использование метода swim-up для обработки эякулята при
advertisement
Министерство образования и науки РФ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОЛОГИИ КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ Направление: 06.03.01 (ОКСО 020400.62) – биология ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА Бакалаврская работа ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА SWIM-UP ДЛЯ ОБРАБОТКИ ЭЯКУЛЯТА ПРИ ПРОЦЕДУРЕ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ Работа завершена: "___"_________ 201_ г. ____________________ (А.А. Матвеева) ____________________ (Г.Ю. Яковлева) ____________________ (О.Н. Ильинская) Работа допущена к защите: Научный руководитель: к.б.н., доцент "___"_________ 201_ г. Заведующий кафедрой д.б.н., профессор "___"_________ 201_ г. Казань–2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 3 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 5 1.1 Бесплодие 5 1.2 Экстракорпоральное оплодотворение 6 1.3 Обработка эякулята перед экстракорпоральным оплодотворением 14 1.4 Микрофлора эякулята 19 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 22 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 22 2.1 Объект исследований 22 2.2 Микробиологические исследования эякулята 22 2.3 Статистическая обработка 24 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 25 3.1 Определение качественного состава эякулята 25 3.2 Оценка количественного и качественного состав эякулята, после 28 его обработки методом флотации (swim up) ВЫВОДЫ 32 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 33 2 ВВЕДЕНИЕ Бесплодие – невозможность оплодотворения ооцита сперматозоидом [http://www.ayzdorov.ru/Chto_takoe_besplodie.php]. На сегодняшний день, самыми эффективными методами лечения бесплодия являются: внутриматочная инсеминация (ВМИ) и экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО). Суть этих методов заключается во введении сперматозоида в ооцит in vivo или in vitro, для последующего развития эмбриона в полости матки. Однако для полноценного преобразования эмбриона из сперматозоида, нужны биохимические изменения в структуре самого сперматозоида. В обычной жизни, процесс капацитации происходит в момент прохождения сперматозоида в женских половых путях до ооцита. В случае же с ВМИ и ЭКО, процесс капацитации напрямую связан с обработкой спермы. Методов обработки эякулята несколько: флотация (swim up) и градиент плотности. У каждого из методов есть свои плюсы и минусы. Так, при использовании метода градиента плотности - эффективность выхода жизнеспособной фракции сперматозоидов увеличивается, время, затраченное на обработку эякулята - уменьшается, но этот метод очень затратный, так как требует большое количество дорогостоящих препаратов [Руководство ВОЗ 2012]. В отличие от метода градиента плотности, флотация (swim up) - наиболее дешевый, легко доступный и не менее эффективный метод. Суть этого метода заключается во всплытии фракции подвижных сперматозоидов, тогда как мертвые сперматозоиды, дебрис и иные клетки остаются на дне пробирки [Гусарева с соавт., 2005]. Целью нашей работы является – оценка возможности использования метода флотация (swim up) для очистки эякулята, применяемого в экстракорпоральном оплодотворении, от микроорганизмов. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи: 1) Определить качественный состав экстракорпоральном оплодотворении 3 эякулята, применяемого в 2) Оценить количественный и качественный состав эякулята, после его обработки методом флотации (swim up). 4 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Бесплодие Одной из проблем 21 века является бесплодие. Однако не стоит заявлять о том, что это проблема только данного века, бесплодие описано и в Библии [Lunenfeld, 1995]. По статистике, около 8% супружеских пар сталкиваются с этой проблемой в течение репродуктивного периода жизни. Также подсчитано, что каждый год количество бесплодных семей на 2 млн. увеличивается. Иными словами, бесплодие представляет собой значительное бремя для национальных систем здравоохранения по всему миру. Бесплодие - это неспособность сексуально активной, не использующей контрацепцию пары добиться беременности в течение одного года. Причина бесплодия может обуславливаться любыми нарушениями в процессе созревания половых клеток и процессе оплодотворения. Как видно из рисунка 1, по статистике 40% бесплодных пар не могут зачать ребенка изза проблем связанных с женским здоровьем, 45% из-за проблем мужчины и 15 % приходятся на случаи несовместимости организмов супругов, так называемую иммунологическую форму бесплодия и другие, более редкие формы [Афанасьев, 2012]. Причина бесплодия 50% 45% %, встречаемость 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% Мужчины Женщины др. причины Рисунок 1 – Причины бесплодия в парах 5 На сегодняшний день известно, что каждая 10 пара не способна к зачатию долгожданного дитя, без вмешательства медицины. В данном случае, понятие «вмешательство медицины» подразумевает - искусственное оплодотворение. Самым эффективным методом лечения бесплодия, на сегодняшний день является – внутриматочная инсеминация (ВМИ) и экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО). ЭКО – зачатие ребенка вне организма женщины, в пробирке. 