молекулярная биотехнология

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ
БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«НИЖЕГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ
УНИВЕРСИТЕТ им. Р.Е. АЛЕКСЕЕВА»
Кафедра «Нанотехнологии и биотехнологии»
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ
Методические указания по организации самостоятельной работы студентов
по дисциплине «Молекулярная биотехнология»,
обучающихся по направлению
19.04.01 «Биотехнология» дневной формы обучения
Нижний Новгород 2015
1
Составители: Т.Н. Соколова, О.В. Кузина, А.А. Калинина, В.Р. Карташов
УДК 541.1
Молекулярная биотехнология: метод. указания к организации самостоятельной работы студентов по дисциплине «Молекулярная биотехнология», обучающихся по направлению 19.04.01 «Биотехнология» дневной
формы обучения/ НГТУ; сост.: Т.Н. Соколова и др., Н. Новгород, 2015. – 12
с.
Методические указания предназначены для самостоятельной работы
студентов по дисциплине «Молекулярная биотехнология».
В пособие даны рекомендации для самостоятельного изучения теоретического курса дисциплины и подготовки к промежуточному контролю.
Редактор Э.Б. Абросимова
Подписано в печать 10.03.2013. Формат 60 841/16. Бумага газетная.
Печать офсетная. Усл. п. л. 0,5. Тираж 80 экз. Заказ
.
Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева.
Типография НГТУ. 603950, г. Нижний Новгород, ул. Минина, 24.
Нижегородский государственный технический
университет им. Р.Е. Алексеева, 2015
2
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Дисциплина «Молекулярная биотехнология» входит в цикл дисциплин ОП
подготовки магистров по направлению 19.04.01 Биотехнология программе «Промышленная биотехнология и биоинженерия» вариативная часть, дисциплина по
выбору студента. Для успешного освоения курса необходима подготовка до
уровня бакалавра и желательно прохождение таких биологических дисциплин как
биохимия, микробиология, биотехнология.
В задачи курса «Молекулярная биотехнология» входит изучение общих
принципов конструирования рекомбинантных организмов; получение современных представлений о способах выявления, переноса и экспрессии целевого гена, а
также получения и выделения целевого продукта; изучение возможностей использования трансгенных организмов – от бактерий до растений и животных;
знакомство с правовыми аспектами и проблемами биобезопасности при использовании генномодифицированных организмов.
Это определяет основные направления самостоятельной работы студентов –
ознакомление с последними достижениями в области генетической инженерии
(интернет-ресурсы, научные периодические издания), самостоятельное изучение
тем, которым на лекциях уделяется недостаточное внимание, подготовка к контрольной работе.
3
1. СТРУКТУРА САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
На самостоятельную работу по дисциплине «Молекулярная биотехнология»
по учебному плану отводится 90 часов, которые отводятся на изучение теоретического курса дисциплины, включая подготовку к практическим занятиям. Теоретический курс включает четыре модуля – «Основы молекулярной биотехнологии», «Основные молекулярные генетические механизмы», «Технология рекомбинантных ДНК», «Трансгенные растения и животные».
2. МЕТОДИКА РЕАЛИЗАЦИИ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
ПО ИЗУЧЕНИЮ ТЕОРЕТИЧЕСКОГО КУРСА
Теоретический материал осваивается студентами, как в ходе прослушивания лекций, так и самостоятельного изучения теоретического курса и решения задач.
В программе дисциплины выделен раздел для самостоятельного изучения
теоретического материала. Для этого по каждому разделу (модулю) дисциплины
обозначены конкретные темы и дан список рекомендованной литературы. Для
самостоятельной работы студентами используются источники из списка рекомендованной литературы и электронные ресурсы, доступ к которым обеспечивается в
электронных читальных залах библиотеки.
Приведен список контрольных вопросов для подготовки к экзамену и тестовые задания для проверки знаний при промежуточной аттестации.
2.1 Перечень тем теоретического цикла для самостоятельного изучения
Принципы конструирования рекомбинантных организмов
История генетической инженерии. Виды генетической инженерии – клеточная, хромосомная и генная инженерия. Проблемы, решение которых возможно
с применением генетической инженерии. Технологии рекомбинантных ДНК и
общие принципы конструирования промышленно важных продуцентов для биотехнологии. Молекулярные основы генной инженерии. Источники генов для целевых продуктов.
