Document 2351963

ГНУ Научно-исследовательский институт пушного звероводства и
кролиководства имени В.А. Афанасьева, РАСХН
На правах рукописи
САМОЙЛОВ АРТЕМ ВЛАДИМИРОВИЧ
Разработка и совершенствование методов
трансфекции экзогенной ДНК в
эмбриональные клетки кур
03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Диссертация на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Научный руководитель:
доктор биологических наук
Сураева Н.М.
Московская область, п. Родники - 2010
2
СОДЕРЖАНИЕ
Введение……………………………………………………………………
5
1. Обзор литературы………………………………………………………
10
1.1. Продуценты белков фармацевтического назначения………………
10
1.2. Генные конструкции………………………………………………….
13
1.3. Трансгенная птица……………………………………………………
18
1.3.1. Получение трансгенных кур с помощью первичных
эмбринальных клеток……………………………………………………..
19
1.3.2. Получение трансгенных кур с помощью долгосрочных линий
эмбриональных клеток……………………………………………………
21
1.3.3. Трансфекция с помощью сперматозоидов как переносчиков чужеродной ДНК……………………………………………………...…...
23
1.4. Методы определениея интеграции и экспрессии
чужеродной ДНК………………………………………………………….
2. Материалы и методы…………………………………………………...
26
29
2.1. Биологический материал……………………………………………..
29
2.1.1. Содержание экспериментальной птицы…………………………..
29
2.1.2. Получение спермы и проведение искусственного осеменения….
29
2.1.3. Плазмиды, использованные в работе……………………………...
31
2.2. Проведение трансфекции сперматозоидов………………………….
32
2.3. Определение интеграции чужеродной ДНК………………………..
33
2.3.1. Выделение ДНК из тканей эмбрионов…………………………….
33
2.3.2. Выделение ДНК из цельной крови………………………………...
33
2.3.3. Определение интеграции методом ПЦР…………………………..
33
2.4. Методы определения экспрессии встроенного гена………………..
34
2.5. Культивирование зародышевых клеток……………………………..
35
2.5.1. Приготовление STO клеток………………………………………...
35
2.5.2. Приготовление эмбрионального экстракта……………………….
36
2.5.3. Выделение и культивирование гонадных примордиальных и
бластодермальных зародышевых клеток………………………………...
2.6. Гистохимическое и иммуногистохимическое окрашивание эмбри-
37
3
ональных клеток……………………………………………………….
39
2.7. Трансфекция первичных примордиальныхклеток и инъекция их в
зародышевый серп………………………………………………………...
2.7.1. Стерилизация реципиентов………………………………………...
41
41
2.7.2. Проведение трансфекции первичных гонадных клеток с
помощью липофекции…………………………………………………….
41
2.7.3. Инъекция трансфецированных гонадных клеток………………...
42
3. Результаты исследований………………………………………………
43
3.1. Разработка и совершенствование методов получения трансгеной
птицы с использованием первичных половыхи стволовых клеток кур.
43
3.1.1. Получение трансгенных эмбрионов кур с использованием
первичной культуры примордиальных клеток………………………….
43
3.1.2. Разработка метода получения линии первичных половых
клеток………………………………………………………………………
46
3.1.3 Разработка метода получения бластодермальных клеток кур…...
49
3.1.3.1 Культивирование бластодермальных клеток с использованием
мышиного LIF……………………………………………………………..
50
3.1.3.2 Разработка метода культивирования бластодермальных
клеток с эмбриональным экстрактом…………………………………….
52
3.2. Разработка и совершенствование методов получения трансгенной
птицы с использованием сперматозоидов в качестве переносчиков чужеродной ДНК…………………………………………………………..
52
3.2.1. Влияние манипуляционных воздействий и индивидуальных особенностей птицы на эффективность оплодотворения………………
53
3.2.2 Изучение оптимальных режимов подготовки образцов тканей и
условий для проведения ПЦР – анализа…………………………………
56
3.2.3 Получение трансгенной птицы с геном ГКСФ человека методом
опосредованного переноса с помощью сперматозоидов……………….
59
3.2.4 Экспрессия чГКСФ в крови трансгенной птицы………………….
65
3.2.5 Наследование чужеродного гена в поколении F1……………………………
65
4. Обсуждение результатов исследования……………………………….
68
5. Выводы…………………………………………………………………..
79
4
6. Сведения о практическом использовании результатов
исследования……………………………………………………………….
80
7. Рекомендации по использованию научных выводов………………...
81
8. Список использованной литературы…………………………………..
82
Приложения………………………………………………………………...
94
5
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы. В настоящее время биотехнология стремительно занимает передовые рубежи научно-технического прогресса. Этому
способствовало два обстоятельства. С одной стороны, бурное развитие современной молекулярной биологии и генетики, благодаря которым можно
широко использовать потенциал живых организмов. С другой стороны,
большая практическая потребность в новейших технологиях, необходимых
для преодоления все возрастающих потребностей в продовольственных товарах и фармацевтических препаратах. Особенно выдающиеся достижения были сделаны после открытия молекулярной структуры генома человека, а также возникновение в результате этого открытия молекулярной генетики, клеточной и генной инженерии.
В относительно небольшой период учеными были разработаны принципы и методики выделения из генома отдельных генов и их искусственного
синтеза на базе функционирующих генных конструкций. Немного позже были разработаны методы внедрения чужеродных генов в геном организмов.
Впервые подобная технология была продемонстрирована на бактериях Escherichia coli более тридцати лет назад [Cohen G.N., et al., 1973]. С тех пор технология генетической манипуляции организмов достигла поразительного
прогресса и на сегодняшний день воспроизводится на бактериях, грибах,
простейших, растениях и животных.
Введение чужеродных генов животным, с использованием рекомбинантных конструкций, позволяет получить трансгенных особей, у которых
введенные гены могут улучшать породные свойства животных, повышать
устойчивость их организма к различным инфекционным заболеваниям, или
получать животных-продуцентов физиологически активных продуктов, необходимых в медицине, ветеринарии, животноводстве.
Важнейшим приоритетом создания трансгенных организмов остается
получение рекомбинантных белков на их основе. Использование белков в ка-
6
честве лекарственных средств (инсулин, выделенный из поджелудочной железы свиньи) впервые было апробировано в 20-е годы прошлого столетия.
Через 60 лет был получен человеческий инсулин с помощью рекомбинантных бактерий. Этот инсулин оказался качественным и был адоптирован для
всех групп пациентов, страдающих диабетом.
В конце 20-го столетия в мире широко развернулись исследования по
получению трансгенных животных. В 1987 году впервые была продемонстрирована возможность получения рекомбинантных белков с молоком
трансгенных млекопитающих [Peshon, J.J., et al., 1987].
К началу 21-го столетия было получено уже более 100 лекарственных
белков с молоком трансгенных животных. А также получен ряд рекомбинантных протеинов из белка яйца трансгенной птицы [Zhu L., van de Lavoir
M.C. et al., 2005].
Онкология остро нуждается в гематопоэтических факторах роста, таких, как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, эритропоэтин и
тому подобных, так как доказана эффективность использования гранулоцетарного колония стимулирующего фактора (ГКСФ) человека против различных форм лейкопении, вызванной химио- и радиотерапией при лечении онкологических заболеваний. ГКСФ восстанавливает иммунную систему и
обеспечивает возможность применения боле высоких доз препаратов при
химиотерапии, что повышает эффективность лечения онкологических заболеваний. Технологии получения рекомбинантных белков открывают новый
более эффективный путь производства белковых фармацевтических препаратов.
Целью исследований являлась разработка и усовершенствование биотехнологических методов генетической трансформации эмбриональных клеток кур.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
7
Усовершенствовать методы получения трансгенной химерной птицы
1.
при использовании первичных эмбриональных половых клеток.
Получить долгосрочные культуры эмбриональных примордиальных
2.
(ППК) и бластодермальных (ЭСК) клеток кур.
Усовершенствовать методы трансфекции геном гранулоцитарного ко-
3.
лониестимулирующего фактора (ГКСФ) человека сперматозоидов петуха с
помощью липосом.
Получить трансгенных кур с встроенным геном ГКСФ человека с ис-
4.
пользованием сперматозоидов петуха в качестве переносчиков чужеродной
ДНК.
5.
Изучить характер экспрессии и наследования целевого гена у транс-
генной птицы.
Научная новизна работы. Впервые в нашей стране получены трансгенные куры с геном ГКСФ человека, и продемонстрирована экспрессия этого
гена. Определены оптимальные режимы трансфекции гена ГКСФ человека в
сперматозоиды петуха (количественный состав сперматозоидов, режимы обработки семени, подбор производителей). Продемонстрировано наследование введенного гена у потомков.
Показана возможность успешного культивирования первичных половых
клеток (ППК) из гонад ранних эмбрионов птицы на митотически неактивном
STO (мышиные эмбриональные фибробласты) монослое и разработан протокол длительного культивирования ППК, с целью их дальнейшего использования для трансфекции.
Впервые разработан метод получения трансгенных химерных эмбрионов
птицы в результате трансплантации трансфецированных первичных ППК гонад в зародышевый диск реципиента, предварительно стерилизованного ультрафиолетовым облучением.
Практическая значимость работы. Результаты исследований, полученные при изучении оптимальных приемов культивирования in vitro эмбри-
8
ональных клеток птицы, могут быть использованы при разработке технологии производства рекомбинантных белков.
Разработано наставление «Способ получения генетически модифицированной сельскохозяйственной птицы при использовании сперматозоидов петуха в качестве переносчиков чужеродной ДНК», утвержденное на заседании
секции «Селекция, генетика и биотехнология сельскохозяйственных животных РАСХН», протокол № 5, от 15 октября 2010 г. Предложенный способ
отличается высокой эффективностью, простотой, дешевизной и быстротой
исполнения.
Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены, обсуждены и одобрены на ежегодных отчетных сессиях отдела «Биотехцентр»
ГНУ НИИПЗК им. Афанасьева В.А. (2007 - 2010), а также на VI симпозиуме
«Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний» (Москва, 2009); XVIII Международной конференции «СПИД, рак и
общественное здоровье» (С.-Петербург, 2009); IX Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием «Отечественные
про-тивоопухолевые препараты» (Н.Новгород, 2010); заседании секции «Селекция, генетика и биотехнология сельскохозяйственных животных РАСХН»
(Дубровицы, 2010).
Личный вклад соискателя. Автор принимал непосредственное участие
во всех этапах работы, в т.ч. приготовление микроинструментов для выделения и работы с первичными половыми и бластодермальными клетками птицы (изготовление стеклянных пипеток для инъекции трансфецированных
клеток в эмбрион), приготовление питательных сред и рабочих растворов;
выделение клеток из эмбрионов птицы, их культивирование, окрашивание и
криоконсервация; получение семени от петухов, ее оценка, проведение
трансфекции сперматозоидов и искусственного осеменения куриц; выделение ДНК из крови цыплят и тканей эмбрионов, проведение ПЦР диагностики; получение крови от птицы, приготовление сыворотки и проведение ИФА;
9
анализ и обобщение полученных результатов исследований, написание статей, отчетов и докладов.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в т.ч. 7 – в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 102 страницах
машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов
и методов исследований, результатов исследований, обсуждения полученных
результатов, выводов, сведений о практическом использовании результатов
исследований, рекомендаций по использованию научных выводов, списка
использованной литературы, приложений. Работа иллюстрирована 12 таблицами, 12 рисунками и содержит 8 страниц приложений. Список литературы
включает 107 библиографических источника, в т.ч. 91 на иностранном языке.
1.
Основные положения и результаты, выносимые на защиту.
Использование препарата «Lipofectamin® 2000» для трансфекции пер-
вичных ППК птицы чужеродным геном, с последующим переносом их в зону зародышевого серпа эмбрионов доноров, позволяет получить 25% трансгенных эмбрионов.
2.
Смена среды и сворачивание фидерного монослоя стромальных клеток
являются лимитирующими факторами, влияющими на процесс пролиферации ППК при культивировании in vitro, при этом выявлена способность фидерных клеток линии STO поддерживать долгосрочную культуру ППК.
3.
Максимальная эффективность получения трансгенной птицы с геном
ГКСФ человека от числа рожденных потомков продемонстрирована при использовании
препарата
липосом
«Lipofectamin®
2000»
и
составила
33,3%.Установлена экспрессия гена ГКСФ человека в крови трансгенных
кур. Наследование чужеродного гена наблюдалось от 25 до 50% у цыплят
первого поколения.
10
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. ПРОДУЦЕНТЫ БЕЛКОВ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ
Достижения в области молекулярной биологии и биотехнологии последних лет создали базу для промышленного получения рекомбинантных
белков.
После получения в 1982 году человеческого инсулина при помощи
генномодифицированных бактерий он был адоптирован для всех групп пациентов, страдающих диабетом. Такими же превосходными качествами обладал
и рекомбинантный гормон роста человека. Однако вскоре выяснилось, что
эволюционные способности бактерий синтезировать некоторые белки, ограниченны, особенно если речь идет о сложных белках. При этом белковые нити могут необратимо ассоциировать друг с другом, или неправильно ориентироваться, нарушая активный центр молекулы, состоящий из нескольких
субъединиц.
В связи с тем обстоятельством, что бактерии не могли удовлетворить
те запросы, которые предъявлялись к биологическим системам синтеза
сложных белков, следующим объектом исследования были выбраны дрожжи,
от которых как уже от эукариотических клеток с большим потенциалом к
синтезу белковой массы предполагалось решение обсуждаемых проблем.
Однако синтетические возможности дрожжей также были ограничены. Получение рекомбинантных белков с использованием генетически модифицированных микроорганизмов не обеспечивает посттрансляционных модификаций, таких как гликолизирование, фолдинг белка, что приводит к снижению стабильности и физиологической активности получаемого белка.
