отзыв

отзыв
официального оппонента доктора медицинских наук
Ерофеевой Марианы Константиновны на диссертационную
работу Аканиной Дарьи Сергеевны на тему «Разработка
средств детекции высоковирулентного штамма вируса гриппа
А подтипа Н51чГ1», представленную к защите на соискание
ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.02.02 - вирусология в Диссертационный
совет Д 001.035.01 при Федеральном государственном
бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский
институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова»
Актуальность темы исследования.
Грипп не утратил своего лидирующего положения в инфекционной
патологии человека по своей коварности и по значению неблагоприятных
последствий перенесенных заболеваний. Вирусы гриппа ежегодно вызывают
эпидемии в различных странах, а время от времени -
пандемии,
охватывающие население практически всех стран мира Совокупность 3-х
основных признаков необходима для реализации пандемических потенций
вируса: антигенная новизна, патогенность для людей, способность к
трансмиссии в человеческой популяции.
По оценкам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в
результате ежегодных эпидемий во всем мире на заболевания тяжелой
формой гриппа приходится от 3 до 5 миллионов случаев, умирает ежегодно
от 250 000 до 500 000 человек. Постоянно существует угроза появления
нового пандемического штамма, поэтому грипп может являться орудием
биологического терроризма.
Помимо «человеческих» вирусов, особая
обеспокоенность в последние годы связана с птичьими вирусами гриппа,
способными вызвать тяжелые заболевания у человека, нередко с летальным
исходом.
К наиболее высокому уровню приоритетности отнесены подтипы
вируса гриппа типа А: Н1, Н2, НЗ; высокий уровень приоритетности
2
присвоен
подтипам
А(Н5Ш)
(как
предложенный
в
настоящем
исследовании), А(Н9Ы2), А(Н7И7), А(Н7К2), А (Н7Ш). За последние десять
лет отмечается подъем циркуляции высоко патогенных вирусов гриппа среди
птиц. Вирусы подтипа А(Н51Ч1) вызывают особое беспокойство в связи с
продолжающимися вспышками заболеваний, вызванных этим вирусом у
птиц, что сопровождается передачей этого вируса человеку. На стыке 20 и 21
веков, угрожаемой в перспективе ее развития в пандемию была вспышка
«птичьего» гриппа А(Н5И 1) в Гонконге в 1997 году, когда из 18 заболевших
6 умерли. Распространение инфекции удалось остановить после уничтожения
всего поголовья домашних птиц, однако в 2003 г. был вновь отмечен ее
подъем, продолжающийся до настоящего времени. Несмотря на высокий
уровень патогенности вируса, отсутствие факта передачи от человека к
человеку является ограничением пандемического распространения данного
варианта вируса гриппа По данным ВОЗ на март 2015 г. в мире
зарегистрировано 784 случая инфицирования людей вирусом гриппа
А(Н5И1), из них 429 (55%) случаев закончились смертельными исходами.
Случаи инфицирования людей вирусом гриппа А(Н5ЕП) наблюдались в
Иране, Непале, Индии, Корее, с 2013 г. -
в Республике Бангладеш,
Камбодже, Китае, Египте, Индонезии, Вьетнаме. В нашей стране пока не
зарегистрировано
ни
одного
случая
заболевания
человека
гриппом,
вызванным вирусом А (Н5Ш). Первая вспышка «птичьего гриппа» среди
домашней птицы в России произошла в июле 2005 года в Новосибирской
области (Львов и др., 2005) и была связана с миграцией водоплавающих птиц
из Азиатских стран на территорию нашей страны.
Невозможно
предсказать
возбудитель следующей
пандемии,
не
исключено, что это будет один из «птичьих» вирусов. Время и место
появления следующего пандемического вируса также невозможно точно
предсказать, важную роль в этом играет глобальное наблюдение за
циркуляцией вирусов гриппа среди людей и животных в мире и подготовка к
очередной пандемии при тесном сотрудничестве с ВОЗ.
