Введение в гистологию. Гистологическая техника

Волгоградский государственный медицинский университет
Кафедра гистологии,
гистологии, эмбриологии,
эмбриологии, цитологии
лекция для студентов I курса
всех факультетов
1
Волгоград,
Волгоград, 2013
2013
Цели:
Цели:
Определить назначение,
назначение, содержание,
содержание, место гистологии,
гистологии,
цитологии и эмбриологии в системе подготовки врача.
врача.
Рассмотреть возникновение гистологии,
гистологии,
эмбриологии как самостоятельных наук.
наук.
цитологии
и
Охарактеризовать роль отечественных ученых в создании
самостоятельных кафедр гистологии в России в 1919-ом веке.
веке.
Определить особенности развития гистологии,
гистологии, цитологии и
эмбриологии на современном этапе.
этапе.
Изучить методы исследования в гистологии:
гистологии: световая и
электронная
микроскопия,
конфокальная
лазерная
микроскопия,
микроскопия,
микроскопия, гистохимия,
гистохимия, иммуногистохимия,
иммуногистохимия, методы
исследования живых клеток и тканей,
тканей, количественные
методы в гистологии (фотометрия,
фотометрия, спектрофлуорометрия,
спектрофлуорометрия,
денситометрия,
денситометрия, морфометрия).
морфометрия).
2
1
Гистология – это наука о строении,
строении,
функциях,
функциях, взаимодействии и развитии
тканей,
составляющих
организм
тканей,
многоклеточных животных и человека.
человека.
Histos – ткань,
ткань, logos – учение (греч).
греч).
Это фундаментальная медикомедико-биологическая наука,
наука,
изучающая микроскопическое и ультрамикроскопическое
строение и жизнедеятельность тканей.
тканей.
Гистология описывает тканевой уровень
организации живого.
живого.
3
Ткань
–
система
клеток
и
их
производных,
объединенных
производных,
общностью строения,
,
происхождения
и
строения
функций.
функций.
Со времени Келликера и Лейдига (середина 1919-го века)
века)
выделяют 4 вида тканей (эпителий,
эпителий, соединительная,
соединительная,
мышечная и нервная ткани).
ткани).
Клетка – это главная тканеобразующая единица,
единица, но не
единственный гистологический элемент.
элемент.
Общая гистология описывает тканевой уровень
организации живого,
живого, а частная гистология
(микроскопическая анатомия)
анатомия) – строение органов
организма человека по системам.
системам.
4
2
Концепция тканей важна для
медицины:
медицины:
Разные
ткани
дают
разные
виды
опухолей (рак – это злокачественная
опухоль из эпителиальной ткани).
ткани).
Некоторые
болезни
поражают
определенный вид тканей (диффузные
болезни
соединительной
ткани:
ткани:
системная красная волчанка и др.)
др.)
При повреждении каждая ткань имеет
свой потенциал регенерации (высокий –
эпителия,
эпителия, низкий – у нервной ткани).
ткани).
5
6
3
Основателем гистологии (в
конце 18-го века) является
анатом и физиолог, не
использовавший
микроскопический метод,
хотя микроскоп к тому
времени уже был
изобретен.
7
Первый гистолог на планете Французский ученый Биша (Bichat 17711771-1802),
Автор книги «Общая анатомия в приложении к физиологии
и медицине»
медицине» 1801г
1801г.
Автор первого определения тканей «простые структуры,
структуры,
сочетаясь по 4-6-8, образуют органы»
»
.
органы
Выделил 21 вид тканей (костная,
костная, хрящевая,
хрящевая, мышечная – но и
«артерии»
артерии», «вены»
вены», «волосы»
волосы»).
8
4
Термин «гистология»
предложен через 17 лет
после смерти Биша
немецким морфологом
Майером, применившим для
описания тканей микроскоп.
9
Цитология – наука о структуре,
структуре, функции
и развитии клетки.
.
клетки
Клетка
–
это
элементарная
структурноструктурнофункциональная
и
генетическая
единица
организма,
составляющая
основу
его
организма,
жизнедеятельности
и
обладающая
всеми
признаками
живого:
раздражимость,
живого:
раздражимость,
проводимость,
проводимость, сократимость,
сократимость, поглощение и
усвоение,
усвоение, секреция,
секреция, экскреция,
экскреция, дыхание,
дыхание, рост и
размножение.