Известно, что культуры клеток человека и животных обеспечивают
экспрессию и посттрансляционные модификации представляющих практический интерес эукариотических белков. Однако, получаемые новые белки в
линиях генно-инженерных клеток млекопитающих хотя и могут быть пра-
11
вильно модифицированы, с активностью, сравнимой с нативными протеинами, но выход белка из культуральных клеток низкий. К тому же создание
клеточных культур является сложной и дорогой процедурой. Промышленные
реакторы, в которых выращиваются клетки (при этом требуется высококвалифицированный персонал и ценное оборудование), также являются дорогими, как в отношении их стоимости, так и в отношении их обслуживания.
Строительство завода с биореакторами оценивается в десятки миллионов
долларов США.
Растения также имеют ряд преимуществ как объект трансгенеза. Растения дают большое количество биомассы, их культивирование относительно
дешевое, поэтому растения стали перспективным объектом в качестве продуцентов рекомбинантных белков. Кроме того, процессинг и укладка чужеродных белков в клетках растений аналогичны таковым в животных клетках,
в то время как в бактериях аналогичные процессы или происходят не в полном объеме, или невозможны. Однако и в этом случае имеют место серьезные ограничения, связанные с неправильным гликозированием и проблемами
с очисткой из-за присутствия в растениях неблагоприятных для человека
протеаз и полифенольных примесей [Ma S.Jevnikar A.M., 2003].
Основа стратегии использования трансгенных животных как биореакторов состоит во включении в клетки организма генов, которые вызывают у них
синтез новых белков, как правило, фармакологического или технологического направления.
Трансгенные животные, как продуценты рекомбинантных белков,
имеют ряд преимуществ перед микроорганизмами, клеточными системами и
растениями. Путем сочетания структурных генов со специфическими регуляторными элементами можно добиться экспрессии трансгенов в определенных тканях органа. Такие биологические системы как молочная железа [Прокофьев М.И. и др., 2003; Houdebine L.M., 2002;], белок яйца птицы [Zhu L., et
al., 2005], семенная плазма [Dyck M.K., et al., 2003], жировые железы [Royer
12
C., et al., 2005], кровь и лимфа личинок насекомых [Markaki M., et al., 2007] и
другие потенциально могут быть использованы для синтеза фармацевтических белков.
Наибольший прогресс в производстве трансгенных продуцентов был
достигнут при получении тканеспецифичной интеграции экзогенных генов в
эпителиальные клетки молочной железы и производстве белков с молоком
[Прокофьев М.И., и др., 1994].
Однако сложность и трудоемкость получения трансгенных животных,
продуцирующих лекарственные белки с молоком, и длительные сроки создания производственного стада побудили ученых искать другие источники получения продуктов лекарственных белков. К тому же, молочные железы животных не способны в большинстве случаев проводить правильное гликозилирование экзогенных белков.
Альтернативой технологии получения лекарственных белков через молочную железу с молоком животных, является яйцевод кур для производства
экзогенных белков в белке яйца. Куры являются более привлекательными по
целому ряду причин [Ivarie R., 2003]. Современные куриные кроссы производят более 300 яиц в год на крупных птицеводческих фермах с автоматическим кормлением, поением и сбором яиц. Белок яйца имеет естественную
стерильную среду, которая обеспечивает длительное хранение, содержит высокую концентрацию белка и протеазные ингибиторы, обеспечивающие идеальные условия для стабилизации биологической активности чужеродных
белков. Белок куриного яйца содержит только 7 протеинов, что значительно
упрощает очистку целевых экзогенных белков. Мойка яиц, разрушение скорлупы и отделение белка от желтка полностью автоматизированы. Несколько
компаний разработали методы очистки рекомбинантных белков, содержащиеся в очень малых количествах в белке яйца с высоким их выходом и упрощенными методами в процессе переработки продукта. Более 300 миллионов
вакцин после ослабления патогенности вирусов производятся в оплодотво-
13
ренных яйцах и применяются для человека. Таким образом, технология работы с яйцом разработана для промышленного производства [Peltola H. et al.,
1994]. И, наконец, время получения новой генерации кур от оплодотворения
яйца до начала яйцекладки около 7 месяцев. Для сравнения этот период 18-20
месяцев у овец и коз и 33 месяца у коров. Таким образом, продуктивная способность кур является чрезвычайно высокой за счет короткой генерации кур
и применения искусственного осеменения (одним эякулятом петуха можно
осеменить 10-20 куриц).
1.2. ГЕННЫЕ КОНСТРУКЦИИ
Первые опыты по внедрению изолированных генов в генотип эмбриона
были осуществлены в 1980г. и показали возможность получения трансгенных особей [Gordon J.W., et. al., 1980]. Последующие же эксперименты продемонстрировали нестабильность экспрессии чужеродных белков трансгенными животными. При этом экспрессия этих же белков в культурах трансфецированных клеток была на высоком уровне.
Спустя десятилетие была открыта последовательность генных регуляторов, локализованных вдали от целевых генов и существенным образом влияющих на экспрессию белка в клетках организма трансгенных животных.
Проведение многочисленных предварительных экспериментов как in vitro в
культуре клеток, так и in vivo на трансгенных животных продемонстрировали, что вносимая генная конструкция должна содержать в себе множество
рабочих сигналов координации гена и добавочные клеточно-специфические
структурные элементы.
На механизм генного контроля над экспрессией белка, очевидно, оказывают воздействие различные аспекты, такие как транскрипция, трансляция и
стабильность матричной РНК. На сегодняшний день изучение этих механизмов привело к формированию концепций создания векторов для проведения
трансгенеза.
14
При проектировании генной конструкции генные инженеры учитывают,
что гены эукариот включают в себя две структурные области: кодирующую,
с которой считывается информация в процессе синтеза мРНК и регуляторную, которая запускает и контролирует работу РНК – полимеразы II, а через
нее и синтез мРНК. Регуляторная область включает три типа последовательностей ДНК: промоторы, связывающие РНК с полимеразой II, энхансеры, регулирующие скорость транскрипции и инсуляторы, отделяющие регуляторные элементы одного гена от промотеров других генов. Эти элементы играют
важнейшую роль в контроле над трансгеном и его экспрессией [Shyu A.B.
and Wilkinson M.F., 2000].
Промотор является основополагающим элементом гена и расположен
выше кодирующей области. Он содержит небольшой участок инициации
транскрипции РНК – полимеразы II с характерным для него устойчивой последовательностью из 12 оснований с чередованием нуклеотидов тимидина и
аденозина (в последовательности ТАЕАА…), называемой
ТАТА - боксом
[Paldi A., et al., 1993].
На сегодняшний день изучены и подобраны промоторы для экспрессии
генов в клетках эукариот. Так, например, известный металтианиновый (МТ)
промотор активен в разнообразных клетках организма [Palmiter R.D., et al.,
1991]. EF1α промотор активен во всех клетках и осуществляет контроль над
транскрипцией. [Jefferies H.B. and Thomas G., 1994]. Интересно, что человеческий EF1α промотор продемонстрировал активность в мышечных клетках
трансгенных кроликов [Taboit-Dameron F., et al., 1999]. CMV – давно использующийся промотор, также очень активный во многих клетках как в культуре
и в тканях трансгенных животных [Zhan Y., et al., 2000].
В экспериментах по получению трансгенных куриц в составе вносимой
генной конструкции
использовался целый ряд промоторов. Так высокая
концентрация человеческого интерферона, до 200 мкг в белке на куриное
яйцо была достигнута при встраивании в плазмиду CMV промотора [Simon
15
G. et al., 2005]. И при использовании того же промотора была отмечена экспрессия зеленого флуоресцирующего белка (GFP) в эмбриональных клетках
и тканях эмбрионов кур [Naito M., et al., 2000]. Также экспрессия в тканях
трансгенных кур на протяжении нескольких поколений была продемонстрирована при использовании β-актинового промотора [Ebara F. and Fujihara N.,
1999] и наработка человеческих моноклональных антител в белке куриного
яйца под контролем овальбуминового промотора [Zhu L., et al., 2005]. Таким
образом, выбор промотора для получения трансгенных химерных кур зависит от места встраивания в ДНК хозяина и конструкции целевого гена.
Под энхансерами сначала понимали последовательности ДНК, усиливающие экспрессию связанного с ним гена. Сейчас к энхансерам относят любой дискретный элемент последовательности ДНК, который связывает транскрипционный фактор и действует (положительно или отрицательно) на
транскрипцию. Энхансеры, таким образом, взаимодействуют с регуляторными белками (полимераза II), изменяя уровни транскрипции гена и оказывая
опосредованное влияние на промотор [Arnosti D.N., et al., 1996, 2003, 2003].
Инсуляторы — области в несколько сот оснований, которые обладают
способностью блокировать сигналы, исходящие от окружения. Эта функция
инсуляторов включает две активности. Во-первых, они блокируют взаимодействие между энхансером и промотором, если находится между ними. При
этом инсулятор выполняет только разделительную функцию и не влияет на
активность энхансера и промотора. Во-вторых, инсулятор выполняет барьерную функцию для распространяющегося конденсированного хроматина. Показано, что существуют инсуляторы, как выполняющие одну из двух функций, так и обе.
Тот факт, что инсуляторы могут влиять на энхансер-промоторные взаимодействия может быть рассмотрен в контексте роли этих последовательностей в модулировании функций энхансера. Энхансеры не обладают специфичностью действия, следовательно, инсуляторы обеспечивают невозмож-
16
ность активации генов в ненужном месте или в ненужное время развития энхансерами соседнего гена [West A.G., et al., 2002].
Кроме структурного гена, в конструкции присутствует маркерный ген.
Одним из самых распространенных классов маркерных генов для генной
трансформации являются маркеры комплементирующие фенотипические мутантные аллели.
Такими маркерами например является β-галактозидаза. экспрессию гена LacZ E.coli, кодирующего фермент β-галактозидазу можно обнаружить
гистохимически [LisJ.T., et al., 1983]. Для этого его снабжают необходимым
промотором и впоследствии активность β-галактозидазы можно обнаружить
по цветной реакции гидролиза o-nitrophenil-β-D-galactopyranoside [Miller K.,
et al., 1972].
Green fluorescent protein, зеленый флуоресцирующий белок был выделен из медузы Aequorea Victoria. Медуза Aequorea Victoria излучает яркий
зеленый свет краями своего зонтика. Этот свет является продуктом взаимодействия двух протеинов акворина, состоящего из ипоакварина (Са 2+ связующего участка), органического субстрата (колиентиразина) и молекулярного
кислорода и зеленого флуоресцирующего белка, состоящего из модифицированного гексапептида в качестве хромофора.
Этот маркерный ген произвел революцию среди генов – прижизненных
маркеров трансгенеза. Основной особенностью белкового продукта этого гена является способность испускать свечение длиной волны в 507 нм при его
освещении светом с длиной волны в 27кДа [Prasher D.C., et al., 1982, 1992].
Известно, что этот белок практически не токсичен для организма хозяина и
может использоваться в качестве прижизненного маркера.
Для более успешной интеграции чужеродных генов геном реципиента в
структуру генных конструкций были введены вирусные частицы.
Методика применения ретровирусных векторов в качестве переносчиков чужеродной ДНК в геном животных и домашней птицы основывается на
17
естественной способности вирусов внедрять ДНК в клетки животных. На сегодня существует ряд ретровирусных систем способных успешно интегрировать ген в ДНК клетки.
Значительных успехов, судя по публикациям, в этой области были достигнуты при микроинъекции в субзародешевую полость ретровирусного
вектора, содержащего ген бактериальной lacZ, с целью трансфекции бластодермальных клеток in vivo [Mozdziak P.E., et al., 2003]. После инкубации были получены трансгенные особи, большая часть которых содержали ген lacZ
в сперме. Поколение G2 трансгенной птицы давало расщепление по гену около 50%, что согласуется с уровнем наследственности по Менделю.
Позднее была опубликована статья, в которой описывается подобная
работа по получению трансгенной птицы с геном зеленого флюоресцирующего белка (GFP) посредством микроинъекции ретровируса в субзародешевую полость [Bon C.K., et al., 2006]. Полученные результаты подтверждают
ранее проведенные опыты.
Несмотря на всю привлекательность и удобство применения ретровирусов в трансгенезе домашней птицы, этот метод имеет и ряд недостатков.
Его применение ограничивает размер структурного гена более в 8 тысяч нуклеотидных пар, в некоторых случаях интеграция в исходный сайт не стабильна, а также сопровождается низкой экспрессией рекомбинантного белка
и не исключена опасность рекомбинации ретровируса в онкогены в организме птиц.
Ретровирусы являются РНК-содержащими вирусами, которая может
инфицировать млекопитающих, вызывая несколько заболеваний (подобно
герпесу, разным формам рака и вызывать иммунодефицитные синдромы).
Эти недостатки могут стать решающими в случае коммерческого производства рекомбинантных белков данным методом [Clark J. et al., 2000].
18
1.3.ТРАНСГЕННАЯ ПТИЦА
Получение рекомбинантных протеинов из белка яйца трансгенной птицы, стало возможным благодаря развитию новых методов введения чужеродных генов в половые клетки этих животных. Белок яйца содержит около 4 г
белка, половина которого представлена одним белком – овальбумином. Следовательно, с помощью овальбуминового промотора можно было бы получить до грамма рекомбинантного белка с 25% чистотой в стерильном естественным образом белке яйца. В отличие от крупного рогатого скота, овец,
коз и кроликов было показано, что птица и человек в качестве компонентов
своих гликопротеинов используют остатки сиаловой кислоты одинаковой
структуры (NANA).
