Генетика старения и долголетия
advertisement
3-я Международная 3rd International Conference 06–10.04.2014 RUSSIA Sochi конференция 06–10.04.2014 РОССИЯ Сочи Брайан Кеннеди Дэвид Гемс Ян Вайг Нир Барзилай Клаудио Франчески Джуди Кампизи Роберт Шмуклер Рис Ричард Миллер Вальтер Лонго 2 Конференция – 2014 3- я Международная конференция Конференция – 2014 Департамент изучения рака и ответов на повреждение ДНК, Отдел наук о жизни, Национальная лаборатория Лоренса Беркли Баковский институт изучения рака (Cancer & DNA Damage Responses Department, Life Science Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Buck Institute for Age Research), Беркли, США 06–10.04.2014 Сочи Генетика старения и долголетия 6–10 апреля 2014 года в Сочи состоится международная конференция «Генетика старения и долголетия». Задачи конференции: • Получить срез современных знаний в области механизмов старения и долголетия и методов противодействия старению • Простимулировать международные колаборации • Познакомить инвесторов с ведущими специалистами в области старения и долголетия • Дать стимул и известность частным инициативам и фондам в области радикального продления жизни Основные темы: Джуди Кампизи (Judith Campisi) • Гены долголетия у человека и животных • Эпигенетические механизмы старения • Окружающая среда, гены и старение • Биомаркеры биологического возраста • Фармакологические вмешательства в старение • Генетика регенерации • Системная биология в исследованиях старения Участники Конференции: крупнейшие специалисты США, Европы и России по генетике старения и продолжительности жизни, изучению природы рака и возрастзависимых заболеваний, исследованию долгожительства и математическому моделированию продолжительности жизни, в том числе: Президент Института исследований старения Бака (The Buck Institute for Research on Aging), Калифорния, США. Брайан Кеннеди (Brian Kennedy) Этот научный центр является признанным мировым лидером в области фундаментальных и прикладных исследований старения. В 20 лабораториях института с помощью новейших технологий разрабатываются и испытываются геропротекторные препараты, а также лекарства для предотвращения и лечения возрастзависимых заболеваний (онкологических, сердечно-сосудистых, диабета и др.). Брайан Кеннеди – один из ведущих специалистов в области биологии старения, известный также своими исследованиями, проведенными совместно с Леонардом Гуаранте в Массачусетском Технологическом Институте исследованиями, результаты которых показали, что сиртуины (Sir2) модулируют старение. Лаборатория старения C.elegans Института здорового старения Лондонского университетского колледжа (C.elegans aging Lab, Institute of Healthy aging UCL), Великобритания. Дэвид Гемс (David Gems) Нир Барзилай (Nir Barzilai) Ян Вайг (Jan Vijg) Исследования лаборатории Яна Вайга посвящены геномной нестабильности и механизмам ее индукции. Было показано, что с течением времени в клетке накапливается большое число повреждений ДНК и что этот процесс является тканеспецифичным. Например, в мозге в отличие от печени частота мутаций меньше и не возрастает с возрастом. Последствиями геномной нестабильности являются нарушения экспрессии генов, ведущие к раку и чертам старения. Ян Вайг является автором известной книги «Старение генома». Отдел экспериментальной патологии Университета Болоньи (Department of Experimental Pathology, University of Bologna), Болонья, Италия. Клаудио Франчески (Claudio Franceschi) Отделение Геронтологии, Университет медицинских наук Арканзаса (Departments of Geriatrics, University of Arkansas for Medical Sciences), ЛитлРок, США Роберт Шмуклер Рис (Robert J. Shmookler-Reis) Отделение генетики Медицинского колледжа Альберта Энштейна (Albert Einstein College of Medicine, Department of Genetics), Нью-Йорк, США. Директор Института геронтологии при Медицинском колледже Альберта Эйнштейна (Albert Einstein College of Medicine), Бронкс (США). Основные темы его исследований: раскрытие генетического компонента старения у человека продление жизни. Известен исследованиями сверхдолгожителей (людей старше 100 лет) в рамках проекта Longevity Genes Project («Гены долголетия»). Результаты проекта показали, что люди, обладающие определенным набором генов, стареют медленнее других, возрастзависимые заболевания начинаются у них в среднем на 30 лет позже, и протекают менее долго и менее мучительно. Исследователь роли генов в ограничении продолжительности жизни и процессе старения на модели круглого червя C.elegans (нематоды). Геном C.elegans полностью секвенирован, а продолжительность жизни составляет 2-3 недели, что делает этого червя идеальным объектом для генетических манипуляций с целью продления жизни. Дэвид Гемс является первооткрывателем многих генов долголетия. В эксперименте черви с некоторыми мутациями живут в 5 раз дольше по сравнению с обычными представителями вида. Лаборатория профессора Джуди Кампизи проводит многосторонние исследования механизмов старения, специализируясь на выяснении молекулярных причин старения клеток и клеточной смерти. Работы по изучению механизмов клеточного старения и роли теломер и теломер-ассоциированных белков в поддержании стабильности генома принесли Джуди Кампизи мировую известность. В настоящее время она вместе со своими сотрудниками занимается изучением реакции клеток на различные стрессовые стимулы, которые могут вызвать клеточное старение. К таким стимулам относится дисфункция теломер, повреждение нетеломерных участков ДНК, избыток сигналов к делению клетки, нарушение организации хроматина и т.д. Андрей Гудков (Andrei V. Gudkov) Одно из направлений исследований профессора Шмуклер-Риса – поиск генов, регулирующих продолжительность жизни у нематоды C. elegans. В его лаборатории были созданы мутанты нематоды по гену age-1, у которых вырезана каталитическая субъединица фосфатидининозитол-3-киназы (PI3K(CS)), обладающие десятикратно увеличенной продолжительностью жизни. Эти нематоды обладают гораздо более длительным периодом развития, нормальной подвижностью, однако при этом мутантным животным приходится пожертвовать размерами тела и скоростью метаболизма. Также эти черви обладают исключительной устойчивостью к оксидативному и электрофильному стрессам по сравнению с червями в контрольной группе. Онкологический институт Розвелла Парка (Roswell Park Cancer Institute), США Основал компанию Cleveland BioLabs (NASDAQ: CBLI), выпускающую лекарства против рака и биозащитные препараты, основанные на его собственных изобретениях. Автор более 160 научных работ в области онкологии, вирусологии, молекулярной генетики и радиационной биологии. Обладатель американских и международных патентов. Один из самых успешных российских биологов, работающих за границей. 3 Основным направлением исследований Клаудио Франчески является роль иммунной реакции в возникновении рака и при старении человека. Изучение долгожителей, которым удалось избежать рака и болезней сердца является одним из перспективных подходов в этом направлении. Клаудио Франчески и его коллеги исследовали, почему некоторым людям удается дожить до 100 лет, и при этом не заболеть раком. Оказалось, что у долгожителей наблюдается повышенная активность таких противовоспалительных цитокинов, как IL-10 и TGF-beta, а также пониженный ответ на IGF-1. В настоящее время Клаудио Франчески является одним из ведущих исследователей в Европейском проекте «Генетика здорового старения в Европе» (Genetics of Healthy Aging, GEHA). Этот проект включает в себя 24 организации из стран Европы плюс Пекинский институт генома в Китае. Задачей проекта является поиск генов, ответственных за здоровое долголетие. Департамент центра патологии и гериатрии, Университет Мичигана (Department of Pathology and Geriatrics Center, University of Michigan), Мичиган, США Ричард Миллер (Richard Miller) Лаборатория, возглавляемая Ричардом Миллером была одной из первых, показавших влияние рапамицина на увеличение продолжительности жизни у млекопитающих. Рапамицин способен ингибировать mTOR сигнальный путь, его применение вызывает 10%-ное увеличение продолжительности жизни у подопытных мышей. Это одна из первых работ, показавших возможность направленного фармакологического вмешательства в увеличение продолжительности жизни. Институт молекулярной генетики РАН (Institute of Molecular Genetics, RAS), Москва, Россия Елена Пасюкова (Elena Pasyukova) Занимается выявлением генетических детерминант, определяющих продолжительность жизни у Drosphila melanogaster. В результате широкомасштабного скрининга, в котором было задействовано более 1000 мутантных линий, были выявлены 58 ранее не описанных мутаций, влияющих на увеличение продолжительности жизни. Также удалось выявить общий транскрипционный профиль, характерных для мух долгожителей. Модельная система плодовой мушки, используемая Еленой Пасюковой и ее коллегами, позволяет изучать комплексный вклад и взаимодействие генов в определение долголетия. 4 Конференция – 2014 Школа геронтологии Леонарда Дэвиса, Университет Южной Калифорнии (Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California), Дэвис, США Вальтер Лонго (Valter Longo) Создатель генетически модифицированного штамма дрожжевого грибка, способного жить в 10 раз дольше обычного. Для достижения результата учёные использовали сочетание двух приёмов: они выключили определённые гены (Ras2, Tor1 и Sch9) в клетках и посадили клетки на низкокалорийную диету. Исследователи также обнаружили, что для продления жизни дрожжей необходима серин-треониновая киназа Rim15. ОБЗОР ОСНОВНЫХ ГРУПП ГЕНОВ СТАРЕНИЯ ГЕНЕТИКА Центр популяционного здоровья и старения, университет Дюка (Center for Population Health and Aging, Duke University), Дурхам, США Анатолий Яшин (Anatoly Yashin) Генетика и эпигенетика старения и долголетия Ученый, занимающийся статистическим анализом и математическим и компьютерным моделированием генетических и демографических данных, связанных со старением. Сфера интересов – использование биомаркеров старения для предсказания вероятной продолжительности жизни, а также взаимодействие генетических и негенетических факторов в определении продолжительности жизни. В настоящее время группа, возглавляемая Анатолием Яшиным, разработала новые методы анализа популяционных многофакторных генетических данных, которые находят применение в лонгитюдных исследованиях. В научно-консультационный и программный комитет Конференции также входят ведущие мировые специалисты в области генетики старения и долголетия: Вера Горбунова (Vera Gorbunova) Университет Рочестера (University of Rochester), США Джон Тауэр (John Tower) Университет Южной Калифорнии (University of Southern California), США Гордон Литгоу (Gordon Lithgow) Институт исследований по проблемам старения Бака (Buck Institute for research on aging), США Вадим Гладышев (Vadim Gladyshev) Гарвардская медицинская школа (Harvard Medical School), США Роман Кондратов (Roman Kondratov) Государственный Университет Кливленда (Cleveland State University), США Роберт Тэнгей (Robert Tanguay) Университет Лаваля (Université Laval), Канада Мэтт Кеберлейн (Matt Kaeberlein) Университет Вашингтона (University of Washington), США Елена Будовская (Yelena Budovskaya) Институт наук о жизни имени Сваммердама (Swammerdam Institute for Life Sciences), Нидерланды Эрик Лагасс (Eric Lagasse) Университет Питтсбурга (University of Pittsburgh), США Михаил Благосклонный (Mikhail V. Blagosklonny) Онкологический институт Розвелла Парка (Roswell Park Cancer Institute), США Жао Педро де Магалхас (Joao Pedro de Magalhaes) Ливерпульский университет (University of Liverpool), Великобритания Шей Сокер (Shay Soker) Институт регенеративной медицины Вейк-Форест (Wake Forest Institute for Regenerative Medicine), США Андрей Селуянов (Andrei Seluanov) Университет Рочестера (University of Rochester), США Скотт Плетчер (Scott Pletcher) Университет Мичигана (University of Michigan), США Уильям Орр (William C. Orr) Южный методистский Университет (Southern Methodist University), США Сергей Либерт (Sergiy Libert) Массачусетский технологический институт (Massachusetts Institute of Technology), США Victoria Lunyak (Виктория Луняк) Институт исследований по проблемам старения Бака (Buck Institute for research on aging), США Южин Су (Yousin Suh) Медицинский колледж Альберта Эйнштейна (Albert Einstein College of Medicine), США 5 СТАРЕНИЯ И ДОЛГОЛЕТИЯ 2014 А лексей Моск а лев руководитель лаборатории Молекулярной радиобиологии и геронтологии Института биологии Коми НЦ УрО РАН, заведующий кафедрой экологии СыктГУ, заведующий лабораторией генетики старения и продолжительности жизни Московского физико-технического института Старение – процесс постепенного угнетения основных функций организма (регенерационных, репродуктивных и др.), вследствие которого организм теряет способность поддерживать гомеостаз, противостоять стрессам, болезням и травмам. Потеря функций делает неизбежными возрастзависимые патологии, которые являются причинами смерти. Т радиционно старение рассматривается как механический износ и накопление ошибок. В рамках этой модели случайные ошибки и стресс, вызванный воздействием экологических факторов, приводят к нарушению метаболизма, усиленной выработке свободных радикалов и повреждению макромолекул в каждой клетке и ткани (рис. 1). В то же время известно, что умеренные дозы стрессоров способны стимулировать собственные защитные силы организма, тренируя его возможности справляться с более мощными стрессами. Существуют доказательства того, что изменение в результате воздействия факторов окружающей среды биологической компоненты смертности (то есть старение) зависит и от активности определенных генов, цитокинов и гормонов, а значит, может корректироваться и регулироваться. Умеренные стрессы стимулируют экспрессию генов стрессоустойчивости, способствуя предотвращению или элиминации новых, в том числе и спонтанных повреждений, что замедляет старение (рис. 2). Длительные или жесткие воздействия стресс-факторов истощают компенсаторные механизмы и приводят к резкому увеличению числа повреждений и физиологических нарушений, что ускоряет старение организма (рис. 2). Как правило, при поиске «геронтогенов» (генов, контролирующих старение и продолжительность жизни) у модельных животных применяют поиск