РОЛЬ РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ И ЕГО СУПРЕССОРОВ В МЕХАНИЗМЕ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ
advertisement
РОЛЬ РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ И ЕГО СУПРЕССОРОВ В МЕХАНИЗМЕ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ Ергазиева А.М., Айдарбекова Н. Евразийский Национальный Университет им. Л.Н.Гумилева Казахстан, Астана ROLE OF RNA INTERFERENCE AND ITS IN THE MECHANISM suppressor PLANT PROTECTION Ergazieva AM, Aydarbekova H L.N. Gumilyov Eurasian National University. Astana, Kazakhstan Ключевые слова: РНК интерференция, вирус, растение, супрессор, супрессия. Ещё двадцать лет назад молекулярная биология не знала такого удивительного феномена, как РНК-интерференция. Сегодня же у учёных не вызывает сомнения, что это явление принимает участие в широчайшем спектре физиологических процессов у всех живых существ, а её и специфичности молекулярные не уступают посредники — короткие антителам крови [1]. механизм включается в борьбу не только по разнообразию У простейших РНК-интерференция обеспечивает иммунитет, в частности — защиту от вирусов. этот РНК — У более развитых организмов (и не столько) с внешними, но и с внутригеномными паразитами, а также становится важнейшим регулятором активности генов [1,2]. На сегодняшний день идентифицированы уже тысячи коротких регуляторных РНК, а механизм РНК-интерференции изучен очень подробно, однако бесспорно и то, что мы наблюдаем пока только верхушку этого айсберга. Открытие РНК-интерференции, несомненно, одно из главных событий молекулярной биологии и генетики на рубеже веков, а наиболее важное следствие этого открытия - обнаружение новых фундаментальных механизмов, с помощью которых молекулы РНК могут влиять на экспрессию генов [2]. Кроме того, в настоящее время этот подход уже широко применяется как лабораторный метод для выявления функций генов, в том числе и при изучении генома человека. Уже в ближайшем будущем могут появиться основанные на принципе РНК-интерференции лекарства нового поколения, действующие специфично на определенный ген и выключающие синтез кодируемого им белка. Такими мишенями РНК-интерференции могут быть, например, гены, активные в клетках опухолей, или гены, обеспечивающие размножение вирусов.Впервые об открытии было объявлено в феврале 1998 г., когда Файер и Меллоу опубликовали в журнале «Nature» статью, в которой на одной из самых популярных генетических моделей (нематоде) Caenorhabditis elegans круглом черве объяснили ряд полученных ранее экспериментальных результатов, казавшихся весьма странными. Так, для селекции сорта цветков петуний, который обладал бы более яркими бордовыми лепестками, генетики вводили в ее клетки ген, отвечающий за синтез красного пигмента [3]. К удивлению ученых, многие цветы, вместо того, чтобы усилить окраску, вовсе теряли пигмент и получались белыми. Как позже выяснилось из работ Файера и Меллоу, в основе этого парадокса лежит РНКинтерференция. Во всех подобных случаях в клетках подопытных организмов появлялись большие количества так называемых малых РНК копий отдельных участков ДНК, вводимых в клетку, активность которых подавлялась. В класс малых РНК включают молекулы, содержащие от 20 до 300 нуклеотидов. За эффект РНК интерференции отвечают самые короткие из них, состоящие всего из 2128 нуклеотидов. Особенностью этих молекул является то, что они, в отличие от большинства других клеточных РНК, состоящих всего из одной цепи нуклеотидов, являются двуцепочечными (дцРНК). Нуклеотиды с противоположных цепочек дцРНК спариваются друг с другом аналогично двуцепочечным ДНК в хромосомах. При попадании в клетку дцРНК непонятного происхождения начинается уничтожение последней. Специальные белки разрезают ее на мелкие кусочки, которые с помощью комплекса ферментов атакуют и разрушают информационную РНК, произведенную клеткой. Сигнал от гена гасится, белок не производится, ген