размножение.
Эукариотическая
клетка
–
это
система,
система,
состоящая
из
ядра
и
цитоплазмы,
цитоплазмы,
отграниченная
от
внешней
среды
плазматической мембраной.
мембраной.
Цитоморфология,
Цитоморфология, цитофизиология и цитохимия
и цитогенетика – главные разделы цитологии.
цитологии. 10
5
11
Эмбриология – наука о закономерностях
развития зародыша.
зародыша.
Embryon – зародыш,
зародыш, logos – учение (греч.)
греч.)
Эмбриогенез – это часть онтогенеза.
онтогенеза.
Эмбриогенез тесно связан с прогенезом
(развитие и созревание половых клеток)
клеток) и
ранним постнатальным онтогенезом.
онтогенезом.
Для понимания онтогенеза необходимо знание
филогенеза (биогенетический закон Э.Геккеля
(середина XIX века)
века) о повторении онтогенезом
филогенеза в сжатой форме).
форме).
12
6
Эмбрион человека в конце эмбрионального периода
13
Возникновение и развитие гистологии как науки
(домикроскопический период)
период)
Этап
Предыстория гистологических
представлений
Макроскопическая
гистология
18-19 веков.
Представители
Сущность
взглядов
Аристотель, Гален
(2-ой век н.э.),
Гиппократ,
Авиценна
Описывали
отдельные
органы их
составные
части
Биша, Майер,
Меккель
Введено
понятие
ткани,
дана 1-я
классификация тканей
Ошибочность
представлений
В ткани
выделены
структуры
органного
характера
14
7
ЭТАПЫ СТАНОВЛЕНИЯ ГИСТОЛОГИИ.
ГИСТОЛОГИИ.
1667 год – Robert Hooke – создал микроскоп,
микроскоп, рассмотрел клетки
растений.
растений.
1590 – братья Янсен Ганс и Захария – «медные дельфины»
дельфины».
1717-18 век – Антон ван Левенгук (добавил окуляр,
окуляр, поднял
увеличение до х300300-400, увидел движение клеток (эритроциты,
эритроциты,
спермии)
спермии)
Петр I, посетив Голландию,
Голландию, увидел движение эритроцитов,
эритроцитов,
заказал Шепперу 1-ый русский микроскоп (1698 г.).
Дальнейшее развитие микроскопической техники:
техники:
М. Мальпиги описал разные виды клеток,
клеток, но считал клетку одной
из многих гистологических элементов (как волокна,
волокна, трубочки,
трубочки,
сосуды)
сосуды)
Каспар Вольф – член Петербургской академии наук – первые
попытки объяснить закономерности клеточного строения и
происхождения клеток (первый эволюционист).
эволюционист).
15
Все это предвосхитило
создание клеточной теории,
но в 18-ом веке
господствовала теория
Геллера о волокнистом
строении живой материи.
16
8
В 1839 году Шлейден и Шванн одновременно
сформулировали клеточную теорию.
теорию.
Клетки – элементарные единицы всего живого
Из клеток построены все животные и растительные
организмы
Шлейден – теория цитобластемы:
цитобластемы: клетки возникают вокруг
ядра путем концентрации глыбок и зерен (нарисовал
почкование дрожжевой клетки,
клетки, но неправильно объяснил.
объяснил.
Теодор Шванн (1839) «Микроскопическое исследование
соответствия в структуре и росте животных и растений»
растений»
Сходство
животных
и
растительных
клеток,
клеток,
универсальность клеточного строения
Описал деление клеток,
клеток, но не оценил его значение (процесс,
процесс,
обратный ассимиляции клеток.
клеток.
Описал взаимоотношения клеток,
клеток, но свел свойства
целостного организма к свойствам клеток.
клеток.
17
Рудольф Вирхов – автор 1-го учебника по
патогистологии «Целлюлярная патология»
патология».
Он развил клеточную теорию.
теорию.
