генетическая идентификация бактерий коллекционных штаммов
advertisement
С.Сейфуллин атындағы Қазақ агротехникалық университетінің Ғылым жаршысы / Вестник науки Казахского агротехнического университета им. С. Сейфуллина. – 2013. - №2 (77). – C.14-21 ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ КОЛЛЕКЦИОННЫХ ШТАММОВ НА ОСНОВЕ ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 16S RRNA ГЕНА М.А. Куйбагаров, А.Б. Шевцов, А.Х.Жумалин, Т.Б. Карибаев, Ж.Ж.Аканова, Е.С. Шевцова Аннотация В результате проведенной работы выделено 36 образцов ДНК коллекционных штаммов микроорганизмов. Амплифицирован фрагмент протяженностью около 800 п.н. и определена нуклеотидная последовательность 16S rRNA гена. Ключевые слова: бактерии, штаммы, генетическая идентификация, праймеры, секвенирование. Введение Начиная с постулатов Коха идентификация бактерий сводилась в выделение чистых культур с последующей идентификацией фенотипическими тестами, к основным из которых можно отнести микроскопию по Грамму и анализ ферментации углеводов. Данные методы не всегда пригодны для точного и достоверного определения бактериальных патогенов так как: в бактериологической практике встречаются культуры, биохимический профиль которых не соответствует характеристикам предполагаемого рода или вида; не все бактерии растут на средах используемых при анализе ферментации углеводов; достоверная идентификация редко встречаемых видов бактерий требует наличие химических реагентов или иммунологических тестов, которые не доступны в обычных ветеринарных лаборатория. Сложно применять фенотипические методы и при типировании медленно растущих культур (микобактерий) идентификация которых занимает от 6-8 недель. Все это приводит к тому, что врач бактериолог вынужден определять культуру на основании результатов ограниченного списка фенотипических тестов, эпизоотологических и клинических данных, что приводит к ошибкам и как следствие к проблемам терапии и не эффективности противоэпизоотических мероприятий. В практику современных ветеринарных лабораторий вошли новые методы основанные на фенотипических и генетических данных [1, 2, 3]. Универсальной системой идентификации по генетической информации является анализ нуклеотидной последовательности 16S rRNA гена. Метод начал развиваться в 1980-х годах когда С. Woese с сотрудниками, установили что, филогенетические отношения бактерий могут быть определены, сравнивая высоко консервативную часть генетического кода [4]. Развитие автоматических генетических анализаторов и баз данных привело к тому что современная таксономия бактерий построена на основании нуклеотидной последовательности 16S rRNA гена. Протяженность данного гена составляет приблизительно 1540 п.н., нуклеотидная последовательность чередуется участками консервативными для всех видов бактерий с вариабельными, что позволяет подобрать универсальные праймеры для ПЦР амплификации практически полной последовательности. Принцип метода основан на ПЦР амплификации полной или частичной последовательности гена с последующим определение нуклеотидной последовательности. В ветеринарной практике сравнительная идентификация 22 видов фенотипически трудно идентифицируемых видов бактерий выделенных от животных с использованием фенотипических тестов и с использованием анализа нуклеотидной последовательности 16S rRNA гена выявил, что используя полное определение последовательности 16S rRNA гена 95 % (21/22) штаммов были идентифицированы до рода и 86 % (19/22) до вида. Фенотипическая идентификация с использованием коммерческих