замолкает. В этом и состоит РНК интерференция. На языке генетиков ею называется специфическая деградация одноцепочечной молекулы информационной РНК в присутствии двуцепочечной РНК с такой же. Объявлены имена лауреатов самой престижной премии в мире. Как уже сообщала «МГ», Нобелевская премия по физиологии и медицине 2006 г. присуждена двум американским ученым - 47-летнему Эндрю Файеру (Массачусетский техноло-гический институт) и 46-летнему Крейгу Меллоу (Медицинский колледж Массачусетского университета) за открытие явления РНК-интерференции, которое положило начало новой эре биомедицинских исследований последовательностью [4]. Открытое нобелевскими лауреатами явление широко распространено среди большинства организмов. Одно из возможных объяснений роли РНК интерференции защита организмов от РНК содержащих вирусов и мобильных элементов, перемещающихся посредством РНК. Таким образом, дцРНК может быть важным звеном иммунной системы, распознающим и ликвидирующим чужую РНК. В том случае, если в клетку проник РНК содержащий вирус, такая система защиты не даст ему размножиться. Если же вирус содержит ДНК, дцРНК будет мешать ему производить вирусные белки. Этот защитный механизм, предохраняющий клетку от вирусов и мобильных генетических элементов, можно использовать в терапевтических целях [5]. Недавние эксперименты на животных показали, что с помощью дцРНК можно погасить ген, обусловливающий, например, высокий уровень холестерина в крови, в перспективе использовать РНК интереференцию для лечения вирусных инфекций, рака и обменных нарушений. Известно два основных нарушения при развитии рака нарушение клеточного цикла, результатом которого является ненормальный рост клеток, и потеря чувствительности к белкам, вызывающим апоптоз. Использовать РНК интерференцию в лечении рака можно, подавляя гены, ответственные за клеточный цикл и противо апоптозные гены в клетках опухоли [6]. Для избирательного действия на раковые клетки можно вводить уникальные последовательности дцРНК, специфичные для какого нибудь определенного гена, или непосредственно в опухоль. Недавние исследования ясно показали перспективы РНК интерференции в подавлении роста и разрушении раковых клеток. Предпринимаются успешные попытки введения вирусных векторов в раковые клетки, что также способствует подавлению их роста. Однако все эти методы лечения находятся пока на предклинических испытаниях[5,6]. Способность РНК интерференции ингибировать репликацию вирусов и других инфицирующих агентов была продемонстрирована на клеточных культурах и подает надежды на лечение этих заболеваний. Но пока это дело будущего, а уже сейчас разработан метод РНК интерференции, который предполагает внесение в клетку специально сконструированной под определенный ген дцРНК, которая является инструментом для изучения роли того или иного гена. Так что теперь биологи всего мира пытаются, применяя этот подход, выяснить функции генов организмов, для которых известны нуклеотидные последовательности. РНК интерференция используется исследователями для анализа функций различных генов. Если необходимо исключить из клетки какой либо белок или несколько белков, исследователь может инъецировать двуцепочечные фрагменты РНК, комплементарные участку информационной РНК. Это возможно на различных этапах клеточного цикла и называется генным нокдауном. Например, таким способом было систематически инактивировано 5690 генов C.elegans для определения генов, регулирующих продолжительность жизни [7]. Но основная проблема в том, что не все гены подвержены РНК интерференции, а в норме в организме животных дцРНК вообще не образуется, и до сих пор неизвестны ферменты, которые могли бы с ней взаимодействовать[5,7]. Polerovirus P0. Beet western yellows virus (BWYV), представитель семейства Poleroviridae,кодирует белок P0, который является сильным супрессором RNAi. Впервые это было обнаружено в экспериментах с агроинфильтрацией вирусного белка