«свободное образование клеток по Шлейдену и Шванну
– фантазия»
фантазия»,
Вирхов создал теорию клеточного государства:
государства: клетки
зависят
друг
от
друга,
но
функционируют
друга,
самостоятельно,
хотя
эта
самостоятельность
–
самостоятельно,
относительна,
относительна,
Вирхов
привел
гистологические
представления
в
соответствие с современными взглядами:
взглядами: в одну группу
объединил соединительную,
соединительную, хрящевую и костную ткань,
ткань, как
содержащие и клетки,
клетки, и межклеточное вещество.
вещество.
Труды Вирхова положили
воззрениям в гистологии.
гистологии.
конец
механистическим
18
9
РАЗВИТИЕ И СТАНОВЛЕНИЕ ГИСТОЛОГИИ КАК НАУКИ
(МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ ПЕРИОД)
ПЕРИОД)
Этап
ПредставиПредставители
Сущность
взглядов
Ошибочность
представлений
Гистология
в период
становлестановления
клеточной
теории
Мальпиги,
Мальпиги,
Вольф,
Вольф,
Шлейден,
Шлейден,
Шванн,
Шванн,
Вирхов
(1(1-я половина
19 века)
века)
Создание
клеточной
теории об
универсальноуниверсальности клеточного
строения
Механицизм
представлений
об автономавтономности клеток,
клеток,
ошибочность
представлений
об их делении
Келликер,
Келликер,
Лейдиг (60(60-е9090-е годы)
годы);
Первые
учебники,
учебники,
современная
классификаклассификация тканей
(13(13- 8-4).
Не
учитывалось
происхождепроисхождение тканей
ВозникновеВозникновение морфоморфофункциофункциональных
систем
19
Этапы становления гистологии:
гистологии:
К концу 19 века накапливаются данные о глубокой
специфичности тканей высших организмов и человека,
человека,
возникающей
в
ходе
онтогенеза
и
обусловленной
филогенетически.
филогенетически.
Ремак (в противоположность Келликеру и Лейдигу)
Лейдигу) – зародышевые
листки отличаются по форме,
форме, структуре,
структуре, и взаиморасположению
клеток.
клеток. Каждый дает начало определенным тканям.
тканям.
Геккель и Бар (француз):
француз): эпителий – изначальная в онтогенезе
ткань (генетическая классификация тканей).
тканей).
Гертвиг – учение о мезенхиме.
мезенхиме.
Райхерт,
Райхерт, Гис – учение о соединительной ткани и ее трофических
функциях.
функциях.
Русская школа:
школа: Ломоносов (первый внедрил микроскоп),
микроскоп),
Шумлянский Александр Михайлович (1748(1748-1795) – описал капсулу
почечного тельца.
тельца. Тереховский Мартын Матвеевич – профессор
анатомии и ботаники Петербургского сухопутного госпиталя –
опроверг
теорию
самозарождения
клеток
и
обосновал
20
экспериментально.
экспериментально.
10
Трагическая личность –
профессор Горянинов из
Петербургской военномедицинской академии – за
5 лет до Шлейдена и
Шванна изложил
положения клеточной
теории (1834 год).
21
В России 1-я кафедра
гистологии,
гистологии, эмбриологии и
сравнительной анатомии
на медицинском
(«лекарском»
лекарском») факультете
появилась в Московском
Университете по новому (3(3му,
му, 1863 года)
года) уставу
Российских университетов
в 1864 году (до этого
элементы гистологии
преподавались на кафедре
анатомии – ординарным
профессорo
профессорoм Соколовым
Иваном Михайловичем …
22
11
…и физиологии –
экстраординарный
профессор Павел
Петрович Эйнбродт.
Эйнбродт.
Он предвосхитил
выделение
гистологии в
самостоятельную
академическую
дисциплину и много
сделал для этого.
этого.
П.П. Эйнбродт (1833(1833-1865)
Электив по
сравнительной
эмбриологии вел
приватприват-доцент
Ковальский .
23
Последователем
Павла Эйнбродта стал
А.И.Бабухин - основатель
московской школы
гистологов (описал
гистофизиологию
мышечной и нервной
ткани:
ткани: развитие нервных
волокон,
волокон, строение
сетчатки),
сетчатки), зав.