1.2 Экстракорпоральное оплодотворение Первая беременность, полученная методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), была внематочной [Steptoe, Edwards, 1976]. Это важнейшее событие произошло в 1976 году в Британии, благодаря научнопрактическим исследованиям ученых: гинеколога P. Steptoe и биолога R. Edwards, которые позднее, в 1978 году, получили первую маточную беременность методом ЭКО. Родился первый ребенок зачатый in vitro – Луиза Браун [Steptoe, Edwards, 1978]. К вспомогательным репродуктивным технологиям относятся: экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) и перенос эмбриона (ПЭ) в полость матки, инъекция сперматозоида в цитоплазму ооцита (ИКСИ), криоконсервация спермы, ооцитов, эмбрионов, ткани яичника, донорство спермы, ооцитов и эмбрионов, суррогатное материнство, предимплантационная диагностика, получение сперматозоидов для ИКСИ, искусственная инсеминация обогащенной спермой мужа (ИОСМ) или донора (ИОСД) [Афанасьев, 2012]. Искусственная инсеминация — это введение в половые пути женщины ранее полученной во время эякуляции семенной жидкости мужчины. Если у мужчины наблюдается азооспермия (полное отсутствие в эякуляте сперматозоидов) женщинам, желающим иметь детей, но из-за бесплодия мужа не имеющим таких возможностей, по понятным морально6 этическим соображениям искусственным путем вводят в половые пути сперматозоиды мужчин-доноров. Для этого эякулят замораживается в жидком азоте при температуре -196°С, где может сохраняться в течение длительного времени. В некоторых странах благодаря технике криоконсервации создаются банки спермы [Афанасьев, 2012]. Экстракорпоральное оплодотворение, или оплодотворение in vitro, применяют: 1) При женском бесплодии, не связанном с нарушением образования женских гамет (нарушении проходимости маточных труб). 2) После менопаузы. Применяется тогда, когда в яичнике женщины еще имеются примордиальные фолликулы, но развитие их до уровня зрелых яйцеклеток и оплодотворение последних в естественных условиях невозможно. 3) Может быть использована имплантация зародыша, полученного из родительских половых клеток, в матку приемной матери (так называемое "суррогат-материнство", которое необходимо тогда, когда у "генетической" матери отсутствует или недоразвита собственная матка при полноценной функции яичников) [Белоусов, 2005]. Рисунок 2 – Экстракорпоральное оплодотворение 7 Одним из разновидностей ЭКО является ИКСИ (ICSI – IntraCitoplasmatical Sperm Injection). Главная суть которой заключается в том, что в яйцеклетку под микроскопом вводится всего один сперматозоид. Рисунок 3 - Интрацитоплазматическая инъекция сперматозоидов (ИКСИ), разновидность экстракорпорального оплодотворения ЭКО включает в себя несколько стадий [Гульмамедова, 2008]: 1) Отбор пациентов. 2) Стимуляция суперовуляции. 3) Гормональный и ультразвуковой мониторинг. 4) Трансвагинальная пункция фолликулов и получение преовуляторных ооцитов под контролем УЗИ. 5) Эмбриологический этап. 6) Перенос эмбрионов. 7) Поддержка лютеиновой фазы. 8) Диагностика наступившей беременности. 1.2.1 Отбор пациентов для ЭКО Отбор пациентов для ЭКО основывается на данных полученных из их предварительного общеклинического 8 обследования и результатов дополнительных исследований: лапароскопии, гистеросальпингографии, спермограммы мужа, тестов функциональной диагностики, УЗИ органов малого таза, изучения гормонального статуса. На сегодняшний день считается, что ЭКО – эффективен практически при любой форме инфертильности. Однако нужно учесть, что этот метод не является панацеей в лечении бесплодия и должен использоваться лишь в крайних мерах, когда предыдущие усилия и методы не привели к желанному результату. Согласно приказу Минздрава России от 30.08.2012 N 107н "О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению", к перечню противопоказаний ВРТ относят [www.consultant.ru]: Некоторые паразитарные и инфекционные болезни (туберкулез, ВИЧ, сифилис, гепатит); Примечание: острые воспалительные заболевания любой локализации у женщины являются противопоказанием к использованию ВРТ до их излечения. Пациенты, идущие на ЭКО с ВИЧ, гепатит В, С допускаются до программы в стадии ремиссии со справкой от инфекциониста Новообразования (злокачественные и доброкачественные); Болезни крови и кроветворных органов; Болезни эндокринной системы, расстройства питания нарушения обмена веществ; Психические расстройства; Болезни нервной системы; Болезни системы кровообращения; Болезни органов дыхания; Болезни органов пищеварения Болезни мочеполовой системы; Болезни костно-мышечной системы и соединительной ткани; Врожденные пороки развития; 9 и Травмы, отравления и некоторые другие воздействия внешних причин. Также, согласно приказу Минздрава РФ от 30.08.2012 N 107н, разделу 2, пункту 11 [www.consultant.ru]: При подготовке к программе ВРТ на этапе оказания первичной специализированной медико-санитарной помощи для определения относительных и абсолютных противопоказаний к применению ВРТ мужчине и женщине проводится обследование, которое включает: а) определение антител к бледной трепонеме в крови; б) определение антител класса M, G к вирусу иммунодефицита человека (далее - ВИЧ) 1, 2, к антигену вирусного гепатита B и C, определение антигенов вируса простого герпеса в крови; в) микроскопическое исследование отделяемого половых органов на аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы, на грибы рода кандида, паразитологическое исследование на атрофозоиты трихомонад; г) микробиологическое исследование на хламидии, микоплазму и уреаплазму; д) молекулярно-биологическое исследование на вирус простого герпеса 1, 2, на цитомегаловирус. Однако, если вы оказались в ряду счастливчиков, свой режим жизни придется несколько перекроить. Например, побольше проводить времени супругам на свежем воздухе. Также следует немедленно сообщить вашему лечащему врачу об ОРЗ и других подобных заболеваниях. Нужно исключит переохлаждение и повышении температуры, так обоим партнерам следует на 3 месяца отказаться от горячих ванн, бань, сауны. Завязать с курением, алкоголем и другими одурманивающими веществами. Проследить за правильным питанием, в частности отказаться от фаст-фуда. Есть еще одна рекомендация, которая может всех насмешить, однако ее лучше выполнить – не работать с компьютером на коленях и не носить в карманах брюк сотовые 10 телефоны. Все эти правила относятся как к будущей матери ребенка, так и отцу [Петрова, 2011]. 