с нуклеиновыми кислотами. По-видимому, для анализа результатов и в этом случае удобно воспользоваться параметром β, представляющим собой отношение интенсивности люминесценции, связанной с белками (527 нм), к таковой, отражающей содержание нуклеиновых кислот (610 нм). По своему физиологическому смыслу параметр β представляет собой содержание белка в ткани или клетке на единицу нуклеиновых кислот. Его увеличение свидетельствует об усилении синтетических процессов в клетке. В случае необходимости из величины параметра β можно определить соотношение белков и нуклеиновых кислот, проведя соответствующую «калибровку» по результатам биохимических исследований. Однако во многих случаях на практике величина параметра β может быть использована непосредственно для определения направленности изменений содержания белков в исследуемой ткани. Например, при изучении процессов репарации в головном мозге гиппокампэктомированных крыс описанным выше методом с акридиновым оранжевым в зоне разрушения было установлено увеличение параметра α, а, следовательно, отношения РНК/ДНК, что указывало на повышение интенсивности процессов синтеза белков в этой области. К аналогичным выводам приводит и анализ приведенных на рис. 64 спектров люминесценции препаратов, подвергнутых двойной окраске на белок (ДХТАФ) и нуклеиновые кислоты (этидиум бромид). Неповрежденные участки гиппокампа характеризуются параметром β = 0,52 - 0,78 (рис. 64, 2, 3), в то время как в области разрушения, где идет интенсивный заместительный синтез, полоса люминесценции связанного с белком ДХТАФ становится преобладающей в спектре и параметр β достигает значения 1,68. Необходимо отметить, что общее понижение уровня кривой 1 (рис. 64) связано с присутствием в поле зрения большого количества «пустых» участков, еще незаполненных глиальными клетками. Однако применение двухволнового метода определения отношений концентрации позволяет и в этом случае получить данные, не зависящие от степени заполненности клетками поля зрения микроспектрофлуориметра. Заканчивая этот раздел, следует подчеркнуть, что описанная пара красителей не, является, повидимому, единственной, пригодной для этих целей и, возможно даже, что это не лучший вариант. Исследователь может сам выбрать пары красителей, наиболее полно удовлетворяющих требованиям поставленной им конкретной задачи. Например, в описанной паре ДХТАФ может быть заменен флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ), имеющим спектры поглощения и люминесценции, близкие к таковым ДХТАФ. Связывание ФИТЦ с белком (условие 4) подробно изучено, так как этот краситель — один из наиболее часто применяемых для метки антител [39]. Рис. 64. Спектры люминесценции различных участков среза головного мозга гиппокампэктомированной крысы, окрашенного ДХТАФ (белок) и этидиум бромидом (нуклеиновые кислоты). 1 – разрушенный участок гиппокампа; 2 – участок гиппокампа вблизи зоны разрушения; 3 – неразрушенный участок гиппокампа. Длина волны 365 нм. ФИТЦ Флуоресцеинизотиоцианат I Мелкокристаллический порошок желтовато-оранжевого цвета, хорошо растворим в водных растворах бикарбоната натрия и двузамещенного фосфата натрия C21H12ClNO5S м.в. 425,85 При использовании же ДХТАФ в качестве люминесцентной метки на белок следует особенно внимательно отнестись к выбору оптимального времени окраски препарата и концентрации красителя. Это связано с интересной особенностью ДХТАФ, заключающейся в том, что интенсивность люминесценции препарата достаточно быстро достигает плато насыщения и затем резко падает. В результате увеличение времени окраски приводит к резкому ослаблению люминесценции препарата. Правильно окрашенный препарат обладает высокой устойчивостью к возбуждающему люминесценцию излучению. Люминесценция препарата не уменьшается при длительной промывке в воде. Липиды: белки. В ряде случаев возникает необходимость изучения изменения концентрации липидов по отношению к таким важнейшим компонентам структуры клетки, как белки и нуклеиновые кислоты. Естественно, что и для этой цели могут быть разработаны соответствующие двухволновые методы измерения. В основе гистохимии липидов лежит метод окрашивания их неполярными жирорастворимыми красителями [32, 33]. Суть этого метода заключается в том, что неполярные красители растворяются в жировых веществах клетки значительно лучше, чем в воде и водноспиртовых смесях, и поэтому в процессе окраски ткани переходят из водно-спиртового раствора в жировые включения препарата. Обычно при использовании методов абсорбционной микроскопии (наблюдение в проходящем свете) применяются перенасыщенные растворы нафтоловых суданов в 50—70%-ном спирте (этанол, изопропанол и т.д.) [32, 33]. Столь высокая концентрация красителя и довольно длительная окраска срезов не являются необходимыми при использовании люминесцентной микроскопии, чувствительность которой примерно на 3 порядка выше чувствительности абсорбционной микроскопии. При этом появляется возможность применения весьма малых концентраций люминесцентного красителя-метки на жиры в окрашивающей жидкости, что, в свою очередь, позволяет исключить в случае необходимости спирты из состава окрашивающего раствора. Наиболее хорошо изученным красителем-меткой на липиды является обладающий сильной голубой люминесценцией 3,4-бензпирен, введенный в гистохимию Бергом [267]. 3,4-БЕНЗПИРЕН (бенз[а]пирен) Слегка желтоватые игольчатые кристаллы; не растворим в воде; слабо растворим в этиловом спирте; растворимость в насыщенном водном растворе кофеина 0,00075% Полное отсутствие полярных групп у этого ароматического канцерогенного соединения делает его высоко специфическим красителем на липиды. Было изучено действие 3,4-бензпирена на клетки при их прижизненном окрашивании [268-271] и показана низкая (по сравнению с красителями акридинового ряда) токсичность его. Применение 3,4-бензпирена вместе с акридиновым оранжевым позволило Бревису [272] разработать метод одновременного люминесцентно-микроскопического выявления липидов, ДНК и РНК в одной и той же клетке прижизненно и в срезах фиксированной ткани. Метод нашел применение в ряде исследований [273-276]. Для приготовления водного раствора 3,4-бензпирена берут насыщенный раствор кофеина в воде (75 мг/10 мл) и добавляют в него 3,4-бензпирен из расчета 2 мг на 100 мл. Полученную смесь выдерживают в термостате 20—24 ч при температуре 50° С и затем тщательно фильтруют, получая таким образом готовый к употреблению водный раствор красителя. При изучении срезов фиксированных препаратов может быть использован также и водноспиртовый раствор 3,4-бензпирена. Насыщенный раствор в абсолютном этаноле (или изопропилене) разбавляется дистиллированной водой в нужной пропорции (от 50 до 70%) и после энергичного перемешивания фильтруется перед употреблением. Срезы, окрашенные в водно-спиртовом растворе, требуют тщательной промывки, так как возможно выпадение мелких сильно люминесцирующих кристаллов 3,4-бензпирена из остатков водно-спиртовой смеси при переносе препарата в воду для промывки (рис. 65, 3). Сопоставление спектров поглощения и люминесценции 3,4-бензпирена со спектрами поглощения ДХТАФ, ФИТЦ и этидиум бромида указывает на возможность совместного применения этих красителей при разработке двухволновых методов регистрации соотношения концентраций липиды: белки и липиды: нуклеиновые кислоты. Действительно, узкие линии излучения 3,4-бензпирена (рис. 65) не перекрываются полностью ни с полосами поглощения ДХТАФ и этидиум бромида, ни с полосами их излучения. Рис. 65. Спектры люминесценции 3,4бензпирена. 1 – бензольный раствор; 2– кристаллы; 3 – кристаллы в бензольном растворе. Длина волны возбуждения 365 нм. Экспедиционный микроспектрофлуориметр с интерференционным светофильтром. Пример реализации двухволнового метода определения соотношения концентраций липидов и белков в клетке приведен на рис. 66. Срезы мозга крысы (фиксация Карнуа, заливка в парафин) обрабатывали водным раствором 3,4-бензпирена в течение 5 мин (выход окраски на насыщение) и промывали в течение 2 мин в дистиллированной воде. В результате этого липиды, оставшиеся в препарате после фиксации Карнуа, заливки в парафин и проводки по спиртам, приобретают яркую голубую люминесценцию. Наиболее интенсивно люминесцируют стенки кровеносных сосудов и область мозолистого тела, спектр которого приведен на рис. 66, 1. Необходимо отметить, что 3,4-бензпирен можно полностью отмыть в 96%-ном этаноле, что приводит к исчезновению голубой люминесценции срезов. Последующая окраска этого препарата водным раствором 3,4-бензнирена позволяет вновь получить голубую люминесценцию его той же интенсивности. Это указывает на строгую специфичность связывания (а вернее, растворения) 3,4бензпирена с липидами. Рис. 66. Спектры люминесценции одного и того же участка среза головного мозга крысы после окраски: 1 – 3,4бензпирен; 2 – 3,4-бензпирен и ДХТАФ; 3 – 3,4-бензпирен и этидиум бромид. Длина волны возбуждения 365 нм. Дополнительная обработка окрашенного таким образом препарата водным раствором ДХТАФ в концентрации 10-4 М в течение 2 мин с последующей промывкой в дистиллированной воде приводит к появлению в спектре его люминесценции дополнительной полосы излучения ДХТАФ, ковалентно связанного с белком (рис. 66, 2). Некоторое перекрытие люминесценции 3,4-бензпирена с полосой поглощения ДХТАФ, а также, возможно, явление экранирования возбуждающего излучения выражается в снижении интенсивности люминесценции 3,4-бензпирена примерно в 2 раза. Особенно сильно этот эффект сказывается на линии излучения 3,4-бензпирена в 480 нм, совпадающей с максимумом поглощения ДХТАФ, которая совершенно исчезает в спектре люминесценции препарата с двойной окраской (рис. 66, 2). В наименьшей степени перекрытие спектра люминесценции 3,4бензпирена со спектром поглощения ДХТАФ сказывается, по-видимому, на линии излучения 3,4бензпирена в 430 нм. С учетом эффекта взаимного экранирования возбуждающего люминесценцию УФ-излучения 365 нм можно, по-видимому, по соотношению интенсивностей люминесценции в 430 и 517 нм препарата, окрашенного двумя красителями: 3,4-бензпиреном и ДХТАФ, судить о соотношении в нем концентрации липидов (430 нм) и белков (520 нм). Разработка других модификаций такого двухволнового метода с использованием вместо названных красителей (3,4-бензпирена и ДХТАФ) других пар с иными соотношениями полос поглощения и люминесценции и применение их для изучения того же препарата является, вероятно, наиболее прямым методом учета возможных погрешностей, связанных с перекрытием спектров поглощения и люминесценции красителей, входящих в состав пары. Другим методом определения взаимного влияния красителей может служить регистрация спектра люминесценции того же участка клетки при измененной длине волны возбуждающего излучения. При этом по изменению соотношения интенсивностей полос в спектре люминесценции может быть определена степень взаимодействия красителей. Если количество известных люминесцентных меток на белки с самыми разнообразными спектрами поглощения и люминесценции достаточно велико, то относительно опробованных и изученных люминесцентных меток на липиды этого сказать нельзя, хотя число потенциальных меток такого типа из разряда ароматических соединений может быть исключительно большим. Поиск и исследование люминесцентных меток липидов является, по-видимому, одной из перспективных задач цитохимии. Использованный в описанных методах неполярный ароматический углеводород 3,4-бензпирен как люминесцентная метка на липиды обладает только одним, но очень существенным недостатком — высокой канцерогенностью. По этой причине применение его в практике лабораторных исследований не желательно. В качестве метки липидов может быть использован также хлорофилл, обладающий интенсивной люминесценцией в красной области спектра. Липиды: нуклеиновые кислоты. Не останавливаясь подробно на этом методе, аналогичном по идее предыдущему, напомним, что соотношение полос поглощения и люминесценции 3,4-бензпирена и этидиум бромида таково, что позволяет использовать их для комплексной окраски препарата с целью получения сведений о соотношении концентраций липидов и нуклеиновых кислот в исследуемом участке клетки или ткани. В качестве примера реализации такого подхода на рис.66 приведен спектр люминесценции среза головного мозга крысы, обработанного вначале насыщенным раствором 3,4-бензпирена в 70%-ном этаноле (окраска - 3 мин, промывка 20 мин) и докрашенного затем водным раствором этидиум бромида (10-5 М, окраска 1 мин, промывка 1 мин). Длительная промывка после обработки спиртовым раствором 3,4-бензпирена необходима для удаления (механического) его ярко люминесцирующих кристаллов (рис.65) с поверхности среза. Спектр люминесценции окрашенного таким образом препарата (рис.66) содержит полосы люминесценции растворенного в липидах бензпирена (430, 454, 480 нм) и этидиум бромида, связанного с нуклеиновыми кислотами (620 нм). Соотношение интенсивностей люминесценции в областях 430 и 620 нм может, по-видимому, быть использовано для определения соотношения в изучаемом участке клетки липидов и нуклеиновых кислот. ТРЕХВОЛНОВЫЕ МЕТОДЫ По своей сути эти методы аналогичны описанным выше двухволновым методам и отличаются от них только несколько большей сложностью выбора комплекса красителей-меток и интерпретации результатов. В то же время они несут больше информации, и развитие этих методов представляется весьма заманчивым. Определение соотношения липидов, белков и нуклеиновых кислот. Рассмотрение трехволновых методов имеет смысл начать именно с этого метода из соображений удобства изложения, так как он состоит в комбинации только что описанных выше двухволновых методов определения соотношений липиды : белки и липиды: нуклеиновые кислоты. При этом используются те же люминесцентные красители-метки - 3,4-бензпирен, ДХТАФ и этидиум бромид. Данные о соотношении спектров поглощения и люминесценции этих меток и о количественном связывании их с липидами, белками и нуклеиновыми кислотами также приведены выше и нет необходимости повторять их еще раз. Срезы головного мозга крысы обрабатывают вначале (6 мин) водным раствором 3,4бензпирена (или 70%-ным спиртовым раствором 3,4-бензпирена) и в течение 1 мин докрашивают затем этидиум бромидом (10-5 М). В результате такой обработки срез приобретает люминесценцию, спектр которой представлен на рис.66, 3. Линии люминесценции растворенного в липидах 3,4бензпирена в голубой области (430, 450, 480 нм) и широкая полоса люминесценции связанного о нуклеиновыми кислотами этидиум бромида (620 нм) составляют характерную особенность этого спектра (рис. 67, 1). Последующая обработка того же препарата водным раствором ДХТАФ (10-4 М, время окраски 2 мин, промывка 2 мин) приводит к появлению в зеленой области описанного выше спектра дополнительной полосы люминесценции (530 нм) ковалентно связанного с белками ДХТАФ (рис. 67, 2, 3). Необходимо при этом отметить, что соотношение интенсивностей люминесценции 3,4бензпирена, ДХТАФ и этидиум бромида различно для разных по своей структуре и функциям участков головного мозга, что отражает, по-видимому, разное соотношение концентраций липидов, белков и нуклеиновых кислот в этих участках мозга. Порядок окраски препарата может быть изменен таким образом, что после обработки 3,4бензпиреном следует окраска белков активным красителем (ДХТАФ или ФИТЦ), а затем — обработка этидиум бромидом. Регистрируемые при этом результаты не отличаются от приведенных выше. Рис. 67. Спектры люминесценции участка среза головного мозга крысы после окраски: 1 – 3,4-бензпирен и этидиум бромид; 2 – тот же участок после дополнительной окраски ДХТАФ; 3 – другой участок того же препарата. Определение соотношения липидов, ДНК (двухспиралъных) и РНК (односпиральных нуклеиновых кислот). Этот метод основав на совместном применении 3,4-бензпирена и акридинового оранжевого и был предложен впервые Бревисом [272]. Не останавливаясь подробно на описании метода окраски препарата, рассмотрим получаемые таким методом результаты. Срез мозга крысы обрабатывают водным раствором 3,4-бензпирена (окраска 6 мин, промывка 1 мин) с последующей докраской акридиновым оранжевым 1:30 000 (рН 4,6; окраска 8 мин; промывка 3 мин). В результате такой обработки срез приобретает полихроматическую люминесценцию. Липидные включения имеют голубой цвет, ядра - зеленые, цитоплазматические включения и ядрышки - красные. Соответственно этому в спектре люминесценции (рис. 68) наблюдаются характерные линии излучения растворенного в липидах 3,4-бензпирена (430, 454 нм), а также полосы излучения мономеров (530 нм) и димеров (640 нм) акридинового оранжевого, связанных с двухспиральными (ДНК) и односпиральными (РНК) нуклеиновыми кислотами. Рис. 68. Спектры люминесценции участка среза головного мозга крысы после окраски: 1 – акридиновый оранжевый; 2 – 3,4-бензпирен и акридиновый оранжевый. Определение соотношения белков, ДНК (двухспиральных), РНК (односпиралъных нуклеиновых кислот). В качестве основного красителя при разработке этого метода [246, 247] был использован акридиновый оранжевый, спектральные характеристики которого подробно описаны выше. Поэтому для реализации идеи метода было необходимо в пару к акридиновому оранжевому подобрать такую люминесцентную метку на белки, которая наиболее полно удовлетворяла бы изложенным выше требованиям. Поиск метки проводился внутри класса активных красителей проционового типа, аналогичных по своей структуре описанному выше ДХТАФ. С этой целью были изучены спектральные характеристики проционовых красителей: алого GS, красного GS, яркокрасного 8ВS, ярко-красного 5ВS, желтого 4RS, ярко-желтого GGS, ярко-оранжевого GS, яркооранжевого 2RS, зеленого 2ВS, печатающего зеленого В и синего 3RS [277]. Спектры поглощения этих красителей приведены на рис. 69 и 70, а спектры люминесценции наиболее ярко люминесцирующих из них - на рис 69. Сравнение спектральных характеристик упомянутых проционовых красителей и акридинового оранжевого показывает, что наиболее подходящим, хотя, возможно, и не наилучшим, является проционовый печатающий зеленый В, максимум люминесценции в первой полосе которого лежит в области 450 нм. При этом необходимо отметить, что полоса поглощения этого красителя в области 600—700 нм перекрывается частично с полосой люминесценции димеров акридинового оранжевого с максимумом излучения 640 нм. При обработке срезов нервных ганглиев брюхоногого моллюска Lymnaea stagnalis (фиксация замораживанием с замещением или ФСУ (6:3:1), по В.Я. Бродскому [227]) вначале проционовым печатающим зеленым В (водный раствор, 5⋅10-4 г/мл, рН 5,6), а затем акридиновым оранжевым (цитрат-фосфатный буфер; рН 4,1; 10-4 М) возникает полихроматическая картина люминесценции гигантских нейронов [247]. Места локализации белков (аксон, нейропиль) характеризуются голубым свечением, в то время как область ядра, где расположены ДНК и белки, обладает голубовато-зеленой люминесценцией. Малиновая люминесценция (смесь голубого и красного излучения) специфична для областей цитоплазмы, богатых как белками, так и РНК (апикальный участок и аксонный холмик). Соответственно этому различные по своей структуре [278] и функциям участки гигантского нейрона (рис. 71) обладают характерными спектрами люминесценции. Основной полосой в спектре люминесценции аксона является полоса излучения печатающего зеленого В (450 нм), связанного с белками. Слабая зеленая люминесценция в области 530 нм может быть обязана своим происхождением комплексам мономеров акридинового оранжевого с цитоплазматической ДНК и двухспиральными участками РНК (рис. 71, в). Область зелено-голубого свечения ядра нейрона демонстрирует наличие двух достаточно интенсивных полос люминесценции (рис. 71), одна из которых принадлежит связанному с белком печатающему зеленому В (450 нм). Наибольшей интенсивностью в этом участке клетки обладает полоса люминесценции комплексов мономеров акридинового оранжевого (530 нм) с двухспиральными нуклеиновыми кислотами (ДНК). Участки клетки, для которых характерна высокая скорость синтеза белков и развитая сеть шероховатого эндоплазматического ретикулума (апикальный участок, аксонный холмик), имеют ярко выраженный трехполосный спектр люминесценции (рис.71, а). Наибольшую интенсивность при этом демонстрирует печатающий зеленый В (белки) и димерная форма акридинового оранжевого (640 нм), связанная, по-видимому, с односпиральными нуклеиновыми кислотами (РНК). Слабое свечение в зеленой области спектра (530 нм) обязано своим происхождением комплексам мономеров акридинового оранжевого с двухспиральными участками рибосомальной РНК, цитоплазматической (в том числе - митохондриальной) ДНК. Рис. 69. Спектры поглощения растворов проционовых красителей в концентрации 5⋅10-4 г/мл [277]. а: 1 – алый GS, 2 – яркокрасный 8BS, 3 – зеленый 2BS; б: 1 – синий 3PS, 2 – желтый, 3 – ярко-красный 4RS 5BS. Рис. 70. Спектры поглощения растворов проционовых красителей в концентрации 5⋅10-4 г/мл [277]. а: 1 – красный GS, 2 – яркооранжевый GS, 3 – ярко-желтый G GS; б: 1 – ярко-оранжевый 2RS, 2 – печатающий зеленый B. Рис. 71. Спектры люминесценции различных участков гигантского нейрона моллюска Lymnaea stagnalis, окрашенного проционовым красителем печатающим зеленым В и акридиновым оранжевым. а – апикальный участок; б – ядро; в – проксимальный участок. Длина волны возбуждения 365 нм. Рис 72. Спектры люминесценции растворов проционовых красителей [277]. а: 1 – печатающий зеленый В, 2 – яркооранжевый 2RS, 3 – ярко-оранжевый GS, 4 – красный - GS; б: 1 – ярко-красный 8ВS, 2 – желтый 4RS. Длина волны возбуждения 365 нм. Приведенные на рис. 72 спектральные характеристики достаточно хорошо согласуются с полученными разнообразными методами сведениями относительно соотношения белков, ДНК и РНК в гигантских нейронах моллюсков. Однако необходимо отметить, что комплект использованных в этом методе красителей (печатающий зеленый В и акридиновый оранжевый), по-видимому, не является иаилучшим и описание метода приведено здесь скорее для иллюстрации возможностей, связанных с новым аспектом применения хорошо известных люминесцентных красителей. Поиск люминесцирующих в голубой области спектра меток на белки следует, вероятно, в первую очередь производить среди так называемых оптических отбеливателей. Эти новые в бытовой химии вещества [279] выполняют свое назначение благодаря способности к интенсивной люминесценции в голубой области спектра. Вместе с тем к ним предъявляются требования высокой стабильности и способности прочно связываться с тканями, в том числе шелковыми и шерстяными. 3.3. Анализ спектральных характеристик Обсуждение задач, для решения которых двух- и трехволновые методы регистрации являются наиболее удобными, можно было бы продолжить, включив такие вопросы, как, например, определение соотношения живых и мертвых клеток, грампопожительных и грамотрицательных микроорганизмов, специфичность и неспецифичность связывания антител, меченных разными по цвету люминесценции соединениями и т.д. Существует, тем не менее, один методический вопрос, который, хотя бы кратко, должен быть рассмотрен здесь. Речь идет об определении соотношения интенсивностей полос люминесценции отдельных красителей в суммарном спектре люминесценции препарата. С возникающими при этом затруднениями мы сталкивались и в предыдущей главе (см. рис. 31). Их можно проиллюстрировать рис.73, где приведены спектры люминесценции двух красителей и суммарный спектр их смеси. Если, например, определять отношение интенсивности люминесценции в 530 нм (максимум кривой 2) к таковой в длине волны 450 нм (максимум кривой 1), измеряя амплитуды в соответствующих (530 и 450 нм) длинах волн регистрируемого суммарного спектра (рис. 73, 3), будет получена ошибочная величина этого отношения, равная 2,1. В то же время истинная величина этого отношения, определяемая по амплитудам парциальных спектров люминесценции красителей (рис. 73, 1, 2), равна 1,5. Рис. 73. Суммарный (3) спектр люминесценции смеси двух красителей (1, 2). Причиной такой ошибки является то, что суммарный спектр образуется сложением парциальных спектров. При этом обычно спектры люминесценции красителей представляют собой относительно широкие полосы асимметричной формы с достаточно резким подъемом в коротковолновой (относительно максимума) области и медленным плавным спадом в длинноволновой области спектра. При аддитивном сложении таких парциальных спектров это обстоятельство приводит к тому, что длинноволновый спад полосы излучения красителя, максимум которого расположен в более коротковолновой (по сравнению со вторым красителем) области, «приподнимает» полосу излучения красителя с более длинноволновым максимумом, как это видно на примере влияния полосы красителя (1) на амплитуду полосы красителя (2) в их суммарном спектре (3). В то же время благодаря резкому спаду коротковолновой части полосы излучения красителя (2) ее присутствие в суммарном спектре мало влияет на амплитуду люминесценции красителя (1) с максимумом в более коротковолновой области спектра. В ряде случаев, когда максимумы люминесценции отстоят достаточно далеко один от другого (например, 3,4-бензпирен и этидиум бромид, рис. 66), или в случае красителей с линейчатым спектром взаимным влиянием полос люминесценции красителей можно пренебречь. Однако в большинстве случаев этот эффект необходимо учитывать. Простейший способ учета вклада соседних полос люминесценции в интенсивность излучения в максимуме одного из красителей в суммарном спектре был описан ранее (рис. 31) и состоит в предварительном нормировании спектра люминесценции красителя (1). Тогда, измерив его амплитуду в максимуме, можно всегда определить и интенсивность люминесценции этого красителя в длине волны, совпадающей с максимумом люминесценции красителя (2). Вычитая определенный таким образом вклад красителя (1) из общей интенсивности люминесценции в максимуме красителя (2), получают истинную интенсивность люминесценции красителя, используемую затем для вычисления безразмерного параметра (ξ, α, β и т.д.), характеризующего соотношение тех или иных веществ в клетке. При большом объеме данных перспективным является применение вычислительной техники для автоматизации этой процедуры. Информация может вводиться в УЦВМ в виде магнитной записи [280], перфоленты [281] или непосредственно в графической форме с бланка самописца. В память машины вводятся также парциальные спектры люминесценции красителей. По соответствующим алгоритмам УЦВМ производит разбиение суммарных спектров люминесценции препарата на парциальные спектры соединений, использованных для его окраски. Например, с помощью спектрочитающего устройства в УЦВМ «Раздан-2» были введены с бланка самописца парциальные спектры люминесценции, моделирующие характеристики мышечной клетки (рис. 30; рис. 74, 1, 2). По требованию оператора в соответствии с алгоритмом УЦВМ произвела сложение этих спектров (рис. 74, 3), а затем из суммарного спектра вычла один из составляющих компонентов (рис. 74, 1) и в результате получила, как это и должно быть, кривую 4 (рис. 74), практически совпадающую по форме и амплитуде с исходным спектром (рис. 74, 2). Рис. 74. Сложение (3) и вычитание (4) двух спектров (1, 2) с помощью УЦВМ. Трудоемкость анализа при использовании ЦВМ может быть значительно снижена, если помимо записи спектров в графической форме на самописце будет параллельно производиться запись той же информации в цифровой форме на магнитный носитель или на перфоленту [281]. Другой подход к решению этой задачи заключается в использовании специализированных аналоговых вычислительных машин, позволяющих синтезировать суммарный спектр из отдельных полос, меняя их форму, амплитуду и положение в спектральном диапазоне. Примером реализации такого подхода может служить разработанный в Институте белка АН СССР и выпускаемый СКБ БП АН СССР прибор СК-2 [282]. Подбирая амплитуду и форму составляющих суммарный спектр полос излучения (до 7 отдельных полос) с максимумами, расположенными в известных длинах волны, исследователь может синтезировать суммарный спектр, совпадающий с полученным в эксперименте, и таким образом определить парциальные составляющие анализируемого спектра (рис. 75). Преимуществом такого способа является то, что в этом случае отпадает необходимость в трудоемкой операции перекодировки исходных данных из аналоговой формы в цифровую и обратно. Имея в виду возможность использования этого прибора не только для полуавтоматического анализа оптических спектров, но и для обработки спектров ЯМР, ЭПР, хроматографических кривых и т. д., можно предполагать, что такого типа системы обработки данных будут иметь широкое распространение. Рис. 75. Синтез суммарных спектров на приборе СК-2. Обратить внимание на смещение левого максимума люминесценции в суммарном спектре в случае достаточно широкой (а) полосы компонента. При сужении (б) полосы левого компонента сдвиг в суммарном спектре не наблюдается. Более прямой метод устранения взаимного влияния полос излучения и поглощения красителей состоит в раздельном возбуждении люминесценции каждого из них излучением с заранее выбранной длиной волны. Интенсивности люминесценции красителей при этом измеряются также раздельно в области максимумов излучения, что требует коренного изменения техники возбуждения и регистрации люминесценции. Такой подход был использован Чансом и соавт. [283] при раздельном измерении люминесценции восстановленных пиридиннуклеотидов и окисленных флавопротеинов перфузируемых тканей (печень и сердце), а также И.Я.Барским и Г.В.