Однако существуют значительные различия в физиологии воспроизводства кур и млекопитающих. Проблемы извлечения зиготы у птицы и ее
большой размер создают трудности при проведении микроинъекции чужеродных генов, в то время как сразу после снесения яйца эмбрион легко доступен, но уже состоит из примерно 60000 клеток. Первые попытки использовать эмбриональные клетки сразу после откладки яйца, в качестве потенциальных клеток мишеней для внедрения чужеродной ДНК в половую линию птицы увенчались сначала большими надеждами, а затем долей разочарования. К успехам можно отнести разработку технологии создания половых
химер кур при пересадке донорских клеток из неинкубированного яйца [Сураева Н.М., Прокофьев М.И., 2008; Petitte J.N., Clark M.E., et al., 1990.,], затем
из зародышевого серпа, крови и ранних гонад [Yasuda Y., et al., 1992; Tajima
A., et al., 1993]. Однако после трансфекции данных клеток не удавалось получить стабильную передачу трансгена в поколениях. Пожалуй только с использованием репликативно-дефектного ретровирусного вектора в качестве
переносчика экзогенных генов были получены нескольких поколений трансгенной птицы, стабильно передающих экспрессирующий ген бактериальной
19
β-галактозидазы в соответствии с Менделевским распределением [Mozdziak
P.E. et al., 2003], но уровень экспрессии оставался низким. И только недавно
в связи с достижениями в области молекулярной и клеточной биологии, по
созданию более эффективных генных векторов вирусного и невирусного
происхождения, развитию технологии культивирования плюрипотентных
стволовых эмбриональных клеточных линий, использованию сперматозоидов
и половых органов в качестве объектов введения генов, яйцо трансгенных
кур стало рассматриваться как одно из перспективных систем синтеза фармацевтических белков.
Человеческие моноклональные антитела (мАт), полученные из яйца
трансгенных кур, по своим физиологическим характеристикам не уступали
аналогичным, полученным с помощью таких традиционных систем, как
клетки яичника хомячка (CHO) или мышиные миеломные клетки за исключением различий в профилях N-linked олигасахаридов [Zhu L., van de Lavoir
M.C., et al., 2005]. В отличие от трансгенных растений и млекопитающих
мАт, продуцируемые куриной системой, обладали повышенной ADCC, приемлемым полураспадом, несмотря на отсутствие остатка сиаловой кислоты,
правильным гликозилированием, превосходным связыванием, хорошим
уровнем интернализации. К тому же концентрация рекомбинантного белка
также была высокой в пределах 1-3 мг на яйцо, что представлялось уже возможным использования этой технологии для коммерческого получения этого
белка.
1.3.1. ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ КУР С ПОМОЩЬЮ ПЕРВИЧНЫХ
ЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК
ППК кур, выделенные из бластодиска сразу же после откладки яйца
(бластодермальные клетки), зародышевого серпа на стадии 5-7, крови эмбриона на стадии 13-17 и развивающихся гонад на стадии 25-27, могут быть использованы в качестве потенциальных клеток мишеней для внедрения чуже-
20
родной ДНК в половую линию птиц.
Трансфекцию бластодермальных клеток проводили с помощью ретровирусных векторов [Bosselman R.A., et al., 1989; Salter D.W., et al., 1986] или
липофекции [Fraser R.A., et al., 1993]. Бластодермальные клетки по сравнению с ППК, полученными из крови или гонад, технически легче выделить и
трансфецировать, но, с другой стороны, необходимы большие материальные
затраты на содержание реципиентов для отбора половых химер.
ППК, выделенные из зародышевого серпа, также были трансфецированы
репликативно-дефектным ретровирусным вектором. Часть потомков полученных химер содержали чужеродный ген [Han J.Y., et al., 1994].
Исследования, в которых использовали выделенные из крови и трансфецированные ретровирусом куриные ППК или ППК других видов птиц,
продемонстрировали, что эти клетки могли успешно мигрировать к гонадам
реципиента [Simkiss K., et al., 1989; Ono T., et al., 1996].
В другой работе было показано, что у 3% эмбрионов была обнаружена
экзогенная ДНК после инъекции трансфецированных ППК из крови репликативно дефектным ретровирусом [Vick L.E., et al., 1993].
Гонадные клетки, выделенные из 6-ти дневных эмбрионов, были трансфецированы in vitro плазмидой pCMVβ, содержащей ген бактериальной βгалактозидазы под цитомегаловирусным промотором, с помощью электропорации и липофекции [Hong, Y.H., et al., 1998]. Эффективность трансфекции с
помощью электропорации с применением ДМСО составила 80%, в то время,
как при липофекции всего 17%. В этой же работе ППК после трансфекции с
помощью электропорации инъецировали в 2,5 дневные эмбрионы (17 стадия
развития эмбриона). Наличие чужеродного гена было зарегистрировано в гонадах 6 и 10 дневных эмбрионов и у вылупившихся цыплят, соответственно,
в 100%, 67% и 41% случаев. Таким образом, электропорация является эффективным средством трансфекции гонадных ППК для получения трансгенных
птиц.
21
Инъекция чужеродной ДНК в зону зародышевого серпа через проделанное отверстие в скорлупе приводит к созданию химерных особей [Eguma
K., et al., 1999]. После проведенных экспериментов интеграция чужеродной
ДНК была продемонстрирована с помощью ПЦР анализа и гистохимического
окрашивания. Хотя интеграция ДНК в эмбрионе показана в 60% случаев, в
гонадные же клетки интеграция составила порядка 8%. Такой разброс данных показал, что в большинстве случаев происходит эписомное встраивание
ДНК [Eguma K., et al., 1999]. И такие химеры не могут передавать по наследству полученный ген. Также к созданию химерных эмбрионов приводит проведение липофекции и электропорации плазмидной ДНК в области зародышевого серпа [Naito M., et al., 2000].
1.3.2 ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ КУР С ПОМОЩЬЮ
ДОЛГОСРОЧНЫХ ЛИНИЙ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК
Первые плюрипотентные эмбриональные клеточные линии были получены из эмбриональных тератокарцином [Martin G.R, Evans M.J., 1975] и
представляли собой смесь недифференцированных и многих типов дифференцированных клеток. Их принято называть клетками эмбриональных карцином (ЭКК) и использовать для изучения раннего эмбрионального развития.
С использованием похожей техники культивирования из эмбрионов были
получены линии эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) мыши [Evans M.G,
Kaufman M.H., 1981], которые после трансплантации в бластоцисту давали
рост, различным типам клеток, включая клетки зародышевого пути. К плюрипотентным стволовым клеткам относят также примордиальные половые
клетки (ППК) зародыша, которые были получены путем культивирования
выделенных из зачатков гонад мыши первичных половых клеток с использованием фидерного слоя и факторов роста [Resnick J.L., et al., 1992]. ППК при
инъекции в бластоцисту давали рост соматическим и половым химерам.
Использование всех перечисленных типов стволовых линий мышей
22
внесло неоценимый вклад в изучение вопросов дифференциации и генной
регуляции при разработке методов культивирования и трансплантации генетически модифицированных стволовых клеток. Получение стволовых клеточных линий кур является привлекательным направлением исследований,
так как птичий эмбрион всегда был удобным объектом для различных манипуляций, а в последнее время стали также очевидными и большие потенциальные возможности использования яйца для продукции фармацевтических
белков.
В течение последних 20 лет были предприняты многочисленные попытки вывести постоянные линии бластодермальных клеток кур. Однако полученные клетки не вполне удовлетворяют определению ЭСК, так как при их
использовании не удается получить половых химер. Тем не менее, в публикациях к таким линиям все же применяется термин ЭСК в связи с тем, что
эти клетки имеют эмбриональное происхождение, способны к неограниченной пролиферации и дифференцировке в производные всех трех зародышевых листков in vivo и in vitro.
Эмбриональные клетки кур представляют огромный интерес в плане
получения генетически модифицированной птицы. Так, с их помощью в 2005
году были получены трансгенные соматические химеры [van de Lavoir M.C.,
et al., 2006].
Однако исследователи столкнулись с трудностями при попытках получения долгосрочных линий эмбриональных стволовых клеток, т.к. не удавалось провести несколько пассажей клеток из-за их дифференцировки [Pain
B., 1999]. Очевидно, что трансфекция будет более результативной, если эмбриональные донорские клетки будут трансфецированы in vitro и отобраны
клоны с хромосомным встраиванием чужеродного гена. Эта задача может
быть выполнена в случае разработки метода долгосрочного культивирования
ППК и бластодермальных клеток.
Были изучены различные факторы, влияющие на свойства клеток при
23
их длительном культивировании. При использовании в качестве фидерного
слоя клеток STO, а в качестве добавки в среду культивирования кондиционной среды BRL (клетки печени крысы) удалось поддержать клеточную линию без проведения трансфекции на протяжении 20 пассажей [Petitte J.N.,
2004]. Учитывая эти факторы, была проведена трансфекция клеток и получены химеры, продуцирующие моноклональные антитела [van de Lavoir M.C.,
2005]. Однако в дальнейшем многие исследователи пытались повторить опыты, но после двух пассажей клетки начинали дифференцировать в фибробласты или погибали. В качестве альтернативы BRL был предложен эмбриональный экстракт. Экстракт получали путем гомогенизации с последующим
центрифугировании на больших скоростях семисуточных эмбрионов кур.
Добавление экстракта к культуральной среде позволяло успешно инкубировать трансфецированные бластодермальные клетки и пересаживать их реципиентам [Wang Y., 2006].
Но, тем не менее, вопрос о долгосрочном культивировании бластодермальных клеток, ввиду неоднозначности опубликованных данных и возникающих трудностей во время культивирования, остается довольно открытым и требующим дополнительных наработок.
К плюрипотентным стволовым клеткам относят примордиальные половые клетки (ППК), которые наряду с ЭСК используют для получения химер [Han J.Y., 2002]. Для работы с этими клетками были предложены различные виды фидерных клеток [Tang, 2007], изучалось влияние ростовых факторов на свойство ППК пролиферировать [van de Lavoir M.C., Diamond J.H.,
2006], а также в опытах учитывались способы получения ППК.
1.3.3. ТРАНСФЕКЦИЯ С ПОМОЩЬЮ СПЕРМАТОЗОИДОВ КАК
ПЕРЕНОСЧИКОВ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК
Трансгенез с использованием сперматозоидов также, как и инфекция
вирусными плазмидами не требует больших финансовых затрат, однако
24
предполагает использование невирусных конструкций генов. Поэтому разработка технологии введения чужеродного гена путем переноса со спермой открывает широкие возможности по использованию яйца кур для продукции
фармацевтических белков.
Способность сперматозоидов связывать чужеродную ДНК впервые была показана в работе B.G. Brackett et al. (1971). В 1989 году Lavitrano с сотрудниками сообщили о получении трансгенных мышей при использовании
сперматозоидов в качестве вектора для переноса чужеродной ДНК в яйцеклетку, при ее оплодотворении [Lavitrano M., et al., 1989].
Оказалось, что ДНК связывается со сперматозоидами не случайно. У
большинства видов животных преимущественное место связывания ДНК локализовано в пост-акросомальной области головки сперматозоида [Lavitrano
M., et al., 1997]. Было идентифицировано три больших класса протеинов, связывающих ДНК, как потенциальных субстратов для взаимодействия ДНК с
головкой сперматозоида. После связывания ядерная интернализация ДНК
осуществляется в пределах минут, и посредником этого процесса являются
молекулы СD4, присутствующие на мембране сперматозоидов. Комплекс
ДНК - CD4 покидает поверхность головки сперматозоида и интегрирует в
ядро через его поры, достигает ядерного матрикса, где ДНК отделяется от
комплекса СD4. Таким образом, взаимодействие сперматозоида и ДНК представляет
собой
процесс,
регулируемый
специфическими
факторами
[Gandolfi, 2000].
В последнее время успешный перенос экзогенного гена с помощью
сперматозоидов был показан на нескольких видах животных, включая рыб
[Khoo Y.W., 2000], птиц [Nakanishi A. and Iritani A., 1993], млекопитающих
[Lavitrano M., et al., 1997], земноводных [Jonak J., 2000]. Однако работ, показавших при этом наличие экспрессии чужеродного гена, очень мало. Более
того, если ДНК не интернализирована в ядро сперматозоида, а только перенесена сперматозоидом в цитоплазму яйцеклетки, копии ДНК плазмиды мо-
25
гут быть обнаружены на ранних стадиях развития эмбриона, но не выявляются у взрослых животных.
В настоящее время возможность использования сперматозоидов в качестве вектора для введения чужеродной ДНК в ооцит, с целью получения
трансгенных животных является одновременно наиболее привлекательной и
неоднозначной. Так в начале воспроизводимость результатов Lavitrano (1989)
была поставлена под вопрос, а затем появились публикации, в которых были
показаны как положительные, так и отрицательные результаты использования данного метода [Maione B., et al., 1998].
Для увеличения эффективности переноса гена с помощью сперматозоидов предложено несколько подходов. В лаборатории Sirard (США) [Gagne
M., et al., 1995; Rieth A., et al., 2000] было показано, что в результате применения электропорации сперматозоидов осуществлялся перенос гена сперматозоидами, но не было получено точных доказательств об интеграции чужеродного гена в геном полученных эмбрионов.
При использовании моноклональных антител для связывания генной
конструкции со сперматозоидами перед хирургическим осеменением свиней
около 20% родившихся поросят оказались трансгенными. При этом была
подтверждена интеграция чужеродного гена в геном полученных животных,
его экспрессия и передача потомкам [Chang K., et al., 2002].