1.2.2 Стимуляция суперовуляции при ЭКО Основной задачей подготовки экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов является получение большого числа зрелых, жизнеспособных преовуляторных яйцеклеток, способных к оплодотворению "в пробирке". Для этого проводят стимуляцию суперовуляции. Эффективность ЭКО в стимулированных циклах составляет от 30% до 40% возникновения беременностей на перенос. Показатель наступления беременности возрастает при переносе более одного эмбриона. Суперовуляцию можно стимулировать различными препаратами прямого или опосредованного действия. Наибольшее распространение получили препараты синтетических нестероидных антиэстрогенов - кломифена-цитрат (КЦ) и его аналоги: серофен, клостильбегит, перготайм, кломид; а также препараты, содержащие естественные ФСГ и ЛГ, выделенные из мочи женщин в постменопаузе (ЧМГ): меногон, неопергонал, пергонал, хумегон, а также средства, содержащие только ФСГ: фертинорм, метродин, урофоллитропин, пурегон (рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон). [http://www.medicalj.ru/maneuver/gynecological-surgery/568-eko-iksi]. Наиболее простой, безопасный и дешевый способ стимуляции суперовуляции аналогами кломифена-цитрата. Однако применение этих схем стимуляции суперовуляции в современных условиях следует ограничить в связи с недостаточной эффективностью (4-12%), обусловленной сохранением высокого уровня ЛГ, часто возникающим «паразитарным» пиком ЛГ и антиэстрогенным действием на эндометрий [Гюльмамедова, 2008]. В последние годы наиболее широкое применение получили препараты человеческие менопаузальные гонадотропины (ЧМГ). Введение ЧМГ способствует усилению процесса фолликулогенеза, 11 если стимуляция овуляции начинается в раннюю фолликулиновую фазу. Стимуляция овуляции гонадотропинами проводится 10-15 дней, начиная со 2-3 дня менструального цикла. Широко внедрены в клиническую практику комбинированные схемы применения ЧМГ и аналогов КЦ. Введение препаратов ЧМГ производится либо одновременно на фоне приема КЦ, либо последовательно, когда прием КЦ прекращается. Эта более мягкая схема используется при синдром поликистозных яичников (СПКЯ), чтобы уменьшить число развивающихся фолликулов. С этой же целью при СПКЯ используется чистый ФСГ. Имеется опыт стимуляции препаратами ЧМГ после лечения даназолом (данол, дановал, даноген). Лечение даназолом применяется у пациенток с эндометриозом или со склонностью к образованию кист в яичниках. Эти препараты оказывают преимущественно антигонадотропное действие. Эффективность программы ЭКО при использовании только препаратов ЧМГ не превышает 15-20%. В настоящее предпочтение время отдается среди режиму схем стимуляции стимуляции с суперовуляции помощью агонистов гонадотропин-рилизинг-гормона (а-ГнРГ) (85%). Применение аналогов гонадолиберина повышает эффективность программы ЭКО более чем в 2 раза. Эффективность наступления беременности из расчета на один перенос эмбрионов в полость матки при использовании а-ГнРГ составляет примерно 40%. При постоянном чувствительность введении (происходит агонистов десинтитизация) а-ГнРГ снижается рецепторов клеток аденогипофиза, что позволяет добиться блокады гонадотропной активности и вторичной функции гонад (так называемая медикаментозная кастрация). Это позволяет унифицировать стартовые условия фолликулогенеза, обеспечивает вступление в фазу активного роста большего числа фолликулов, а также предотвращает «паразитарный» выброс ЛГ. Наиболее широко применяется так называемая длинная схема, когда введение а-ГнРГ начинается с середины лютеиновой фазы предыдущего 12 цикла (19-22 день) введением депо-декапептила или золадекса, или ежедневными инъекциями декапептила до дня введения ХГ. При наступлении полной блокады секреции эстрадиола (100-50 пкмоль/л) (2-5 день цикла) начинается стимуляция роста фолликулов введением ЧМГ [http://www.medicalj.ru/maneuver/gynecological-surgery/568-eko-iksi]. 1.2.3 Гормональный и ультразвуковой мониторинг при ЭКО Гормональный мониторинг позволяет определять концентрацию эстрадиола (Е2) в течение лечебного цикла. Это дает возможность оценить функциональную зрелость ооцитов и фолликулов и определить момент введения разрешающей (овуляторной) дозы ХГ 5-10 тыс. ЕД (Профази, Прегнил), который имитирует пик эндогенного ЛГ и ведет к окончательному созреванию ооцитов перед овуляцией. Обычно концентрация Е2 в крови в это время составляет около 300 пг/мл из расчета на каждый фолликул диаметром 15 мм и более. По данным ультразвукового мониторинга, применяемого для слежения за ростом фолликулов и эндометрия в динамике, этому моменту соответствует диаметр лидирующего фолликула 18-19 мм и толщина эндометрия 9-10 мм [http://www.medicalj.ru/maneuver/gynecological- surgery/568-eko-iksi]. 1.2.4 Трансвагинальная пункция фолликул и получение преовуляторных ооцитов при ЭКО Трансвагинальная пункция фолликулов яичников (ТВП) - заключительный этап стимуляции суперовуляции в программе ЭКО. Трансвагинальная пункция фолликул и получение преовуляторных ооцитов под контролем УЗИ является важным этапом, который проводится спустя 35-36 часов после введения ХГ [Петрова, 2011]. Эффективность проведения программы ТВП зависит как от высокой квалификации специалистов, так и от оборудования, отвечающего всем требованиям современной науки. Это позволяет получить количество 13 ооцитов, адекватное числу образовавшихся в яичниках фолликулов, и снизить риск осложнений [Руководство ВОЗ, 2012]. Основные принципы технологии, применяемой на эмбриологическом этапе программы ЭКО, следующие: 1) Получение фолликулярной жидкости, содержащей ооциты. 