наборов или обычным методом 20 из 22 штаммов (91%) были идентифицированы до рода, а 1 штамм до вида. Однако, только 55 % (12/22) фенотипически идентифицированных штаммов были правильно идентифицированы до рода и 4,.5 % (1/22) до вида [5]. Опираясь на литературные данные, в нашем исследовании мы хотели проверить достоверность идентификации бактериальных штаммов в депозитариях в сравнении с анализом фрагмента 16S rRNA гена. Материалы и методика исследований В исследовании были проводили с использованием использованы 36 штаммов (таблица спектрофотометра BioPhotometer 1). Выделение ДНК из культур plus (Eppendorf). После чего все оббактерий проводили с помощью на- разцы ДНК были доведены до бора выделения и очистки ДНК единой концентрации 1 нг/мкл. GeneJET™ (Fermentas) согласно ПЦР амплификацию инструкции по применению. фрагмента ДНК протяженностью Количественный анализ ДНК около 800 п.н. была выполнена с универсальными праймерами [6] 8f 5’– AgAgTTTgATCCTggCTCAg-3 и 806R5’ ggACTACCAgggTATCTAAT в общем объеме 20 мкл. Готовили смесь, содержащую 25 нг ДНК, 1Ед. Taq DNA Polymerase (Fermentas), 0,2 mM каждого дНТФ, 1-х ПЦР буфер, 2,5 mM MgCl2, 10 пмоль каждого праймера. Программа ПЦР выполнялась на амплификаторе Mastercycler Gradient, (Eppendorf) и включала в себя длительную денатурацию 5 минут при 95С; 30 циклов: 95С-30 с, 55С – 40 с, 72С – 50 с; финальную элонгацию 72С – 7 минут. Анализ амплифицированных целевых фрагментов ДНК проводили методом разделения фрагментов ДНК в 1,5 агарозном геле, в присутствии интеркалирующего агента – бромистого этидия, который был использован с целью дальнейшей визуализации ДНК. Электрофорез проводили в камере для горизонтального электрофореза Max Fill HU10, и источником тока «Consort EV 243». В качестве электродного буфера использовали 1х ТАЕ-буфер. Документирование полученных результатов проводили, используя систему документаций гелей Bio-Print. Размеры молекул анализируемых образцов ДНК определяли путем сопоставления их электрофоретической подвижности в геле с подвижностью маркеров – фрагмент ДНК известной молекулярной массы. В качестве маркера молекулярных масс использовали DNA Ladder 1kb (Fermentаs). ПЦР продукты очищали от остатков олигонуклеотидов методом дефосфолирирования с помощью щелочной фосфатазы (SAP – shrimp alkaline phosphatase) и эндонуклеазы I типа. Реакцию секвенирование проводили с применением набора реагентов для циклического секвенирования с использованием красителей-терминаторов CEQ WellRED (CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit) согласно инструкции производителя, с последующим разделением фрагментов на автоматическом генетическом анализаторе CEQ 8000 (Beсkman Coulter). Нуклеотидные последовательности, полученные, с применением прямого и обратного праймеров были проанализированы и объединены в общую последовательность, используя программное обеспечение SeqMan (DNASTAR). Полученные нуклеотидные последовательности 16S rRNA гена были идентифицированы относительно доступных нуклеотидных последовательностей депонированных в базах данных Gene Bank (www.ncbi.nih.gov), используя алгоритм BLAST. Идентификация была осуществлена относительно инвентарных номеров GeneBank первых трех нуклеотидных последовательностей имеющих максимальное совпадение. Кроме этого, эти же нуклеотидные последовательности были использованы для построения филогенетических деревьев с рефе- рентными нуклеотидными последовательностями используя программное обеспечение Mega 5.0. Для выравнивания использовали алгоритм ClustalW, а для построения древ метода присоединения ближайших соседей (Neiighbor-Joining NJ). Основные результаты исследований НИР и обсуждение полученных данных Была проведена работа по от 4,5 до 80 нг/мкл, соотношение рекультивированию коллекционных длин волн 260/280 в среднем штаммов микроорганизмов на составляло 1,7. В результате питательных средах. Одновременно постановки ПЦР был проводился контроль роста амплифицирован фрагмент изучаемых микроорганизмов по протяженностью около 800 п.