Липосомальные препараты взаимодействует с ДНК, формируя липосомальные ДНК-комплексы, которые могут проникать через плазматическую
мембрану клетки, обеспечивая проникновение ДНК внутрь клетки. При использовании липофеканта в условиях in vitro 51,6% сперматозоидов петуха
содержали экзогенную ДНК [Nakanishi A. and Iritani A., 1993]. В результате
искусственного осеменения кур семенем, трансфецированным с помощью
липосом, экзогенная ДНК выявлялась в бластодерме 67% эмбрионов. Однако
включение чужеродной ДНК в геном вылупившихся цыплят не наблюдалось,
26
хотя у этих цыплят была отмечена эписомальная интеграция чужеродной
ДНК, аналогично данным O.J. Rottmann et al. [1992, 1996].
Было предложено дополнить метод переноса ДНК со сперматозоидами
использованием рестриктаз.
Сперматозоиды крупного рогатого скота были трансфецированы NortI
линеализованной pEGFP и соответствующим рестрикционным ферментом
путем липофекции. С использованием меченой ДНК было показано, что около 80% радиоактивной ДНК было интернализовано сперматозоидами. Кроме
того, было показано, что GFP интегрирует в геномную ДНК сперматозоида в
NortI – чувствительных местах. После оплодотворения сперматозоидами,
трансфецированными плазмидой REMI путем липофекции, GFP экспрессировался примерно у 30% полученных морул. При использовании подготовленной таким образом спермы для искусственного осеменения коров, 3 из 6
коров стали стельными. Родилось 2 живых теленка. В двухмесячном возрасте
у 60% лимфоцитов этих телят выявлялось специфическое зеленое свечение.
Как сообщают авторы, при использовании данной технологии на курах, 90%
(17/19) цыплят экспрессировали GFP, и 80% (25/30) их потомков проявляли
тот же эффект [Shemesh M., et al., 2000].
1.4. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНТЕГРАЦИИ И ЭКСПРЕССИИ
ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК
Методы идентификации встроенных генных конструкций в клетках
животных не базируется на необходимости выделения высокомолекулярной
ДНК, как при создании геномных банков ДНК. Для подтверждения трансгенной вставки достаточно наличия ДНК со средней молекулярной массой
1,65 * 107 кД.
Самым быстрым и недорогим способом определения интеграции чужеродного гена является полимеразная цепная реакция (ПЦР) [Сurrent Protocols,
1987]. В реакции используется пара праймеров, ограничивающих специфиче-
27
ский для трансгена участок ДНК. Положительной стороной метода является
использование небольшого количества биологического материала для анализа, высокая чувствительность и быстрота (1,5-2 часа после выделения ДНК).
К недостаткам этого метода можно отнести тот факт, что он с одинаковой
эффективностью выявляет как интегрировавший трансген, так и эписомную
форму вектора. По этой же причине невозможно определить количество интегрированных копий трансгена. Также реакция очень чувствительна к контаминации использованным вектором и продуктами ПЦР.
Более точным методом определения интеграции трансгена является
классическая гибридизация по Саузерену. В основе метода лежит гибридизация тотальной ДНК объекта с меченым специфическим фрагментом трансгена. Перенесенная в гель тотальная ДНК анализируемого животного переносится на нитроцеллюлозную мембрану или, в случае дот-блотинга, тотальная
ДНК иммобилизируется в виде точек на целлюлозной мембране и затем помещается в раствор, содержащий меченый фрагмент ДНК трансгена. После
отмывки не связавшегося фрагмента, меченая ДНК визуализируется тем или
иным способом. Образцы тотальной ДНК с интеграцией трансгена, после гибридизации содержат метку. Метод гибридизации отличается высокой точностью и выявляет, в основном, только интегрированную форму плазмиды.
Благодаря этому Southern-блот анализ является общепризнанным стандартом
для определения интеграции [Сurrent Protocols, 1987].
Нозерн-блотинг позволяет определять эффективность экспрессии
трансгена по количеству синтезируемой с него мРНК. В этом случае на мембрану переносят фракционированную тотальную мРНК проверяемой ткани
животного и гибридизируется с меченым фрагментом ДНК трансгена, аналогично гибридизации по Саузерену. Одним из положительных качеств Нозерн-гибридизации является возможность определения эффективности экспрессии трансгена в различных особях и тканях, что позволяет отслеживать
специфичность экспрессии трансгена в различных тканях организма и при
28
передаче трансгена по наследству. Однако наличие мРНК в исследуемой
пробе не обязательно указывает на уровень фактически синтезируемого продукта. Для обнаружения у трансгенного организма собственно белкового
продукта используется метод иммуно-ферментного определения белка.
Вестерн-блотинг. Данный метод включает в себя фракционирование
белкового лизата в геле, перенос на мембрану и последующее инкубирование
белкового лизата в геле, перенос на мембрану и последующее инкубирование
с меченными радиоактивно или ферментативно антителами к искомому белку. После визуализации метки можно количественно в сравнении со стандартами оценить количество искомого белка в пробе. К трудностям этого метода
можно отнести долгую и сложную процедуру получения антител к искомому
белку [Young W.S., 1991].
29
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. БИОЛОГИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ
2.1.1. СОДЕРЖАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПТИЦЫ
Работа выполнена в период с 2007-2010гг. в лаборатории трансгенеза
отдела «Биотехцентр» ГНУ НИИПЗК им. В.А. Афанасьева.
В опытах использовали 10 куриц и 3 петухов кросса «Радонеж» и 10
куриц кросса «Птичное».
Птица содержалась на базе вивария «Отдела Биотехцентр» НИИ ПЗК
им Афанасьева В.А. в поселке Горки Ленинские Московской области. Помещение вивария представлено отдельным отапливаемом и вентилируемым
помещением. Птица содержалась в батарейных клетках типа ЛПХ-7. Кормление осуществлялось дважды в день комбикормом для кур-несушек (ЗАО
«Истра Хлебопродукт», Россия, МО), уборка помета проводилась ежедневно,
поение осуществлялось водопроводной водой.
Сбор яиц осуществлялся один раз в день. Перед инкубацией яйца хранились не более 10 дней при температуре 6-100С. Инкубировались яйца в лабораторном инкубаторе ИПХ-10И, производства ОАО «Пятигорсксельмаш»
(Россия, Пятигорск) при температуре 37,5-380С и относительной влажности
60%, от 7 до 21 суток.
2.1.2. ПОЛУЧЕНИЕ СПЕРМЫ И ПРОВЕДЕНИЕ ИСКУССТВЕННОГО
ОСЕМЕНЕНИЯ
Получение спермы от петухов осуществлялось путем массажа поясничной части спины по направлению к хвосту в течение 5-10 с, затем надавливанием большого и указательного пальца на клоаку происходит эрекция
копулятивного органа и семяизвержение. Сперму получали в спермоприемник (маленький стеклянный стаканчик с ровными краями). Оценка качества
спермы и подсчет количества сперматозоидов производилась под микроскопом, при этом учитывалось количества сперматозоидов, их подвижность и
30
жизнеспособность.
Разбавление спермы проводилось разбавителем, предложенным и произведенным на базе Всероссийского научно-исследовательского и технологического института птицеводства. Разбавитель представляет собой раствор,
содержащий уксуснокислый натрий, глюкозу, сахарозу, бикарбонат натрия,
щавелевую кислоту и дистиллированную воду. Разбавление проводилось в
соотношении 1:3.
Подсчет количества сперматозоидов проводили на предварительно
обездвиженной и разбавленной в 100 раз сперме. Этого добивались добавлением к 1000 мкл дистиллированной воды 10 мкл разбавленной спермы. Подсчитывали количество сперматозоидов в камере Горяева. Далее рассчитывали концентрацию сперматозоидов по формуле:
X = n * 225 * 1100 * 100, где Х – концентрация сперматозоидов
(млрд. /мл); n – количество сперматозоидов в одном большом квадрате камеры Горяева; 225 – количество больших квадратов в камере Горяева; 1100 коэффициент; 100 – показатель разбавления спермы. Концентрацию в млрд.
/мл умножали на количество мл спермы после ее разбавления разбавителем.
Осеменение кур производилось с применением шприца с укороченным
катетером, для этого помощник держит курицу левой рукой, а правой надавливает слегка на живот в области между лонными костями и грудной клеткой. При этом клоака птицы слегка выпячивается. Осеменатор левой рукой
слегка растягивает клоаку и надавливает на нее, пока не покажется отверстие
яйцепровода. Правой рукой вводит в яйцепровод катетер на глубину 4-5см и
впрыскивает дозу спермы.
С целью изучения наследования гена ГКСФ человека у потомков первичных трансгенных куриц проводили искусственное осеменение трансгенных куриц спермой не трансгенных петухов.
31
2.1.3. ПЛАЗМИДЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ
В работе использовали конструкцию вектора pIRES EGFP2 (фирмы
Clontech, США), любезно предоставленную нам С.И. Городецким (ИМБ им.
В.А. Энгельгардта РАН). Данный вектор предназначен для экспрессии в эукариотических клетках, который содержит CMV-промотор и эукариотический селективный ген устойчивости к неомицину/канамицину. В полилинкер
вектора pIRES EGFP2 был проклонирован ген ГКСФ человека по сайтам рестрикции BamHI-EcoRI, размер исходной генной конструкции составлял 5308 пар оснований, размер полученной генной конструкции pIRES
EGFP2-ГКСФ составил 6585 пар оснований. Строение плазмиды представлено на рисунке 1.
Рис 1. Строение вектора pIRES2, с содержанием гена
ГКСФ человека.
32
2.2. ПРОВЕДЕНИЕ ТРАНСФЕКЦИИ СПЕРМАТОЗОИДОВ
Плазмидную ДНК pIRES EGFP2-ГКСФ, в количестве 40 мкг растворяли в среде OPTI-MEM (Invitrogen, США) – 250 мкл, добавляли 40 мкл
«Lipofectin®» («Invitrogen», США) и инкубировали 40 минут, при комнатной
температуре. Одновременно готовили смесь рестриктазы SalI с липофектином на среде OPTI-MEM, для этого 150 ед. (4 мкл) рестриктазы смешивали
со 150 мкл среды OPTI-MEM и добавляли 40 мкл «Lipofectine®», смесь также инкубировали 40 минут.
Производили взятие спермы. В опыт отбирали 500 млн сперматозоидов
на одно осеменение. Промывку спермы от семенной жидкости проводили
путем двукратного центрифугирования (220g, 5 мин), отбора супернатанта и
разбавления осевших сперматозоидов разбавителем для спермы в объеме 1
мл. Смешивали растворы ДНК и рестриктазы, добавляли к осевшим сперматозоидам после второго центрифугирования, перемешивали пипетированием
и инкубировали 30 минут при комнатной температуре и осеменяли куриц.
При использовании препарата «Lipofectamin® 2000», («Invitrogen»,
США) для проведения трансфекции сперматозоидов брали 60 мкг плазмидной ДНК pIRES EGFP2-ГКСФ смешивали с 300 мкл среды ОPTI-MEM, одновременно 60 мкл препарата «Lipofectamin® 2000» смешивали также с 300
мкл среды ОPTI-MEM, растворы инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Затем объединяли оба раствора и также инкубировали при комнатной
температуре 20 мин.
Получали сперму и отмывали от семенной жидкости. К сперматозоидам добавляли комплекс ДНК и «Lipofectamin® 2000», перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение часа. Далее осуществляли
искусственное осеменение куриц.
33
2.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНТЕГРАЦИИ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК
На разных стадиях экспериментов биологическим материалом для выделения ДНК служили как ткани эмбрионов птицы, так и цельная кровь, взятая от полученных цыплят.
2.3.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ТКАНЕЙ ЭМБРИОНОВ
Яйца инкубировали в инкубаторе и извлекали эмбрионы. К выделенным эмбрионам добавляли 500 мкл раствора PBS (ООО «НПО ПанЭко», Россия, Москва), гомогенизировали, путем пипетировали и отбирали 100 мкл
гомогенизата для выделения ДНК.
ДНК из гомогенизата выделяли с помощью наборов «Универсальной
пробоподготовки» (ООО «Лаборатория ИзоГен», Россия, Москва). Выделенная ДНК либо сразу использовалась для постановки ПЦР, либо хранилась
при температуре - 20° С.
2.3.2. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ
Кровь для выделения ДНК брали из подкожно-локтевой вены [Рыбакова Г.А., 1960], используя вакуумные пробирки VACUETTE® (Австрия).
ДНК из цельной крови выделяли, используя комплект реагентов для
выделения геномной ДНК из цельной крови (ООО «НПФ Синтол», Россия,
Москва). Выделенная ДНК либо сразу использовалась для постановки ПЦР,
либо хранилась при температуре - 20° С.
2.3.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНТЕГРАЦИИ МЕТОДОМ ПЦР
Для проведения анализа на интеграции чужеродной ДНК использовали
метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Реакция проводилась с применением наборов для постановки ПЦР GenPak® PCR Core (ООО «Лаборатория ИзоГен», Россия, Москва). Набор представляет собой лиофилизованные
34
сухие смеси, готовые для амплификации ДНК. Каждая прбирка с готовой
смесью содержит ингибированную для «горячего старта» Tаg ДНК полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты и хлорид магния с конечными концентрациями, соответственно, 1 u, 200 мкМ и 2,5 mM, а также оптимизированную буферную систему для проведения одной стандартной ПЦР.
Для проведения реакции использовали амплификатор ДНК многоканальный «ТерцикТМ» (НПО «ДНК-Технология», Россия, Протвино).
Праймеры для проведения ПЦР были подобраны, учитывая строение
плазмиды и целевого гена, используемых при проведении экспериментов.
Праймеры подбирались с помощью компьютерной программы Vector NTI,
синтез праймеров осуществлялся фирмой ООО «СибЭнзим-М», (Россия, Новосибирск).
