«Утверждаю» ___________________ Председатель Ученого совета

«Утверждаю»
___________________
Председатель Ученого совета
проф. И.А. Горлинский
ОТЧЕТ
старшего преподавателя кафедры биохимии по программе поддержки молодых ученых
СПбГУ
Татьяны Вячеславовны Никитиной
за 2008/2009 учебный год
Научно-исследовательскую работу проводила в научной группе доцента кафедры
биохимии, к.б.н. Л.И. Тищенко в рамках темы «Роль экспрессии генов малых стабильных
РНК в пролиферации и апоптозе опухолевых клеток человека».
Целью научно-исследовательской работы является изучение роли и механизмов
регуляции экспрессии генов, транскрибируемых РНК-полимеразой III (генов класса III) в
пролиферирующих и апоптотических опухолевых эукариотических клетках. Задачи на
2008/2009 учебный год: (1) оценить взаимосвязь между уровнем экспрессии различных
генов класса III – инициаторной тРНКiMet, тРНКHis и представителей молодых субсемейств
Alu (AluYa5 и AluYb8) и физиологическим статусом клеток гистиоцитарной лимфомы
человека U937 (стадии: покоя G0, пролиферации и апоптоза); (2) изучить метилирование
повторов AluYb8 в геноме клеток U937 методом MethyLight.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для исследования изменения содержания нетранслируемых РНК-продуктов
транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой III, при различных физиологических
состояниях клетки использовали в качестве модели культуру клеток гистиоцитарной
лимфомы человека U937, находящихся в состоянии покоя, пролиферации или апоптоза.
Перевод клеток U937 в состояние покоя (фаза G0 клеточного цикла) проводили
культивированием клеток U937 в отсутствии сыворотки в течение 48 ч. Через 2 ч после
добавления в культуру покоящихся клеток 10 % сыворотки эмбрионов крупного рогатого
скота (FBS) большая часть клеток достигала поздней фазы G1 клеточного цикла.
Индукцию апоптоза проводили при помощи обработки клеток U937 ингибитором ДНКтопоизомеразы I – камптотецином – в концентрации 4 мкг/мл. Апоптоз, вызванный
1
камптотецином, был детектирован по появлению в цитоплазматической фракции клеток
U937 высокомолекулярных фрагментов ДНК (от 750 до 10000 п.н.), что является
характерным признаком для клеток этой линии.
Исследование содержания инициаторной тРНКiMet1 и тРНКHis в тотальной РНК
клеток
U937,
находящихся
в
состоянии
покоя,
пролиферации
и
апоптоза,
индуцированного камптотецином, методом ОТ-ПЦР «в конечной точке» показало, что: (1)
содержание инициаторной тРНКiMet1 повышалось примерно в 1,5 раза в апоптотических
клетках (рис. 1, а, дорожки 7 и 9), по сравнению с контрольными клетками,
культивируемыми без добавления камптотецина (рис. 1, а, дорожки 6 и 8); (2) содержание
тРНКHis было примерно одинаково при всех исследованных состояниях клеток:
бессывороточное голодание (рис. 1, б, дорожка 2), пролиферация (рис. 1, б, дорожки 3, 4, 6
и 8) и апоптоз (рис. 1, б, дорожки 5, 7 и 9). Похожие результаты были получены методом
количественной ОТ-ПЦР «в реальном времени» (рис. 2, а. – для тРНКiMet1 и б. – тРНКHis).
Рис. 1. Электрофореграмма разделения продуктов ПЦР «в конечной точке» в 2 %
агарозном геле.
а. – амплификация с использованием праймеров к тРНКiMet1; б. – амплификация с
использованием праймеров к тРНКHis. 1 – маркер длин фрагментов DNA Ladder 1 kb
(Fermentas); 2 – клетки после 48 ч бессывороточного голодания; 3 – клетки после 2 ч с
10% FBS; 4 – клетки после 4 ч с 10% FBS; 5 – клетки после 2 ч с камптотецином (4 мкг/мл); 6 –
клетки после 6 ч с 10% FBS; 7 – клетки после 4 ч с камптотецином (4 мкг/мл); 8 – клетки после
8 ч с 10% FBS; 9 – клетки после 6 ч с камптотецином (4 мкг/мл); 10 – контроль: проба без
кДНК. Во все пробы брали одинаковое количество кДНК. Внизу приведены денситограммы
гелей (получены с помощью программы ScionImage for Windows). На рисунке представлены
репрезентативные результаты одного из трех повторных экспериментов.