зав. 11-ой
кафедрой гистологии в
России,
России, созданной в
Московском университете
в 1864 г.
Позднее в этом же
году создана кафедра
гистологии в Казанском
университете.
университете.
А.И.Бабухин (1827(1827-1891)
24
12
В 1864 году кафедра
гистологии оставалась в
Московском университете
оставалась вакантной,
вакантной, но
доктор медицины
А.И.Бабухин был отправлен
на специализацию за
границу,
границу, а в 1865 году он
стал приватприват-доцентом
кафедры,
кафедры, читавшим
гистологию.
гистологию.
С 1869 года –
А.И.Бабухин - ординарный
профессор кафедры
гистологии.
гистологии. С 1891 г.
зав.
зав.каф.
каф. гистологии – ученик
А.И.Бабухина Огнев Иван
Флорович (диссертация по
сетчатке).
сетчатке).
И.Ф.Огнев (1855(1855-1928)
25
К.Э.Бэр (1792(1792-1826) –
эмбриолог,
эмбриолог, зав.
зав. каф.
каф.
сравнительной
анатомии и физиологии
– первым в России в
1841 году начал читать
курс гистологии в
Петербургской медикомедикохирургической
академии,
академии, который с
1852 г. выделен в
отдельный курс.
курс.
Кафедра гистологии
основана в 1868 г.
(Н.М.Якубович – 1-ый
зав.
зав.каф.).
каф.).
26
13
Кафедра гистологии МедикоМедикохирургической академии
(первая в Петербурге)
Петербурге)
создана в 1868 г.
Н.М.Якубовичем (описал
тонкое строение ЦНС,
ЦНС, открыл
ядра спинного мозга).
мозга).
Н.М.Якубович (1817(1817-1869)
27
С 1895 г. кафедрой заведовал М.Д. Лавдовский (1846(1846-1902), описавший
регенерацию нервных волокон,
волокон, автор 1-го в России (с
Ф.В.Овсянниковым)
Овсянниковым) учебника по гистологии.
гистологии.
28
14
Ф.В.Овсянников (1827(1827-1906)
– в 18581858-1862 г. возглавлял
кафедру физиологии и общей
патологии на мед.
мед. факультете
Казанского университета.
университета. Он
основоположник
экспериментальной физиологии и
микроскопической анатомии в
России (его ученик – И.П.Павлов).
Павлов).
В Петербурге он начинал
преподавать гистологию на
кафедре анатомии и физиологии
Петербургского университета,
университета, а с
1894 г. – на вновь созданной
кафедре гистологии.
гистологии. Один из
основателей морфоморфофункционального направления
(гистофизиология органов
чувств).
чувств).
29
РАЗВИТИЕ И СТАНОВЛЕНИЕ ГИСТОЛОГИИ КАК НАУКИ
(МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ ПЕРИОД)
ПЕРИОД)
Этап
Представители
ВозникновеВозникновение
генетичегенетического
подхода к
гистологичес
ким
системам
Ремак,
Ремак, Геккель,
Геккель, Бэр,
Бэр,
Гис,
,
Гертвиг
Гис
(конец 1919-начало 2020-го
века).
века).
Бабухин,
Бабухин, Огнев,
Огнев,
Овсянников,
Овсянников, Якубович,
Якубович,
Лавдовский,
,
Максимов,
Лавдовский Максимов,
Догель,
Догель, Перемежко.
Перемежко.
Хлопин,
Хлопин, Елисеев,
Елисеев,
Клишов,
Клишов, Кнорре,
Кнорре,
Афанасьев,
Афанасьев, Юрина,
Юрина,
Волкова,
Волкова, Шахламов,
Шахламов,
Автандилов
СовременСовременный период
Сущность взглядов
Классификации
тканей на основе
генетического
подхода,
подхода, подробное
описание видов
тканей.
тканей.
Переход на
ультраструктурультраструктурный уровень
познания
30
15
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ.
ГИСТОЛОГИИ.
Методы изучения живых тканей (культивирование in vitro –
тканевая инженерия).