н. В характеру образуемых колоний. В качестве примера на рисунке 1 результате проведенной работы отображены результаты амплифибыли выделено 36 образцов ДНК кации 16 образцов с отрицательным концентрация которых варьировала контролем. Обозначения: (1-16) образцы, (М) маркер молекулярного веса (Fermentas) (100 – 10000 п.н., от 100-1000 шаг 100 п.н.), (К-) отрицательный контрольный образец; Рисунок 1 - Электрофореграмма ПЦР продуктов амплификации фрагмента 16S rRNA гена Как видно на рисунке 1 во всех образцах отчетливо видна специфическая полоса, свидетельствующая об амплификации фрагмента ДНК протяженностью около 800 п.н. В отрицательном контроле отсутствуют продукты амплификации. В фореграмме нуклеотидной последовательности штамма B. abortus 1324 было выявлено наличие смешанного профиля (рис. 2), указывающее на его контаминацию. Смешанный профиль Рисунок 2 – Смешанный профиль нуклеотидной последовательности 16S rRNA штамма B. abortus 1324 Сравнительный анализ генетических и фенотипических методов представлен в таблице 1. Штамм идентифицируемый фенотипическими методами как C. chavoe при генетической идентификации в BLAST имел максимальное совпадение (100%) с нуклеотидной последовательностью C. novyi , также при построение филогенетического дерева (рис 3а) расположен на одной кладе с C. novyi. Штамм E. сoli 015 достоверно был идентифицирован фенотипическими и генетическими методами (рисунок 3б). Нуклеотидная последовательность 16S rRNA гена S. abortus ovis 17 при идентификации в BLAST имела максимальный процент совпадения с нуклеотидными последовательностями Citrobacter freundii (JX001466, JX0014665), однако при построение филогенетического дерева с референтными последовательностями имеющимися в базе LPSN (http://www.bacterio.cict.fr/) расположена отдельной ветвью но наиболее генетически близка группе сальмонелл (рис 3в). Таким образом для данного штамма анализ 16S rRNA гена не позволил провести видовую идентификацию. Штамм P. multocida bovis 11 генетическим методом идентификации был идентифицирован как Enterococcus spp. На рисунке 3г видно что он расположен на одной ветви с E. durans, E. hirae, E. faecium. Высокая нуклеотидная идентичность 16S rRNA гена между данными видами не позволяет провести их видовую идентификацию. Трудно идентифицируемые фенотипическими методами штаммы микобактерий M. tuberculosis и M. phlei на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S rRNA гена были идентифицированы как M. avium и Paenibacillus barengoltzii соответственно (рис 3д.). 