Температура отжига праймеров зависела от вида праймеров, а именно,
от числа G-C и А-Т оснований в олигонуклеотидах и рассчитывалась по
формуле:
Та (С) = [(G +C) * 4 + (A +T)] * 2 – 5
Время шага полимеризации выбирали в соответствии с длиной амплифицируемых фрагментов и активностью Таg полимеразы.
После завершения реакции продукты ПЦР разделяли путем электрофореза в 2 % агарозном (ООО «Компания Хеликон», Москва) геле в ТВЕбуфере (121,1г Трис-HCl, 51,35г борной кислоты, 3,72г ЭДТА в 1л бидистилированной воды) в качестве электрофорезного буфера. При приготовлении
геля в раствор агарозы в ТВЕ-буфере добавляли этидиумбромид (ООО
«Компания Хеликон», Москва) (20мг/мл) до конечной концентрации 0,5
мкг/мл, продукты амплификации визуализировали в ультрафиолетовом свете
с длиной волны 366 нм и фотографировали.
2.4. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ВСТРОЕННОГО ГЕНА
Уровень экспрессии ГКСФ человека у трансгенной птицы исследовался
35
в сыворотке крови. Забор крови для получения сыворотки проводили из подкожно локтевой вены, используя вакуумные пробирки VACUETTE® (Австрия) соответствующего типа. В дальнейшем кровь обрабатывали согласно
наставлению VACUETTE® по получению сыворотки крови.
Образцы сыворотки были проанализированы на содержание ГКСФ с
помощью тест-системы для иммуноферментного анализа «Human – G –
CSF», производства фирмы «Invitrogen» (США)., Kat №KHC2031.
2.5. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ЗАРОДЫШЕВЫХ КЛЕТОК
2.5.1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ STO КЛЕТОК
Клетки STO были любезно предоставлены Институтом биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Клетки находились в 1,5 мл флаконах для
криоконсервации в замороженном виде. Количество клеток во флаконах было неизменно и составляло 250 тыс.
Культивирование STO клеток происходило в среде DMEM + 10% FBS
(эмбриональная телячья сыворотка) (Sigma)+ глютамин + NЕАА 1%+ гентомицин 5% + пируват натрия 1,5% + Цистиамин 1,12%. Культивирование клеток проводили в инкубаторе, обеспечивающим 95%-ную относительную
влажность воздуха, температуру 38ºС и содержание
7% СО2 в воздухе
(Sanyo, Япония).
Клетки оттаивали при температуре 40°С, на водяной бане, далее клетки
соединяли со средой культивирования и переносили во флаконы для культивирования с площадью поверхности культивирования 25 см2.
Пассажирование клеток проводили на 6 - 7 сутки культивирования при
80%-100% плотности монослоя. Культуру клеток промывали 1 мл трипсинЭДТА (НПО «ПанЭко», Москва) и инкубировали с 0,25% раствором трипсин-ЭДТА при 38°С в течение 5 минут, пипетировали, клеточную суспензию
собирали и рассевали по 2 флаконам для культивирования. В каждый флакон
добавляли культуральную среду. Клетки культивировались до 2-3 пассажа.
36
При достижении клетками 80-90% конфлюэнтности для снижения митатической активности, обрабатывали раствором Mitomicin C (Sigma). Для
этого в среду культивирования добавляли Mitomicin C из расчета 10 мкг/мл
клетки инкубировались в СО2 инкубаторе в течение 2 часов. Далее удаляли
среду и промывали клетки трижды раствором PBS без кальция и магния.
Суспензию клеток 2 - 3 флаконов объединяли, центрифугировали при
55g, 5 мин. Супернатант удалили, клетки суспендировали в среде DMEM с
содержанием фетальной сыворотки крови 10% и DMSO 10%. Проводили
подсчет клеток в камере Горяева.
Клетки помещали в соломинки в объеме 150-160 мкл (200 тысяч клеток) инкубировали 10-15 мин при комнатной температуре. Замораживание
производили на программируемом приборе РПЗ (г. Харьков). Программа для
замораживания: с +20оС до -7оС со скоростью 1оС/мин, сиддинг, и далее до36оС со скоростью 0,3оС/мин. с последующим переносом в жидкий азот.
2.5.2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЭМБРИОНАЛЬНОГО ЭКСТРАКТА
Оплодотворенные яйца инкубировали в инкубаторе в течение 7 суток.
Готовили раствор PBS- (Sigma). На лед помещали стаканчик с охлажденным
PBS- и собрали в него извлеченные эмбрионы. Из стаканчика эмбрионы перемещали в другой с охлажденным PBS-, (из расчета один эмбрион на один
мл PBS). Гомогенизировали эмбрионы сначала с помощью 20 мл шприца без
иглы, затем с иглой. Гомогенат переносили в 50 мл коническую пробирку
(Corning). Пробирку с гомогенатом охлаждали в жидком азоте в течении 15
минут. Затем размораживали, помещая пробирку в теплую воду (37°С). Процедуру охлаждения и оттаивания проводили дважды. Центрифугировали при
охлаждении 4°С при 20000g, в течении 30 минут. Отбирали супернатант.
Фильтровали супернатант через акриловый фильтр (Pall corporation),
37
надетый на 20 мл шприц. Фильтрат фасовали по 1.5 мл в пробирки для замораживания (Corning), маркировали и помещали в жидкий азот на хранение.
2.5.3. ВЫДЕЛЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ГОНАДНЫХ
ПРИМОРДИАЛЬНЫХ И БЛАСТОДЕРМАЛЬНЫХ ЗАРОДЫШЕВЫХ
КЛЕТОК ПТИЦ
Примордиальные зародышевые клетки выделяли из гонад шести дневных эмбрионов кур. Для этого изолированные эмбрионы помещали под бинокуляр и в фосфатно-солевом растворе – PBS (ООО «НПО ПанЭко», Россия, Москва) с помощью глазного скальпеля и препаровальной иглы из эмбриона сначала выделяли мезонефрос, на поверхности которого располагаются гонады, а затем от мезонефроса отделяли и сами гонады.
Изолированные гонады помещали в 0,25% раствор трипсина с 0.53 мМ
ЭДТА на солях Хэнкса без Ca2+ и Mg2+ (ООО «НПО ПанЭко», Москва), инкубировали 10 минут при 37°С, затем гонады промывали в растворе РВS несколько раз и суспензировали в культуральной среде.
Бластодермальные клетки выделяли из не инкубированных оплодотворенных яиц кур. Для этого изолировали бластодиск из яйца с помощью кольца из фильтровальной бумаги, который накладывали на желток вокруг бластодиска, затем ножницами вырезали кольцо с прикрепленным к нему бластодиском и стенкой желтка. Бластодиск помещали в раствор PBS и под бинокуляром отделяли от желтка. Диски переносили в пробирку с культуральной средой и суспензировали.
Культивирование гонадных клеток, проводили в 96-ти луночных
планшетах. Использовали следующий состав культуральной среды: Knockout
DMEM (ООО «НПО ПанЭко», Россия, Москва), содержащую 10% FBS (эмбриональная телячья сыворотка) (Sigma), 2% куриной сыворотки, 6 мг/мл
мышиного фактора лейкемии (LIF) (Sigma), 5 мг/мл основного фактора роста
фибробластов, 5 мг/мл фактора стволовых клеток, 0,1 мМ β-меркаптоэтанола,
раствора 1Х раствор незаменимых аминокислот, 1 мМ пирувата и 2 мМ глу-
38
тамина. Смену среды проводили один раз в 5 суток. Для посева использовались различные концентрации гонадных клеток, а именно, 10, 20 и 30 тыс.
клеток на лунку 96-луночного планшета.
Бластодермальные клетки культивировали в 96-ти луночных планшетах с использованием Knockout DMEM с добавлением 10% FBS, 6 мг/мл
мышиного LIF, 0,1 мМ β-меркаптоэтанола, раствора 1Х раствор незаменимых аминокислот, 1 мМ пирувата и 2 мМ глутамина. За сутки до культивирования лунки 96-и луночного планшета желатинизировали 0,1 % раствором
желатина (ООО «Биолот», Россия, С-Петербург) и засевали фидерными клетками (клетки линии STO в концентрации 104 на см2, обработанные митомицином). При пожелтении среды производили частичную ее подмену. При
пассажировании клеточную массу снимали 0,25% раствором трипсина (ООО
«НПО ПанЭко», Россия, Москва).
При культивировании бластодермальных клеток с эмбриональным экстрактом использовали следующий состав среды для культивирования (из
расчета 25 мл готовой среды):
1. DMEM Glucose 4,5 g/l (Gibco) – 19,8 мл;
2. FBS – 3,75 мл;
3. L – glutamine – 0,25 мл;
4.
ß – mercaptoetonol -0,25 мл;
5. Gentamicin – 0,125 мл;
6. Эмбриональный экстракт – 0,625 мл.
Клетки культивировались в 48 луночных планшетах. Предварительно
лунки желатинизировались путем добавления в лунку 0,5 мл 0,1% раствора
желатина, экспозицией в течение 30 мин и его удалением.
Далее в лунку засевались митотически неактивные STO клетки в концентрации 10000 клеток в лунку. Для культивирования STO клеток использовали среду для культивирования на эмбриональном экстракте. Планшет с
39
клетками помещали в СО2 инкубатор на ночь (Т=380С, 7% СО2).
На следующий день оценивали состояние STO клеток, проводили посев
бластодермальных клеток. Объем среды для культивирования составлял 600
мкл.
Проводили ежедневный контроль роста клеток и полную замену среды
для культивирования (среда с экстрактом). При разрастании клеток (около
100% конфлюентности) проводили последовательные пассажирование клеток. Из лунки с клетками отбирали половинный объем среды (300 мкл) в чистую лунку, добавляли 300 мкл новой среды. Отбирали оставшуюся среду с
клеток, промывали раствором PBS- (500 мкл), отбирали его и снова добавляли PBS- (500 мкл). Инкубировали при комнатной температуре 2 мин, наблюдая за клетками под микроскопом, сливали PBS, добавляли смесь старой и
новой сред (600 мкл), аккуратно пикетировали и разносили по 300 мкл в заранее приготовленные лунки с STO. Помещали клетки в СО2 инкубатор, проводили контроль роста и замену среды.
2.6.
ГИСТОХИМИЧЕСКОЕ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ
ОКРАШИВАНИЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК
Для окраски примордиальных клеток на присутствие гликогена использовался набор реагентов для определения в лейкоцитах гликогена (полисахаридов) (НПФ Абрис+», Россия, С-Петербург), в основе методики лежит
PAS (ШИК) – реакция по методу Mc Manus.
Для префиксации на предметном стекле высушенные на воздухе капли
и мазки суспензии культуры гонадных клеток фиксировали в течение 1 мин в
10% растворе формалина на спирту (96° этаноле), промывали 1 мин в проточной воде. Далее препараты помещали в йодную кислоту (1% водный раствор) на 5-7 мин, после чего промывали в дистиллированной воде и высушивали с помощью фильтровальной бумаги. Затем препараты помещали в реактив Шиффа на 15 мин и промывали в проточной воде в течение 5 мин. После
40
высушивания препараты оценивали под световым микроскопом при увеличении ×40. Гликоген окрашивался в ярко-малиновый (фуксиновый) цвет.
Окрашивание бластодермальных клеток на SSEA-1 антиген проводили
в 96 луночных планшетах, где и культивировались бластодермальные клетки.
Аспирировали среду для культивирования клеток, клетки промывали трижды
раствором PBS (Sigma). К клеткам добавляли первичные антитела - SSEA-1
(480): sc-21702 (Santa Cruz biotechnology, inc.) в рабочей концентрации 0,1
мг/мл в объёме 20 мкл. на лунку. Инкубацию с антителами проводили 1 час,
накрыв планшет крышкой при комнатной температуре.
Далее проводили 3х кратную отмывку в объеме 200 мкл буфером для
отмывки (PBS+0.1% желатин+0.02% натрия азид).
В лунки с клетками вносили конъюгированные с флуорохромом вторичные антитела CD15 (Santa Cruz biotechnology, inc.) по 20 мкл. в рабочей
концентрации 0,1 мг/мл. Накрывали крышкой и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Далее промывали трижды буфером для
отмывки.
Детекцию свечения флуорохрома проводили под флуоресцентным
микроскопом, отмечая зеленое свечение.
Бластодермальные клетки на присутствие щелочной фосфатазы окрашивали 96 луночных планшетах. Клетки фиксировали в 10% растворе формалина в абсолютном метаноле при температуре 0-5 °С в течение 30 с. На
клетки наносили инкубационную среду после фильтрования (35 мг αнафтилфосфата, 35 мг прочного синего RR, 35 мл буферного раствора).
Оставляли клетки при комнатной температуре на 8—10 мин. Ополаскивали в проточной воде в течение 10 с. Докрашивали метиловым зеленым в
течение 15 мин или гематоксилином Майера 3—4 мин. Промывали о просматривали под микроскопом.
41
2.7. ТРАНСФЕКЦИЯ ПЕРВИЧНЫХ ПРИМОРДИАЛЬНЫХ КЛЕТОК
И ИНЪЕКЦИЯ ИХ В ЗАРОДЫШЕВЫЙ СЕРП
2.7.1. СТЕРИЛИЗАЦИЯ РЕЦИПИЕНТОВ
В работе использовались оплодотворенные яйца.
Облучение ультрафиолетовым (УФ) светом проводили с помощью системы обработки УФ ламинар-бокса при комнатной температуре.
Облучение яиц УФ проводилось в следующих режимах:
1.
до закладки в инкубатор на протяжении одного часа;
2.
до закладки на протяжении двух часов;
3.
до закладки в течение двух с половиной часов;
4.
через сутки после начала инкубации на протяжении двух часов;
Режимы облучения были выбраны исходя из особенностей развития
ППК и их миграции в теле эмбриона.