инженерия).
Методы изучения фиксированных тканей (светооптические и
электронноэлектронно-микроскопические).
микроскопические).
Светооптические:
Светооптические: темнопольная,
темнопольная, поляризационная,
поляризационная, фазовофазовоконтрастная,
контрастная, интерференционная (поляризационная+
поляризационная+фазовофазовоконтрастная),
контрастная), люминисцентная,
люминисцентная, ультрафиолетовая.
ультрафиолетовая.
Электроннотрансмиссионная
Электронно-микроскопические:
микроскопические:
сканнирующая элетронная микроскопия.
микроскопия.
и
Гистохимия – устанавливает локализацию химических веществ в
структурах
тканей
(кислая
фосфатаза
–
лизосомы,
лизосомы,
ацетилхолинэстераза – нервная ткань – для диагностики болезни
Гиршпрунга.
Гиршпрунга.
Иммуногистохимия – более чувствительный и специфичный
метод гистохимии,
гистохимии, где любой антиген может быть выявлен с
помощью антител (CD4+).
31
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ.
ГИСТОЛОГИИ.
Методы изучения живых тканей (культивирование in vitro –
тканевая инженерия,
инженерия, изучение поведения внутриклеточных
паразитов:
паразитов: вирусов,
вирусов, микоплазм).
микоплазм).
Методы изучения фиксированных тканей (светооптические и
электронноэлектронно-микроскопические).
микроскопические).
Светооптические методы микроскопического исследования:
исследования:
- Обычная световая микроскопия (окрашенных гистологическими
красителями объектов)
объектов)
- темнопольная микроскопия (для живых неокрашенных
объектов – микроорганизмов),
микроорганизмов), микроскоп имеет специальный
конденсор,
конденсор, делающий объект освещенным на темном фоне.
фоне.
- фазовофазово-контрастная микроскопия использует оптическую
систему,
систему, которая позволяет рассмотреть прозрачные объекты
без окраски (например,
например, живые объекты).
объекты). Она основана на
принципе,
принципе, что луч,
луч, проходя через клетки и межклеточное
вещество,
вещество, имеющие разный показатель преломления,
преломления, меняет
свою скорость попо-разному (т.е. меняется фаза световой волны).
волны).
Структуры выглядят более темными или более светлыми.
светлыми.
интерференционная (поляризационная + фазовофазово-контрастная)
контрастная)
микроскопия создает 3-х-мерное изображение (используется
32
оптика Номарского).
Номарского).
16
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ.
ГИСТОЛОГИИ.
Поляризационная микроскопия позволяет увидеть объекты,
объекты,
состоящие из высоко организованных молекул и, как следствие,
следствие,
обладающие двойным лучепреломлением:
лучепреломлением: как коллаген,
коллаген,
микрофиламенты и проч.
проч. В нем устанавливают два
перпендикулярных фильтра,
фильтра, между которыми помещается
объект.
объект. Если в объекте есть структуры с двойным
лучепреломлением,
лучепреломлением, то их ориентированные молекулы развернут
ось света,
света, исходящего от поляризатора,
поляризатора, и будут выглядеть
яркими на темном фоне.
фоне.
Люминисцентная
микроскопия.
Люминисценция
–
это
микроскопия.
способность некоторых веществ,
веществ, будучи облученными одной
длиной волны,
волны, испускать излучение большей длины волны.
волны.
Обычно при облучении УФУФ-лучами объекты испускают волны
световой длины.
длины. Естественная (первичная)
первичная) люминисценция –
слабая.
Вторичная (наведенная)
слабая.
наведенная) – сильная (например,
например, при
обработке парами формалина адреналин флюоресцирует.
флюоресцирует. Можно
усилить флюоресценцию флюоресцирующими красителями
(родамин).
родамин). В микроскопе два параллельных фильтра (для
фильтрации волн от источника и от объекта.
объекта.
33
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ.
ГИСТОЛОГИИ.
Электронная микроскопия:
микроскопия:
- трансмиссионная ЭМ,
ЭМ, как и световая,
световая, показываетт объект «на
просвет»
просвет». ЭМ использует вместо светового луча поток
электронов,
электронов, испускаемых раскаленным катодом,
катодом, которые
частично проникают через объект (ультратонкий срез ткани),
ткани),
частично задерживаются им.