Ранее нами были получены данные о повышенном содержании инициаторной
тРНКiMet1 в тотальной РНК клеток эпидермоидной карциномы человека А431 при
апоптозе, индуцированном ЭФР в высокой концентрации (100 нг/мл) (Nikitina e.a.,
Цитология. 2004. Т. 46. № 5. С. 437-441). Мы предполагаем, что повышенное содержание
инициаторной тРНК (по сравнению с примерно постоянным содержанием тРНК,
участвующих в элонгации, например, тРНКHis) необходимо клеткам, переходящим в
2
состояние апоптоза, для того, чтобы они могли быстро начать синтез белков,
участвующих в реализации программы клеточной гибели, которые не синтезируются в
пролиферирующих клетках.
Рис. 2. Содержание тРНКiMet1 (а) и тРНКHis (б) в тотальной РНК клеток U937,
находящихся в состоянии покоя, пролиферации и в апоптозе.
Заштрихованные столбцы соответствуют пробам без камптотецина, серые – пробам с
камптотецином. Стадия клеточного цикла и время инкубации после добавления
камптотецина указаны под каждым столбцом; r – соотношение содержания исследуемой РНК
в экспериментальной пробе и в контроле (клетках после культивирования с 10% FBS в
течение 2 ч); для каждого столбца указано стандартное отклонение. Для обозначенных * пар
столбцов уровень значимости p<0,05.
На следующем этапе работы мы изучили изменение содержания продуктов
экспрессии Alu-повторов, принадлежащих к самым молодым субсемействам – AluYa5 и
AluYb8, в клетках U937 при переходе к апоптозу. Это было необходимо для проверки
гипотезы о том, что короткие диспергированные повторы SINE, к которым относятся Aluповторы человека, и их РНК-продукты могут играть определенную роль в реакции клетки
на сильные цитотоксические повреждения и, возможно, обеспечивать реализацию
апоптозного пути. В качестве объекта исследования были выбраны субсемейства AluYa5
и AluYb8, так как они являются наиболее многочисленными представителями молодого
семейства AluY в геноме человека, сохраняют функциональный внутригенный промотор
3
для РНК-полимеразы III и, как полагают, могут быть транскрипционно активными и
распространяться по геному путем ретротранспозиции, используя ферментативный
аппарат последовательностей L1 (представителей длинных диспергированных повторов
LINE у человека) (Schmid. Nat. Genet. 2003. Vol. 35. P. 15-16).
Рис. 3. Содержание AluYa5-РНК (а) и AluYb8-РНК (б) в тотальной РНК клеток U937,
находящихся в состоянии покоя, пролиферации и в апоптозе.
Пояснения см. в подписи к рис. 2.
Методом количественной ОТ-ПЦР «в реальном времени» было показано, что
содержание как AluYa5-РНК (рис. 3, а), так и AluYb8-РНК (рис. 3, б) значительно
возрастало
(в
4-10
раз)
в
апоптотических
клетках
U937,
по
сравнению
с
пролиферирующими клетками. Анализ кривых плавления продуктов ПЦР, полученных
амплификацией с праймерами к последовательности AluYa5, показал присутствие целого
ряда слившихся друг с другом пиков (рис. 4, а). Это объясняется тем, что для
амплификации использовались праймеры, подобранные к консервативным участкам
последовательности AluYa5, которые также присутствуют в других последовательностях,
принадлежащих к различным субсемействам молодого семейства AluY (например,
AluYb8, AluYb9, AluY, AluYc1, AluYg6, AluYa4, AluYa8). Поэтому продукты ПЦР в
реальном времении в этом случае являются гетерогенными и представлены ДНК-копиями,
соответствующими
фрагментам
различных
Alu-повторов
и
имеющими
разные
4
температуры
плавления,
но
одинаковые
размеры
(что
было
подтверждено
электрофоретическим разделением продкутов ПЦР в агарозном геле). Очевидно, что
представленные на рис. 3, а данные относятся не только к AluYa5-РНК, но и к РНК других
перечисленных
субсемейств.
Для
амплификации
AluYb8-кДНК
использовались
праймеры, комплементарные уникальным участкам этой последовательности, которые
присутствуют также у AluYb9 (которая отличается от AluYb8 лишь одной нуклеотидной
заменой и распространена в геноме человека и в значительно меньшей степени) и
отсутствуют у последовательностей, принадлежащих к другим субсемействам AluY.