2) Выделение комплекса ооцит - клетка кумулюса (окружающие ооцит фолликулярные клетки) из фолликулярной жидкости пунктированного фолликула и перенос в питательную среду. 3) Микроскопический контроль стадии созревания ооцитов по состоянию клеток кумулюса. 4) Выделение прогрессивно подвижной фракции сперматозоидов из эякулята методом центрифугирования. 5) Инсеминация ооцитов путем введения в среду 50-100 тыс. спермиев на 1 ооцит. 6) Удаление капилляром с поверхности зигот фолликулярного эпителия через 18 ч культивирования. 7) Контроль оплодотворения по наличию 2 пронуклеусов в ооците. 8) Культивирование эмбрионов в течение 5 дней развития. 9) Отбор эмбрионов с лучшей морфологией, более продвинутых по стадии дробления. 10) Перенос эмбрионов с помощью катетера в полость матки [http://www.medicalj.ru/maneuver/gynecological-surgery/568-eko-iksi]. 1.3 Обработка эякулята перед экстракорпоральным оплодотворением Сперматозоиды in vivo во время прохождения через женский половые пути к месту оплодотворения (фаллопиевы трубы) освобождаются от семенной плазмы и других компонентов спермы, а также претерпевают целый комплекс ультроструктурных и биохимических изменений, в результате которых, они готовы к оплодотворению яйцеклетки. Иными словами, сперматозоиды проходят фазу капацитации, наиболее выраженную в мембране головки сперматозоида. Главной задачей очищения спермы, 14 является подготовка сперматозоидов к оплодотворению яйцеклетки in vitro, т.е. капацитация в пробирке [Гусарева с соавт., 2005]. Также подготовка спермы осуществляется для того, чтоб выбрать лучшие сперматозоиды отделив при этом семенную плазму, мертвые сперматозоиды и другие вредоносные клетки. Выбор метода приготовления спермы основывается на истории болезни пациента, на предварительном анализе спермы и на выбранном методе оплодотворения. Также существуют постулаты приготовления спермы. 1) Первая порция эякулята содержит наибольшее количество сперматозоидов (высокая фракция), в то время как оставшаяся часть содержит секрет из семенных пузырьков (низкая фракция). Иными словами, критически важно собрать первые капли эякулята в пробирку, предназначенную для сбора сперматозоидов. 2) Время от сбора эякулята, до начала приготовления спермы – не должно превышать более 60 минут. 3) Нормальный образец спермы достигает своего полного разжижения за 30-60 минут. 4) Слишком долгое пребывание сперматозоидов в семенной плазме, приводит к низкому выходу подвижных сперматозоидов и к снижению их способности к оплодотворению. 5) Не рекомендуется центрифугировать необработанную сперму, т к мертвые сперматозоиды и потенциальные токсины сконцентрируются около подвижных сперматозоидов [Руководство ВОЗ 2012]. Перед тем как начать обработку спермы, следует дождаться ее разжижения, в условиях 30-минутной инкубации при комнатной температуре. Затем сперматозоиды необходимо отмыть, так как семенная плазма, даже в небольших количествах, может быть токсичной, как для них, так и для яйцеклеток. Кроме того, в сперме могут присутствовать бактерии, которые 15 при попадании в женские половые пути или даже при инсеминации in vitro способны размножаться и вызывать воспаления. Семенная плазма включает в себя большое количество простагландинов, которые при попадании в полость матки могут вызывать пароксизмальные и болезненные сокращения миометрия. Обработка спермы предполагает не только отделение сперматозоидов от семенной плазмы, но и увеличение доли клеток, обладающих высокой подвижностью и нормальным строением, а также индукцию процесса капацитации [Rennemeier, 2009]. Отделение семенной жидкости от фракции лучших сперматозоидов может осуществляться множеством способов, однако на сегодняшний день в основном применяется два – флотация (swim-up) и центрифугирование в градиенте плотности. Большинство методов включает начальное разжижение спермы (в условиях простой инкубации) и последующее отделение содержащей сперматозоиды фракции от семенной плазмы путем центрифугирования. Супернатант выбрасывают, а дальше применяют одну из перечисленных процедур. 1.3.1 Флотация или метод swim-up Сперматозоиды для искусственного оплодотворения чаще всего получают методом флотации, который основан на том, что самые подвижные и полноценные клетки обладают способностью всплывать против силы тяжести в верхний слой культуральной среды. Длительность процедуры 6090 минут. Значение этого метода на столько велико, что для проникновения сперматозоидов в супернатант, клеткам необходимы те же свойства, что и для проникновения в шеечную слизь и оплодотворения яйцеклеток. Поэтому результаты искусственного оплодотворения коррелируют с концентрацией всплывших сперматозоидов. Основной недостаток этого метода — малый выход подвижных сперматозоидов, особенно при выраженной патологии спермы. Выход клеток 16 можно повысить путем увеличения времени инкубации, легкого встряхивания пробирки с культурой клеток и использования сразу нескольких параллельных проб (так называемый «многопробирочный» способ). Тем не менее методом флотации можно получить более подвижные сперматозоиды и относительно большее количество нормальных клеток, чем методами центрифугирования в градиенте плотности и фильтрации. Хотя метод флотации требует относительно больших затрат времени, он технически прост, не нуждается в сложном лабораторном оборудовании и в руках разных лаборантов дает одинаковые результаты. Метод: 1) Тщательно перемещайте образец спермы . 