26 штаммов бруцелл на основании анализа нуклеотидной последовательности 16S rRNA гена были идентифицированы как Brucella spp. Штаммы B. suis 1024, B. suis 1001-1, B. ovis 68 на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S rRNA гена были идентифицированы как Bordetella bronchiseptica (в связи с большими размера филогенетическое дерево не приводится). AF025367 Citrobacter sp. 3а AF025373 Citrobacter werkmanii AJ233408 Citrobacter freundii 3в AB045606 Clostridium novyi Clostridium chavoe KazNIVI AB037910 Clostridium haemolyticum X74770 Clostridium tetani L37585 Clostridium botulinum A 60 100 X68189 Clostridium sporogenes NR 074482 Clostridium perfringens U59278 Clostridium septicum M59091 Clostridium carnis U51843 lostridium chauvoei AB075771 Clostridium sordellii 100 AF025368 AF025368 Citrobacter braakii AF025369 Citrobacter sp. 100 58 36 100 48 M59291 Citrobacter freundii AY373829 S. subterranea strain FRC1 EU014684 S. enterica subsp. houtenae AF025372 Citrobacter diversus HQ992945 Citrobacter koseri AF025363 Citrobacter rodentium AF025364 Citrobacter sedlakii 0.02 EU014687 S. enterica subsp. enterica serovar Enteritidis EU014685 S. enterica subsp. salamae 3б X80725 E.coli (ATCC 11775T) E. coli 015 AF530475 Escherichia fergusonii EU014688 S. enterica subsp. diarizonae EU014681 S. choleraesuis EU014686 S. enterica subsp. enterica serovar Typhimurium EU014681 S.choleraesuis Z47544 S.typhi AJ508775 Escherichia albertii JN175333 Escherichia blattae JN175345 Escherichia hermannii Salmonella abortus ovis 17 KazNIVI EU014680 S. enterica subsp. indica JN175338 Leclercia adecarboxylata AF008580 S. enterica IIIa AF530476 Escherichia vulneris AF025371 Citrobacter farmeri FR870441 Citrobacter amalonaticus AF029227 S. bongori 0.002 0.002 3г 3д X 7 6 1 7 7 E .ca n is A F 0 6 1 0 1 3 E . m u n dtii E F 1 9 7 9 9 4 E . th a ila n dicu s AJ536036 M . intracellulare EF054881 M . arosiense U84502 M . bohemicum EF591053 M . bouchedurhonense JF738056 M . yongonense AJ536037 M . avium subsp. avium X52934 M . avium subsp. paratuberculosis A J 2 7 6 3 5 4 E . du ra n s P a s te u re lla m u lto cida b o v is 1 1 K A Z N I V I Y1 7 3 0 2 E . h ira e A J 3 0 1 8 3 0 E . fa e ciu m EF521891 M . avium subsp. silvaticum X52934 M . paratuberculosis M ycobacterium tuberculosis KAZNIVI AF547932 M . haemophilum A F 5 3 9 7 0 5 E .ra tti A F 3 3 5 5 9 6 E .v illo ru m A J 2 7 1 3 2 9 E .v illo ru m X52930 M . malmoense X52926 M . szulgai AF480602 M . gastri AJ536035 M . kansasii A J 8 9 1 1 6 7 E .de v rie s e i A F 0 6 1 0 0 2 E . ps e u do a v iu m A F 1 3 3 5 3 5 E . a v iu m Y1 8 2 9 6 E . ra ffin o s u s X88922 M .conspicuum AY368456. M . nebraskense DQ536403 M . seoulense D Q 4 1 1 8 1 0 E . gilv u s A J 3 0 1 8 3 5 E .m a lo do ra tu s FJ042897 M . mantenii GQ153270 M . paraffinicum AF480604 M . scrofulaceum X52923 M . gordonae A Y0 2 8 4 3 7 E .ph o e n icu lico la A Y3 9 6 0 4 7 E . h e rm a n n ie n s is D Q 4 1 1 8 1 2 E . pa lle n s Y1 1 6 2 1 E .a s in i AB548725 M . ulcerans AB268503 M . shinjukuense AF406783 M . lacus AF480605 M . africanum A J 8 8 8 9 0 6 E .ca n in te s tin i A F 0 6 1 0 0 7 E .dis pa r A B 0 1 2 2 1 2 E . fa e ca lis AF547903 M . bovis AJ131120 M . tuberculosis AF480584 M . microti A M 0 3 9 9 6 8 E . te rm itis A Y9 4 3 8 2 0 E . ca cca e A F 2 8 6 8 3 1 E . m o ra v ie n s is AF502574 M . pinnipedii X58890 M .tuberculosis X58890 M ycobacterium A F 2 8 6 8 3 2 E .h a e m o pe ro x idu s A M 0 3 9 9 6 6 E .s ile s ia cu s A F 0 3 9 9 0 0 E . ga llin a ru m AY457083 M . w olinskyi X67847 M .intermedium A F 0 3 9 9 0 3 E .ca s s e lifla v u s A J 4 2 0 8 0 2 E . fla v e s ce n s AJ431371 M ycobacterium sp. U94745 M . duvalii A J 8 7 7 0 1 5 E . a qu a m a rin u s AJ010747 M . elephantis AF480603 M . phlei A F 0 6 1 0 0 1 E .s u lfu re u s A J 3 0 1 8 4 0 E . s o lita riu s AJ634379 M . confluentis AB537170 M . madagascariense A F 0 6 1 0 0 4 E . s a cch a ro ly ticu s E F 1 5 4 4 5 4 E . ca m e llia e AJ131761 M . smegmatis A J 5 8 2 7 5 3 E . ita licu s