3
Угроза возникновения новой пандемии, предупреждение заноса и
распространения высоко патогенных вирусов гриппа на территории нашей
страны требует проведения мониторинга среди людей, домашних и диких
птиц с использованием современных средств диагностики.
В связи с этим диссертационная работа Аканиной Д.С, посвященная
решению
важной
проблемы
-
разработке
способов
лабораторной
идентификации вируса гриппа А подтипа Н5М1 и обнаружения антител к
нему, представляется актуальной, современной и своевременной.
Степень
обоснованности
научных
положений,
выводов
и
рекомендаций, сформулированных в диссертации, их достоверность и
новизна. Достоверность полученных результатов и обоснованность научных
положений и выводов не вызывает сомнений.
комплексном
использовании
современных,
хорошо
адекватных
зарекомендовавших
Они базируются на
поставленным
себя
в
задачам
исследовательской
практике серологических, вирусологических, молекулярно-биологических и
генно-инженерных методов. Все исследования выполнены с использованием
официально утвержденных методик. Используемые дизайны исследований
соответствуют требованиям, предъявляемым к подобным исследованиям.
Лабораторные эксперименты осуществлялись на сертифицированном и
проверенном
оборудовании.
Результаты
исследований
подвергнуты
статистической обработке с использованием пакета прикладных программ.
Комплексный подход к достижению цели и решению поставленных
задач
позволил
автору
получить
новые
данные,
важные
для
совершенствования системы мониторинга вируса гриппа А подтипа Н51Ч1
среди диких и домашних птиц в различных районах РФ. Созданы
отечественные тест-системы на основе ПЦР и ПЦР-РВ для диагностики
вируса гриппа А подтипа Н5№ с учетом генотипов вируса, циркулирующих
на
территории
Российской
Федерации.
Разработанные
тест-системы
являются универсальными и позволяют детектировать все известные на
сегодняшний день генотипы вируса гриппа А подтипа Н51чГ1. Достигнута
4
высокая эффективность применения молекулярно-генетических методик
мониторинга вируса гриппа А подтипа H5N1 среди птиц.
«Тест-система для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А
подтипа
H5N1
методом
ПЦР»
сертифицирована
во
Всероссийском
Государственном Центре качества и стандартизации лекарственных средств
для животных и кормов (ФГБУ «ВГНКИ»), сертификат соответствия №
РОСС 1Ш.ФВ01.Н26634. В результате исследований автора получен
Российский патент № 2361924 «Способ обнаружения вируса гриппа А
подтипа H5N1».
Впервые показана возможность использования метода количественного
определения содержания РНК вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР
в режиме реальном времени для контроля получения рекомбинантного
вируса гриппа H5N1 методом обратной генетики.
Показана возможность применения разработанных методов для
дифференциации инфицированных и вакцинированных инактивированной
вакциной птиц непрямого ИФА для обнаружения антител к неструктурному
белку NS 1 вируса гриппа А подтипа H5N1.
Научно-практическая значимость работы
Разработанные диссертантом тест-системы и методики на основе ПЦР
и ПЦР в реальном времени использованы при проведении Международной
интеркалибрации WHO External Quality Assessment Programm (EQAP) по
молекулярной диагностике гриппа в 2007-2011 г.г. Получен международный
сертификат от 31. 10. 2011 г. Для «Тест-системы для обнаружения и
дифференциации
вируса
гриппа
А
подтипа
H5N1
методом
ПЦР»
разработаны СТО 42418073-0001-2007 и Инструкция по применению от 21.
05. 2009 №1-4.7/02562, которые утверждены в Министерстве Сельского
хозяйства РФ. Данная тест-система сертифицирована во Всероссийском
Государственном Центре качества и стандартизации лекарственных средств
для животных и кормов (ФГБУ «ВГНКИ»). Разработанные методы и тестсистемы на их основе могут быть использованы в лабораториях научно­
5
исследовательских институтов, в региональных ветеринарных лабораториях,
в диагностических лабораториях Роспотребнадзора и Минсельхоза РФ для
изучения эволюции вируса гриппа А подтипа H5N1 с целью предсказания
масштабов и тяжести грядущих эпидемий. Методика обнаружения антител к
рекомбинантному неструктурному белку вируса гриппа NSlHa основе
непрямого
выявления
ИФА
может
быть
использована для
вакцинированных
дифференциального
инактивированной
вакциной
и
инфицированных птиц.