Папаяном в микрофлуориметре, описанном ниже [284]. Большие перспективы открываются также с разработкой систем, позволяющих регистрировать спектры люминесценции образцов через малые и изменяемые промежутки времени (10-9 с) после прекращения возбуждения. В этом случае появляется возможность разделить спектры соединений с разным временем жизни возбужденного состояния. Глава 4. Люминесцентные красители.2. Исследование динамики функциональной организации клеточных структур В данной главе приводится ряд примеров использования красителей, квантовый выход которых сильно меняется при связывании их с различными компонентами клеточных структур и зависит от окружения, для изучения молекулярной организации функциональных механизмов клетки. Выбор примеров достаточно произволен, и основная задача их - проиллюстрировать как возможности, так и трудности применения люминесцентных меток для изучения живой клетки и ее органоидов. 4.1. Взаимодействие контрактильных белков в процессе мышечного сокращения Одной из возможных причин возникновения сил, позволяющих мышце совершать механическую работу за счет использования потенциальной энергии химических связей АТФ, является взаимодействие полярных групп сократительных белков. Поэтому исследование топографии разноименно заряженных полярных групп белков в структуре элементарной ячейки сократительного аппарата мышцы (саркомера) и ее изменения в процессе сокращения - один из важнейших аспектов изучения механизма мышечной деятельности. Использование люминесцентных красителей-меток и техники спектрального анализа клеток открывает новые возможности в этом направлении. Для исследования использовались живые и глицеринизированные мышечные волокна psoas кролика, портняжной мышцы лягушки и запирательного мускула Balanus [54, 285]. Приготовление глицеринизированных волокон производилось по общепринятой методике [286, 287]. Локализацию красителей в структуре саркомера определяли, фотографируя препараты на люминесцентном микроскопе. Распределение оптических плотностей на негативах измеряли на модифицированном микрофотометре МФ-4. Спектры люминесценции регистрировали с помощью универсального микроспектрофлуориметра, снабженного приставкой для регистрации изменения интенсивности люминесценции в двух избранных интервалах (10-12 нм) видимой области спектра [105]. Люминесценцию объекта возбуждали линией излучения дуговой ртутной лампы ДРШ-250 с длиной волны 365 нм, выделяемой светофильтром УФС-6. Размер фотометрируемого участка составлял 5×15 мкм. Применение многоканального самописца позволяло параллельно с изменением интенсивности люминесценции в двух длинах волн регистрировать натяжение мышечного волокна, используя для этой цели пьезокерамические датчики или тензодатчики. Ввиду того, что многие органические красители, в особенности анионные, помимо электростатического взаимодействия способны к гидрофобному взаимодействию с макромолекулами белков [288], в первую очередь была изучена гидрофобная структура саркомера. С этой целью применялась аммонийная соль 8-анилино-1-нафталеносульфоната (АНС), обладающего способностью избирательно связываться с гидрофобными участками белковых молекул. Свойство этого красителя резко (в 20-100 раз) увеличивать интенсивность люминесценции при адсорбции на гидрофобную область белковых молекул позволило использовать его для обнаружения локальных деформаций мышечных белков [51, 52], для определения локализации гидрофобных участков в саркомере [53] и для оптической регистрации изменения структуры мембраны при возбуждении нервного волокна. АНС 8-анилино-1-нафталеносульфонат С16Н15N2SО3 Спектр поглощения этого анионного красителя приведен на рис. 76. Интенсивность люминесценции АНС с максимумом 548 нм весьма незначительна в растворе и резко увеличивается при связывании его с волокном. При этом происходит смещение максимума люминесценции в область 490 нм. Добавление раствора АТФ к препарату окрашенного волокна вызывает его изотоническое сокращение и увеличение интенсивности люминесценции. Рис. 76. Спектры поглощения растворов красителей (фосфатный буфер, рН=6,8). а – АНС (1) и аурамин 00 (2) в концентрации 10-5 г/мл; б – тиазоловый желтый в концентрации 2,5⋅10-5 г/мл. Это изменение интенсивности люминесценции могло быть обусловлено следующими факторами: 1. Увеличением количества окрашенного субстрата в поле зрения микроскопа при сокращении мышечного волокна. 2. Увеличением количества возбуждающего люминесценцию излучения, поглощенного волокном, за счет увеличения светорассеяния при сокращении [289]. 3. Увеличением квантового выхода красителя. 4. Увеличением количества групп, специфически связывающих краситель. Возможно также, что все эти факторы вносят свой вклад в наблюдаемое увеличение интенсивности люминесценции красителя. Локализация АНС в А- и Z-полосах саркомера совпадает с описанной ранее [53]. С целью изучения распределения электроотрицательных полярных групп белков в структуре саркомера был использован катионный краситель аурамин ОО, ценным качеством которого является полное отсутствие его люминесценции в растворе. Электростатическое взаимодействие аурамина ОО с отрицательно заряженными полярными группами субстрата позволяет молекулам этого красителя приобрести необходимую жесткость структуры и сопровождается появлением интенсивной люминесценции их с максимумом 520 нм. АУРАМИН ОО Тетраметилдиамино-дифенилкетоиминогидрохлорид С17Н22N3Cl м. в. 303,84 При окрашивании глицеринизированных миофибрилл аурамин ОО локализуется так же, как и АНС, в области А- и Z-полос саркомера. Изотоническое сокращение окрашенного аурамином ОО глицеринизированного волокна под действием АТФ приводит к увеличению интенсивности люминесценции красителя на 60-70%. Ввиду того, что роль гидрофобных взаимодействий при связывании катионных красителей с белками мала [288], можно предполагать, что в данном случае аурамин ОО выявляет локализацию электроотрицательных групп белков в структуре саркомера. Аналогичным образом взаимодействует с мышечными белками и другой катионный краситель - акридиновый оранжевый [206, 290], основным недостатком которого является значительная люминесценция его в растворе. Для определения локализации электроположительных групп белков в структуре саркомера был использован анионный краситель - тиазоловый желтый. Ценной особенностью, определившей использование этого красителя, является относительно слабая люминесценция его с максимумом 420 нм в растворе. Интенсивность люминесценции тиазолового желтого резко возрастает при связывании его субстратом. При этом происходит смещение максимума в область 450 нм. ТИАЗОЛОВЫЙ ЖЕЛТЫЙ (Титановый желтый) С28Н19N5О6S4Na2 м. в. 695,75 При окрашивании тиазоловым желтым глицеринизированных миофибрилл оказалось, что он локализуется так же, как АНС и аурамин ОО, в области А- и Z-полос саркомера. Однако в отличие от этих красителей, интенсивность люминесценции глицеринизированного волокна, окрашенного тиазоловым жёлтым, незначительно уменьшается при изотоническом сокращении волокна под действием АТФ. Поэтому можно предполагать, что связывание тиазолового желтого с мышечными белками в отличие от АНС не является гидрофобным. В то же время, если наблюдаемое увеличение интенсивности люминесценции АНС и аурамина ОО при сокращении мышечного волокна под действием АТФ может быть объяснено влиянием чисто физических и аппаратурных факторов, таких, как увеличение количества окрашенного субстрата в поле зрения микроспектрофлуориметра или увеличение оптической плотности волокна при сокращении, то уменьшение интенсивности люминесценции тиазолового желтого может быть объяснено только взаимодействием его с исследуемым субстратом. Для выявления локализации полярных групп в структуре саркомера было изучено взаимодействие более чем 100 различных люминесцентных меток с белками глицеринизированных миофибрилл. Установлено, что положительно и отрицательно заряженные полярные группы белков имеются только в области А- и Z-полос. Там же локализуются и метки гидрофобных участков белковых молекул. Ни одним из использованных красителей не удается окрасить I-полосу саркомера. Это означает, что в актиновых нитях не имеется свободных полярных или гидрофобных групп. Судя по распределению интенсивности люминесценции в А-полосе (различие между Н-зоной и областью перекрытия актиновых и миозиновых нитей), приближение миозиновых нитей «активирует» появление заряженных групп в актиновых нитях в области перекрытия. Возможно, что именно этот механизм лежит в основе возникновения положительной обратной связи, обеспечивающей генерацию силы или перемещение при сокращении. Исследование изменения полярной структуры саркомера в процессе его сокращения представляет достаточно сложную в методическом отношении задачу. Внимательный анализ накопленного опыта показывает, что известные методы использования красителей-меток неприменимы для изучения процессов, протекающих при сокращении мышечного волокна, ввиду резкого изменения оптических и геометрических параметров самого объекта. В этом случае изменение интенсивности люминесценции красителя, связанного с волокном, зависит от многих, в том числе и от аппаратурных факторов. С целью обойти трудности, возникающие в связи со спецификой объекта, были разработаны новые методические подходы, основанные, в частности, на одновременном применении двух люминесцентных меток. Измеряемым параметром при этом служит не изменение абсолютной интенсивности люминесценции метки, а изменение соотношения интенсивностей люминесценции двух меток, взаимодействующих с определенными группами белков и между собой. Этот параметр уже в значительной мере не зависит от аппаратурных факторов и отражает в основном перестройки макро-молекулярной структуры сократительного аппарата. Такой подход оказался хотя и трудоемким (особенно этап подбора соответствующих меток, когда из 100-120 предварительно изученных соединений удается отобрать 2-3 пригодных для дальнейшей работы), но в достаточной мере перспективным. В частности, таким образом была выявлена донорно-акцепторная пара - тиазоловый желтый и аурамин ОО. Оба этих красителя локализуются в одних и тех же участках саркомера - в области А- и Zполос. При последовательной окраске вначале аурамином отрицательно, а затем тиазоловым желтым положительно заряженных групп белков глицеринизированного мышечного волокна спектр люминесценции его состоит из двух полос излучения (рис. 77, 1) примерно равной интенсивности с максимумами 450 нм (тиазоловый желтый) и 520 нм (аурамин ОО). Добавление АТФ в концентрации 10-2 М к окрашенному таким образом глицеринизированному волокну приводило к изотоническому сокращению его, сопровождающемуся уменьшением интенсивности полосы излучения тиазолового желтого и увеличением интенсивности полосы излучения аурамина ОО (рис. 77, 2). Рис. 77. Взаимодействие люминесценции меток при сокращении мышцы. а – спектры люминесценции глицеринового мышечного волокна, окрашенного последовательно аурамином 00 и тиазоловым желтым, до 91) и после (2) сокращения волокна под действием АТФ; б – схема возможного распределения полярных групп и люминесцентных меток в А-диске саркомера. Длина волны возбуждения 365 нм. Дополнительные исследования [285] показали, что в основе наблюдаемого эффекта лежит миграция энергии возбуждения от молекул тиазолового желтого к молекулам аурамина ОО благодаря почти полному перекрытию полосы излучения тиазолового желтого с полосой поглощения аурамина ОО. При этом степень миграции энергии зависит от расстояния между молекулой-донором (тиазоловый желтый) и молекулой-акцептором (аурамин ОО) так, что гашение люминесценции тиазолового желтого на 10% наблюдается при расстоянии между метками около 250 Å. Сближение этих молекул до 170-180 Å увеличивает степень гашения люминесценции тиазолового желтого до 70% (рис. 78). Таким образом, данные о локализации тиазолового желтого и аурамина ОО (А- и Z-полосы) и зависимости степени гашения люминесценции тиазолового желтого аурамином ОО от расстояния между ними позволяют интерпретировать приведенный на рис. 77 эффект. По-видимому, в сократительных белках актомиозиновой области саркомера имеются чередующиеся положительно и отрицательно заряженные полярные группы, с которыми связываются тиазоловый желтый (—) и аурамин ОО (+) соответственно. Сокращение окрашенного таким образом глицеринизированного волокна приводит к сближению разноименных полярных групп сократительных белков и связанных с ними красителей, что сопровождается гашением люминесценции тиазолового желтого приблизившимся к нему аурамином ОО. Разноименно заряженные группы сократительных белков актомиозиновой части несокращенного саркомера расположены на расстоянии более 250 Å. В противном случае часть люминесценции тиазолового желтого была бы уже погашена и не наблюдалось бы столь сильного тушения его люминесценции (до 72%), как это показано на рис. 77. При сокращении волокна эти группы сближаются до расстояния около 150 Å, и степень гашения люминесценции тиазолового желтого составляет 70-80% (рис. 77, 78). Сближение этих красителей до меньшего расстояния приводило бы к практически полному гашению люминесценции, однако, при полном сокращении волокна всегда остается заметной полоса излучения тиазолового желтого, интенсивность которой составляет около 15-20% от исходной. Рис. 78. Зависимость интенсивности люминесценции раствора (10-4 М) тиазолового желтого о концентрации аурамина 00 в этом же растворе. Приведенные оценки расстояний между разноименно заряженными группами белков являются ориентировочными и требуют уточнения, так как, например, сохранение люминесценции тиазолового желтого при полном сокращении волокна может происходить и за счет связанного в области Z-полосы красителя, возможно не меняющего свою излучательную способность при сокращении. В заключение необходимо отметить, что применение метода двойной окраски к исследованию живого мышечного волокна наталкивается на определенные трудности, связанные с многокомпонентностью этой системы. Закономерности изменения спектров люминесценции здесь более сложные. Естественно, для интерпретации изменения спектра люминесценции окрашенного аурамином и тиазоловым желтым глицеринизированного волокна необходимо попытаться точнее установить природу мест связывания этих меток на волокне. Такая попытка может быть сделана с использованием модельных объектов. В качестве модели были выбраны интактные митохондрии [291], позволяющие изменять количество отрицательно заряженных групп на их поверхности. Известно, что сдвиг соотношения окисленных и восстановленных форм компонентов дыхательной цепи интактных митохондрий сопровождается изменением количества полярных групп на внешней митохондриальной мембране [55, 56, 292]. Изменение окислительно-восстановительного состояния может быть вызвано действием соответствующих ингибиторов, субстратов или разобщителей окислительного фосфорилирования и проконтролировано по интенсивности люминесценции НАД⋅Н (460-470 нм) и окисленных флавопротеинов (520 - 530 нм). Выделенные митохондрии печени крысы характеризуются спектром люминесценции (рис. 79, 1) с широкой вершиной, состоящей из максимумов излучения НАД⋅Н (460-470 нм) и окисленных флавопротеинов (520-530 нм). При добавлении к суспензии субстрата окисления - янтарной кислоты - наблюдается увеличение интенсивности люминесценции НАД⋅Н и характерные изменения люминесценции НАД⋅Н в ответ на добавки Са2+, что позволяет оценить функциональное состояние митохондрии в суспензии. Спектры люминесценции регистрировали на микроспектрофлуориметре. Для возбуждения люминесценции использовали линию излучения дуговой ртутной лампы ДРШ-250, выделяемую светофильтром УФС-6. При изучении кинетики интенсивности люминесценции применяли спектральное двухканальное устройство, позволяющее непрерывно регистрировать на многоканальном самописце изменение интенсивности люминесценции в полосах шириной 7-10 нм в заранее выбранных (460 и 540 нм) участках спектра (рис. 79). Изменение спектра люминесценции митохондрии при окрашивании их аурамином ОО в концентрации 10-5 М (рис. 79, 2) свидетельствует о том, что взаимодействие аурамина с митохондриальной мембраной приводит к окислению дыхательной цепи митохондрии (на это указывает снижение интенсивности люминесценции НАД⋅Н). Увеличение интенсивности люминесценции в области 520-530 нм происходит, по-видимому, как за счет связывания аурамина, так и за счет увеличения концентрации окисленных флавопротеинов, максимум люминесценции которых, к сожалению, совпадает с максимумом люминесценции красителя. При повышении концентрации аурамина наблюдается дальнейший рост интенсивности люминесценции в области 520-530 нм в основном за счет связывания красителя с мембраной митохондрий (рис. 79, 3, 4). Наиболее отчетливо это прослеживается при титровании, результаты которого приведены на рис. 80. Аурамин ОО оказывает разобщающее действие на окислительное фосфорилирование даже в малых концентрациях, о чем свидетельствует окисление НАД⋅Н, регистрируемое по снижению его люминесценции (рис. 80, 1а, б). Рис. 79. Изменение спектра люминесценции суспензии митохондрий при окраске их аурамином 00. Концентрация аурамина 00: 1 – 0; 2 – 10-5 М; 3 2⋅10-5 М; 4 – 10-4 М. Длина волны возбуждения 365 нм. Штриховкой показаны спектральные участки регистрации кинетики (см. рис. 80). Рис. 80. Изменение интенсивности люминесценции НАД Н (1) и аурамина 00(2) в суспензии митохондрий в разных (а, б) функциональных состояниях при увеличении концентрации красителя. При ухудшении функционального состояния митохондрий (б) наблюдается сдвиг кривых в сторону меньших концентраций аурамина при сохранении их формы. По оси ординат – интенсивность люминесценции в отн. ед. По оси абсцисс – концентрация аурамина 00 в молях. Монотонное изменение интенсивности люминесценции аурамина и НАД⋅Н происходит при увеличении концентрации красителя до 5.10-4 М. Дальнейшее увеличение концентрации аурамина приводит к значительному спаду интенсивности его люминесценции (рис. 80, 2а). Концентрация 5⋅10-4 М соответствует, по-видимому, насыщению аурамином отрицательно заряженных центров связывания красителя на мембране митохондрий. Блокирование аурамином этих центров приводит к резкому окислению НАД⋅Н (рис. 80, 1а), сопровождающемуся, вероятно, уменьшением количества отрицательно заряженных групп на внешней митохондриальной мембране. На основании этих экспериментальных данных можно полагать, что в состав отрицательно заряженных групп митохондриальной мембраны, с которыми связывается аурамин, входят специфические места связывания Са2+. На обоснованность такого предположения указывает наличие конкуренции между аурамином и Са2+ за места связывания. Добавки Са2+ к суспензии митохондрий, окрашенных аурамином, приводят к ступенчатому спаду интенсивности люминесценции аурамина, величина которого постепенно уменьшается (рис. 81, а, 1). Параллельно этому наблюдаются слабые изменения люминесценции НАД⋅Н, регистрируемые в области 460 нм (рис. 81, а, 2). Возможно, что отмеченное на рис. 80 снижение интенсивности люминесценции аурамина при увеличении его концентрации более 5⋅10-4 М также обусловлено вытеснением молекул красителя с групп связывания кальцием, концентрация которого в среде растет за счет выхода его из внутреннего объема митохондрий при окислении дыхательной цепи, сопровождаемом уменьшением интенсивности люминесценции НАД⋅Н. Рис. 81. Изменение интенсивности люминесценции митохондрий, окрашенных аурамином 00 в концентрации, выше насыщающей, при последовательных добавках. а – янтарной кислоты и Са2+, Mg2+ и La2+. Положение точки перегиба на кривой титрования (рис. 80) зависит от функционального состояния используемых в опыте митохондрий. При ухудшении этого состояния, регистрируемом по изменению люминесцентного ответа НАД⋅Н на добавки Са2+ (рис. 80, а, б) и повышению общей окисленности дыхательной цепи, точка перегиба смещается в область концентрации аурамина 4⋅10-5 М при сохранении формы кривых (рис. 80, 1б, 2б). На возможность взаимодействия аурамина с местами связывания Са2+ указывает и то, что он оказывает на митохондриальную мембрану такое же действие, как и лантан - известный ингибитор энергозависимого накопления Са2+ в митохондриях [293]. Добавление к суспензии митохондрий La3+ в концентрации, превышающей количество мест связывания аурамина, приводит к характерному изменению ответов люминесценции НАД⋅Н на добавление Са2+ (рис. 82, 2). В этом случае наблюдается ступенчатое снижение интенсивности люминесценции, так же как и при добавлении Са2+ к суспензии митохондрий, окрашенных аурамином в концентрации, выше насыщающей (рис. 81, а). Добавление Са2+, Мg2+- и Lа3+ к суспензии митохондрий, окрашенных аурамином, приводит к однотипному ступенчатому снижению интенсивности люминесценции красителя (рис. 81, б). Повидимому, эти катионы конкурируют с красителем за места связывания на митохондриальной мембране и вытесняют его в раствор, где аурамин теряет способность люминесцировать. Рис. 82. Изменение интенсивности люминесценции НАД Н митохондрий в ответ на добавки янтарной кислоты и Са 2+. 1 – интактные миохондрии; 2 – митохондрии, обработанные 50 мМ La3+. 4.2. Изучение динамики кальция при функционировании клеток Важнейшая роль ионов Са2+ в регуляции различных функциональных механизмов клетки в настоящее время широко известна [294, 295], и потому интерес к методам определения его в клетках постоянно возрастает. Одним из наиболее старых применяемых в гистологии методов обнаружения кальция является метод, основанный на образовании ярко окрашенных лаков его при взаимодействии с гематоксилином или с ализариновыми красителями [32]. Широко распространен метод с ализариновым красным S (рис. 83), который образует с кальцием нерастворимый лак краснооранжевого цвета. Локализация лака наблюдается при микроскопировании препарата в проходящем свете. Специфичность этого метода невысока, так как и другие ионы металлов (алюминий, хром, барий, стронций, железо, бериллий, кадмий, лантан, свинец и т.д.) могут образовывать с ализариновым красным лаки, окраска которых меняется от ярко-алого для алюминия до пурпурночерного для железа [296]. Рис. 83. Спектр поглощения ализаринового красного S. По-видимому, более высокой специфичностью обладает люминесцентный вариант метода обнаружения кальция с ализариновым красным [297-300]. Однако последовательность протекающих при этом реакций образования продуктов с различными свойствами, в том числе и с оптическими, достаточно сложна, и ее, по-видимому, полезно рассмотреть подробнее с целью получить основу для интерпретации наблюдаемой окраски препаратов. При этом необходимо сразу отметить два обстоятельства. Первое из них заключается в том, что сами по себе сухие лаки ализаринового красного S с двухвалентными ионами люминесценцией не обладают. По-видимому, образование лака - конгломератов и длинных цепочек из молекул красителя, соединенных двухвалентными ионами, приводит как к сдвигу спектра люминесценции в инфракрасную область, так и к резкому повышению вероятности безызлучательной диссипации поглощенной красителем энергии возбуждающего люминесценцию излучения. Второе обстоятельство, которое, по-видимому, необходимо учитывать, заключается в том, что сам ализариновый красный является типичным анионным красителем, способным к электростатическому взаимодействию с положительно заряженными группами различных компонентов биологического объекта, помимо его способности к специфическому взаимодействию с ионами металлов. АЛИЗАРИНОВЫЙ КРАСНЫЙ S С14Н7 О7SN2⋅Н2О м. в. 360,28 Действительно, кристаллы ализаринового красного S обладают люминесценцией с максимумом излучения в красной (670-680 нм) области спектра (рис. 84, 1). Растворение кристаллов в дистиллированной воде приводит к некоторому расширению этой полосы люминесценции и появлению дополнительного плеча с максимумом в районе 520 нм (рис. 84, 2). Это плечо, повидимому, обязано своим происхождением комплексам, в которых одна молекула ализаринового красного соединена с одним ионом Са2+. На обоснованность такого предположения указывает то, что при добавлении к раствору красителя раствора СаСl2 наблюдается выпадение хлопьевидного осадка с максимумом люминесценции в области 520 нм (рис. 84, 3). Образовавшийся комплекс оказывается неустойчивым и сразу же после образования спектр люминесценции его изменяется так, что интенсивность максимума излучения в зеленой области (520 нм) начинает падать одновременно с появлением и ростом полосы люминесценции в красной области спектра (685 нм). В течение нескольких минут этот новый максимум становится основным (рис. 84, 4) в спектре люминесценции осадка. Причиной наблюдаемого изменения спектра люминесценции осадка является, по-видимому, образование таких комплексов, в которых один ион Са2+ связывает две молекулы ализаринового красного S. Происходящее при этом объединение π-орбит двух молекул красителя и приводит, вероятно, к смещению полосы люминесценции из зеленой в красную область спектра. Полезно отметить здесь, что спектр люминесценции такого двойного комплекса ализаринового красного S c Са2+ (рис. 84, 4) сильно отличается по форме от спектра люминесценции свободных молекул красителя в растворе (рис. 84, 2) или в кристаллах (рис. 84, 1). Рис. 84. Спектры люминесценции ализаринового красного S. 1 – кристаллы красителя; 2 – насыщенный раствор; 3 – осадок выпадающий после добавления CaCl2 к насыщенному раствору; 4 – влажный осадок, остающийся после испарения воды из осадка, выпавшего после добавления CaCl2; 5 – 9 – изменение интенсивности люминесценции влажного осадка при постепенном испарении из него остатков воды. Длина волны возбуждения 436 нм. Осадок, обладающий спектрами люминесценции 3 – 9, в проходящем свете имеет красный цвет. В дальнейшем по мере высыхания осадка и испарения из него воды наблюдается постепенное уменьшение интенсивности красного максимума люминесценции (рис. 84, 4-9), что связано, повидимому, с образованием полимерных цепочек из чередующихся молекул красителя и кальция, т.е. с образованием собственно лака. Сложность интерпретации результатов взаимодействия клеток с ализариновым красным S при использовании только визуального наблюдения может быть проиллюстрирована на примере рецептора растяжения речного рака. После обработки этого препарата насыщенным раствором красителя возникает довольно яркая красная люминесценция различных структур этого объекта. При наблюдении одного и того же препарата, как в свете его люминесценции, так и в проходящем свете можно видеть, что некоторые структуры, такие, например, как ядра глиальных клеток, окружающих нейроны рецептора, не обладают заметной люминесценцией, хотя в проходящем свете в них наблюдается высокая плотность красного пигмента. В то же время мышечные клетки характеризуются как высокой плотностью красного пигмента, наблюдаемого в проходящем свете, так и довольно яркой красной люминесценцией. Ядра рецепторных нейронов отличаются по цвету люминесценции (желто-оранжевая) от мышечных клеток. Таким образом, сравнение окраски препарата в проходящем свете и в свете люминесценции указывает на большую специфичность люминесцентного варианта. Сравнивая спектры люминесценции, полученные в модельных опытах (рис. 84) и при изучении различных участков рецептора растяжения (рис. 85), можно сделать заключение, что, действительно, наблюдаемое в проходящем свете распределение красителя обязано своим происхождением как образованию истинных лаков с Са2+ (например, нелюминесцирующие осадки в ядрах глиальных клеток), так и прямому электростатическому взаимодействию ализаринового красного с положительно заряженными группами белков, а также с ионами Са2+, связанными с отрицательно заряженными группами белков. Спектры люминесценции клеток. содержат две основные полосы излучения. Одна из них характерна для одиночных молекул красителя (ср. рис. 84, 2 и рис. 85, 3), в то время как другая полоса с максимумом излучения в области 520 нм принадлежит комплексу одного иона Са2+ с одной молекулой ализаринового красного. Таким образом, люминесценцию различных структур, в том числе мышечных клеток, следует, по-видимому, отнести за счет электростатического взаимодействия самих молекул красителя с полярными группами белков. При этом возникает вопрос о специфичности такого взаимодействия и о роли мест связывания Са2+ на белках в этом процессе. Рис. 85. Спектры люминесценции рецептора растяжения речного рака, флуорохромированного насыщенным раствором ализаринового красного в течение 10 мин. 1 – аксонный холмик медленно адаптирующегося нейрона; 2 – ядро того же нейрона; 3 – участок медленно адаптирующейся мышцы; 4 – 7 – изменение спектра люминесценции медленно адаптирующейся мышцы в течение 14 мин после добавления к препарату (3) нескольких кристаллов ЭДТА; 8 – дендрит медленно адаптирующегося нейрона после обработки препарата ЭДТА. Рост красной люминесценции одного и того же участка мышцы (рис. 85, 3) после добавления к препарату ЭДТА (рис. 85, 4-7) указывает на возможность взаимодействия красителя с группами белков, блокированными ионами Са2+. В качестве другого примера люминесцентного индикатора кальция, использовавшегося в гистохимии, может быть назван флуорексон [301, 302]. Это соединение совместно с тетрациклином было применено для разработки двухцветной окраски минерализованных тканей [303]. ФЛУОРЕКСОН 2, 4-Бис-[N, N'-ди(карбоксиметил)аминометил]флуоресцеин. Флуоресцеинкомплексон. Кальцеин С30Н26N2О13 м. в. 622,55 И, наконец, наибольшее распространение в качестве люминесцентной метки кальция в последнее время получил антибиотик тетрациклин. Способность тетрациклина образовывать с кальцием хеллат [304] была использована для разработки методов исследования кальция не только в минерализованных тканях [305, 306], но и в различных клетках [307] и их органоидах [308-311]. ХЛОРТЕТРАЦИКЛИН Ауреомицин С22Н23 О8N2Cl м. в; 478,9 Весьма интересные данные о росте и минерализации кости были получены при комплексном применении всех трех упомянутых выше меток [312]. Животным вводили сначала ализариновый красный S, через неделю - окситетрациклин b еще через неделю - флуорексон. По прошествий недели после введения флуорексона изготавливали препараты костей и их люминесценцию исследовали микроскопически. В результате такой обработки вокруг гаверсовых полостей кости образовывались концентрические зоны разного цвета люминесценции. Наиболее удаленная от гаверсова канала область обладала красной люминесценцией ализарина, далее следовала область золотисто-желтой люминесценции окситетрациклина и непосредственно к гаверсовой полости примыкало кольцо зелёной люминесценции флуорексона. Эта работа представляет собой пример изящного применения трехцветного люминесцентного метода, позволяющего легко проследить направление и скорость минерализации кости. Одним из важнейших и наиболее трудных вопросов, возникающих при попытке использовать люминесцентные, красители-метки для изучения функциональных механизмов клетки является вопрос о природе субстрата, связывающего люминесцентную метку. Большая сложность и многокомпонентность клетки, наличие в ней взаимодействующих структурных органоидов, имеющих зачастую сходные механизмы действия, не позволяют использовать непосредственно представления о взаимодействии метки с какими-либо чистыми веществами in vitro для интерпретации данных, полученных при исследовании клетки. Необходимым, обычно, является проверка этих представлений на все более усложняющихся модельных объектах, таких, как суспензия митохондрий и их наружных и внутренних мембран, саркоплазматический ретикулум, сократительный аппарат и т.