в листья GFP трансгенных растений N. benthamiana [6]. Последующие исследования не выявили РНК связывающей способности P0, однако было обнаружено, что белок взаимодействует с гомологом S фазной киназы который является компонентом SCF семейства убиквитин E3 лигазы [7,8]. Данное взаимодействие осуществляется посредством, так называемого, F box домена вирусного белка. Точечные мутации в F box предотвращают взаимодействие с SKP1гомологом и одновременно уменьшают патогенность вируса. Соответственно, выключение экспрессии гена гомолога SKP1 в растениях N. benthamiana приводит к устойчивости растения к вирусной инфекции. Позднее было обнаружено, что экспрессия P0 в трансформированных растениях Arabidopsis приводит к различным аномалиям в развитии растений и повышенному уровню некоторых miRNA%целевых транскриптов, указывая на P0 действие на уровне RISC комплекса [8]. Весьма интересно, что экспрессия P0 вызывает деградацию AGO1 белка в in planta и P0 физически взаимодействует с AGO1 [7]. Параллельные биохимические исследования по механизму P0 супрессии RNAi показали, что Fbox белок взаимодействует с PAZ доменом в AGO1. F box белки являются компонентами комплексов E3 убиквитин лигазы, которые маркируют белок для протеасомной деградации [6] и, возможно,упомянутое выше взаимодействие с SKP1 является функционально важным. Примечательно,что данное взаимодействие завершается протеолитической деградацией AGO1. Однако остается неясным, что конкретно приводит к деградации AGO1, так как данный процесс не чувствителен к специфичному ингибитору протеосомной активности [9]. Таким образом, способность P0 вызывать AGO1 деградацию, является дополнительным примером всей сложности процесса вирусной адаптации к защитному механизму RNAi.Tobamovirus репликаза. Tobacco mosaic virus (TMV) приводит к активации защитную RNAi в растениях, так как вирусная инфекция сопровождается генерацией вирусных siRNA [8].Геном TMV кодирует белок 126 кДа, ответственный за репликацию вируса и его движение, и, как было позднее обнаружено, также вовлеченный в супрессию RNAi [9]. Также TMV родственный вирус мозаики томатов (Tomato mosaic virus (ToMV)) кодирует 130 кДа репликазный белок супрессор RNAi [10]. Более того, единичная аминокислотная замена в ToMV репликазе приводит к отсутствию симптомов в течение вирусного заражения. Биохимические эксперименты по изучению взаимодействия TMV репликазы с молекулами РНК указывают, что данный белок имеет способность связывать короткие молекулы siRNA [5]. Подобно TMV, другой репликазный белок 122 кДа штамма вируса (cr TMV), инфицирующего растения семейства крестоцветные, также способен связать 21 нт siRNAs и спаренные miRNA, таким образом предотвращая их встраивание в RISC. Более того было показано, что siRNA связывающая способность белка не препятствует активности уже препрограммированного RISC, указывая на необратимость механизма программирования нуклеазного комплекса.Последние исследования указывают на то,что инфекция TMV препятствует метилированию siRNA ферментом HEN1 метилтрансферазой. К тому же, данный эффект и формирование симптомов заболевания были непосредственно связаны с экспрессией репликазного белка 126 кДа [11]. Однако остается неясным, влияет ли данный супрессор непосредственно на активность HEN1, или же он участвует в процессе демелитилирования уже преметилированных молекул siRNA. Интересным и в определенной мере противоречивым является факт, что экспрессия репликазного белка 122 кДа cr TMV сопряжена с увеличенной аккумуляцией молекул siRNA, несмотря на его негативное влияние на HEN1 метилтрансферазу, активность которой необходима для поддержания стабильности молекул siRNA [10]. Closterovirus P21. Ранние исследования с Beet yellows virus (BYV) продемонстрировали, что белок 21 кДа (P21) супрессирует РНК индуцированное умалчивание экспрессии белка GFP. Супрессия RNAi была также выявлена для гомолога P21, кодируемого другими членами