2) Поместите 1 мл спермы в стерильную 15 мл коническую центрифужную пробирку, аккуратно наслоите 1.2 мл обогащенной среды на эякулят. Либо аккуратно подслоите сперму под культуральную среду. 3) Наклоните пробирку под углом 45о для увеличения площади поверхности и инкубируйте в течение 1 часа при температуре 37о С. 4) Аккуратно верните пробирку в вертикальное положение и удалите 1 мл верхней культуральной среды. Она будет содержать максимальное количество подвижных сперматозоидов. 5) Разведите ее 1.5–2.0 мл обогащенной средой. 6) Центрифугируйте при 300–500 g в течение 5 мин и удалите супернатант. 7) Ресуспендируйте осадок эякулята в 0.5 мл обогащенной среды для оценки концентрации сперматозоидов, их общей подвижности и прогрессивно-подвижной фракции. 8) Образец можно использовать сразу для терапевтических или исследовательских целей [Руководство ВОЗ 2012]. 1.3.2 Центрифугирование в градиенте плотности 17 Этим методом подвижные и нормальные сперматозоиды отделяются не только за счет скорости вращения центрифуги, но и в силу своего удельного веса. Известно, что жизнеспособные сперматозоиды по удельному весу отличаются от дегенерировавших или мертвых. При выполнении этого метода использует центрифугирование эякулята в градиенте плотностей, содержащем коллоидные шарики, покрытые силаном, которые разделяют клетки по их плотности. Кроме того, подвижные сперматозоиды активно проникают через градиент и формируют небольшой осадок на дне пробирки. Метод простого двукратного градиента плотностей является наиболее применимым, обычно используют 40% (v/v) плотность как верхний слой и 80% (v/v) плотность как нижний. Обработка сперматозоидов с помощью градиента плотностей обычно позволяет получить фракцию высокоподвижных сперматозоидов, свободную от клеточного дебриса, лейкоцитов, округлых клеток и дегенерирующих половых клеток. Ряд коммерческих продуктов доступен для обработки спермы в градиенте плотностей. Эти продукты следует использовать согласно рекомендациям производителя. Любое отклонение от рекомендаций производителя должно быть обосновано. Большинство градиентов концентрации среды содержит относительно высокие молекулярно-массовые компоненты, которые, по сути, снижают осмолярность, поэтому они обычно готовятся в среде, которая изомолярна с жидкостями женских половых путей. (ВОЗ, 2012) Промытую суспензию сперматозоидов наносят на колонку, содержащую несколько слоев коллоидной жидкости разной плотности и затем центрифугируют. Для этой цели можно использовать перколл с коллоидными силиконовыми частицами диаметром 15-30 нм. Частицы покрывают биологически инертным поливинилпирролидоном (Уппсала, Швеция). Центрифугирование в градиенте плотности отделяет живые сперматозоиды не только от мертвых, но и от лейкоцитов. Предложены 18 различные модификации и составы растворов, содержащих коллоидные частицы: непрерывные градиенты плотности, ступенчатые градиенты плотности и (миниперколл). ступенчатые градиенты Непрерывный плотности градиент в малом плотности объеме требует ультроцентрифугирования (> 100 000 g), которое лучше разделяет частицы небольшого размера, такие, как вирусы и митохондрии. Поэтому для разделения сперматозоидов, имеющих относительно крупные размеры, используют преимущественно ступенчатый градиент плотности. Фракция, обогащенная подвижными сперматозоидами, легко выявляется в виде мутной полосы в области между 85% и 100% суспензией перколла. При очень плохом качестве сперматозоидов и очень малом их количестве целесообразно использовать мини-колонку с перколлом, так как для этого требуется всего 0.9 мл жидкости [Руководство ВОЗ 2012]. Выход подвижных сперматозоидов при центрифугировании в градиенте плотности больше, чем при использовании метода флотации, но данные о влиянии того или иного из этих методов на результаты обычного ЭКО противоречивы. В контролируемом проспективном исследовании не было обнаружено разницы в частоте оплодотворения при использовании разных методов обработки сперматозоидов. Однако, по данным другого контролируемого исследования, частота оплодотворения после центрифугирования сперматозоидов в градиенте плотности оказалась гораздо большей, чем после флотации. В любом случае результаты искусственного оплодотворения больше зависят от состояния фертильности обоих партнеров, чем от методов обработки сперматозоидов [http://medkarta.com/?cat=article&id=27294]. Нет никакого риска и воспаления женских половых путей вследствие попадания в них коллоидных силиконовых частиц при инсеминации [Руководство ВОЗ 2012]. 1.4 Микрофлора эякулята 19 На сегодняшний день, методы очистки сравнивают и на чистоту, т.