Основные типы клонирующих векторов. Общая схема вектора на примере
бактериальной экспрессионной плазмиды. Использование регуляторных элементов репликации и биосинтеза для конструирования векторов: сайты инициации
репликации, маркерные гены - гены для селекции векторов и репортерные гены,
4
регулируемые промоторы и другие регуляторные элементы экспрессии целевого
гена. Использование внехромосомных элементов, подвижных генетических элементов и вирусов для конструирования векторов. Временная (транзиентная) экспрессия и интеграция в хромосому. Идентификация и изоляция рекомбинантных
организмов.
Мечение нуклеиновых кислот (типы меток - радиоактивные и флуоресцентные, мечение концов, трансляция ника). Гибридизация нуклеиновых кислот.
Гель-электрофорез. Секвенирование ДНК. Принципы секвенирования ДНК. Подготовка фрагментов ДНК – метод контига и метод дробовика. Секвенирование
Maксама-Гилберта (химическое). Секвенирование Сэнгера-Коулсона (дидезоксиили ферментативное). Электрофорез и чтение сиквенсов. Автоматизация секвенирования ДНК.
Ферменты молекулярного клонирования: Биология и активность эндонуклеаз рестрикции. Системы рестрикции-модификации. Последовательности узнавания для ферментов рестрикции. Участки ДНК, разрезанные ферментами рестрикции. Разрезание ДНК эндонуклеазами рестрикции. Рестрикционное картирование. Создание карты путем расщепления ДНК с помощью нескольких рестриктаз. Создание карты по частичному расщеплению маркированной на конце ДНК.
Использование компьютера для создания карт рестрикции. ДНК лигирование.
Факторы, влияющие на активность ферментов рестрикции. ДНК полимеразы.
Термостабильная ДНК-полимераза. Терминальная трансфераза. Обратные транскриптазы. Бактериофаг РНК полимераза. Нуклеазы: ДНКаза и РНКаза. ДНКлигаза. Полинуклеотидкиназа.
Самостоятельное изучение:
Введение рекомбинантных ДНК и РНК в реципиентные клетки: биологические, химические, физические, механические методы. Трансформация, трансфекция с помощью вирусов, электропорация, липосомы, микроинъекция и бомбардировка микрочастицами. Решение задач по темам: ферменты молекулярного клонирования, получение генов для клонирования.
Вопросы для промежуточного контроля:
1. Что такое эндонуклеазы рестрикции типа II и почему они так важны для
технологии рекомбинантных ДНК?
2. Опишите применение плазмиды pBR322 в качестве вектора. Какими особенностями она обладает?
3. Зачем рестрицированную плазмидную ДНК перед лигированием часто
обрабатывают щелочной фосфатазой?
4. Что такое линкер и адаптер? Где их используют?
5
5. Что такое дидезоксинуклеотиды? Как с их помощью определяют нуклеотидную последовательность ДНК?
6. Какая реакция катализируется ферментом обратной транскриптазой? Как
этот фермент используется в рекомбинантных ДНК-технологиях?
7. Что такое ДНК-микрочипы, и как они используются в функциональной
геномике?
Экспрессия и выделение целевых белков
Проблемы экспрессии чужеродных генов в целевом организме. Причины
использования разнообразных систем (простейшие, растения и животные) для
биопродукции белков. Гетерологичная экспрессия, пострансляционные модификации и получение функционально активных аутентичных белков. Гликозилирование рекомбинантных белков в зависимости от клетки-хозяина. Стабилизация
целевых продуктов в клетке.
Конструирование секретирующих организмов. Активное использование регуляторных особенностей биосинтеза белка для оптимизации конструкции генноинженерных организмов.
Самостоятельное изучение:
Метаболическая инженерия. Использование естественных систем биосинтеза и хранения запасных веществ организма-хозяина для конструирования продуцентов целевых продуктов. Выделение генетически-модифицированных организмов и проблема удаления маркерных генов. Метаболическая перегрузка. Тельца
включения.
Вопросы для промежуточного контроля:
1. Почему плазмидный вектор с максимально сильным промотором не всегда является наилучшим экспрессирующим вектором?
2. Иногда стратегия синтеза белка-мишени включает получение этого белка
в составе гибридного продукта. В чем преимущество такого подхода? Как создают гибридный белок?
3. Что такое тельца включения и как избежать их образования?
