Специфические особенности инициации трансляции на РНК
advertisement
Московский Государственный Университет Имени М.В. Ломоносова ФАКУЛЬТЕТ БИОИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ На правах рукописи БОЧКАЕВА (АДЬЯНОВА) Занда Владимировна Специфические особенности инициации трансляции на РНК вируса гепатита С 03.01.03 – Молекулярная биология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2010 1 Работа выполнена на Факультете биоинженерии и биоинформатики Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова Научные руководители: доктор химических наук, профессор Шатский Иван Николаевич кандидат химических наук Теренин Илья Михайлович Официальные оппоненты: кандидат биологически наук Гмыль Анатолий Петрович доктор биологических наук, профессор Аграновский Алексей Анатольевич Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им.В.А. Энгельгардта РАН Защита состоится «25» июня 2010 года в 16-00 на заседании Диссертационного совета Д 501.001.76 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119234 Москва, Воробьевы горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, ауд. 536. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Автореферат разослан «24» мая 2010 года. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Крашенинников И.А. 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Трансляция мРНК в клетке это сложный процесс, который с точки зрения механизмов обычно разделяют на три стадии: инициацию, элонгацию и терминацию. Лимитирующей стадией процесса биосинтеза белка является в подавляющем числе случаев инициация– стадия, на которой происходит присоединение рибосомы к мРНК и поиск стартового кодона. Регуляция процесса трансляции в эукариотической клетке за редкими исключениями направлена именно на регуляцию стадии инициации. Поэтому неудивительно, что как раз инициация трансляции привлекает внимание ученых, изучающих регуляцию биосинтеза белка, в первую очередь. В клетках эукариот помимо канонического кеп-зависимого механизма, когда рибосома привлекается на мРНК с помощью метилированного остатка гуанозина на 5’конце мРНК – кепа (от англ. cap), инициация трансляции может осуществляться за счет посадки рибосомы непосредственно внутри мРНК (так называемые участки внутренней посадки рибосомы или IRES’ы от англ. Internal Ribosomal Entry Site). По кеп-зависимому механизму транслируются если не все, то, по крайней мере, подавляющее большинство всех мРНК эукариот, тогда как IRES-зависимая инициация характерна в первую очередь для мРНК тех вирусов, жизненный цикл которых полностью протекает в цитоплазме. Не имея на 5’-конце собственных мРНК кеп-структуры, они не могли бы эффективно конкурировать за компоненты инициаторного аппарата с клеточными матрицами, не будь у них специальных механизмов инициации трансляции. Считается также, что в некоторых клеточных мРНК также существуют IRES-элементы, однако в последние годы было опубликовано немало работ, ставящих это под сомнение. . Одним из вирусов, использующих IRES-зависимый механизм инициации для трансляции своей мРНК в клетках, является высокопатогенный вирус гепатита С. В настоящее время по некоторым оценкам им инфицировано более 3% населения Земли (170 млн человек), и как причина смерти гепатит С выступает даже чаще, чем вирус иммунодефицита человека. При заражении вирус в основном поражает клетки печени, но причины такой тканеспецифичности пока неизвестны. Одна из наиболее вероятных гипотез – регуляция жизненного цикла вируса специфическими компонентами клеток печени. Понятно, что со времени своего открытия в 1989 году вирус гепатита С является одним из самых изучаемых вирусов, однако многие аспекты его жизненного цикла остаются малоизученными в силу отсутствия адекватных in vivo систем, где бы вирус 3 эффективно реплицировался. Некоторые важные детали трансляции его мРНК также остаются неразгаданными: как осуществляется регуляция трансляции мРНК вируса, какие рибосомные белки участвуют во взаимодействии рибосомы с IRES’ом, какова роль отдельных доменов в 5’-нетранслируемой области и высоко консервативной 3’нетранслируемой области мРНК, какова причина тропизма вируса к клеткам печени? Все это далеко не полный перечень вопросов, которые до сих пор остаются открытыми. Ответы на них, возможно, позволили бы в перспективе хотя бы снизить риск развития у больных тяжелых заболеваний, таких как цирроз и рак печени. По структуре и функциональной роли 5’- и 3’- нетранслируемых областей РНК HCV уже опубликованы сотни работ. И тем не менее все время остаются неясными некоторые моменты в их организации, механизме взаимодействия с 40S рибосомными субчастицами и друг с другом. Три части этой диссертационной работы и посвящены отдельным, активно дискутируемым в литературе аспектам организации и функционирования 5’- и 3’нетранслируемых областей РНК вируса гепатита С. Цели исследования: 1. Исследование роли рибосомного белка p40 в образовании бинарного комплекса 40S рибосомной субчастицы с IRES’ом мРНК вируса гепатита С. 2. Определение роли домена I 5’-нетранслируемой области мРНК вируса гепатита С в инициации трансляции. 