д. Не менее полезным является использование в качестве моделей узкоспециализированных клеток, в которых изучаемый механизм представлен наиболее ярко. Некоторые подходы подобного типа были описаны выше. Определенную пользу может принести также прием, заключающийся в применении к одному и тому же препарату последовательно нескольких люминесцентных меток одного и того же субстрата. Наблюдаемые при этом зачастую конкурентные отношения меток, обладающих разной по цвету люминесценцией, могут доставить ценную информацию. Например, изложенные выше данные, полученные при исследовании суспензий митохондрий, указывают на возможность взаимодействия аурамина с местами специфического связывания кальция на белках. Поэтому представлялось интересным сравнить локализацию аурамина с локализацией одиночных молекул ализаринового красного S на белках одного и того же препарата. Оказалось, что если препарат рецептора растяжения рака, окрашенный ализариновым красным, дополнительно обработать аурамином, то последний вытесняет с белков ализариновый красный. Это видно не только по замене его красной люминесценции на зеленую люминесценцию аурамина, но и по ослаблению плотности ализарина в проходящем свете в местах его непосредственной связи с белками (мышца). Таким образом, аурамин (катион) выступает здесь как своеобразный конкурент молекул ализаринового красного S (анион) за места связывания на белках. Места, за которые может происходить конкуренция, представляют собой, по-видимому, отрицательно заряженные группы белков, блокированные Са2+ и приобретающие таким образом положительный заряд. Анион ализаринового красного электростатически связывается с ионом Са2+, в свою очередь связанным с отрицательно заряженной группой белка. Появившийся в среде катион аурамина, взаимодействуя с отрицательно заряженными группами белков, вытесняет с них Са2+, через который осуществлялась связь аниона ализаринового красного с этими группами. Точно также можно наблюдать взаимоотношения ализаринового красного S и хлортетрациклина, о котором известно, что интенсивность его люминесценции на несколько порядков выше, если он связан с кальцием и находится в неполярном окружении — в мембранах [308, 309, 313]. При окрашивании препарата рецептора растяжения рака хлортетрациклином можно наблюдать яркую зеленую люминесценцию мышц, приядерных и примембранных областей обоих нейронов. Дополнительная окраска препарата ализарином приводит почти к полному замещению зеленой люминесценции хлортетрациклина красной люминесценцией ализарина. Докраска этого же препарата хлортетрациклином только частично возвращает зеленую люминесценцию, наиболее заметную в медленно адаптирующейся мышце. Следует при этом отметить, что в отличие от аурамина хлортетрациклин не вытесняет из препарата красный продукт взаимодействия ализарина с белками мышц, наблюдаемый в проходящем свете. По-видимому, места связывания этих люминесцентных меток различны. Результаты подробных исследований взаимодействия хлортетрациклина с митохондриальной суспензией (рис. 86) указывают на то, что основной вклад в люминесценцию вносит комплекс хлортетрациклина с Са2+, находящийся в гидрофобной области митохондриальной мембраны [313]. Приведенные выше сравнительные наблюдения показывают, что хотя все три красителя имеют отношение к кальцию, они характеризуют, однако, разные аспекты его обмена в клетке. Свободный кальций определяется ализариновым красным S по местам локализации зеленой люминесценции его одиночных комплексов с красителем (520 нм), по узкополосной (рис. 84, 4) красной люминесценции (685 нм) комплексов кальция с двумя молекулами красителя или по местам локализации красного нелюминесцирующего лака, наблюдаемого в проходящем свете. Молекулы ализаринового красного S, являющегося анионным красителем, способны к электростатическому взаимодействию с Са2+, связанным с отрицательно заряженными группами белков. В этом случае ализариновый красный S обладает характерной широкополосной люминесценцией кирпично-красного цвета (рис. 84, 2; рис. 85, 1, 3) и может вытесняться вместе с Са2+ с групп связывания аурамином. Возможно, что в число мест взаимодействия обоих этих красителей входят и специфические места связывания Са2+. Рис. 86. Изменение люминесценции хлортетрациклина (длина волны 540 нм), связанного интактными митохондриями (1) и митохондриями, ингибированными олигомицином (2) [313]. Длина волны возбуждения 436 нм. Что касается хлортетрациклина, то его люминесценция выявляет, по-видимому, присутствие кальция в гидрофобных участках препарата. Это уже упоминавшееся качество хлортетрациклина резко (в 200-400 раз) увеличивать квантовый выход при связывании его с кальцием в неполярных (мембраны) структурах клетки нашло применение и при изучении динамики кальция в мембране аксона при генерации потенциала действия [314]. 4.3. Исследование структуры мембраны при генерации потенциала действия Для полноты изложения представляется полезным кратко суммировать на основе литературных данных попытки применения люминесцентных красителей-меток в изучении структуры мембраны нерва во время генерации потенциала действия. Наиболее подходящими для этих целей являются именно красители или комбинации красителей с переменным квантовым выходом. Естественно, что одной из первых меток, примененных для изучения структурных изменений мембраны, оказался АНС. Было установлено, что изменение интенсивности люминесценции нерва, окрашенного АНС, коррелирует с суммарным потенциалом действия тонких волокон [57]. Исследования на гигантских аксонах кальмара [315-322] показали, что изменения интенсивности люминесценции АНС имеют разный знак в зависимости от того, внутри аксона или снаружи он находится (рис. 87). Аналогичным образом изменяется люминесценция АНС в искусственных бислойных лецитиновых мембранах под действием импульсов напряжения, когда краситель находится в растворе с одной стороны мембраны [323]. Рис. 87. Изменение интенсивности люминесценции (1) аксона кальмара, флуорохромированного АНС во время потенциала действия (2) [322]. АНС на внешней поверхности аксона. Использовано синхронное накопление сигнала. Существенным недостатком АНС в этих экспериментах является весьма малая величина изменения интенсивности его люминесценции в ответ на электрическую стимуляцию объекта, лежащая значительно ниже уровня шумов. Поэтому оказывается необходимым применение сложных методов синхронного накопления для выделения полезного сигнала из-под шума. Более того, окончательно не ясно, отражает ли потенциалзависимое изменение люминесценции АНС динамику структурных перестроек в мембране или оно связано с прямым действием электрического поля на молекулы красителя или их окружение [324]. Наилучшие результаты, были получены при использовании мероцианиновых красителей, обладающих высоким соотношением сигнал/шум на аксоне. Изменение люминесценции аксона, окрашенного мероцианином, оказалось возможным наблюдать во время одиночного потенциала действия без применения накопления сигнала [325-327]. «Мероцианин 540» Применявшийся краситель слабо растворим в воде, и потому готовили его спиртовой раствор, разбавлявшийся затем морской водой. Конечное содержание спирта - 1%. Данные, полученные на аксоне кальмара диаметром 0,4 мм, окрашенном в течение 10 мин при температуре 14° С, приведены на рис. 88. Рис. 88. Изменение интенсивности люминесценции аксона кальмара, флуорохромированного мероцианиновым красителем, во время потенциала действия [325]. Прямые измерения. В живых клетках мероцианин окрашивает в основном мембранные структуры препарата, взаимодействуя при этом, по-видимому, с липидной областью мембраны, свободной от функциональных белковых групп. Во всяком случае, окраска мероцианином не вызывает нарушений работы механизмов ионного транспорта, не препятствует генерации потенциала действия и не нарушает, например, колебательного режима работы митохондриальных мембран (рис.89). Рис. 89. Влияние мероцианина на функциональное состояние митохондрий. 1 – интенсивность люминесценции «мероцианина-540», связанного с мембраной митохондрий; 2 – концентрация калия в среде; 3 – скорость потребления кислорода. Другим перспективным подходом, аналогичным рассмотренному выше на примере взаимодействия белков в саркомере мышцы, является использование для изучения мембран пары красителей, квантовый выход которых меняется за счет миграции энергии возбуждения при сближении меток. Используя такую пару люминесцентных красителей, Кун [328] весьма изящно исследовал сближение липидных монослоев при их контакте. Монослои формировались из арахидоновой кислоты на твердой подложке (поливиниловая пленка, стекло) или на поверхности воды. Поверхность одного монослоя окрашивали красителем-донором (Д), поверхность второго - красителем-акцептором (А), в качестве которых были использованы люминесцентные метки с приведенными ниже структурными формулами. Используя монохроматическое излучение, возбуждали только голубую люминесценцию метки-донора. Приближение второго монослоя с адсорбированной на нем меткой-акцептором на расстояние менее 200 Å приводило к уменьшению интенсивности голубой люминесценции донора и появлению желтой люминесценции акцептора. Миграция энергии возбуждения от метки-донора к метке-акцептору наблюдалась в интервале расстояний между этими молекулами от 50 до 200 Å. Аналогичные результаты были получены и в случае использования в качестве акцептора нелюминесцирующего гемоглобина, безызлучательно рассеивающего принятую от метки-донора энергию. Естественно, что в этом случае о миграции энергии возбуждения судили только по уменьшению интенсивности голубой люминесценции. Расчеты показывают [328], что взаимодействие красителей в данном случае может быть описано как взаимодействие фосфоресцирующих электрических диполей. Миграцию энергии между различными парами таких соединений, как хлорофиллы а и в, и некоторыми красителями исследовали на бислойных липидных мембранах [329]. Пигменты вводили в мембрану и определяли ту концентрацию их, при которой по изменению спектра люминесценции обнаруживалась миграция энергии. Было показано, в частности, что миграция энергии между хлорофиллом а и в осуществляется на расстоянии до 100 Å.По-видимому, методические подходы с использованием явления миграции энергии окажутся наиболее перспективными при исследовании структурных изменений в клеточных мембранах в процессе выполнения ими функций. 4.4. Взаимодействие белков и нуклеиновых кислот Явление миграции энергии от одного красителя к другому может служить основой для разработки чрезвычайно чувствительных методов исследования взаимодействия различных макромолекул в процессе функционирования их в клетке. Некоторые особенности такого подхода могут быть рассмотрены на примере разработки люминесцентного аналога известной реакции Грама [330—332]. Отношение микроорганизмов к окраске по Граму является одним из важнейших таксономических признаков. Однако классический вариант реакции Грама [333] представляет собой довольно длительный и трудоемкий процесс, требующий предварительной фиксации исследуемых клеток. В этой связи представлялось полезным разработать быстрый способ прижизненного определения грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов на основе использования некоторых специфических свойств люминесцентных красителей. Как неоднократно указывалось, отношение к окраске по Граму связано с особенностями клеточной оболочки микроорганизмов. Предполагается, что в то время как поверхность грамотрицательных клеток покрыта слоем белков и липопротеидов, в состав клеточной оболочки грамположительных микроорганизмов входит рибонуклеиновая кислота [32, 333, 334]. Поэтому для разработки метода были выбраны люминесцентные красители, один из которых - АНС -обладает высоким сродством к гидрофобным группам белковых молекул, а другой - этидиум бромид характеризуется крайне высокой специфичностью связывания с нуклеиновыми кислотами. Другим особым свойством, общим для обоих красителей, определившим их выбор для разработки метода, является способность резко (в 50-100 раз) увеличивать квантовый выход люминесценции при связывании с субстратом. Это обстоятельство исключительно полезно в методическом отношении, так как позволяет наблюдать окрашенные клетки без предварительной отмывки избытка несвязавшихся красителей. В связанном виде АНС и этидиум бромид обладают люминесценцией с максимумами 490 и 610 нм соответственно, как это схематически показано на рис. 90. При этом полоса излучения АНС перекрывается практически полностью полосой поглощения этидиум бромида, что создает особо благоприятные предпосылки для миграции энергии с АНС на этидиум бромид. Для разработки метода были использованы 150 заведомо определенных по Граму штаммов микроорганизмов, полученных из лаборатории коллекционных культур ИБФМ АН СССР. Микроорганизмы окрашивали водными растворами этидиум бромида в концентрации 10-5 г/мл и АНС в концентрации 10-4 г/мл (Serva, ФРГ). Каплю окрашиваемой бактериальной суспензии наносили на предметное стекло и добавляли к ней каплю раствора этидиум бромида. Затем препарат накрывали покровным стеклом, излишки жидкости удаляли фильтровальной бумагой, после чего на край покровного стекла наносили каплю раствора АНС и оттягивали жидкость фильтровальной бумагой с противоположной стороны, ускоряя таким образом распределение АНС в препарате под покровным стеклом. Препарат окантовывали парафином для предохранения от высыхания и исследовали микроспектрофлуориметрически при возбуждении люминесценции в максимуме поглощения АНС (365 нм). Рис. 90. Спектры поглощения АНС в концентрации 10-4 г/мл (1) и этидиум бромида в концентрации 2,5⋅10-4 г/мл (2). Схематически показано положение полос излучения АНС (3) и этидиум бромида (4) в спектральном диапазоне. После окраски этидиум бромидом и АНС по описанной выше методике живые грамотрицательные микроорганизмы резко отличаются от грамположительных по цвету люминесценции. Живые грамотрицательные микроорганизмы разных видов приобретают голубую люминесценцию с максимумом излучения в области 490 нм (рис. 91, 1), в то время как грамположительные бактерии вне зависимости от их видовой принадлежности обладают однотипной красной люминесценцией с максимумом излучения в области 605-610 нм (рис. 91, 2). Рис. 91. Спектры люминесценции грамотрицательных (1 – Serratia marcescens B-63) и грамположительных (2 – Bacilus subtilis В-580) микроорганизмов, окрашенных АНС и этидиум бромидом. Длина волны возбуждения 365 нм. Следует отметить, что в культурах грамотрицательных микроорганизмов, выращенных в жидких средах, встречаются единичные клетки, обладающие люминесценцией в красной области спектра. Количество таких клеток увеличивается в препаратах из культур, выращенных на твердых средах. Можно было предположить, что это мертвые или поврежденные клетки. Контрольные опыты с окрашиванием суспензий грамотрицательных микроорганизмов, подвергнутых нагреву до 100° С, показали, что при увеличении времени нагревания суспензии относительное количество клеток, приобретающих красную люминесценцию, пропорционально увеличивается. Смену цвета люминесценции грамотрицательных микроорганизмов с голубого на красный удобно наблюдать на одиночной клетке у видов, обладающих ярко выраженной двигательной активностью. Если в свежеприготовленном препарате грамотрицательных бактерий Enterobacter cloacae клетки характеризуются высокой двигательной активностью и имеют голубую люминесценцию (рис. 92, 1), то через некоторое время их движение замедляется и в спектре люминесценции появляется красная компонента (рис. 92, 2), которая становится доминирующей (рис. 92, 3) после прекращения подвижности клеток. При этом форма спектра люминесценции поврежденных или мертвых грамотрицательных микроорганизмов (рис. 92, 3) становится такой же, как и у заведомо грамположительных клеток (рис. 92, 4). Следует отметить, что в то время как вегетативные клетки грамположительных микроорганизмов приобретают красную люминесценцию с максимумом излучения 605-610 нм, их споры обладают голубой люминесценцией с максимумом излучения 490 нм. Рис. 92. Изменение спектров люминесценции грамотрицательных бактерий Enterobacter cloacae В-69 (1-3) при повреждении, сопровождающемся прекращением движения (3). Для сравнения приведен спектр люминесценции грамположительных микроорганизмов Staphylococcus aureus В-83 (4). Длина волны 365 нм. Имея в виду упомянутые специфические свойства использованных красителей, можно предполагать, что именно различие в организации клеточной оболочки грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов является причиной наблюдаемого различия в их люминесцентной окраске. Действительно, появление у живых грамотрицательных микроорганизмов голубой люминесценции с максимумом излучения 490 нм указывает на то, что только АНС имеет возможность связываться с субстратом (гидрофобные области белков) на поверхности этих клеток. Повреждение белково-липопротеиновой оболочки клеток грамотрицательных микроорганизмов открывает доступ этидиум бромиду к местам его специфического взаимодействия с молекулами нуклеиновых кислот, что приводит к появлению характерной для связанного этидиум бромида дополнительной полосы люминесценции в красной области (рис. 92, 2). При этом по мере увеличения интенсивности полосы люминесценции этидиум бромида (605-610 нм) наблюдается уменьшение интенсивности излучения АНС с максимумом в области 490 нм (рис. 96, 3). Повидимому, причиной этого является безызлучательная миграция энергии с АНС на этидиум бромид благодаря почти полному перекрытию полосы излучения АНС (рис. 90, 3) с полосой поглощения этидиум бромида (рис. 90, 2). По той же причине (непроницаемость внешней оболочки для этидиум бромида и отсутствие специфических для него мест связывания на поверхности) наблюдается голубая люминесценция спор грамположительных микроорганизмов за счет абсорбции на их поверхности АНС. Иная ситуация возникает при взаимодействии двух красителей с оболочкой грамположительных микроорганизмов. В этом случае этидиум бромид имеет доступ к специфическим для него местам связывания с рибонуклеиновыми кислотами. Благодаря этому грамположительные клетки приобретают красную люминесценцию с максимумом излучения в области 605-610 нм. Возможно, что и АНС адсорбируется на гидрофобных группах белков этих клеток, однако, упомянутая выше миграция энергии с АНС на этидиум бромид приводит к резкому ослаблению голубой люминесценции АНС в области 490 нм (рис. 91, 2). Результаты описанных выше исследований позволяют полагать, что донорно-акцепторная пара АНС - этидиум бромид представляет собой тонкий инструмент для изучения взаимодействия белков и нуклеиновых кислот в клетке. Как и следовало ожидать, имея в виду высокую специфичность взаимодействия каждого из этих красителей, люминесценция не возникает при добавлении ДНК или РНК к раствору АНС, так же как и в случае добавления гистона к этидиум бромиду. При окрашивании ДНК (или РНК) парой АНС - этидиум бромид возникает только характерная красная люминесценция этидиум бромида. Обработка этой парой меток раствора гистона приводит к появлению только голубой люминесценции АНС. Другая картина [335, 336] наблюдается при окрашивании коацерватных капель [337], образованных системой ДНК-гистон. Добавление к препарату АНС приводит к появлению голубой люминесценции его комплексов с гистоном (рис. 93, 1). Дополнительное окрашивание этих же капель этидиум бромидом вызывает резкое изменение спектра: голубая люминесценция АНС гасится и появляется красная люминесценция комплексов этидиум бромида с ДНК (рис. 93, 2). Несомненно, что миграция энергии с АНС на этидиум бромид лежит в основе регистрируемого эффекта, как и в описанном выше случае изменения окраски при гибели грамотрицательных клеток. Интересно отметить, что гашение люминесценции АНС за счет миграции энергии на этидиум бромид наблюдается и в том случае, когда коацерватные капли (система ДНК - гистон) приготавливаются из предварительно окрашенных компонентов ДНК + этидиум бромид и гистон + АНС. Присутствие меток на макромолекулах не препятствует образованию ими коацерватных капель, имеющих люминесценцию только в красной области спектра. По-видимому, это означает, что миграция энергии с АНС, закрепленного на гистоне, на этидиум бромид, связанный с ДНК, осуществляется вдоль молекулы белка и нуклеиновой кислоты по системе взаимодействующих πэлектронных орбит этих макромолекул. Рис. 93. Спектры люминесценции коацерватных капель (система ДНКгистон), окрашенных вначале АНС (1), а затем дополнительно этидиум бромидом (2). Другим примером использования этого же методического подхода может служить работа Бекера и соавт. [338], в которой исследовалась полимеризация белков микротрубочек и их связь с мембранными структурами клетки. При этом один компонент тубулина (белок микротрубочек) или мембраны окрашивали флуоресцеинизотиоцианатом (донор), а другой - родаминизотиоцианатом (акцептор). Длина волны возбуждения соответствовала поглощению метки-донора. При смешивании приготовленных таким способом растворов в спектре люминесценции помимо полосы излучения флуоресцеинизотиоцианата (желто-зеленый цвет) появлялась дополнительно и полоса люминесценции родаминизотиоцианата (красный цвет) за счет миграции энергии от молекулыдонора к молекуле-акцептору при образовании комплексов тубулин - тубулин и тубулин - мембраны. Заканчивая данную главу, имеет смысл обратить внимание на возможность использования некоторых люминесцентных меток с высокой специфичностью взаимодействия для выяснения молекулярного состава соответствующих функциональных механизмов клетки. Приведенные выше данные свидетельствуют о высокой специфичности взаимодействия этидиум бромида именно с нуклеиновыми кислотами. Оказалось, что этидиум бромид, кроме того, обладает способностью в малых концентрациях подавлять спайковую электрическую активность нервных клеток, накапливаясь в их мембранах. Этот эффект трудно объяснить, не предполагая наличия «скелета» из нуклеиновой кислоты в составе электрогенных каналов клеточной мембраны, имея в виду и то обстоятельство, что рибонуклеопротеиновые комплексы из клеточной стенки грамположительных микроорганизмов послужили одной из первых моделей электрогенных каналов в искусственных липидных мембранах [339-341]. ПРИЛОЖЕНИЕ Приборы и техника люминесцентного спектрального анализа клеток Введение Какие бы заманчивые перспективы не открывались в биологии клетки в связи с внедрением в практику лабораторного эксперимента методов люминесцентного спектрального анализа, возможность их реализации зависит прежде всего от наличия в распоряжении исследователя соответствующей техники эксперимента. Важнейшими приборами, необходимыми для этой цели, являются микроспектрофлуориметры. В настоящее время большинство исследований на клеточном уровне выполняется на приборах, изготовленных непосредственно в лаборатории. Основная причина, определяющая эту ситуацию, заключается в том, что промышленные приборы обычно весьма консервативны и трудно поддаются приспособлению их для наиболее оптимального решения конкретных задач. Поэтому, несмотря на некоторые трудности самостоятельного изготовления микроспектрофлуориметров, многие исследователи как за рубежом [342-346, 122, 196], так и в нашей стране [347-357) идут по пути самостоятельного создания приборов, наиболее полно отвечающих требованиям поставленной задачи. Такого типа приборы обладают в то же время значительной гибкостью и легко могут быть модернизированы при смене объекта или цели исследования. Наиболее рациональным подходом при этом является, по-видимому, максимальное использование стандартных блоков и узлов [21, 168, 358-365], выпускаемых промышленностью. Рациональное сочленение стандартных блоков позволяет получить установки, способные решать достаточно широкий круг задач. Такой подход может быть проиллюстрирован описанием серии микроспектрофлуориметров, разработанных и эксплуатировавшихся в течение ряда лет в Институте биологической физики АН СССР. Важной особенностью этих приборов, как и большинства отечественных микроспектрофлуориметров, является использование интерференционных светоделительных пластинок в качестве опак-иллюминатора. Именно это позволяет применять специальные высокоапертурные микрообъективы и получать высокую яркость люминесценции микрообъекта, что является особенно важным для устойчивости работы спектроанализирующего устройства. Приложение 1 П1. Микроспектрофлуориметры П1.1. Микроспектрофлуориметр на базе стандартных деталей и узлов Микроспектрофлуориметр на базе стандартных деталей и узлов [168] является наиболее простым в изготовлении и заслуживает описания, так как его принципиальная схема, приведенная на рис. 1.1, послужила основой нескольких интересных модификаций, описываемых ниже. Основным элементом оптической схемы прибора служит трехпризменный светосильный спектрограф ИСП-51 со стеклянной оптикой на область спектра от 370 до 1000 нм. Сочленение спектрографа 1 с микрообъективом 14, достигается тем, что входная щель 7 спектрографа помещена в плоскость промежуточного изображения микроскопа, состоящего из микрообъектива 14 и окуляра Гюйгенса 4 (линзы 6 и 8). Оптическая система микроспектрофлуориметра при регистрации спектров люминесценции клеток работает следующим образом. Источник света - ртутная дуговая лампа 25 типа ДРШ-250 (или ДРШ-100) - освещает коллекторную линзу 24, действующие размеры которой ограничиваются диафрагмой 23. После этого световой поток проходит через водный теплофильтр 22 (4%-ный раствор СuSO4) и светофильтры 21, выделяющие необходимую для возбуждения люминесценции линию излучения ртути. Все эти детали представляют собой единый узел 20, в качестве которого используется система освещения люминесцентного осветителя ОСЛ-1 [21]. Возбуждающее люминесценцию излучение отражается опак-иллюминатором ОИ-17 с интерференционной светоделительной пластинкой 12 и микрообъективом 14, установленным в стандартном револьверном держателе от любого биологического микроскопа, направляется на микрообъект 15. При этом в плоскость микрообъекта проецируется изображение диафрагмы 23, являющейся, таким образом, полевой диафрагмой. Рис. 1.1. Блок-схема микроспектрофлуориметра на базе стандартных деталей и узлов. 