Поэтому
в
этом
случае
продукт
ПЦР
был
представлен
однородными
последовательностями AluYb8/9 с одинаковой температурой плавления, при денатурации
которых на кривой плавления присутствовал один четкий пик (рис. 4, б). Таким образом,
наши данные свидетельствуют, что в апоптотических клетках U937 существенно
повышается содержание Alu-РНК, синтезируемых с Alu-повторов, принадлежащих к
целому ряду молодых субсемейств.
Рис. 4. Кривые плавления продуктов амплификации кДНК, полученных методом ПЦР в
присутствии специфичных праймеров для последовательности AluYa5 (а) и AluYb8 (б).
По оси абсцисс указана температура (°С), по оси ординат – отрицательная величина
скорости изменения флуоресценции SYBR Green I пробе.
Имеющиеся в настоящее время сведения позволяют выдвинуть несколько рабочих
гипотез о роли SINE и SINE-транскриптов при программируемой клеточной гибели (см.
обзор: Никитина, Тищенко. Молекулярная биология. 2008. Т. 42. № 4. С. 547-558): (1)
активная ретротранспозиция SINE, приводящая к встраиванию этих последовательностей
в новые области генома и, в результате, к нарушению нормальной экспрессии генов,
генотоксическому стрессу и, как следствие, к запуску апоптозных путей; (2) специфичная
регуляция аппарата трансляции с участием SINE-РНК, обеспечивающая подавление
5
тотального синтеза белка и осуществление синтеза специфических (про-апоптотических)
белков; (3) регуляция Alu-РНК активности про-апоптотического белка – протеинкиназы
PKR, регулируемой двухцепочечными РНК; (4) Alu-РНК могут способствовать переходу
клетки к апоптозу, активируя внутриклеточные системы неспецифического иммунитета
(например, систему интерферона β), аналогично действию экзогенных вирусных РНК.
Выяснение точной роли SINE и SINE-транскриптов в апоптозе остается актуальной
проблемой для будущих исследований.
Рис. 5. Содержание метилированных и неметилированных последовательностей AluYb8
в геномной ДНК клеток U937, находящихся в состоянии покоя, пролиферации и в
апоптозе.
Стадия клеточного цикла и время инкубации после добавления камптотецина указаны
под каждым столбцом.
Известно, что в пролиферирующих клетках содержание Alu-РНК очень низкое, в
отличие от некоторых других РНК-продуктов генов класса III, прежде всего – тРНК и 5S
рРНК. С другой стороны, показано, что в апоптотических клетках содержание тРНК
6
(кроме инициаторной тРНК) снижается, а согласно нашим данным, количество Alu-РНК
значительно повышается. Невыясненным остается механизм, позволяющий клетке
одновременно снижать синтез тРНК и повышать синтез Alu-РНК, при том, что гены обеих
этих групп РНК имеют одинаковые промоторы. Одним из возможных механизмов
является изменение метилирования последовательностей генов. Для проверки этой
гипотезы мы исследовали метилирование AluYb8-повторов методом MethyLight. Было
показано,
что
доля
последовательностей
AluYb8,
метилированных
в
областях,
комплементарных праймерам, составляла 92±6%, а неметилированных - 7±5%.
Эти
показатели не зависят от физиологического состояния клеток (рис. 5). Таким образом,
повышение
экспрессии
Alu-повторов
не
сопровождается
снижением
уровня
метилирования их последовательности. Следует отметить, что метод MethyLight
позволяет исследовать метилирование лишь части CpG-сайтов Alu-повтора, а именно –
CpG-сайтов, расположенных в участках, комплементарных используемым для ПЦР
праймерам. Кроме того, в нашей работе были исследованы участки Alu-повторов, не
включающие в себя промотор. Можно предположить, что влияние на транскрипцию будет
оказывать метилирование именно CpG-сайтов, входящих в состав промотора, так как
именно с промотором связываются базальные транскрипционные факторы TFIIIB и
TFIIIC, которые затем привлекают в транскрипционный комплекс РНК-полимеразу III.
Более того, недавно полученные данные свидетельствуют, что на транскрипцию генов
класса III с внутригенным промотором (а именно – гена EBER-1 вируса Эпштейна-Барра)
существенное влияние оказывает метилирование CpG-сайтов, расположенных не внутри
гена, а в 5’-фланкирующей области. Можно предположить, что и в случае Alu-повторов
достаточно высокий уровень метилирования, показанный в нашей работе, не препятствует
экспрессии тех копий AluYb8, которые имеют гипометилированные 5’-фланкирующий
области.