3. Определение роли 3’-нетранслируемой области мРНК вируса гепатита С в инициации трансляции Научная новизна и практическая значимость. В ходе работы было показано, что антитела к рибосомному белку р40, который расположен в районе места связывания IRES’а вируса гепатита С на 40S рибосомной субчастице, подавляют трансляцию в бесклеточной системе лизата ретикулоцитов кролика. При этом было показано, что добавление антител не влияет на стадию элонгации и терминации трансляции. Эти результаты совместно с результатами наших коллег из Новосибирска являются первыми, указывающими на роль рибосомного белка p40 в кеп-независимой трансляции. Методом внесения делеционных мутаций в 5’-нетранслируемую область вируса гепатита С было показано, что наличие домена I в 5’-нетранслируемой области мРНК ингибирует трансляцию, направляемую IRES’ом, в 4 раза в клетках печени и в 2 раза – в непеченочных клетках. Причем основной вклад в это ингибирование вносит область между доменом I и доменом II, который уже входит в состав IRES-элемента. С помощью модельной мРНК, содержащей два инициаторных кодона для одной рамки считывания: AUG-кодон HCV и AUG-кодон люциферазы, было показано, что IRES 4 вируса гепатита С направляет трансляцию исключительно со «своего» инициаторного кодона. При кепировании IRES’а он может направлять инициацию трансляции и по классическому сканирующему механизму. В этом случае инициация может осуществляться как с IRES-ного, так и с расположенного ниже AUG-кодона. Впервые экспериментально показано, что молекула мРНК, содержащая одновременно кеп и IRESэлемент, может направлять трансляцию или по сканирующему, или по IRES-зависимому механизму. Это наблюдение представляет интерес с точки зрения возможных вариантов инициации трансляции в эукариотических клетках, но не имеет прямого отношения к реальной трансляции РНК HCV, которая, как известно, не кепирована. Поэтому данный раздел работы приводится в диссертации, но не в автореферате Наконец, в ходе исследования специальных химерных конструкций показано, что 3’-НТО мРНК вируса гепатита С аналогично поли(А)-последовательности стимулирует как IRES-, так и кеп-зависимую трансляцию in vivo и совершенно не влияет на эффективность трансляции in vitro. Важно отметить, что стимулирующий эффект не является тканеспецифичным. Полученные данные объясняют наиболее спорные вопросы трансляции на мРНК вируса гепатита С: в частности, вопрос о роли 3’-нетранслируемой области и домена I 5’нетранслируемой области мРНК вируса в инициации трансляции. Кроме того, полученные данные впервые указывают на роль рибосомного белка p40 в IRES-зависимой трансляции, и впервые исследован сканирующий механизм на IRES-содержащей РНК и показан его фактический вклад в общую трансляцию на IRES-содержащей мРНК. Апробация работы. Диссертация была апробирована на заседании кафедры молекулярной биологии Биологического факультета МГУ 14 мая 2010 года. Материалы работы были представлены на международной конференции Ribosomes 2010, Италия, 2010. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 печатные работы. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 75 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждения, материалы и методы, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 30 рисунками и 1 таблицей. Библиографический указатель включает 200 цитированных работ. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Открытая рамка считывания генома вируса гепатита С кодирует один полипептид, который после синтеза клеточные и вирусные протеазы разрезают на 3 структурных и 7 5 неструктурных белков. По краям ОРС располагаются высококонсервативные 5’-НТО и 3’-НТО (рис. 1). Хотя в целом геном вируса отличается довольно большой вариабельностью, 5’-и 3’-НТО очень консервативны, что, возможно, указывает на важность их первичной структуры в жизненном цикле вируса. Рис. 1 Схематическое изображение генома вируса гепатита С. 1. Инициация трансляции на мРНК вируса гепатита С: роль рибосомного белка p40 в связывании IRES-элемента с 40S субчастицей рибосомы Белок p40 малой субчастицы рибосомы млекопитающих был идентифицирован как один из компонентов, находящихся вблизи участка связывания IRES-элемента вируса гепатита С[12]. Всего в совместной работе с лабораторией Г.Г. Карповой в районе этого участка было найдено 5 рибосомных белков: S3a, S5, S14, S16 и p40. Наше внимание привлек именно белок р40, поскольку у него имеется прокариотический гомолог – белок S2, являющийся функционально важным компонентом рибосомы E.coli, многие мутации по нему летальны. Было показано, что он связывает белок S1[178], который играет ключевую роль в связывании мРНК у прокариот. Кроме того, недавно было установлено, что белок S2 непосредственно взаимодействует с дуплексом ШД-антиШД, образуемого мРНК и 16S рРНК при инициации трансляции у прокариот [179]. С другой стороны, о роли эукариотического белка p40 в трансляции ничего не было известно. И лишь совсем недавно в указанной совместной работе с группой Г.