1 – призменный монохроматор (ИСП-51); 2 – мотор развертки спектра; 3 – поворотная призма; 4 – визирная трубка; 5 – узел входной щели; 6 – 8 – линзы окуляра Гюйгенса ×4; 7 – входная щель монохроматора (полевая диафрагма окуляра Гюйгенса); 9, 11, 18, 34, 35 – зеркала; 10 – кювета; 12 – светоделительная пластинка с интерференционным покрытием; 13 – револьверный держатель микрообъективов; 14 – объектив; 15 – препарат; 16 – предметный столик; 17 – конденсор; 19 – осветитель с лампой накаливания; 20 – блок осветителя ОСЛ-1 в сборе; 21 – светофильтры; 22 – жидкостный теплофильтр; 23 – ирисовая диафрагма; 24 – коллекторная линза; 25 – дуговая лампа ДРШ-250; 26 – реостат; 27 – блок электролитических конденсаторов фильтра; 28 – выпрямитель; 29 – электронный стабилизатор сетевого напряжения; 30 – стабилизированный источник высокого напряжения; 31 – фотоумножитель; 32 – милливольтметр (рН-метр ЛПУ-01; 33 – самописцы. Свет люминесценции препарата, собранный высокоапертурным микрообъективом 14 и прошедший через пластинку 12 с интерференционным покрытием, поворотным зеркалом 11 (деталь осветителя ОСЛ-1) и линзой 6, направляется в спектрограф ИСП-51. При этом в плоскости входной щели 7 спектрографа находится промежуточное люминесцентное изображение микрообъекта. Таким образом, входная щель 7 спектрографа вырезает требуемый участок увеличенного изображения исследуемой клетки. Этот участок и его расположение во входной щели спектрографа можно визуально наблюдать при введении в ход лучей поворотной призмы 3. В этом положении призма 3 вместе с линзами 6 и 8 представляет собой видоизмененный окуляр Гюйгенса ×4, в плоскости полевой диафрагмы которого размещена входная щель спектрографа. Промежуточное изображение объекта исследования в плоскости полевой диафрагмы окуляра Гюйгенса (входной щели 7 спектрографа) рассматривается с помощью визирной трубки 4 от фотонасадки типа МФН-1. При этом окончательно выбирается для исследования участок микрообъекта. Затем поворотная призма 3 выводится из хода лучей и световой поток из входной щели поступает в колиматор спектрографа. В качестве узла поворотной призмы 3 может быть использован с незначительной переделкой узел призм насадки сравнения ОКС-1. Свет люминесценции выбранного участка объекта исследования, ограниченного входной щелью, разлагается призмами в спектр, изображение которого фокусируется выходным объективом фотокамеры в плоскость кассеты для фотопластинок, где устанавливается выходная щель спектрографа. Непосредственно за ней находится фотокатод фотоэлектронного умножителя типа ФЭУ-51 со спектральной чувствительностью от 400 до 800 нм. Таким образом, регистрирующий узел вместе с выходной щелью и кожухом ФЭУ и его делитель напряжения может быть установлен вместо обычной кассеты для фотопластинок. Разрешающая способность спектрографа при этом несколько ухудшается, однако для широких линий люминесценции биологических объектов это улучшение не столь существенно. Препарат 15 размещается на предметном столике 16 от микроскопа МС-51. С помощью конденсора 17, зеркала 18 и осветителя 19 (типа ОИ-19) возможно освещение препарата проходящим светом от лампы накаливания. Такое освещение может быть полезным для предварительного выбора участка клетки без излишнего освещения его лучами сине-фиолетовой или УФ-области спектра. Излучение этого же источника света, выделенное узкополосным интерференционным светофильтром, может быть использовано для контроля рассеивающих свойств изучаемой области объекта, как это упоминалось выше. Для облегчения юстировки столика относительно оптической оси микроскопа он имеет одну точку опоры (стальной шарик) и три регулировочных винта. Описываемый прибор позволяет изучать также спектры люминесценции раствора в кюветах. Для этого возбуждающее люминесценцию излучение может направляться дополнительными зеркалами 34 и 9 на кювету 10 с исследуемым веществом. Поворотное зеркало 11 переключается при этом в верхнее положение и направляет свет люминесценции кюветы во входную щель 7 спектрографа. На практике, однако, особенно при наличии контактных микрообъектов [21], удобнее бывает производить эти исследования в микрокюветах, размещенных на предметном столике вместо микропрепарата 15. Развертка спектра в описываемой первой модели микроспектрофлуориметра осуществлялась мотором 2 типа РД-0,9, на валу которого были закреплены контакты метчика длин волн. Электронная схема микроспектрофлуориметра была построена также по принципу максимального использования доступных стандартных приборов. Регистрация спектров люминесценции производилась фотоумножителем 31 типа ФЭУ-51, питающимся от стабилизированного источника напряжения 30 типа ВС-22. Сигнал с сопротивления нагрузки ФЭУ подавался на вход рН-метра 32 типа ЛПУ-01, используемого в режиме высокоомного нульиндикатора, на выходные клеммы которого подключался электронный самопишущий милливольтметр 33 типа ЭПП-09 (КСП-4). Таким образом, в этой системе регистрации рН-метр ЛПУ-01 играет роль буферного каскада для согласования высокого выходного сопротивления фотоумножителя с низким входным сопротивлением самописца. Поступающий на вход ЛПУ-01 сигнал постоянного тока с выходного сопротивления ФЭУ модулируется вибропреобразователем, и дальнейшее усиление его по мощности осуществляется усилителями переменного тока, лишенными такой неприятной особенности, как дрейф нуля. Регистрирующая система на базе ЛПУ-01 работает исключительно стабильно и надежно. Компенсация темнового тока ФЭУ осуществляется ручкой «настройка но буферному раствору» на лицевой панели прибора после предварительной установки пределов компенсации ручкой «рН» под откидной крышкой на боковой панели прибора. Ручка «крутизна» может быть использована для регулировки усиления сигнала после предварительной калибровки ее положения, однако более удобно изменять чувствительность, используя набор калиброванных сопротивлений нагрузки ФЭУ при установленной в крайнее по часовой стрелке положение ручки «крутизна» на лицевой панели ЛПУ-01. Одна из выходных клемм ЛПУ-01, к которым подключается самописец 33, периодически замыкается на землю контактами метчика длин волн. Ртутная дуговая лампа 25 типа ДРШ-250 питается постоянным током от выпрямителя 28 типа ВСА-III через реостат 26 (R =30 Ω). На выходе выпрямителя включен электролитический конденсатор 27 емкостью 800 мкФ на рабочее напряжение 300 В для сглаживания пульсаций напряжения. Существенным элементом схемы является электронный стабилизатор сетевого напряжения 29 типа St = 2000 (Tesla), от которого питаются все элементы электронной схемы микроспектрофлуориметра. Применение этого стабилизатора позволяет снизить, по крайней мере, на порядок пульсации светового потока ртутной лампы без использования сложных систем стабилизации светового потока. Ценным качеством описанной выше базовой модели является простота ее изготовления из узлов по сути дела снятых с вооружения современных лабораторий оптических приборов. Обладая высокой чувствительностью, эта модель микроспектрофлуориметра может быть использована для исследования спектров люминесценции клеток в области 500—700 нм без коррекции регистрируемой кривой на спектральную чувствительность установки. Основным недостатком модели являлся завал спектральной характеристики в области от 400 до 500 нм, определяемый спектральной характеристикой стандартной «желтой» интерференционной светоделительной пластинки 12 опак-иллюминатора ОИ-17, использованного в описанном микроспектрофлуориметре. По спектру отражения (под углом 90°) и обратному ему спектру пропускания «желтой» пластинки (рис. 1.2, 1) можно видеть, что она хорошо отражает излучение в области 380—460 нм, используемое для возбуждения люминесценции, и пропускает с малыми искажениями свет люминесценции объекта в области >530 нм. Пластинками такого типа комплектуется большинство отечественных люминесцентных микроскопов (МЛ-1, МЛ-2, МЛ-3) и осветителей (ОИ-17, ОСЛ-1, ОИ-30). Расширить спектральный диапазон микроспектрофлуориметра можно, заменив эту пластинку на «синюю» светоделительную пластинку, спектральная характеристика которой приведена на рис. 1.2, 2 [169]. Для возбуждения люминесценции будут использоваться только лучи УФ-области спектра в диапазоне от 300 до 400 нм. При этом спектральный диапазон микроспектрофлуориметра, в котором можно регистрировать спектры люминесценции объекта практически без коррекции их на спектральную чувствительность прибора, увеличивается от 420 до 700 нм. Приведенные на рис. 1.3 спектры люминесценции стандартных образцов стекол ЖС-19 (1, 2) и БС-10 (3, 4), полученные на микроспектрофлуориметре с «синей» пластинкой, незначительно отличаются от паспортных характеристик этих образцов [361]. Рис. 1.2. Спектральные характеристики «желтой» (1) и «синей» (2) светоделительных пластинок. По оси абсцисс – длина волны в нм; по оси ординат справа – пропускание в %, слева – оптическая плотность. Рис. 1.3. Спектры люминесценции стандартных образцов стекол ЖС-19 (1, 2) и БС-10 (3, 4). 1, 3 – спектры, полученные на микроспектрофлуориметре; 2, 4 – паспортные характеристики. В ряде случаев бывает необходимо использовать для возбуждения люминесценции излучение сине-фиолетовой области спектра (400—460 нм). В этом случае «желтая» пластинка вновь становится необходимой. Поэтому желательно иметь в составе микроспектрофлуориметра обе светоделительные пластинки. Наиболее удобно использовать с этой целью вместо опакиллюминатора ОИ-17 узел сменных светоделительных пластинок от люминесцентного осветителя типа ОИ-30 с контактными объективами [21], предварительно заменив в этом узле нейтральную полупрозрачную светоделительную пластинку на «синюю» пластинку с интерференционным покрытием. Это тем более возможно, что контактные объективы, входящие в комплект осветителя ОИ-30, необходимо иметь в составе микроспектрофлуориметра не только для исследования подвижных клеток и тканей, таких, например, как мышечные, но и для работы с суспензиями клеток или органелл. В этом случае преимущества контактного объектива заключаются в том, что его выступающая фронтальная линза погружается в кювету с суспензией на фиксированную глубину и изменение высоты поверхности жидкости при добавлении в кювету субстратов, ингибиторов или иных агентов не влияет на величину регистрируемого сигнала. Приведенные на рис. 1.3 спектры имеют линейную развертку по шкале длин волн. Это достигается применением профилированного кулачка (рис. 1.1, узел 2), компенсирующего нелинейность дисперсии призменного спектрографа ИСП-51. Приведенный на рис. 1.1 одноканальный самописец ЭПП-09 (КПС-4), несмотря на свою широкую распространенность, неудобен в работе, так как регистрируемые на нем спектры оказываются равномерно распределены по длине диаграммной ленты, что затрудняет их сравнение непосредственно в процессе эксперимента. В этом отношении более удобны двухкоординатные самописцы (например, ПДС-01 или ПДП4-002), ось Х которых питается напряжением с ползунка потенциометра, жестко связанного с валом кулачка развертки спектра. Для питания потенциометра может быть использован любой низковольтный источник стабильного постоянного напряжения. В этом случае семейство спектров люминесценции исследуемого объекта может регистрироваться на одном листе бумаги, что позволяет непосредственно в процессе эксперимента следить за изменением формы спектра. Продолжая перечисление возможных усовершенствований микроспектрофлуориметра при замене стандартных блоков, входящих в его состав, необходимо особо коснуться источника возбуждающего люминесценцию излучения - дуговой ртутной лампы типа ДРШ-250. Стабильность этого источника может быть резко повышена. Примером газоразрядных дуговых ламп с ртутным (см. Приложение 4) и ксеноновым (см Приложение 5) наполнением, отличающихся высокой стабильностью положения излучающего плазменного шнура, является ртутная дуговая лампа типа ДРШ-250-2 [362], уровень собственных шумов которой не превышает 0,02% в полосе 1 Гц - 10 кГц [363]. Однако столь высокая стабильность может быть реализована только при питании этой лампы от стабилизированного источника тока. Ввиду большой перспективности применения подобного типа источников излучения в микроспектрофлуориметрах представляется полезным привести здесь схему (рис. 1.4, а) одного из стабилизированных источников тока [363]. Выпрямитель, выполненный на диодах Д-245 и имеющий на входе автотрансформатор Атр, при положении 1 переключателя П2 нагружен на цепь, состоящую из дуговой лампы Rн и балластного сопротивления Rб == 0,8- 1,5 Ом. Пока лампа не зажжена, напряжение на ней равно напряжению холостого хода выпрямителя, что для лампы типа ДРШ-250-2 должно составлять 80—90 В. Это напряжение достаточно для зажигания лампы при подаче поджигающего импульса. Рис. 1.4. Схема лабораторного источника питания дуговых ламп (а) и блок-схема источника питания Ип-16 (б). После поджига лампы и выхода ее в рабочий режим, когда падение напряжения на ней составляет 30-35 В, переключатель П2 переводится в положение 2. При этом вместо балластного сопротивления Rб в цепь лампы включается регулирующий элемент, состоящий из трех параллельно соединенных транзисторов П-210. Обратная связь по току осуществляется напряжением, снимаемым с измерительного сопротивления (Rи=0,6 Ом), включенного последовательно с нагрузкой. Установка тока в цепи лампы осуществляется переменным сопротивлением 2,5 кОм в цепи обратной связи. Ценной особенностью описанного стабилизатора тока является возможность с помощью автотрансформатора регулировать напряжение на его входе и таким образом изменять напряжение на нагрузке от 0 до 100 В и ток в цепи от 5 до 12,5 А. Это дает возможность не только обеспечивать оптимальный режим питания ртутной дуговой лампы типа ДРШ-250-2, рабочее напряжение которой к концу срока службы увеличивается от 32 до 50 В, но и использовать этот источник как для питания дуговых ламп другого типа (ксеноновых), так и для питания низковольтных галогенных ламп накаливания высокой яркости типа КГМ (см. Приложение 5). В качестве промышленного блока питания высокостабильных дуговых ламп типа ДРШ-250-2 и ДКСШ-150, а также галогенных ламп накаливания типа КГМ-10-90 и КГМ-9-75 может быть рекомендован универсальный источник питания ИП-16М, разработанный в СКБ БП АН СССР (Пущино). Относительно небольшие габариты и высокие качественные показатели этого устройства достигнуты за счет использования двойного импульсного и линейного регулирования. Упрощенная схема источника питания ИП-16 [364] приведена на рис.1.4, б. Она включает в себя управляемый выпрямитель (Д1-Д5) на тиристорах (импульсный регулятор) и компенсационный транзисторный стабилизатор тока (линейный регулятор). Напряжение с управляемого выпрямителя через фильтр (Др1 и С1) подается в цепь, состоящую из нагрузки Rн коллекторной цепи регулирующего транзистора РТ и эталонного сопротивления R7, падение напряжения на котором сравнивается с опорным напряжением. Разность опорного напряжения на R7 усиливается балансным каскадом УПТ (Т1 и Т2) и воздействует на регулирующий транзистор таким образом, чтобы ток в его коллекторной цепи оставался постоянным. Источником опорного напряжения служит термокомпенсированный стабилитрон Д818Е, что в сочетании с балансным каскадом УПТ, выполненном на высокочастотных транзисторах, обеспечивает высокую стабильность тока нагрузи. Напряжение с регулирующего транзистора РТ подается на схему управления [365] тиристорами (Д2 и Д4) выпрямителя, которая, изменяя момент включения тиристоров, поддерживает напряжение на РТ постоянным (4-5 В) при всех изменениях напряжения в сети и на нагрузке. К недостаткам этой схемы авторы относят высокий уровень импульсных наводок, связанных с переключением тиристоров. Однако ввиду малой длительности фронтов влиянием этих наводок в ряде случаев можно пренебречь. Блочность конструкции, легкость замены узлов дают возможность гибкого использования описанного микроспектрофлуориметра (рис. 1.1) для решения разнообразных задач, связанных не только с изучением спектров люминесции, но и с регистрацией кинетики изменения люминесценции одновременно в нескольких спектральных интервалах. С этой целью в плоскости фокусировки выходного объектива спектрографа устанавливается 2-3 или более выходных щелей постоянной ширины, вырезающих несколько заранее выбранных участков спектра шириной 10-15 нм. Прошедшие через эти щели потоки света определенной длины волны направляются на фотокатоды соответствующих фотоумножителей. Фотоумножители, регистрирующие интенсивность люминесценции каждый в своем, определяемом положением щели спектральном интервале, питаются от одного и того же источника высокого напряжения 30, но имеют раздельные каналы усиления - согласования 32 на ЛПУ-01. Естественно, что в этом случае необходим многоканальный самописец 33. Таким способом можно получать информацию о быстро протекающих в клетке процессах. В ряде случаев для учета интенсивности поглощения и рассеяния возбуждающего люминесценцию излучения, вместо осветителя с лампой накаливания 19 может быть установлен дополнительный фотоумножитель на УФ-область спектра типа ФЭУ-39 или ФЭУ-71 со своим блоком усилителя-согласователя 32 (ЛПУ-01). С той же целью учета рассеяния препаратом возбуждающего люминесценцию излучения может быть использован один из каналов регистрации в плоскости фокусировки спектра люминесценции. В частности, может быть выбран диапазон длин волн 650-700 нм, в который попадает отраженная объектом красная компонента возбуждающего люминесценцию излучения дуговой лампы 25. Это возможно при условии, что в области 650-700 нм не имеется полос люминесценции объекта, и поэтому при подборе светофильтров 21 можно не полностью блокировать красную компоненту. В более общем случае такой опорный канал регистрации может быть выбран в любой, свободной от полос люминесценции объекта области спектра. Соответственно этому выбирается узкополосный интерференционный светофильтр для осветителя с лампой накаливания 19. В этом случае об изменении оптических характеристик объекта судят по интенсивности проходящего через него светового потока источника 19. Аналогичным образом можно поступать и при регистрации спектров люминесценции. Регистрируемая при этом узкая полоса проходящего светового потока, не затрудняя анализа спектральных характеристик, позволяет следить за изменениями абсорбционных характеристик объекта. В качестве довольно простого, но ценного приспособления необходимо упомянуть также управляемую электромагнитным реле заслонку, устанавливаемую в осветителе 20 на пути возбуждающего люминесценцию излучения. Это дает возможность резко снизить дозу УФоблучения клетки при достаточно длительных измерениях, когда есть опасность, что это облучение внесет заметные изменения в измеряемый параметр люминесценции объекта. В сущности, описанный микроспектрофлуориметр нельзя назвать прибором. Скорее - это в значительной мере универсальная установка, в состав которой могут входить дополнительные устройства, поставляющие информацию о функциональном состоянии исследуемого объекта, регистрируемую на том же многоканальном самописце синхронно с оптическими характеристиками. Особую важность при этом имеют такие дополнительные параметры, как потребление кислорода, изменение рН, сила натяжения мышцы. В результате установка становится довольно громоздкой, однако в лабораторных условиях это обычно не имеет существенного значения. Приведенная установка в течение ряда лет успешно использовалась для описанных в предыдущих главах спектральных исследований собственной люминесценции нервных, мышечных и растительных клеток, а также суспензий митохондрий. Она же применялась при изучении биолюминесценции и взаимодействия красителей-меток с органоидами клеток и целыми клетками. Как видно из рис. 1.1 , особенностью установки является то, что осветитель 20, микроскоп и предметный столик 16 не связаны жестко друг с другом. Это имеет как свои преимущества, так и свои недостатки. Основным преимуществом такой системы является то, что вокруг предметного столика имеется значительное свободное пространство. Это дает возможность закреплять на предметном столике мелких животных (лягушка [169, 192], крыса [197]) при исследовании их клеток в невыделенном из живого организма виде, т. е. in situ. Известно, что при исследованиях функциональных механизмов живой клетки, т. е., по сути дела, при изучении физиологии клетки, наиболее трудной для экспериментатора задачей является обеспечение ей нормальных условий существования. В случае же исследования клеток in situ вся ответственность за их жизнеобеспечение возлагается на само подопытное животное, и полученные таким образом данные наиболее полно отражают суть протекающих в живой клетке процессов. При исследовании in situ клетки более крупных животных (кролик [198], собака) предметный столик 16 может быть временно удалён из установки. Недостатки такой системы очевидны. Это, прежде всего, ее малая жесткость. В результате проведение морфологических исследований при больших увеличениях затруднено. Отсутствие фотоаппарата также несколько снижает универсальность. П1.2. Микроспектрофлуориметр для морфологических исследований на базе стандартных узлов Микроспектрофлуориметр для морфологических исследований на базе стандартных узлов. Отмеченные выше недостатки предыдущей системы во многом устранены в установке, представляющей собой модификацию базовой модели. Ее основным отличием является то, что вместо отдельных узлов осветителя, микроскопа и предметного столика (рис. 1.5), использован люминесцентный микроскоп МЛ-3 [21]. При этом микроскоп МЛ-3 подвергся следующим конструктивным изменениям. 1. Плоская станина заменена полым прямоугольным основанием, в котором размещена кварцевая поворотная призма 8, позволяющая либо освещать препарат снизу проходящими лучами источника света с лампой накаливания 9, либо направлять прошедшее через микрообъект возбуждающее люминесценцию излучение источника света (ДРШ-250) на фотоумножитель (ФЭУ-4) для регистрации его интенсивности. 2. Единственная «желтая» светоделительная интерференционная пластинка заменена блоком из двух сменных пластинок - «желтой» и «синей» (см. рис. 1.2). Это позволяет выбирать наиболее оптимальные условия возбуждения и регистрации спектров люминесценции объекта. [В новых выпускаемых ЛОМО микроскопах серии ЛЮМАМ установлены сменные светоделительные пластинки]. 3. В корпусе микроскопа в районе размещения жидкостного теплофильтра выфрезеровано отверстие и закреплена обойма. Это позволяет на место теплофильтра устанавливать зеркало 3 под углом 45° к оптической оси осветительного устройства. Помещаемая в обойму оптическая система сопрягает с микроскопом выходную щель монохроматора 26 и дает возможность использовать для возбуждения люминесценции монохроматическое излучение от ксеноновой дуговой лампы 27 мощностью 500 В, питаемой стабилизированным источником тока 29 (рис. 1.5). 4. К изменениям микроскопа можно отнести также сменный сканирующий предметный столик. Он представляет собой стандартный предметный столик микроскопа МЛ-3, на котором жестко закреплены синхронный двигатель и коробка скоростей, приводящие в движение винт поперечной подачи. Полное перемещение поперечной подачи соответствует одному обороту прецизионного потенциометра, сигнал с которого подается на ось Х двухкоординатного самописца 22 (рис. 1.5). Это позволяет исследовать распределение интенсивности люминесценции вдоль выбранного направления микрообъекта, а также изучать микротонкослойные хроматограммы и электрофореграммы в отраженном и проходящем свете, а также в свете люминесценции [366]. При проведении этих исследований сканирующий предметный столик устанавливается взамен стандартного предметного столика МЛ-3 и многожильный кабель управления разъемом соединяют с системой управления и регистрации. В остальном эта система (рис. 1.5) по конструкции и применению аналогична предыдущей (рис. 1.1). Рис. 1.5. Блок-схема универсального микроспектрофлуориметра для морфологических исследований. 1 – дуговая ртутная лампа ДРШ250-2; 2, 17 – линзы; 3, 14, 16 – зеркала; 4 – блок сменных светоделительных пластинок; 5 – микрообъектив; 6 – предметный столик; 7 – конденсор; 8 – призма; 9 – лампа накаливания; 10, 19, 20, 21 – фотоумножители; 11 – запирающий светофильтр; 12 – сферическое зеркало с отверстием 13; 15 – окуляр; 18 – монохроматор; 22 – двухкоординатный самописец; 23 – кулачок; 24 – реохорд; 25 – 6-канальный самописец; 26 – монохроматор возбуждения; 27 – ксеноновая дуговая лампа; 28 – стабилизатор сетевого напряжения; 29, 30 – стабилизированные источники питания дуговых ламп; 31 – источник питания ФЭУ. Использование жесткой системы микроскопа МЛ-3 совместно с зондовой системой ФМЭЛ-2 дает возможность уверенно регистрировать спектры люминесценции участков клетки диаметром до 1 мкм. П1.3. Малогабаритный инвертированный микроспектрофлуориметр Малогабаритный инвертированный микроспектрофлуориметр [367]. Обе описанные выше установки для микроспектрального люминесцентного анализа клеток обладают большим весом и довольно громоздки. В лабораторных условиях эти обстоятельства не играют существенной роли. В то же время необходимость поисков объектов исследований, наиболее удобных для решения проблемы, требует зачастую проведения экспедиционных работ. Особенно важным это бывает при изучении молекулярной организации функциональных механизмов живой клетки. В этих условиях компактность прибора, его малый вес и габариты, а следовательно, транспортабельность приобретают существенное значение. Блок-схема малогабаритного микроспектрофлуориметра приведена на рис. 1.6. Этот прибор представляет собой дальнейшую модификацию базовой модели (рис. 1.1). Основное отличие заключается, прежде всего, в применении инвертированной схемы наблюдения и регистрации люминесценции. Это создает большие удобства при исследовании люминесценции и биолюминесценции клеток мелких морских животных, которых можно в специальной кювете поместить на предметный столик 20, отпрепарировать с помощью бинокулярной лупы 22 и, разместив в поле зрения объектива 19 микроспектрофлуориметра необходимый участок клетки, приступить к его спектральным исследованиям. Рис. 1.6. Блок-схема инвертированного микроспектрофлуориметра. 1 – призменный монохроматор; 2 – кулачок разверстки спектра; 3 – призма; 4 – окуляр; 5 – поворотная призма; 6 – щелевая диафрагма; 7 – зеркало; 8 – окуляр; 9 – сменная интерференционная светоделительная пластинка; 10 – запирающий светофильтр; 11, 13 – линзы; 12 – полевая диафрагма; 14 – апертурная диафрагма; 15 – светофильтры; 16 – жидкостный фильтр; 17 – коллектор; 18 – источник света; 19 – микрообъектив; 20 – предметный столик с препаратом; 21-23 - бинокулярная лупа; 24 – проекционная система осветителя (11 - 17); 25 – реостат; 26 – электролитический конденсатор фильтра; 27 – блок питания дуговой лампы4 28 – электронный стабилизатор сетевого напряжения; 29 – блок питания дуговой лампы; 30 – ЛПУ-0,1; 31 – двухкоординатный самописец; 32 – зеркало; 33 – выходная щель монохроматора; 34, 35 – компенсация темнового тока ФЭУ; 36 – ФЭУ. Остальные изменения по сравнению с базовой моделью (рис. 1.1) носят непринципиальный конструктивный характер и направлены на увеличение компактности системы. Основу прибора составляют люминесцентный микроскоп МЛ-3 и монохроматор УМ-2. От микроскопа МЛ-3 используется оптическая система 24 проекции возбуждающего люминесценцию излучения ртутной дуговой лампы 18 типа ДРШ-250 с модифицированным кожухом, а также револьвер объективов 19, узел светоделительной пластинки 9 и узел визуального наблюдения 7, 8. При этом ввиду необходимости оснащения микроспектрофлуориметра дополнительной «синей» светоделительной пластинкой в стандартном корпусе узла 9 вырезается сквозное фигурное отверстие, в котором на салазках типа «ласточкин хвост» размещается узел сменных («синей» и «желтой») светоделительных пластинок. Применение инвертированной схемы потребовало изменения угла наклона тубуса визуального наблюдения 8 относительно оптической оси и соответственно изменения угла наклона зеркала в корпусе блока 7. В плоскости люминесцентного изображения объекта 21 установлена оптическая щель 6 с изменяемыми как по высоте, так и по ширине размерами. Она является одновременно как диафрагмой, выделяющей необходимый для исследования участок микрообъекта, визуально наблюдаемый через тубус 4 при вдвинутой в ход лучей призме 3, так и входной щелью монохроматора 1 типа УМ-2. Для уменьшения габаритов монохроматора в его схему дополнительно введены поворотные призмы 5 и 32. При выведении призмы 5 из хода лучей световой поток поворотным зеркалом направляется на пленку фотоаппарата, закрепляемого на тубусе для фотографирования выделенного щелью 6 исследуемого участка микрообъекта. Изображение спектра люминесценции объекта фокусируется в плоскость выходной щели 33, непосредственно за которой расположен фотокатод фотоумножителя 36 типа ФЭУ-51. При изменении угла поворота призмы монохроматора с помощью профилированного для линеаризации спектра кулачка 2, закрепленного на оси коробки скоростей развертки спектра, изображение спектра сканируется в плоскости выходной щели 33 и регистрируется фотоумножителем 36. Сигнал с выходного сопротивления фотоумножителя 33 через рН-метр 30 типа ЛПУ-01, включенный по описанной выше схеме, регистрируется по оси Y двухкоординатного самописца 31, по оси Х регистрируется сигнал угла поворота призмы (длина волны), снимаемый с прецизионного потенциометра, закрепленного на одном валу с кулачком развертки спектра 2. Таким образом, самописец регистрирует спектр люминесценции исследуемого участка микрообъекта. В состав электрической схемы микроспектрофлуориметра входят также: электронный стабилизатор сетевого напряжения 28 типа St—200 (Tesla), стабилизированные источники высокого 29 (типа ВС-22) и низкого 27 напряжения, питающие фотоумножитель 36 и ртутную дуговую лампу 18 соответственно. Следует отметить, что при необходимости дальнейшего уменьшения габаритов и веса микроспектрофлуориметра ряд стандартных узлов его электрической схемы (блоки 27, 28, 29, 30) может быть заменен на более экономичные и малогабаритные устройства собственного изготовления. Некоторые из примеров узлов такого типа описаны ниже. П1.4. Экспедиционный микроспектрофлуориметр с интерференционным светофильтром переменной длины волны Экспедиционный микроспектрофлуориметр с интерференционным светофильтром переменной длины волны [368]. Дальнейшее уменьшение габаритов и веса микроспектрофлуориметра возможно при замене диспергирующего элемента призменного типа на интерференционный фильтр переменной длины волны. Такого типа микрофлуориметры использовали в биологических исследованиях [196, 369, 370]. Отличительной особенностью их является исключительная простота, и потому они заслуживают подробного описания. Принципиальная схема одной из модификаций микроспектрофлуориметра с интерференционным светофильтром переменной длины волны приведена на рис. 1.7. В основу прибора положен люминесцентный микроскоп типа МЛД (МЛ-3) с некоторыми конструктивными изменениями. Первым из них является уже описанная выше замена единственной «желтой» светоделительной пластинки на узел 9 сменных («желтой» и «синей») пластинок. Второе изменение в конструкции микроскопа заключается в установке на его станину системы развертки спектра, состоящей из электродвигателя 30, коробки скоростей 29 и конической передачи 28 с гибкими валиками привода. Таким образом, люминесцентный микроскоп работает в обычном стандартном режиме и позволяет наблюдать люминесценцию объекта 11 через окуляр 14 при введенном в ход лучей зеркале 13. При выведении зеркала 13 из хода лучей люминесцентное изображение микрообъекта проецируется в плоскость щелевой диафрагмы 16, ограничивающей размеры подлежащего исследованию участка микрообъекта 11. При введенной в ход лучей поворотной призме 17 изображение объекта и щель 16 рассматриваются с помощью окуляра 18, и изменением горизонтального и вертикального размера щели 16 окончательно устанавливаются размеры исследуемого участка. Перед