семейства Closteroviridae. Более того, в инфицированных растениях BYV P21 обнаруживается в клетке в качестве растворимого белка цитоплазмы, а также в форме нерастворимых белковых тел на периферии клетки. Другой гомолог P21 вируса Citrus tristeza супрессирует RNAi на внутриклеточном и межклеточном уровнях [9]. Биохимические тесты показали, что P21 взаимодействует со спаренными miRNAs и siRNAs in vivo. Способность P21 выборочно связывать спаренные siRNAs была подтверждена в других исследованиях. Примечательно, что подобно P19, P21 не воздействует на активность RISC комплекса, но препятствует процессу miRNA метилирования. Структурные исследования выявили взаимодействие альфа спиральных мономеров белка P21, в которых N( и C%концевые участки белка соприкасаются с соседними мономерами посредством симметрических head to head, tail to tail взаимодействий [10]. Белок формирует октамерические кольца с центральной впадиной диаметром ~90 A° и позитивно заряженной внутренней поверхностью кольца, которая, вероятно, играет роль в связывании молекул siRNAs. Более того было показано, что в противоположность селективному взаимодействию Tombusvirus P19 с молекулами siRNA длиной 21 нт, BYV P21 образует связывающую поверхность, отвечающую за электростатическое взаимодействие с siRNAs 21 нт, а также более длинными ss и dsRNAs in vitro. Невольно хочется предположить, что способность P21 связывать длинные dsRNAs вовлекает дополнительную супрессивную деятельность белка, возможно на уровне синтеза молекул siRNAs. В заключение, P21 представляет собой вирусный супрессор RNAi, который подобно ранее обсуждаемым примерам, препятствует программированию RISC, необходимого для нуклеазной деградации вирусной РНК. Белок оболочки Turnip crinkle virus (TVC). Белок оболочки p38 (CP/p38) Turnip crinkle virus (TCV) представляет собой еще один пример вирусного белка, проявляющего множественные биологические функции. Наряду с его структурной ролью в формировании вируса, было показано, что данный белок отвечает за системное распространение и межклеточное движение вируса [12]. Более того, TCV CP функционирует как важный фактор образования симптомов заболевания в ходе инфекции, а также воздействует на модуляцию симптомом в присутствии сателлитных вирусных РНК [11]. Первым признаком возможного участия TCV CP в супрессии RNAi было наблюдение, что данный белок восполняет супрессорный недостаток TBSV P19 дефектного мутанта. Последующие эксперименты, включающие метод инфильтрации Agrobacterium, показали, что TCV CP действительно является сильным супрессором RNAi [21]. Более того, TCV CP препятствовал аккумуляции вирусных siRNAs. Последующие исследования показали, что, в отличие от P19 и HC%Pro, TCV CP связывает dsRNAs вне зависимости от размера молекул, т.е. белок также связывает длинные dsRNAs [13]. Это означает, что взаимодействие CP:dsRNA может препятствовать доступности субстрата (dsRNAs) для DCL нуклеазы, что приводит к уменьшению аккумуляции siRNAs. Действительно, последние исследования установили решающую роль p38 в ингибировании DCL4, который отвечает за продукцию 21 нт вирусных siRNAs. Интересно, что p38 не препятствует активности DCL2 фермента, который необходим для синтеза 22 нт siRNAs. Более того, результаты данной работы показали, что деятельность супрессора p38 не зависит от вирион формирующей функции белка. Небольшие цистеин обогащенные белки. Цистеин обогащенные белки, кодируемые вирусами, которые принадлежат семействам Hordeivirus, Tobravirus, Pecluvirus, Furovirus и Carlavirus, не проявляют существенного родства, однако они обладают структурным сходством и играют важную роль в вирусных инфекциях, и функционируют в качестве патогенных вирусных факторов Tobravirus 16K. Способность Tobacco rattlevirus (TRV), члена семейства Тобравируса, супрессировать RNAi впервые была обнаружена при инокуляции вирусом GFP экспрессирующих трансгенных растений [11] с последовавшей