Г. Карповой было показано, что p40 находится в непосредственной близости от домена IIIe IRESэлемента HCV. На данном этапе работы нашей целью было выяснить, участвует ли напрямую белок p40 в связывании IRES-элемента вируса гепатита С, а также в связывании других матриц, 6 и по возможности изучить роль белка в процессе трансляции. В соответствии с поставленной целью, проделанную экспериментальную работу по изучению роли рибосомного белка p40 в трансляции мРНК вируса гепатита С можно разделить на 2 стадии: 1. Изучение влияния белка p40 на образование бинарного комплекса между IRESэлементом вируса гепатита С с 40S субчастицей, 2. Исследования роли белка p40 в трансляции различных мРНК. 1.1 Изучение влияния белка p40 на образование бинарного комплекса между IRESэлементом вируса гепатита С с 40S субчастицей рибосомы 1.1.1. Получение белка p40 Нашими коллегами из Новосибирского института биотехнологии и фундаментальной медицины (лаб. проф. Г.Г. Карповой) была любезно предоставлена плазмида pET-15b, содержащая ген белка p40 человека с гексагистидиновым хвостом для гетерологической экспрессии данного белка в клетках Escherichia coli. С помощью этой плазмиды мы в нативных условиях выделили рекомбинантный белок p40. В результате был получен раствор белка p40 с концентрацией ~ 0.4 мкг/мкл (рис.2 а). 1.1.2. Исследование малых субчастиц рибосом на наличие белка p40 и насыщение им Известно, ассоциирован что с белок малой p40 довольно субчастицей слабо рибосомы, поэтому нам необходимо было оценить его наличие в имеющихся у нас препаратах рибосом. Как видно на рисунке, белок p40 присутствует в рибосомных 40S субчастицах (рис.2б) в нестехиометрических количествах (примерно 0,5:1). Рис.2 а) Фотография геля с результатами электрофореза (SDSПААГ). 1 – белковые маркеры молекулярного веса, 2 – образец очищенного белка p40 (0.5 мкл), 3 – то же, но для 1 мкл р40; б) Фотография геля, окрашенного серебром, с результатами электрофореза (ДСН-ПААГ). 1 – рекомбинантный белок p40 (0,4 мкг), выделенный в нативных условиях, 2 – белковые маркеры молекулярного веса, 3 – малые субчастицы рибосом 40S (0,5 мкл раствора). Чтобы проверить, возможно ли полностью насытить рибосомные 40S субчастицы белком, их инкубировали с 5-кратным избытком рекомбинантного p40, после чего рибосомы отделяли от несвязавшегося белка центрифугированием смеси через подушку 10% сахарозы. Осевшие рибосомы ресуспендировали и анализировали методом электрофореза в ПААГ (рис. 3). 7 Как видно происходит, из причем рисунка, насыщение количество белка действительно в рибосомах увеличивается, как и ожидалось, примерно в 2 раза (стоит заметить, что подвижность из-за наличия рекомбинантного гексагистидинового белка при хвоста электрофорезе несколько меньше подвижности нативного). Положительный результат данного эксперимента позволил нам проверить, влияет Рис.3 Фотография геля, окрашенного Кумасси R250, с результатами электрофореза (ДСНПААГ). 1 – 40S, не прошедшие инкубацию с белком p40, 2 – очищенный рекомбинантный белок p40, 3 – рибосомные субчастицы 40S, проинкубированные с белком p40, 4 – 40S, проинкубированные без добавления белка. ли наличие белка р40 в 40S субчастице на эффективность образования бинарного комплекса 40S с IRES’ом HCV, и также на трансляцию ряда мРНК. 1.1.3. Исследование влияния p40 на эффективность связывания малых субчастиц рибосом с мРНК вируса гепатита С Для проведения этого исследования мы синтезировали фрагмент мРНК вируса гепатита С методом транскрипции in vitro с использованием радиоактивно меченнного α-[32P]-UTP. После этого насыщенные белком p40 рибосомные субчастицы инкубировали с меченной мРНК с добавлением разных количеств белка p40: брали 1x-, 2x- и 5х-кратные молярные избытки белка по отношению к субчастицам. В качестве контроля инкубировали меченную мРНК с 40S субчастицами рибосомы, не насыщенными p40. После этого рибосомные субчастицы и все, что с ними связалось, отделяли от всех остальных компонентов методом центрифугирования в градиентном растворе сахарозы (5-20%). Содержимое пробирок фракционировали и анализировали профили радиоактивности. Как видно из рис. 4, никакого влияния добавления белка p40 на эффективность образования бинарного комплекса не Несвязавшаяся РНК Бинарный комплекс Рис.4 Влияние насыщения малых субчастиц рибосом белком р40 на связывание с IRES-элементом HCV. 8 обнаруживается. Из этого нами был сделан вывод, что добавление белка p40 если и увеличивает константу связывания, то не настолько, чтобы это сказывалось на количестве связанного с субчастицами IRES’а. Теоретически, можно было бы предположить, что при данных концентрациях компонентов мы просто не могли этого увидеть, поскольку константа диссоциации комплекса IRES-элемента с 40S субчастицей составляет около 2 нМ. И действительно, изотермы адсорбции, полученные нашими новосибирскими коллегами для данной системы, показали, что белок p40 увеличивает константу связывания IRES-элемента с 40S рибосомной субчастицей всего в 5 раз. Таким образом, белок p40 не является тем ключевым компонентом 40S субчастиц, который определяет уникальную особенность IRES-элемента РНК вируса гепатита С давать с ними прочные бинарные комплексы. Естественно, данный факт никак не исключает того, что р40 влияет на следующие после образования бинарного комплекса стадии образования инициаторного комплекса на мРНК вируса гепатита С. 1.2 Исследование необходимости белка p40 для трансляции различных мРНК Данное исследование мы проводили методом трансляции in vitro. Эффективность трансляции оценивалась по включению [35S]-метионина в репортерный белок. Трансляцию проводили в лизате ретикулоцитов кролика (Promega) с добавлением различных количеств моноклональных антител к исследуемому белку, любезно предоставленных нашими коллегами из Новосибирска.