щелевой диафрагмой 16 на пути светового потока, создающего люминесцентное изображение микрообъекта, в специальном кожухе установлен линейный интерференционный светофильтр 15 переменной длины волны. Спектральная характеристика использованного в данном приборе интерференционного светофильтра переменной длины волны приведена на рис. 1.8 в виде кривой 1, огибающей зарегистрированные на спектрофотометре «Shimadzu МРS-50 L» спектры пропускания участков шириной 1 мм, выбираемых вдоль по пластине фильтра. В пределах от 400 до 700 нм фильтр обладает удовлетворительной по своей линейности характеристикой (рис. 1.8, 1) и пропускает 40% падающего на него света. При этом ширина выделяемого спектрального диапазона составляет на полувысоте 16 нм на 1 мм длины фильтра (рис. 1.8, 2). Следует особенно отметить наличие вторых гармоник фильтра. Это выражается в том, что, например, при установке линейки фильтра в синей области в спектре его пропускания помимо полосы с максимумом 390 нм (рис. 1.8, 3) имеется дополнительная (и довольно интенсивная) полоса пропускания в красной (720 нм) области спектра (рис. 1.8, 3'). Соответствующие вторые гармоники имеются и у других полос пропускания. Например, полоса пропускания 400 нм (рис. 1.8, 4) имеет вторую гармонику с максимумом 750-760 нм (рис. 1.8, 4'). Такая особенность линейного фильтра переменной длины волны может привести к грубым ошибкам, если не принять соответствующих мер по полному устранению красной компоненты из возбуждающего люминесценцию излучения ртутной дуговой лампы 1 (рис. 1.7). Это обстоятельство вызывает необходимость тщательного контроля при настройке микроспектрофлуориметра. Рис. 1.7. Экспедиционный микроспектрофлуориметр светофильтром переменной длины волны. – источник света; – коллектор; – жидкостный фильтр; – светофильтры; – апертурная диафрагма; – линза; – полевая диафрагма; – линза; – сменная светоделительная пластинка; – микрообъектив; – предметный столик с препаратом; – запирающие светофильтры; – зеркало; – окуляр; – интерференционный светофильтр переменной длины волны; – щелевая диафрагма; – поворотная призма; – окуляр; – фотоумножитель; – усилитель ЛПУ-0,1; – двухкоординатный самописец; с интерференционным – блок питания ФЭУ; – электронный стабилизатор сетевого напряжения; – блок питания источника света; – проекционная система (2-8); – реечная передача; – реохорд; – коническая передача; – коробка скоростей; – двигатель СД-0,9. Рис. 1.8. Спектральные характеристики интерференционного фильтра переменной длины волны. По оси ординат – пропускание в %; по оси абсцисс – длина волны в нм. Таким образом, в описываемом устройстве анализ спектра люминесценции объекта производится путем перемещения светофильтра переменной длины волны системой развертки спектра (30, 29, 28) перед щелевой диафрагмой 16. При выведенной из хода лучей поворотной призме 17 пропущенный светофильтром 15 свет люминесценции микрообъекта попадает на фотокатод фотоумножителя 19 типа ФЭУ-51 и через усилитель-согласователь 20 (может быть использован рНметр ЛПУ-01) подается на ось Y двухкоординатного самописца 21, на ось Х которого снимается напряжение с линейного потенциометра, пропорциональное длине перемещения светофильтра 15, т. е. длине волны пропускания. В результате двухкоординатный самописец 21 регистрирует спектр люминесценции исследуемого участка микрообъекта 11. В качестве высоковольтного источника 22 питания ФЭУ может быть использован стабилизированный выпрямитель ВС-22, в то время как для питания дуговой ртутной лампы 1 применяется сильноточный источник низкого напряжения 24. Вся электрическая схема прибора подключается к сети через электронный стабилизатор сетевого напряжения 23 типа St-2000. Таким образом, может быть использована электрическая система питания и регистрации, применявшаяся в описанных выше микроспектрофлуориметрах. При необходимости дальнейшего уменьшения габаритов и веса прибора усилительсогласователь 20 типа ЛПУ-01 может быть заменен малогабаритным усилителем на полевых транзисторах, монтируемым непосредственно в кожухе делителя напряжения ФЭУ. Такого типа усилители постоянного тока могут быть собраны по различным схемам. Возможные варианты представлены на рис. 1.9 и 1.10. Рис. 1.9. Принципиальная схема усилителя с высоким входным сопротивлением. Рис. 1.10. Принципиальная схема усилителя с полевым транзистором на входе. Усилитель постоянного тока (рис. 1.9) представляет собой усилитель с обратной связью, выполненной на микросхеме К284 УД1В с высоким входным сопротивлением. Резисторы R12-R14 служат для установки нуля на выходе усилителя при отсутствии сигнала на входе. На выходе усилителя включен делитель напряжения R17-R23, позволяющий ступенчато изменять глубину обратной связи и тем самым - коэффициент усиления сигнала. Аналогичный описанному выше усилитель может быть выполнен на основе интегральной микросхемы операционного усилителя К1УТ401А (рис. 1.10). Входной каскад, собранный на униполярном полевом транзисторе КП1ОЗА по схеме истокового повторителя, служит для повышения входного сопротивления устройства. Делитель R2-R4 создает необходимое смещение на одном из входов (10) операционного усилителя, на второй вход которого подается сигнал с нагрузки истокового повторителя R1). Цепочка R5С1 введена для предотвращения самовозбуждения усилителя на высоких частотах. С выхода усилителя напряжение обратной связи подается через сопротивление R7 на затвор истокового повторителя. Применение двух независимых источников питания позволяет существенно снизить дрейф нуля усилителя. Полное устранение дрейфа нуля возможно, по-видимому, только при переходе на усиление по переменному току. При этом модуляцию сигнала можно производить различными способами: периодически прерывая световой поток, модулируя ток ФЭУ или используя вибропреобразователь для модуляции выходного тока ФЭУ, как это и осуществляется при использовании ЛПУ-01 в качестве согласующего усилителя. Помимо этих способов для модуляции выходного сигнала ФЭУ может быть использован транзисторный прерыватель [371]. Для дальнейшего уменьшения габаритов и веса установки возможна также замена источника 22 высоковольтного питания ФЭУ малогабаритным и экономичным блоком преобразователя, одна из схем которого приведена на рис. 1.11. Особенностью всех описанных выше микроспектрофлуориметров является применение механической щелевой диафрагмы 16 (рис. 1.7) в плоскости люминесцентного изображения микрообъекта. Единственным критерием выбора этой системы явилась возможность самостоятельного изготовления ее в любой механической мастерской, хотя зондовая система с диафрагмой, представляющей собой свободный от отражающего покрытия участок сферического зеркала, типа применяемой в микроскопах МУФ-5 и МУФ-6 [21], несомненно, более удобна в работе. В этом случае исследователь имеет возможность рассматривать при поиске необходимого участка микрообъекта все поле зрения. Сейчас, когда налажен серийный выпуск фотоэлектрических насадок типа ФМЭ-1 и ФМЭЛ-1 [21], представляется возможным применить эту систему при изготовлении микроспектрофлуориметров. Рис. 1.11. Принципиальная схема высоковольтного преобразователя напряжения для питания ФЭУ. Одним из примеров может служить модификация описанного выше экспедиционного микроспектрофлуориметра (рис. 1.7), в которой механическая щелевая диафрагма 16 заменена зондовой системой 18 фотоэлектрической насадки типа ФМЭЛ-1. Тогда все устройство остается неизменным, но становится более удобным в работе. Конечно, узел визуального наблюдения (см. рис. 1.7, 13, 14) является излишним и может быть удален (вместе с согласующей линзой ФМЭЛ-1) из состава микроскопа МЛД (МЛ-3). Однако, имея в виду возможность фотографирования объекта при снятой зондовой системе, этот узел может быть и сохранен. В описании экспедиционного микроспектрофлуориметра необходимо отметить возможность использования при работе с ним унифицированного сканирующего предметного столика. Эксплуатация этого прибора в экспедиционных установках показала его высокую надежность. Сборка и надстройка системы после транспортировки до места назначения производится за 1-2 ч. П1.5. Бесщелевой микроспектрофлуориметр с фоторегистрацией Бесщелевой микроспектрофлуориметр с фоторегистрацией. Рассматривая описание различных конструкций микроспектрофлуориметров, уместно уделить некоторое внимание одной интересной системе бесщелевого малогабаритного микроспектрофлуориметра. Его оптическая схема приведена на рис. 1.12. Источник света 1 освещает коллекторную линзу 2. Ограниченный щелевой диафрагмой 3 равномерно светящийся участок линзы 2 проектируется микрообъективом 6 в плоскость микрообъекта 7 с помощью интерференционной светоделителъной пластинки 5. Введенный в ход лучей светофильтр 4 выделяет требуемую для возбуждения люминесценции линию излучения ртутной лампы 1. Таким образом, люминесцирующий участок имеет щелевидную форму. Рис. 1.12. Схема бесщелевого микрофлуориметра с фоторегистрацией. 1 – ртутная дуговая лампа; 2 – коллектор; 3 – щелевая диафрагма; 4 – светофильтр; 5 – интерференционная светоделительная пластинка; 6 – микрообъектив; 7 – препарат; 8 – запирающий светофильтр; 9 – отражательная реплика дифракционной решетки; 10 – фотопленка; 11 – зеркало; 12 – окуляр; 13 – поворотная призма; 14 – визирная трубка. Микрообъектив 6 собирает свет люминесценции щелевого участка микрообъекта 7, и с помощью плоской дифракционой решетки 9 в нулевом порядке создается увеличенное изображение щелевидной области микрообъекта 7 в свете его люминесценции. В другом участке плоскости 10 в первом порядке дифракционной решетки 9 получается спектральное разложение света люминесценции этой же области микрообъекта. В составе попадающего на решетку 9 светового пучка имеется также частично прошедшая через запирающий светофильтр 8 возбуждающая люминесценцию линия излучения дуговой лампы 1, отраженная от покровного стекла микрообъекта 7. Изображение этой линии в спектре первого порядка дифракционной решетки может быть использовано в качестве реперной точки при последующей обработке фотопленки на микрофотометре с целью получения спектра люминесценции объекта в графической форме. Для предварительного просмотра микрообъекта 7 и выбора подлежащего спектральному исследованию участка его в ход лучей нулевого порядка микрообъектива 6 и дифракционной решетки 9 вводится зеркало 11, направляющее световой поток в плоскость полевой диафрагмы окуляра 12. Полученное в этой плоскости изображение визуально просматривается с помощью визирной трубки 14 и поворотной призмы 13. Система описанного типа может найти применение в полевых условиях. П1.6. Высокоапертурный бесщелевой спектрофлуориметр Высокоапертурный бесщелевой спектрофлуориметр [372, 373]. Хотя, строго говоря, этот прибор не предназначен для исследования микропрепаратов, его следует упомянуть здесь, так как в конструкции этого спектрофлуориметра заложена идея бесщелевого микроспектрофлуориметра. Важнейшая задача, которую необходимо решить в первую очередь при разработке приборов для спектрального анализа сверхслабого свечения тканей, заключается в создании оптической системы с максимально возможным светосбором. При люминесцентных исследованиях одиночных клеток эта задача решается достаточно просто путем применения высокоапертурных микрообъективов. Однако увеличение яркости объекта по мере увеличения апертуры микрообъективов сопровождается уменьшением поля зрения. Таким образом, выигрывая в яркости, можно проиграть в общей интенсивности светового излучения за счет уменьшения массы (объема) излучающего материала. С целью в той или иной мере обойти возникающие противоречия была разработана оптическая система, сочетающая в себе высокую апертуру микрообъектива и относительно большое поле зрения (рис. 1.13, 2, 3). Все элементы этой системы выполнены в виде отражающих зеркальных поверхностей, что дает возможность использовать ее в диапазоне от ультрафиолетовой до инфракрасной области спектра. Излучающий объект 1 помещен в фокусе объектива, состоящего из собирающего вогнутого сферического зеркала 2 и формирующего параллельный пучок выпуклого зеркала 3. Сформированное в виде параллельного пучка излучение объекта 1 попадает непосредственно на дифракционную решетку 4 и с помощью плоского зеркала 5 направляется на выходное сферическое зеркало 6, в плоскости фокусировки которого размещена выходная щель 7. За выходной щелью 7 установлен фотоумножитель 8, регистрирующий спектр излучения. С целью сравнения спектров сверхслабого хеми- и биолюминесцентного излучения объекта 1 со спектрами собственной фотолюминесценции этого же объекта в описываемое устройство введена дополнительно система возбуждения фотолюминесценции, содержащая в своем составе дуговую лампу 9, линзу 10 и светоделительную пластинку с интерференционным покрытием 11. Рис. 1.13. Схема высокоапертурного бесщелевого спектрофлуориметра. 1 – объект исследования; 2, 3 – зеркальный светосильный объектив; 4 – дифракционная решетка; 5 – плоское зеркало; 6 – сферическое зеркало; 7 – выходная щель монохроматора; 8 – ФЭУ; 9 – дуговая лампа; 10 – конденсор; 11 – светоделительная пластинка; 12 – контротражатель. Эффективное относительное отверстие светоотбирающей системы равно примерно 1:0,6. Светосила прибора может быть повышена за счет использования контротражателя 12. П1.7. Микроспектрофотометр для изучения фосфоресценции клеток Микроспектрофотометр для изучения фосфоресценции клеток [376]. Описывая фотоиндуцированное излучение микрообъекта, обычно приходится определять его как люминесценцию, не уточняя, идет ли речь о флуоресценции или о фосфоресценции. Причиной этого является в основном отсутствие приборов, необходимых для определения типа наблюдаемой люминесценции. В то же время этот вопрос в ряде случаев приобретает принципиальное значение, так как триплетные состояния возбужденных хромофоров, при дезактивации которых возникает фосфоресценция, могут играть значительную роль в таких важных внутриклеточных процессах, как, например, зрение и фотосинтез. Более того, иногда оказывается важным точно знать, из какого возбужденного состояния - синглетного (флуоресценция) или триплетного (фосфоресценция) происходит излучение красителя-метки, связанного с объектом исследования. В связи с этим были предприняты успешные попытки создания ряда приборов для изучения фосфоресценции микрообъектов [374—379]. Одну из этих установок [376], по-видимому, наиболее удачную, целесообразно рассмотреть подробнее. Оптическая схема установки приведена на рис. 1.14. В качестве источника возбуждающего излучения 1 использована ртутная дуговая лампа типа ДРШ-100-2, помещенная в фокусе кварцевого конденсора 2. Изображение светящегося тела лампы переносится коллектором 4 в плоскость апертурной диафрагмы 5, которая коллектором 6 изображается в плоскости входного зрачка микрообъектива 9. Плоские зеркала 3 и 7 и сменная интерференционная светоделительная пластинка 8 меняют направление светового потока. Три сменных пластинки 8, отличающиеся одна от другой границей между областями пропускания и отражения, закреплены в специальном опакиллюминаторе. Это позволяет выбрать наиболее оптимальные условия возбуждения и регистрации люминесценции объекта. Плоскость полевой диафрагмы 10 сопряжена оптически с плоскостью объекта 11, что позволяет менять размеры исследуемого участка препарата, изменяя размер полевой диафрагмы. В установке предусмотрена возможность использования охлаждающего столика 12, представляющего собой миниатюрный газовый холодильник [378], работающий на основе эффекта Джоуля-Томпсона. При этом температура исследуемого объекта может поддерживаться в интервале от комнатной до 192° С. Для разделения во времени возбуждающего излучения и света фосфоресценции применяется механическая модуляция, осуществляемая сменным диском 16, закрепленным на оси двигателя постоянного тока 17. На разных расстояниях от оси вращения диска расположены две системы вырезов, одна из которых служит для модуляции возбуждающего излучения, в то время как другая для модуляции света фосфоресценции. При этом соотношение между длительностью возбуждения, длительностью наблюдения и интервалом между ними определяется геометрией диска, а абсолютные значения этих временных интервалов изменяются линейно с изменением числа оборотов диска, которое в данной установке может плавно меняться от 5 до 100 об/с. Специальное стробоскопическое устройство служит для точного определения числа оборотов диска. Модуляция возбуждающего излучения осуществляется в плоскости апертурной диафрагмы 5, а модуляция света фосфоресценции - в плоскости выходного зрачка микроскопа, расположенного за окуляром 18, т. е. в местах наименьших сечений световых пучков. Рис. 1.14. Оптическая схема фосфоресцентного микроскопа с одним модулирующим диском [376]. – лампа ДРШ 100-2; – кварцевый конденсор; – плоское зеркало; – кварцевый коллектор; – апертурная диафрагма; – кварцевая линза; – плоское зеркало; – интерференционная светоделительная пластинка; – микрообъектив; – полевая диафрагма; – объект; – микрохолодильник; – лампа накаливания СЦ-61; – стеклянный коллектор; – выдвижное зеркало; – модулирующий диск; – электродвигатель; – окуляр; – микрофотонасадка; – откидывающаяся призма; – входная щель монохроматора; – вогнутое зеркало; – выходная щель; – реплика дифракционной решетки; – откидывающееся плоское зеркало; – фотоумножитель; – опорный ФЭУ; – кварцевая пластинка. В наборе имеются специальные диски для исследования флуоресценции. Система модулирующих прорезей в этих дисках такова, что возбуждающее излучение и свет флуоресценции прерываются одновременно и, таким образом, вся установка превращается в обычный микроспектрофлуориметр. Естественно, что при этом в оптическую систему необходимо ввести светофильтры для выделения области возбуждения и запирающий светофильтр. Исследуемое излучение объекта из окуляра 18 попадает в микрофотонасадку 19 типа МФН-3. Наблюдение объекта в свете фосфоресценции осуществляется с помощью призмы 20. При фотографировании и спектральных исследованиях призма 20 выводится из хода лучей. Для регистрации спектральных характеристик вместо фотоаппарата устанавливается монохроматор с фотоумножителем, как это показано на рис. 1.14. При этом плоскость входной щели 21 монохроматора совпадает с плоскостью изображения объекта. Алюминированное вогнутое зеркало изображает входную щель 21 в плоскости выходной щели 23. Диспергирующим элементом служит реплика дифракционной решетки 24, поворотом которой осуществляется развертка спектра. В случае исследования слабосветящихся объектов перед репликой может быть введено зеркало 25. При этом изображение входной щели 21 совпадает с выходной щелью 23 и регистрируется изменение интенсивности свечения объекта в широком спектральном диапазоне. В качестве, приемника излучения используется фотоумножитель 26 типа ФЭУ-39, питание которого осуществляется высоковольтным источником ВС-22. Регистрирующая часть установки выполнена в нескольких вариантах, соответствующих разным режимам ее работы. В одном варианте сигнал с ФЭУ через усилитель У1-2 подается на самописец, на ленте которого при повороте реплики дифракционной решетки записывается спектр исследуемого свечения. Кривая затухания в этом случае может сниматься или по точкам, или посредством изменения скорости вращения модулирующего диска и применения дисков разной геометрии, или при помощи стробирования [371] ФЭУ в определенный момент времени после окончания возбуждающего импульса. Последняя система позволяет значительно увеличить постоянную времени регистрации и существенно улучшить соотношение сигнал - шум. Для быстрой регистрации кривых затухания послесвечений с временем жизни 10-4-10-1с служит система, состоящая из ФЭУ-39, широкополосного усилителя переменного тока типа Ф-73 и осциллографа С1-4 (С1-19). Развертка осциллографа по времени может быть как линейной, так и экспоненциальной. Опорный сигнал, необходимый для стробирования ФЭУ-39, подается с дополнительного фотоумножителя 27, на который с помощью кварцевой пластинки 28 отражается 5-7% модулированного светового потока, возбуждающего свечение объекта. Этот же сигнал служит для синхронизации экспоненциальной развертки осциллографа при исследовании кривых затухания. Определенным недостатком этой системы является относительно малое временное разрешение (не более 10-4 с). Существенное повышение временного разрешения вряд ли возможно в системах с механической модуляцией световых потоков. По-видимому, дальнейшие перспективы в этой области связаны с применением импульсных источников света, в том числе лазерных умножителей частоты, а также различных электрических и магнитных модуляторов световых потоков. В заключение этого раздела следует отметить, что в зависимости от конкретной задачи исследования схема микроспектрофлуориметра и его устройство могут широко варьировать. Приложение 2 П2. Микрофлуориметры Простота изготовления одноканальных микрофлуориметров, позволяющих объективно измерять интенсивность люминесценции в том или ином выделяемом светофильтром участке спектра, привела к довольно широкому распространению их. При этом используются как электронные [380-384], так и фотографические [385-386] системы регистрации. Однако, учитывая, что промышленностью выпускается удобная в работе фотоэлектрическая насадка типа ФМЭЛ-1, представляющая собой в комплекте с люминесцентным микроскопом, в особенности с такими, как МЛ-4 [21] или «Люмам ИЗ» [387], хороший и надежно работающий микрофлуориметр, нет надобности описывать здесь устройства лабораторного изготовления. Необходимо только еще раз подчеркнуть изложенные выше соображения о трудностях интерпретации результатов измерения интенсивности одной полосы люминесценции, тем более, что широкий набор входящих в состав ФМЭЛ-1 интерференционных фильтров позволяет проводить измерения последовательно в нескольких участках спектра. Определенный интерес представляют собой используемые в ряде лабораторий многоканальные микрофлуориметры, позволяющие производить измерения интенсивности люминесценции одновременно в заранее выбранных участках спектра [388-404]. П2.1. Трехканальный микрофлуориметр Одним из примеров подобного типа устройств является трехканальный микрофлуориметр, блок-схема которого приведена на рис. 2.1. Прибор позволяет одновременно измерять интенсивность люминесценции в синей (420-480 нм), желтой (500-560 нм) и красной (600-750 нм) областях спектра. Здесь светоделительные пластинки (рис. 2.1, 3, 10, 11) использованы не только для отделения света люминесценции от возбуждающего его излучения (3), но и для грубого разделения света люминесценции по трем спектральным областям (10, 11). Основой прибора является люминесцентный микроскоп МЛ-3, подвергнутый некоторым конструктивным изменениям. С целью построения инвертированной системы произведена перестройка крепления зеркала визуального наблюдения 8. Кроме того, стандартная «желтая» пластинка, которой комплектуется микроскоп МЛ-3, заменена «синей» светоделительной пластинкой 3. Таким образом, ультрафиолетовое излучение источника 1 типа ДРШ-250, организованное оптической системой осветителя 2 микроскопа МЛ-3, отражается «синей» пластинкой 3 и микрообъективом 4 фокусируется на микрообъект 5, возбуждая его видимую люминесценцию. Свет люминесценции микрообъекта, собранный объективом 4, свободно проходит через «синюю» светоделительную пластинку 3 и запирающий светофильтр 7 типа ЖС-3 и попадает на «желтую» светоделительную пластинку 10. Как видно из спектральной характеристики, приведенной на рис. 2.2, 1, пластинка 10 отражает лучи синей области спектра, направляя их на фотокатод ФЭУ-51 (1), и пропускает лучи желто-зеленой и красной областей спектра на «красную» светоделительную пластинку 11. Спектральная характеристика пластинки 11 такова, что она отражает лучи желто-зеленой области спектра, направляя ее на фотокатод ФЭУ-51 (2) следующего канала, и пропускает лучи красной области спектра. Прошедший через «красную» светоделительную пластинку свет люминесценции поворотной призмой 12 направляется на фотокатод ФЭУ-51 третьего канала прибора для регистрации. Для улучшения спектральных характеристик каждого из каналов перед фотокатодами фотоэлектронных умножителей могут быть установлены дополнительные запирающие фильтры. Подбором этих дополнительных запирающих фильтров и изменением коэффициентов усиления фотоумножителей чувствительность всех трех каналов может быть установлена одинаковой. Визуальное наблюдение объекта в этом приборе осуществляется с помощью окуляра 9 при введении в ход лучей зеркала 8. Полевая диафрагма осветителя 2 используется для ограничения поля зрения и выбора, таким образом, подлежащего исследованию участка изучаемого объекта. Рис. 2.1. Блок-схема трехканального инвертированного микрофлуориметра. 1 – ртутная дуговая лампа ДРШ-250; 2 – проекционная система осветителя микроскопа МЛ-3 (МЛД); 3 – интерференционная светоделительная пластинка («синяя»); 4 – микрообъектив; 5 – препарат; 6 – предметный столик; 7 – запирающий светофильтр; 8 – зеркало; 9 – окуляр; 10 – интерференционная светоделительная пластинка («желтая»); 11 – интерференционная светоделительная пластинка («красная»); 12 – поворотная призма; 13, 14, 15 – каналы электронной регистрации. На рис.2.1 не приводится электрические блоки питания и регистрации. Для этой цели могут быть использованы любые из описанных выше систем, а также специальная система импульсного возбуждения и регистрации люминесценции. П2.2. Двухканальный импульсный микрофлуориметр Двухканальный импульсный микрофлуориметр [393]. Другим примером построения схемы микрофлуориметра, позволяющей существенно уменьшить ошибки измерения, обусловленные как нестабильностью источника возбуждающего люминесценцию излучения, так и изменением интенсивности и цвета люминесценции объекта за счет фотохимического разрушения флуорохрома, может служить схема, приведенная на рис. 2.2. Прибор собран на основе опытного образца люминесцентного микроскопа «Люмам» (1, 2, 6-10, 17—20, 35-38), выпускаемого ЛОМО. Одной из отличительных особенностей этого микрофлуориметра является использование импульсной лампы 3 типа ИФТ-200 с непрерывным спектром излучения [394] для возбуждения люминесценции препарата 19. При этом часть (≈7%) возбуждающего люминесценцию излучения, выделяемого светофильтром 8 из общего потока лампы 3 полированной кварцевой пластинкой 11, ответвляется в канал сравнения, состоящий из диафрагмы 12, позволяющей регулировать величину оптического сигнала, оптических элементов 13-15 и фотоумножителя 16 типа ФЭУ-71. Основной поток возбуждающего излучения, прошедший через пластинку 11, отражается интерференционной светоделительной пластинкой 17 и микрообъективом 18 фокусируется в плоскость препарата 19, возбуждая его люминесценцию. Люминесцентное излучение объекта, собранное микрообъективом 18, проходит через светоделительную пластинку 17, запирающий светофильтр 21 и линзу 23, с помощью интерференционной пластинки 24 создает два изображения объекта (в коротковолновой и длинноволновой) областях спектра люминесценции) в плоскостях диафрагм 25 и 31 соответственно. Изображение в плоскости регулируемой зеркальной диафрагмы 25 может рассматриваться с помощь визирной системы 29, 30. При этом производят совмещение фотометрируемого участка изображения микрообъекта с фотометрическим отверстием диафрагмы 25. Поскольку диафрагма 31 «красного» канала оптически сопряжена с диафрагмой 25, предполагается, что отверстие диафрагмы 31 будет совмещено с тем же участком изображения микрообъекта. Рис. 2.2. Двухканальный импульсный микрофлуориметр [393]. – лампа накаливания КГМ-75; 4, 37 – коллекторы; – импульсная лампа ИФТ-200; – переключающееся зеркало; 9, 14, 26, 32 – линзы; – апертурная диафрагма; – возбуждающий светофильтр; , 12 – полевые диафрагмы; – кварцевая пластинка; , 35 – зеркала; , 21, 27, 33 – запирающие светофильтры; , 28, 34 – ФЭУ; , 24 – сменные интерференционные светоделители; – микрообъектив; – препарат; – фазовоконтрастный конденсор; – система фокусировки для контрастной микроскопии; – ахроматическая тубусная линза; , 31 – фотометрическая диафрагма; -30 – система для визуального наблюдения; – зеленый светофильтр; – лампа накаливания; , 40 – интегрирующие емкости; , 42 – переключающиеся контакты. Описанная система позволяет проводить два типа измерении. по одноволновому и по двухволновому методам. Если препарат окрашен монохроматическим красителем, максимум излучения которого лежит, например, в желтой области спектра, то применяется одноволновый метод регистрации с помощью системы 25—28, как это показано на рис. 2.2. Второй измерительный канал 12-16 используется для устранения влияния нестабильности светового потока источника излучения 3. При этом во время импульсной вспышки источника 3 на фотоумножителе 28 регистрируется сигнал, обусловленный люминесценцией фотометрируемого участка объекта 19. Одновременно фотоумножитель 16 регистрирует сигнал, пропорциональный интенсивности возбуждающего люминесценцию излучения источника 3. Каждый из сигналов накапливается на интегрирующих конденсаторах 39 и 40 и усиливается усилителями постоянного тока. Частное от деления рабочего и опорного сигналов регистрируется цифровым вольтметром ВК2-6, перестроенным по схеме деления и показывающим интенсивность люминесценции в относительных единицах. Для измерения двухволновым методом на интегрирующий конденсатор 40, сигнал подается с фотоумножителя 34 «красного» измерительного канала. Цифровой вольтметр при этом показывает отношение интенсивностей люминесценции объекта в «желтой» и «красной» областях спектра, которое также не зависит от изменений интенсивности возбуждающего излучения. Положительной особенностью прибора является применение цифрового индикатора, что повышает производительность труда при массовых измерениях большого количества