X55602 M . thermoresistible AJ429045 M . agri N R 0 2 5 6 2 5 E .ita licu s A F 0 6 1 0 0 9 E . ce co ru m A F 0 6 1 0 0 6 E . co lu m b a e X52932 M . flavescens AB073196 P. macerans AY323610 P. timonensis M ycobacterium phlei KAZNIVI L 3 2 8 1 3 E .s e rio licida A F 2 9 4 4 1 0 P a s te u re lla m u lto cida s u b s p. m u lto cida 0 .0 5 AJ548480 M . chimaera AY167814 P. barengoltzii 0.02 Рисунок 3 – Филогенетические деревья построенные на основании анализа нуклеотидной последовательности 16S rRNA гена Во многих нуклеотидной случаях анализ видовой принадлежности. Это связано с 16S тем что, бруцеллы наземных животных последовательности rRNA является окончательным решением являются при определении этиологических агентов уровень ДНК гибридизации между видами инфекционных превышает болезней человека, генетически 80%, а однородными: нуклеотидная встречаемыми идентичность 16S rRNA составляет около бактериями [7]. Но ограниченная дис- 100%. Также видовая идентичность не криминационная способность 16S rRNA была установлена у Enterococcus spp и гена Salmonella spp. вызванных редко не всегда позволяет идентифицировать бактерии до видового Важно отметить, что генетическая уровня и требуется дальнейший анализ идентификация генов кодирующих белки или постановка недостоверную целевых идентификацию у 9 из 36 штаммов, что фенотипических тестов. В нашем исследовании не один штамм позволила выявить фенотипическую составило 25%. бруцелл не был идентифицирован до Заключение Проведенные исследования еще раз доказывают введения целесообразность генетической выделенных культур лабораторную в практику ветеринарных лабораторий необходима ветеринарных лабораториях является автоматизация технологии. В настоящее время может быть оптимизировано только постановка ПЦР и анализ последовательности с соответствующего программного обеспечения с валидированными базами данных, например MicroSeq (Applied Biosystems Inc) или SmartGene IDNS. Однако, обеспечение затрудняет интерпретацию. Поэтому для клиническую 16S rRNA анализа в микробиологических использованием что внедрения данной методики в практику больших препятствий в использовании недостаточная результаты, идентификации лабораторий Казахстана. Одно из самых клинических противоречивые разное программное может выдавать дальнейшая разработка методических указаний и валидированных баз данных. Таблица 1. Сравнительный анализ генетических и фенотипических методов идентификации № штамма В-0179 В-0083 В-0089 В-0053 В-0055 В-0113 B-0101 Фенотипическая идентификация Генетическая идентификация № штамма Фенотипическая идентификация E. сoli 015 E. сoli B-014 B. melitensis 1 499 Enterococcus B-014 B. bovis 11 spp. 8 melitensis487 S.abortus ovis Salmonella B-015 B. melitensis 17 spp. 4 511 M. tuberculosis M. avium B-015 B. 8 melitensis10 Brucella spp. 1 B.melitensis 1 Brucella spp. B-016 B. 1 melitensis909 B-017 B.melitensis 0 54 B-017 B. 4 melitensis653 B-034 B.melitensis10 7 ш3 B-034 B.melitensis 8 А1/3 B-039 B. melitensis 9 Ю-1 Brucella spp. В-010 B. abortus Контаминирована 0 1324 B-018 B. suis 4-1 M. phlei C. chavoe P. barengoltzii C. novyi B. abortus 4556 B. abortus T-7-1 B-0107 Brucella spp. B. abortus 4004 Brucella spp. B-0113 B. abortus 1106 Brucella spp. B-0101 B. abortus 4556 Brucella spp. B-0137 B. abortus 64-1 Brucella spp. B-0345 B. abortus ЮК-1 B-0346 B-0467 Brucella spp. B. abortus ЮК-2 B-0377 Brucella spp. P. multocida Brucella spp. B-0103 Генетическая идентификация B. abortus Brucella spp. B-016 К-9-1 Brucella spp. 0 B. abortus Brucella