В качестве контроля параллельно проводили трансляцию без добавления антител. Матричные РНК получали методом транскрипции in vitro. В ходе исследования мы использовали мРНК с 5’-нетранслируемыми областями мРНК вируса гепатита С и βактина, кодирующие люциферазу светлячка (ок. 80 кДа), а безлидерная мРНК (c1lacZ) кодировала начало белка c1 фага λ, слитого с β-галактозидазой (ок. 60 кДа). Следует отметить, что эти матрицы используют разные способы инициации трансляции: как неоднократно указывалось выше, 5’-нетранслируемая область мРНК вируса гепатита С содержит IRES-элемент, мРНК β-актина – стандартной клеточной матрицы – относительную короткую последовательность, направляющую трансляцию исключительно по кеп-зависимому сканирующему механизму. Безлидерная мРНК c1lacZ устроена следующим образом: после инициаторного триплета, который находится на самом 5’ конце этой мРНК (не считая одного остатка G для более эффективного проведения T7-транскрипции) расположены 13 первых триплетов открытой рамки считывания белка c1 фага λ, после которой следует кодирующая часть β-галактозидазы. 9 1.2.2. Трансляция мРНК актина с добавлением различного количества моноклональных антител к белку p40 Мы добавляли к трансляционной системе, не содержащей мРНК, 0, 0.25, 0.4, 0.5 и 1.5 мкг антител против белка p40. Реакционную смесь преинкубировали, после чего добавляли мРНК и проводили трансляцию в течение 1 часа. На рисунке 5 представлены результаты проведенного эксперимента. Видно, что при повышении концентрации антител количество синтезированного белка значительно уменьшается. Следовательно, антитела к исследуемому белку р40 подавляют трансляцию, протекающую по кеп-зависимому механизму. На данном этапе, мы не можем делать вывод о необходимости белка p40 именно для кеп-зависимой трансляции. Вполне возможно, что, связавшись с белком-мишенью, антитела чисто стерически мешают связыванию малой субчастицы рибосомы с мРНК и трансляции в целом. Тем не менее, данный эксперимент уже позволяет сделать некоторые выводы: 1) мишенью на 40S субчастицах для используемых моноклональных антител является эпитоп, который располагается на поверхности белка р40, обращенной в раствор; 2) антитела к белку p40 мешают трансляции мРНК β-актина. 1.2.3. Трансляция мРНК вируса гепатита С с добавлением различного количества антител к белку p40 Трансляцию проводили так же, как и эксперимент с мРНК актина. Как мы видим на рисунке 5, здесь наблюдается та же зависимость, что и при использовании матричной РНК актина: при повышении концентрации антител количество белка-продукта понижается. На основе проделанного эксперимента мы можем сделать вывод, что антитела против рибосомного белка p40 подавляют трансляцию, протекающую и по IRES-зависимому механизму. Этот факт подкрепляет ранее сделанные наблюдения, что белок p40 в малой субчастице рибосомы находится в области связывания субчастицы с IRES-элементом РНК вируса гепатита С. 1.2.4. Трансляция безлидерной мРНК фага с добавлением различного количества антител к белку p40 Как уже было сказано ранее, безлидерная мРНК перед инициаторным кодоном не имеет никакой последовательности, кроме одного гуанилового остатка. Ее трансляция может инициироваться двумя различными способами: путем канонического образования 48S-инициаторного комплекса и путем прямого связывания с 80S-рибосомой. Во втором случае инициация осуществляется без участия каких-либо факторов инициации трансляции. 10 Трансляцию безлидерной мРНК проводили при тех же условиях, что и две предыдущие матрицы, с добавлением таких же количеств антител. Рис.5. Эффективность трансляции безлидерной мРНК, либо мРНК, содержащей 5’-НТО HCV или актина, при добавлении различных количеств моноклональных антител против белка p40. Результаты эксперимента показали, что антитела к р40 совершенно не способны ингибировать трансляцию безлидерной мРНК (рис.5). Из этого можно сделать два важных вывода. Во-первых, антитела против белка p40 не мешают ни элонгации, ни терминации трансляции, ни стерически, ни как-либо другим способом. Во-вторых, Результаты выполненных экспериментов показали, что, несмотря на довольно умеренный вклад белка p40 в образование бинарного комплекса, его блокирование в малых субчастицах рибосом подавляет IRES- и кеп-зависимую трансляцию. Что касается более конкретной функциональной роли белка р40, то следует еще раз вспомнить, что трансляция безлидерной мРНК может протекать в отсутствие каких-либо факторов инициации трансляции. Следовательно, можно предположить, что роль р40 как раз и