препаратов. Учитывая, что выход цифрового вольтметра может быть непосредственно подключен к перфоратору, можно параллельно фиксировать результаты измерения на перфоленте. Это существенно снижает трудоемкость подготовки материала для обработки на ЭЦВМ (в случае такой необходимости). В описываемом устройстве для выбора объекта исследования с целью предохранения препарата от фотохимического выцветания может быть применено наблюдение в фазовом контрасте (система 20, 35-38) или в свете люминесценции, возбуждаемой лампой накаливания 1 типа КГМ9-75. В случае использования контактных объективов для фокусировки на разную глубину ткани линза 23 может быть заменена на фокусирующую систему 22. Проведенные на этом приборе исследования показали, что при изучении окрашенных фиксированных препаратов степень фотохимического выцветания объектов при импульсном освещении такая же, как и при непрерывном, и зависит только от дозы облучения объекта. П2.3. Двухканальные поляризационные микрофлуоримегры Двухканальные поляризационные микрофлуоримегры [395]. Ввиду того, что при изучении взаимодействия люминесцентных красителей-меток с высокоупорядоченными структурами клеток (например, мышечных) может возникнуть потребность исследования степени поляризации люминесценции красителя, представляется полезным дать краткое описание двух усовершенствованных моделей [395] двухканального поляризационного микрофлуориметра [389]. Оба варианта с фотографической (рис.2.3) и фотоэлектрической (рис.2.4) системами регистрации предназначены для работы в широкой области спектра, включая его ультрафиолетовый диапазон. Принцип действия прибора с фотографической регистрацией (рис. 2.3) состоит в следующем: на два кадра фотопленки, заряженной в специальную кассету 23, производится одновременное фотографирование исследуемого объекта в лучах люминесценции, прошедших через призмуанализатор 22 и отраженных от ее гипотенузной грани, поляризованных в двух взаимно перпендикулярных плоскостях. Затем с помощью обычной методики фотометрирования фотографических изображений осуществляется измерение плотностей почернения полученных на негативах изображений микроструктур и расчет степени поляризации люминесценции. Люминесценция объекта возбуждается монохроматическим излучением источника 1, выделяемым с помощью зеркального монохроматора 2-5 с дифракционной решеткой 5, выходной щелью которого является зрачок микрообъектива 8. Поляризованное призмой 6 возбуждающее излучение отражается интерференционной светоделительной пластинкой 7 и фокусируется на объект 9 микрообъективом 8. Для устранения влияния интерференционной пластинки 7 на поляризацию возбуждающего излучения поляризатор 6 ориентируется относительно этой пластинки таким образом, чтобы колебания электрического вектора были ей параллельны. Ошибку, обусловленную влиянием пластинки на поляризацию, можно учесть, предварительно измерив ее действие в рабочей части спектра, либо скомпенсировать с помощью подобной по пропусканию пластинки, устанавливаемой над пластинкой 7 в перпендикулярной ей плоскости [396]. Визуальное наблюдение препарата с целью выбора подлежащей исследованию области его осуществляется с помощью системы 16 или, при работе в ультрафиолетовой области спектра, с помощью телевизионной установки ПТУ-26 на видиконе 20 с кварцевым окном. Прибор позволяет также измерять фотографическим способом величину двойного лучепреломления и дихроизма, для чего применяется освещение проходящим монохроматическим светом через конденсор микроскопа 10 при выведенных запирающем фильтре 21 и интерференционном светоделителе 7. При изменении двулучепреломления анизотропного объекта он устанавливается так, чтобы колебания электрического вектора света составляли с его оптической осью угол 45°. Фотографирование объекта производится в области спектра, не поглощаемой исследуемыми структурами. Для регистрации дихроизма при выведенном из хода лучей поляризаторе производится фотографирование объекта в лучах выбранной длины волны, находящейся в зоне поглощения исследуемого участка препарата. Измерив на каждом из двух полученных негативов плотности почернения в изображении изучаемой структуры и пустого участка, подсчитывают коэффициенты поглощения света с колебаниями, параллельными (k║) и перпендикулярными (k⊥) оптической оси этой структуры. Дихроизм в определенной длине волны определяется по формуле: Д =( k║— k⊥)/(k║ + k⊥). Естественно, что перед фотографированием препарат ориентируется определенным образом относительно анализатора 22. Отличием фотоэлектрического варианта прибора (рис. 2.4) от описанной выше модели с фотографической регистрацией является замена фотопленки двумя фотоумножителями 22 и 23. Отсутствует здесь также телевизионная система наблюдения в ультрафиолете, а оптическая система визуальной настройки 15-20 построена по зондовой схеме. В то же время в схему введена дополнительная система 24-27 возбуждения люминесценции объекта от источника 27. При этом интерференционная светоделительная пластинка 24 служит дополнительно для компенсации влияния пластинки 5 на поляризацию люминесценции объекта 7. Рис. 2.3. Принципиальная оптическая схема фотографического варианта двухканального микрофлуориметра [395]. 1 – источник света (лампа ДРШ-250-2); 2 – коллектор; 3 – входная щель монохроматора; 4 – вогнутое зеркало; 5 – плоская дифракционная решетка; 6, 6’ – сменные интерференционные поляризаторы для УФ и видимой области спектра; 7 – сменные интерференционные светоделители; 8 – микрообъектив; 9 – препарат; 10 – конденсор; 11 – апертурная диафрагма; 12, 19 – переключающиеся алюмированные зеркала; 13, 15 – алюмированные зеркала; 14 – линза; 16 – система визуального наблюдения; 17 – фотозатвор; 18 – окуляр микроскопа; 20 – видикон; 21 – запирающие сменные светофильтры; 22 – сменные интерференционные анализаторы для Уф и видимой области спектра; 23 – фотокассета. Имеются отличия и в системе измерения дихроизма. Под конденсором микроскопа располагается кристалл исландского шпата 14 с точечной диафрагмой 13, которая раздваивается этим кристаллом. Два изображения диафрагмы с помощью коденсора проецируются в плоскость анизотропного объекта, который устанавливается с помощью препаратоводителя так, чтобы одно изображение диафрагмы попало на исследуемый участок клетки, другое - на пустой участок препарата. Каждый из сигналов регистрируется своим ФЭУ (22, 23) при выведенном зеркале 15. Электронная система регистрации вычисляет отношение этих сигналов, фиксируемое на самописце, проградуированном для этой цели в значениях оптической плотности, т.е. измеряется коэффициент поглощения анизотропным объектом составляющей светового потока с колебаниями, параллельными оси объекта (k║). Затем объект перемещают так, чтобы оба изображения диафрагмы 13 в плоскости препарата поменялись местами, и производят измерение k⊥. Дихроизм определяется по приведенной выше формуле. Рис. 2.4. Принципиальная схема фотоэлектрического поляризационного микрофлуориметра [395]. 1 – источник света; 2 – коллектор; 3 – двойной монохроматор; 4 – сменные поляризаторы; 5 – сменные интерференционные светоделители; 6 – микрообъектив; 7 – препарат; 8 – конденсор или микрообъектив; 9, 11, 12 – алюмированные зеркала; 10 – линза; 13 – точечная диафрагма; 14 – кристалл испанского шпата; 15 – вогнутое алюмированное зеркало с отверстием; 16 – зеркало; 17, 19 – линзы; 18 – окуляр; 20 – защитные светофильтры; варианта двухканального 21 – сменные анализаторы; 22, 23 – ФЭУ; 24 – интерференционный светоделитель; 25 – светофильтр; 26 – коллектор; 27 – источник света; 25-27 – осветитель и интерференционный светоделитель условно повернуты на 900 относительно оптической оси микроскопа. П2.4. Двухканальный микрофлуориметр с раздельным возбуждением Двухканальный микрофлуориметр с раздельным возбуждением [284]. Основной сферой применения микрофлуориметров будеть являться, по-видимому, комплексный эксперимент, в котором регистрация интенсивности люминесценции объекта в определенных длинах волн предварительно изученного спектра люминесценции его сопровождает регистрацию физиологических параметров этого же объекта, таких как, например, электрическая или механическая активность, газообмен и др. В этих случаях применение громоздкой микроспектральной техники может оказаться как неудобным, так и излишним. Более того, возникает необходимость (см. гл. I) регистрировать внутриклеточную компартментализацию состояний тех или иных (например, энергетических) функциональных систем клетки. В этом случае представляет интерес не сам спектр люминесценции объекта, а прямая регистрация отношения интенсивности отдельных полос излучения в этом спектре (например, ξ, т. е. отношение интенсивности люминесценции окисленных флавопротеинов к таковой восстановленных пиридиннуклеотидов, а также упоминавшиеся выше параметры α, β и аналогичные им). Одним из удобных для этой цели приборов может явиться двухканальный микрофлуориметр с раздельным возбуждением люминесценции двух исследуемых соединений. Его принципиальная оптическая схема, собранная на основе люминесцентного микроскопа «Люмам», приведена на рис. 2.5. Возбуждение флуоресценции осуществляется падающим через микрообъектив 12 излучением с применением в опак-иллюминаторе сменных интерференционных светоделателей 11. В качестве источника света 1 использована ртутная лампа ДРШ-250-2. Ограничение размеров освещаемого поля осуществляется с помощью диафрагмы 10 типа «кошкин глаз», а выделение фотометрируемого участка - с помощью регулируемой зеркальной диафрагмы 17, расположенной в плоскости изображения объекта. Наблюдение объекта с целью выбора места препарата для фотометрирования и приведение измеряемой структуры внутрь зонда может осуществляться как в свете люминесценции, так и по методу фазового контраста. В последнем случае обычный микрообъектив 12 заменяется фазовым, а освещение производится в проходящем свете от лампы накаливания 27 через фазовоконтрастный конденсор 14. Преимуществом такого способа освещения является минимальное фотохимическое воздействие возбуждающего света на объект. Изображение объекта, полученное в плоскости зеркальной диафрагмы 17, наблюдается с помощью оптической системы 22. Интенсивность флуоресценции части объекта, изображение которой приходится на отверстие в этой диафрагме, регистрируется с помощью фотоумножителя 20 типа ФЭУ-71. Рис. 2.5. Оптическая схема двухволнового микрофлуориметра с раздельным возбуждением [284]. 1 – дуговая лампа; 2, 5, 9, 18, 28 – линзы; 3, 30 – теплофильтры4 4 – затвор; 6, 10, 17, 25, 29 – диафрагмы; 7 – сменный диск со светофильтрами; 8, 8’ – светофильтры возбуждения; 11 – сменные светоделители; 12 – микрообъектив; 13 – препарат; 14 – конденсор; 15, 21 – системы сопряжения; 16, 24, 31 – зеркала; 19, 19’ – светофильтры; 20, 26 – ФЭУ; 22 – система визуального наблюдения; 23 – кварцевая пластинка; 27 – лампа накаливания. Возбуждающие и запирающие стеклянные светофильтры попарно установлены в прорезях диска 7, как это показано на рис. 2.5, 4. Они находятся на разных расстояниях от оси вращения диска и ориентированы в нем таким образом, что каждому возбуждающему светофильтру в осветительной части прибора соответствует определенный запирающий светофильтр перед фотоумножителем в регистрирующей системе. Так, в одном из вариантов возбуждающий светофильтр 8" изготовлен из стекла УФС-6 (толщиной 4 мм), соответствующий запирающий светофильтр 19" - из стекол СС-5 (3 мм) и ЖС-3 (1 мм). Это пара светофильтров соответствует максимумам возбуждения и излучения восстановленных пиридиннуклеотидов. Для регистрации окисленных флавопротеинов применяется пара светофильтров: 8' - из стекла СС-5 (4 мм) и 19' - из стекла 3С-8 (4 мм). При вращении диска оптическую ось осветительной части прибора пересекают попеременно возбуждающие светофильтры 8 или 8', в эти моменты перед ФЭУ оказываются соответствующие запирающие светофильтры 19' и 19". Частота смены светофильтров 60 Гц. Это обеспечивает практически одновременную регистрацию различных полос люминесценции. Сигналы после ФЭУ усиливаются, распределяются на два канала и попадают в электрическую систему, которая может регистрировать абсолютные значения каждого сигнала, их отношение и изменение во времени. Диски выполнены сменными, каждый из них содержит определенную комбинацию светофильтров, предназначенную для решения разных задач. В разработанном приборе соответствующим образом расположенные пары светофильтров позволяют измерять три-четыре полосы флуоресценции при их оптимальном возбуждении. В приборе предусмотрена возможность работы с контактной оптикой, что позволяет проводить прижизненные исследования на целых органах животных. Для фокусировки на различную глубину органа тубусная линза 15 (см. рис. 2.5) заменяется оптической системой 21, состоящей из неподвижной отрицательной и перемещаемой вдоль оптической оси положительной линзы. Наблюдение объекта осуществляется в этом случае в свете флуоресценции или по методу темного поля в падающем свете. Раздельное возбуждение с возможностью выбора оптимальных для каждого вещества условий и раздельная же регистрация их люминесценции с последующей автоматической обработкой результатов являются, несомненно, одним из важнейших преимуществ описанного микрофлуориметра. Следует при этом иметь в виду, что использование раздельного возбуждения меняет величины регистрируемых отношений полос люминесценции. В частности, при исследовании препарата рецептора растяжения рака (см. табл. 3) с применением данного микрофлуориметра для клеток разного типа были получены отношения интенсивности люминесценции окисленных флавопротеинов к таковой восстановленных пиридиннуклеотидов ξ1, примерно в 2 раза более высокие, чем аналогичные отношения ξ, измеряемые при суммарном возбуждении обоих компонентов окислительного обмена излучением с длиной волны 365 им: Участок препарата Быстро адаптирующийся нейрон Медленно адаптирующийся нейрон Быстро адаптирующаяся мышца Медленно адаптирующаяся мышца Аксон ξ [182] 0,9 0,6 1,3 0,9 1,2 ξ1 [284] 1,9 1,4 2,2 1,8 2,1 ξ1/ξ 2,1 2,3 1,75 2 1,75 Это и следовало ожидать из сопоставления спектров поглощения окисленных флавопротеинов с длиной волны возбуждения. Заканчивая рассмотрение различных систем микроспектрального анализа одиночных клеток, необходимо отметить, что в последнее время в ЛОМО разработана и выпущена специальная микроспектральная насадка СФН-10, которая в комплекте с микроскопом МЛ-4 или «Люмам-ИЗ», а также с соответствующими электронными блоками измерения и регистрации представляет собой микроспектрофлуориметр для области спектра от 300 до 800 нм. Приложение 3 П3. Приборы и методы автоматического анализа клеточных популяций В заключение следует хотя бы кратко остановиться на методах автоматического анализа одиночных клеток с целью получения статистически усредненной информации о популяции этих клеток [397-406]. Задача измерения параметров большого количества одиночных клеток и последующего построения соответствующих гистограмм приводит к необходимости упрощения способа регистрации спектральных характеристик клеток. В этом случае микроспектрофлуориметр заменяется одним из описанных выше многоканальных микрофлуориметров и измеряются интенсивности люминесценции одной и той же клетки в нескольких, выбранных в соответствии с характеристиками красителей длинах волн. Специальные вычислительные устройства используют эти данные для построения гистограмм, характеризующих популяцию клеток в целом. Естественно, что при этом автоматизации подлежит и процесс предъявления клеток анализирующему устройству, что достигается применением сканирующего столика или проточной системы и специальной камеры для образца (рис. 3.1), в которой окрашенные клетки (1) потоком жидкости подаются по капилляру (2) и через зазор между калиброванным концом капилляра и покровным стеклом камеры (3) выносятся из измерительной камеры 5. Зазор между концом капилляра и покровным стеклом находится в фокусе микрообъектива многоканального микрофлуориметра. Поэтому в момент прохождения клетки через зазор возникает импульсный световой сигнал определенного спектрального состава. Оптическая система разделяет монохроматические составляющие этого сигнала и направляет их в соответствующие каналы регистрации. Автоматические устройства выдают гистограммы сигналов либо для каждого из каналов регистрации, либо для отношения их. Рис. 3.1. Проточная камера для автоматического многоканального анализа клеточных популяций. 1 – флуорохромированные клетки; 2 – калиброванный капилляр; 3 – покровное стекло камеры; 4 – микрообъектив многоканального микрофлуориметра; 5 – корпус камеры. Одним из примеров использования такого метода может служить определение ДНК, белка и объема одиночных клеток из больших популяций с применением двойной окраски [397]. Суспензия фиксированных клеток предварительно обрабатывалась РНКазой и затем окрашивалась для определения ДНК раствором пропидиум иодида (0,05 мг/мл в 2%-ном цитрате натрия), одного из аналогов этидиум бромида [404]. После промывки эти клетки окрашивались дополнительно флуоресценизотиоцианатом (ФИТЦ) для выявления белка. Спектры люминесценции обработанных таким образом клеток имеют максимумы излучения 590 нм (пропидиум иодид) и 530 нм (ФИТЦ). Суспензию окрашенных клеток пропускали через специальную проточную камеру. Для разделения максимумов излучения использовали светофильтры. Результаты анализа выражали в виде гистограмм для каждого из каналов, регистрирующих ДНК и белки. Недостатком этого способа представления результатов анализа является то, что двойная окраска не используется здесь для получения характерного для изучаемых клеток соотношения белок/ДНК и может быть без ущерба для точности результатов заменена раздельной регистрацией двух порций суспензии, каждая из которых окрашивается соответствующим красителем. Наиболее полно преимущества двухволновой регистрации используются, например, в работе Торелла[ 406], в которой двухцветная окраска клеток акридиновым оранжевым. применяется для анализа популяции клеток крови. С этой целью для представление результатов используется фазовая плоскость (экран осциллографа), в которой одна из осей - интенсивность люминесценции мономеров, а другая - интенсивность люминесценции димеров. При таком способе можно увидеть разные подгруппы популяции клеток, которые характеризуется определенными средними величинами α. Подобного типа системы особенно перспективны для целей автоматизации медицинской диагностики клеток. Приложение 4 Энергетическая яркость в отдельных линиях ртутных ламп [мВт/см2ср⋅нм] [362]. ДРШ ДРШ ДРШ ДРШ 250-2М 250-2 250-3 200 λНМ 248,2 2400 4060 500 1620 254* 1100 2000 35 830 260,3 90 265,2 1740 269,2 330 275,3 6,0) 80 190 180 280,4 1050 310 13 330 289,4 620 770 100 1150 293,5 60 780 296,7 2550 3900 520 1440 302,2 (2,6) 4100 4850 900 2370 312,6 (3,2) 7500 10600 2700 6200 334,1 1400 5200 570 1150 365,0 (6,3) 7700 12500 3440 7300 404,7 (7,8) 2950 6240 1720 3920 435,8 3960 6800 2220 4660 546,1 4000 8700 3260 4900 577,0 (9,0) 5600 12400 3000 5150 * Данные ориентировочны из-за самообращения линии. ДРШ 100-2 1210 1530 60 75 440 180 2340 0 1920 8400 0 1340 10000 8200 6300 6000 5000 СВД 120А 65 60 55 110 11 14 60 29 5 90 150 280 40 240 120 190 330 350 Приложение 5 Энергетическая яркость ламп со сплошным спектром и фона ртутных ламп [362]. ДРШλНМ 250-2М ДРШ- ДРШ- ДРШ- ДРШ- СВД250-2 250-3 200 100-2 120А 250 260 50 50 - - - - - - 270 320 280 360 200 10 30 290 300 500 300 310 325 350 380 400 450 500 550 260 240 80 40 40 40 20 10 30 600 - ДКсШ ДКсШ КГМ -120 -150 27×100 КГМ КГМ 9×75 6×15 50 54 90 100 0,5 - - 10 8 17 - - 10 84 140 1,1 - 130 130 4 НО 180 1,7 0,5 40 270 240 4 130 200 2,3 0,6 640 720 750 750 680 630 370 200 440 70 90 60 30 50 . 40 20 10 30 320 360 380 120 120 120 190 50 60 320 500 480 390 410 370 110 70 160 4 2 1.5 0,7 0,9 0,5 0,5. 0,5 1,0 160 185 225 270 300 310 300 290 270 230 255 290 310 320 320 300 310 295 3,1 4,0 5,3 7,9 10,9 12,5 19,0 28,5 39,0 1,0 1,2 2,0 3,2 5,5 7,0 12,0 20,0 28,5 0,5 0,6 1.0 2,0 3,6 4,8 9,0 14,5 21,0 350 - 80 30 1,0 240 300 54,6 37,1 28,0 - Приложение 6 Российская Академия наук Институт биофизики клетки РАН Научно-учебный Центр биологии клетки (Лицензия № 24Н-0108 Минобразования РФ от 31 марта 2000 г.) Программа курса СПЕКТРАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ КЛЕТОК Область знаний-510000 Естественные науки и математика) специальность: 01160 (биофизика) Автор курса: к.б.н. В.Н. Карнаухов ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА Данный курс предназначен для ознакомления студентов с методами спектрального анализа внутриклеточных органелл, одиночных клеток и клеточных популяций как в живых, так и в фиксированных препаратах. Необходимость использования этих методов обусловлена большими достижениями биохимии в исследованиях выделенных из клеток и тканей физиологически активных макромолекул. Эти достижения во многом базируются на использовании методов классического спектрального анализа чистых (нерассеивающих) растворов. Для дальнейшего движения в понимании принципов функционирования живых клеток, данные биохимии, полученные методами классического спектрального анализа, необходимо “привязать” к функционирующим одиночным клеткам, и их популяциям, используя методы спектрального анализа для изучения таких многокомпонентных и гетерогенных систем, как клетка. Эти особенности клетки как объекта спектральных исследований создают определенные ограничения и особенности и методов регистрации и способов интерпретации полученных результатов. В то же время использование методов спектрального анализа клеток создает уникальные возможности решения как фундаментальных проблем биологии, так и прикладных задач в области медицины, биотехнологии и экологии, что может быть проиллюстрировано оригинальными примерами. В предлагаемом курсе должно быть показано соотношение результатов спектрального анализа клеток с результатами методов классической биохимии, цитохимии и электронной микроскопии. Особое внимание будет уделено задачам, решение которых невозможно без применения спектрального анализа клеток. ПРОГРАММА КУРСА А: АБСОРБЦИОННЫЙ СПЕКТРАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ОДИНОЧНЫХ ЖИВЫХ КЛЕТОК. 1. Физические основы, возможности и ограничения метода. Спектры поглощения, ослабления и светорассеяния. Особенности спектроскопии поглощающих и рассеивающих многокомпонентных гетерогенных объектов. 2. Энергетика клетки. Спектры поглощения макромолекул входящих в состав энергосистем растительных и животных клеток. Гемопротеины, каротиноиды, хлорофиллы и т.д. Функции каротиноидов в животных клетках. Разностные спектры. 3. Внутриклеточные пигменты. Спектры поглощения каротиноидов, каротинпротеинов и т.д. Функции каротинпротеинов. 4. Техника и методы эксперимента. Микроскопы и спектрофотометры, сопряжение, регистрация. Общая схема микроспектрофотометра. Ошибки и ограничения. 5. Проблемы и перспективы. Новые возможности на новой элементной базе. Б: ЛЮМИНЕСЦЕТНЫЙ СПЕКТРАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ОДИНОЧНЫХ ЖИВЫХ КЛЕТОК. 6. Физические основы, возможности и ограничения метода. Роль светорассеяния, изменения положения максимумов при формировании сложного многокомпонентного спектра люминесценции. Флюоресценция и фосфоресценция. 7. Энергетика автотрофных клеток. Спектры люминесценции соединений, входящих в состав энергосистем растительных клеток. Хлорофиллы, фикобилины, фикоцианины и т.д. Многокомпонентность спектров реальных растительных клеток. 8. Энергетика гетеротрофных клеток. Спектры люминесценции соединений, входящих в состав энергосистем клеток животных. Пиридиннуклеотиды и фловопротеины. Определение энергетической активности клеток. Два пула митохондрий в одиночной нервной клетке. 9. Биолюминесценция и ее связь с энергетикой. Примеры спектров биолюминесценции. Особенности ее регистрации. Сверхслабое свечение тканей, хемилюминесценция. 10. Роль спектрального анализа одиночных клеток для понимания глобальных процессов. Синезеленые – вариотрофный организм. Парадоксы синезеленых. Симбионты. Адаптация биоценозов тропической зоны Океана к недостатку фосфатов в среде обитания. Красный прилив. 11. Медицинские приложения. Цитодиагностика заболеваний. Контактная микроскопия. Примеры из практики. 12. Техника и методы эксперимента. Люминесцентный микроскоп, сопряжение со спектроанализатором. Регистрация. Общая схема микроспектрофлюориметра. Ошибки и ограничения. 13. Проблемы и перспективы. Конфокальные системы, новые регистраторы, компьютерная обработка данных, времена жизни возбужденных состояний, криомикроскопия. В: ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ СПЕКТРАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ОДИНОЧНЫХ КЛЕТОК С ПРИМЕНЕНИЕМ КРАСИТЕЛЕЙ-ЗОНДОВ. 14. Определение жизнеспособности клеток. Основы методов и подходов. Типы флюорохромов, интерпретация результатов. Акридиновый оранжевый. 15. Динамика нуклеиновых кислот в клетке. Акридиновый оранжевый, димеры и мономеры, их связь с двухспиральными (ДНК) и односпиральными (РНК) нуклеиновыми кислотами. Параметр α и его динамика в процессе синтетической активности клетки. Выявление активной РНК и его механизм. Примеры использования для исследования нейронов и иммунокомпетентных клеток крови. 16. Белковый синтез в клетке. Двух- и трехкомпонентные окраски клеток. Флюоресцентно меченые антитела. 17. Взаимодействие макромолекул. Перенос энергии возбуждения, флюоресцентные метки, акцепторы и доноры. Примеры использования. 18. Люминесцентные красители и зонды. Краткий анализ известных данных. Примеры использования. 19. Проблемы и перспективы. Новые флюорохромы и новая техника измерений. Г: ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ СПЕКТРАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ. 20. Двухволновая микрофлюориметрия. Основы метода, безразмерные параметры. Техника эксперимента и примеры приложений в биологии, медицине и экологии. 21. Системы поиска нетипичных (патологических) клеток. Основы метода, примеры реализации. 22. Проблемы и перспективы. Новая элементная база, новые возможности. Д: ЗАКЛЮЧЕНИЕ. 23. Комбинация нескольких методов применительно к одному и тому же микрообъекту. Техника эксперимента, интерпретация данных. Примеры применения. 24. Проблемы и перспективы. Новые методы спектрального анализа клеток. Возможности и перспективы. Список рекомендуемой литературы 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Свенсон К., Уэбстер П. Клетка. Мир. М. 1980. С. 1-300. Де Дюв К. Путешествие в мир живой клетки. Мир. М. 1987. С. 1-256. Марголис. Эволюция клетки. Мир. М. Карнаухов В.Н. Функции каротиноидов в клетках животных. Наука. М. 1973. С. 1-107. Карнаухов В.Н. Биологические функции каротиноидов. Наука. М. 1988. С. 1-240. Карнаухов В.Н. Люминесцентный спектральный анализ клеток. Наука. М. 1978. С. 1-204. Карнаухов В.Н., Яшин В.А. Спектральный анализ морского микропланктона. Пущино. 1980. С. 140. 8. Карнаухов В.Н., Карнаухова Н.А., Яшин В.А. Методы и техника люминесцентной цитодиагностики. 9. Карнаухова Н.А. Люминесцентные параметры ядерных клеток крови в процессе иммунного ответа организма. Биофизика. Т. 29. №2. С. 267-279. 10. Карнаухов В.Н. Спектральный анализ клеток в экологии и охране окружающей среды. ОНТИ НЦБИ РАН, Пущино. 1988. С. 1-104. 11. Рощина В.Д., Рощина В.В. Выделительные функции высших растений. Наука. М. 1989. С. 1-214. Мельникова Е.В., Карнаухов В.Н., Головкин Б.Н. Применение 12. Рощина В.В., микроспектрофлюориметрии в спектральном анализе секреторных клеток растений. Изв. РАН. Сер. биол. 1997. №2. С. 167-171. Обобщенная Схема Окислительного Метаболизма Клетки Жирными линиями выделен основной путь окисления углеводов. Сплошными линиями показаны спектры поглощения и люминесценции восстановленных, а пунктирными – окисленных форм компонентов окислительного обмена Список первоисточников 1. Вавилов С.И. Микроструктура света. М., Физматгиз, 1950. 2.Теренин А.Н. Фотохимия красителей и родственных органических соединений. М.-Л., Физматгиз, 1947. 3. Принсгейм П. Флуоресценция и фосфоресценция. М., ИЛ., 1951. 4. Волькенштейн М. В. Строение и физические свойства молекул. М.– Л., Физматгиз, 1955. 5. Рид С. Возбужденные электронные состояния в химии и биологии. М., ИЛ, 1960. 6. Константинова-Шлезингер М.А. Люминесцентный анализ. М., Физматгиз, 1961. 7. Ельяшевич М.А. Атомная и молекулярная спектроскопия. М., Физматгиз, 1962. 8. Владимиров Ю.А., Литвин Ф.Ф. Фотобиология и спектральные методы исследования. Практикум по общей биофизике, т. 8. М., “Высшая школа”, 1964. 9. Юденфренд С. Флуоресцентный анализ в биологии и медицине. М., “Мир”, 1965. 10. Баренбойм Г.М., Доманский А.В., Туроверов К. К. Люминесценция биополимеров и клеток. Л., “Наука”, 1966. 11. Божевольнов Е.А. Люминесцентный анализ неорганических, веществ. М., “Химия”, 1966. 12. Столяров К.П., Григорьев Н.Н. Введение в люминесцентный анализ неорганических веществ. Л., “Химия”, 1967. 13. Степанов Б.И. Введение в химию и технологию органических красителей. М., “Химия”, 1971. 14. Паркер С. Фотолюминесценция растворов. М., “Мир”, 1972. 15. Черницкий Е.А. Люминесценция и структурная лабильность белков в растворе и клетках. Минск, “Наука и техника”, 1972. 16. Бурштейн Э.А. Люминесценция белковых хромофоров (Модельные исследования).- Биофизика (Итоги науки и техники), т. 6. М., ВИНИТИ, 1976. 17. Брумберг Е.М. Флуоресцентная микроскопия биологических объектов при верхнем освещении.Биофизика, 1959, 4, № 4, 471-475. 18. Брумберг Е.М. О флуоресцентных микроскопах.- Журн. общей биол., 1955, 16, № 3, 222. 19. Брумберг Е.М., Гершгорин А.С. Опак-иллюминатор преимущественно для люминесцентного микроскопа. Авт. свид. СССР № 78637, 1948. 20. Брумберг Е.М., Крылова Г.Н. Применение интерференционных делительных зеркал в флуоресцентной микроскопии.- Журн. общей биол., 1953, 14, № б, 461-464. 