Омирбекова А.А

АННОТАЦИЯ
диссертации на соискание учёной степени доктора философии (PhD) по
специальности «6D060700 – Биология»
Омирбековой Анель Адилевны
Изучение углеводородокисляющих микроорганизмов ризосферы и ризопланы
растений
Общая характеристика работы. Работа посвящена изучению и скринингу
углеводородокисляющих микроорганизмов ризосферы и ризопланы растений,
обладающих высоким биодеградационным потенциалом.
Проведен первоначальный отбор толерантных к нефтяному загрязнению видов
растений по морфологическим и физиологическим особенностям, далее изучено
биоразнообразие микроорганизмов в ризосфере и ризоплане растений и проведен
отбор активных штаммов, растущих в присутствии загрязнителя, и установлено их
таксономическое положение. Создана коллекция природных ризосферных микроорганизмов-деструкторов углеводородов. Идентифицированы продукты метаболизма
после культивирования углеводородокисляющих микроорганизмов на загрязнителе,
созданы растительно-микробные ассоциации и моделирован процесс биодеградации
загрязнителя.
Актуальность темы исследования. В настоящее время в результате
антропогенной деятельности происходит
широкомасштабное загрязнение
окружающей среды токсичными веществами. Объем добычи нефти и газа в
Республике Казахстан составляет в среднем 81,8 млн. тонн [Егоров, 2014].
Загрязнение почвы происходит в процессе транспортировки, переработки и хранения
нефти, при этом ее потери по официальным данным составляет в 8-9 млн. тонн в год.
Особую нагрузку испытывает почва, что проявляется в ухудшении её физикохимических свойств, угнетении самоочищающей способности и функциональной
активности организмов почвенного биоценоза. Для восстановления загрязненных
земель разрабатываются и внедряются различные химические и биотехнологические
методы [Gao et al, 2014]. В последние годы изучение микроорганизмов ризосферы
продиктовано необходимостью решения как теоретических, так и ряда практических
задач, связанных с ремедиацией, поиском ценных штаммов-продуцентов и
конструирование растительно-микробных симбиотических систем для повышения
биодоступности загрязнителя. Растительно-микробные ассоциации и симбиозы,
обладающие гибким метаболизмом и уникальными ферментными системами, имеют
большие преимущества при выживании в неблагоприятных условиях окружающей
среды, обусловленные не только повышенной толерантностью к ксенобиотикам, но и
способностью к активному удалению токсикантов из сферы обитания [Nie et al,
2011]. Поэтому, поиск и создание коллекции природных углеводородокисляющих
микроорганизмов из ризосферы и ризопланы связано с тем, что в биоценозах,
подвергавшихся долговременному действию ксенобиотиков, формируются
микроорганизмы, поддерживавшие свою численность за счет утилизации
присутствовавших в окружающей среде синтетических молекул.
Цель и задачи исследования.
Цель работы – изучение углеводородокисляющих микроорганизмов, выделенных
из ризосферы и ризопланы растений, способных к росту в присутствии нефтяного
1
загрязнения
и
взаимодействие
активных
микроорганизмов-деструкторов
углеводородов нефти с корневой системой растений.
Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих
задач:
1. Скрининг и подбор растений, устойчивых к различным уровням загрязнения
почв нефтяными углеводородами.
2. Изучение биоразнообразия микроорганизмов ризосферы и ризопланы
растений, а также выделение и отбор углеводородокисляющих микроорганизмов из
ризосферы и ризопланы растений.
3. Изучение генотипических и фенотипических характеристик активных
штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов с целью установления их
таксономического положения.
4. Характеристика
деструктивной
активности
отдельных
видов
углеводородокисляющих микроорганизмов ризосферы и ризопланы растений.
5. Изучение взаимодействий микроорганизмов - деструкторов ризосферы и
ризопланы растений в присутствии углеводородов нефти в модельных условиях.
Методы исследования. Микробиологические, биохимические, химические
методы и методы, молекулярной генетики.
Научная новизна исследования. Впервые создана рабочая коллекция из 20
микроорганизмов-представителей ассоциативной микрофлоры корневой зоны
растений, растущих в присутствии углеводородов нефти.
Впервые проведено изучение структуры микробных комплексов ризосферы и
ризопланы толерантных растений, выращенных на загрязненных почвах, и
установлено, что типичными представителями околокорневой зоны растений
являются микроорганизмы родов Arthrobacter, Microbacterium и Gordonia.
Впервые для представителей рода Gordonia на примере штамма G. rubripertincta
показаны пути биодеградации н-алканов, н-алкилзамещенных циклогексанов и
бензенов с образованием различных промежуточных продуктов.
Впервые установлено, что 1,4-циклогександиен-1-карбоновая кислота является
метаболитом в пути разрушения алкилзамещенных алканов с нечетным числом
углеродных атомов. Установлено, что инокуляция растений штаммами G.
rubripertincta L-RP 20 и Rhodococcus sp. T-RP 18 приводит к снижению концентрации
углеводородов нефти в почве.
Теоретическая
и
практическая
значимость
работы.
Изучение
морфологических и физиологических особенностей
толерантности растений к
углеводородам нефти, биоразнообразия микроорганизмов в ризосфере и ризоплане
растений, а также отбор активных штаммов, растущих в присутствии загрязнителя
способствуют расширению современных теоретических представлений о
закономерностях адаптации растений к действию ксенобиотиков.