мутантных линий, характеризующихся свойствами, отражающими значительное изменение темпа старения. Наиболее продуктивными подходами являются: поиск генов, выключение которых (loss of function) продлевает жизнь; анализ продолжительности жизни мутантов со сверхактивацией (gain of function) 6 ОБЗОР ОСНОВНЫХ ГРУПП ГЕНОВ СТАРЕНИЯ ГЕНЕТИКА гена кандидата. Фенотипами, 2014 оцениваемыми при этом, помимо самой длительности жизни, может быть скорость возникновения функциональных нарушений, связанных со старением (например, динамика поведенческих реакций и накопление липофусцина в клетках). Для ускорения темпов исследований могут быть применены стресс-факторы (обычно тепловой или окислительный шок), поскольку устойчивость к стрессу, как правило, связана с увеличением продолжительности жизни. У разных модельных животных было выявлено несколько сотен генов, изменение активности которых замедляет скорость старения. К сигнальным механизмам, задействованным в регуляции процессов старения и долголетия, относятся инсулин/IGF-1, PI3K-, TOR-, MAPK-, NF-kB-, TGF-ß-, WNT-сигнальные пути (Kenyon, 2010). При благоприятных условиях внешней среды результатом данной регуляции является перераспределение энергетических и пластических ресурсов клетки и организма от репаративных путей, обеспечивающих поддержание жизнеспособности, к процессам роста и размножения. Напротив, при неблагоприятных условиях гормональное стимулирование роста прекращается, но активируются белки, способствующие увеличению стрессоустойчивости клеток. Данный регуляторный путь консервативен в эволюции от беспозвоночных до млекопитающих. Наиболее изучен в связи с генетикой старения инсулиноподобный путь сигнализации. Связывание инсулиноподобного фактора роста (IGF-1) с рецептором инсулина/IGF-1 на внешней поверхности клетки активирует на внутренней мембране клетки фосфоинозитол-3-киназу СТАРЕНИЯ И ДОЛГОЛЕТИЯ (PI3K), что приводит к образованию низкомолекулярного посредника – фосфоинозитид-3,4,5-трифосфата. Он связывается с другой киназой, которая называется 3-фосфоинозитидзависимая киназа 1 (PDK-1) и в свою очередь активирует (фосфорилирулирует) киназы Akt/PKB и SGK-1, что позволяет протекать нормальным ростовым процессам в клетке. В то же время выключаются факторы стрессоустойчивости, такие как транскрипционный фактор FOXO. У людей-долгожителей повышена чувствительность к инсулину при сохранении его низкого уровня в плазме крови. Активность инсулиноподобного сигналинга и уровень экспрессии инсулиноподобных пептидов снижены у долгоживущих нематод, мышей и людей. Мыши-гетерозиготы и люди с мутацией гена рецептора IGF-1 имеют большую продолжительность жизни. Мутации в генах субстратов 1 и 2 инсулинового рецептора приводят к увеличению продолжительности жизни дрозофил и мышей. Мутации в генах киназ PI3K, AKT/PKB, PDK сопровождаются увеличением продолжительности жизни животных. Напротив, активность фосфатаз PTEN, SHIP1 и SHIP2, противостоящих действию PI3K, способствует долголетию. Инсулиноподобный сигналинг подавляет активность механизмов стресс-ответа, связанных с транскрипционным фактором FOXO. Активность FOXO и FOXO-зависимых генов (PEPCK, Hsps, MnSod) приводит к увеличению продолжительности жизни. Еще один FOXO-зависимый ген – GADD45, при сверхэкспрессии также приводит к увеличению продолжительности жизни и стрессоустойчивости у дрозофил, а также ассоциирован со многими возраст-зависимыми патологиями у человека. Мутация в гене почечного гормона klotho приводит к уменьшению, ОБЗОР ОСНОВНЫХ ГРУПП ГЕНОВ СТАРЕНИЯ а сверхэкспрессия — к увеличению продолжительности жизни мышей. Klotho ингибирует эффекты инсулин/ IGF-1 пути, увеличивая устойчивость к окислительному стрессу на уровне клетки и организма, тем самым способствуя долголетию. Долгоживущие дрозофилы со сниженной активностью инсулинового сигналинга характеризуются более высоким уровнем липидов. С возрастом угасает жировой обмен, что приводит к возраст-зависимым заболеваниям, таким как метаболический синдром и атеросклероз. Дислипидемия связана с изменениями активности многих генов. Важную роль в возраст-зависимых заболеваниях и долголетии играют гормоны-регуляторы жирового обмена адипонектин, лептин, грелин и резистин. PPAR являются лиганд-индуцибельными транскрипционными факторами, которые принадлежат к надсемейству ядерных рецепторов гормонов. Связываясь с ретиноидным рецептором X в качестве партнера, они запускают транскрипцию генов, содержащих особую последовательность ДНК, которая называется PPRE (Peroxisome Proliferator Response Element). В качестве лигандов PPAR выступают жирные кислоты или их производные. PPARa экспрессируется в тканях, где требуется высокий уровень митохондриального окисления жирных кислот, то есть в печени, почках, сердце, скелетных мышцах и стенке сосудов. Он активируется жирными кислотами, эйкозаноидами, 15-d простагландином, окисленными жирными кислотами. Он регулирует экспрессию генов, способствующих окислению липидов и метаболизму липопротеинов (например, главного аполипопротеина высокой плотности Apo A-1). Таким образом, PPARa противодействует метаболическому синдрому и старению в целом. Активация стресс-резистентности Продолжительность жизни • AMPK, SIRT1, FOXO, HSF-1, NRF-2, HIF-1 • увеличение уровня шаперонов, генов репарации ДНК, антиоксидантных ферментов • снижение затрат на рост и деление клеток (ингибирование PI3K, TOR, S6K) 100 ДОЛГОЛЕТИЕ стресс (ограничительная диета, гипертермия, гипоксия) ускоренное старение Истощение стресс-резистентности • развертывание или агрегация белков • мутации в ДНК • митохондриальная недостаточность • дисфункция Ca2+ гомеостаза • клеточное старение • апоптоз (JNK) Рис. 2. Механизмы влияния стрессов разной величины на скорость старения и продолжительность жизни организма Активируемый жирными кислотами в жировой ткани ядерный рецептор Pparg-2 (Nr1c3) является одним из генов долголетия млекопитающих. Он играет ключевую роль в повышении чувствительности к инсулину, но при этом стимулирует адипогенез и участвует в неопластических процессах, таких как рак кишечника. При старении снижается экспрессия ферментов липогенеза ATP-цитрат лиазы и ацетил-CoA карбоксилазы, а также цитозольной фосфолипазы A2 и фосфолипазы C-γ1. Напротив, сверхэкспрессия генов β-окисления жирных кислот приводит к продлению жизни Drosophila melanogaster. Характерная черта столетних – крупные липопротеиновые частицы и большое количество липопротеинов высокой плотности. Со старением и долголетием ассоциированы гены белков, участвующих в транспорте триглицеридов, такие как аполипопротеин E4 и аполипопротеин D. Сверхэкспрессия у дрозофилы как человеческого ApoD, так и собственного гомолога GLaz приводит к увеличению продолжительности жизни. В ответ на снижение наличия питательных веществ метаболические системы организма перестраиваются на экономичный режим функционирования. NAD+-зависимые деацетилазы SIRT1, HDAC1, 3, 4 активируются при энергетическом голодании клетки; повышение их экспрессии продляет жизнь. AMPK, сенсор количества в клетке АМФ, способствует долголетию. Напротив, киназа TOR активируется при наличии аминокислот и ускоряет старение, ее ингибирование увеличивает продолжительность жизни мышей. Нокаут гена RSK3/S6 протеинкиназы, активируемой mTOR, продлевает жизнь мышам. Транскрипционный фактор PHA-4/FOXA опосредует эффекты ограничения калорийности питания и способствует увеличению продолжительности жизни нематод. Чрезмерно высокая активность биосинтеза белка в клетке цитотоксична и приводит к стрессу эндоплазматической сети. Снижение экспрессии факторов инициации трансляции eIF4E, eIF4G, eIF4E-BP продлевает жизнь червям и мышам. С возрастом снижается активность систем утилизации поврежденных и избыточных белков – протеасомы 20S C2, лизосомальной системы и автофагии. Сверхэкспрессия генов регуляторной субъединицы протеасомы и белков автофагии приводит к увеличению продолжительности жизни модельных животных. В регуляции продолжительности жизни задействованы некоторые E3-убиквитин лигазы. Наиболее подвержены оксидативным повреждениям митохондриальные белки. Оверэкспрессия митохондриального шаперона Hsp22 у дрозофил Рис. 3. Гены, изменяющие свою экспрессию при старении организма. Генная сеть выполнена на сайте http://string-db.org на основании списка генов-биомаркеров старения человека из базы данных GenAge: Human Genes Commonly Altered During Ageing (http://genomics.senescence.info/genes/microarray.php) привела к увеличению продолжительности жизни, а сверхактивация митохондриальной протеазы LON увеличивала длительность жизни грибку Podospora anserina. Около 50% белков, ассоциированных со старением и долголетием, участвуют в трансдукции сигналов. TGF-ß сигналинг снижен у долгоживущих червей. При старении мышц наблюдается патологическая активизация Wnt-сигналинга. У долгоживущих морских ежей с возрастом происходит повышение активности Notch-сигналинга. Выявлена роль в регуляции продолжительности жизни стресс-ответа, связанного с активностью киназ MAPK каскада. Различные малые ГТФазы инициируют MAPK сигналинг при стрессе и клеточном старении. Сверхэкспрессия p38MAPK продлевает жизнь дрозофилам. Активность киназ MEK1, MEK2, ERK1, ERK2 повышена в предшественниках В клеток старых мышей. Повышенный уровень стрессактивируемой протеинкиназы SAPK/ JNK вызывает увеличение продолжительности жизни дрозофил. Напротив, ингибирование киназы GSK3 вызывает клеточное старение. Важную роль в процессах старения играют гены, регулирующие выработ- ку свободных радикалов. Некоторые из этих генов способствуют дополнительной выработке свободных радикалов. Нокаут гена p66Shc, митохондриальной мишени p53 при ответе на оксидативный стресс, приводит к увеличению продолжительности жизни мышей. Нематоды с мутацией в гене Clk-1, контролирующем биосинтез компонента электронотранспортной цепи митохондрий и антиоксиданта убихинона, а также гетерозиготные по данному гену нокаутные мыши, живут дольше. Митохондриальные распрягающие белки UCP-1, -2, -3 снижают образование активных форм кислорода в митохондриях. Сенсоры оксидативного стресса VDAC1 и VDAC3 влияют на продолжительность жизни разных видов животных. Долголетию способствует увеличение активности ряда белков антиоксидантной защиты. MAPK киназный каскад регулирует ответ клетки на оксидативный стресс посредством активации транскрипционного фактора SKN-1. Активность SKN-1 повышена у долгоживущих нематод, мышей и мух. Сверхэкспрессия у дрозофил генов пероксиредоксина II (Jafrac1) и пероксиредоксина 5 (dPrx5), контролирующих уровень в клетке пероксидов, приводит к 7 8 ОБЗОР ОСНОВНЫХ ГРУПП ГЕНОВ СТАРЕНИЯ ГЕНЕТИКА увеличению продолжительности 2014 жизни. Оверхэкспрессия Mn-SOD в ряде случаев увеличивает продолжительность жизни мух и мышей. Оверэкспрессия Cu/Zn SOD в нейронах продляет жизнь дрозофилам. Трансген митохондриальной каталазы замедляет возрастные изменения биомаркеров старения сердца грызунов. Достаточно большое количество генов изменяет свою экспрессию при старении человека (рис. 3). Экспрессия части из этих генов уменьшается в связи с замедлением процессов роста и развития, активация других происходит в рамках провоспалительного и стресс-ответа, возникающих в результате накопления внутриклеточных и тканевых повреждений и ошибок. Приведенные на рис. 3 гены можно разделить на группы на основании тех процессов, в которых они задействованы (таблица). Повидимому, дерегуляция именно эти процессов играет основную роль в старении организма человека. Одной из главных причин изменения экспрессии генов при старении является изменение их эпигенетической регуляции, к которой относится изменение степени метилирования регуляторных последовательностей ДНК, ковалентная модификация гистоновых белков и экспрессия регуляторных некодирующих РНК. В настоящее время активно развивается эпигенетическая теория старения, которая признает основополагающую роль неадаптивных эпигенетических изменений в старении. Установлено, что с возрастом происходит накопление эпимутаций – например, эпигенетически репрессированные гены становятся активными. Генетически идентичные близнецы в старости существенно различаются по паттернам метилирования геномов, что приводит к различиям в экспрессии СТАРЕНИЯ И ДОЛГОЛЕТИЯ их генов и продолжительности жизни. Разброс эпигенетических маркеров увеличивается с возрастом между отдельными клетками одной и той же ткани одного организма. С возрастом происходит глобальное деметилирование повторяющихся последовательностей генома (в частности в последовательностях мобильных генетических элементов) и локальное гиперметилирование помоторов генов рРНК и других РНК-полимераза IIтранскрибируемых генов. Клеточное старение (перманентная остановка роста и деления клетки) сопровождается возникновением в ядре старение-ассоциированных участков гетерохроматина (SAHF), что обусловлено привлечением гетерохроматиновых белков и белка Rb к промоторам E2Fзависимых генов пролиферации, приводящим к репрессии генов-мишеней транскрипционного фактора E2F. При старении снижается активность метилтрансфераз DNMT1 и DNMT3a, деацетилазы SIRT1, увеличивается активность гистоновых деметилаз Jmjd3 и Jarid1b, что приводит к неадаптивному изменению «эпигенетического ландшафта» клетки, изменению экспрессии генов, способствующему старению. Таким образом, анализ имеющихся сведений об эволюционно-консервативной генетической регуляции старения и долгожительства позволил сформировать функциональную классификацию генов продолжительности жизни: «Регуляторы» продолжительности жизни. Переключатели онтогенетических программ (отвечают за восприятие и передачу внешнесредовых сигналов, синтез, рецепцию и трансдукцию гормонов инсулинового пути, вторичных липофильных гормонов). Большая часть из них способствует росту и размножению, но подавляет стрессоустойчивость. Некоторые, напротив, стимулируют 1. Таблица. Процессы, в которых задействованы гены, изменяющие свою экспрессию при старении организма Процесс Участвующие гены Дифференцировка клеток CLU, B2M, APOD,TFRC,LGALS3, GFAP, S100A6, S100A4, GADD45B, GADD45G, PTGS2, NOX4, COL3A1, UQCRQ PTGS2, DDIT3, GADD45A, GADD45B, GADD45G, CDKN1A, CDKN2A, SIRT1, PSMD11 C1QA, CLU, B2M, PCSK6, S100A6, CX3CL1, HLA-G, ADIPOR2, DERL1, TXNIP, PSMD11, SIRT1,CDKN2A, CDKN1B, ANXA5, PTGES3, TNFSF10, CCL2,LITAF, GBP2, COL3A1, EFEMP1, AGER, C3 