Структура диссертационной работы традиционна. Работа изложена на
156 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора
литературы,
описания
материалов
и
методов,
главы
собственных
исследований (экспериментальной части), выводов, списка цитируемой
литературы, включающего 148 источников, в том числе 112 иностранных, 4
приложения. Работа иллюстрирована 26 рисунками и 11 таблицами.
Введение содержит все необходимые регламентированные разделы,
позволяющие получить благоприятное предварительное впечатление от
представленной к защите диссертации. Автор обосновал актуальность
выбранной темы и необходимость ее разработки. Цель и задачи работы
сформулированы ясно и верно: разработать и усовершенствовать методы
лабораторного выявления вируса гриппа А подтипа H5N1 и антител к нему.
Автор показал новизну проведенных исследований и их практическую
значимость
Раздел «Обзор литературы» достаточно полно представляет анализ
научной информации по проблеме и по теме диссертации. Приведена
характеристика
вируса
гриппа,
отражены
вирусологические
и
эпидемиологические аспекты, свойственные подтипу H5N1, а также
особенности клинического проявления заболевания, вызванного данным
вирусом. В обзоре представлен филогенетический анализ вируса, отражены
современные способы детекции вируса, при этом особое внимание уделено
молекулярным методам исследования и их преимуществам: быстрота,
6
надёжность и экономичность. Вместе с тем автор подчеркивает, что
дальнейшее развитие ПНР получит в области количественного определения
нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) инфекционных агентов. Обзор написан
хорошим языком, информативен. Рисунки, приведенные в обзоре, хорошо
иллюстрируют данные литературы.
Собственные исследования автора начинаются разделом «Материалы и
методы», в котором подробно изложены сведения об объектах изучения, о
методах испытаний и приборах, использованных в экспериментах. В
таблицах приведены характеристики использованных в работе штаммов,
количество и места сбора полевых образцов, праймеры, температурные
условия для проведения ПНР. Указаны методы статистической обработки.
В
четвёртой
главе
работы
представлены
полученные
автором
собственные результаты исследования.
Первая часть собственных исследований посвящена разработке тестсистемы для обнаружения и дифференциации РНК вируса гриппа А подтипа
Н5И1 методом ПЦР. Эффективность и специфичность тест-системы была
проверена на референтных коллекционных штаммах вируса гриппа,
Результаты исследования эпидемических штаммов вируса гриппа,
выделенных от людей, показали, что с помощью разработанной тест-системы
можно выявить геном вируса гриппа А подтипа N1. Специфичность тестсистемы также была проверена с эпидемическими и эталонными штаммами
вируса гриппа А, выделенными от животных, в том числе и от птиц. При
обнаружении РНК вируса гриппа А подтипа N1 положительные результаты
были получены с эпидемическими штаммами А/СССР/90/77 (НШ1) и
АЛУ^И/ЭЗ (НШ1), хранившимися в замороженном состоянии длительное
время.
Аналитическая
чувствительность
метода,
или
минимально
детектируемое количество РНК вируса гриппа подтипа Н5 и N1 составила
102 ЭИД50/МЛ и 103 ЭИД50/МЛ, соответственно.
Следующим этапом работы являлась разработка и оптимизация
качественного и количественного обнаружения вируса гриппа А подтипа
7
Н5>П и дифференциация его от других подтипов вируса гриппа А и других
вирусов на основе ПЦР в реальном времени.
Построение
калибровочного
графика
с
использованием
последовательных разведений рекомбинантной плазмиды с известной
концентрацией позволило разработать метод количественного определения
вирусной
РНК.
Показана
возможность
использования
разработанной
модификации ПЦР в режиме реального времени для определения накопления
рекомбинантного вируса гриппа А Н5141, полученного методом обратной
генетики.