идентификацией 16 кДа цистеин обогащенного белка (16K) в качестве супрессора. В процессе инфекции этот белок играет ключевую роль для эффективной аккумуляции TRV. Более того, мутационная инактивация гена 16K компенсировалась соэкспрессией CMV 2b, что указывало на функциональное сходство белков в механизме супрессии RNAi. Более того, обнаружено, что белок 16К в состоянии частично супрессировать RNAi в клетках Drosophila [13]. Последующие трансформационные эксперименты с использованием Agrobacterium на GFP трансгенных растениях N. benthamiana показали, что для активности 16K требуется экспрессия полной последовательности белка [12]. Экспрессия 16K ведет к незначительному уменьшению уровня аккумуляции GFP siRNAs, подчеркивая возможную роль белка в супрессии начальных этапов RNAi в инфицированных растениях. Последние данные свидетельствуют, что TRV 16K блокирует RNAi до момента образования dsRNA, так как супрессионная активность белка нивелировалась с увеличением дозы dsRNA [14]. Hordeivirus γb. Barley stripe mosaic virus (BSMV) кодирует 17кДа цистеин обогащенный белок γb, который не является обязательным для репликации и движения вируса, но существенно воздействует на процесс патогенеза [11]. Первый косвенный признак возможного участия γb в супрессии RNAi был получен в экспериментах с использованием мутанта TRV, который не экспрессирует p16. Показано, что отсутствие белка может быть компенсировано экспрессией BSMV γb. Аналогично, мутант BSMV с недостающей экспрессией γb был неспособен к системному движению в растении, однако данный функциональный дефект не наблюдался в трансгенных растениях, экспрессирующих потивирусный супрессор HC%Pro, одновременно указывая на важную роль γb в системном движении и его участии в супрессии RNAi [12]. В дальнейшем было показано, что C терминальная часть γb формирует спиральную структуру и участвует в межбелковых взаимодействиях, а также является критической в супрессии RNAi . Интересным представляется наблюдение, что Poa semilatent virus (PSV), который кодирует γb, локализуется в цитоплазме и пероксисомах . Биохимические анализы показали, что BSMV γb взаимодействует с ssRNAs посредством трех Zn связующих участков, находящихся на N(терминальной части белка [14]. Более того, РНК связующая способность γb белка существенно стимулируется в присутствии Zn ионов. Несмотря на необходимость получения дальнейших биохимических данных, эти результаты дают основание предполагать, что взаимодействие вирусного белка с РНК являетсяключевой функцией γb в супрессии RNAi. Современные молекулярные и биохимические исследования некоторых вирусных супрессоров значительно расширили наши представления о вирусных стратегиях супрессии RNAi. Вирусные супрессоры о ладаютширокимспектромбиохимических свойств, необходимых для борьбы с RNAi на разных стадиях этой защитной системы. Для более полного изучения механизма молекулярных отношений между защитной системой организма и вирусами необходимы дальнейшие детальные молекулярные, биохимические и структурные исследования вирусных супрессоров. Со временем эти знания могут быть реализованы для развития эффективных стратегий создания растений устойчивых к вирусным патогенам. Tombusvirus P19. Ранние генетические исследования белка P19, который кодируется геномом вирусов семейства Tombusviridae, показали участие белка в процессах репродукции, движения, упаковки РНК и векторной трансмиссии вируса [14]. Позднее было обнаружено, что P19 является важным патогенным фактором, который необходим для развития симптомов инфекции . Например, P19 вируса кустистой карликовости томатов (Tomato bushy stunt virus(TBSV)) не оказывает существенного влияния на начальные этапы инфекции в растениях Nicotiana benthamiana, но необходим для системного вторжения в другие организмы, такие как перец (Capsicum annum) и шпинат (Spinacia oler(acea) [15]. Участие P19 в супрессии RNAi было впервые продемонстрировано на трансгенных растениях, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein (GFP)), инфицированных картофельным вирусом X (Potato virus X (PVX)), который был использован в качестве вектора для экспрессии P19. Дальнейшие исследования показали решающую роль TBSV P19 в защите вирусной РНК в ходе системной инфекции в растениях N. benthamiana . Более того, биологическая активность белка зависела от его количества, т.