spp. B-019 Brucella spp. Brucella spp. Brucella spp. Brucella spp. B. suis 723-1 Brucella spp. 8 B-020 Brucella spp. Brucella spp. 7 B-018 Brucella spp. Brucella spp. B. suis 196-1 Brucella spp. B. suis 1024 B. B-0501 К-4107 2 B. abortus 1126 B-018 Brucella spp. B-0509 B. abortus Brucella spp. B. suis 1001-1 B. bronchiseptica 9 B-018 43-62 bronchiseptica B. ovis 68 B. bronchiseptica 0 Список литературы 1. Onderdonk A.B., Sasser M. Gas-liquid and high-performance chromatographic methods for the identification of microorganisms. Manual of Clinical Microbiology, 6th Ed. Washington: American Society for Microbiology, 1995. – 1506 р. 2. Pfyffer. J.A. Kellogg, D.A. Bankert, G.S. Withers, W. Sweimler, T.E. Kiehn, G.E. Application of the Sherlock Mycobacteria Identification System using high-performance liquid chromatography in a clinical laboratory // J Clin Microbiol. - 2001. – Vol. 39. – P. 964-970. 3. A. Karger, R.Stock, M.Ziller, M.C.Elschner, B.Bettin, F.Melzer, T.Maier, M.Kostrzewa, H.C.Scholz, H.Neubauer, H.Tomaso. Rapid identification of Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei by intact cell Matrix-assisted Laser Desorption/Ionisation mass spectrometric typing // BMC Microbiology. – 2012. – Vol. 12. – P. 229 - 234. 4. Woese C. R. Bacterial evolution // Microbiological Reviews. - 1987. – Vol. 51. – P 221–271. 5. H. Cai, M. Archambault, J. F. Prescott. 16S ribosomal RNA sequence–based identification of veterinary clinical bacteria // J Vet Diagn Invest. – 2003. – Vol. 15. P. 465–469. 6. Vegas E. Z. S., Nieves B., Araque M., Velasco E., Ruiz J., Vila J. Outbreak of Infection With Acinetobacter Strain RUH 1139 in an Intensive Care Unit // Infection control and hospital epidemiology. – 2006. - Vol. 27, № 4. - P. 397 – 404. 7. C.J. Somers, B.C. Millar, J.Xu. Haemophilus segnis: a rare cause of endocarditis // Clinical Microbiology and Infection.- 2003. – Vol. 9. – P. 1048–1050. Түйін Коллекциялық микроорганизм штамдарының қоректік ортада қайта өсіру жұмыстары жүргізілді. Концентрациясы 4,5 тен 80 нг/мкл дейін болатын ДНҚ-ң 36 сынамасы бөлініп алынды. ПТР қою нәтижесінде 800 ж.н. болатын фрагмент амплификацияланды және штамдардың 16S rRNA генінің нуклеотидтік тізбегі анықталды. Анықталған бояғыш-терминаторларды нуклеотидтік қолдану арқылы тізбектермен секвенирлеу CEQ жүргізіліп, WellRED ары қарай автоматтық генетикалық анализаторда CEQ 8000 (Beсkman Coulter) фрагменттерді бөлініп талданды және жалпы тізбекке біріктірілді. Алынған 16S rRNA генінің тізбектері, Gene Bank деректер базасында депонирленген нуклеотидтік тізбектермен BLAST алгоритімін қолдану арқылы нақтыланды.Референтті нуклеотидтік тізбектермен филогенетикалық ағаштар құрылды. Summary The work on reculturing collection strains of microorganisms was carried on culture media. 36 DNA samples were isolated with a concentration of 4.5 to 80 ng/mcl. As a result of PCR analysis fragment with the length of about 800 bp was amplified and the nucleotide sequence of 16S rRNA gene of strains was determined. Nucleotide sequences were sequenced using the CEQ WellRED Dye Terminator, followed by the separation of fragments on an automatic genetic analyzer a CEQ 8000 (Beckman Coulter), analysis and association in the general sequence. The resulting nucleotide sequences of the 16S rRNA gene were identified by the comparison with the accessible nucleotide sequences deposited at GenBank databases, using the algorithm BLAST. Phylogenetic trees were constructed with the reference nucleotide sequences.
