Использование антисмысловой РНК для подавления функции
advertisement
Использование антисмысловой РНК для подавления функции гена mutS в Escherichia coli MG1655 Автор(ы): Поддъяков Иван Школа: 2086 Класс: 10 Руководители: Бубнов Дмитрий Михайлович, сотрудник ВКПМ, ФГУП ГосНИИГенетики Шаронин Василий Олегович, НЦПЗ РАМН, ГБОУ СОШ №2086, к.б.н. Шаронина Юлия Александровна, ГБОУ СОШ № 2086, учитель биологии Escherichia coli используется как для биохимических и генетических исследований, так и для конструирования штаммов-продуцентов различных метаболитов по причине относительной простоты организации и удобства культивирования. Геном E. coli сиквенирован, информация о метаболизме, генетическом аппарате объединена в базу данных. Разработаны эффективные методы внесения модификаций в геномную последовательность. Получены делеции и сверхэкспресии большинства открытых рамок считывания. Одним из наиболее перспективных подходов генетической инженерии на этом объекте является внесение однонуклеотидных замен, коротких делеций и инсерций методом трансформации клеток одноцепочечными олигонуклеотидами. Преимущество данного метода заключается в получении мутаций с частотой до 50%, что позволяет вносить хромосомные мутации без использования селекции. Однако на данный метод накладывает ограничение репарация ДНК, опосредованная продуктом гена mutS. Эта система способна репарировать до 99% внесенных замен. Для лабораторных исследований ген mutS инактивируют путем получения его делеции, однако это неприменимо для промышленных штаммов-продуцентов. В этом случае функцию гена можно подавить обратимо путем экспрессии антисмысловой РНК. Известно, что экспрессия обычных антисмысловых РНК неэффективна в клетках Escherichia coli. Причина заключается в необходимости достижения многократного избытка антисмыслового транскрипта над целевым. Кроме того, РНК подвергается расщеплению клеточными РНКазами. Наибольшей эффективностью обладают антисмысловые РНК, фланкированные взаимнокомплементарными последовательностями (которым соответствуют инвертированные повторы в молекуле кодирующей ДНК) таким образом, чтобы образовывалась шпилька. Такие молекулы более устойчивы к действию ферментов, поэтому их экспрессия способна приводить к подавлению функции целевых генов в клетках E. сoli. Структура антисмысловой РНК. А – последовательность, комплиментарная транскрипту гена mutS, В – шпилька, образованная двумя взаимно комплиментарными участками. Цель: изучить возможность подавления функции гена mutS путем экспрессии антисмысловой РНК. Задачи: Сконструировать плазмиду, несущую антисмыловую по отношению к гену mutS последовательность, фланкированную инвертированными повторами, под контролем сильного индуцируемого промотора. Изучить влияние этой конструкции на функцию гена mutS путем измерения частоты возникновения спонтанных мутаций. Методы • • • • • Методы молекулярного клонирования: камера для горизонтального электрофореза SE-1, источник питания Эльф-4, микроцентрифуга MiniSpin, система гель-документирования Gel Doc XR+, амплификатор Mastercycler gradient. Генетическая трансформация клеток методом электропорации: центрифуга многофункциональная 5804R, электропоратор Eporator. Культивирование штаммов в пробирках: пробирки, среда LB, антибиотики тетрациклин и ампициллин, IPTG, ламинарный бокс БАВнп-01. Культивирование E. coli на агаризованной среде: среда LA, антибиотики тетрациклин и рифампицин, чашки Петри, микробиологическя петля, шпатель Дригальского, ламинарный бокс БАВнп-01. Оценка функции гена mutS посредством определения частоты возникновения спонтанных мутантов, устойчивых к рифампицину: среда LA, антибиотики тетрациклин и рифампицин, чашки Петри, программа MicrosoftOfficeExcel 2010, ламинарный бокс БАВнп-01. Молекулярное клонирование Подведение итогов Генетическая трансформация Определение частоты возникновения спонтанных мутантов Культивирование штаммов в пробирках Культивирование E. coli на агаризованной среде Клонирование фрагмента ДНК, несущего антисмысловую последовательность к гену mutS на вектор pQE-30. EcoRI, HindIII - сайты рестрикции, IR1,2 – инвертированные повторы, as-mutS – антисмысловая последовательность по отношению к гену mutS, bla – ген устойчивости к ампициллину, pBR322 ORI – ориджин репликации вектора pBR322, PN25/lacO – промотор N25/lacO, T0 – терминатор транскрипции T0 фага λ. Частота возникновения спонтанных мутаций в штаммах, несущих плазмиды pQE-30 и pQE-30_asmutS при наличии и отсутствии индукции. На основе коммерческого экспрессионного вектора pQE-30 получили плазмиду pQE-30_as-mutS, несущую антисмысловую по отношению к гену mutS последовательность , фланкированную инвертированными повторами, под контролем сильного IPTGиндуцируемого промотора PN25/lacO. Дикий штамм Esсheriсhia coli MG1655 был трансформирован полученной плазмидой и исходной pQE-30. Для обоих типов трансформантов была определена интенсивность спонтанного мутагенеза. Частота возникновения спонтанных мутаций для клонов, несущих плазмиду pQE-30_as-mutS превышает таковую для контрольных клонов в отсутствие индукции в 3,5 раза, а случае индукции IPTG – 115 раз. Значительное увеличение частоты возникновения спонтанных мутаций при наличии индукции соотносится с литературными данными, полученными на штамме с делецией гена mutS . Добавление IPTG при культивировании клонов с контрольной плазмидой pQE-30 не влияет на частоту возникновения спонтанных мутаций. Обсуждение Исходя из полученных результатов, подавление функции гена mutS путем экспрессии антисмысловой РНК может быть применено как эффективный способ инактивации репарации ДНК. Использование сильного IPTGиндуцируемого промотора PN25/lacO для контроля транскрипции антисмысловой РНК позволяет подавлять функцию гена mutS обратимо и контролируемо. Вещество-индуктор непосредственно не влияет на частоту возникновения мутаций в клонах с немодифицированной плазмидой. Такой способ подавления функции гена mutS, возможно, найдет применение в методе внесения хромосомных мутаций путем трансформации клеток одноцепочечными олигонуклеотидами. Этот метод применим не только для фундаментальных исследований, но и в ходе получения штаммов-продуцентов различных соединений, для которых особенно важна генетическая стабильность, что не позволяет использовать штамм с делецией mutS. Также, подавление функций других генов, отвечающих за репарацию ДНК, может быть применено для получения индуцируемого мутаторного фенотипа, который используют для случайного мутагенеза фрагментов ДНК. Выводы Экспериментально оцененное увеличение частоты возникновения спонтанных мутаций свидетельствует о том, что экспрессия антисмысловой РНК является эффективным методом обратимого подавления функции гена mutS. Полученные данные соотносятся с литературными данными для штамма с делецией mutS, что говорит о полном подавлении экспрессии гена. Наличие плазмиды pQE-30_as-mutS в штамме без индукции приводит к небольшому допустимому увеличению частоты возникновения спонтанных мутаций. Это позволяет постоянно поддерживать плазмиду в штамме и индуцировать экспрессию антисмысловой РНК при необходимости. Автор работы выражает благодарность коллективу ВКПМ, ФГУП ГосНИИГенетики, за помощь и содействие в работе