у ЭМ –
им. Вместо линз
электромагнитные катушки.
катушки. Изображение получается не на
сетчатке,
сетчатке, а на фотопластинке (прошедшие через объект электроны
засвечивают ее)
ее) или на флюоресцирующем экране.
экране. Электронная
микроскопия дает черночерно-белое изображение!
изображение! (Черные
(Черные структуры –
электроноплотные,
электроноплотные, белые – электронопрозрачные).
электронопрозрачные).
- сканнирующая ЭМ дает 3-х-мерное изображение
(на
поверхность объекта напыляется металл,
металл, от которого под углом
отскакивают электроны).
электроны).
Электронный микроскоп дает большее увеличение,
увеличение, чем световой
микроскоп (свыше 100 тысяч раз)
раз) и большую разрешающую
способность (0.2 мкм – 3 нм),
нм), так как длина волны у пучка
34
электронов гораздо короче,
короче, чем у светового пучка.
пучка.
17
МИТОЗ. АНАФАЗА.
Трансмиссионная электронная микроскопия. x
10,000.
Сh – дочерние хромосомы, расходящиеся по
полюсам клетки.
35
Деление клетки в культуре.
Сканнирующая электронная микроскопия, х5.000
Округлая клетка
У нее появляется
разделительная
борозда
Но узкий
удлиняется
Клетки отодвигаются
друг от друга
межклеточный
мостик
сохраняется
до разделения
36
18
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СМ и ЭМ
признак
световой микроскоп
освещение
свет (солнца,
солнца,
эл.
эл.лампы)
лампы)
линзы
оптические
(стекло)
стекло)
увеличение
до
x 1,000
разрешение
200 нм
цвет
зависит от
изображения окраски
электронный
микроскоп
пучок электронов
электромагэлектромагнитные
катушки
от
1,000(обычн
1,000(обычн
о до 100.000
раз)
раз)
0.2 нм
черночерно-белый
37
1.2
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ
Гистохимия – это метод окраски тканей,
тканей, выявляющий наличие
и локализацию в клетках или межклеточном матриксе
определенных макромолекул (биохимия выявляет лишь
наличие и количество веществ,
веществ, но не локализацию).
локализацию). При
окраске срезов образуется цветной продукт,
продукт, который
выявляется световым микроскопом.
микроскопом. Например,
Например, нуклеиновые
кислоты можно выявить реакцией Фельгена (окраска
галлоцианиномквасцами,
ДНК
и
РНК
галлоцианином-хромовыми
квасцами,
окрашиваются в темнотемно-красный цвет),
цвет), липиды – суданом III
(желтый цвет)
цвет) или серебрением (осмированием)
осмированием) – черный
цвет.
цвет.
Если до окраски по Фельгену обработать срез ферментом
ДНКаза,
ДНКаза, расщепляющим ДНК,
ДНК, то после окраски окрашенными
будут лишь РНК.
РНК. Если обработать срез РНКРНК-азой,
азой, то окраска
будет обусловлена присутствием только ДНК.
ДНК. Такая
предварительная обработка дает контроль гистохимических
реакций.
реакций.
38
19
1.2
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ
Разновидность гистохимии – гистоэнзимология –
устанавливает локализацию ферментов (энзимов)
энзимов)
в структурах тканей (кислая фосфатаза «метит»
метит»
лизосомы,
лизосомы, ацетилхолинэстераза – нервную ткань –
(используется
для
диагностики
болезни
Гиршпрунга.
Гиршпрунга.
Количественная
гистохимия
с
помощью
фотометрии,
фотометрии, денситометрии позволяет оценить
количественно наличие веществ в структурах.
структурах.
39
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ.
ГИСТОЛОГИИ.
1.2
Иммуногистохимия – более чувствительный и специфичный
метод,
метод, чем рутинная гистохимия,
гистохимия, где любая макромолекула
(антиген )может быть выявлена с помощью антител.
антител.
Например,
Например, лимфоциты Т -хелперы имеют на поверхности
антигенный
маркер
CD4+.