е. если раньше сперма считалась стерильной, то на данный момент времени это утверждать не приходится. Состав микрофлоры уретры у мужчин не меняется в зависимости от возраста. Уже через несколько часов после рождения, у мальчика наблюдается развитие в ладьевидной ямке уретры – эпидермального стафилококка (Staph. epidermidis). В свою очередь, эпидермальный и сапрофитный стафилококки (Staph.epidermidis, Staph.saprophyticus) – являются, наиболее распространенными, среди взрослых здоровых мужчин. Мочеиспускательный канал мужчины благоприятен для жизни и размножения сапрофитных стафилококков, потому что имеет нейтральнощелочную среду. Однако было отмечено, что уменьшение бактериальной обсеменности по мере продвижения вглубь уретры - начинается с 5 сантиметров, иными словами - уретра практически стерильна [http://www.venuro.ru/transit/Normal_microflora.php]. Состав микрофлоры передней уретры здорового мужчины, частота выявления 50 – 100 % : Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus; 25 % : Streptococcus mitis, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Proteus sp., Bacteroides sp., Corynebacteria; 0 – 5 % : Staphylococcus aureus, Neisseria sp., Pseudomonas aeruginosa [http://www.venuro.ru/transit/Normal_microflora.php]. В России прочно утвердилось мнение о значительном превалировании в этиологии бесплодных браков «женского» фактора. Только в самое последнее время в аспекте этой проблемы все чаще стали звучать результаты исследований, указывающих на весьма значительную роль при этом мужской инфертильности. Наиболее частая причина мужского бесплодия - воспалительные поражения мочеполовой системы, вызывающие изменение нормальных характеристик эякулята [Задоев, 2012]. Учитывая, что особенно часто у мужчин с бесплодием встречались воспалительные заболевания, в 20 отчетной документации бактериологической лаборатории ООО «ПРО-МЕД» за 2011-2012 гг., были отмечены наиболее часто встречаемые микроорганизмы - большую часть из них составили грамположительные кокки (70.8 %), грамотрицательные факультативно-анаэробные палочки зарегистрированы в 8.1 % случаев [Касимова, 2012]. В спектре изолированных культур преобладали бактерии, относящиеся к: Enterococcus faecalis (21.0 %); Corinebacterium spp. (9.3 %); Staphylococcus epidermidis (14.6 %); Streptococcus equi (8.6 %); Escherichia coli (6.0 %); Staphylococcus haemolyticus (8.4); Streptococcus agalactiae (5.8); Corynebacterium minutissimum (5.7); Streptococcus spp. (10.0); Streptococcus pyogenes (1.2); Прочие (27,2). Известно, что при сборе эякулята может происходить смешивание спермы уретральной микрофлорой, более того, многие исследователи, в том числе M. Willen с соавт. [Willen et al., 1996], не обнаруживают различий в видовом составе микрофлоры уретры и эякулята здоровых мужчин. При этом в микробном спектре эякулята, не менее 1/3 объема которого составляет секрет предстательной железы, доминируют грамположительные микроорганизмы, относящиеся к родам Corinebacterium, Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus (коагулазонегативные виды). Их преобладание связано с наличием в семенной плазме бактерицидных белков, основной мишенью воздействия которых являются грамотрицательные бактерии. При определенных условиях, прежде всего связанных со снижением местного и 21 системного иммунитета, в сперме мужчин регистрируются условно патогенные микроорганизмы, являющиеся представителями семейства Enterobacteriaceae c преобладанием вида E.cоli [Horcajada, 2002], а также рода Enterococcus и другие [Касимова с соавт., 2012]. 22 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Объект исследований Объектом исследований служили 10 мужчин репродуктивного возраста, пациенты клиники Нуриевых, пришедших на предварительное обследование с целью возможности дальнейшего использования эякулята для экстракорпорального оплодотворения. 2.1.1 Отбор проб эякулята для микробиологического анализа Отбор эякулята для микробиологических анализов проводился с соблюдением всех мер стерильности. Время между сбором образца семени и началом исследования в микробиологической лаборатории не превышало 3 ч. [Руководство ВОЗ, 2012] В работе использовали нативный эякулят (контроль) и эякулят прошедший обработку флотацией (swim up). 2.2 Микробиологические исследования эякулята 2.2.1 Посев эякулята Сущность метода заключалась в определении общего содержания мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов, способных расти на питательной агаризованной среде. Проводилась серия десятикратных разведений в водопроводной воде и из каждого разведения по 1 мл суспензии вносили в стерильные чашки Петри, которые затем заливали расплавленным и охлажденным до 45-500С МПА (глубинный посев). Подсчет колоний производили в вариантах разведений, дающих не более 80 колоний на чашке. Данные выражали в виде средних величин с расчетом среднеквадратичных отклонений. 2.2.2 Изучение морфологических и тинкториальных свойств бактерий, выделенных из эякулята 23 Окраска по Грамму Метод Грама – метод окраски микроорганизмов для исследования, позволяющий дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенки. 1) На фиксированный мазок наливают метиленовую синь на 2-3 минуты. Во избежание осадков окрашивают через фильтровальную бумагу. 2) Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают раствором Люголя или иодистым раствором по Граму (водный раствор иодида калия и кристаллического иода в соотношении 2:1) на 1-2 минуты до почернения препарата. 3) Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20-40-60 секунд). 4) Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1-2 мин. 5) Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином (2-5 мин). 6) Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой [http://worldofscience.ru/biologija/17-mikrobiologija/367-okraska-po-gramu.html], [ http://humbio.ru/humbio/infect_har/002d6824.htm]. Выделенные аэробные бактерии были идентифицированы использованием прямого белкового профилирования с MALDI-TOF масс- спектрометрии Bruker Daltonik MАLDI Biotyper (Германия). В таблице 1 представлены значения логарифмических показателей при определении видовой принадлежности микроорганизмов. 24 Таблица 1 – Значение логарифмических показателей при определении видовой принадлежности микроорганизмов в масс-спектрометре Bruker Daltonik MАLDI Biotyper. Значение 1.300 … 3.000 2.000 … 2.299 Описание Высокая вероятность идентификации вида Гарантированная идентификация рода, возможная идентификация вида 1.700 … 1.999 Возможная идентификация рода 0.000 … 1.699 Отсутствие надежной идентификации 2.3 Статистическая обработка Математическую обработку данных проводили в стандартной компьютерной программе ―Excel 7.0.