21. Скворцов Г.Е., Панов В.А., Поляков Н.И., Федин Л.А. Микроскопы. Л., “Машиностроение”, 1969. 22. Поллистер П., Орнштейн А. Цитофотометрический анализ в видимой части спектра.- В кн.: Методы цитологического анализа. М., ИЛ, 1957, с. 9–97. 23. Карнаухов В.Н. Спектральные исследования энергетического аппарата живых нервных клеток.– Биофизика, 1968, 13, № 4, 622–629. 24. Карнаухов В.Н. Живая клетка как объект спектральных исследований.- Биофизика живой клетки, т. 1. Пущино, 1970, 113-117. 25. Левин С.В. Количественное изучение светорассеяния в отдельных живых клетках.- Цитология, 1960, 2, 489-493. 26. Карнаухов В.Н. Спектрофотометрические исследования живых клеток.- Биофизика живой клетки, т. 4. Пущино, 1973, 185-198. 27. Н.S.Conn's Biological stains. Lillie R.D. (Ed.). Baltimore, Williams and Wilkins Co., 1969. 28. Лаптев Н.Г., Богословский Б.М. Химия красителей. М., “Химия”, 1970. 29. Мельников Б.Н., Морыганов П.В. Применение красителей. М., “Легкая индустрия”, 1971. 30. Gurr E. Synthetic dyes in biology, medicine and chemistry. New York - London, Acad. Press, 1971. 31. Красовицкий Б.М., Болтин Б.М. Органические люминофоры. Л. “Химия”, 1976. 32. Пирс Э. Гистохимия, теоретическая и прикладная. М., ИЛ, 1962. 33 Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М., “Мир”, 1969. 34. Мейсель М.Н., Гуткина А.В. Люминесцентная микроскопия в биологии и медицине.- В кн.: Люминесцентный аналиа. М., Физматгиз, 1961, 309–324. 35. Михайлов В.Г. Люминесцентный анализ в медицине. Ташкент, Медгиз УзССР, 1963. 36. Зеленин А.В. Люминесцентная цитохимия нуклеиновых кислот. М., “Наука”, 1967. 37. Мейсель М.Н. Флуоресцентная микроскопия и цитохимия в общей микробиологии.- В кн.: Успехи микробиологии, вып. 7. М., “Наука”, 1971, 3–32. 38. Люминесцирующие антитела. М., “Медицина”, 1972. 39. Гольдин Р.Б., Белецкая Л.В., Крюкова И.Н., Шаханина К.Л. Иммунолюминесценция в медицине. М., “Медицина”, 1977. 40. Kasperson T. The cell functions and cell growth. W.W. Norton and Co, I950. 41. Методы цитологического анализа. М., ИЛ, 1957. 42. Роrrо Т.J., Dadik S.P., Green М., Morse H.Т. Fluorescence and absorption spectra of biological dyes.Stain Technol., 1963, v. 38, 37. 43. Porro Т.J., Morse Н.Т. Fluorescence and absorption spectra of biological dyes. II.- Stain Technol., 1965, v. 40, 173. 44. Введение в количественную цитохимию. М., “Мир”, 1969. 45. Introduction to quantitative cytochemistry. Wied G.L. (Ed.). New, York - London, Acad. Press. 1966. 46. Fluorescence techniques in cell biology. Thaer A.A., Sernet М. (Eds). Berlin, Springer, 1973. 47. Агроскин Л.С., Папаян Г.В. Цитофометрия. Л., “Наука”, 1977. 48. Хачатурова Е.Н., Смирнова Е.А. Применение риванола - SO2 для цитофотометрии ДНК. - Изв. АН СССР. Сер. биол., 1966, № 6, 900-905. 49. Колесников В.А. Ранние изменения цитохимических свойств хроматина в регенерирующей печени. Канд. дис. М., 1976. 50. Laurence D.S.R. A study of the adsorption of dyes on bovine serum albumin by the method of polarization of fluorescence.- Biochem. J., 1952, v. 51, № 2, 168. 51. Duke J.А., МсКау R., Botts J. Conformational change accompanying modification of myosin ATP-ase.Biochim. et biophys. acta, 1966, v. 126, № 3, 600-603. 52. Cheung Н., Morales М. Studies of myosin conformations by fluorescent techniques. Biochemistry, 1969, v. 8, 2177-2182. 53. Aronson J.F., Detern A., Morales М. Myofibrillar shortening observed with a fluorescent “Vital Stain”.Fed. Proc., 1967, v. 26, 553. 54. Франк Г.М., Теплова В.В., Карнаухов В.Н. Люминесцентные спектральные исследования распределения полярных и гидрофобных групп в саркомере.- Биофизика живой клетки, т. 2. Пущино, 1971, 6-15. 55. Azzi A., Chance В., Radda G.К., Lee С.Р. A fluorescence probe for energy dependent structural changes in fragmented membranes.- Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1969, v. 62, 612–619. 56. Chance В., Azzi A., Mela L., Radda G., Vainic H. Local anesthetic induced changes of a membranebound fluorochrome. A link between ion uptake and membrane structure.- FEBS Letters, 1969, v. 3, № 1, 10-13. 57. Tasaki J., Watanabe A., Sandlin R., Garnay L. Changes in fluorescence, turbidity and birefringence associated with nerve exitation.- Proc. Nat. Acad. Sci.. USA, 1968, v. 61, 3, 883-888. 58. Rigler R., Ehrenberg M. Molecular interactions and structure as analysed by fluorescence relaxation spectroscopy.- Quart. Rev. Biophys., 1973, v. 6, № 2, 139-199. 59. Vallee В.L., Riordan J.F., Johansen J.Т., Livingston D.M. Spectro-chemical probes for protein conformation and function.- Cold Spring Harbor Sympos. Quant. Biol, 1972, v. 36, 517-531. 60. Brandt L., Gohlke J.R. Fluorescent probes for structure. Annual Rev. Biochem., 1972, 41, 808. 61. Williamson С.Е., Corvin А.H. Dyes as biologie probes, colour and dye microenvironments.- J. Colloid and Interface Sci., 1972, v. 38, № 3, 567-576. 62. Cornelius G., Görtner W., Haynes D.H. Cation complexation by valinomycin- and nigericin-type ionophores registered by the fluorescence signal of Tl+.- Biochemistry, 1974, v. 13, № 15, 3052. 63. Cohen L.В., Salzberg В.M., .Davila H.V., Ross W.N., Landowne D., Waggoner A.S., Wang C.H. Changes in axon fluorescence during activity: Molecular probes of membrane potential.- J. Membr. BioL, 1974, v. 19, 1-36. 64. Карнаухов В.H. Спектральные методы исследования энергетики и регуляции в живой клетке.Биофизика живой клетки, т. 3. Пущино, 1972, 100-117. 65. Карнаухов В.H. Спектральный анализ в изучении внутриклеточной регуляции обмена веществ и энергии.- Цитология, 1976, т. 18, №. 4, 408-418. 66. Браун А.Д., Кудрявцев Б.H. Исследования по количественной цитохимии в СССР.- Цитология, 1976, т. 18, № 4, 379-396. 67. Брумберг Е.М. Ультрафиолетовая флуоресцентная микроскопия.- Журн. общей биол. 1956, т. 17, №6, 401– 412. 68. Розанов Ю.М., Черногрядская H.А., Шуделъ М.С., Боровиков Ю.С. Изучение спектров ультрафиолетовой флуоресценции клеток различных тканей.- Цитология, 1969, т. 11, № 1, 104. 69. Владимиров Ю.А. Некоторые особенности флуоресценции ароматических аминокислот.- ДАН СССР, 1957, т. 116, № 5, 780-783. 70. Конев С.В. Спектры флуоресценции и спектры действия флуоресценции некоторых белков.--ДАН СССР, 1957, т. 116, № 4, 594-596. 71. Владимиров Ю.А. О люминесценции ароматических аминокислот в молекуле белка.- ДАН СССР, 1961, т. 136, № 4, 960-963. 72. Бурштейн Э.А. Люминесценция ароматических аминокислот и белков в растворах при возбуждении в коротковолновой ультрафиолетовой области.- Биофизика, 1961, т. 6, № 6, 753– 763. 73. Черногрядская H.А., Пильщик Е.М., Шуделъ М.С; Кудрявцева М.В., Асташина Т.П. Некоторые данные по ультрафиолетовой флуоресценции клеток различных тканей.- В кн.: "Электронная и флуоресцентная микроскопия клетки". М.-Л., “Наука”, 1964, 82-87. 74. Штранкфельд И.Г. О люминесценции мышц и мышечных блоков.- Биофизика, 1963, т. 8, № 6, 690-695. 75. Барский И.Я., Брумберг Е.М., Брумберг В.А. Об ультрафиолетовой флуоресценции мышц.- ДАН СССР, 1962, т. 147, № 2, 474. 76. Черногрядская Н.А., Шуделъ М.С., К вопросу об ультрафиолетовой флуоресценции околоядерных телец сперматид некоторых саранчовых.- ДАН СССР, 1962, т. 145, № 4, 917-919. 77. Брумберг Е.М., Барский. И.Я., Черногрядская В.А., Шудель М.С. К вопросу о природе ультрафиолетовой флуоресценции клеток.- ДАН СССР, 1963, т. 150, № 6, 1356-1358. 78. Хрущев Н.Г. Ультрафиолетовая флуоресценция.элементов рыхлой соединительной ткани в норме и в условиях воспаления. Архив анат. гистол. эмбриол., 1963. т. 46, № 2, 39-45. 79. Сафронов В.Г., Ягунов А.С. УФ-флуоресценция живых и убитых клеток крови и костного мозга облученных животных.– Цитология, 1969, т. 10, № 4, 471-475. 80. Воробцова Н.Е., Сафронова В.Г. Исследование УФ-флуоресценции клеток костного, мозга потомков облученных животных.– Цитология, 1969, т. 11, № 2, 255-259. 81. Брумберг И.Е. Изменение интенсивности ультрафиолетовой флуоресценции лейкоцитов периферической крови при различных условиях облучения животного.- Цитология, 1969, т. 11, № 2, 251-254. 82. Проценко М.И., Ганин А.Ф., Груздев А.Д., Мосолов А.Н. Исследование повышенного уровня УФфлуоресценции и синей люминесценции в культуре фибробластов после однократного рентгеновского облучения.- Цитология, 1970, т. 12, № 2, 214-219. 83. Черногрядская В.А., Пильщик Е.М., Шудель М.С., Кудрявцева. М.В., Асташина Т.П. К вопросу об ультрафиолетовой флуоресценции митохондрий - ДАН СССР, 1964, т. 156, 174-176. 84. Шудель М.С. УФ-флуоресценция живых клеток асцитной карциномы Эрлиха при различных взаимоотношениях в них дыхания и гликолиза.- В кн.: "Электронная и флуоресцентная микроскопия клетки". М.– Л., “Наука”, 1964. 85. Конев С.В. Электронно-возбужденные состояния биополимеров. Минск, “Наука и техника”, 1965. 86. Розанов Ю.М., Черногрядская Н.А., Барский И.Я., Боровиков Ю.С., Шудель М.С. Поляризованная УФ-флуоресценция мышечных волокон и некоторых других анизотропных цитологических объектов.- Цитология, 1971, т. 13, № 2, 190-200. 87. Черногрядская Н.А., Шудель М.С., Барский И.Я., Розанов Ю.М., Боровиков Ю.С. Изучение фотографическим методом поляризованной ультрафиолетовой флуоресценции саркомера гигантских мышечных волокон Balanus rostratus.- Цитология. 1972, т. 14, 10, 1233-1238. 88. Шудель М.С., Боровиков Ю.С., Яснецкий Г.Н. Изучение методом поляризованной УФфлуоресценции саркомера гигантских мышечных волокон Balanus rostratus.- В кн.: "Структура, функция и реактивность клеток". Л., “Наука”, 1973, 10-12. 89. Карнаухов В.Н. Микроспектральные исследования метаболизма гигантских нейронов большого прудовика.– В кн.: "Свойства и функции макромолекул и макромолекулярных систем". М., “Наука”, 1969. 90. Warburg О. Wasserstofföbertragende Fermente. Berlin, 1948, s.21. 91. Ленинджер А. Биохимия. М., “Мир”, 1974, 434-436. 92. Massay V. Lypoil deghydrogenase.- In: The Enzymes, v. 7. New York, Acad. Press, 1962, p. 275. 93. Theorell H. Das gelbe Oxydationsferment. - Biochem.. Z., 1935, v. 278, 263. 94. Chance В., Schoener В. Fluorimetric studies of flavin component of the respiratory chain. In: “Flavins and flavoproteins”. Slater (Ed.). Amsterdam - New York - London, Elsevier Publ., 1966, p. 510-528. 95. Chance В., Mela L., Wong D. Flavoproteins of the respiratory chain.- In “Flavins and flavoproteins”. K.Yagi (Ed). Baltimore, Univ. Park Press, 1968, p. 107. 96. Flavoproteins. Kamin H. (Ed.). Baltimore, Univ. Park Press, 1970. 97. Зинченко В.П., Щипакин В.H., Карнаухов В.H. Люминесцентное определение флавопротеинов и пиридиннуклеотидов в микросомах и митохондриях.- В кн.: "Митохондрии. Молекулярные механизмы ферментативных реакций". М., “Наука”, 1972, 185-188. 98. Duysens L.N.М., Amez J. Fluorescence spectrophotometry of reduced phosphopyridine nucleotide in intact cells in the nearultraviolet and visible region.- Biochim. et biophys. acta, 1957, v. 24, 19. 99. Chance В., Baltscheffsky H. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. VII. Binding of intramitochondrial reduced pyridine nucleotide.- J. Biol. Chem., 1958, v. 233, 736. 100. Chance В., Thorell В. Localization and assay of respiratory enzymes in living cells. Fluorescent measurements of mitochondrial pyridine nucleotide in aerobiosis and anaerobiosis.- Nature, 1960, v. 184, 931. 101. Chance В., Jöbsis F.F. Change in fluorescence in a frog sartorious muscle following a twitch.- Nature, 1959, v. 184, 195. 102. Jöbsis F.P., Duffield J.С. Oxidative and glycolitic recovery metabolism in muscle. Fluorimetric observations on their relative contributions.- J. Gen. Physiol., 1967, v. 50, 1009. 103. Scholz R., Thurman R.G., Williamson J.R., Chance В., Bachere T. Flavin and pyridine nucleotide oxidationreduction changes in perfused rat liver.- J. Biol. Chem., 1969, v. 244, 2317-2324. 104. Estabrook R.W. Fluorimetric measurement of reduced pyridine nucleotide in cellular and subcellular particles.- Analyt. Biochem., 1962, v. 4, 231. 105. Карнаухов В.H. Люминесцентные исследования мышечных клеток.- В кн.: "Молекулярная и клеточная биофизика". М., “Наука”, 1977, с. 247–258. 106. Kohen E., Kohen С., Thorell В., Akerman L. Kinetics of the fluorescence response to microelectrophoreticaly introduced metabolites in the single living cell.- Biochim. et biophys. acta, 1968, v. 158, 185-188. 107. Kohen E., Kohen С., Thorell В. Microfluorimetric study of drug induced metabolic adaptations.Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem., 1971, v. 352, 635-644. 108. Kohen E., Kohen С., Thorell В. Rapid microfluorimetry of enzyme reactions in single living cells.Biochim. et biophys. acta, 1971, v. 234, 531–536. 109. Kohen E., Thorell В., Kohen С., Salmon J.М. Studies on metabolic events in localized compartments of the living cell by rapid microspectrofluorometry.- In: Advances in biological and medical physics, v. 15. Acad. Press, 1974, p. 271-297. 110. Четвериков А.Г., Ричардс Г.П., Пейсахзон Б.И, Применение флуоресцентной спектроскопии для прижизненного наблюдения за окислительно-восстановительными уровнями в клетках завядающих растений.- ДАН СССР, 1976, т. 230, № 2. 111. Drujan B.D., Castillon R., Guerrero E. Application of fluorimetry in determination of vitamin A.Analyt. Biochem., 1968, v. 23, 44–52. 112. Карнаухов В.Н., Татарюнас Т.Б., Петруняка В.В. Накопление каротиноидов в мозге и сердце животных при старении. Роль каротиноидов в формировании липофусцина.- Биофизика живой клетки, т. 3. Пущино, 1972, 64-75. 113. Karnaukhov V.N., Tataryunas Т.В., Petranyaka V.V. Accumulation of carotenoids in brain and heart of animals on aging; The role of carotenoids in lipofuscin formation.- Mech. Age Dev., 1972, v. 2, 201210. 114. Karnaukhov V.N. On the nature and function of yellow ageing pigment lipofuscin.-Exper. Cell Res., 1973, v. 80, 479-483. 115. Карнаухов В.H. Функции каротиноидов в клетках животных. М., “Наука”, 1973. 116. Карнаухов В.H. О роли каротиноидов в формировании липофусцина и адаптации клеток к недостатку кислорода.- Цитология, 1973, т. 15, № 5, 638-542. 117. Karnaakhov V.N. Carotenoids in oxidative metabolism of molluscoid neurons.-Exper. Cell Res., 1971, v. 64, 301-306. 118. Стрелер Б. Время, клетки и старение. М., “Мир”, 1964. 119. Bjorklund A., Falck В., Owman С. Fluorescence microscopic and microspectrofluorometric techniques for the cellular localization and characterization of biogenic amines.- In: Methods of in vestigative and diagnostic endocrinology, v. 1. S.A.Berson (Ed.). 1971, p. 318. 120. Буданцев А.Ю. Моноаминэргические системы мозга. М., “Наука”, 1976. 121. Сахарова А.В., Сахаров Д.А. Люминесценция биогенных моноаминов на срезах нервной ткани, фиксированной водным формальдегидом.- Цитология 1968, т. 10, № 3, 389. 122. Runge. A recording microfluorospectrophotometer. - Science, 1966, v. 156, 1499. 123. Гуринович Г.П., Севченко А.H., Соловьев К.H. Спектроскопия хлорофилла и родственных соединений. Минск, “Наука и техника”,1968. 124. Brugsch M.A. Porphyrine. 2 Aufl. Leipzig, 1959. 125. Верболович П.А. Миоглобин и его роль в физиологии и патологии животных и человека. М., Медгиэ, 1961. 126. Манешин С.К., Аревшатян А.А. Люминесценция порфиринов в дрожжах р. Candida, выращенных на углеводородах.- Биофизика, 1972, т. 17, 352-354. .127. Манешин С.К., Денисова Т.С., Аревшатян А.А. Исследование особенностей и природы порфирииов, синтезируемых дрожжами.- Биофизика живой клетки, т. 4. Пущино, 1973, 59-66. 128. Манешин С.К., Аревшатян А.А. Авт. свид. СССР, № 351892, 1973. 129. Bisalpгtra T. Plastids.- In: Algal physiology and biochemistry. W.D.P.Stewart (Ed.). Oxford-London Edinburgh - Melbourne, Blackwell Sci. Publ., 1974, p. 140-160. 130. Meek J.C. Chlorophylls.- In Algal physiology and biochemistry. W.D.P.Stewart (Ed.). Oxfor- London Edinburgh - Melbourne, Blackwell Sci. Pгbl., 1974, p. 161-175. 131. Gooditn T.W. Carotenoids and biliproteins.- In Algal physiology and biochemistry. W.D.P.Stewart (Ed.). Oxford - London - Edinburgh - Melbourne, Blackwell Sci. Publ., 1974, p. 176-205. 132. Рабинович E. Фотосинтез, т. 2. М., ИЛ, 1953. 133. Гродзинский А.М., Гродзинский Д.М. Краткий справочник по физиологии растений. Киев, “Наукова думка”, 1973. 134. Govindjee, Braun В.Z. Light absorption, emission, and photosynthesis.- In: Algal physiology and biochemistry. W.D.P.Stewart (Ed.). Oxford - London-Edinburgh - Melbourne, Blackwell Sci. Publ., 1974, p. 346-389. 135. Gray В.H., Gantt E. Spectral properties of phycobilisomes and phycobiliproteins from the blue-green alga - Nostoc sp.-Photo-chem. Photobiol., 1975, v. 21, 121-128. 136. Тарусов Б.Н., Иванов И.И., Петрусевич Ю.М. Сверхслабое свечение биологических систем. Издво МГУ, 1967. 137. Труды Московского общества испытателей природы, т. 39. Сверхслабые свечения в биологии. М., “Наука”, 1972. 138. Гурвич А., Еремеев В.Ф., Карабчиевский Ю.А. Энергетические основы митогенетического излучения и его регистрация на фотоэлектронных умножителях. М., “Медицина”, 1974. 139. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М., “Наука”, 1972. 140. Mc Elroy W.D., Rainwater C.S. Spectral energy distribution of the light emitted by firefly extracts.- J. Cell. and Compar. Physiol., 1948, v. 32, 421-426. 141. Strehler В.L. Adenosine-5'-triphosphate and creatine phosphate. Determination with Luciferase.- In Methods of enzymatic analysis. New York - London, Acad. Press, 1963, p. 559-572. 142. Brewer G.J., Eaton J.W. Eritrocyte metabolism: interaction with oxygen transport.- Science, 1971, 171, 1205-1211. 143. Ashley С.С., Ridgway E.В. Simultaneous recording of membrane potential, calcium transient and tension in single muscle.- Nature, 1968, v. 219, № 5159, 1168-1169. 144. Johnson F.H., Shimomura 0. Preparation and use of aequorin for rapid microdetermination of Ca2+ in biological systems.- Nature New Biol. 1972, 237, № 78, 287-288. 145. Hallet M., Carbone E. Studies of calcium influx into squid giant axon with aequorin. J. Cell. Physiol., 1972, v. 80, № 2, 219-226. 146. Izutsu К.Т., Felton S.P., Siegel I.A., Yoda W.T. Aequorin: its ionic specificity.- Biochem. and Biophys. Res. Communs, 1972, v. 49, № 4, 1034-1035. 147. Morin J.С., Hastings J.W. Energy transfer in a bioluminescent system.-J. Cell. Physiol., 1973, v. 77, № 3, 313-318. 148. Harvey E.N. Bioluminescence. New York, Acad. Press, 1952. 149. Nicol J.A.C. Animal luminescence.- In: Advances Comparative Physiology and Biochemistry, v. 1, 1962, p. 217–273. 150. Willey N.S. Bioluminescence. Production of light by organisms.- In: Photophysiology, v. 2. A.C.Giese (Ed.). New York, Acad. Press, 1964, p. 389-421. 151. Johnson F.H. Bioluminescence.- In: Comprehensive biochemistry, v. 27. M. Florkin and E.H. Stotz (Eds). Amsterdam - London - New York, Elsevier Publ. Co, 1967, p. 79-136. 152. Hastings I.W. Bioluminescence. Annual Rev. Biochem., 1968, v. 37, p. 597-627. 153. Биолюминесценция моря. М., “Наука”, 1969. 154. Cormier M.J., Eckroade С.В. Studies on the bioluminescence of Renilla reniformis. III. Some biochemical comparison of the system other Renilla species and determination of the spectral energy distributions.– Biochim. et biophys. Acta. 1962, v. 64, 340. 155. Wampler J.E., Hori K., Lee J.W., Cormier M.J. Structured bioluminescence. Two emitters during both the in vitro and in vivo bioluminescence of the sea pansy, Renilla.- Biochemistry, 1971, v. 10, 2903– 2908. 156. Wampler J.E., Karkhanis Y.D., Morin J.G., Cormier M.J. Similiarities in the bioluminescence from the Pennatulacea.- Biochim. et biophys. acta. 1973, v. 314, 104–109. 157. Karkhanis Y.D., Cormier M.J. Isolation and properties of Renilla reniformes luciferase, a low molecular weight energy conversion enzyme.- Biochemistry, 1971, v. 10, 317–326. 158. De Luca M., Dempsey M.E., Hori К., Wampler J.E., Cormier M.J. Mechanism of oxidative carbon dioxid production during Renilla reniformes bioluminescence.- Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1971, v. 68, № 7, 1658-1660. 159. Andersen J.M., Cormier M.J. Lumisomes, the cellular site of bioluminescence in Coelenterates.-J. Biol. Chem., 1973, v. 248, № 8, 2937-2943. 160. Spurlock В.О., Cormier M.J. A fine structure study of the anthodium in Renilla Mülleri. Evidence for the existence of a bioluminescent organelle, the luminelle.- J. Cell BioL, 1975, v. 64, 15-28. 161. Hori K., Wampler J.E., Matthews J.C., Cormier M.J. Identification of the product exited states during the chemiluminescent and bioluminescent oxidation of Renilla Luiciferin and certain its analogs.– Biochemistry, 1973, v. 12, № 22, 4463-4468. 162. Morin J.С. Colenterate bioluminescence.- In “Colenterate biology: Reviews and new perspectives. Muscatine L. and Lenhoff H. (Eds). New York, Acad. Press, 1974, p. 397-438. 163. Cormier M.J., Hori K., Karhanis Y.D., Anderson J.M., Wampler J.E., Morin J.G., Hastings J.W. Evidence for similar biochemical requirements for bioluminescence among the Coelente-rates.- J. Cell Physiol., 1973, v. 81, № 2, 291–297. 164. Лабас Ю.А. О механизме активируемой кальцием биолюминесценции гребневиков.- Биофизика живой клетки, т. 4. Пущино, 1973, 83-109. 165 Dare L.S., Cormier M.J. Requirements for luminescence in extracts of a balanoglossid species.- J. Biol. Chem., 1961, v. 236, 288. 166. Bellisario R., Spencer Т.Е., Cormier M.J. Isolation and properties of luciferase, a non-heme peroxidase, from the bioluminescent earthworm, Diplocardia longa.- Biochemistry, v. 11, 1972, № 12, 2256-2266. 167. Зинченко В.П., Карнаухов В.Н., Лабас Ю.А. Спектральные исследования связи биолюминесценции с окислительным обменом гребневика.– Studia biophysica, 1970, v. 23, № 1, 77-84. 168. Карнаухов В.Н., Кулаков В.И., Мельникова Е.В., Яшин В.А. Микроспектрофлуориметр на базе стандартных деталей и узлов.- Цитология, 1968, v. 10, № 5, 654–657. 169. Карнаухов В.Н., Зинченко В.П. Люминесцентные спектральные исследования путей терминального окисления при изменении функциональной активности одиночной мышечной клетки.– Цитология, 1971, 13, № 10, 1243–1249. 170. Машанский В.Ф., Лабас Ю.А., Карнаухов В.H. О механизме инактивируемой кальцием биолюминесценции гребневика.– В кн.: Биологическая спектрофотометрия и фотоактинометрия. Красноярск, 1973, 60–70. 171. Машанский В.Ф., Лабас Ю.А., Снегиревская Е.С. Природа фотогенных гранул и пусковые механизмы активируемой кальцием биолюминесценции у гребневиков.– Цитология, 1974, т. 16, № 12, 1459–1464. 172. Лабас Ю.А., Машанский В.Ф. Структурная основа свечения гребневиков.– Биология моря, 1976, 1, 57–66. 173. Karnaukhov V.N. Spectrometric investigations of the energy system of living neurons.– Neurosci. Translations, 1968–1969, № 8. 174. Chance В., Williams G.R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation.– Adv. Enzymol., 1956, v. 17, 65. 175. Карнаухов В.Н., Павленко В.К. Люминесцентные спектральные исследования рецептора растяжения речного рака.– Studia biophysica, 1970, v. 23, 69–76. 176. Гуляев П.И., Павленко В.К., Шлиппенбах В.Я. Поперечно-полосатая структура механорецепторного нейрона речного рака,– Цитология, 1968, v. 10, №. 9, 1183–1185. 177. Павленко В.К., Снетков В.И., Лебедев О.Е., Гордиенко В.А. Терморецепторная функция рецептора растяжения речного рака.– Физиол. журн. СССР, 1975, т. 61, № 6, 925–932. 178. Павленко В.К. Нейроплазматический комплекс – микротрубки, септальный ретикулум.– В кн.: "Немышечные формы подвижности". Пущино, 1976, 70–85. 179. Terzuolo C.A., Chance В., Наndelman E., Rossini L., Shmelser P. Measurement of reduced pyridine nucleotides in a singl neuron.– Biochim. et biophys. acta, 1966, v. 126, 361-372. 180. Коган А.Б., Загускина Л.Д., Загускин С.Л. Вызванные колебания напряжения кислорода над поверхностью одиночного механореценторного нейрона речного рака.– Физиол. журн. СССР, 1974, т.40, № 4, 533–539. 181. Hultborn R., Hyden H. Microspectrophotometric determination of nerve cell respiration at high potassium concentration.– Exper. Cell Res., 1974, v. 87, 346–350. 182. Карнаухов В.Н., Лебедев О.E., Павленко В.К. О двух пулах митохондрий в одиночном механорецепторном нейроне.– Цитология, 1976, v. 18, № 10, 1189– 1193. 183. Павленко В.К., Машков Д.А. Ультраструктурное исследование механорецепторного нейрона речного рака.– Биофизика живой клетки, т. 4. Пущино, 1973. 137-147. 184. Brandt J.Т., Martin A.P., Lucas F.V, Vorbeck M.L. The structure of rat liver mitochondria: A reevaluation.– Biochem. and Biophys. Res. Communs, 1974, v. 59, № 3, 1097–1103. 185. Lieberman A.R. Microtubule-associated endoplasmic reticulum in the frog's brain.– Z. Zellforsch., 1971, v. 116, № 4, 564-577. 186. Карнаухов В.Н. Действие функциональной нагрузки на энергоаппарат клетки.– В кн.: "Проблемы дефицита возбуждения". Петрозаводск, 1971, 34–35. 187. Березовский В.А., Петунин Ю.И., Сушко Б.С., Якут Л.И. К вопросу о механизме транспорта кислорода через биологические мембраны. Цитология, 1976, т. 18, № 1, 53–57. 188. Glock G.F., Lean P. Levels of oxidized and reduced diphosphopyridine nucleotide and triphosphopyridine nucleotide in animal tissues.– Biochem. J., 1955, v. 61, 388. 189. Зинченко В.П. Прижизненное исследование пиридиннуклеотидов и флавопротеинов мышцы. Канд. дис. Пущино, 1975. 190. Карнаухова Н.А. Датчик для регистрации натяжения мышцы.– Биофизика живой клетки, т. 4. Пущино, 1973, 171–174. 191. Зинченко В.П. Изменение люминесценции пиридиннуклеотидов мышечной клетки в ответ на кратковременную стимуляцию.– Биофизика живой клетки, т. 3. Пущино, 1972, 76–80. 192. Karnaukhov V.N., Zinchenko V.P. The muscle cell energy regulation by its functional activity.– Abstr. I – Europ. Biophys. Congr., EXI/1, 399–402, Vienna, 1971. 193. Hill A.V. The mechanism of muscular contraction.– Physiol. Rev., 1922, v. 2, 310. 194. Карнаухов В.Н., Петруняка В.В. Окислительно-восстановительные состояния тканей при недостатке кислорода.– В кн.: "Биофизика и научно-технический прогресс". Пущино, 1971, 34– 38. 195. Зинченко В.П., Захаров С.Д. Параллельные микроспектрофлуориметрические и полярографические исследования регуляции энергетики мышечной клетки.– Биофизика живой клетки, т. 4, Пущино, 1973, 123–129. 196. Chance В., Cohen P., Jöbsis F., Schoener B. Localized fluorometry of oxidation-reduction states of intracellular pyridine nucleotide in brain and kidney cortex of the anaesthetized rat.– Science, 1962, v. 136, 325–329. 197. Карнаухов В.Н; Браниловская В.Г., Хаспеков Л.Г., Зинченко В.П., Лукьянова Л.Д. Окислительно-восстановительные состояния нервной ткани крыс in situ.– ДАН СССР, 1971, т. 201, № 1, 227–229. 198. Карнаухов В.Н., Яшин В.А., Антипов E.E. Люминесцентные микроспектральные исследования окислительно-восстановительных состояний клеток в связи с действием гемодинамических факторов на микроциркуляторное сосудистое русло.– В кн.: "Методы исследования функций организма в онтогенезе". M., АПН, 1975, 136–138. 199. Барский И.Я., Поляков Н.И., Якубенас В.А. В. Контактная микроскопия. M., “Медицина”, 1976. 200. Карнаухов В.Н., Лукьянова Л.Д., Хаспеков Л.Г., Браиловская В.Г. Динамика окислительновосстановительных состояний срезов коры головного мозга.– Биофизика живой клетки, т. 3. Пущино, 1972, 118–123. 201. Татарюнас Т.Б., Шунгская В.Е., Хаспеков Л.Г., Ененко С.О., Карнаухов В.Н. Полярографические и люминесцентные микроспектральные исследования окислительного метаболизма культуры нервной ткани.– Биофизика живой клетки, т. 3. Пущино, 1972, 124–131. 202. Брумберг E.M., Барский И.Я., Папаян Г.В. Двухволновый микрофлуориметр. Оптико-тех. пром., № 9, т. 62, 1967. 203. Rigler R. Microfluorimetric characterization of intracellular nucleic acids and nucleoproteins by acridine orange.–Acta physiol. scand., 1966, v. 67, Suppl. 267. 204. Фаддеева M.Д. Определение биспиральной ДНК в смеси с денатурированной по флуоресценции акридинового оранжевого в комплексе с ДНК. I. Исследование интенсивности зеленой флуоресценции.– Цитология. 1969, 11, № 1, 56–63. 205. Барский И.Я., Папаян Г.В., Фаддеева M.Д. Определение биспиральной ДНК в смеси с денатурированной по флуоресценции акридинового оранжевого в комплексе с ДНК. II. Двухволновый метод.– Цитология, 1969, т. 11, № 1, 64–70. 206. Полянский Ю.Н., Карнаухов В.Н. О взаимодействии акридинового оранжевого с глицеринизированным мышечным волокном.– Биофизика, 1968, т. 13, № 5, 902–905. 207. Zanker V. Ober der Nachweis definierte reversibler Assoziate (reversible Polymerisate) der Acridinorange durch Absorption und Fluoreszenzmessungen in wässriger Lösung.– Z. phys. Chem., 1952, v. 199, № 4, 225. 208. Zanker V. Quantitative Absorbtions- und Emissionsmessungen an Acridinorangekation bei Normalund Tieftemperatur in organischen Losungsmitteln und ihr Beitrag zur Deutung des meta-chromatischen Fluoreszenzproblem.–Z. phys. Chem., 1952, v. 200, № 5/6, 250. 209. Морозов Ю.В. Особенности люминесценции димеров акридинового оранжевого и родамина Б. – Биофизика, 1963, т. 8, № 3, 331. 210. Борисова О.Ф. Изучение люминесценции комплексов акридинового оранжевого с нуклеиновыми кислотами. Канд. дис. M., 1966. 211. Strugger S. Die Vitalfärbung der Chromosome.– Dtsch. tierartzl. Wochenschr., 1940, v. 48, 645. 212. Strugger S. Zeilphysiologische Studien mit Fluoreszentindikationen.–Flora, 1946, v. 35, 101. 213 Strugger S. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchung über die Aufnahme und Speicherung des Acridinorange durch lebende und tote Pflanzenzellen.– Janaische Z. Naturwiss., 1940, v. 73, 97. 214. Bukatsch F., Haitinger M, Beiträge zur fluoreszenzmikroskopische Darstellung des Zellinhaltes, insbesondere des Cytoplasmes und des Zelkerns.– Protoplasma, 1940, v. 34, № 4, 515. 215. Мейсель М.Н. Люминесцентно-микроскопический анализ функционального состояния живого вещества.– Изв. АН СССР. Сер. физ., 1951, т. 15, .№ 6, 778. 216. Мейсель М.Н., Корчагин В.В. Люминесцентно-микроскопическое выявление нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов.– Бюл. экспер. биол. мед., 1952, т. 33, № 3, 49. 217. Борисова О.Ф., Туммерман Л.А. Люминесценция комплексов акридинового оранжевого с нуклеиновыми кислотами.– Биофизика, 1964, т. 9, № 5. 218. Nash D., Plaut W. On the denaturation of chromosomal DNA in situ.– Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1964, v. 51, № 5, 731–735. 219. Борисова О.Ф., Туммерман Л.А. Применение люминесценции красителя акридинового оранжевого для изучения вторичной структуры нуклеиновых кислот.– Биофизика, 1965, т. 10, № 1, 32–36. 220. Фаддеева М.Д. Спектральные свойства комплексов акридинового оранжевого с нативной, денатурированной и ренатурированной ДНК.– Цитология, -1964, т. 6, № 2, 241–244. 221. Зеленин А.В. Взаимодействие аминопроизводных акридина с клеткой. М., “Наука”, 1971. 222. Брумберг В.А., Певзнер Л.З. Цитофометрический анализ некоторых способов избирательной экстракции РНК из срезов.– Цитология, 1966, 8, № 3, 437– 439. 223. Фаддеева М.Д. Зависимость между увеличением температуры плавления ДНК, вызванным соединением ДНК с основными красителями, и их ингибирующим действием на реакцию ферментативного гидролиза ДНК дезоксирибонуклеазой.– Цитология, 1969, т. 11, № 2, 225–223. 224. Франк Г.М., Карнаухов В.Н., Колаев В.А., Яшин В.А. Спектральные характеристики флуорохромированных акридиновым оранжевым клеток белой крови человека.– Биофизика, 1977, т. 22, № 6, 1015–1025. 225. Kaspersson T. The cell function and the cell growth. W.W.Norton and Go, 1950. 226. Браше Ж. Биохимическая цитология. М., ИЛ, 1960. 227. Бродский В.Я. Трофика клетки. М., “Наука”, 1966. 228. Нуdén H. Biochemical changes in glial cells and nerve cells at varying activity.– In: Biochemistry of Central Nervous System, v. 3. Proc. 4-th Internal. Congr. Biochem. London, Pergamon Press, 1959. 229. Hydén В. Biochemical and functional interplay between neuron and glia. – Res. Adv. in Biol. Psychiatry, 1964, v. 6, 31–54. 230. Сейц И.Ф., Луганова И.С. Биохимия клеток крови и костного мозга в норме и при лейкозах. Л., “Медицина”, 1967. 231. Ростамян М.А., Абрамян К.С. Ультраструктура клеток крови. Ереван, Изд-во АН АрмССР, 1975. 232. Gibor A., Granick S. Plastides and mitochondria inheritable systems.– Science, 1964, v. 145, 890. 233. Granick S. Cytoplasmic units of inheritance.– Science, 1965, v. 147, 911. 234. Эренпрейс Я.Г. Немитохондриальная ДНК цитоплазмы.– Усп. совр. биол., 1976, т. 81, № 1. 235. Захарян Р.А., Галоян А.А. Изменения в структуре генома клеток мозга.–В кн.: "Вопросы биохимии мозга", т. 8, Ереван, 1973, 131. 236. Шишков В.П., Бронштейн В.Б. Морфологический и цитохимический анализ лимфоцитов лимфопоэтических органов крупного рогатого скота и мышей в норме и при лейкозе.– В кн.: "Лейкозы сельскохозяйственных животных". М., “Колос”, 1975, 77–81. 237. Mandel P., Harth S., Borkowski T. Metabolism of the nucleic acids in various zones of the brain.– In: Regional Neurochemistry. S.S.Kety and J.Elkes (Eds). New York, Pergamon Press, 1961. 238. Gaito J. Molecular psychobiology. Illinois. Charles C.Thomas Publ. 1966. (Гейто Дж. Молекулярная психобиология. М., “Мир”, 1969.) 239. Leslie I. The nucleic acid content of tissues and cells.– In: The nucleic acids, v. 2. E.Chargaff and J.N.Davidson (Eds). New York, Acad. Press, 1955. 240. Zamenhoff S., Bursztyn H., Rich K., Zamenhoff P.S. The determination of deoxyribonucleic acid and of cell numbers in brain.– J. Neurochem., 1964, v. 11, 505. 241. Иванов В.Б. Цитохимическое изучение отношения РНК/белок в протоплазме растущих клеток корня.– Журн. общей биол., т. 22, 1961, № 2, 100–107. 242. Гейнисман Ю.Я. Структурные и метаболические проявления функций нейрона. М., “Наука”, 1974. 243. Карнаухов В.H., Гордон Р.Я., Утешев В.К. Люминесцентные спектральные исследования репарации тканей головного мозга крыс при действии РНК.– Цитология, 1977, 19. 244. Brizzee K.R., Vogt J., Kharetchko X. Postnatal changes in glia/neuron index with a comparison of methods of cell enumeration in the white rat.– In: Growth and Maturation of the Brain. D.P.Purpura and J.P.Schade (Eds). New York, Elsevier, 1964. 245. Барский В.E., Иванов В.Б., Михайлов Г.И., Скляр Ю.E. Применение бесцветных активных красителей в гистохимии.– Цитология, 1975, т. 17, № 8, 987. 246. Melnikova E.В., Karnaukhov V.N. Luminescent spectral method for determination of a relation between DNA, RNA and proteins in cells.–Abstr. IV Internat. Biophys. Congr., 3, p. 400, Moscow, 1972. 247. Мельникова E.В., Карнаухов В.H. Люминесцентный метод определения соотношения ДНК: РНК: белок в клетке.– Биофизика живой клетки, т. 4. Пущино, 1973, 153–157. 248. Young М.R., Smith А.U. The use of euchrysine in staining cell and tissues for fluorescence microscopy.–J. Roy. Microsc. Soc., 1964, v. 82, № 4, 233. 249. Dahlberg A.E., Dingenon С.W., Peacock A.C. Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agaroseacrylamide composite gels.– J. Mol. Biol., 1969, v. 41, 139-147. 250. Haag D., Tschahargane C., Goerttler K. Simultaneous differentia] staining of nucleic acids and proteins in histological tissues by means of j-band effect.– Histochemie, 1971, 26, 190–193. 251. Le Pecq J.В., Paoletti C. A new fluorometric method for RNA and DNA determination.– Analyt. Biochem., 1966 v. 17, 100–107. 252. Le Pecq J.В., Paoletti C. A flyorescent complex between ethidium bromide and nuoleic acids. Physicalchemical characterization.–J. Mol. Biol., 1967, v. 27, 87-106. 253. Van Dyke K., Szustkiewicz С. Automated systems for the fluorometric determination of nucleic acids by the ethidium bromide technique.– Analyt. Biochem., 1968, v. 23, 109–116. 254. Burns V.W.F. Fluorescence decay time characteristics of the complex between ethidium bromide and nucleic acids.– Arch. Biochem. and Biophys., 1969, v. 133, № 2, 420-424. 255. Sela I. Fluorescence of nucleic acids with ethidium bromide: an indication of the configurative state of nucleic acids.– Biochim. et biophys. acta, 1969, v. 190, № 1, 216–219. 256. Paoletti J., Le Pecq J.B. Resonance energy transfer between ethidium bromide molecules bound to nucleic acids. Does intercolation wind or inwind the DNA helix?–J. Mol. Biol., 1971, v. 59, 43-62. 257. Burns V.W.F. Location and molecular characteristic of fluorescent complexes of ethidium bromide in the cell.– Exper. Cell. Res., 1972, v. 75, № 1, 200. 258. Кудрявцев Б.Н., Кудрявцева М.В., Фаддеева М.Д. Цитофлуориметрия ДНК с этидиум бромидом – SО2.– Цитология. 1974, т. 16, I, 107-112. 259. Коновалова З.Б. Активные красители и их применение в цитологии.– В кн.: "Механизмы проницаемости, возбуждения и повреждения клетки". Л., “Наука”, 1969, 107–129. 260. Барский В.Е., Иванов В.Б., Скляр Ю.Е; Михайлов Г.И. Дихлортриазиниламинофлуоресцеин – новый флуорохром для цито- и гистохимического выявления белка.– Изв. АН СССР. Сер. биол. 1968, № 5, 744–747. 261. Чибисова В.А., Шаханина К.Л., Скляр Ю.Е., Михайлов Г.И. Использование дихлортриазиниламинофлуоресцеина для получения люминесцирующих сывороток.– Бюл. экспер. биол. и мед., 1969, т. 68, № 11, 120–122. 262. Иванов В.В. О возможности применения проционовых красителей в гистохимии.– ДАН СССР, 1961, т. 137, № 2, 419–421. 263. Вирник А.Д., Чекалин М.А. О взаимодействии активных красителей с аминокислотами.– Журн. прикл. химии, 1962, т. 35, № 3, 588–593. 264. Барский В.Е., Иванов В.Б. Люминесцентно-цитохимический метод определения концентрации белка.– В кн.: "Электронная и флуоресцентная микроскопия клетки". М.–Л., “Наука”, 1964, 157163. 265. Агроскин Л.С. Бродский В.Я., Папаян Г.В., Раутиан Л.П. Проверка применимости закона Бугера–Бэра в цитофотометрии. Анализ цитохимических реакций, выявляющих аминокислотные остатки в белках.– Цитология, 1970, т. 12, № 11, 1471–1476. 266. Иванов В.Б. Доказательство образования ковалентных связей при окраске гистологических препаратов проционовыми красителями.– Цитология, 1976, т. 18, № 2, 227–229. 267. Berg N. O. A histological study of masked lipid. Stainability distribution and functional variations.– Acta pathol. microbiol. scand., 1951, v. 90, Suppl. 1–192 268. Петрикевич С.Б., Мейсель М.Н. О локализации в клетках ароматического углеводорода 3,4бензпирена.– ДАН СССР, 1965, т. 165, № 1, 203–206. 269. Ляпунова Е.А., Петрикевич С.Б., Зеленин А.В. О прижизненности люминесцентномикроскопических исследований, проводимых с помощью флуорохромов акридинового оранжевого и 3,4-бензпирена.– Изв. АН СССР. Сер. биол., 1965, т. 6, 980. 270. Shires Т.К. A fluorescence microscopic study of methodologic effect on the intranuclear distribution of benzo[a] pyren.–Cancer Res., 1969, v. 29, 1277–1287. 271. Иванова О.Ю., Дутова Т.А., Андрианов Д.А. Микроспектро-флуориметрическое исследование изменений концентрации бензпирена в монослойной культуре фибробластов при культивировании их в среде, содержащей бенз[а]пирен.– Цитология, 1969, т. 11, № 4, 512–516. 272. Бревис П.В. Одновременное выявление в клетках нуклеиновых кислот и липидов с помощью метода прижизненной люминесцентной микроскопии клеток.– Архив патол., 1957, т. 19, 84. 273. Dutta G.P. Simultaneous demonstration of nucleic acids and lipids with fluorescence microscopy.– J. Histochem. and Cytochem., 1970, v. 18, № 10, 760–761. 274. Masin F., Masin М. Simultaneous demonstration of DNA, RNA and lipids.– J. Histochem. and Cytochem., 1971, v. 19, № 2, 132–133. 275. Dutta G.P. Comments on simultaneous demonstration of DNA, RNA and lipids.– J. Histochem. and Cytochem., 1971, v. 19, № 4, 252. 276. Masin F., Masin M. Replay to the comments of Dr. Dutta.– J. Histochem. and Cytochem., 1971, v. 19, № 4, 252–253. 277. Мельникова Е.В. Спектральные характеристики проционовых красителей.– Биофизика живой клетки, т. 2. Пущино, 1971, 98– 105. 278. Карнаухов В.Н., Вартонь С.С. Ультраструктурная организация каротиноидсодержащих гранул в нейронах моллюсков.– Цитология, 1971, т. 13, № 9, 1088–1093. 279. Емельянов А.Г. Оптические отбеливающие препараты. М., “Легкая индустрия”, 1972. 280. Васильчиков В.В., Карнаухов В.Н., Тяжелова В.Г. Автоматическая обработка микроспектральных характеристик живых клеток.– В кн.: "Современные проблемы машинного анализа биологических структур". М., “Наука”, 1970, 90-95. 281. Буданцев А.Ю., Жариков С.И., Барилко Ш.И., Коробкова Т.Н., Борисюк Г.Н. Микроспектрофлуориметр с выводом информации на перфоратор. Цитология, 1978, т. 20, № 2, 343–346. 282. Бирюков С.В., Сафрошкин Ю.В. Прибор СК-1 для анализа спектральных кривых. Пущино, 1974. 283. Chance В., Mayer D., Rossini L. A time-sharing instrument for direct readout of oxidation-reduction states in intracellular compartments of cardiac tissue.– IEEE Trans. on Bio-Med. Engrng, 1970, v. 17, № 2, 118–121. 284. Папаян Г.В., Барский И.Я., Виноградова Г.Н., Иоффе В.А. Многоканальный микрофлуориметр с раздельным возбуждением.– Цитология, 1977, т. 19, № 9, 1072–1076. 285. Франк Г.М., Теплова В.В., Карнаухов В.Н. Динамика полярных групп контрактильных белков при сокращении мышцы.– Биофизика живой клетки, т. 4. Пущино, 1973, 3–7. 286. Szent-Geörgyi A. Free energy relations and contractions of actomyosin. Biol. Bull., v. 96, 140, 1949. 287. Аронет Н.И. Мышечные и клеточные сократительные (двигательные) модели. Л., “Наука”, 1971. 288. Левин С.В. Исследование конформационных изменений белков путем анализа их взаимодействия с органическими красителями.– В кн.: Механизмы проницаемости, возбуждения и повреждения клетки. Л., “Наука”, 1969, 41–63. 289. Jöbsis F.F. Spectrometric studies on intact muscle. II. Recovery from contractile activity.– J. Gen. Physiol, 1962, v. 46, № 5, 929–969. 290. Каломкарова М.Б., Кофман Е.Б., Филатова Л.Г., Штранкфельд И.Г. О связывании акридинового оранжевого мышечными белками.– Цитология, 1965, т. 7, № 2, 240-243. 291. Теплова В.В. О взаимодействии люминесцентных красителей с мембраной митохондрий.– Биофизика живой клетки, т. 3. Пущино, 1972, с. 27–34. 292. Chance В. Fluorescent probe for environment and the structural and charge changes in energy coupling of mitochondrial membranes.– Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1970, v. 67, № 2, 560–571. 293. Lehninger A.L., Carafoli Е. The interaction of La3+ with mitochondria in relation to respiration – coupled Ga2+ transport.– Arch. Biochem. and Biophys., 1971, v. 143, 506. 294. Ebashi S., Endo M. Calcium ion and muscle contraction.– Progr. Biophys. and Mol. Biol., 1968, v. 18, 123–183. 295. Ebashi S., Endo M., Ohtsuki S. Control of muscle contraction.– Quart. Rev. Biophys., 1969, v. 2, 351– 384. 296. Dahl L.K. A simple and sensitive histochemical method for calcium.– Proc. Soc. Exper. Biol., 1952, v. 80, 474. 297. Harris W.Н. Microscopic method of determining of rates of bone growth.–Nature, 1960, v. 188, 1038. 298. Harris W.H., Travis D.F., Friberg U., Radin F. The in vivo inhibition of bone formation by Alizarin Red S.– J. Bone Joint Surg., 1964, v. 46–A, 493. 299. Adkins К.F. Alizarin Red S as an intravital fluorochrome in mineralizing tissues,– Stain Technol., 1965, v. 40, 69. 300. Russell Е.L. Improved methods for staining bones of small fetuses and vertebrates in Alizarin red S.– Bioscience, 1973, v. 23, 366–377. 301. Diehl Н., Elingboe J. L. Indicator for titration of calcium in presence of magnesium using EDTA.– Analyt. Chem., 1956, v. 28, 882 302. Wallach D.P.H., Steck T.L. Fluorescence techniques in microdetermination of metals in biological materials. II. An imporved method for direct complecsometric titration of calcium in small serum samples.– Analyt. Biochem., 1963, v. 6, 176. 303. Suzuki H.К., Mathews A. Two-colour fluorescent labelling of mineralizing tissues with tetracycline and 2,4-bis N, N-di-(carbomethil) aminomethilfluorescein.– Stain Technol, 1966, v. 41, 57. 304. Regna P.В., Solomons I. A., Murai К., Timureck E., Brunnings K.J., Lazier N.A. The isolation and general properties of terramycin and terramcin-sults.– J. Amer. Chem. Soc., 1951, v. 73, 4211. 305. Milch R.А., Тоbiе J.E., Robinson R.A. A microscopic study of tetracycline localization in sceletal neoplasms.– J. Histochem. and Cytochem., 1961, v. 9, 261. 306. Frost H.M., Villanueva S.R., Roth H. Tetracycline staining of newly forming bone and mineralizing cartilage in vivo.– Stain Technol., 1960, v. 35, 135. 307. Tapp E., Kovacs К., Carrol R. Tetracyclin staining of tissues in vitro.–Stain Technol., 1966, 40, 199. 308. Du Buy H.G., Showacre J.L. Selective localization of tetracycline in mitochondria of living cells.– Science, 1961, v. 133, 196. 309. Caswell А.H., Hutchison J.D. Visualization of membrane bound cations by a fluorescent technique.– Biochem. and Biophys. Res. Communs, 1971, v. 42, № 1, 43-49. 310. Caswell A.H. The migration of divalent cation in mitochondria visualized by a fluorescent chelate probe.– J. Membr. Biol., 1972, v. 7, № 4, 345–346. 311. Popov P.G., Vartzarova К.J., Kossekova G.P., Nikolov T.K. Fluorimetric study of tetracyclines – a new class of fluorescent probes.– Biochem. Pharmacol., 1972, v. 21, № 17, 2363–2372. 312. Modis L., Petko M., Földes I. Histochemical examination of supporting tissues by means of fluorescens. II. Fluorochromes as an indicator of lamellar bone mineralization.– Acta morphol. Acad. sci. Hung., 1969, v. 17 (2), 157. 313. Zinchenko V.P., Teplova V.V., Evtodienko Y.V. Study of chlorotetracycline, interaction with the system of energy transformation in mitochondria.– Studia biophys., 1974, v. 44, № 3, 183. 314. Hallet M., Schneider A.S., Carbone E. Tetracyclin fluorescence as a calcium probe for nerve membrane with some model studies using eritrocyte ghosts.– J. Membr. Biol., 1972, v. 10, № 1, 31. 315. Wallach D.F. H., Ferberg E., Selin D., Weidekamm E., Fischer H. The study of lipid – protein interactions in membranes by fluorescent probes.– Biochim. et biophys. acta, 1970, v. 203, 67. 316. Cohen L.В., Landowne D., Shrivastav В.В., Ritchie J.M. Changes in fluorescence of squid axon during activity.– Biol. Bull., 1970, v. 139, 2, 418-419. 317. Cohen. L.В., Davila H.V., Waggoner A.S. Changes in axon fluorescence.– Biol. Bull., 1971, v. 141, 382-385. 318. Cohen L.B. Changes in neuron structure during action potential propagation and synaptic transmition.– Physiol. Rev., v. 53, 1973, 2, 373–418. 319. Conti F., Tasaki I., Wanke E. Fluorescence signal in ANS-stained squid axon during voltage-clamp.– Biophysik, 1971, v. 8, 1 58–70. 320. Hallett M., Tasaki I., Schneider A., Carbone E. Studies of the exitation process in nerve with extrinsic fluorescence.– Biol. Bull., 1971, v. 141, 2, 388–389. 321. Tasaki I., Watanabe A., Hallett M. Fluorescence of squid axon membrane labelled with hydrophobic probes.– J. Membr. Biol., 1972, v. 8, 109–132. 322. Tasaki I., Hallett M., Carbone E. Further studies of nerve membranes labelled with fluorescent probes.– J. Membr. Biol., 1973, v. 11, 4, 353-376. 323. Conti F., Malerba F. Fluorescence signals in ANS-stained lipid bilayers under applied potentials.– Biophysik, 1972, v. 8, 4, 326–332. 324. Radda G.K., Vanderkooi. Can fluorescent probes tell us anything about membranes?– Biochim. et biophys. acta, 1972, v. 265, № 4, 509–549. 325. Davila В.V., Salberg В.M., Cohen L.В., Waggoner A.S. A large Change in axon fluorescence that provides a promising method for measuring membrane potential.– Nature, New Biol., 1973, v. 241, 109, 159-160. 326. Ross W.N., Salberg B.M., Cohen L.В., Davila H.V. A large change in dye absorption during the action potential.– Biophys. J., 1974, 14, 983–986. 327. Salama G,, Morad M. Merocyanin 540 as an optical probe of transmembrane electrical activity in the heart.– Science, 1976, v. 191, 485–487. 328. Kuhn H. Interaction of chromophores in monolayer assemblies.– Pure and Appl. Chem., 1971, v. 27, 3, 421–438. 329. Pohl G.W. Energy transfer in black lipid membranes.– Biochim. et biophys. acta, 1972, 288, v. 1, 248– 253. 330. Карнаухов В.H., Мельникова E.В., Петрикевич С.Б., Теплова В.В., Яшин В.А. Способ определения грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Авт. свид. СССР № 469747, 1975. 331. Карнаухов В.Н., Мельникова E.В., Петрикевич С.Б. Способ определения жизнеспособности грамотрицательных микроорганизмов. Авт. свид. СССР № 490821, 1975. 332. Карнаухов В.H., Мельникова E.В., Петрикевич С.Б. О механизме люминесцентного метода определения живых грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов.– ДАН СССР, 1977, т. 232, № 6, 1424–1426. 333. Фробишер М. Основы микробиологии, M., “Мир”, 1965. 334. Шлегель Г. Общая микробиология. М., “Мир”, 1972. 335. Евреинова Т.H., Мельникова E.В., Погорелов А.Г., Аллахвердов Б.Л. Стабилизация и сосуществование коацерватных систем различного химического состава,– ДАН СССР, 1975, т. 224, № 1, 239-241. 336. Евреинова Т.H., Мельникова E.В., Аллахвердов В.Л., Карнаухов В.H. Сосуществование коацерватных систем различного химического состава.– Журн. эволюц. биохим. и физиол., 1977, т. 13, № 3, 330–335. 337. Евреинова Т.В. Концентрирование веществ и действие ферментов в коацерватах. М., “Наука”, 1966. 338. Becker J.S., Oliver J.M., Berlin R.D. Fluorescence techniques for following interaction of microtubule subunits and membranes.– Nature, 1975, v. 254, 152-154. 339. Muller P., Radin D.O. Resting and action potentials in experimental bimolecular lipid membranes.– J. Theoret. Biol., 1968, 18, 222. 340. Leo D., Kushnir. Studies on a material which induced electrical exitability in bimolecular lipid membranes. Production, isolation, cross identification and assay.– Biochim. et biophys. acta, 1968, 75113, 285–299. 341. Laborre R., Ehrenstein С., Lecar H. Yon transport through exitability inducing material (EIM). Channels in lipid membranes.– J. Gen. Physiol., 1972, v. 60, 72. 342. Pearse A.G.E., Rost F.W.D. A microspectrofluorimeter with epiillumination and photoncounting.– J. Microsc., 1969, v. 89, № 3, 312–328. 343. Olson R.A. Rapid scaning microspectrofluorimeter.– Rev. Scient. Instrnm., 1960, v. 31, 844. 344. Loeser С.N., West S.S. Cytochemical studies and quantitative television fluorescence and absorption spectroscopy.– Ann. N. Y. Acad. Sci., 1962, v. 97, 346. 345. Caspersson Т., Lomakka G., Rigler R.J. Registrierender Fluoreszenzmikrospectrograph zur Bestimmung der primär und sekundärfluoreszenz verschiedener Zell-substanzen. – Acta histochem., 1965, Suppl. 6, S. 117. 346. Kohen E., Kohen C., Thorell B. Rapid automatic microspectrofluorometric study of intracellular energy metabolism.– Exper. Cell Res., 1976, v. 101, № 1, 47–54. 347. Агроскин Л.С., Королев Н.В. Микроскоп - спектрофлуориметр для ультрафиолетовой области.– Биофизика, 1961, т. 6, № 1, 478–485. 348. Агроскин Л.С., Барский И.Я. Спектры возбуждения и яркость собственной флуоресценции клеток.–ДАН СССР, 1961, т. 139, № 4, 987-990. 349. Максимовский Л.Ф. Схема микроскопа - спектрофлуориметра.– Цитология, 1964, т. 6, № 2, 255– 256. 350. Агроскин Л.С., Предтеченский Ю.Б., Барский И.Я., Шудель М.С. Установка для записи спектров ультрафиолетовой люминесценции клеток.– В кн.: "Электронная и флуоресцентная микроскопия клетки". М.– Л., “Наука”, 1964, 152–155. 351. Ягунов А.С., Прокофьев А.Я. Установка для изучения спектров флуоресценции отдельных клеток.– Цитология, 1966, т. 8, № 4, 569–572. 352. Морозов Ю.E., Фукс Б.Б. Простой цитоспектрофлуориметр.– Архив патологии, 1968, № 4, 86–87. 353. Каминир Л.Б., Хруст Ю.Р., Емельянова Л.А., Долгов А.И. Микроспектрофлуориметр для регистрации спектров люминесценции в видимой области.– Вестник АН СССР, 1966, т. 8, 127. 354. Агроскин Л.С. Вопросы надежности цитоспектрофотометров и цитоспектрофлуориметров.– Цитология, 1968, т. 10, № 1, 20–27. 355. Розанов Ю.М., Селиванов Г.В., Боровиков Ю.С. Установка для исследования спектров флуоресценции биологических микрообъектов.– Цитология, 1969, т. 11, № 7, 910–915. 356. Агроскин Л.С. Монохроматоры для цитофотометров и цитофлуориметров.– Цитология, 1976, т. 18, № 5, 647-648. 357. Агроскин Л.С., Королев Н.В, Монохроматоры для микроопектрофотометров. ПТЭ, 1963, т. 4, 135-138. 358. Нагибина И. М., Прокофьев В.К. Спектральные приборы и техника спектроскопии. Л., “Машиностроение”, 1967. 359. Яковлев С.А., Шишацкая Л.П. Источники света, применяемые в спектроскопии.– Оптико-мех. промышленность, 1969, № 1, 53– 57. 360. Каралис В.Н., Корнеева Э.А. Аппаратура для флуоресцентного анализа. М., Изд-во стандартов, 1970. 361. Каталог цветного стекла. Л., “Машиностроение”, 1967, 54. 362. Виноградова Г.Н., Иоффе В.А., Папаян Г.В. Спектральное распределение энергетической яркости источников света, применяемых в микроспектрофотометрии.– В кн.: "Описания научных принципов устройства новых приборов и методики пользования ими". Пущино, 1977. 363. Берестовский Г.Н. Электрические и электрооптические явления в возбудимых клеточных и искусственных мембранах. Докт. дис. Пущино, 1974. 364. Куликов В.И., Джус А.И. Транзисторные стабилизаторы постоянного тока для питания газоразрядных ламп и ламп накаливания.– В кн.: "Описания научных принципов устройства новых приборов и методики пользования ими (Аппаратура для исследования фотобиологических процессов)". Пущино, 1974. 365. Грейвер E.С. Ключевые стабилизаторы напряжений постоянного тока. М., “Связь”, 1970. 366. Медведев А.И., Карнаухов В.Н., Кулаков В.И., Медведев Б.И. Флуориметрическое определение веществ на хроматограммах и электрофореграммах.– Прикл биохим. микробиол., 1973, т. 9, 312– 314. 367. Карнаухов В.Н., Шамаров А.М., Яшин В.А., Кулаков В.И. Инвертированный микроспектрофлуориметр.–Цитология, 1975, т. 7, № 5, 585–587. 368. Карнаухов В.Н., Яшин В.А., Шамаров А.М; Дударев В.В. Микроспектрофлуориметр с интерференционным светофильтром переменной длины волны.– Цитология, 1975, т. 17, № 4, 478–481. 369. Буданцев А.Ю., Жариков С.И. Использование интерференционных светофильтров переменной длины волны в микроспектрофлуориметрии.– В кн.: "Фотометрические измерения и их метрологическое обеспечение". М., ВНИИОФИ, 1974 370. Chance В., Legallais V., Schoener В. Metabolicaly linked changes in fluorescence emission spectra of cortex of rat brain, Kidney, and adrenal gland.–Nature, 1962, v. 4846, 1073–1075. 371. Берестовский Г.Н., Луневский В.З., Ражин В.Д. Установка для исследования динамики обратимых изменений оптических свойств нервной клетки при одиночном возбуждении.– Цитология, 1968, т. 10, № 7, 916–921. 372. Хршановский С.А., Карнаухов В.Н. Светосильная аппаратура для спектрального анализа сверхслабого свечения клеток и тканей в УФ- и видимой областях спектра.–В кн.: "Ультрафиолетовое излучение и его применение в биологии". Пущино, 1973, 243-244. 373. Хршановский С.А., Маркин В.В., Шитова В.П., Шичков В.В. Оптическая система для спектральных исследований излучений биологических объектов.– В кн.: "Описания научных принципов устройства новых приборов и методики пользования ими". Пущино, 1974, 16–19. 374. Vialli М. Indrizzi di recerca nel campo della istoluminescenza.– Z. wiss. Microsc., 1964, v. 66, № 3, 164-170. 375. Szent-Gyöigyt A. On the possibility of a phosphorescence microscope.–Appl. Opt., v. 4, 1965, № 1. 376. Поляков Я.С., Розанов Ю.М.,. Брумберг E.М. Установка для исследования фосфоресценции микрообъектов. – Цитология, 1966, т. 8, № 5, 677-681. 377. Поляков Я.С. Фосфоресцентный микроскоп.– Журн. прикл. спектроскопии, 1967, т. 7, № 4, 633– 637. 378. Поляков Я.С., Преображенский Р.К. Охлаждающий столик для исследования люминесцирующих объектов под микроскопом.– Цитология, 1966, т. 8, № 4, 577–575. 379. Суббота-Мельник П.А. Таумер.–ПТЭ, 1963, т. 3, 106-107. 380. Chance В., Legallais V. Differential microfluorimeter for the localization of reduced pyridine nucleotide in living cell.– Rev. Scient. Instrum., 1959, v. 30, 731–735. 381. Баренбойм Г.М., Барский И.Я., Брумберг E.М., Пинто Р.И. Установка для измерения интенсивности флуоресценции микроструктур биологических объектов.– Биофизика, 1962, т. 7, .№ 3, 351–356. 382. Розанов Ю.М., Кудрявцев В.Н. Метод флуоресцентной цитофотометрии для количественного определения ДНК.– Цитология, 1967, т. 9, № 3, 361–368. 383. Каулин А.Б., Фокин В.Н. Поляризационный микрофлуориметр.– Цитология, 1968, т. 10, № 1, 142-147. 384. Агроскин Л.С. Универсальная микрофотометрическая насадка.– Цитология, 1971, т. 13, № 12, 1531–1534. 385. Барский И.Я., Хавкин Т.В. Фотографический способ микрофлуориметрии при иммунолюминесцентных исследованиях.–Цитология, 1968, т. 10, № 11, 1501–1504. 386. Хавкин Т.Н., Кудрявцев Б.Н., Берлин Л.Б., Кудрявцева М.В. Фотографический метод флуориметрии ДНК в хромосомах человека при использовании люминесцентного варианта реакции Фельгена. – Цитология, 1970, т. 12, № 9, 1209–1212. 387. Зарубина И.Д., Давыдова М.И., Кулаков, А.А., Смирнов В.А. Современное состояние и перспективы развития промышленной аппаратуры для цитохимических методов исследования.– Цитология, 1976, т. 18, № 4, 521–528. 388. Бабаджанян Д.П., Бородина В.М., Каминир Л.Б. Автоматический счет микроорганизмов, различающихся по цвету люминесценции.– Прикл. биохим. и микробиол., 1966, т. 2, 703–706. 389. Розанов Ю.М., Барский И.Я., Боровиков Ю.С. Двухканальный поляризационный микрофлуориметр.– Цитология, 1970, т. 12, № 11, 1477–1480. 390. Kohen E., Kohen C., Thorell В. Rapid two-channel microfluorimetry. A method for comparative study of metabolism, phase differences or transport in cytoplasm and nucleus.– Biochim. et biophys. acta, 1972, v. 281, № 1, 189–196. 391. Kohen E., Michaelis М., Kohen С., Thorell В. A study of metabolic control and intracellular transport by multifunctional photon counting and two-channel microfluorimetry.– Exper. Cell Res., 1973, v. 80, № 1. 392. Kohen E., Kohen С., Thorell В. Rapid multichannel microfluorimetry for metabolic and spectral studies in single living cell.– Exper. Cell Res., 1973, v. 80, № 2. 393. Папаян Г.В., Иоффе В.А., Виноградова В.Н.., Барский И.Я. Двухлучевой импульсный микрофлуориметр с цифровым отсчетом.– Цитология, 1974, т. 16, № 3, 395–397. 394. Маршак И.С. Импульсные источники света. М., “Энергия”, 1963. 395. Иоффе В.А., Боровиков Ю.С., Барский И.Я., Розанов Ю.М. Двухканальный поляризационный микрофлуориметр.– Цитология, 1974, т. 16, № 1, 112–116 396. Шифферс Л.А. Применение интерференционного светоделителя при исследовании поляризации флуоресценции микрообъектов. Оптико-мех. пром., 1972, т. 11, 3-6. 397. Chrissman Н.A., Steinkamp J. A. Rapid, simultaneous measurement of DNA, protein, and cell volume in single cells from large mammalian cell populations.– J. Cell Biol., 1973, v. 59, 76B–771. 398. Dittrich W., Göhde W. Pulse fluorimetry on single cells in suspension.– Z. Naturforsch. Teil B, 1969, v. 24 В, 360. 399. Adams L.R., Kamentsky I.A. Machine characterization of human leucocytes by acridine orange fluorescence.– Acta Cytol.,. 1971, v. 15, 289. 400. Bonner W.A., Hulett H.R., Sweet R.G., Herzenberg L.A. Fluorescence activated cell sorting.– Rev. Scient. Instrum., 1972, v. 43, 404. 401. Tobey R.A., Chrissman H.A. Use of flow microfluorometry in detailed analysis of effect of chemical agents on cell cycle progression.– Cancer Res., 1972, v. 32, 2726. 402. Holm D.М., Cram L.S. An improved flow microfluorometer for rapid measurement of cell fluorescence.– Exper. Cell Res., 1973, v. 80, 105. 403. Steincamp J.A., Fulwyler М.J. Coulter J.R., Heibert R.D; Horney J.L., Mullaney P.F. A new multiparameter separation for microscopic particles and biological cells.– Rev. Scient Instrum., 1973. 404. Hudson В., Upholt W.В., Divinny J., Vinogard J. The use of an ethidium bromide analogue in the dyedensity buoyant procedure for isolation of closed circular DNA.– Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1969, v. 62, 813. 405. Ягунов А.С., Попанов О.Г. Установка для автоматической регистрации интенсивности ультрафиолетовой флуоресценции отдельных клеток.–Цитология, 1975, т. 17, №. 1, 104. 406. Thorell B. Automated cell population analysis.– Blood Cells. 1975, v. 1, 71–77.