Таким образом, в данной работе мы показали, что при переходе клетки к апоптозу
в ней повышается содержание некоторых РНК-продуктов транскрипции РНК-полимерзы
III – инициаторной тРНКiMet1 и Alu-РНК, синтезируемых с Alu-повторов молодых
субсемейств. Мы полагаем, что данное изменение необходимо для реализации клеткой
апоптотического пути, и что названные
РНК-продукты, синтезируемые РНК-
полимеразой III, могут играть важную роль в изменении физиологического статуса
клетки, используя различные механизмы: активация синтеза de novo проапоптотических
белков
(тРНКiMet),
нарушение
структуры
геномной
ДНК
при
активации
ретротранспозиции Alu, регуляция трансляции мРНК путем взаимодействия Alu-РНК с
рибосомами
и
протеинкиназой
PKR,
активация
внутриклеточных
систем
7
неспецифического иммунитета под действием Alu-РНК. Однако все приведенные
гипотезы требуют проведения дополнительных исследований с целью тщательной
проверки. Также представляется важным дальнейшее изучение механизмов регуляции
транскрипции генов инициаторной тРНКiMet1 и Alu-повторов, так как имеющиеся данные
свидетельствуют, что уровень экспрессии различных генов, транскрибируемых РНКполимеразой III, различается в апоптотических клетках: он может как повышаться (в
случае генов инициаторной тРНКiMet1 и Alu-повторов), так и снижаться (гены тРНК,
участвующих в элонгации трансляции, гены 5S рРНК). Поэтому представляется
необходимым выявить те факторы, которые определяют указанные различия в
транскрипции каждой конкретной группы генов класса III. Наиболее перспективным нам
кажется изучение уровня метилирования ДНК и доступности для связывания
транскрипционных факторов промоторных и 5’-фланкирующих участков Alu-повторов,
принадлежащих к молодым субсемействам, а также выявление специфичных белковых
факторов, которые могут участвовать в регуляции транскрипции Alu-последовательностей
в апоптотической клетке.
Данные наших исследований были представлены на 12ой Пущинской школеконференции молодых ученых «Биология – наука 21го века» (Пущино, 2008 г) и
опубликованы в 1 статье и 1 тезисах доклада на конференции.
Публикации:
Статья:
Никитина Т.В., Гао Л., Карпачева К.Е., Тищенко Л.И. Изменение экспресии генов
тРНК и Alu-повторов молодых субсемейств Ya5 и Yb8, транскрибируемых РНКполимеразой III, в клетках человека U937 при апоптозе, индуцированном камптотецином.
// Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. Вып. 1. 2009. С. 49-60.
Тезисы:
Карпачева К.Е., Гао Л., Никитина Т.В., Тищенко Л.И. Усиление экспрессии генов
молодых субсемейств AluY в опухолевых клетках человека при апоптозе. // Материалы
12ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука 21го века».
2008.С. 30.
Грант:
Выигран грант DAAD и Роснауки на проведение исследования по теме
«Исследование роли метилирования и доступности ДНК для связывания с
транскрипционными факторами и РНК-полимеразой III в регуляции экспрессии молодых
субсемейств Alu в клетках рака простаты человека» в лаборатории урологии под
руководством профессора В.А. Шульца при Клинике Университета Генриха Гейне
(Дюссельдорф, Германия) (шифр проекта: 1.2.97.2009; номер контракта заказчика:
2.2.2.3/8175)
8
Педагогическая нагрузка:
1. чтение курса лекций магистрам 1 курса «Трансляция – рибосомальный синтез белка» –
18 ч;
2. чтение курса лекций магистрам 2 курса «Разделы функциональной геномики» – 18 ч;
3. проведение практических занятий у магистров 2 курса (маг. программа
«Молекулярная биология гена») по функциональной геномике - 18 ч.
4. проведение практических занятий у магистров 1 курса (маг. программа
«Молекулярная биология гена») по курсу «Компьютерные технологии для анализа
биомолекул» – 12 ч;
5. проведение практикума у магистров 1 курса «Методы анализа генома» – 36 ч;
6. спецсеминары по магистерской программе «Молекулярная биология гена» (1 и 2 курс
магистратуры) – 30 ч;
7. рецензирование магистерских диссертаций и выпускных квалификационных работ
бакалавров.
Отчет заслушан и утвержден на заседании кафедры биохимии 8 мая 2009 г
(протокол № 16).
8 мая 2009 г.
ст. преподаватель, к.б.н. Т.В. Никитина
секретарь кафедры биохимии,
доцент, к.б.н. Е.В. Романовская
заведующий кафедрой биохимии СПбГУ,
проф. Е.Г. Скворцевич
9