4. В чем преимущество локализации чужеродных белков на поверхности
клеток? Какие стратегии используются для того, чтобы сделать белки секретируемыми?
5. Предложите несколько способов снижения метаболической перегрузки E.
coli, синтезирующих в большом количестве рекомбинантный белок.
6. Почему для получения белков, использующихся в медицине, лучше применять эукариотические, а не прокариотические системы?
7. Что такое аффинная метка? Для чего ее используют?
6
8. Какие функции важны для бактериального вектора клонирования? Зачем
вектор имеет более одного сайта клонирования?
9. Опишите двухгибридную систему, которая использует дрожжевой GAL4
белок, и объясните, как двухгибридная система обнаруживает взаимодействие
между белками.
Генетически важные продуценты
Генно-инженерные организмы в хозяйственной деятельности человека и
перспективы их дальнейшего использования. Особенности использования генномодифицированных микроорганизмов, животных и растений.
Дрожжевые системы экспрессии. Клетки насекомых и бакуловирусы для
синтеза целевых белков.
Использование рекомбинантных микроорганизмов различных систематических групп для получения коммерческих продуктов (ферменты, инсулин, гормон роста, интерфероны, моноклональные антитела и т.д.). Использование трансгенных микроорганизмов в медицине, биомассы ГМ-микроорганизмов и производимых ими ферментов, и добавок в пищевой и кормовой промышленности, в качестве продуктов питания. Биоремедиация. Применение трансгенных животных:
научные модели, модели для изучения болезней человека, источники для производства фармацевтических препаратов, ксенотрансплантантов и пищи. Использование трансгенных растений в фундаментальных исследованиях, создании принципиально новых сортов сельскохозяйственных культур, производство биологически активных веществ для медицины, ветеринарии и субстратов для промышленности
Самостоятельное изучение:
Эукариотические системы экспрессии - линия СНО, SP2/0, MEL, COS. Белоксинтезирующие системы клеток с нарушенной проницаемостью внешних
мембран, бесклеточные системы – прокариотические и эукариотические, проточные системы
Вопросы для промежуточного контроля:
1. Что такое трансгенные организмы? Каково практическое применение
трансгенных организмов?
2. Объясните роль рекомбинации в нацеливании гена в эмбриональных
стволовых клетках. Как нацеливание гена может быть использовано для создания
"нокаутных" мутаций?
3. Эксперимент по функциональной геномике проводится с использованием
ДНК-микрочипов для анализа уровня экспрессии генов в бактерии. Какие гены
7
вы ожидаете обнаружить избыточно экспрессируемыми в клетках, выращенных
на минимальной среде по сравнению с клетками, выращенными на полной среде?
4. Вы хотите ввести человеческий ген инсулина в бактериальную клеткухозяина в надежде на производство большого количества человеческого инсулина. Что вы используете – геномную ДНК или кДНК? Объясните ваши рассуждения.
5. В чем состоит экономическое преимущество использования генномодифицированных растений и животных в качестве «биореакторов»?
Трансгенные растения и животные
Трансгенные растения и животные как биореакторы для получения ценных
для промышленности и медицины органических соединений. Конструирование
трансгенных растений. Векторные системы для растений на основе Ti-плазмид и
фитовирусов. Культуры растительных клеток. Биопродукция ценных для промышленности и медицины органических соединений в растениях и растительных
клетках. Преимущества и проблемы биопродукции в растительной системе. Метаболическая инженерия растений. Создание растений, устойчивых к болезням,
вредителям (растения, синтезирующие инсектициды), гербицидам (на примере
раундапа). Изменение пищевой ценности и внешнего вида растений. Повышение
продуктивности и устойчивости к внешней среде.
Технологии создания трансгенных животных. Сложность и длительность
создания трансгенных животных. Использование искусственных хромосом для
переноса генов. Использование модифицированных эмбриональных стволовых
клеток. Клонирование переносом ядра. Трансгенные животные как «биореакторы» биологически активных веществ.
Самостоятельное изучение
Направленный или сайт-специфический мутагенез (Получение делеций и
вставок, химический мутагенез, система сопряженного праймирования для мутагенеза, системы циклического отбора мутантных ДНК метод кассетного мутагенеза ПЦР в направленном мутагенезе).