GBP2, COL3A1, COL1A1, HBA1, CLU, CALB1, CCL2, PTGS2, NOX4, ACSS2, DNMT3A, DNMT3B, DNMT1, LONP1, CAT, SOD2, GSTA1, MGST1, CLIC4, DERL1, ADIPOR2, HLA-G, CX3CL1, CTSS, B2M HBA1, IL6, CAT, SOD2, SIRT1, MGST1, LONP1, CLU, COL1A1, PTGS2, DDIT3, TXNIP TFRC, CCL2, CX3CL1, SOD2, PTGS2, CAT, SIRT1, LONP1, NDRG1 CDKN1B, CDKN1A, PSMD11, GADD45A, NDRG1, SIRT1 C3, IL33, PTGS2, IL6, CXCL1, SERPING1, APOD, PPARG MSN, COL3A1, C1QA, C1QC, C1QB, SERPING1, HCST, CLU, APOD, CX3CL1, HLA-G, PPARG, CDKN1A, CDKN2A, SIRT1 GBP2, SIRT1, PTGS2, CCL2, CX3CL1, HLA-G, B2M, COL3A1 LYZ, SERPING1, APOD, GFAP, CX3CL1, CCL2, COL1A1, TFRC, C3, COL3A1, COL1A1, SOD2, PTGS2, NOX4, ANXA5, CSORF13, KDM6B Регуляция клеточного цикла Межклеточная сигнализация Ответ клетки на химические стимулы Ответ клетки на оксидативный стресс Ответ на гипоксию Ответ на повреждение ДНК Регуляция воспалительного ответа Регуляция процессов иммунной системы Ответ на цитокиновые стимулы Ответ на поранение устойчивость к стрессу (например, Klotho). «Медиаторы» (киназы, деацетилазы белков, транскрипционные факторы). Под действием регуляторов они осуществляют переключение программ стрессоустойчивости в ответ на сигналы из окружающей среды (наличие пищи, перенаселение, условия температурного и светового режимов, облучение) или эндогенный окислительный стресс. Тканеспецифичным образом регулируют экспрессию разных эффекторных генов либо непосредственно активность или время жизни белков. Кроме того, «медиаторы» взаимодействуют между собой, подавляя или стимулируя эффекты друг друга. «Эффекторы», гены стрессоустойчивости: гены белков теплового шока, антиоксидантной защиты, репарации белков и ДНК, компонентов протеосомы, гены кальпаинов, белков автофагии, врожденного иммунитета, детоксификации ксенобиотиков и регуляторов метаболизма. Сверхэкспрессия этих генов, как правило, увеличивает продолжительность жизни. Зачастую они действуют аддитивно, активируясь под действием отдельных «медиаторов» и увеличивая продолжительность жизни в условиях стресса. Ряд «медиаторов», напротив, подавляет их активность. Гены жизнеспособности или гены «домашнего хозяйства». Функционируют повсеместно, на всех стадиях жизненного цикла и обеспечивают структуру клетки, дыхание, биосинтез аминокислот, липидов и нуклеотидов и т. д. Их мутации либо летальны, либо ведут к патологиям. В условиях стресса некоторые из них могут временно репрессироваться под действием «медиаторов», что позволяет сэкономить ресурсы для функционирования «генов-эффекторов» и увеличить продолжительность жизни. Гены, участвующие в функционировании митохондрий. Это компоненты электронотранспортной цепи, цикла трикарбоновых кислот, рассопрягающие белки, ген clk-1 у нематод. Регулируют энергетический метаболизм, уровень свободных радикалов, а некоторые из них — апоптоз. Гены-регуляторы клеточного старения и апоптоза (p53, p21, p16, pRB). Участвуют в предотвращении рака, регуляции клеточного цикла и гибели ненужных или вредных клеток в раннем онтогенезе и зрелости. Плейотропным побочным действием в старости является клеточное старение (репликативное или стресс-индуцированное) делящихся клеток или избыточная убыль постмитотических клеток. Полный текст статьи опубликован в журнале «Экологическая генетика» Tом XI № 1 2013 ОБЗОР ОСНОВНЫХ ГРУПП ГЕНОВ СТАРЕНИЯ Методы изучения и вмешательства 2. в эпигенетические и генетические процессы Анализ предрасположенностей и вмешательства в генетические и эпигенетические процессы, ассоциированные со старением Выявление факторов, Генотипирование Гены, экспрессия которых снижает продолжительность жизни Мишени Подходы РНК-интерференция мтДНК SNPs Белок-коди­ рующие гены Делеционный полиморфизм Микро- и мини­ сателлиты Полногеномное секвенирование Гены, коди­рующие регуляторные РНК Фармакологическое подавление активности продуктов Гены, экспрессия которых увеличивает продолжительность жизни Мобильные гене­тические элементы Некодирующие регуляторные последовательности Инструментарий ДНК-чипы Низкой плотности PCR Высокой плотности Экспрессионные микрочипы RT-qPCR Оценка уровня мРНК отдельных генов-мишеней Полногеномные чипы метилирования Внесение в клетку дополнительных копий генов Ретровирусные векторы (внесение копии гена в яДНК) Аденовирусные векторы (внесение копий без встраивания в геном) PCR-arrays Профилирование уровней метилирования генов Метил-чувст­ вительный PCR Фармакологическое подавление их ингибиторов или индукция активаторов Секвенирование ДНК Профилирование экспрессии генов 5. 6. Терапевтические вмешательства предрасполагающих к возникновению возрастзависимых патологий для планирования профилактических вмешательств 3. 4. 9 MALDI-TOF масс-спектро­ метрия Атомно-силовая микроскопия (AFM) Адресная тканеспецифическая доставка продукта гена (стабилизированной мРНК или белка) Тканеспецифическое (???) изменение уровня метилирования промоторов определенных генов, модификация гистонов 10 Прямая речь От первого лица Старение нужно признать болезнью и лечить Девид ГЕМС, Лондонский университетский колледж (Великобритания): – Старение прослеживается везде, где для этого существуют эволюционные условия – оно отмечается даже у бактерий и одноклеточных грибов. Однако некоторые виды, на первый взгляд, не подвержены старению, включая животных (например, Hydra vulgaris). Таким образом, старение не является обязательной особенностью живых систем. Джуди Кампизи, Баковский институт изучения рака (США): Когда будет найдено лекарство от старости? – Будущее практически невозможно предсказать. Прорыв придет, откуда не ждали. Может быть, это будет клеточная терапия, может быть, стволовые клетки. Брайан Кеннеди, президент Института Бака (США): – Чтобы проводить клинические испытания на людях и регистрировать препарат как антивозрастное средство, нужно, чтобы сначала официально было признано, что старение является болезнью или особым физиологическим состоянием, требующим лечения. Пока ни в одной стране мира правительство этого не признало. Также очень остро стоит вопрос нехватки финансирования для исследований старения. Клаудио Франчески, Университет Болоньи (Италия): – Я, конечно, уважаю достижения современной науки, но пока мы не приступим к широкомасштабным исследованиям на людях, ожидать появления «таблетки от смерти» не приходится. Михаил Благосклонный, Онкологический институт имени Розвелла Парка в Буффало (США): – Возрастные заболевания – это признаки старения, как дым – признак огня. Замедление старения одновременно продлит жизнь и отодвинет возрастные заболевания. 11 ГЕНЕТИКА СТАРЕНИЯ И ДОЛГОЛЕТИЯ 25 вопросов Михаилу Батину 2014 Интервью с Президентом Фонда поддержки научных исследований «Наука за продление жизни» [1] Михаил, как давно существует ваш Фонд, и с какими целями он был создан? – Фонду пять лет. Главная цель одна – добиться создания научных технологий радикального продления жизни. [2] И как успехи, будем мы жить вечно? – Я думаю, это будет зависеть от ума. Недостаточно умные умрут. Мыслящие, в конечном итоге, будут жить долго и счастливо. [3] В чем заключатся ваша работа? – Доказывать, что белое – это белое, а черное – это черное. Убеждать людей, что быть живым хорошо, а быть мертвым – плохо. [4] До сих пор это сделать не удалось? – Нет. Хотя какие-то процессы осознания в обществе начались. В СМИ тема продления жизни стала модной. Под эту идею начали давать мегагранты. Но все это – капля в море. [5] Главное достижение Фонда, на Ваш взгляд? Чем можно гордиться? – Организация первой в России операции по трансплантации биоинженерной трахеи, которую провел профессор Маккиарини. Передача его технологии российским специалистам. Участие в проведении экспериментов, результатом которых стало существенное увеличение продолжительности жизни модельных животных. Проведение двух международных конференций по генетике старения. Сейчас готовим третью. [6] Почему вас интересует именно генетика старения? – Меня много что интересует в области продления жизни. Но генетические методы корректировки старения – одно из самых перспективных направлений. Пожалуй, самым многообещающей работой является создание генной терапии долголетия. [7] Кого вы приглашаете на конференции? – Ведущих ученых с безупречной репутацией, признанных лидеров в своей области. Если на первую конференцию в 2010 году к нам приехали около 50 специалистов из 7 стран, то в 2012 – уже более 200 ученых из 20 стран. [8] Каковы стратегические задачи этих конференций? – Стратегических задач две. Первая – нам нужен глобальный проект изучения старения, по масштабам сопоставимый с созданием Большого Адронного коллайдера – международная программа «Энджином человека». Вторая – нам необходимо показать инвесторам всю перспективность вложения средств в эту научную область. [9] Что вы на сегодняшний день можете предложить инвесторам? – Для начала я могу предложить задуматься над тем, что капитализация мертвого инвестора равна нулю. [10] Вы сами покупаете акции компаний, занимающихся разработкой технологий продления жизни? – Да. Глупо этого не делать. 12 От первого лица От первого лица 13 ГЕНЕТИКА [11] Почему Вы тратите столько денег и сил на борьбу со старением? – Старение – глобальная проб­ лема номер один. Если вы не боретесь со старением, это не значит, что старение не борется с вами. Распад вашего организма не останавливается ни на секунду. Необходимо минимум воображения, чтобы перенестись на 30-40 лет вперед и понять, что на самом деле является вашей основной проблемой. [12] Почему богатые люди не спешат вкладываться в исследования старения? – Потому что любят деньги больше, чем жизнь. [13] Но если посмотреть на проблему прагматично, на омолаживающих препаратах можно хорошо заработать? – Конечно, это приятно – заработать несметные богатства на реальном, нешарлатанском лекарстве от старости. Но для меня гораздо важнее сама возможность воспользоваться средством радикального продления жизни. Чтобы оно было доступно для меня, моих родных и близких, да для всех. У нас, трансгуманистов, другая психология. Продление жизни – самое главное. Все остальное, включая деньги – лишь средства достижения этой цели. [14] Вы являетесь ярким выразителем идей трансгуманизма. Сформулируйте их суть. – Трансгуманизм, прежде всего – этический выбор, выбор между добром и злом. В пользу добра, конечно. Мы исходим из того, что смерть – это зло, а смерть всех живущих на земле является торжеством зла. Идея трансгуманизма – борьба со смертью и её причинами, то есть борьба со злом во всех его проявлениях. [15] Чем трансгуманизм отличается от религии? – Тем, что предлагает вести борьбу со смертью, борьбу со злом рационально – с помощью науки, с помощью доказанных и работающих методов. [16] Почему люди не хотят бороться со смертью? – Люди смирились с ситуацией. Они говорят об естественности умирания, о необходимости освободить место для других поколений. Эти оправдания смерти – от безысходности, от незнания теоретических возможностей науки, от нежелания действовать рационально. Человеку проще принять смерть и старение, чем начать действовать. Борьба со смертью и старением – это сложное внутреннее решение. Нужно решиться противостоять сложившимся устоям, добиться победы воли и разума над желанием психологического комфорта, над сиюминутным интересом. [17] Что больше всего мешает тому, чтобы люди жили сотни лет? – Вера в загробную жизнь. Очень для многих смерть – это не понастоящему. То есть большинство людей серьезно рассчитывают на жизнь после смерти и не видят смысла продлевать реальную жизнь. [18] Принято считать, что продолжительность жизни зависит в первую очередь от генетики, во вторую – от окружающей среды и в третью – от качества медицины. Ваше мнение? – В ходе исследований ученые все лучше понимают процессы, происходящие в организме при старении. Очевидно, что старение – это результат взаимодействия генов и среды. Нет сомнений, что нас ждут научные Проект Фонда по развитию регенеративной медицины в России Профессор Паоло Маккиарини впервые приехал в Москву по приглашению Фонда «Наука за продление жизни». 19 февраля в Президиуме РАН он дал мастер-класс для клеточных биологов, трансплантологов и хирургов из Москвы, СанктПетербурга, Обнинска, Новосибирска, Екатеринбурга и других городов России, рассказав о методике проведения операций по пересадке трахей, выращенных их стволовых клеток пациентов. [19] В какой области исследований нас ждет прорыв? – Я думаю, мы увидим практически одновременно и выращивание сложного органа человека, и сверхдолгоживущих трансгенных млекопитающих, и управление регенерацией, и эффективные «вирусы долголетия». [20] Кого из ученых Вы можете назвать лидером в геронтологии? – Есть 30–40 лабораторий в мире, которые в своих исследованиях идут более-менее ровно. Большинство ведущих ученых в этой области вы сможете увидеть в Сочи в следующем году на конференции «Генетика старения и долголетия». [21] Как вы относитесь к понятиям «здоровое» или «успешное» старение? – Это оксюморон. Старение может протекать более болезненно или менее болезненно. Старение можно замедлить. Но нельзя сделать деструктивный процесс ни здоровым, ни успешным. Как нельзя сделать нищету достойной, а зубную боль – приятной. [22] Что важного можно сделать для продления жизни уже сейчас, не дожидаясь научных прорывов? – Первое – добиться, что бы ВОЗ признала старение заболеванием. Только тогда можно будет разрабатывать лекарственные препараты простив старения и выводить их на рынок. А это самый большой рынок в мире, так как стареет 100% населения во всех странах. Еще 100 лет назад Илья Мечников, Нобелевский лауреат, писал: «Старость – это болезнь, которую можно и нужно лечить». Но ВОЗ и ныне там. Второе – внедрить диагностику старения в клиническую практику. [23] Несколько лет назад вы предложили оценивать эффективность государственной власти по средней продолжительности жизни в стране и по тем мерам, которые принимаются для ее существенного повышения. 