‖. В работе все эксперименты были проведены не менее чем в четырех повторностях. Группу данных считали однородной, если среднеквадратическое отклонение σ в ней не превышало 13%. Различие между группами считали достоверным при критерии вероятности Р<0.05. 25 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 3.1 Определение качественного состава эякулята Из представленных образцов эякулята было выделено 26 изолятов. Из них 34.5% представлены палочковидными формами и 65.4% - кокками (таблица 2). При определили грампринадлежности выделенных изолятов, было показано, что 16 (61.5 %) имели грамположительный морфотип строения клеточной стенки, и 10 (38.5%) - граммотрицательный морфотип. Видовой состав микроорганизмов эякулята определяли с использованием анализатора MALDI BioTyper, Bruker Daltonik (Германия), принцип действия которого основан на масс-спектрометрии константных белков микроорганизмов. Как видно из таблицы 3, микрофлора эякулята представлена следующими родами: Micrococcus, Staphylococcus, Rhizobium, Kocuria, Escherichia, Rothia, Pseudomonas, Acinetobacter, Streptococcus. Максимальное количество выделенных изолятов принадлежит к роду Staphylococcus (42%) (рисунок 4). Единичными экземлярами представлены изоляты родов Micrococcus (Micrococcus luteus), Rhizobium (Rhizobium radiobacter), Rothia (Rothia amarae). Среди выделенных бактерий принадлежащих к роду Staphylococcus преобладают S. epidermidis, S. haemolyticus, S. lugdunensis, S. warneri (рисунок 5). 26 Таблица1 – Морфологические и тинкториальные свойства клеток выделенных из эякулята изолятов. морфология Морфотипы 1 микрококки + 2 Кокки, ди и тетро + 3 Кокки, ди и тетро + 4 кокки + 5 Прямые или слегка изогнутые - палочковидные бактерии 6 Кокки, ди и тетро + 8 кокки - 9 Кокки, ди и тетро + 10 Палочки со слегка закруглѐнными концами - 11 Палочки со слегка закруглѐнными концами - 12 палочки со слегка закруглѐнными концами - 13 Кокки, ди и тетро + 14 Кокки, ди и тетро + 15 кокки + 16 кокки + 17 кокки + 18 кокки + 19 палочки - 20 Кокки + 21 палочки - 22 кокки + 23 палочки - 24 палочки - 25 Кокки, собранные в цепочки + 26 Кокки, собранные в цепочки + 27 Таблица 2: видовая принадлежность выделенных изолятов № Микроорганизм Показатель 1 Micrococcus luteus N203 CPB 2.208 2 Staphylococcus epidermidis DSM 3269 DSM 2.105 3 Staphylococcus epidermidis 10547 CHB 2.09 4 Staphylococcus lugdunensis DSM 4806 DSM 2.341 5 Rhizobium radiobacter DSM 30147T HAM 2.109 6 Staphylococcus epidermidis 6b_s ESL 1.972 7 not reliable identification 1.306 8 Kocuria rosea DSM 20447T DSM 2.19 9 Staphylococcus epidermidis DSM 3269 DSM 2.134 10 Escherichia coli ATCC 25922 THL 2.351 11 Escherichia coli DSM 682 DSM 2.371 12 Escherichia coli ATCC 25922 THL 2.417 13 Staphylococcus epidermidis 10547 CHB 1.93 14 Staphylococcus epidermidis DSM 3269 DSM 2.1 15 Staphylococcus haemolyticus DSM 20264 DSM 2.204 16 Staphylococcus haemolyticus DSM 20264 DSM 2.24 17 Rothia amarae IBS_MS_31 IBS 2.18 18 Staphylococcus warneri DSM 30728 DSM 2.021 19 Pseudomonas oryzihabitans DSM 6835T DSM 2.36 20 Kocuria rhizophila DSM 348 DSM 2.02 21 Acinetobacter lwoffii LMG 10596 LMG 2.27 22 Staphylococcus haemolyticus Mb18803_2 CHB 2.116 23 Acinetobacter lwoffii V506 MCRF 2.253 24 Pseudomonas oryzihabitans DSM 6835T DSM 2.29 25 Streptococcus agalactiae 04_158 CTL 2.426 26 Streptococcus agalactiae 04_158 CTL 2.346 28 Acinetobacter Streptococcus 8% 4% Pseudomonas 8% Micrococcus 4% Rothia 4% Staphylococcus 48% Escherichia 12% Kocuria 8% Rhizobium 4% Рисунок 4 - Родовая принадлежность изолятов эякулята Staphylococcus warneri 9% Staphylococcus Staphylococcus lugdunensis 11% Staphylococcus epidermidis 55% Staphylococcus haemolyticus 25% Рисунок 5 - Представители рода Staphylococcus, выделенные из эякулята 29 В отличие от литературных данных [Willen et al., 1996, Касимова c cсоавт., 2012], видовой состав предложенного нам эякулята отличается отсутствием таких родов, как: Enterococcus и Corinebacterium, и наличием Rhizobium, Kocuria, Rothia, Pseudomonas, Acinetobacter. Наличие видов Rhizobium radiobacter, Escherichia coli, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae говорит о заболевании мочеполовой системы, которое может стать причиной бесплодия [Касимова с соавт., 2012]. А наличие таких видов, как Kocuria rhizophila, Micrococcus luteus и Rothia amarae чаще всего встречающиеся на коже человека, и Acinetobacter lwoffii, встречающиеся во внешней среде и распространенные повсеместно, свидельствует о нарушении пациентами правил отбора проб. 3.2 Оценка количественного и качественного состав эякулята, после его обработки методом флотации (swim up) Необходимость обработки спермы при in vivo или in vitro оплодотворении обусловлена следующими причинами: 1) Подготовка сперматозоидов к оплоотворению. Процесс капацитации или биохимический процесс на уровне мембраны, в результате которого меняется подвижность сперматозоидов. Гиперактивация подготавливает сперматозоиды к акросомной реакции в условиях in vivo или in vitro, перед оплодотворением ооцита. 