е. успешная инфекция, сила симптомов, а также стабильность вирусной РНК требуют достаточно высокого уровня экспрессии P19. Вероятно наиболее весомым объяснением функции того или иного белка является определение его структуры. Исследования, проведенные двумя независимыми научными группами, полученные методом рентгеновской кристаллографии, указали на существование комплекса между димерами P19 и двухцепочечными молекулами siRNA . Данные структурные исследования выдвинули первое объяснение возможного молекулярного механизма работы вирусного супрессора в процессе блокирования RNAi. Более того, прямое физическое взаимодействие между P19 и вирусными siRNAs было также обнаружено in planta, т.е. в инфицированных растениях. Эти исследования выявили существование корреляции между способностью P19 эффективно связывать siRNA и амплитудой симптомов вирусного заболевания в некоторых растениях [11]. Таким образом, функция P19 в качестве вирусного супрессора состоит в том, что в ходе инфекции белок P19 связывает обильно циркулирующие вирусные siRNA, делая их недоступными для программирования RISC, активность которого направлена на разрушение вирусной РНК. В результате этого происходит аккумуля ция вирусных молекул РНК в инфицированном организме. Доказательством в поддержку данной модели служит тот факт, что инфекция N. benthamiana с дефектными по P19 мутантами TBSV ассоциирована с присутствием в растениях RISC комплекса, который содержит вирусные siRNA и имеет специфичную рибонуклеазную активность [14]. Также было показано,что P19 препятствует процессу защитного метилирования miRNAs. Таким образом, есть основание предполагать, что способность P19 связывать siRNA может препятствовать работе фермента HEN1, ответственного за метилирование siRNA (это было показано для некоторых других вирусных супрессоров). Получены мутанты вируса TBSV с репортерным геном GFP, отсутствующей транслируемой последовательностью гена CP, с частично и полностью инактивированным геном P19. Установлено, что вирусный белок-супрессор нуклеазной активности P19 способствует поддержанию синтеза и накопления вирусных белков в организме растения. Полная инактивация гена Р19 приводит к полной деградации вирусной РНК и невозможности синтеза вирусных белков, что наблюдается при заражении растений мутантом RMJ-3 с полностью инактивированным геном Р19. Белок Р19 играет решающую роль в инфицировании модельных растений Nicotiana benthamiana L. и Capsicum annuum L. При инфицировании растений через почву диким типом вируса TBSV происходит заражение проростков только через 14 дней после посева семян. Пауза является следствием функционирования дополнительного защитного механизма растения. Подтверждено предположение о роли капсидного белка в распространении системной инфекции в растениях. P19 белка вируса кустистой карликовости томатов является мощным супрессоров РНК глушителей и, в зависимости от вида хозяина, необходимы для коротких и длинных расстояниях движение вируса и симптомов производства. P19 взаимодействует с белками растений ALY и relocalizes некоторых из этих белков из ядра в цитоплазму. Здесь мы показали, что косупрессия по агроинфильтрации в Nicotiana benthamiana из P19 и подмножество ALY белки, которые не relocalized от ядра мешал способность P19 для подавления РНК глушителей. Мы показали, что это вмешательство коррелирует с перемещением P19 из цитоплазмы в ядро, а также построения и анализа химерных ALY гены, мы показали, что С-концевой части центральной, РНК признание мотив ALY