ИНСТРУКЦИЯ «Среда-РНК» АмплиСенс

ИНСТРУКЦИЯ
по применению реагента
для стабилизации и сохранения мРНК клеток крови
«Среда-РНК»
АмплиСенс
Федеральное бюджетное учреждение науки
«Центральный научно-исследовательский
институт эпидемиологии»,
Российская Федерация, 111123,
город Москва, улица Новогиреевская, дом 3а
НАЗНАЧЕНИЕ
Среда-РНК предназначена для забора цельной крови, а также для сохранения и транспортировки с
одновременной стабилизацией внутриклеточной мРНК для последующего выделения тотальной
РНК. Рекомендуемым методом выделения является фенольное выделение по Хомчинскому или его
модификация с использованием комплектов реагентов для выделения тотальной РНК производства
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора – «РИБО-золь-A», «РИБО-золь-D».
ОПИСАНИЕ
1 флакон, содержащий 100 мл транспортной среды. Хранить при комнатной температуре (от 18 до
25 °С).
Срок хранения – 12 мес.
Транспортирование – при комнатной температуре.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Первым этапом многих молекулярных исследований мРНК является забор цельной крови.
Основной проблемой этих исследований является нестабильность внутриклеточной РНК, которая
подвергается быстрой деградации в течение нескольких часов после забора крови. Более того,
количество некоторых видов РНК возрастает in vitro после забора крови вследствие генной
индукции. Оба этих процесса деградации и индукции могут привести к ошибочной оценке уровня
РНК in vivo.
Среда-РНК содержит компонент, который in vitro стабилизирует профиль экспрессии, имеющийся
in vivo, посредством снижения деградации РНК и минимизации генной индукции in vitro.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
При соблюдении условий хранения внутриклеточный профиль экспрессии мРНК остается
стабильным 5 сут при температуре от 2 до 8 °С, 3 сут при комнатной температуре, при температуре
не выше минус 16 °С в течение 6 мес.
lg коп/мл
Cохранность РНК в среде
8,50
8,00
7,50
7,00
6,50
6,00
5,50
5,00
gus
gapdH
abl
0
1
2
3
4
5
сутки
Оценка сохранности мРНК и стабильности профиля экспрессии производилась с использованием
образцов цельной крови, забранной в среду-РНК. Хранение пробирок проводилось в течение 4,5 сут
при комнатной температуре. Выделение РНК производилось каждые сутки в трех повторах.
Профиль
экспрессии
трех
человеческих
генов:
β-глюкуронидазы
(gus),
глицеральдегидтрифосфатдегидрогеназы (gapdH), и Абельсон (abl) анализировался при помощи
количественной ОТ-ПЦР. На рисунке представлен средний логарифм концентрации копий мРНК в
мл выделенной РНК и разбросы (0,95).
РЕКОМЕНДУЕМЫЕ ФОРМАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объем пробирок, используемых Количество цельной Количество среды для
для анализа, (мл)
крови, (мл)
сохранения РНК, (мл)
1,5
0,35
1,05
2,0
0,5
1,4
5,0
1,25
3,5
10,0
2,5
6,9
REF 981 / VER 26.01.12 / стр. 2 из 5
ПОРЯДОК РАБОТЫ
ВНИМАНИЕ! Перед использованием убедитесь, что пробирка со средой хранилась при
температуре от 18 до 25 °С и в ней визуально не обнаруживается наличие кристаллов. В противном
случае необходимо выдержать пробирку со средой при комнатной температуре до растворения
кристаллов, после этого начинать процедуру по забору крови.
1. Сразу после взятия крови в одноразовую стерильную пробирку, содержащую ЭДТА, и
перемешивания, поместить необходимое количество забранной крови в среду для стабилизации
и сохранения РНК (см. табл.). Промаркировать пробирку.
2. После этого немедленно аккуратно перемешать содержимое пробирки посредством
переворачивания 8-10 раз.
3. Инкубировать в вертикальном положении при комнатной температуре не менее 4 ч и не более 72
ч перед перемещением в холодильную камеру (при температуре от 2 до 8 °С) или морозильную
камеру (при температуре не выше минус 16 °С) или перед началом процедуры выделения РНК.
4. Перед началом процедуры выделения РНК центрифугировать содержимое пробирок при 5000 g
(например, 13400 об/мин для центрифуги «Eppendorf minispin» для пробирок объемом 1,5; 2,0
мл). Далее проводить выделение РНК из осадка.
* При выделении РНК по методу Хомчинского растворение осадка может не произойти до
момента добавления фенола. Это является допустимым, однако после добавления фенола
необходимо добиться растворения осадка путем тщательного перемешивания.
ЗАМОРАЖИВАНИЕ – ОТТАИВАНИЯ ОБРАЗЦОВ
Замораживание необходимо проводить при вертикальном положении пробирок.
Образцы, забранные в среду-РНК могут храниться при температуре не выше минус 16 °С. В случае,
если планируется хранить образцы при температуре ниже минус 16 °С, необходимо выдержать их
при температуре минус 16 °С в течение 24 ч, потом хранить при температуре не выше минус 68 °С.
Оттаивать замороженные пробирки необходимо в вертикальном положении при комнатной
температуре в течение приблизительно 2 ч.
ВНИМАНИЕ! Не производить оттаивание при температуре выше 25 °С.
Примечание. Если перед замораживанием не проводилась 4-х часовая инкубация при комнатной
температуре, выдержать пробирки, по меньшей мере, еще 2 ч после достижения комнатной
температуры перед началом процедуры выделения РНК.
REF 981 / VER 26.01.12 / стр. 3 из 5
СИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ
Номер в каталоге
Осторожно!
Обратитесь к
сопроводительной
документации
Код партии
Максимальное число
тестов
Только для
исследовательских целей
Использовать до
Дата изменения
Обратитесь к
руководству по
эксплуатации
Ограничение температуры
Не допускать
попадания
солнечного света
Верхнее ограничение
температуры
Дата изготовления
Производитель
REF 981 / VER 26.01.12 / стр. 4 из 5
Лист вносимых изменений
Редакция
24.06.11
LA
Место внесения
изменений
п. Порядок работы
По тексту
26.01.12
LA
Нижний колонтитул
Титульная страница
Суть вносимых изменений
Добавлена информация о необходимости маркировки
пробирок со средой после добавления образцов клинического
материала
Добавлен раздел «Символы, используемые в печатной
продукции»
Изменено название института на ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии Роспотребнадзора
«Кат. №» и «дата изменения» заменены на
соответствующие символы
Добавлен символ и реквизиты производителя
Добавлен символ RUO – только для исследовательских
целей
REF 981 / VER 26.01.12 / стр. 5 из 5