заключается в связывании одного из факторов инициации трансляции. В пользу этого говорит тот факт, что его дрожжевой гомолог – белок S0 – может взаимодействовать с двумя субъединицами фактора инициации eIF3: Tif32 и Nip1. С другой стороны, вряд ли в лизате ретикулоцитов инициация трансляции на безлидерной мРНК осуществляется исключительно по бесфакторному механизму. Известно, что область мРНК в 5’-сторону от инициаторного кодона контактирует в составе 48S-комплекса с факторами инициации eIF2 и eIF3, а также рибосомной мРНК и рибосомными белками S5, S14, S26 и S28. В то же время, как следует из последних моделей малой субчастицы эукариотических рибосом, 11 Rps0 расположен в области «выхода» мРНК и, возможно, даже способен с ней контактировать. Таким образом, более реалистичным выглядит предположение о том, что связывание антител к p40 с рибосомой препятствует корректному взаимодействию 5’НТО мРНК с 40S субчастицей и/ или факторами инициации. Полученные результаты, вкупе с результатами наших коллег, представленными в опубликованной статье, являются первыми свидетельствами, указывающими на роль белка p40 в инициации трансляции по кеп-независимому механизму. 2. Инициация трансляции на мРНК вируса гепатита С: влияние области нт. 1-41 на работу IRES’а Традиционно IRES-элементом мРНК вируса гепатита С принято считать участок 5’НТО с 42 по 342 нуклеотид, который включает домены II, III и IV этой 5’-НТО. Важная роль предшествующих IRES’у 5’-проксимальных 40 нуклеотидов (так называемый домен I 5’-НТО) в репликации вируса ни у кого не вызывает сомнений, однако возможное участие их в трансляции вирусной мРНК до сих пор остается предметом дискуссий. В последнее время роль домена стали рассматривать с новой стороны в связи с нахождением в нѐм сайтов связывания специфичной печеночной микроРНК miR-122, которая по одним данным стимулирует работу IRES-элемента, а по другим данным - нет. В литературе в ряде работ домен I ингибировал трансляцию, в некоторых – стимулировал, поэтому целью наших исследований было разобраться в вопросе о роли домена I в функции IRES-элемента РНК HCV и проверить различные выдвигаемые в литературе гипотезы о механизме регуляции трансляции этим участком 5’НТО HCV. 2.1 Исследование влияния различных мутаций домена I на работу IRES’а HCV 2.1.1. Создание мутантных конструкций Чтобы изучить роль домена I в инициации трансляции мРНК HCV мы создали на основе плазмиды pGL3R ряд молекулярно-генетических конструкций, содержащих в качестве репортерного ген люциферазы светлячка, вирусную 3’-НТО HCV и различные варианты вирусной 5’-НТО со введенными мутациями: 1) HCV-3’utr – полноразмерная немутированная конструкция; 2) HCV-ΔIa-3’utr – конструкция с удаленным субдоменом Ia (удалена только шпилька домена I); 3) HCV- ΔIab-3’utr – конструкция с полностью удаленным доменом I (удалены и шпилька и спейсер, конструкция начинается ровно с домена II IRES’а, с нт 42); Матрицы для транскрипции in vitro получали методом ПЦР. 12 2.1.2. Удаление домена I повышает эффективность IRES-зависимой трансляции в in vitro. Первоначально мы проанализировали эффекты введенных мутаций на трансляцию in vitro. Полученные мРНК транслировались в цитоплазматическом экстракте асцитной карциномы Кребс-2. Данная система пригодна для изучения трансляции эукариотических мРНК в гораздо большей степени, чем традиционно используемый ретикулоцитов кролика. лизат Эффективность трансляции определяли по ферментативной активности гена-репортера при помощи набора фирмы Promega. Чтобы отличать специфическую HCV IRES-зависимую трансляцию от других способов инициации трансляции (см. далее), в качестве одного из контролей использовалась та же система, но с добавлением мутанта Рис. 6 Диаграмма результатов трансляции в экстракте S30 асцитной карциномы Кребс-2. Все результаты нормированы к значениям для трансляции конструкции HCV-3’UTR. доминантно-негативного хеликазы полностью eIF4A R362Q. Он подавляет трансляцию, процесс сканирования. включающую Эффект добавления белка R362Q смотрели при параллельной контрольной трансляции всех мРНК с добавлением эквимолярного количества очищенного eIF4A дикого типа, чтобы убедиться, что само по себе добавление белка (или каких-либо компонентов буферного раствора) не влияет на работу трансляционной системы. Как видно на диаграмме, полное удаление домена I стимулирует трансляцию почти в 2 раза, причем добавление в трансляционную смесь белка R362Q не меняет этого соотношения. Удаление же одной шпильки Ia мало влияет на работу IRES’а. Из этих данных, можно однозначно сделать вывод, что домен I 5’-НТО HCV не является необходимым для трансляции элементом. И даже наоборот ингибирует ее. 2.1.3. Удаление домена I повышает эффективность IRES-зависимой трансляции в 4 раза – в клетках печени человека и в 2 раза – в непеченочных клетках. Одинаковые количества (по 400 нг) А-кепированных мРНК трансфицировали в клетки HEK293T (клетки почек эмбриона), а также HepG2 и Huh7 (обе линии - клетки гепатомы) человека. Трансфекцию осуществляли липофильным агентом Унифектин-56. 