2012 год, июль [24] С этой точки зрения, кто из наших современников самый полезный человек? – Я думаю, сейчас это Сергей Брин. Но надо посмотреть, как он потратит миллиард, обещанный для радикального продления жизни. [25] А какие исследования вы считаете первоочередными? – Думаю, что нужно вести исследования по всем направлениям. Некоторые считают это неверным, но я думаю, в борьбе со старением такая стратегия самая правильная. Беседовала Алла Павлова. Фотографии предоставлены Фондом «Наука за продление жизни» В Москве на Площади Революции организован Митинг в поддержку развития технологий радикального продления жизни. 2012 год, 22 сентября 2010 год, декабрь 2010 год, сентябрь В Российском научном центре хирургии имени академика Б.В. Петровского РАМН (г. Москва) в декабре 2010 года впервые в нашей стране была успешно проведена уникальная операция по трансплантации трахеи с использованием методов регенеративной медицины. Фонд выступил инициатором создания в России политической Партии продления жизни. 2012 год, 14 декабря 2012 год, сентябрь 2011 год, декабрь Паоло Маккиарини получает мегагрант для реализации проекта «Регенерация тканей дыхательных путей и легкого» на базе Кубанского медицинского университета. Вы и сейчас так 2014 считаете? – Да. И оценивать по этому показателю нужно не только эффективность власти, но и эффективность всей мировой науки. Борьба за продление жизни – самая разумная политика для всех и для каждого. Самое нужное и осмысленное занятие, которым когда-либо занимался человек – это борьба со старением. Победить или даже просто замедлить старение – самое полезное, что можно сделать для всех людей на планете. Проект Фонда по формированию социального заказа на исследования в области продления жизни В Клинике Carreggi Университета Флоренции 15 сентября начался первый цикл обмена опытом между специалистами Российского научного центра хирургии РАМН и лабораторией профессора Паоло Маккиарини. 2010 год, февраль открытия, которые позволят и корректировать геном, и обеспечивать благоприятную среду, и при помощи биомедицинских технологий поддерживать здоровье человека сколь угодно долго. СТАРЕНИЯ И ДОЛГОЛЕТИЯ 2012 год, июнь В Краснодарской краевой клинической больнице №1 им. проф. С.В. Очаповского 19 июня проведена первая в мире трансплантация искусственной трахеи и части гортани с использованием собственных клеток пациента. В Брюсселе на Гранд Плас проведена акция по привлечению внимания к проблемам недостаточного финансирования исследований в области биотехнологий. На 25-й Московской международной книжной выставкеярмарке была представлена книга Михаила Батина и Алексея Турчина «Футурология. XXI век: бессмертие или глобальная катастрофа». 14 Генная терапия ГЕНЕТИКА СТАРЕНИЯ И ДОЛГОЛЕТИЯ 2014 medportal.ru Генная терапия за неделю излечила лейкоз Как сообщил 26 марта Scientist, в Мемориальном онкологическом центре Слоан-Кеттеринг в Нью-Йорке прошли успешные ограниченные испытания генной терапии острого лимфобластного лейкоза, болезни системы кроветворения, которая считается неизлечимой. У одного из пациентов, Дэвида Апонте (David Aponte), признаки заболевания исчезли всего за восемь ствует только там. Ученые выделили у пациентов клетки другого типа, Т-лимфоциты, с помощью обезвреженного вируса внесли в них ген, направляющий эти клетки иммунной системы на все клетки с маркером CD19. Затем генно-инженерные Т-лимфоциты вводились пациентам, в организме которых они сразу атаковали и уничтожали все В-клетки, не только раковые. Как отмечает Майкл Саделейн, «у всех пяти пациентов после такого лечения злокачественный рост стал неопределяемым». По подсчетам ученого организм должен был восполнить недостаток обычных Т-лимфоцитов и здоровых В-клеток за два месяца, однако для того чтобы гарантировать восстановление здоровой иммунной системы пациентам делали пересадку костного мозга. В настоящее время группа Саделейна изучает возможности направления Т-лимфоцитов на поражение опухолевых клеток других раковых заболеваний. В тех случаях, когда на Секвенирование генома Новые статистические методы позволят усилить возможности геномики Майкл Саделейн, директор Центра клеточной инженерии поверхности раковых клеток не удается выявить уникальную молекулумишень, ученые пытаются нацелиться на два маркера, присутствующих в паре только на клетках злокачественного роста. Британские медики начинают применять генную терапию для лечения «сердечников» В публикациях, вышедших недавно в журнале PLOS Genetics, две группы исследователей под руководством ученых из Медицинской Школы при Калифорнийском Университете Сан-Диего (США) описали новые статистические модели, позволяющие шире и глубже идентифицировать связи между однонуклеотидными полиморфизмами ДНК и фенотипом. Новые модели дадут возможность более полно и точно изучить генетические основы множества заболеваний и способов их лечения. Создан новый софт для поиска болезнетворных генов russian.rt.com Дэвид Апонте дней, у четырех других больных то же самое произошло за восемь недель, хотя один из них позже скончался от закупорки кровеносного сосуда, не связанной с терапией, а другой после обострения. У всех троих излечившихся, которые к началу экспериментальной терапии находились в стадии обострения заболевания, в настоящее время отмечена ремиссия, которая продолжается от пяти месяцев до двух лет. По словам одного из руководителей и соавтора исследования Майкла Саделейна (Michel Sadelain), следующее испытание с привлечением 50 пациентов уже подготовлено, и он с коллегами планирует применение испытанного терапевтического подхода к другим раковым заболеваниям. Ключевым моментом этой генной терапии является выявление уникальной молекулы на поверхности раковых клеток с последующей генетической модификацией иммунных клеток пациента таким образом, чтобы они могли прицельно атаковать злокачественные клетки. При остром лимфобластном лейкозе происходит неконтролируемая пролиферация незрелых В-клеток иммунной системы. Группа Саделейна выявила на поверхности таких злокачественных клеток молекулу, обозначенную CD19, которая присут- 15 гены на здоровые или «подсажи Такой подход к лечению еще вать» в организм те, что помогут никем и никогда не практикоему справиться с болезнью. вался. Беспрецедентный метод Британцы пока делают лишь обещает избавить людей от первые шаги в этой области медисердечно-сосудистых заболеваний цины, которая еще не полностью без применения каких-либо медиизучена. В теории генная терапия, каментозных препаратов. Вместо помимо сердечных заболеваний, этого хирурги будут пересаживать может помочь в лечении опредепациентам здоровые гены. ленных типов вирусных инфекПервыми новый метод на себе испробуют 250 человек. От них «В поисках правильного метода будет зависеть лечения генами прошло 20 лет судьба дальнейизнуряющей и кропотливой работы, ших испытаний. но нам до сих пор немного боязно Если все пройприступать к совместной терапии дет успешно с кардиологами. В то же время мы и результат горды быть «пионерами» в этой не заставит усомниться в области», – заявила профессор состоятельности фармакологии Имперского колнового подледжа Лондона Шин Хардинг. хода в течение определенного времени, генная терапия получит ций, наследственных отклонений более широкое применение. и некоторых форм рака. Способ лечения заключается в Применению этой терапии пересадке здоровых генов паципредшествовали 20 лет лабораентам с различными сердечными торных исследований в США. Там заболеваниями вместо оперативее испробовали на 37 пациентах, ного вмешательства или лечения но лишь для того, чтобы узнать, медикаментами. К примеру, мединасколько она безопасна. ки могут менять мутировавшие Андерс Дэйл В качестве примера профессор Андерс М. Дэйл (Anders M. Dale) упоминает результаты недавнего исследования, опубликованные в Nature Genetics: использовав традиционный метод GWAS, ученые смогли выявить более десятка новых однонуклеотидных полиморфизимов, связанных с первичным склерозирующим холангитом (хроническим воспалительным заболеванием печени). После этого исследователи применили новые статистические методы и обнаружили с их помощью 33 дополнительные замены, тем самым более чем утроив число позиций в геноме, связанных с опасным для жизни заболеванием печени. Таким образом, новые методы увеличивают аналитические мощности исследователей, объединяя априорные сведения о функциях полиморфизмов c учетом их плейотропной (множественной) взаимосвязи с множеством фенотипов. «Метод GWAS сводится к поиску вариантов среди 1 млн. пар однонуклеотидных полиморфизмов, – говорит профессор Дэйл. – Новый подход увеличит эффективность поиска в 10-100 раз, до 3 млрд. позиций. Это позволит извлечь максимум возможной информации, которая важна для открытия генов, разработки лекарственных препаратов и более точной оценки индивидуального риска развития определенных заболеваний». По материалам University of California, San Diego Health Sciences Группа ученых под руководством специалистов из Университета Рокфеллера добилась серьезных успехов в разработке алгоритма поиска болезнетворных генов в ДНК человека. Компьютерная программа, разработанная командой Юваля Итана, определяет кратчайший маршрут между любыми двумя генами человека (как своеобразный GPS-навигатор), что позволяет легко обнаруживать отклонения в генетической карте и диагностировать генетические заболевания. Некоторые заболевания вызваны всего лишь одной мутацией гена. К сожалению, современные методы выявления болезнетворных генов дают сотни потенциальных вредоносных генов, и врачам приходится тщательно выискивать среди них тот самый, болезнетворный. Но теперь, благодаря новому программному алгоритму, появилась возможность упростить «охоту» на них. Юваль Итан Новое программное обеспечение впервые использовали для поиска мутаций, связанных с геном под названием TLR3, который очень важен для устойчивости организма к особому штамму герпеса, вызывающему тяжелые повреждения мозга у генетически предрасположенных детей. Ранее исследователи Лаборатории Сент-Джайлз во главе с Жан-Лоран Казанова уже обнаружили, что тяжелое течение такого заболевания связано с мутацией генов, расположенных близко к TLR3. Чтобы проверить, насколько хорошо работает новое программное Новый алгоритм поиска искал болезнетворные гены среди 5% генов с самым коротким расстоянием от гена TLR3 (в центре). В результате среди 601 гена удалось найти болезнетворные гены еще до того, как они были выявлены в ходе трудоемких экспериментов СNews.ru обеспечение, ученые провели поиск среди всех генов, кодирующих белки, у двух пациентов с генетическими заболеваниями. Нужно было обнаружить один болезнетворный ген среди сотен других генов с потенциально болезнетворными мутациями. После сортировки генов, близких к TLR3, новая система обнаружили искомый болезнетворный ген TBK1. Кроме того, программа нашла два других болезнетворных гена, EFGR и SRC, которые ответственны за синдром Элерса-Данло и нейросенсорную потерю слуха. Жан-Лоран Казанова По словам разработчиков, новая технология поиска буквально позволяет найти «иголку в стоге сена» – один или несколько генов, связанных с известными генетическими заболеваниями. Таким образом, становится возможной быстрая диагностика потенциально смертельных генетических заболеваний, что особенно важно для перспективной генной терапии. Кроме того, новая методика может помочь изучить пока неизвестные генетические механизмы. 16 17 Эволюция идей в геронтологии 1850-e ЭВОЛЮЦИОННЫЕ ТЕОРИИ 1880-e 1890-e 1900-e 1910-e 1920-e 1930-e Теория Эволюции 1940-e 1950-e Снижение силы отбора с возрастом Darwin, 1859; Wallace, 1959 Карбонильная интоксикация Yin, Brunk, 1995 Selye, 1936 Неврозы ускоряют старение Дистресс способствует старению И.П. Павлов, 1924 Омолаживающий эффект экстрактов половых желез Selye, 1956 Половые гормоны Brown–Sequard, 1889 Элевационная теория Voronoff, 1925 В.М. Дильман, 1968 Изменение баланса гормонов Дегенерация щитовидной железы Теория «интенсивности жизнедеятельности» Altman, 1886 Растрата «запаса жизненной энергии» Свободнорадикальная теория Lohmann, 1929 Иммуностарение Campbell, Work, 1953 Гуморальная теория иммунитета Соединительная ткань Ehrlich, 1897 А.А. Богомолец, 1938 Клеточное старение (лимит Хейфлика) Weismann, 1889 КЛЕТОЧНЫЕ ТЕОРИИ Старение – терминальная дифференцировка клеток Введено понятие стволовой клетки Maximow, 1909 Растрата «жизненного фермента» И.И.Шмальгаузен, 1926 Мембранная гипотеза Израсходование «определенных веществ» Законы наследования Апоптоз как причина старения Уманский, 1982 Гематопоэтические стволовые клетки Протечка ядерных пор при старении клетки Kotwaliwale, Dernburg, 2009 Дефект ламины стенки ядра при синдроме ХатчинсонаГилфорда De Sandre-Giovannoli et al., 2003 Реактивация теломеразы в организме мышей, больных прогерией Jaskelioff et al., 2010 Ho, Punzel, 2003 Conboy et al., 2003 Открытие гематопоэтической стволовой ниши Schofield, 1978 Till, McCulloch, 1961 Старение стволовой ниши Стволовые клетки в старении Открытие теломеразы Lajtha, Schofield, 1971 Клеточное старение как антираковый механизм McCormick, Campisi, 1991 Greider, Blackburn, 1985 Снижение способности клетки к самообновлению белков Поперечные сшивки Нагорный, 1935 Crick, Watson, 1956 Радиационное старение Russ, Scott, 1939 1901 Bjorksten, 1968 Двойная спираль ДНК Muller, 1927 Переоткрытие законов Менделя Szillard, 1959 Рецепторы AGEs на поверхности клеток Роль в старении транспозиций мобильных элементов Murrey, 1990 Сверхэкспрессия отдельных генов продлевает жизнь Cerami, 1985 Теория катастрофы ошибок Orgel, 1963 Соматические мутации Конечные продукты гликирования (AGEs) Роль повреждений ДНК в старении Снижение уровня метилирования ДНК при старении Г.Д.Бердышев, Б.Ф.Ванюшин, 1967 СИСТЕМНЫЕ ТЕОРИИ 1825, 1860 Понятие гомеостаза Сбои в процессе функционирования сложной системы А.А. Богданов, 1927 Mandelbrot, 1975 Адаптивно-регуля­торная, Генорегуляторная В.