Анализ 648 образцов, собранных от диких и домашних птиц во время
эпизоотий 2005-2008 года, проведенный с использованием разработанных
автором тест- систем, продемонстрировал их универсальность и возможность
идентификации вируса гриппа А подтипа Н51М1 не только у погибших и
больных птиц, но также и у птиц без клинических признаков заболевания.
Выявление
вирусов
классическими
молекулярными
методами
методами
идентификации
было
вирусов.
подтверждено
Все
пробы,
положительные при обнаружении методом одностадийной ПЦР, также
оказались положительными при анализе с помощью ПЦР в реальном
времени.
В заключении соискатель на высоком профессиональном уровне
анализирует полученные результаты, тщательно обосновывая последующие
основные выводы. Диссертация завершается выводами, которые правомерно
вытекают из полученных результатов и согласуются с положениями,
сформулированными в работе. Обоснованность выводов определяется
результатами исследований, полученными на значительном материале.
Диссертация
написана
литературным
языком,
оформлена
и
иллюстрирована в соответствии с действующим стандартом.
Автореферат отражает содержание работы, содержит рисунки и
таблицы. Основные материалы диссертации опубликованы в печати (18
опубликованных тезисов
и статей), в том числе
8 - в ведущих
8
рецензируемых научных журналах,
рекомендованных ВАК
России,
и
многократно докладывались на научных конференциях разного уровня.
В диссертационной работе имеется 4 приложения, в которые вошли
патент
Российской
Инструкция
по
Федерации,
применению
и
СТО
42418073-0001-20076262199,
сертификат
соответствия
№
РОСС
1Ш.ФВ01.Н26634 для тест-системы для обнаружения и дифференциации
РНК вируса гриппа А подтипа Н5Ы1 методом ПЦР.
В процессе прочтения диссертации возникает вопрос - можно ли
использовать разработанные тест-системы не только для определения РНК в
образцах от животных и птиц, но и для определения РНК у людей или в
образцах окружающей среды?
В тексте диссертации, приложении и автореферате также имеются
опечатки, небольшие неточности, которые не носят принципиального
характера и не влияют на ценность выполненной работы.
В целом, диссертация Д. С. Аканиной является законченным
исследованием, результаты которого, безусловно, обладают признаками и
научной новизны, и практической значимости.
Заключение
Диссертация Аканиной Дарьи Сергеевны на тему «Разработка средств
детекции вы соковирулентного ш тамма вируса гриппа А подтипа Н51Ч1»
является
научно-квалификационной
работой,
имеющей
важное
теоретическое и практическое значение, в которой успешно решена
актуальная для биологии задача. По своему содержанию, актуальности,
методическому уровню исполнения, достоверности полученных данных,
новизне разработок и практической значимости полученных результатов
представленная к защите диссертационная работа Д.С. Аканиной полностью
отвечает требованиям п. 9 «Положения о порядке присуждения ученых
степеней», утвержденного Постановлением Правительства РФ от 24.09.2013
№ 842, предъявляемым к кандидатским диссертациям, а ее автор, Аканина
9
Дарья Сергеевна, заслуживает присуждения искомой ученой степени
кандидата биологических наук по специальности 03.02.02 - вирусология.
Руководитель лаборатории испытаний
новых средств защиты от вирусных инфекций
ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России
доктор медицинских наук
Мариана Константиновна Ерофеева
nmriana_erof@mail.ru. Тел. 8-812-499 15 37
Подпись руки Марианы Константин
Ученый секретарь
ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава
кандидат медицинских наук
Тамара Геннадиевна Лобова
достоверяю.
Адрес организации: Индекс 197376
Город, Адрес, Россия, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова 15/17
Телефон +7 (812) 499-15-00
Факс+7(812) 499-15-00
Е-таП office@influenza.spb.ru
\УеЬ-сайт http://www.influenza.spb.ru/
Подпись
^
Удостоверяю.
Нач-к о.к.
/ 1/ "
Бойкова Т.А.
/
7г
~
-