13 Чтобы учесть возможную разницу в эффективности трансфекции и лизисе клеток, вместе с исследуемой мРНК мы котрансфицировали по 20 нг кепированной мРНК, кодирующей люциферазу Renilla reniformis. В соответствии в результатами экспериментов in vitro полное удаление домена I повышает уровень трансляции и in vivo. мРНК HCV-ΔIa-3’utr ведет себя менее однозначно: как и in vitro мы наблюдаем небольшое подавление трансляции в клетках HEK293T, тогда как в обеих линиях клеток гепатомы человека она транслируется практически на одном уровне с мРНК дикого типа. В любом случае из совокупности данных in vitro и in vivo можно заключить, ингибирующий что эффект домена I на трансляцию связан в основном с межшпилечной областью (нуклеотиды 21-41), то есть с областью Ib, при этом, вопреки некоторым предположениям литературе, Рис. 7. Сравнение трансляционной эффективности IRES’a HCV с удаленными доменами Ia и Iab в присутствии и отсутствие кодирующей части. открытой считывания в начало рамки вирусного полипептида не влияет на трансляцию. Можно было бы предположить, что наличие домена I или только Ib влияет на способность IRES’а связывать малую субчастицу рибосомы, что является первым этапом в инициации трансляции на мРНК HCV. Чтобы проверить это предположение, мы сравнили фрагментов эффективности мРНК HCV образования с малой бинарных субчастицей комплексов рибосомы соответствующих методом связывания рибонуклеопротеидных комплексов с нитроцеллюлозной мембраной: 40S субчастицы рибосом инкубировали с радиоактивно меченными мРНК HCV, после чего полученные комплексы пропускали через нитроцеллюлозную мембрану. При этом, как известно, несвязанная с рибосомами РНК мембраной не задерживается. Проанализировав радиоактивность, задержанную мембраной, можно определить количество связавшейся РНК, иколичественно оценить сродство разных РНК к рибосомным субчастицам в исследуемых комплексах. 14 Как следует из данных, приведенных на рис.8, наличие полноразмерного домена I либо только лишь его субдомена Ib не влияют на аффинность IRES’а к малой субчастице рибосомы. Таким образом, мы можем заключить, что домен I 5’-НТО мРНК HCV ингибирует трансляцию мРНК от 2 (в непеченочных клетках) до 4-5 (в печеночных клетках) раз, причем удаление домена не влияет способность IRES’а взаимодействовать Рис.8 Изотермы связывания малых субчастиц рибосом с субчастицей на с рибосомы. малой Различный IRES-элементами HCV дикого типа и его уровень стимуляции трансляции в мутантными вариантами ΔIa и ΔIab. печеночных и непеченочных клетках наводит на мысль о возможной тканеспецифичности его работы. Можно предположить, что с доменом I связываются какие-то белки, что приводит к снижению эффективности трансляции. Причем, следует отметить, что конструкция HCV-ΔIa-3’utr транслируется практически наравне с РНК дикого типа, что указывает на важность именно межшпилечной области (Ib). Эти данные противоречат имющемуся в литературе предположению о стимуляции трансляции HCV печеночной микроРНК miR122, взаимодействующей с удаленной нами межшпилечной областью. 3. Инициация трансляции на мРНК вируса гепатита С: роль 3’-НТО Роль 3’-НТО мРНК HCV в трансляции до сих пор однозначно не определена. Если же 3’-НТО стимулирует IRES-зависимую трансляцию, то ничего неизвестно о возможном механизме такой стимуляции. 3’-НТО вируса гепатита С уникальна среди вирусов, содержащих гепатитоподобные IRES’ы. Она чрезвычайно консервативна и имеет уникальную трехчастную структуру: поли(U/UC) тракт, вариабельную часть и так называемую область X-region, представляющую собой 3 шпильки. Учитывая эти обстоятельства, мы решили посмотреть, насколько специфична стимуляция 3’-концом для IRES’а именно гепатита С, а также проверить гипотезу о тканеспецифичности такой стимуляции. Последний аспект особенно важен, поскольку вирус HCV реплицируется в клетках печени. 3.1 Создание химерных конструкций Мы создали несколько химерных моноцистронных мРНК, содержащих в качестве репортерного ген люциферазы светлячка. В 5’-НТО такие конструкции содержали либо IRES вируса гепатита С, либо схожий по вторичной и третичной структуре IRES PTV-1, 15 либо совершенно отличный от HCV и PTV-1 IRES EMCV, либо же кепированную 5’-НТО канонической эукариотической мРНК β-актина. Следует особо подчеркнуть, что хотя IRES PTV-1 и похож на IRES HCV, этот вирус относится к совершенно другому семейству – семейству пикорнавирусов. Таким образом, мы предполагали проверить, является ли стимуляция 3’-НТО специфичной для HCV-подобных IRES-элементов. В 3’НТО наши конструкции содержали либо исследуемую 3’-НТО HCV, либо случайную последовательность длиной ок. 200 нуклеотидов, либо ее же, но содержащую также поли(А)-хвост, характерный для эукариотических мРНК (рис. 9). Рис. 9 Схематическое изображение созданных химерных конструкций. 3.2 3’-НТО вируса гепатита С не стимулирует трансляцию, направляемую как IRES’ом HCV, так и IRES’ом PTV-1 in vitro Для начала нам необходимо было определиться с трансляционной системой, в которой проводились бы дальнейшие исследования. В первоначальных опытах, проведенных в стандартных in vitro системах, таких как лизат ретикулоцитов кролика или цитоплазматический экстракт клеток мышиной асцитной карциномы Кребс-2, 3’-НТО мРНК HCV не стимулировал трансляцию, направляемую IRES’ом HCV (данные не представлены). Таким образом, эти трансляционные системы не подходят для наших исследований, т.