2) Выделение наилучшей популяции сперматозоидов с поступательным движением и нормальной морфологией; 3) Удаления погибших сперматозоидов, посторонних клеток и их фрагментов [Гусарева с соавт., 2005]. Метод, использованный в нашей работе – флотация (swim up). По статистике, этот метод является наиболее дешевым, но и не уступает в эффективности заключается во методу градиента концентрации. Суть этого метода всплытие жизнеспособной фракции сперматозоидов. Преимущество метода: обогащение образца сперматозоидами с активным 30 поступательным движением и присутствием весьма небольшого количества (или полным отсутствием) неподвижных сперматозоидов. Кроме того, почти полностью исключается попадание в образец других клеток или их фрагментов [Гусарева с соавт., 2005]. Однако этот метод можно использовать и при очистке спермы от микроорганизмов. Как видно из рисунка 6, применение метода флотации приводит к снижению общего микробного обсеменения эякулята на 73%. Из них на 58% снижается количество аэробных микроорганизмов и 77% факультативно-анаэробных (рис 7-8). Рисунок 6 - Изменение количества аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов эякулята при флотации 31 Рисунок 7 - Изменение количества аэробных микроорганизмов эякулята при флотации Рисунок 8 - Изменение количества факультативно-анаэробных микроорганизмов эякулята при флотации 32 Аэробные микроорганизмы, которые остаются в эякуляте после применения этого метода, представлены кокковыми формами. Из них представители родов Streptococcus (Streptococcus agalactiae 04_158 CTL) и Rothia (Rothia amarae IBS_MS_31 IBS) полностью перешли в надосадок. Из всех выделенных представителей рода Staphylococcus в надосадке встречались Staphylococcus epidermidis DSM 3269 DSM, Staphylococcus haemolyticus DSM 20264 DSM, Staphylococcus warneri DSM 30728 DSM. Следовательно, применение метода обсемененность эякулята более чем в два раза. 33 флотации снижает ВЫВОДЫ 1) Из эякулята предназначенного для экстракорпорального оплодотворения было выделено 26 изолятов, из которых 42% относятся к роду Staphylococcus. 2) Применение метода флотации (swim up) приводит к снижению общего микробного обсеменения эякулята на 73%. Представители родов Streptococcus и Rothia полностью перешли в надосадок. 34 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1) Агапова, С.А. [электронный ресурс] – режим доступа : http://www.venuro.ru/transit/Normal_microflora.php - дата доступа 8.05.2015 2) Афанасьев, Ю.И. Гистология, эмбриология, цитология [Текст] / Ю. И. Афанасьев, Н. А. Юрина, Е. Ф. Котовский - 6-е изд., изм. и доп. - 2012. - 800 с. 3) База знаний по биологии человека, [электронный ресурс] – режим доступа : http://humbio.ru/humbio/infect_har/002d6824.htm - дата доступа 13.05.2015 4) Белоусов, Л.В. основы общей эмбриологии [Текст] / Л.В. Белоусов – 3-е изд., изм. и доп. – М. : изд. Моск. Ун-та : Наука – 2005. – 368 с. – ISBN 5-02-035314-0. 5) Всемирная организация здравоохранения [Текст] : Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека – 5-е изд. изм и доп. – 2012. – 305с. - ISBN 978-5-905106-09-05 6) Гусарева, А.А. Эмбриологические подходы к лечению методами вспомогательных репродуктивных технологий [Текст] / А.А. Гусарева, А.А. Осипова, Е.А. Калинина, Л.В. Адамян – Мск. : Учебно-методическое пособие для системы послевузовского образования. - М: МГМСУ, 2005. – 49с. – ББК 57.1я77+57.125.4 7) Гюльмамедова, И.Д. Проблемы имплантации в программе IVF / И.Д. Гюльмамедова, О.К. Межова – Гинекология. – Донецк. – 2008. - 253 с. 8) Задоев, С.А. Гипербарическая оксигенация в лечении больных хроническим конгестивным простатитом [Текст] / Задоев С.А., Евдокимов В.В. – Урология, Т.4 – 2001. – №1. – С. 27–29 9) Касимова, Т.В. Микрофлора эякулята как потенциальная причина репродуктивных проблем [Текст] / Т.В. Касимова, Ю.А. Богданов, И.Д. Кузнецов, Т.И. Карпунина – Пермь. : Фундаментальные исследования, 2012. –– № 2-2. – 308-310 с. 35 10) Мир науки, [электронный ресурс] – режим доступа : http://worldofscience.ru/biologija/17-mikrobiologija/367-okraska-po-gramu.html дата доступа 13.05.2015 11) Петрова Е.А. Подготовка и ведение супружеских пар при использовании вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в преодолении бесплодия [Текст] / Е.А. Петрова, С.И. Михалевич – Минск.2011. - № 7 - 42 с. 12) Приказ Минздрава России от 30.08.2012 № 107н "О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению" - Зарегистрировано в Минюсте России 12.02.2013 № 27010 13) AyZdorov.ru [electronic – resource] режим доступа : http://www.ayzdorov.ru/Chto_takoe_besplodie.php - дата доступа 18.05.2015 14) Bruker.ru, [electronic resource] – режим доступа : https://www.bruker.com/ru/products/mass-spectrometry-and-separations/maldibiotyper/technical-details.html - дата доступа 17.05.2015 15) Medicalj.ru [electronic resource] – режим http://www.medicalj.ru/maneuver/gynecological-surgery/568-eko-iksi доступа - : дата доступа 3.05.2015 16) Medkarta.com [electronic resource] – режим доступа : http://medkarta.com/?cat=article&id=27294 – дата доступа 1.06.2015 17) Rennemeier, C Microbial quorum-sensing molecules induce acrosome loss and cell death in human spermatozoa [Text] / C. Rennemeier, T.Frambach, F. Hennicke, J. Dietl - Infect Immun – 2009, - Nov;77(11):4990-7. doi: 10.1128/IAI.00586-09. 18) Steptoe, P.C. Research in human in-vitro fertilisation and embryo transfer [Text] / P.C. Steptoe, R.G. Edwards – 1976, - Lancet 1(7965):880-882 19) Steptoe, P.C. Birth after the reimplantation of a human embryo [Text] / P.C. Steptoe, R.G. Edwards – 1978, - Lancet 2(8085):366 36 20) Weissenberg, R. Controlled trial of high spermatic vein ligation for varicocele in infertile men [Text] / R. Weissenberg, B. Lunenfeld, A. Karasik, B. Goldwasser – 1995 21) Willen, M. 3. The bacterial flora of the genitourinary tract in healthy fertile men [Text] / M. Willen, E. Hoist, E.B. Myhre, A.M. Olsson - Scand. J. Urol. Nephrol. – 1996. – V. 30. – P. 387-393. 37