В. Фролькис, 1965 Сверхэкспрессия генов репарации ДНК продлевает жизнь Plyusnina et al., 2011 Ген синдрома Вернера Nakura et al., 1993 Модификации гистонов при старении Понятие фрактала Cannon, 1932 Orr, Sohal, 1992 Johnson et al., 1990; Kenyon et al., 1993 Rose, Charlesworth, 1981 ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ ТЕОРИИ Neeper et al., 1992 Мутации ряда генов продлевают жизнь Vilenchik, 1970 Создание линий мух-долгожителей путем селекции на позднюю плодовитость Закон Гомперца-Мейкхема Одновременная активация теломеразы и онкосупрессорных генов в организме мышей Tomás-Loba et al., 2008 Verzar, 1956 Открытие индуцированного мутагенеза Mendel, 1865 Нарушение дифференцировки клеток из-за Реактивация теломеразы Открытие старение-ассоциированного изменения экспрессии генов Cutler, 1982 в культуре клеток Bodnar et al., 1998 секреторного фенотипа Campisi et al., 2005 Zs-Nagy, 1978 Оловников, 1971 Сшивки коллагена Ruzicka, 1922 Loeb, 1903 ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ТЕОРИИ Обеднение организма недифференцированными клетками Franceschi, Ottaviani, 1997 Теория маргинотомии Strehler et al. 1959 Старение коллоидов Butschli, 1882 МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ТЕОРИИ Перекисное окисление липидов Minot, 1908 Kujoth et al., 2007 Врожденный иммунитет и хроническое воспаление как причина старения Walford, 1969 Hayflick, Moorhead, 1961 Ограниченная способность соматических клеток к делению Гомоплазия дефектных мтДНК Miquel et al., 1980 Аутоиммунитет А.А. Богданов, 1924 Hutter et al., 2004 Митохондриальная теория Harman, 1956 Система крови Mechnikov, 1882 Теория митохондриального «порочного круга» McCord, Fridovich, 1969 Открытие АТФ Rubner, 1908 В.Н. Анисимов и др., 1973 Образование свободных радикалов in vivo Pearl, 1928 Клеточная теория иммунитета Эпифиз как солнечные часы старения Korenchevsky, 1961 Lorand, 1904 Открытие митохондрий ИММУННЫЕ ТЕОРИИ Kirkwood, 1977 Теория общего адаптационного синдрома (стресса) И.П. Павлов, 1897 Bayliss & Starling, 1902 2010-e Теория отработанной сомы Strehler et al. 1959 Учение о высшей нервной деятельности 2000-e В. П. Скулачев, 1999 Отравление клеток липофусцином И.И. Мечников, 1903 Открытие первого гормона (секретина) 1990-e Теория феноптоза Medawar, 1946 Аутоинтоксикация продуктами жизнедеятельности микрофлоры толстого кишечника ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЕ ТЕОРИИ 1980-e Теория накопления мутаций Weismann, 1889 ЭНДОКРИННЫЕ ТЕОРИИ 1970-e Williams, 1957 Теория запрограммиро­ванного старения НЕЙРОГЕННЫЕ ТЕОРИИ 1960-e Теория антагонистической плейотропии Fisher, 1929 ИНТОКСИКАЦИОННЫЕ ТЕОРИИ Автор – Алексей Москалев Piña, Martínez, Suau, 1988 Стрессоустойчивость в основе долголетия Parsons, 1995 Теория надежности в геронтологии Гаврилов, 1978 Кольтовер, 1983 Регуляторная роль микроРНК при старении Boehm, Slack, 2005 Термодинамическая теория старения Сужение пространства гомеодинамики Rattan, 1998 Gladyshev, 1999 Фрактальная гипотеза старения А.А. Москалев, 2009 18 ПРЯМАЯ РЕЧЬ Генетическая диагностика Препараты для замедления старения появятся в ближайшие 10 лет Нир Барзилай, директор института геронтологии при медицинском колледже Альберта Эйнштейна (США): – Для долгожителей роль среды и стиля жизни не имеет первостепенного значения. Главную роль играют гены. Долгожители обладают унаследованным набором ДНК, способным противостоять ущербу от нездорового образа жизни. Андрей Селуянов, Рочестерский унверситет (США): – Большой прорыв произошёл в последние 10 лет. До этого мы думали: «Один ген – один процесс». Теперь ищем регуляторы множества генов, каскадов реакций. Такой подход позволяет разрабатывать лекарства, которые будут напрямую активировать эти каскады. Ян Вайг, Медицинский колледж Альберта Эйнштейна (США): Мне кажется, что за последнее десятилетие больше внимания стало уделяться вмешательствам. Люди увидели, что на самом деле существует большое количество способов продлить жизнь и увеличить здоровый период жизни модельным животным – от червей до мышей и обезьян. Однако, во многом из-за нехватки финансирования, мы до сих пор не знаем всех причин старения. В данный момент всем интересно что-то изменить в «черном ящике» старения, и гораздо меньше желающих пролить свет в этот «черный ящик». Вера Горбунова, Рочестерский университет (США): – Я думаю, в ближайшие лет 10 уже можно будет применять какие-то научно обоснованные препараты для замедления старения. Проблема в том, что на людях эксперимент займёт очень много времени, чтобы точно доказать эффект. Но по результатам, проверенным на лабораторных животных, такие препараты будут разработаны. Ричард Миллер, Университет Мичигана (США): Когда вы говорите: “Я занимаюсь исследованиями старения”, большинство людей думают, что вы хотите понять, что происходит с организмом человека в старости. Конечно, я считаю очень полезным изучение пожилых людей. Но, на мой взгляд, необходимо проводить исследования молодежи и людей среднего возраста, чтобы попытаться выяснить, в чем же заключается старение. Что нарушается со временем в их организмах? Какие изменения в экспрессии генов, в гормональной системе превращают их в пожилых людей? Вот что я считаю исследованием старения в его наиболее фундаментальном и, вероятно, самом продуктивном смысле. Андрей Гудков, научный директор Онкологического института имени Розвелла Парка в Буффало, США: – Наличие у рака «подготовительной стадии» создает потрясающую возможность. Можно просто время от времени убивать предраковые клетки. Например, раз в несколько лет делать превентивную, очистительную терапию. Ведь мы уже в сущности знаем, какие первые шаги делает клетка, чтобы стать плохой, — вот такие клетки и уничтожать. 19 ГЕНЕТИКА Технологии секвенирования нового поколения СТАРЕНИЯ И ДОЛГОЛЕТИЯ 2014 в диагностике и прогнозировании лечения рака П осле завершения секвенирования генома человека исследователи и клиницисты ощутили потребность в прочтении все большего количества индивидуальных геномов, чтобы найти ответы на фундаментальные и клинически значимые вопросы. Геномная информация, как ожидалось, даст ключ к пониманию природы болезней и позволит создать специфические диагностические и терапевтические стратегии, в частности, для лечения рака. Тем самым будет реализована идея таргетной и персонализированной медицины. Растущие потребности дали толчок технологическому развитию, и помимо традиционного метода секвенирования по Сенгеру стали появляться новые высокопроизводительные геномные технологии. В 2005 году возникли первые платформы для параллельного ДНК-секвенирования, открыв эру секвенирования нового поколения (next-generation sequencing, NGS). Эти технологии радикально увеличили скорость получения данных о нуклеотидной последовательности – до сотен гигабаз за один запуск прибора, в то время как стоимость секвенирования снизилась на несколько порядков. – полупроводниковое секвенирование (Ion Torrent), а также недавно появившиеся технологии: – секвенирования одной молекулы (Helicos Genetic Analysis System), – наносеквенирование (DNAnanoboll) (Complete Genomic). Они высокотехнологичны, то есть позволяют определять последовательность нуклеотидов быстрее и дешевле. В настоящее время на рынке лидирует компания Illumina, которая за два-три года собирается довести стоимость секвенирования Что такое NGS К технологиям секвенирования нового поколения относятся: – секвенирование путем синтеза с обратимой терминацией (Illumina), – пиросеквенирование (Roche), – секвенирование путем лигирования (SOLiD), HiSeq2000, Illumina одного генома с 30х покрытием (кратность прочтения) до суммы меньше $1000. Помимо полногеномного секвенирования, которое для многих клинических лабораторий остается слишком затратным, развивается таргетное секвенирование – ограниченное интересующими исследователей участками генома, которые можно прочитать с более высоким покрытием. Наиболее часто используются методы, основанные на обогащении образцов последовательностями исследуемых генов путем ПЦР (PCR-based enrichment methods). Другой вариант – методы обогащения, основанные на гибридизации (hybridization-based enrichment methods) с олигонуклеотидными ДНК-чипами либо в растворе на магнитных частицах-носителях. Преимущество методов гибридизации заключается в возможности охвата большого участка генома. Сложный геномный ландшафт опухоли Обстоятельство, осложняющее диагностику и лечение, состоит в 20 Генетическая диагностика ГЕНЕТИКА том, что злокачественная опухоль 2014 генетически неоднородна. Традиционно опухоль рассматривали как массу трансформированных клеток, которые несут сходные генетические отличия, и, хотя меняются по мере прогрессии заболевания и в ответ на лечение, но меняются в одном направлении. Использование методов NGS показало, что все гораздо сложнее – опухоль представляет собой совокупность клеточных популяций с различными профилями генетических нарушений. Гетерогенность можно считать отличительной чертой злокачественных новообразований, и именно она может стать причиной неточного диагноза и терапевтической устойчивости опухоли. Команда Чарльза Свантона (Charles Swanton) из Института исследований рака Университета Лондона (Cancer Research UK London Research Institute) провела полногеномное исследование клеток из биопсий первичных опухолей и их метастазов, полученных от четырех пациентов с почечно-клеточной карциномой. Убедившись в геномном разнообразии раковых клеток, ученые нашли подтверждение модели «ветвящейся эволюции» (branched evolution) клеточных популяций. В соответствии с этой моделью, опухоль инициирована клетками, несущими первичную мутацию, которые через какое-то время дают начало целому букету клональных клеточных популяций. Эти популяции несут первичную мутацию, но, поскольку в клетках ломается система защиты ДНК, в них быстро накапливают и другие мутации. «Опухолевые клетки гетерогенны на всех уровнях, – говорит Свантон. – От числа копий ДНК и мутаций до изменения уровней экспрессии генов и функциональных нарушений. Гетерогенность раковых клеток, по-видимому, перевешивает их общность». Его группа обнаруСТАРЕНИЯ И ДОЛГОЛЕТИЯ Генетическая диагностика Чарльз Свантон жила, что анализ биомаркеров даже в двух образцах одной и той же опухоли может дать противоречивые прогностические результаты. Это ставит под сомнение то, насколько точно геномный анализ материала, полученного при биопсии из одного или даже нескольких мест опухоли, позволит правильно определить стратегию лечения. Еще больше осложняет ситуацию свойство раковых клеток изменяться в ответ на терапию – так, метастазы, появившиеся после химиотерапии, могут быть генетически не очень похожи на первичную опухоль, из которой они возникли. Но, даже выявив это разнообразие, очень трудно отличить мутациидрайверы, определяющие развитие опухолевого процесса от «случайных пассажиров», по выражению Свантона. Он же говорит о том, что при всей гетерогенности в раковых клетках наблюдаются и признаки конвергентной эволюции, когда ветви с разными мутациями могут приобретать одни и тем же нарушения, например, инактивацию гена PTEN (ген фосфатазы, считающейся опухолевым супрессором). Свантон считает, что Модель «ветвящейся эволюции» это свидетельствует о сильном отборе, способствующем возникновению таких мутаций. Более полную информацию о гетерогенности опухоли дают технологии секвенирования единичных клеток, которые позволяют выявлять и разнообразие их геномных нарушений, и изменения транскриптомов. Однако для использования в клинической практике эти технологии пока слишком дороги, и, что еще более важно – результаты этих исследований трудно интерпретировать. Как бы то ни было, методы NGS оказались очень полезны для исследования клональной структуры и генетической эволюции опухоли. А поскольку гетерогенность значительно осложняет поиск биомаркеров и прогнозирование чувствительности опухоли к терапии, внедрение этих знаний в клиническую практику связано с большими ожиданиями по повышению точности постановки диагноза, подбора таргетной и персонализированной терапии. Мутации, ассоциированные с раком За последние годы в ходе исследований полногеномных ассоциаций (GWAS) выявлены сотни генетических вариаций, ассоциированных с болезнями. В большинстве случаев это однонуклеотидный полиморфизм (SNP), выражающийся в замене одного нуклеотида на другой. Но GWAS имеют дело только с обычными вариациями (частота встречаемости которых в популяции > 5%). На сегодня более 7000 сильных SNPассоциаций (p < 1.0 х 105) включено в каталог Catalog of Published GenomeWide Association Studies, собранный в Национальном институте исследований генома человека (National Human Genome Research Institute). Однако большинство этих SNP оказывает незначительный эффект и очень редко они являются причиной патологии. Гипотеза, связывающая обычные вариации с обычными болезнями, оказалась несостоятельной. Методы NGS дали возможность изучить редкие вариации (с частотой встречаемости <5%), связанные с предрасположенностью к болезням, в том числе, к раку. Для поиска редких вариаций необходимо полногеномное секвенирование относительно большой выборки людей. Этой цели должны послужить результаты проекта «1000 геномов», в котором будет составлен каталог генетических вариантов с частотой < 1% в популяции. Более амбициозный проект UK10K ставит своей целью секвенировать 10 тысяч геномов из двух хорошо фенотипически описанных популяций в Великобритании, чтобы описать редкие вариации, ассоциированные с несколькими болезнями. NGS технологии уже помогли выявить некоторые мутации, которые способствуют опухолевой трансформации (см. таблицу ниже). (Jiekun Xuan, Ying Yu a, Tao Qing a at all, 2013) Гены, входящие в диагностические панели, выявляемые методами NGS, представляют собой потенциальные мишени для таргетных препаратов или потенциальные маркеры устойчивости к ним. Большая часть этих лекарств создана для лечения часто диагностируемых раков, таких как 21 Гистограмма, показывающая диапазон мутации для гена CDKN2A (из базы COSMIC) рак молочной железы или прямой кишки. Для менее изученных форм опухолей методы NGS могут выявить неизвестные ранее ключевые мутации, что может стать основой для разработки новых биомаркеров. Хотя сегодня существуют база данных генетических вариантов, например Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC), собранный Институтом Сенгера (Wellcome Trust Sanger Institute), коллекция “золотого стан- дарта” прогностических индикаторов пока не создана, и лишь небольшая часть биомаркеров испытана и клинически проверена (менее 100 из нескольких тысяч). Большую проблему представляет интерпретация данных секвенирования. Некоторые компании специализируются на биоинформатических и системно-биологических подходах к этой проблеме, в том числе, разрабатывают компьютерные модели, воспроизводящие Гены Тип аберрации Тип опухоли Мишень Эффект Метод секвенирования Тип образца EBF1-PDGFRB, BCRJAK2, NUP214-ABL1 IL7R, SH2B3 слияние любая киназный сигнальный путь активация полногеномное мутация любая активация полногеномное TP53 мутация клет. карцинома цитокиновый сигнальный путь регуляция клет.