к. мы не наблюдали эффекта стимуляции 3’-НТО HCV in vitro. 16 3.3 3’-НТО вируса гепатита С стимулирует трансляцию, направляемую как IRES’ом HCV, так и IRES’ом PTV-1 in vivo Мы трансфицировали химерные мРНК, содержащие IRES HCV или PTV-1 в 5’-НТО и неспецифическую последовательность или 3’-НТО HCV с 3’-конца, в клетки линии Huh7, HeLa и HEK293T. Эффективность трансфекции анализировали стандартным описанным ранее способом: контрансфекцией кепированной мРНК Renilla reniformis. Результаты показали, что 3’-НТО HCV в 5-6 раз стимулирует трансляцию, направляемую как IRES’ом HCV, так и IRES’ом PTV-1 (рис.10). Кроме того, мы не обнаружили и тканеспецифичности этого эффекта. 3’-НТО HCV почти так же эффективно стимулирует трансляции обоих IRES’ов и в непеченочных клетках: в 4-6 раз в HeLa и в 3,5-5 раз – в HEK293T. Полученные результаты представляют интерес и потому, что PTV является представителем не семейства Flaviviridae, а Picornaviridae и, помимо структуре различий в кодируемого полипептида, отличается от Рис. 10 Стимуляция трансляция мРНК 3’НТО HCV in vivo в клетках линий Huh7, HeLa и HEK293Т. HCV структурой 3’-НТО: она полиаденилирована, что характерно для пикорнавирусов. Поэтому результаты наших экспериментов показывают, что нет никакого специфического взаимодействия между структурами 5’-и 3’нетранслируемых областей HCV. 3.4 Удаление разный областей 3’-НТО HCV снижает эффективность IRES-зависимой трансляции 17 Как мы уже говорили, 3’-НТО HCV сильно структурирована и состоит из трех частей: вариабельной части, поли(U/UC)-тракта и Х-области, образующей три шпильки на самом конце РНК. Мы решили изучить вклад каждой из областей в стимуляцию трансляции 3’-НТО HCV. Для этого у РНК удаляли различные фрагменты 3’-НТО по отдельности либо вместе и смотрели, как эти делеции сказываются на стимуляции трансляции. Рис. 11 Влияние удаления различных частей 3’-НТО HCV на стимуляцию трансляции: ВО – вариабельной области, U/UC – поли(U/UC)-тракта, и X – X-области. Как мы видим на рисунке, удаление Х-области снижает стимуляцию трансляцию, направляемую как IRES’ом HCV (в 3 раза), так и PTV-1 (в 2 раза) обоих линиях клеток, HeLa и Huh7. Удаление поли(U/UC)-тракта как индивидуально, так и совместно с удалением вариабельной части также в обоих случаях сказывается на стимуляции трансляции, хотя и в меньшей степени (снижение на ~30-40%), чем удаление Х-области. Что касается удаления вариабельной части, то здесь мы наблюдаем небольшое подавление трансляции, направляемой IRES’ом HCV (~30%) и практически отсутствие какого-либо эффекта в стимуляции трансляции РНК, содержащей IRES PTV-1. Данные эксперимента позволяют сделать вывод, что Х-область и поли(U/UC)тракт неспецифически задействованы в процессе трансляции. К наличию же вариабельной части чувствительна лишь трансляция, направляемая IRES’ом HCV. Возможно, это указывает на специфичность взаимодействия 5’-и 3’-нетранслируемых областей. Однако, никаких данных о специфической роли вариабельной части в трансляции мРНК вируса гепатита С 18 в литературе нет. Предположить же механизм по результатам этого эксперимента довольно сложно. 3.5 Стимуляция трансляции 3’-НТО HCV не является следствием разной стабильности мРНК Давно известно, что вклад в трансляционную эффективность могут давать два фактора: собственно эффективность трансляции и стабильность мРНК. естественно, что когда речь идет о сравнении эффективности Вполне трансляции трансфицированных мРНК, сразу встает вопрос: не может ли разный уровень трансляции быть обусловленным различной их стабильностью? Чтобы изучить возможную роль 3’НТО в стабилизации исследуемых мРНК, мы использовали метод ПЦР в реальном времени. Мы трансфицировали мРНК, содержащие IRES HCV, в клетки линии Huh7 нелипофильным реагентом (ExGen 500), а затем через разное время (2, 4, 6 и 8 часов) после трансфекции экстрагировали суммарную РНК из половины клеток, в то время как вторую половину использовали для измерения активностей репортерных белков. Рис. Анализ 12 стабильности репортерных мРНК количественным ПЦР’ом в реальном времени. На этом же графике представлен анализ стимуляции трансляции во времени. Как видно на рисунке, стабильность исследуемых мРНК примерно одинакова, несмотря на различный уровень их трансляции (рис. 12). Таким образом, эффекты, оказываемые 3’-НТО РНК HCV на трансляцию, не связаны с различиями в стабильности, а связаны именно с трансляцией, как таковой. 