2.7.2. ТРАНСФЕКЦИЯ ПЕРВИЧНЫХ ГОНАДНЫХ КЛЕТОК С
ПОМОЩЬЮ ЛИПОФЕКЦИИ
Проводили липофекцию гонадных клеток с помощью препарата
«Lipofectamin 2000» («Invitrogen», США) по следующей схеме:
1.
30 мкл OPTI – MEM + 2 мкл плазмидной ДНК.
2.
30 мкл OPTI – MEM + 6 мкл Lipofectamin.
3.
Инкубация 5 мин при комнатной температуре.
4.
Соединяли 1 и 2, инкубировали 20 минут при комнатной
температу-
ре.
5.
Изолированные гонады помещали в 0,05% раствор трипсина с 0.53 мМ
ЭДТА на солях Хэнкса без Ca2+ и Mg2+ (ООО «НПО ПанЭко», Россия,
Москва), инкубировали 10 минут при 38°С, затем гонады промывали в растворе РВS (ООО «НПО ПанЭко», Россия, Москва) несколько раз.
6.
Трипсинизированные и промытые гонады суспензировали в комплексе
3.
7.
Клетки помещали в СО2 инкубатор, при температуре 38°С, на 24 часа.
42
2.7.3. ИНЪЕКЦИЯ ТРАНСФЕЦИРОВАННЫХ ГОНАДНЫХ КЛЕТОК
Одновременно с выделением гонад и проведением липофекции проводили стерилизацию реципиентов. На следующий день (через 24 часа) инкубированные яйца помещали в боковое положение в инкубаторе на 30 мин,
предварительно пометив верх.
В скорлупе над эмбрионом делали трапециевидное отверстие 10х14 мм.
Для инъекции комплекса гонадных клеток с плазмидным комплексом использовали микропипетки с внешним диаметром 40 мкм. Вводили в зону зародышевого серпа в объеме 3 мкл. Отверстие в мембране закрывали заготовленными кусочками мембраны 5х5 мм, а отверстие в скорлупе выпиленным
кусочком скорлупы, стороны которого заклеивали, горячим парафином.
Яйца инкубировались в инкубаторе в течение 5 – 7 дней, извлекались
выжившие зародыши и подвергались дальнейшему изучению.
Полученный в результате исследований цифровой материал биометрически обработан по стандартным программам вариационной статистики с
определением критерия достоверности Стьюдента [Лакин Г.Ф., 1980].
43
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ
ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННОЙ ПТИЦЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
ПЕРВИЧНЫХ ПОЛОВЫХ И СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КУР
Как известно внедрение чужеродного гена в пронуклеус зиготы методом микроинъекции у птицы крайне затруднен. Ввиду видовой специфичности воспроизводительной системы птиц, а именно из-за необходимости проведения сложного хирургического вмешательства, так как эта процедура
должна, проводится до снесения яйца, потому что к моменту снесения яйца
эмбрион развивается до 50000 – 60000 клеток, и микроинъекция гена становится невозможной. Поэтому в последние годы были изучены методики
трансфекции эмбриональных клеток птицы на стадии зародышевого серпа
(5-7 стадии, 1 сутки инкубации), во время миграции ППК(15-17 стадии, 2.5
суток инкубации) из крови и во время колонизации ППК в первичные гонады (25-27 стадии, 5.5-6 суток инкубации).
3.1.1. ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ ЭМБРИОНОВ КУР С
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПЕРВИЧНОЙ КУЛЬТУРЫ ПРИМОРДИАЛЬНЫХ
КЛЕТОК
В наших исследованиях изучались методы введения генных конструкций путем инъекции трансфецированных первичных половых клеток (примордиальных, ППК) в эмбрионы птиц. ППК кур являются одним из наиболее
удобных объектов для получения трансгенных особей, а также для сохранения генетического материала различных видов птиц. С началом циркуляции
крови (5-10 стадии), ППК мигрируют по кровеносным путям в тело эмбриона. На 5.5-6 сутки инкубации яиц ППК из крови начинают активно мигрировать в презумтивные гонады. В этот период ППК больше по размеру (примерно в полтора раза) окружающих кровяных и соматичеких гонадных клеток, содержат эксцентрично расположенное ядро, фрагментированное ядрышко, большое число липидных капель, гранул гликогена и желтка [Сурае-
44
ва Н.М., Толмазова А.Г., 2004; Fuijmoto T., Ukeshima A. and Kiyofaji R.,
1976]. Благодаря высокому содержанию гликогена в цитоплазме ППК ранних
гонад куриц и индюков у исследователей появилась уникальная возможность
гистохимической идентификации этих клеток с помощью ШИК-реакции
[Meyer, D.B., 1960].
Для более вероятного внедрения трансфецированных клеток в гонады
реципиента необходимо было понизить общий уровень собственных ППК в
эмбрионе реципиента. Для достижения этой цели были предложены различные способы, как-то, применение радиоактивного излучения, рентгеновских
волн, введение бисульфанов, хирургическое удаление предшественников
ППК [Naito M.,et al., 2007; Zhu L., van de Lavoir M.A., et al., 2005].
Для снижения общего числа эндогенных ППК реципиентов нами было
впервые изучено влияние УФ облучения на разных стадиях развития эмбрионов.
УФ облучение опытных яиц проводилось в следующих режимах:
1.
до закладки в инкубатор на протяжении одного часа;
2.
до закладки на протяжении двух часов;
3.
до закладки в течение двух с половиной часов;
4.
через сутки после начала инкубации на протяжении двух часов.
Результаты оценивали исходя из количественной разницы, между
средним количеством ППК в аликвоте суспензии гонадных клеток, выделенных из эмбрионов подвергшихся УФ облучению и контрольной группы (таблица 1).
45
Таблица 1
Влияние экспозиции УФ облучения и стадии развития эмбрионов на
количество ППК
Режим УФ облучения
До закладки в инкубатор на протяжении одного часа
До закладки на
протяжении двух
часов
До закладки в течение двух с половиной часов
Через сутки после
начала инкубации
на протяжении
двух часов
Среднее количество ППК
( в аликвоте)
Количество ППК в
контрольной
группе
(в аликвоте)
Процентное отношение ППК опыт
/ППК контроль
11
10
110,0
14
8
175,0
6,6
9,5
69,5
6,1
8,6
71,0
Нами была выбрана плазмида, содержащая ген ГКСФ человека для исследования возможности получения трансгенных химер при использовании
ППК гонад, выделенных из эмбрионов после 7 дней инкубации. Трансфекцию проводили с применением препарата на основе липосом - «Lipofectamin
2000» («Invitrogen», США). Инъекцию трансфецированных клеток осуществляли в зону зародышевого серпа эмбрионов, как подвергшихся стерилизации
ультрафиолетовым облучением в течение 2,5 часов до закладки яиц на инкубацию, так и в контрольные эмбрионы, не подвергавшимся воздействию УФ.
Инъецированные эмбрионы инкубировали в течение семи суток. Интеграцию гена определяли методом ПЦР анализа тотальной ДНК, выделенной
из гомогената всех тканей эмбрионов (кроме гонад) и отдельно ДНК, выделенной из гонад.
Было проинъецировано 23 эмбриона, после 7 дней инкубации продолжили развитие 14 эмбрионов (таблица 2).
46
Таблица 2
Эффективность трансфекции эмбрионов трансфецированными ППК
Число эмбрионов
Из них развилось
Показатели
Всего
Стерилизованные реципиенты
Нестерилизованные
реципиенты
Итого:
Число эмбрионов с
интеграцией гена
Ткани эмбриона
Гонады
Эффективность
трансфекции из
числа развившихся эмбрионов
[%]
n
%
16
8
50
2
0
25,0
7
6
86
1
1
16,7
23
14
60,9
3
1
21,4
По результатам ПЦР анализа у 3-х эмбрионов в выделенной ДНК из
тканей и гонад был зафиксирован ген человеческого ГКСФ, а у одного эмбриона трансгенная вставка присутствовала и в клетках гонад, при этом этот
эмбрион был получен от реципиента без стерилизации ультрафиолетовым
облучением. Таким образом, обработка УФ эмбрионов реципиентов оказала
положительное влияние на эффективность получения химер, т.к. эффективность трансфекции у стерилизованных реципиентов составила 25%, а у не
подвергшихся воздействию УФ 16,7%.
3.1.2. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПОЛУЧЕНИЯ ЛИНИИ ПЕРВИЧНЫХ
ПОЛОВЫХ КЛЕТОК
Ранее было показано, что ППК, выделенные из гонад 5-5.5 -суточных
эмбрионов кур, при долгосрочном культивировании in vitro обладают свойствами эмбриональных половых (EG) клеток млекопитающих, сохраняют
морфологические и гистохимические (окраска на гликоген) характеристики
первичных клеток. Также эти клетки могут быть использованы для получе-
47
ния химер [Han J.Y., Park T.S., et al., 2002].
Использование стабильных линий примордиальных клеток позволяет
существенно повысить вероятность получения половых трансгенных химер.
Ввиду того, что в процессе культивирования с последующей трансфекцией
можно получить культуру клеток с устойчивой интеграцией чужеродной
ДНК.
Таким образом, открылись широкие перспективы для разработки методики культивирования трансфецированных линий зародышевых клеток кур
для последующей интеграции и экспрессии чужеродных генов [Pettite J.N.
and Poult J., 2002] у трансгенной птицы.
С целью разработки метода долгосрочного культивирования ППК для
получения трансгенных химерных куриц нами были использованы гонадные
клетки 6 - суточных эмбрионов кур, а стромальные клетки гонад были использованы в качестве фидерного слоя (рис. 2).
Рис 2. ППК через 10 суток культивирования на монослое стромальных
клеток
После суток культивирования соматические клетки прикреплялись ко
48
дну лунки, образуя монослой в виде фибробластоподобных клеток, тогда как
ППК сохраняли овальную форму, исходный размер и наличие гранул. Стромальные клетки быстро пролиферировали, образуя монослой в течение 5-6
суток (в зависимости от исходной концентрации посева), тогда как ППК делились значительно медленнее, образуя за этот период колонии в 5-6 клеток,
Через 10-15 суток монослой стромальных клеток уже не умещался на
дне лунки и сворачивался в комок, из которого вновь выползали и пролиферировали ППК и стромальные клетки, однако рост последних был значительно медленнее, и монослой не образовывался даже при культивировании в течение 45 дней. После 5-6 суток культивирования среда культивирования закислялась и проводилась ее частичная смена, при этом рост ППК приостанавливался на 2-3 суток.
Максимальная продолжительность культивирования ППК от индивидуальных эмбрионов птицы составила 2 месяца, при этом ППК сохраняли
свои специфические характеристики, а именно, большой размер, наличие
многочисленных гранул, и позитивное окрашивание на гликоген (рис. 3).
Рис 3. Группа ППК кур, окрашенных на гликоген с использованием
ШИК-реакции
49
С целью повышения выхода ППК и преодоления указанных выше
ограничений, связанных со сворачиванием монослоя стромальных клеток,
были проведены эксперименты по замене фетальной сыворотки телят на куриную сыворотку крови и использование в кА
честве фидерного слоя кле-
ток STO, соответственно.
ППК культивировались с добавление куриной сыворотки и без нее.
Было замечено, что в случае, если в культуральной среде присутствовала куриная сыворотка, большая часть ППК не прикреплялись к монослою стромальных клеток, представляя собой суспензионную культуру, тогда как в отсутствии куриной сыворотки ППК образовывали прикрепленные колонии от
5-8 до 20-30 клеток и больше. Таким образом, добавление в среду культивирования куриной сыворотки крови в 2-3 раза увеличило выход ППК.
Через 2 месяца культивирования стромальные клетки начинали погибать. Для увеличения срока культивирования ППК пассировали на фидерный
монослой линии STO до сворачивания стромального монослоя на 5-7 сутки
культивирования и после сворачивания, когда ППК вновь начинали активно
делиться на оставшихся стромальных клетках. Через 3-6 суток число ППК,
культивируемых на STO монослое, увеличивалось в 3-5 раз, однако при пассаже часть стромальных клеток также переносилось на STO монослой и, поэтому фидерный слой представлял собой смешанную культуру.
3.1.3 РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПОЛУЧЕНИЯ БЛАСТОДЕРМАЛЬНЫХ
КЛЕТОК КУР
Следующим объектом для долгосрочного культивирования были выбраны бластодермальные клетки кур (ЭСК). ЭСК легкодоступны, тотипотентны, однако при культивировании возникает опасность их дифференцировки в фибробластоподобные клетки. Необходимо отметить, что только
единичные группы исследователей за рубежом опубликовали данные о получении долгосрочных культур ЭСК. При этом предложенные ими методы
50
культивирования отличаются друг от друга, что свидетельствует о больших
трудностях в их воспроизведении [Pain B., et al., 1996; Van de Lavoir M.C. and
Mather-Love C., 2006; Wang Y., et al., 2006]. В наших исследованиях были
изучены и оценены различные подходы для культивирования ЭСК.
3.1.3.1 КУЛЬТИВИРОВВАНИЕ БЛАСТОДЕРМАЛЬНЫХ КЛЕТОК С
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЫШИНОГО LIF
ЭСК были получены из бластодисков индивидуальных эмбрионов птицы. При этом нами был использован в качестве ростового фактора мышиный
LIF, который уже использовался для этой культуры в качестве коммерческого препарата или в составе кондиционной среды после культивирования клеток печени крыс [Petitte J.N., et al., 2004]. Были обнаружены значительные
различия в ростовых характеристиках бластодермальных клеток. Часть эмбрионов давали хороший рост клеток (80-100% конфлюэнтности через 5-7
суток), (рис. 4), тогда как у других клетки пролиферировали медленно с
дальнейшим переходом к дифференциации. Обычно из 7-ми эмбрионов 1-2
давали рост стволовым эмбриональным клеткам.