отвечает за взаимодействие с P19 , перелокализация или nonrelocalization от Али, и торможение глушителей подавления P19. Мы изучали взаимодействие ALY и P19 с использованием техники бимолекулярных флуоресценции дополнения, чтобы показать, что эти белки связывают физически в ядре, но не обнаруживаемой в цитоплазме, и мы представляем модель, чтобы объяснить динамику этого взаимодействия [15]. (TBSV) P19 является одним из классов растительных и животных белков вируса, которые известны вмешиваться в механизм защиты организма, называют РНК silencing, что цели иностранной (вирус и ретротранспозона) РНК в последовательности определенным образом на деградацию. РНК silencing вызвано двухцепочечной РНК (дцРНК), которые могут быть сформированы во время репликации вируса или вторичную структуру вирусной одноцепочечной РНК [11]. В растениях, дцРНК расщепляется (один или более) Dicer типа (DCL) белки, которые обладают область РНКазы III для получения коротких (21 - до 25нуклеотид) дцРНК молекул, известных как малых интерферирующих РНК (siRNAs) . МиРНК дуплекс раскручивается, и одна прядь становится включены в РНК- индуцированного глушителей комплекса (RISC), где он проведет комплекс на базе сопряжения с дополнительными (вирусный) РНК-мишени Впоследствии активностью РНКазы из RISC расщепляет РНК-мишени, что приводит к ее дальнейшей деградации. Деятельность глушителей подавления P19 была изучена довольно подробно и включает в себя прямого связывания миРНК спуск к P19 димер, предотвращая включение миРНК в RISC [15]. Он не знал, как P19 вступает в контакт с siRNAs и будет ли P19 перерабатывается в этом процессе. Однако, чтобы этот механизм был эффективным, P19 должны быть выражены в начале вирусной инфекции и высокого уровня таким образом, чтобы препятствовать процессу РНК глушителей перед бассейном миРНК, которая сама усиливается хост-закодированных РНК-зависимой РНК-полимеразы, становится слишком большой. РНК глушителей распространяется через сосудистую ткань от места инициирования в отдаленных частях растения, а также с поглощением siRNAs на P19 может блокировать распространение системный сигнал глушителя [ 14]. В связи с вирусной инфекцией, P19, как и некоторые другие растения вирус в кодировке супрессоров глушителей, по-видимому, ответственны за различные фенотипы. TBSV вызывает смертельное системное некроза в Nicotiana benthamiana около 2 недель после заражения. Вирус, в котором P19 ген мутировал, чтобы предотвратить его выражению переехал системно в этих растениях, но не вызывает некроз [16]. Другие эксперименты показали, что в то время как вирусная РНК P19 мутант первоначально накопленного дикого типа уровней в системной N.benthamiana листьев, примерно через 7 дней мутант уровня РНК начал падать, и лишь около 1/200 уровня дикого типа TBSV на 14 дней postinoculation. На месте иммуногистохимическог анализа N. benthamiana инфицированных дикого типа и мутантных P19 Cymbidium кольцевой пятнистости вирус , который связан с TBSV, показали, что вирус-мутант переехал в системной листья, но был приурочен к сосудистой ткани и лишь немногие клетки окружающих тканей мезофилла. В шпинате, P19 мутант тиражироваться и распространяться в инокулированных листьев, но не двигался в системный листья, в то время как перец и вигны, P19 мутант был не в состоянии двигаться даже на короткое расстояние в инокулированных листьев [14]. В N. аЬасит , TBSV индуцированных гиперчувствительной реакции и формирование некротических поражений на прививку листьев, которые были заменены большими, распространяясь хлоротичных поражения в присутствии TBSV P19 мутант. Если такое поведение все в результате провала P19 мутанта для подавления РНК глушителей не известно. Хотя в настоящее время модель P19 подавление активности глушителей предполагает, что она функционирует в отрыве от прямого взаимодействия с siRNAs, мы и другие ранее обнаружили, что P19 также взаимодействует с членами