Методы молекулярной гисто- и цитологии, используемые в
advertisement
Молекулярная гистология и гистопатология Молекулярная гисто- и цитология и гистои цитопатология Классическая Транскриптомика гистология Протеомика Молекулярная гистология Лекция для слушателей школы по новым технологиям в биологии и медицине при НИИБМХ РАМН Лектор: К.Н.Ярыгин Гистохимия Молекулярная гистопатология Микроскопия Лазеры Масс-спектрометрия Биоинформатика Молекулярная цитология и цитопатология Классическая Транскриптомика цитология Протеомика Сортировка Культура Молекулярная цитология клеток клеток Молекулярная цитопатология Цитохимия Лазеры Микроскопия Масс-спектрометрия Методы молекулярной гисто- и цитологии, используемые в НИИБМХ • Лазерная микродиссекция (CLONIS) + экстракция + электрофорез или хроматография + масс спектрометрия • Сортировка клеток (сортер клеток BD FACSAria, система магнитной сортировки Multinyi) + экстракция + электрофорез или хроматография + масс спектрометрия • Ближнепольная микроскопия-масс спектрометрия (перспектива) • (Carl Zeiss) Биоинформатика Подготовка опухолей и образцов здоровых тканей к highthroughput анализу транскриптома и протеома Ткань (опухоль или нормальная) Лазерная микродиссекция Сортировка изолированных из тканей и опухолей клеток Культура клеток Транскриптомика, протеомика Клеточные линии Что Такое Лазерная Микродиссекция? • Лазерная микродиссекция позволяет с помощью лазерного луча вырезать из кусочка фиксированной, замороженной или свежей ткани различные структуры, например клетки, группы клеток, микро-сосуды и т.п. • Существует несколько систем лазерной микро-диссекции, которые используют разные лазеры и различные способы удаления вырезанных структур из ткани • Система Clonis (BioRad) позволяет также отбирать или разрушать клетки в культуре • Clonis дает возможность осуществлять кокультивирование различных клеток, например, культивирование стволовых клеток в присутствии фидерных клеток или раковых клеток в присутствии специфических В лимфоцитов 1 Основные компоненты системы Clonis • Инфракрасный лазер (80mW 780 nm CW laser diode) • Инвертированный микроскоп Nikon TE2000U с моторизованным держателем образца и системой защиты оператора от воздействия лазерного луча • Компьютер Dell Intel Pentium 4 Processor 2.0GHz 1GB 532 MHz DDR SDRAM, 80GB IDE Hard Drive, 21’’ Color Monitor • Программное обеспечение – LaserVox interactive 3D visualization and measurement software • Специальные расходные материалы Лазерная микродиссекция группы клеток из ткани ЛМД эпителия из очага аденомы простаты Области использования лазерного микродиссектора Clonis • Транскриптомика: для анализа нужно вырезать от 100 до 1000 клеток. • Протеомика: для анализа нужно > 1 млн клеток (для LC-MS/MS – 50 тысяч?). • Культура клеток: 1) изоляция клонов и чистых культур клеток определенного типа; 2) изучение взаимодействия клеток в культуре. Автоматическая лазерная микродиссекция объектов из среза ткани Лишь некоторые методы окраски ткани позволяют проводить протеомный анализ А Б • 2D электрофореграммы экстрактов окрашенной (A) и неокрашенной (Б) ткани идентичны • Материал, полученный в результате ЛМД окрашенного среза может быть использован для протеомного анализа методом 2D электрофорез-MALDI-TOF 2 Примеры клеток, которые можно изолировать с использованием клеточного сортера и иммуномагнитосфер Примеры клеток, которые можно изолировать без использования клеточного сортера и иммуномагнитосфер • Раковые клетки на разных стадиях озлокачествления • Дифференцированные клетки определенных морфофункциональных типов (их можно использовать в том числе как контроль при изучении экспрессионной геномики рака) • Разнообразные взрослые и фетальные стволовые и прогениторные клетки • Клетки гематопоэтических рядов, в том числе все типы иммунных клеток • Раковые клетки (первичные культуры опухолевых клеток) • «Мезенхимальные» стволовые клетки из разных источников (жировая ткань, костный мозг, периферическая кровь, пуповинная и плацентарная кровь и т.д.) • Многие тип дифференцированных клеток (первичные культуры) • Эмбриональные стволовые клетки Иммуномагнитная сепарация: технология MACS Принцип работы сортера клеток • • • • • Технология MACS использует MACS MicroBeads, колонки MACS и сепараторы MACS. MACS MicroBeads – это суперпарамагнитные частицы, конъюгированные с высокоспецифичными МАТ. Их используют для того, чтобы специфически пометить нужную субпопуляцию клеток в смеси. Диаметр - приблизительно 50 nm – меньше порога разрешения светового микроскопа. MACS MicroBeads биодеградируемы и, как утверждает фирма-производитель, не вызывают реакции со стороны клеток. Так как MicroBeads малы, то для фиксации клеток необходимо создать магнитное поле с высоким градиентом. Колонки MACS, заполненные не токсичным для клеток матриксом, позволяют генерировать сильное магнитное поле, сохраняя жизнеспособность клеток. Колонка MACS помещается в постоянное магнитное поле сепаратора MACS, сила которого достаточна для удержания клеток, меченых минимальным числом MicroBeads. Клетки, не связавшие MicroBeads, удаляются простым промыванием колонки буфером. После изъятия колонки из магнитного поля точно так же элюируются клетки, связавшие магнитные частицы. Вся процедура занимает менее 1 часа, что существенно меньше, чем необходимо для сепарации минорных субпопуляций с помощью сортера. . Иммуномагнитная сепарация: этапы Иммуномагнитные сепараторы Miltenyi Biotec Мечение клеток иммунобидами Элюция немеченых клеток Элюция меченых клеток miniMACS . cliniMACS autoMACS 3 Клетки из пуповины человека: двойное окрашивание на нестин (зеленый) и коллаген II (красный) Клетки из пуповины человека: двойное окрашивание на нестин (зеленый) и коллаген II (красный) Группа профессора Каприоли: масс спектральная визуализация биологических объектов с использованием метода МАЛДИ Integrating Histology and Imaging Mass Spectrometry Pierre Chaurand,† Sarah A. Schwartz,† Dean Billheimer,‡ Baogang J. Xu,† Anna Crecelius,† and Richard M. Caprioli Текущее направление поиска в области молекулярной гистологии в НИИБМХ: интеграция микроскопии и масс спектрометрии Исполнители: группа профессора Е.Н.Николаева и лаборатория клеточной биологии Группа профессора Р. Хеерена: визуализация с использованием методов вторично ионной эмиссии и MALDI Effect of Local Matrix Crystal Variations in Matrix-Assisted Ionization Techniques for Mass Spectrometry Stefan L. Luxembourg, Liam A. McDonnell, Marc C. Duursma, Xinghua Guo, and Ron M. A. Heeren* FOM Institute for Atomic and Molecular Physics, 4