цикла инактивация полногеномное VTI1A-TCF7L2 слияние прямая кишка транскрипц. факторы активация полногеномное ARID1A, ARID1B, ARID2, MLL, MLL3 PREX2 ATRX BRIP1 DNMT3A мутация печень регуляция хроматина инактивация полногеномное острая лимфобластическая лейкемия острая лимфобластическая лейкемия перифер. кровь колоректальные аденокарциномы гепатоклеточные карциномы мутация мутация мутация мутация меланома нейробластома яичники AML Rac exchange factor надстройка теломер репарация ДНК метилирование ДНК инактивация инактивация инактивация инактивация полногеномное полногеномное полногеномное экзом CBFB MAGI3-AKT3 N0TCH1 SF3B1 мутация слияние мутация мутация молочная железа молочная железа клет. карцинома CML транскрипц. факторы клет. сигнальный путь клет. сигнальный путь сплайсинг мРНК инактивация активация инактивация инактивация экзом экзом экзом экзом MXRA5 мутация легкое ремоделирование матрикса активация экзом CSMD3 мутация легкое неизвестно инактивация экзом RAC1 GRIN2A SPOP, FOXA1, MED 12 FAT4 ARID1A мутация мутация мутация мутация мутация меланома меланома простата желудок желудок клет. сигнальный путь глутаматные рецепторы регуляция транскрипции клеточная адгезия ремоделирование хроматина активация неизвестно неизвестно инактивация инактивация экзом экзом экзом экзом экзом меланомы нейробластомы перифер. кровь острые моноцитические лейкемии опухоли молочной железы опухоли молочной железы клет. карциномы головы и шеи хронич. лимфоцитические лейкемии немелкоклеточные карциномы легкого немелкоклеточные карциномы легкого меланомы меланомы опухоли простаты аденокарциномы желудка аденокарциномы желудка 22 Генетическая диагностика Генетическая диагностика ГЕНЕТИКА СТАРЕНИЯ И ДОЛГОЛЕТИЯ 2014 Майкл Пеллини сигнальные и транскрипционные пути в организме человека. Анализ РНК Методы секвенирования нового поколения позволяют исследовать не только ДНК, но и РНК злокачественных опухолей. Совокупность РНК, которые в настоящий момент синтезируются с ДНК, – транскриптом, представляет собой моментальный снимок спектров экспрессии генов и регуляторных элементов в клетке, ткани или организме при определенном физиологическом состоянии. Транскриптом включает матричные РНК (mRNA), а также микроРНК (miRNA) и другие некодирующие РНК. Разнообразие транскриптов (РНК, синтезируемых с одного гена) увеличивается за счет альтернативного сплайсинга, слияния генов, и редактирования РНК. Образование слитных генов считается одним из общих свойств злокачественной трансформации. Наиболее часто такие перестройки выявляются при гематологических новообразованиях и саркомах костей и мягких тканей, реже в эпителиальных карциномах. Обнаружить слияния генов в обычной солидной опухоли цитогенетическими методами сложно. Анализ РНК методами RNA-Seq значительно облегчает задачу поиска новых слитных генов в различных опухолях, в том числе при раке простаты, раке молочной железы, лимфоме, саркоме, меланоме. Специалисты считают, что появление слитных генов связано с механизмами канцерогенеза в некоторых органах и тканях, и на основе этого можно разработать специфические маркеры. Например, в В-клеточных лимфомах было обнаружено несколько вариантов слитных генов с участием трансактиватора MHC II классаCIITA. Можно предположить, что перестройка CIITA – это новый онкогенный механизм в лимфоидных опухолях. Определен также новый подтип кост- ной саркомы, вызванной слиянием генов BCOR-CCNB3. Другие варианты слияния генов представлены в различных типах рака. Например, слияние, включающее гены RAF сигнального пути, выявлено при раке простаты, раке желудка и меланоме, что указывает на терапевтическую мишень для всех трех типов рака. Некодирующие РНК участвуют в различных биологических процессах, включая пролиферацию, дифференцировку и апоптоз. Показано, что нарушения их экспрессии сопровождают патогенез многих болезней человека, в том числе рака. К ним относятся длинные некодирующие РНК (lncRNA), состоящие более чем из 200 нуклеотидов, которые задействованы в эпигенетических модификациях, регуляции транскрипции и пост-транскрипционном процессинге мРНК. Участие в возникновении рака доказано для десятков lncRNA, но их функциональный каталог еще далек от завершения. Последнее исследование выявило участие новой lncRNA – PCAT-1 в развитии рака простаты. Другой вид некодирующих РНК – микроРНК (miRNA), состоящие из ~22 нуклеотидов. Это важнейший регуляторный элемент экспрессии генов, свое влияние они оказывают, соединяясь с комплементарными последовательностями в таргетных областях. МикроРНК могут работать как онкогены или супрессоры опухоли, нарушение их экспрессии было описано при многих формах злокачественных новообразований. Специалисты считают, что профиль микроРНК, который выявляется методами NGS, может быть индикатором типа опухоли и степени злокачественности опухолевого процесса. Выявление микроРНК в биологических жидкостях открывает возможность для разработки методов неинвазивной диагностики и прогноза терапии злокачественных опухолей. Наконец, эпигенетические модификации ДНК (химические изменения, не затрагивающие последовательности нуклеотидов) вовлечены во многие процессы, происходящие в опухолях. Исследователи считают, что мониторинг статуса метилирования ДНК, проведенный NGS Панель SuraSeq компании Asuragen (Austin, Texas) – таргетное секвенирование от 5 до 52 опухоль-ассоциированных генов. Джилл Хэйгенкорд методами, будет информативен для диагностики, прогноза опухолевого процесса и ответа на терапию. Что уже делается Сегодня существует несколько пилотных проектов, развивающих применение методов секвенирования нового поколения в клинике. Так, ученые из Translational Genomics Research Institute (Phoenix, Arizona), в партнерстве с US Oncology Research (Woodlands, Texas) и Life Technologies (Carlsbad, California) используют полногеномное секвенирование, чтобы создать направленную стратегию лечения для 14 пациенток с тройным негативным раком молочной железы. В Мичиганском университете (University of Michigan, Ann Arbor) исследователи, работающие по программе ‘MI-ONCOSEQ’ (Michigan Oncology Sequencing Project), объединили результаты геномного и транскриптомного секвенирования опухолей у пациентов с поздними стадиями рака и нашли мутации, которые помогут разработать для них оптимальное медикаментозное лечение. Команда Foundation Medicine (Cambridge, Massachusetts) проверила свою панель из 182 генетических локусов, ассоциированных с раком, на приблизительно 400 пациентах и представила первичные данные на симпозиуме American Society for Clinical Oncology (ASCO). «Более 70% исследованных нами случаев связаны с клинически корректируемыми нарушениями», – сказал Майкл Пеллини (Michael Pellini), руководитель исследования. Команда специалистов в Genomics and Pathology Services (University of Washington, St. Louis) выполнила таргетное секвенирование 27 отобранных генов у сотен раковых пациентов. «Мы очень осторожны, потому что должны быть абсолютно уверены, что имеем доказательную систему, которую можно использовать в клинике», – говорит руководитель исследования. Компания Asuragen (Austin, Texas) недавно выпустила на рынок панель SuraSeq – три продукта, которые делают возможным таргетное секвенирование от 5 до 52 опухоль-ассоциированных генов. По словам Гэри Лэтмана (Gary Latham), директора по диагностическим исследованиям и развитию технологий, этот решение основано на клинических реалиях – ограниченном количестве исходного материала: «Обычно бывает, что если Ханс Лерах вы просите 50 нанограммов ДНК, то получаете 10, а если просите 10, то получаете 2». Компания Ion Torrent пришла к такому же решению, развивая AmpliSeq – панель для секвенирования мутаций в 46 различных опухоль-ассоциированных генах всего из 10 нанограммов ДНК. Другие компании делают ставку на полногеномное секвенирование, например, Complete Genomics (Mountain View, California). Джилл Хэйгенкорд (Jill Hagenkord), медицинский директор компании, замечает, что полногеномное секвенирование открывает возможность идентифицировать типы структурных перестроек, которые в изобилии встречаются в геномах опухолевых клеток, с разрешением, невозможным при традиционных методах исследования кариотипа. Он считает, что полногеномное секвенирование гораздо информативнее, чем таргетное. Многие специалисты обратились к анализу транскриптома. Например, компания Genomic Health (Redwood City, California) продвигает на рынок продукты линии Oncotype DX, использующие ПЦР с обратной транс- 23 крипцией (RT-PCR), чтобы проследить изменение профиля экспрессии ключевых генов, связанных с прогрессией и рецидивами рака молочной железы и прямой кишки. Специалисты, работающие по программе MI-ONCOSEQ, сделали трансриптомику ключевым компонентом своих исследований. «В биологии опухоли анализ транскриптома очень информативен», – говорит директор программы Ханс Лерах (Hans Lehrach). Он подчеркивает, что основная задача опухоли – устранить ограничение роста, и добиться этого она может любым способом – делецией участка хромосомы, приобретением точечной мутации в экзоне или аномальным метилированием промотора. Грандиозный проект в настоящее время планируется в Норвегии, его организатор Norwegian Cancer Genomics Consortium, участвуют в нем исследовательские группы в клиниках, биотехнологические и фармакологические компании. Цель проекта – секвенирование опухолевых и Ола Майклбост нормальных тканей каждого онкологического пациента в стране. Это первая национальная инициатива такого рода, она получила поддержку норвежского правительства. «Мы начали с того, что планируем секвенировать экзомы образцов опухолей и крови двух тысяч пациентов, охватив при этом восемь типов рака», – сказал Ола Майклбост (Ola Myklebost), лидер проекта (Oslo University Hospital). Еще более амбициозен IT-Future of Medicine (ITFOM) – обширный международный проект, входящий в программу Европейского Союза Future and Emerging Technologies (FET). Он ставит целью объединение разных источников данных – геномики, метагеномики, эпигеномики, транскриптомики, протеомики и метаболомики, для создания общих предсказательных моделей, пригодных для всех онкологических пациентов в Европе. Материал предоставлен компанией «Персональная биомедицина» 24 ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ГЕНЕТИКА СТАРЕНИЯ И ДОЛГОЛЕТИЯ 2014 Современные технологии редактирования генома В 2012-2013 годах ученые разработал три новых технологии целенаправленного изменения последовательности ДНК млекопитающих: CRISPR-редактирование, цинковопальцевые нуклеазы (Zinc finger nuclease, ZFN) и TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease). Изменение генома с помощью прокариотической системы иммунитета (CRISPR-редактирование) В конце 1980-х годов в ходе первых попыток секвенирования генома кишечной палочки японские исследователи обнаружили участки ДНК, содержащие множественные идентичные повторы, разделенные неидентичными, уникальными участками — спейсерами. Они есть примерно у 40% бактерий и почти у всех архей. Около десяти лет назад выяснилось, что последовательности спейсеров данного вида прокариот подозрительно часто совпадают с последовательностями геномов вирусов, которые поражают этот вид. Такое удивительное совпадение говорило о том, что CRISPR-система — это что-то вроде прокариотического приобретенного иммунитета, который позволяет запомнить врага и справиться с ним при повторном заражении. Ученые установили, что прокариотическая CRISPR-система защиты от вирусов очень похожа на эукариотическую систему РНК-интерференции, которая также участвует в антивирусной защите и использует для этого примерно тот же прием — присоединение к нежелательной мРНК короткого комплементарного РНК-участка и последующее выключение этой ненужной мРНК тем или иным способом (например, ее можно просто разрезать на кусочки). Бóльшая часть вставленных участков окажется бесполезной или даже вредной; однако некоторые 1 2 3 Рис. 1. Итоговая схема работы CRISPR-системы на примере инфекции бактерии E. coli фагом М13. 