семьи ALY растений РНКсвязывающими белками . Животных (мыши, дрозофилы и человека) и дрожжей ALY белки, как известно, участвует в экспорте мРНК из ядра до перевода и включены в комплекс экзона соединения белков, которые знака мРНК во время сплайсинга. Кроме того, животное ALY Также известно, что транскрипционный коактиватор что, возможно, функционирует в качестве наставника для содействия взаимодействию ДНК-связывающие белки . Животные кодировать только один или два ALY белков, в то время как арабидопсис кодирует четыре Элис и есть четыре или более Элис во многих однодольных. Функция завода Элис не известно, хотя в одном исследовании, два из Arabidopsis ALY белки были найдены взаимодействовать в дрожжевые клетки с ДНК-связывающим доменом поли (АДФ-рибоза) полимеразы. Доказательства в растения из фракционирования клеток и зеленого флуоресцентного белка (GFP) пометки предположил, что P19 является цитоплазматический белок , в то время как GFP с метками ALY белков ядерных . Тем не менее, животное ALY белки, как известно, трансфер между ядром и цитоплазмой, и мы предположили, что P19 взаимодействует с ALY в цитоплазме [16]. Кроме того, мы показали, что в результате этого взаимодействия двух из четырех ArabidopsisЭлис и один из двух N. benthamiana Элис были сохранены в цитоплазме в присутствии P19 [17]. 1 Метьюз Р. Вирусы растений.- М.: 1998.-С.405-412. 2 Крылов А.В. Вирусы Дальнего Востока.- М.: 1992.-С.321-327. 3 Омаров Р., Берсимбай Р. Биохимические механизмы супрессии РНК-интерференции висами растений // Биохимия.-2010.-№75 (8).-С.1062 – 1069. 4 Lu R, Folimonov A, Shintaku M, Li WX, Falk BW, et al. Three distinct suppressors of RNA silencing encoded by a 20-kb viral RNA genome // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2004.№10.-Р.15742–15747. 5 Ligang Wu and Joel G. Belasco Let Me Count the Ways:Mechanisms of Gene Regulationby miRNAs and siRNAs // Molecular Cell.-2008.-№29.-Р1-7. 6 Jo´ zsef Burgya´n and Zolta´n Havelda Viral suppressors of RNA silencing // Trends in Plant Science.- 2011.- № 16.(5).-Р.265-272. 7 Li HW, Ding SW. Antiviral silencing in animals //FEBS Lett.-2005.-№;579.-Р.5965–5973. 8 Kajohn Boonrod A single chain antibody against a viral RNA polymerase (TBSV-BS3Statice): Dissertation zur Erlangung des Grades Doktor der Naturwissenschaften am Fachbereich Biologie.- Neustadt an der Weinstrasse, 2003.-8-15р. 9 Scholthof, H. B. Plant Physiol.-2007.- 145№-Р.1110-1117. 10 Rustem Omarov at all. Biological Relevance of a Stable Biochemical Interaction between the Tombusvirus-Encoded P19 and Short Interfering RNAs //Journal of Virology -2006.№80(6).-P. 3000–3008. 11 Ye K, Malinina L, Patel DJ. Recognition of small interfering RNA by a viral suppressor of RNA Silencing // Nature.- 2003.-№426.-874–878. 12 Havelda, Z., C. Hornyik, A. Va´lo´czi, and J. Burgya´n. Defective interfering RNA hinders the activity of a tombusvirus-encoded posttranscriptional gene silencing suppressor // J. Virol.-2005.-№79.-Р.450–457. 13 Wenping Qiu, Herman B. Scholthof Using Vectors Derived from Tomato Bushy Stunt Virus (TBSV) and TBSV Defective Interfering RNAs (DIs) // Current Protocols in Microbiology. - 2007. – U№16I.4.- Р.1-16. 14 Yamamura, Y., and H. B. Scholthof. Pathogen profile Tomato bushy stunt virus: a resilient model system for studying virus-plant interactions // Mol. Plant Pathol. - 2005.-№6. – Р.491–502. 15 Shantanu Kumar at al. Tomato bushy stunt virus (TBSV), a versatile platform for polyvalent display of antigenic epitopes and vaccine design // Virology.- 2009.-№388.-Р.185–190. 16 Rustem Omarov at al., Biological Relevance of a Stable Biochemical Interaction between the Tombusvirus-Encoded P19 and Short Interfering RNAs // Journal of Virology.-2006.№80(6).-Р.3000-3008 17 Mukiyanova G.S. et. all Novel and rapid protocol of viral purification/ Материалы второй международной конференции Астана Биотех 2011.- Астана.-2011.- С. 56