3.4 Стимуляция трансляции 3’-НТО HCV не зависит от механизма инициации. Мы заменили вирусную 5’-НТО на кепированную 5’-НТО мРНК β-актина и обнаружили, что в клетках линии Huh7 3’-НТО вируса гепатита С также стимулирует и 19 кеп-зависимую трансляцию. Причем, стимуляция примерно на том же уровне и стимуляции полиА-хвостом (рис.13). Такие же результаты были получены и для трансляции, осуществляемой не родственным Рис.13 Стимуляция трансляции мРНК, содержащих 5’НТО мРНК бета-актина и вируса энцефаломиокардита, 3’нетранслируемой областью мРНК HCV и поли(А)-хвостом. гепатиту IRES’ом EMCV. Как мы видим, 3’-НТО HCV наравне с полиаденилированным хвостом стимулирует как кеп-зависимую трансляцию, так и трансляцию, направляемую IRES’-ом EMCV, что указывает на полное отсутствие специфического взаимодействие со структурами в 5’-НТО мРНК. Интересно, что мы наблюдали и обратный результат: полиА-хвост стимулирует трансляцию, направляемую IRES’ом HCV, хотя и в чуть меньшей степени, чем 3’-НТО HCV. Полученные опровергают нами результаты довольно распространенное широко мнение о специфичности стимуляции трансляции 3’-НТО HCV. Возможно, наличие 3’НТО подобно HCV, вовлекает в процесс полиА-хвосту, трансляции дополнительные факторы. Однако стоит отметить, что несмотря на множество Рис. 14 Диаграммы стимулации трансляции мРНК HCV и PTV поли(А)-хвостом в различных клеточных линиях. гипотез о значении взаимодействия 3’НТО HCV с различными РНК- связывающими белками, ни одна из них не получила однозначного экспериментального подтверждения. Это касается в первую очередь таких белков как La-аутоантиген и PTB. Хотя, возможно, оба белка могут взаимодействовать как с 5’-НТО HCV, так и с полипиримидиновым участком 3’-НТО, их участие в вирусной трансляции довольно сомнительно. Интересно, что в отличие от экспериментов in vivo, трансляции in vitro в двух разных системах не показали даже слабой стимуляции 3’-нетранслируемой область HCV. Этот 20 факт наводит на мысль о том, что роль 3’-НТО в трансляции может заключаться не во взаимодействии с какими-либо специфическими или неспецифическими факторами, способствующими трансляции, либо же в доставке мРНК в определенный клеточный компартмент. На это может указывать и стимуляция IRES-зависимой трансляции in vitro полиА-хвостом (рис.14). Таким образом, результаты этой части работы показали, что 3’-НТО вируса гепатита С стимулирует как IRES-зависимую, так и кеп-зависимую трансляцию in vivo в клетках различных тканей человека от 2 (в случае актина и IRES’a EMCV) до 6 (в случае IRES’ов HCV и PTV-1) раз. Эта стимуляция не является тканеспецифичной. В свою очередь полиА-хвост также неспецифически стимулирует трансляцию, направляемую IRES’ом HCV в печеночных и непеченочных клетках в ~3,5 раза. Это ставит вопрос о существовании в живых клетках механизмов стимуляции трансляции, которые совершенно не проявляются в бесклеточных системах. Одним из таких механизмов, как уже указывалось выше, может быть направление РНК в компартмент, благоприятный для инициации трансляции, например из-за того, что там концентрируются какие-то ключевые факторы трансляции. Другое объяснение, совместимое с только что приведенным, состоит в том, что 3’ НТО HCV способен неспецифически “привлекать” фактор(ы) трансляции, тем самым создавая их повышенную концентрацию в гипотетическом компартменте, где происходит инициация трансляции на тестируемой мРНК. ВЫВОДЫ 1. Исследовано взаимодействие IRES-элемента РНК вируса гепатита С с 40S субчастицами рибосом человека. Показано, что блокирование рибосомного белка p40 моноклональными антителами практически полностью подавляет трансляцию, направляемую этим IRES-элементом. 2. Первые 40 нуклеотидов 5’-нетранслируемой области РНК вируса гепатита С не являются необходимыми для трансляции и даже, наоборот, ингибируют работу IRES-элемента HCV в 2-4 раза. Основной вклад в это ингибирование вносит область между доменом I и доменом II, который уже входит в состав IRESэлемента. 21 3. Показано, что в случае кепирования 5’-нетранслируемой области РНК вируса HCV она может направлять трансляцию как по IRES-зависимому, так и по сканирующему механизму. 4. Показано, что в отличие от экспериментов in vivo 3’-нетранслируемая область мРНК HCV не стимулирует IRES-зависимую трансляцию in vitro в различных бесклеточных системах. 5. 3’-нетранслируемая область мРНК HCV стимулирует трансляцию in vivo независимо от того использует ли тестируемая мРНК кеп-зависимый или IRESзависимый механизм инициации синтеза белка. Стимулирующий эффект не является тканеспецифичным и наблюдается как в печеночных, так и в клетках другого происхождения. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. С.Е. Дмитриев, Д.Е. Андреев, З.В. Адьянова, И.М. Теренин, И.Н. Шатский (2009). Эффективная кеп-зависимая трансляция мРНК млекопитающих с длинными и сильно структурированными 5’-нетранслируемыми областями in vivo и in vitro. Мол. Биол., 43 (1), 119-125. 2. А.А. Малыгин, З.В. Бочкаева, Е.И. Бондаренко, О.А. Косинова, В.Б. Локтев, И.Н. Шатский, Г.Г. Карпова (2009). Связывание IRES-элемента РНК вируса гепатита С с 40S субчастицей рибосомы: роль белка p40. Мол. Биол., 43 (6), 1070-1076. 3. C. Bung, Z. Bochkaeva, I. Terenin, R. Zinovkin, I. Shatsky, M. Niepmann (2010). Influence of the hepatitis C virus 3’-untranslated region on IRES-dependent and capdependent translation initiation. FEBS Lett., 584(4), 837-842. 4. Z. Bochkaeva, I. Terenin, D. Andreev, S. Dmitriev, I. Shatsky (2010). Two modes of translation of single mRNA. The meeting “Ribosomes 2010”, 3-7 May 2010, Italy. 22