Рис. 4. ЭСК через 6-суток культивирования
Характер роста ЭСК не зависел от наличия в среде куриной сыворотки
51
крови. ЭСК представляли собой маленькие клетки с большим ядром и хорошо различимыми ядрышками, росли колониям в виде однослойного монослоя с четко различимыми границами между клетками. ЭСК экспрессировали
маркеры плюрипотентности – положительная окраска на щелочную фосфатазу (рис. 5) и SSEA-1, (рис. 6).
Рис 5. Выявление активности щелочной фосфатазы в культуре
бластодермальных клеток кур, растущих на фидерном слое из клеток
STO (x 200)
Рис 6. Иммунофлуоресцентная детекция SSEA – 1 антигена в культурах
бластадермальных клеток кур, растущих на фидерном слое из клеток
STO (x 400)
52
Пассажи проводили только в культурах с 80 – 100% конфлюэнтностью,
разводили наполовину с добавлением 50% культуральной среды от предыдущего культивирования с целью сохранения в среде выделенных клетками
ростовых факторов и других неизвестных, но необходимых компонентов.
Однако, после двух пассажей ЭСК начинали дифференцироваться и приобретать вид фибробластов с очень активным ростом или погибали.
3.1.3.2 РАЗРАБОТКА МЕТОДА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
БЛАСТОДЕРМАЛЬНЫХ КЛЕТОК
С ЭМБРИОНАЛЬНЫМ ЭКСТРАКТОМ
Также нами был опробован метод культивирования бластодермальных
клеток с присутствием в культуральной среде эмбрионального экстракта.
Эмбриональный экстракт содержит в себе белки и факторы, способствующих, по мнению ряда авторов, успешному культивированию стволовых клеток.
ЭСК были получены из бластодисков индивидуальных эмбрионов птицы. Морфологические характеристики ЭСК не отличались от клеток, культивируемых с мышиный LIF. ЭСК удалось пассировать два раза. Вновь были
обнаружены значительные индивидуальные различия в ростовых характеристиках бластодермальных клеток из разных бластодисков. Однако в данном
случае рост клеток не зависел от числа клеток и скорее всего был связан с
качеством приготовленного экстракта, т.к. отмечался разный рост клеток при
применении эмбрионального экстракта от разных партий.
3.2 РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ
ТРАНСГЕННОЙ ПТИЦЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СПЕРМАТОЗОИДОВ В
КАЧЕСТВЕ ПЕРЕНОСЧИКОВ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК
Было показано, что сперматозоиды могут быть использованы в качестве природного вектора, доставляющего ДНК в эмбриональные клетки.
Сперматозоиды могут интернализировать экзогенную ДНК, и переносить её
53
в ядро яйцеклетки. Очевидным преимуществом является легкодоступность
материала, отсутствие необходимости применения дорогостоящего оборудования и сравнительно небольшое время для проведения эксперимента. Однако в настоящее время механизмы интеграции экзогенной ДНК в геном сперматозоидов еще не определены, а применение этих методов даже при использовании одинаковой схемы экспериментов может привести к неоднозначным
результатам.
3.2.1. ВЛИЯНИЕ МАНИПУЛЯЦИОННЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ И
ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ОСОБЕНОСТЕЙ ПТИЦЫ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ
ОПЛОДОТВОРЕНИЯ
До проведения трансфекции, с применением липосомальных препаратов, необходимо было удалить семенную жидкость, содержащейся в эякуляте, а также подобрать критерии обработки семени отвечающих условиям
проведения экспериментов. Для этого нами были подобраны оптимальные
режимы центрифугирования и концентрация сперматозоидов в дозе спермы.
В качестве разбавителя для спермы нами был выбран разбавитель, разработанный и произведенный на базе ВНИТИП. Было выявлено, что подвижность разбавленной спермы сохранялись при комнатной температуре в
течение 5 часов после получения спермы, и даже после суточного хранения.
Аналогичные показатели отмечались нами и при применении в качестве разбавителя среды ОPTI-MEM. Оказалось, что возникающий сразу же после
эякуляции температурный шок у сперматозоидов из-за разницы температур
тела и окружающей среды в виде снижения подвижности, не влиял на качество спермы. С целью удаления семенной жидкости из образцов семени нами
были оценены два режима последовательного центрифугирования при 450g и
220g на протяжении 5 минут с последующим разбавлением сперматозоидов
чистым разбавителем, а также подобран количественный состав сперматозоидов, удовлетворяющий условия проведения экспериментов (таб. 3).
54
Таблица 3
Влияние манипуляционных факторов на эффективность осеменения
Количество яиц
Условия проведения опыта
Центрифугирование
450g, 5мин
Центрифугирование
220g, 5мин
Количество сперматозоидов
в дозе спермы 500 млн с
последующими
3-мя центрифугированиями
220g, 5мин
Общее
Оплодотворенные
% оплодотворенных
137
65
47,0г
39
32
82,0
д
166
83
50,0ж
Средний
показатель
%
60,0а
43,0б
Количество сперматозоидов
в дозе спермы больше
700 – 800 млн с последующими 3-мя центрифугированями 220g, 5мин
25
9
36,0з
Контроль
50
48
96,0
96,0в
Ра,в<0,01; Рб,в<0,01; Рг,д<0,01; Рж,з<0,01
Как видно из результатов представленных в таблице 3, наилучшими
условиями проведения искусственного осеменения, удовлетворяющих условия проведения опыта являются в случае центрифугирования 220g на протяжении 5 минут (82% оплодотворенных яиц) и 500 млн. сперматозоидов в дозе осеменения при необходимости троекратного центрифугирования (50 %
оплодотворенных яиц). Данные показатели выше средних показателей по
группам.
Далее нами были изучены индивидуальные различия петухов к способности к осеменению. При этом учитывалось количество оплодотворенных
яиц, полученных в результате осеменения. Результаты представлены в таблице 4.
55
Таблица 4
Индивидуальные различия спермы петухов по оплодотворяющей способности
№ петуха
1
Количество прове20
денных осеменений
Количество полу90
ченных яиц
Количество оплодо36±1
творенных яиц
% оплодотворенных
40,0а
яиц
Ра,г<0,01; Рб,г<0,01; Рв,г<0,01
Номер петуха
2
3
Смешанная
сперма
16
16
9
86
78
43
31±0,8
31±1,2
27±1,6
36,0б
40,0в
63,0г
Существенных различий между производителями выявлено не было.
Процент оплодотворенных яиц составил от 36,0 до 40,0%. Но можно отметить, что при осеменении кур смешанной спермой наблюдалась тенденция к
увеличению процента осемененных яиц с 36,0-40.0% до 63%., при этом данная разница является достоверной (Р<0,01). Поэтому в дальнейших экспериментах использовалась смешанная сперма от трех производителей.
Также были изучены индивидуальные различия куриц по их способности к эффективному осеменению. Куриц осеменяли смешанной спермой в
дозе 500 млн сперматозоидов при трехкратном центрифугировании при 220g.
Было показано, что курицы под номерами 7, 6 и 10 откладывали 81, 62, и
52% соответственно, оплодотворенных яиц, что выше среднего показателя
(таб.5). В дальнейшем именно эти особи были использованы в опытах по получению трансгенной птицы.
56
Таблица 5
Индивидуальные различия куриц по способности к осеменению
№ курицы
1
5
6
7
10
11
16
Итого:
5
7
5
6
5
4
5
37
Количество
проведенных
осеменений
Количество
полученных яиц
Из них оплодотворенных
19
31
21
21
25
15
16
148
8±
1,6
13±
1,8
13±
2,6
17±
3,0
13±
2,8
3±
2,4
3±
0,6
70
% оплодотворенных
42,1
42,0
62,0
81,0
52,0
20,0
18,8
45,4
3.2.2 ИЗУЧЕНИЕ ОПТИМАЛЬНЫХ РЕЖИМОВ ПОДГОТОВКИ
ОБРАЗЦОВ ТКАНЕЙ И УСЛОВИЙ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР - АНАЛИЗА
Материалом для выделения ДНК служили на разных этапах проведения экспериментов как 7 – суточные эмбрионы, ДНК из которых выделялась
тотально из гомогенизированных тканей, так и цельная кровь, полученная от
цыплят. ДНК из гомогенизированных тканей выделялась стандартно, однако
возникли проблемы выделения ДНК из цельной крови при использовании
комплекта реагентов для выделения геномной ДНК из цельной крови (ООО
«НПФ Синтол», Россия, Москва), предназначенного для работы с образцами
человеческой крови. Ввиду более высокого содержания фибрина в крови куриц, по сравнению с содержанием в крови человека, а также из-за наличия
ядер в эритроцитах птицы, кровь на начальных стадиях выделения образовывала труднорастворимый сгусток, осложняя дальнейшее выделение ДНК.
Для преодоления возникшей проблемы для взятия крови нами были использованы вакуумные пробирки VACUETTE® (Австрия), с добавлением гепарина, а также были подобраны условия для удаления из пробы крови избыточного количества фибрина, путем трехкратного разбавления крови раствором
PBS (ООО «НПО ПанЭко», Россия, Москва) c последующим проведением
центрифугирования. Таким образом, данные модификации позволили эффек-
57
тивно использовать коммерческий набор для выделения ДНК из тканей птицы.
На основании генетической карты плазмиды pIRES2 EGFP ГКСФ с помощью компьютерной программы Vector NTI 9.0.0. были подобраны праймеры для проведения ПЦР анализа. Для повышения достоверности интеграции
генной конструкции нами были подобраны две пары праймеров, кодирующих участок целевого гена ГКСФ и участок CMV промотора. Так для определения наличия гена ГКСФ были подобраны следующие праймеры, кодирующие участок гена в 730 пар олигонуклиотидов:
Gcsf-dir 5' CCT GCC AGC TCC CTG CCC CAG 3'
Gcsf-rev 5' GCC TGC AGG AGC CCC TGG TAG AGG 3';
Для определения наличия CMV промотора были подобраны следующие праймеры, кодирующие участок гена в 305 пар олигонуклиотидов:
CMV-dir 5'GCC AAG TAC GCC CCC TAT TGA CG 3'
СMV-rev 5'CGT ACA CGC CTA CCG CCC ATT TGC 3'
Были подобраны условия проведения реакции, соответствующие следующим температурным и временным режимам:
Для определения наличия гена ГКСФ:
95ºС – 5 мин – первичная денатурация ДНК;
95ºС – 20 сек, 68ºС – 20 сек, 72ºС - 20 сек – 30 циклов – отжиг праймеров и полимеризация;
72ºС – 1 мин – заключительная полимеризация.
Для определения наличия CMV промотора:
95ºС – 5 мин - первичная денатурация ДНК;
94ºС – 20 сек, 68ºС – 10 сек – 33 цикла - отжиг праймеров и полимеризация;
72ºС – 1 мин - заключительная полимеризация.
Результат проверки праймеров представлен на рисунке 7. (А. под номе-
58
рами 2 и 4 используемая плазмида pIRES2 EGFP ГКСФ, под номером 3 ДНК
человека; Б. под номерами 2 и 4 используемая плазмида pIRES2-EGFP
ГКСФ , под номером_3-ДНКчеловека).
1
2
3
4
1
2
3
4
А. Праймеры Gcsf-dir, Gcsf-rev
Б. Праймеры CMV-dir и СMV-rev
1- маркер молекулярной массы Gene
1- маркер молекулярной массы
Ruler TM; 2 – плазмида pIRES EGFP2-
Gene Ruler TM; 2 – плазмида pIRES
ГКСФ; 3 - ДНК человека; 4 - плаз-
EGFP2 ГКСФ; 3 - ДНК человека; 4
мида pIRES2
- плазмида pIRES ГКСФ
Рис 7. Результат проверки подобранных праймеров
Применение приведенных выше методов выделения тотальной ДНК из
тканей и условий проведение анализа позволили достоверно идентифицировать плазмиду, контроль и опытные образцы ДНК.
59
3.2.3 ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННОЙ ПТИЦЫ С ГЕНОМ чГКСФ
МЕТОДОМ ОПОСРЕДОВАННОГО ПЕРЕНОСА С ПОМОЩЬЮ
СПЕРМАТОЗОИДОВ
Известно, что у мышей, свиней при инкубации экзогенной ДНК со
сперматозоидами чаще всего встречается эписомное встраивание, отсутствие
встраивания или трансген не передается следующему поколению. В литературных источниках нам не встречались работы по инкубации плазмид со
спермой петуха. Возможно, что выявленные различия в характере взаимодействий экзогенной ДНК со спермой при ее прямой инкубации и опосредованном переносе, и дальнейшие последствия этих событий регулируются
разными молекулярными механизмами.
В наших экспериментах (таблица 6), на птице также не удалось зафиксировать интеграцию ДНК этим методом, т.к. после осеменения 3 куриц
спермой инкубированной в присутствии плазмидной ДНК, содержащей ген
ГКСФ человека без использования липосом, было собрано 18 яиц, получено
12 эмбрионов, ни один из которых не был трансгенным.
Таблица 6
Получение трансгенных эмбрионов после осеменения кур спермой петухов, инкубированной в присутствии плазмидной ДНК
Показатели
Общее
число
Процент от числа
снесенных
яиц
полученных
эмбрионов
Получено яйц
18
100,0
Получено эмбрионов
12
67,0
100,0
Развились нормально
12
67,0
100,0
Из них трансгенных
0
0,0
0,0
В том числе:
60
В связи с опубликованными данными о положительном влиянии липосом на процесс связи ДНК со сперматозоидами (Shemesh M., et al., 2000;
Harel-Markowitz E., et al., 2009) нами были изучены два препарата на основе
липосом - «Lipofectine®» (Invitrogen) и «Lipofectamin® 2000», (Invitrogen).