Белковая инженерия (Библиотеки пептидов и эпитопов, белки-репортеры в
гибридных белках, бесклеточные белоксинтезирующие системы, прокариотические, эукариотические, проточные системы синтеза белка, создание новых ферментов).
Генетически-модифицированные продукты - мифы и реальность. Коммерциализация трансгенных растений и биобезопасность. Регулирование производства и сертификация генно-модифицированного сырья и пищевых продуктов.
8
2.2 Перечень контрольных вопросов
1. Идентификация и отбор ГМ-клеток и организмов.
2. Вирусная трансдукция.
3. ГМО-технологии. Генетическая инженерия. Молекулярное клонирование.
4. Источники рисков при создании и использовании ГМО.
5. Клонирование генов.
6. Получение рекомбинантных ДНК.
7. Масштабы распространения ГМО в мире. Перспективы ГМО технологий.
8. Трансгенная, ксеногенная, цисгенная и интрагенная трансформации.
9. Векторы для переноса генов. Характеристика основных групп.
10. Структура агробактериальных Ti и Ri-плазмид. Нопалиновая и октопиновая
Ti-плазмиды.
11. Селективные/репортерные гены первого, второго и третьего поколений.
12. Физические методы введения рекомбинантных ДНК в клетку.
13. Транспластомная и митохондриальная трансформация.
14. Агробактериальная трансформация растений.
15. Биобезопасность. Контроль за использованием и распространением ГМО.
16. Способы клонирования трансформированных клеток бактерий, грибов, растений, животных.
17. Генная инженерия и селекция. Цели создания ГМ-сортов растений, пород животных, штаммов микроорганизмов.
18. Бактериальная трансформация.
19. Ферменты синтеза рекомбинантных ДНК.
20. Полимеразная цепная реакция.
21. Трансгенные продукты, лекарства, вакцины. Достоинства и недостатки.
Способы получения.
22. Генная инженерия и молекулярная диагностика
23. Способы получения трансгенных растений.
24. Способы получения трансгенных животных
3. МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ
ПРОМЕЖУТОЧНОЙ АТТЕСТАЦИИ
Контрольно-измерительными параметрами дисциплины являются:
1) перечень контрольных вопросов,
2) перечень вопросов для промежуточного контроля,
3) решение задач.
9
3.1 Перечень контрольных вопросов:
1. Идентификация и отбор ГМ-клеток и организмов.
2. Вирусная трансдукция.
3. ГМО-технологии. Генетическая инженерия. Молекулярное клонирование.
4. Источники рисков при создании и использовании ГМО.
5. Клонирование генов.
6. Получение рекомбинантных ДНК.
7. Масштабы распространения ГМО в мире. Перспективы ГМО технологий.
8. Трансгенная, ксеногенная, цисгенная и интрагенная трансформации.
9. Векторы для переноса генов. Характеристика основных групп.
10. Структура агробактериальных Ti и Ri-плазмид. Нопалиновая и октопиновая Ti-плазмиды.
11. Селективные/репортерные гены первого, второго и третьего поколений.
12. Физические методы введения рекомбинантных ДНК в клетку.
13. Транспластомная и митохондриальная трансформация.
14. Агробактериальная трансформация растений.
15. Биобезопасность. Контроль за использованием и распространением
ГМО.
16. Способы клонирования трансформированных клеток бактерий, грибов,
растений, животных.
17. Генная инженерия и селекция. Цели создания ГМ-сортов растений, пород животных, штаммов микроорганизмов.
18. Бактериальная трансформация.
19. Ферменты синтеза рекомбинантных ДНК.
20. Полимеразная цепная реакция.
21. Трансгенные продукты, лекарства, вакцины. Достоинства и недостатки.
Способы получения.
22. Генная инженерия и молекулярная диагностика
23. Способы получения трансгенных растений.
24. Способы получения трансгенных животных.
3.2 Примеры задач для промежуточного контроля
1. При обработке кольцевой двухцепочечной плазмиды pCELl различными
рестриктазами и их комбинациями получаются следующие фрагменты (размеры
указаны в парах нуклеотидов): EcoRI - 6,0; ВатIII - 6,0; HindIII -6,0; НаеII - 3,0; 2,0
и 1,0; EcoRI и НаеII - 2,0 и 1,0; EcoRI и HindIII - 3,5 и 2,5; EcoRI и ВатHI - 4,5 и
10
1,5; ВатHI и HindIII - 5,0 и 1,0; ВатШ и Haell - 3,0; 1,5 и 0,5; HindIII и НаеII — 3,0;
1,5; 1,0 и 0,5. Используя эти данные, постройте рестрикционную карту pCELl.