Если
обработать
срез
CD4+.
антиCD4+
антителами,, связанными с флюоресцирующим
антиCD4+антителами
красителем (флюоресцином,
флюоресцином, например),
например), то по свечению в
люминисцентном микроскопе можно выявить все Т -хелперы,
хелперы,
присутствующие на срезе.
срезе.
Описанный метод – это прямой иммуногистохимический
метод.
метод. При непрямом методе флюоресцирующей меткой
метят не первичное антитело,
антитело, а вторичное антитело,
антитело, которое
является антителом к комплексу антигенантиген-первичное антитело.
антитело.
Непрямой метод является более чувствительным.
чувствительным.
Иммуногистохимия (так же как и рутинная гистохимия)
гистохимия)
применима как на уровне светового,
светового, так и электронного
40
микроскопа.
микроскопа.
20
Тимус,
Тимус, гистологический препарат,
препарат,
окраска гематоксилингематоксилин-эозин.
41
Тимус,
Тимус, гистологический препарат,
препарат,
окраска антиCD8+
антителами
антиCD8+антителами
(непрямой метод иммуногистохимии).
иммуногистохимии).
Т-супрессоры (клетки,
клетки, экспрессирующие на
поверхности антиген CD8+)
CD8+), имеют на поверхности
42
темный ободок.
ободок.
21
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ.
ГИСТОЛОГИИ.
1.2
Техника замораживаниязамораживания-скалывания:
скалывания: быстро замороженная в
криоконсервантах ткань режется сверхсверх-охлажденным лезвием
– но ткань не режется,
режется, а ломается в местах наименьшего
молекулярного связыввания,
связыввания, например между наружным и
внутренним листком биомембран.
биомембран. Затем на поверхность
скола напыляется металл,
металл, и реплика просматривается в
электронном микроскопе.
микроскопе.
.
Конфокальный лазерный микроскоп (световой)
световой) – позволяет
независимо от толщины среза получить контрастное
изображение и провести пространственную реконструкцию
тканей.
тканей. Лазерный луч сам производит оптический срез ткани
на любом уровне.
уровне. Это разновидность люминисцентной
микроскопии.
микроскопии.
Морфометрия – метод количественной оценки изображения
(определении площади,
площади, периметра,
периметра, ровности контуров и
проч.)
проч.)
43
ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ
ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА
ТЕХНИКА
Этапы гистологической проводки:
Взятие материала,
Фиксация,
Дегидратация и просветление,
Погружение в парафин,
Приготовление срезов,
Окраска,
Заключение в бальзам.
44
22
Взятие
Взятие материала
материала
45
Взятие
Взятие материала
материала
46
23
Фиксация
Фиксация
47
Фиксация
Фиксация
48
24
Обезвоживание
Обезвоживание
50%
60%
70%
80%
90%
49
Дегидратация
Дегидратация и
и просветление
просветление
alcohol
100%I
xylene
50
25
Дегидратация
Дегидратация и
и просветление
просветление
xylene
100%-I
100%-II
51
Заливка
в парафин
52
26
Заливка в парафин
53
Заливка в парафин
54
27
Заливка в парафин
55
Заливка в парафин
56
28
Заливка в парафин
57
Заливка в парафин
58
29
Заливка в парафин
59
Аппарат автоматической
гистологической проводки
60
30
Аппарат автоматической гистологической проводки
61
Приготовление срезов
62
31
Приготовление срезов
63
Приготовление срезов
64
32
Приготовление срезов
65
Приготовление срезов
66
33
Приготовление срезов
67
Приготовление срезов
68
34
Приготовление срезов
69
Приготовление срезов методом сколов
70
35
Окраска
Окраска
71
Окраска
Окраска
xylene
72
36
Окраска
Окраска
Alcohol 80%
Alcohol 90%
Alcohol 100%
73
Окраска
-эозином
гематоксилин
Окраска гематоксилингематоксилин-эозином
74
37
Ободочная кишка,
кишка, окраска альциановым
синим – по ван Гизону.
Гизону.
Коллаген – красного цвета,
цвета, муцины – голубого цвета.
цвета.
75
76
38