Создана коллекция ризосферных углеводородокисляющих микроорганизмов, в
составе которой имеются микроорганизмы-деструкторы, растущие в различных
концентрациях нефти, нефтепродуктов, нафталина и антрацена. Штаммы G.
rubripertincta L-RP 20 и Rh. sp. T-RP 18-деструкторы углеводородов нефти являются
потенциальными инокулянтами семян люцерны и ячменя, они могут использоваться
для повышения эффективности очистки загрязненных углеводородами почв.
Коллекция гарантирует сохранение микробного разнообразия ex situ, является
фондом научных данных о штаммах ценных для микробиологии.
Основные положения, выносимые на защиту:
2
- эколого-функциональные реакции ассоциированных с растениями
ризосферных микробных сообществ на загрязнение нефтяными углеводородами
проявляются в увеличении численности
почвенных
микроорганизмов и
микроорганизмов - деструкторов;
- коллекция из 20 ризосферных микроорганизмов-деструкторов углеводородов
включает перспективные для использования в технологиях очистки штаммы G.
rubripertincta L-RP 20, G. rubripertincta R-RZ 20 и Rh. sp. T-RP 18;
- штаммы G. rubripertincta L-RP 20, G. rubripertincta R-RZ 20 и Rh. sp. T-RP 18
способны деградировать широкий спектр углеводородов нефти;
- 1,4-циклогександиен-1-карбоновая кислота является метаболитом в пути
разрушения алкилзамещенных алканов с нечетным числом углеродных атомов;
- интродуцирование растений штаммами G. rubripertincta L-RP 20 и Rh. sp. T-RP
18 приводит к снижению концентрации углеводородов нефти в почве.
Связь с планом основных научных работ. Диссертационная работа выполнена
в рамках проекта 0366/ГФ «Основы взаимоотношений ассоциативных
микроорганизмов-деструкторов с растениями и моделирование процессов
биодеградации углеводородов в загрязненных почвах».
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и
обсуждены на:
- Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Мир
науки»/ «Farabi alemi» (2012-2014 гг., Алматы, Казахстан);
- 5th International Symposium and Biosorption and Bioremediation (2012, Prague,
Czech Republic);
- 38th Federal European Biochemical Society Congress “Mechanisms in Biology”,
FEBS 2013 (2013, Saint Petersburg, Russia);
- 5th Congress of European Microbiologists (2013, Leipzig, Germany);
- International Conference on Biotechnology and Biodiversity (2013, Zurich,
Switzerland);
- Intenational European Biotechnology Congress (2014, Lecce, Italy);
- International Conference of Environmental, Biological and Ecological Sciences and
Engineering (2014, Paris, France).
На основе полученных результатов, были сделаны следующие выводы:
1. Физиологические и биохимические закономерности адаптации растений к
действию углеводородов нефти заключаются в изменении энергии прорастания,
морфологических параметров, увеличении адсорбирующей поверхности корневой
системы и соотношении различных форм хлорофилла в листьях.
2. Проведена
оценка
численности
эколого-физиологических
групп
микроорганизмов в ризосфере и ризоплане 4 видов растений: люцерны посевной
(Mеdicago sativa), ячменя обыкновенного (Hordéum vulgáre), рапса (Brássica nápus) и
смеси трав, толерантных к действию углеводородов нефти. Численность
микроорганизмов в ризосфере выше, чем в ризоплане на два порядка.
Доминирующим родами микроорганизмов в околокорневой системе растений
являются Arthrobacter, Microbacterium и Gordonia. Создана рабочая коллекция из 20
микроорганизмов-представителей ассоциативной микрофлоры ризосферы и
ризоплана, растущих в присутствии углеводородов нефти.
3. Идентифицированы активные микроорганизмы-деструкторы Gordonia
rubripertincta L-RP20, Gordonia rubripertincta R-RZ20, Rhodococcus sp. T-RP18. 16S
РНК нуклеотидные последовательности их зарегистрированы в базе данных GenBank
3
под регистрационными номерами: KM085968 (Gordonia rubripertincta L-RP20),
KP233861 (Gordonia rubripertincta R-RZ20), KP233862 ( Rhodococcus sp. T-RP18).
4. Изучена деградация углеводородов нефти с помощью Gordonia rubripertincta
L-RP20, Gordonia rubripertincta R-RZ20, Rhodococcus sp. T-RP18. Установлено, что
природные ризосферные активные штаммы
трансформируют 80 различных
компонентов нефти. Показано, что в процессе деградации алкилциклогексанов с
нечетным числом углеродных атомов 1,4-циклогександиен-1-карбоновая кислота
является промежуточным продуктов.
5. Выявлено, что при использовании растительно-микробных ассоциаций
снижается концентрация углеводородов нефти. При инокуляция растений (люцерна и
ячмень) штаммом G. rubripertincta L-RP 20 концентрация углеводородов нефти
снижается до 47%, Rhodococcus sp. T-RP18 – до 48% , а при совместном их действии –
до 65% относительно контроля и
повышает адаптивные свойства растений к
загрязнению почвы за счет повышения активности свободного пролина до 50 % и
пероксидазы в корневой системе до 45 %.
Публикации. Автором диссертационной работы опубликовано 14 научных
публикаций по теме диссертации. В том числе 1 статья, входящая в базу данных
Thomson Reuters, 3 статьи в республиканских научных журналах из перечня
Комитета по контролю в сфере образования и науки РК, 3 тезиса в международных
изданиях с ненулевым импакт-фактором, а также 1 статья и 6 тезисов в материалах
международных конференций и конгрессов.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах
компьютерного текста и состоит из обозначений и сокращений, введения, обзора
литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, списка
использованных источников из 197 наименований, содержит 27 таблиц, 22 рисунка и
6 приложений.
4