1. Всё начинается с того, что фаг нападает на неопытную, не встречавшуюся прежде с данным возбудителем бактерию и впрыскивает в нее свою ДНК. (На рисунке показан только один нападающий фаг и только одно колечко его ДНК, оказавшееся в клетке, однако на самом деле нападающих фагов и впрыснутых ими ДНК гораздо больше.) В ответ бактерия с помощью Cas1/Cas2-белков начинает лихорадочно вырезать все попавшиеся участки ДНК — как фаговые, так и свои собственные, хозяйские — и вставлять их в качестве спейсеров в CRISPR. Если бактерии повезло и она вырезала правильный кусочек из фаговой ДНК, то... 2. Инфекция вызовет реакцию соответствующей crРНК, Cascade-комплекса и Cas3 (подробно показанную на рис. 2 и 3), в результате чего фаговая ДНК будет уничтожена. Однако фаги тоже не лыком шиты, они тоже хотят выиграть эту войну. Стоит фагу мутировать (мутация показана красной точкой), как crРНК перестанет их распознавать, и они невидимыми проникнут в клетку и начнут делать свои черные дела. Казалось бы, клетка обречена, но... 3. Даже недостаточно комплементарный кусочек фаговой ДНК активирует CRISPR-систему, причем вырезание ДНК-фрагментов будет производиться уже именно из фаговой ДНК. Судя по всему, обеспечивается это тем, что Cas1/ Cas2-комплекс даже при некрепком, недостаточно комплементарном присоединении crРНК к ДНК фага начинает скользить по этой враждебной ДНК, вырезая из нее один кусочек за другим, пока не попадется участок, подходящий на роль «правильного» спейсера. Этот спейсер и спасет клетку от заражения. Изображение из статьи Kirill A. Datsenko et al., 2012. Molecular memory of prior infections activates the CRISPR/Cas adaptive bacterial immunity system «счастливчики» случайно вставляют в качестве CRISPR-спейсера фрагмент вирусной ДНК, что дает возможность синтезировать защитную crРНК и победить вирус. Этот новый спейсер они передадут всем своим потомкам, и поэтому от данного вируса их потомки будут защищены. Вообще, набор спейсеров в данной клетке — это, в каком-то смысле, ее история, память о прежних, выигранных, боях с вирусами. Но это еще не всё. Оказывается, вставка спейсеров происходит по принципу положительной обратной связи, то есть вставка одного спейсера резко стимулирует вставку последующих спейсеров из ДНК донора. Так, эксперименты, проведенные в лаборатории Константина Северинова, показали, Константин Северинов что если у данной бактерии есть спейсер к данному вирусу, повторное заражение этим вирусом вызывает направленную вставку дополнительных спейсеров из ДНК вируса. Иными словами, если бактерия уже атаковалась раньше вирусами, то следующие атаки она перенесет легче, потому что у нее будет способность идентифицировать чужеродную ДНК и вставлять новые спейсеры. Полученные знания о работе CRISPR-системы открыли новые перспективы ее применения. В 2013 году в Science вышли две статьи о возможности с помощью CRISPR-системы с невиданной доселе аккуратностью редактировать геномы высших организмов, включая человека Для того чтобы «отредактировать» какое-то место в ДНК, например исправить мутацию, приводящую к генетическому заболеванию, надо сначала это место разрезать. При этом разрезающий фермент — эндонуклеаза — должен обладать высочайшей специфичностью, то есть резать ДНК в нужном месте и только в нем (потому что разрезание ДНК в ненужном месте может привести к совершенно ненужным последствиям). А значит, участок ДНК, по которому распознается это нужное место, должен быть как можно длиннее — ведь чем он длинней, тем меньше вероятность, что такой же участок встретится где-то еще на просторах генома и что там тоже пройдутся «ножницы» эндонуклеазы. И вот так как защитный комплекс CRISPR-систем связывается с относительно длинными (не меньше 20 нуклеотидов) участками ДНК, соответствующими спейсерам, то возникает возможность достичь высокой специфичности редактирования. За основу своей разработки обе группы авторов опубликованных в Science статей взяли просто устроенную систему из Streptococcus thermophilus, состоящую всего из четырех обязательных элементов — tracrРНК, crРНК, РНКазы III и Cas9. Чем меньше компонентов, тем проще работать с системой и тем выше шанс, что система заработает в нестандартных для себя условиях работы в эукариотической клетке. Исследователям 25 Процессинг пре-crРНК и tracrРНК Спейсер (30 bp) пре-crРНК 5’–..ACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCU..–3’ •|||||• |||||||| GUUCAACUAUUGCCUGATCGGAAUAAAAUU CGAUACGA..–5’ A |||| GAA A tracrPHK AAAGUGGCACCGA •|||||||G 3’–UUUCGUGGCU Химерная РНК Направляющая последовательность 5’–NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAG A •|||||• |||| A 3’–GCCUGAUCGGAAUAAAAUU CGAUA GAA Рис. 2. «Химерная» РНК имеет все ключевые фрагменты crРНК и tracrРНК, необходимые для правильного функционирования в клетке: направляющую последовательность (самый значимый участок спейсера, связывающийся с ДНК) и участок повтора, связанный с кусочком tracrРНК. Такая «химера» гораздо проще по структуре, чем две отдельные молекулы crРНК и tracrРНК, а работает примерно с той же эффективностью. Изображение из статьи Le Cong et al., 2013. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Сходную структуру получили и исследователи из второй группы (Prashant Mali et al., 2013. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9) удалось еще более упростить систему. Во-первых, они создали «химерную» tracr-crРНК, которая работала ничуть не хуже, чем tracrРНК и crРНК, синтезируемые по отдельности (рис. 2). Во-вторых, они обнаружили, что бактериальная РНКаза III для работы системы не обязательна, поскольку ее функцию могут выполняют «местные» РНКазы, синтезируемые в эукариотической клетке. Таким образом, для того чтобы разрезать в клетке ДНК в нужном месте, нужно было сделать совсем немного: 1) Поставить последовательность, комплементарную этому «нужному месту», в качестве спейсера в CRISPRкассету и получить химерную tracrcrРНК. 2) Запустить экспрессию этой CRISPR-кассеты и белка Cas9 в соответствующей клетке, снабдив их сигналом ядерной локализации (NLS), чтобы они не «слонялись без толку» по цитоплазме, а плыли прямо в ядро, где, собственно, и находится разрезаемая ДНК. Получившаяся система в работе на клеточных культурах показала отличные результаты: с ее помощью можно как удалять из ДНК какие-то участки, так и вставлять туда новые области. Способы направленной модификации генома ZFN и TALEN Д ля повышения эффективности манипуляции с геномом, можно внести в то место в ДНК, которое мы хотим изменить, двухцепочечный разрыв. Разрыв в ДНК для клетки — очень тревожное событие, и она старается его «зашить» с помощью систем репарации. Здесь есть два возможных пути: гомологичная рекомбинация с другой хромосомой (или любой ДНК) либо негомологичное спаривание концов. В первом случае после «ремонта» всё становится как было, а в результате второго процесса часто остаются следы — как правило, небольшие делеции (мутации, характеризующиеся отсутствием какого-либо фрагмента ДНК). Если исходно исследователи намеревались сломать ген, цель можно считать достигнутой: с большой вероятностью, продукт этого гена будет испорчен. Если же в клетку ввести в качестве матрицы для рекомбинации нужную последовательность ДНК, поврежденный участок заменится на нужный исследователям фрагмент (опять же, с некоторой вероятностью). Именно на этом принципе основаны способы направленной модификации генома ZFN и TALEN. Как внести двухцепочечный разрыв именно туда, куда нужно? Собственно задачу разрезания ДНК отлично выполняет нуклеаза FokI — белок, способный разрезать любую последовательность ДНК на некотором расстоянии от места узнавания (последовательности из 5 нуклеотидов). Однако участки узнавания для FokI встречаются по всему геному, а разрыв нужно внести в какое-то конкретное место, например в интересующий исследователей ген. Для решения этой проблемы ученые обратили внимание на различные ДНК-связывающие белки, например транскрипционные факторы. 26 ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ГЕНЕТИКА Эти белки изменяют активность 2014 генов, связываясь с определенными последовательностями в их регуляторных областях. Поначалу особую привлекательность представляли так называемые домены «цинковых пальцев» — ДНК-связывающие участки белков, в поддержании структуры которых участвует ион цинка. Каждый такой «палец», как правило, узнает три определенных нуклеотида. Учитывая, что белки с «цинковыми пальцами» весьма разнообразны, удалось создать «код цинковых пальцев». Комбинируя разные «пальцы», можно создать белок, который в клетке будет направленно привлекаться к определенной последовательности ДНК. Если пришить такой домен к нуклеазе, полученный белок будет разрезать ДНК только в нужном месте (рис. 4). Однако «код цинковых пальцев» оказался недостаточно полным, чтобы можно было привлечь белок к любой последовательности. К тому же, остается небольшая вероятность, что «палец» распознает не свои три нуклеотида, и тогда ДНК будет порезана не только там, где нужно, но и где-то еще, что может оказаться губительным для клетки. Более изящное решение нашлось у бактерий из рода Xanthomonas. Это патогенные бактерии, поражающие растения. У них есть группа TALбелков, которые выполняют функции транскрипционных факторов, то есть в конечном итоге регулируют количество того или иного белка — не только в клетке бактерий, но и у высших организмов (в данном случае, у растений). Когда бактерии заражают растение, TAL-белки проникают в ядро растительной клетки, и начинают там хозяйничать, изменяя экспрессию генов так, чтобы принести пользу бактериям. ДНК-узнающий участок TAL-белков состоит из нескольких повторяющихСТАРЕНИЯ И ДОЛГОЛЕТИЯ Рис. 3. Схема работы и области применения TAL-белков. ДНК-связывающий участок TAL-белка изображен серым, в виде комплекса из нескольких нуклеотид-узнающих единиц. Комбинируя такие единицы, можно заставить TAL связаться с любой последовательностью в геноме. Пришив к нему активаторный (AD) или репрессорный (RD) участок, можно направленно регулировать активность генов (соответственно, активировать или подавлять). Если соединить TAL-домен с нуклеазой FokI, получится TALEN — инструмент для направленного разрезания геномной ДНК. Так же, как и в случае с цинковопальцевыми нуклеазами, FokI работает в форме димера. Рисунок из обсуждаемого обзора в журнале Science ся единиц, каждая из 34 аминокислот (кроме последней, которая состоит из 20 аминокислот). В большинстве случаев таких повторов 13 либо 28. Все повторяющиеся единицы одинаковы, кроме аминокислот, стоящих в позициях 12 и 13 (этот участочек называется RVD — repeat-variable diresidue). Разные RVD связываются с разными нуклеотидами (каждая пара аминокислот — с одним). Для каждого из четырех нуклеотидов, из которых состоит ДНК, есть наиболее часто встречающаяся пара аминокислот. Таким образом, комбинируя структурные единицы с разными RVD, можно без труда создать ДНК-связывающий участок белка, узнающий нужную последовательность (единственное —N C— 5’— A A T C C T G T C C C T A G T G G C C C C A C T G T G G G G T —3’ 3’— T T A G G A C A G G G A T C A C C G G G G T G A C A C C C C A —5’ N— —C Рис. 4. Схема, изображающая работу цинковопальцевой нуклеазы. Участки «цинковых пальцев» (серые) подобраны так, чтобы узнавать последовательности с обеих сторон от места, куда требуется внести разрыв. Это необходимо, чтобы нуклеаза FokI могла разрезать ДНК (она работает в форме димера). Иллюстрация с сайта sigmaaldrich.com ограничение — в начале последовательности должен стоять нуклеотид T). Учитывая количество повторов, можно быть уверенным, что белок будет связываться именно там, где нужно, в сколь угодно большом геноме. Таким образом можно направленно регулировать активность генов, а если пришить к TAL-повтору нуклеазу FokI (рис. 3), получится практически идеальный инструмент для редактирования генома — TALEN. Из технологий цинковопальцевых нуклеаз и TALEN ученые уже вовсю извлекают практическую пользу. Пока что с их помощью успешно удавалось создавать так называемых нокаутных животных, то есть животных, у которых какой-либо ген не функционирует (за технологию создания нокаутных мышей в 2007 году была вручена Нобелевская премия по физиологии и медицине. До сих пор ZFN и TALEN применялись в основном для работы на клеточных культурах или рыбках Danio rerio, но в начале года корейские ученые опубликовали в Nature Biotechnology статью, в которой описали создание нокаутной мыши при помощи TALEN. При традиционном подходе для создания нокаутных животных требуется забрать несколько клеток из эмбриона на самых ранних стадиях развития, модифицировать их и вернуть обратно. Из такого эмбриона вырастает так называемое мозаичное животное, часть клеток в котором модифицирована, но большая часть не изменена. Далее следует ряд скрещиваний — в надежде, что у какой-то из мозаичных мышей модифицированными окажутся половые клетки и среди потомства будет мышь, гетерозиготная по нужному признаку (то есть с одним нормальным, а вторым мутантным аллелем исследуемого гена). В новом подходе матричную РНК, кодирующую нужную нуклеазу TALEN, вводят прямо в одноклеточную зиготу, образовавшуюся после оплодотворения яйцеклетки, на стадии пронуклеуса (когда в клетке присутвуют одновременно два ядра — от яйцеклетки и от сперматозоида). Выросшая мышь сразу же является гетерозиготой по нужному признаку (значительное упрощение процесса!). Дальше, если нужно, в одну стадию можно получить потомков-гомозигот, то есть мутантных по обоим аллелям данного гена. Авторы статьи в Nature Biotechnology создали мышей, дефектных по гену Pibf1 (progesterone immunomodulatory binding factor) и по гену Sepw1 (selenoprotein W, muscle 1). В обоих случаях они вносили при помощи TALEN разрыв в кодирующую область гена, разрыв залечивался негомологичным соединением концов ДНК. В результате ученые детектировали небольшие делеции в гене, которые приводили к синтезу нефункционального белка. Их коллеги из Мюнхена, опубликовавшие статью в журнале PNAS, пошли дальше и решили не просто испортить ген, а внести в него нужную мутацию. Для этого вместе с мРНК TALEN они ввели в одноклеточный эмбрион короткую одноцепочечную ДНК (144 нуклеотида), которая была комплементарна участку хромосомы, подлежащему изменению, и содержала мутацию. Эта цепочка ДНК должна была послужить матрицей для гомологичной рекомбинации при залечивании разрыва, который 27 Рис. 5. Мутация chocolate в гене Rab38 превращает мышь из черной в коричневую (b) в результате нарушения пигментации. Фотографии с и d демонстрируют нарушенную пигментацию глаз у двухдневного мышонка. Рисунок из статьи Loftus et al., 2002. Mutation of melanosome protein RAB38 inchocolate mice вносила TALEN. Целью для внесения мутации стал ген Rab38, кодирующий белок, который участвует в регуляции внутриклеточного транспорта (в том числе, транспорт пигментов). Мутации в этом гене у человека приводят к развитию наследственного синдрома Германски–Пудлак, который характеризуется пониженной пигментацией (альбинизмом), нарушениями свертывания крови и отложением в тканях воскоподобной субстанции (при этом страдают внутренние органы, в первую очередь легкие и почки). Для того чтобы смоделировать подобные симптомы у мышей, оказалось достаточно заменить в белке RAB38 одну-единственную аминокислоту (замена глицина на валин в 19-й позиции). Полученный фенотип был назван chocolate изза нарушения пигментации (если в норме мышки черные, мутантные мышки «светлеют» и становятся коричневыми, см. рис. 5). a b Рис. 6. Схема эксперимента по внесению мутации chocolate в геном мыши дикого типа (a) и исправление мутантного фенотипа (b). TALEN вводят в одноклеточный эмбрион вместе с одноцепочечной ДНК, которая служит матрицей для рекомбинации. Нуклеаза вводит разрыв в одно из ядер (материнское или отцовское), разрыв репарируется путем рекомбинации с одноцепочечной ДНК. Полученная мышь является основателем мутантной линии Rab38cht , либо основателем «исправленной» линии (Rab38WT). Рисунок из обсуждаемой статьи Wefers et al., 2012 в журнале PNAS. Итак, исследователи сконструировали соответствующую нуклеазу TALEN (TALENRab38), а для контроля — цинковопальцевую нуклеазу (ZFNRab38), которая должна была вносить разрыв в то же место. Когда активности обеих конструкций были проверены на репортерном гене в клеточной культуре, оказалось, что TALEN работает в два раза лучше, чем ZFN. Затем TALEN ввели в одноклеточный мышиный эмбрион вместе с одноцепочечной матрицей для рекомбинации (естественно, что эмбрионов было несколько; см. рис. 6а). В результате из 117 мышей, полученных таким способом, 7 несли мутации в гене Rab38, хотя всего одна мышь была носителем нужной аминокислотной замены (остальные несли делеции, образованные в результате негомологичного спаривания концов). После скрещивания между собой потомства этой мыши удалось получить гомозиготного носителя мутации chocolate, демонстрирующего нужный фенотип (рис. 5, 6a). В следующем эксперименте исследователи решили вернуть фенотип «шоколадной» мыши к нормальному аналогичным способом. На этот раз в одноклеточный эмбрион «шоколадной» мыши ввели TALEN и одноцепочечную ДНК, исправляющую мутацию (рис. 6b). Нужная мышь была получена (хотя эффективность гомологичной рекомбинации тоже была значительно ниже, чем эффективность негомологичного соединения). Авторы работы предполагают, что можно увеличить выход продуктов гомологичной рекомбинации, если искусственно затормозить процесс негомологичного спаривания концов (действительно, такой эффект был показан на дрозофиле). Материал подготовлен на основе статей Дарьи Спасской «Технологии редактирования генома помогут моделировать наследственные заболевания» и Веры Башмаковой «Прокариотическая система иммунитета поможет редактировать геном» (сайт elementy.ru) 28 Как это было ГЕНЕТИКА СТАРЕНИЯ И ДОЛГОЛЕТИЯ 2014 Как это было Итоги 2-й Международной конференции «Генетика старения и продолжительности жизни-2012» П Специалист в области механизмов клеточного старения Джуди Кампизи и директор Института геронтологии при Медицинском колледже Альберта Эйнштейна Нир Барзилай Председатель программного комитета конференции Роберт Шмуклер Рис и Вице-президент Фонда «Наука за продление жизни» Мария Коноваленко. В центре - Анджей Бартке, генетик-рекордсмен, сумевший продлить жизнь мыши в 2 раза ервый день конференции, 22 апреля 2012 года, который был объявлен днем открытых публичных лекций, посетило около 650 человек. Основные темы и задачи конференции: определение наиболее перспективных направлений генетики продолжительности жизни и старения, в том числе: – поиск генов долгожительства – выявление маркеров биологического возраста – поиск фармакологических средств для замедления старения – выяснение механизмов влияния внешней среды на скорость старения – эпигенетические изменения, связанные с продолжительностью жизни – гормональные аспекты старения и продолжительности жизни. Именно в этих областях работают исследователи, приехавшие с Москву со всего мира. По мнению председателя программного комитета конференции Роберта Шмуклера Риса из Университета Арканзаса (США), за последние несколько лет в области генетики старения сделано очень много открытий, и возможно, главный прорыв уже совершен. «Значительные открытия сделаны за последние 10 лет, — подтверждает Вера Горбунова из Университета Рочестера (США). — Старение связано с повреждением и репарацией ДНК, геномной нестабильностью и мутациями, а также реструктуризацией генома и возникновением инверсий и транслокаций генов. С возрастом увеличивается число раковых заболеваний и повреждений генов. Что-то в организме происходит не так. Какие сигнальные пути ДНК затронуты? В каких конкретно молекулах происходят изменения? Сегодня найден белок SIRT6, отвечающий за «ремонт» ДНК и стимулирующий процессы репарации. В молодых клетках SIRT6 способствует восстановлению повреждений при стрессе. Как он в стареющих клетках помогает восстановлению? Все живые организмы стареют. И у животных, которые живут долго, репарация происходит лучше. Репарация ДНК не коррелируется с массой тела — нет разницы большое животное или маленькое. Выяснилось, что долгожители отличаются большей способностью к репарации ДНК. Вопрос в том, можно ли этот механизм перенести на людей?» Группа исследователей из Рочестерского университета под руководством Веры Горбуновой и Андрея Селуянова изучала процессы старения у мелких животных, сегодня черед — за долгоживущими организмами и животными, которые не болеют раком. Например, лысый землекоп живет 30 лет и не болеет раком. Оказалось, клетки этого грызуна синтезируют много гиалуроновой кислоты и рак у них не развивается. Если у них удалить из организма гиалуроновую кислоту (добавить фермент, ее разрушающий), то эти животные начинают болеть раком. По мнению доктора Анджея Бартке из Медицинской школы Университета Южного Иллинойса (США), сегодня наблюдается дисбаланс потребляемой и сжигаемой энергии, что приводит к дисбалансу в организме. Решением проблемы может стать корректировка физической активности и низкокалорийное питание. Профессор НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова (Санкт-Петербург), президент Геронтологического общества РАН Владимир Анисимов считает, что сегодня мы близки к средствам воздействия на процессы старения и возникновения опухолей – и не только в экспериментах, но и в клиниках. Клаудио Франчески из Болонского университета (Италия) делает ставку на исследования образа жизни и состояние организма людей-долгожителей, поскольку именно это может дать много полезной информации. Старение – мозаичное явление, каждая клетка организма стареет со своей скоростью и это системная ситуация. Фенотип старения, считает итальянский ученый, — результат адаптации к накопленным и аккумулированным заболеваниям, это иммунный ответ на репарацию ДНК. «Процесс старения сложный: есть возрастные изменения, но их можно отсрочить, — говорит доктор Франчески. — Известный маркер злокачественных опухолей белок p53 присутствует и у женщин-долгожителей, которые не болеют раком груди. Хотя риск заболевания есть, но он не проявляется. Еще пример: в организме у долгожителей происходят воспалительные процессы, и наблюдается даже повышенный их уровень. При этом нет основных проявлений, которые бы каким-то образом намекали на эти процессы». Долгожители — достаточно стройные люди, среди них нет инсулин-резистентных. Как правило, они имеют гипофункцию щитовидной железы, а их потомки обладают тем же самым генетическим набором. Возможно, все это защищает их от рака. Но у долгожителей часто бывает саркопения — возрастное атрофическое дегенеративное изменение скелетной мускулатуры, приводящее к постепенной потере мышечной массы и силы. В нескольких странах Европы изучались 2568 пар сестер и братьев возрастом свыше 90 лет. Был проведен ДНК-анализ у них и их потомков, чтобы выяснить насколько они наследуют факторы долголетия. По долголетию выделялись Финляндия, северные страны, Италия и Греция. Оказалось, что долголетие наследуется по материнской линии. В Италии количество долгожителей увеличивается с севера на юг. Причем женщиндолгожителей больше, чем мужчин в 3,5 раза (исключение – только на Сардинии этот показатель 1:1). Другое очень перспективное научное направление в этой области – изучение генов стрессоустойчивости и роль устойчивости к различным стрессам в старении и продлении жизни. Один из ведущих ученых в мире в этом направлении – доктор биологических наук, Алексей Москалев из Института биологии Коми научного центра РАН. Облучая молодых мух-дрозофил малыми дозами радиации, ему и сотрудникам его лаборатории удалось пролить их жизнь на 25 процентов. А вообще сегодня для воздействия на стрессоустойчивость ученые используют целый «букет» различных шоков: температура, химия, темнота, яркий свет и т.д. Конференция «Генетика старения и продолжительности жизни» показала главное – наука накопила уже множество доказательств, что старение можно, как минимум, намного отодвинуть. День публичных лекций был организован в Концерт-холле здания Российской академии наук После окончания лекций обсуждения продолжались в кулуарах Суреш Раттан, профессор Университета Аархуса, Дания, исследователь явления гормезиса и его взаимосвязи со старением, отвечает на вопросы студентов из Санкт-Петербурга 29 30 Как это было Как это было ГЕНЕТИКА СТАРЕНИЯ И ДОЛГОЛЕТИЯ 2014 Алексей Перегудов, исполнительный директор Института Биологии Старения; Алексей Москалев, сопредседатель организационного комитета конференции и Михаил Шапошников с коллегами. Роберт Шмуклер Рис, генетик, продливший жизнь червяку нематоде в 10 раз, председатель программного комитета конференции, Михаил Батин и Сергей Полотовский Профессора Колледжа медицинских исследований имени Альберта Эйнштейна: Ян Вайг, ведущий исследователь в области эпигенетики старения и Южин Су, председатель будущей Гордоновской конференции по биологии старения в 2013 году Из отзыва о конференции Натальи Малыгиной, к.б.н., ведущего научного сотрудника НКЦ геронтологии Лекция Джуди Кампизи в первый день конференции по эмоциональной и интеллектуальной насыщенности был поразительна. Маленькая хрупкая женщина, сложенная как балерина, с огромной копной темно-каштановых волос, с выразительными жестами, она будто танцевала свой удивительный доклад о cтарении клеток. Всем было очевидно, что ее исследования – это ее жизнь! Она и называет свои доклады и статьи очень образно: «Рак и старение – конкурирующие демоны», «Сенесцентные клетки – хорошие граждане и плохие соседи». Джуди Кампизи пришла в геронтологию из онкологии, хорошо представляя механизмы клеточного деления, открыла феномен старения клетки – сенесценцию и его связь с возраст-зависимыми заболеваниями. Она сформировала новое направление в геронтологии и, безусловно, является его лидером. Кампизи впервые охарактеризовала специфический секреторный фенотип сенесцентных клеток. Сенесцентные клетки с одной стороны выступают в качестве супрессоров опухолей, поскольку необратимо перестают делиться, тем самым снижая риск злокачественной трансформации у молодых людей, а с другой – они характеризуются специфическим метаболизмом, синтезируют многочисленные провоспалительные цитокины, ростовые факторы и протеазы, которые обладают сильным паракринным эффектом, вызывая воспаление и индукцию перерождения соседних предраковых клеток в злокачественные. Накапливаясь с возрастом, сенесцентные клетки разрушают структуру и функции нормальных тканей. Специфический секреторный фенотип старых клеток – это механизм, обуславливающий и дегенеративные заболевания, и злокачественные новообразования. Важно, что открытия Кампизи до некоторой степени объясняют рецидивы при раковых заболеваниях, ведь, например, при лучевой терапии раковые клетки не только уходят в апоптоз, но и становятся сенесцентными. Отрадно заметить, что на результатах ее работы уже разрабатываются лекарственные препараты, избирательно элиминирующие сенесцентные клетки, тем самым, увеличивая продолжительность жизни. Об этом на конференции сообщил Андрей Гудков, один из ведущих ученых Онкологического института Розвелла Парка. Во втором своем докладе Джуди Кампизи рассказала о сигнальных путях, которые вызывают сенесцентность клеток, и о значимости сенесцентных клеток в репарации тканей. Сенесцентными клетки становятся из-за нарушений в геноме и индуцируют репаративные процессы в тканях. Эта идея очень интересна и свидетельствует о том, сколь неоднозначны процессы, протекающие в организме. Возможно, стареющие клетки в какой-то степени обеспечивают адаптацию организма к новой для себя ситуации. Сенесценция – альтернатива апоптозу. Это важно для понимания патогенеза заболеваний. Так, появились данные, что белки тау, характерная особенность нейронов при болезни Альцгеймера, защищают нейроны от апоптоза. Клетка сама себя защищает от гибели. Стареющий организм адаптируется сам к себе, несмотря на деструктивные процессы, связанные с гормональной перестройкой организма, несмотря на разрушительные химические процессы. В нашем организме, помимо деструктивных процессов, существуют процессы, которые восстанавливают повреждения. В этом участвуют и антиоксидантные ферменты, и сложные системы репарации ДНК. В.В.Фролькис назвал эти процессы витауктом. Проблема адаптации организма к старению, волнует сейчас многих. Клаудио Франчески говорит о ремоделировании организма с возрастом. Джуди Кампизи начала работу по влиянию ишемии мозга на клеточной фенотип и рассказала о начале клинических испытаний одного из самых перспективных геропротекторов – рапамицина. Она говорит, что для эффективной терапии старения нужны очень низкие дозы рапамицина, а лечение, возможно, нужно будет проводить курсами. Вадим Гладышев, профессор Медицинской школы Гарварда, секвенировавший геном голого землекопа, Жоао Педро де Мегалес из Университета Ливерпуля, создатель базы данных Digital Aging Atlas и Дэвид Клэнси, профессор Университета Ланкастера Бланка Рожина из Университета Коннектикутта, продлившая жизнь дрозофиле в 2 раза, Холли Браун-Борг, профессор Университета Северной Дакоты и Елена Заклицкая, соорганизатор конференции Ричард Моримото, специалист в области мисфолдинга белков, Брайан Крэмер, изучающий причины нейродегенерации и Брайан Кеннеди, директор Института исследований старения имени Бака 31 Событие, способное изменить жизнь каждого человека состоится 6–10 апреля 2014 года в Сочи – это международная конференция Генетика старения и долголетия Основная задача конференции – мобилизовать усилия общества, инвесторов и ученых для реализации идеи существенного увеличения продолжительности жизни человека. В Сочи соберутся ведущие мировые эксперты в области продления жизни. Участники конференции убедительно покажут, что старение – болезненное состояние, связанное с огромным количеством заболеваний, требующее лечения. Исследователи старения расскажут о еще неопубликованных результатах экспериментов, покажут реальные перспективы для фармкомпаний в области разработки геропротекторов с терапевтическим эффектом для сердечнососудистых, нейродегенеративных и онкологических заболеваний. Присоединяйтесь! Сопредседатели Оргкомитета: Михаил Батин, президент Фонда «Наука за продление жизни» Алексей Москалев, доктор биологических наук, заведующий лабораториями молекулярной радиобиологии и геронтологии ИБ Коми НЦ УрО РАН, генетики старения и продолжительности жизни МФТИ www.aging-genes2014.com