2. Предположим, что ваш новый ДНК-синтезатор имеет среднюю эффективность присоединения нуклеотидов 98,5%. Каким будет выход продукта, если
вы синтезируете гибридизационный зонд длиной 50 нуклеотидов?
3. Какие две стратегии химического синтеза гена длиной 0,5 т. п. н. вы можете предложить? Какую из них вы предпочтете?
4. Построить карту расположения участков узнавания эндонуклеаз рестрикции на линейной ДНК, если известно, что при действии на эту ДНК ферментом
EcoR1 получаются три фрагменты длиной 850, 500 и 300 пар нуклеотидов, а
BamH1 разрезает эту ДНК на фрагменты 950 п. н., 600 п. н. и 100 п. н. При совместном расщеплении данной ДНК указанными рестриктазами получается следующий набор фрагментов: 600 п. н., 400 п. н., 300 п. н., 250 п. н. и 100 п. н.
5. Построить физическую карту кольцевой ДНК по сайтам рестрикции гипотетических рестриктаз R1 и R2. Фрагменты ДНК при действии R1 9.0 т. п. н. и
3.0 т. п. н.; R2 6.5, 4.5 и 1.5 т. п. н.; R1+R2 5.5., 2.5., 2.0 и 1.0 т. п. н.
6. Сколько молекул бета-галактозидазы присутствует в одной клетке кишечной палочки, если бактерии растут на лактозе? Кишечная палочка имеет цилиндроподобную форму длиной 2 мкм и диаметром 1 мкм; молекулярный вес бета-галактозидазы — 450 000.
Плотность бактериальной клетки — около 1,2 г/мл. На долю растворимых
белков, к которым относится и бета-галактозидаза, приходится 14% всей массы,
из которых бета-галактозидаза составляет 1%.
7. Содержание лизина в рибонуклеазе составляет 10,5% по весу (мол. вес
лизина — 147). Рассчитайте минимальную молекулярную массу рибонуклеазы и
реальную, если известно, что она содержит 10 остатков лизина.
8. Используйте концевую трансферазу для создания гибридных кольцевых и
линейных молекул ДНК, принадлежащих разным геномам. Какие еще ферменты
вам понадобятся для этого?
9. Создайте конструкцию, несущую прокариотический ген устойчивости к
неомицину, подходящую для переноса генов в эукариотические клетки. Опишите
план клонирования с помощью такого вектора.
10. Будут ли последовательности 5’-AATT-3’ и 3’-AATT-5’ в двухцепочечной молекуле ДНК разрезаться на том же самом сайте рестрикции?
11
СПИСОК РЕКОМЕНДОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Основная литература
1. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки: В
3-х т. – М.: Мир, 1994.
2. Жимулев, И. Ф. Общая и молекулярная генетика: учебное пособие для
студентов университетов /И. Ф. Жимулев; отв. ред. Е. С. Беляева, А. П. Акифьев. изд. 4-е, стереотип. третьему. – Новосибирск: Сибирское университетское издательство, 2007. - 478 с.
3. Льюин, Б. Гены = Genes IX: / Б. Льюин; пер. с англ. И. А. Кофиади и др.;
ред. Д. В. Ребриков. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. - 896 с.
4. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с
англ. / Б. Глик, Дж. Пастернак. - М.: Мир, 2002. - 589с.
Дополнительная литература
5. Максимов, Г. В. Теоретические и практические аспекты использования
биотехнологии и генной инженерии / Г. В. Максимов, В.Н. Василенко, В.Г. Максимов, А.Г. Максимов – М.: Вузовская книга, 2004. – 208 с.
6. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии: Учебник для вузов./ В.Н.
Рыбчин. – С.-Пб.: Изд-во СПбГТУ, 1999. – 522 с.
7. Сингер, М. Гены и геномы. (В 2-х т.): Пер. с англ.Т. 1. / М.Сингер, П.Берг.
- М.: Мир, 1998. - 373 с.
8. Кларк Д., Рассел Л. Молекулярная биология. – М.: ЗАО «Компания
КОНД», 2004. – 472 с.
12