В первой серии экспериментов было проведено 7 осеменений куриц
трансфецированной спермой с применением препарата «Lipofectine®» (Invitrogen). Было собрано 51 яйцо с целью получения 7-и суточных эмбрионов
для тестирования их на присутствие чужеродного гена (таблица7). В результате инкубации получено 29 эмбрионов, из которых один (на Рис.8, под №6)
оказался трансгенным (3,4% от числа полученных эмбрионов).
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Рис. 8. ПЦР анализ геномной ДНК эмбрионов на интеграцию генной
конструкции с геном ч-ГКСФ (1 – положительный контроль - pIRES
EGFP2-ГКСФ; 13 – отрицательный контроль выделения ДНК; 12, 11 –
отрицательные
контроли
заведомо
нетрансгенных
куриц;
2,3,4,5,6,7,8,9,10 – ДНК эмбрионов, полученных в результате эксперимента)
61
Таблица 7
Получение трансгенных эмбрионов после осеменения кур спермой петухов, трансфецированной геном ГКСФ человека с применением препарата «Lipofectine®»
Показатели
Общее
число
Процент от числа
снесенных
полученных
яиц
эмбрионов
100,0
57,0
100,0
Получено яйц
Получено эмбрионов
51
29
В том числе:
Развились нормально
29
57,0
100,0
Из них трансгенных
1
2,0
3,4
В следующей серии экспериментов нами был изучен препарат
«Lipofectamin® 2000». Было проведено 3 осеменения куриц спермой трансфецированной плазмидой pIRES EGFP2 ГКСФ с применением препарата
«Lipofectamin® 2000», (Invitrogen) с целью получения после 7-ти суточной
инкубации эмбрионов для тестирования их на присутствие чужеродного гена. Было собрано 20 яиц, получено 9 эмбрионов, 3 (Рис. 9, № 5, 7, 8) из которых оказались трансгенными. Как видно из данных таблицы 8 эффективность
трансгенеза с использованием данного препарата составила 33,3%.
62
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Рис. 9. ПЦР анализ геномной ДНК эмбрионов на интеграцию генной
конструкции с геном ГКСФ человека. (1 – маркер Gene Ruler TM; 2 –
отрицательный контроль выделения ДНК; 3 – отрицательный контроль
заведомо нетрансгенной курицы; 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 – ДНК эмбрионов,
полученных в результате эксперимента, 13 – положительный контроль
(плазмидная ДНК).
Таблица 8
Получение трансгенных эмбрионов после осеменения кур спермой петухов, трансфецированной геном ГКСФ человека с применением препарата «Lipofectamin® 2000
Показатели
Получено яйц
Получено эмбрионов
В том числе:
Развились нормально
Из них трансгенных
Общее
число
20
9
6
3
Процент от числа
снесенных полученных
яиц
эмбрионов
100,0
45,0
100,0
30,0
15,0
67,0
33,3
Таким образом, согласно представленным данным эффективность получения трансгенных эмбрионов с помощью препарата для трансфекции
«Lipofectamin® 2000» оказалась в 10 раз выше по сравнению с препаратом
«Lipofectine®» (Таблица 9).
63
Таблица 9
Влияние различных препаратов липосом на получение трансгенных эмбрионов кур
Из них трансгенных
Число полученных
яиц
Число полученных
эмбрионов
Lipofectine®
51
29
1
Процент от
числа эмбрионов
3,4а
Lipofectamin® 2000
Ра,б<0,01
20
9
3
33,3б
Вид препарата
n
С целью изучения характера интеграции гена ГКСФ человека были получены
цыплята
после
осеменения
трансфецированной
с
помощью
«Lipofectamin® 2000» спермой. Всего было осеменено 3 курицы спермой
трансфецированной плазмидной ДНК геном ГКСФ человека, собрано 20 яиц,
из которых вылупились 6 цыплят (Таблица 10).
Таблица 10
Получение трансгенных цыплят после осеменения кур спермой петухов,
трансфецированной геном hGCSF
Показатели
Общее
число
Процент от числа
Получено яйц
Получено цыплят
20
6
снесенных
яиц
100,0
30,0
Из них трансгенных
2
10,0
полученных
цыплят
33,3
100,0
Оказалось, что эффективность интеграции сохранилась на том же
уровне и в перинатальном периоде развития и составила те же 33,3 %.
Методом ПЦР анализа у 2-х цыплят было зафиксировано присутствие
экзогенной ДНК (Рис. 10,№ 3 и № 6).
64
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Рис. 10. ПЦР анализ геномной ДНК цыплят на интеграцию генной конструкции с геном ч-ГКСФ (12 – положительный контроль - плазмида
pIRES2-EGFP; 10, 11 – отрицательный контроль выделения ДНК; 1 –
ДНК маркер Gene Ruler TM; 8, 9 – отрицательные контроли заведомо
нетрансгенных куриц; 2,3,4,5,6,7– ДНК цыплят, полученных в результате эксперимента)
Интересно, что анализ интеграции исследуемого гена не выявил перестроек и изменений в размере амплифицируемого участка гена, при сравнении его с участком исходной плазмиды. На рисунке 11 представлены трансгенные цыплята, полученные в данном эксперименте.
Рис 11. Трансгенные цыплята поколения F0
65
3.2.4. ЭКСПРЕССИЯ чГКСФ В КРОВИ ТРАНСГЕННОЙ ПТИЦЫ
Иммуноферментным методом было определено содержание ГКСФ человека в сыворотке крови трансгенных цыплят (таблица 11).
Таблица 11
Динамика экспрессии гена ГКСФ человека у трансгенных цыплят
Номера цыплят
Концентрация чГКСФ в крови (пкг/мл) в возрасте (дни)
90
100
А001091
220
70
А001100
70
50
Контроль 1
0
0
Контроль 2
0
0
Динамика экспрессии гена ГКСФ человека у трансгенной птицы в крови анализировалась дважды в возрасте 90 и 100 дней. При этомнаблюдались
изменения в динамике содержания белка ГКСФ человека в анализируемых
образцах крови - у цыпленка А001100 с 70 до 50 пкг/мл, а у цыпленка
А001091 с 220 до 70 пкг/мл.
Таким образом, экспрессия трансгена в крови полученных нами трансгенных цыплятах составила от 50 до 220 пк/мл ГКСФ человека, а в крови
контрольных цыплят, у которых отсутствовала интеграция гена, искомый белок выявлен не был.
3.2.5 НАСЛЕДОВАНИЕ ЧУЖЕРОДНОГО ГЕНА У ТРАНСГЕННОЙ
ПТИЦЫ В ПОКОЛЕНИИ F1
В возрасте пяти месяцев трансгенным курицам были присвоены новые
номера, в связи с заменой крылометок на ногометки, А001091 на 2174 и
А001100 на 2182, соответственно. После достижения полученными трансгенными курицами возраста шести месяцев и начала яйцекладки, они были
искусственно осеменены спермой от нетрансгенных петухов, сперма которых
была только разбавлена разбавителем. После осеменения от каждой курицы
66
было собрано по 9 яиц, яйца инкубировались в течение 21 дней. Было получено 8 цыплят, от каждой курицы по 4 цыпленка. Из крови, которых была
выделена ДНК, и проведен ПЦР анализ на наличие гена ч-ГКСФ (таблица
12).
Таблица 12
Получение первого поколения трансгенных потомков от трансгенных
кур
Число проанализированных
Из них трансНомер
Получено
потомков
генных
курицы потомков
n
% от полученных
n
%
2174
4
4
100
2
50.0
2182
4
4
100
1
25.0
Всего:
8
8
100
3
37.5
В трех образцах ДНК было отмечено наличие трансгенной вставки , таким образом, обе трансгенные курицы передали плазмидную ДНК своим потомкам. Курица № 2174 передала половине из числа анализируемых потомков (2) чужеродный ген, а курица № 2182 - только один (25,0%). Результаты
ПЦР анализа представлены на рисунке 12.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Рис. 12. ПЦР анализ геномной ДНК цыплят от трансгенных куриц на
интеграцию генной конструкции с геном ч-ГКСФ (11 – положительный
контроль; 9,10 – отрицательный контроль; 12 – ДНК маркер Gene Ruler
TM
; 1-8 ДНК полученных эмбрионов).
67
Наличие трансгенных вставок идентичных плазмидным наблюдалось в
пробах ДНК под номерами 2, 5 и 6. Стоит отметить что, полученные фрагменты по своим размерам полностью соответствуют плазмидным, что в свою
очередь говорит об отсутствии перестроек в интегрированной генной конструкции. Среди трансгенного потомства оказалось две курицы и один петух.
После достижения половозрелости трансгенная птица первого поколения будет осеменена для получения второго трансгенного поколения и изучения характера наследования гена ГКСФ человека и экспрессии аналогичного белка.
68
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Возрастающие потребности медицины и ветеринарии во все большем
количестве рекомбинантных фармацевтических белках стимулировали развитие альтернативных систем для их производства, в том числе и использование трансгенных животных в качестве биореакторов. Трансгенная птица
представляет особый интерес, обладая рядом преимуществ по сравнению с
такими продуцентами как, овцы, козы, кролики, крупный рогатый скот, продуцирующие экзогенный белок в молоко. Так как время получения терапевтических белков в белке куриного яйца от момента трансфекции значительно
короче, процедура получения потомков проще и дешевле, возможно получение токсичных для млекопитающих препаратов, более приближенный к человеческому профиль гликозилирования белков, стерильность продукта,
сниженная иммуногенность и стабильность продуцируемых белков, высокий
выход экзогенного белка.
Среди наиболее перспективных методов получения трансгенной птицы
в настоящее время выделяют технологии культивирования эмбриональных
клеток и использование сперматозоидов в качестве переносчиков чужеродной ДНК. Однако при культивировании эмбриональных клеток были обнаружены молекулярные механизмы, защищающие геном от интеграции и экспрессии чужеродных генов, на преодоление которых направляются усилия
генных инженеров. У сперматозоидов, наоборот, существуют эндогенные
механизмы встраивания экзогенной ДНК, но чаще не в хромосому, а в виде
эписомного встраивания.
Нами исследовался комплекс вопросов, связанных с разработкой и
усовершенствованием биотехнологических методов генетической трансформации эмбриональных клеток птицы. А именно проблемы связанные с процессом культивирования первичных половых и бластодермальных клеток,
приемами трансфекции первичной культуры эмбриональных клеток, стери-
69
лизации эмбрионов реципиентов для трансплантации трансфецированных
ППК, новыми биотехнологическими приемами получения трансгенной птицы с геном ГКСФ человека с помощью опосредованного переноса чужеродной ДНК с использованием сперматозоидов и изучением интеграции, экспрессии и наследования гена ГКСФ человека в поколениях трансгеной птицы
с целью создания трансгенной популяции сельскохозяйственной птицы для
получения рекомбинантного белка.
Среди наиболее перспективных методов получения трансгенной птицы в
настоящее время выделяют технологии культивирования эмбриональных
клеток. Эти клетки являются наиболее привлекательными, т.к. сам процесс
развития куриных зародышевых клеток обеспечивает возможность проведения манипуляционных воздействий на разных стадиях развития эмбриона.
Так эмбриональные половые клетки появляются на ранней стадии X [Рольник В.В., 1968; Eyal-Giladi
H. and Kochav S., 1976]. В ряде научных работ
эта стадия развития была широко использована для производства соматических и генеративных химер [Petitte J.N., et al 1990, 1993; Naito M., et al 1991,
1994]. В последующем с развитием зародыша эмбриональные половые клетки могут быть идентифицированы в зоне зародышевого серпа. С развитием
кровяных сосудов ППК пассивно мигрируют и могут быть найдены в циркулирующей крови. После периода миграции, зародышевые клетки активно
заселяют зачатки половых желез [Белоусов Л.В. 1993; Nieuwkoop P.D. and
Sutasurua L.A., 1979].
Однако, значительный успех в использовании первичных эмбриональных клеток наметился только в получении химер первого поколения, в связи
с тем, что часто наблюдалось эписомное встраивание, отсутствие передачи
трансгена в поколениях, перестройки и делеции участка плазмидной ДНК
[Petitte J.N., Clark M.E., et al, 1990; Yasuda Y., et al, 1992; Chang I.K, et al.,
1992; Tajima A., et al, 1993, 1999]. Можно предположить, что это связано с
несовершенством используемых генных конструкций, отсутствием эффек-
70
тивных переносчиков чужеродной ДНК и неадекватным выбором способов
стерилизации реципиентов.
В наших экспериментах использовались генные конструкции в составе
плазмиды pIRES2-EGFP, не так давно принятой на вооружение генными инженерами, также применялся новый препарат для трансфекции на основе липосом - «Lipofectamin® 2000», а в качестве способа стерилизации реципиентов птицы впервые было предложено применение ультрафиолетового излучения.
В результате изучения влияния УФ лучей на количественный состав
эндогенных ППК реципиентов изменение в сторону снижения количества
ППК в гонадах опытных эмбрионов по сравнению с контрольной группой,
наблюдалось при облучении ультрафиолетом яиц в течение 2 – 2,5 часов, как
до начала инкубации, так и во время инкубации. Снижение количества ППК
составило в среднем 30%, (Таблица 1). Таким образом, применение УФ лучей
в данных целях существенно повышает возможность получения химерной
птицы, а также является дешевым, безопасным и эффективным методом по
сравнению с использованием для этих целей рентгеновского облучения
[Naito M., et al., 2007].
В качестве следующей модификации для усовершенствования метода
получения трансгенной химерной птицы при использовании первичных эмбриональных половых клеток был использован препарат для липофекции
«Lipofectamin® 2000». Липосомы взаимодействует с ДНК, формируя липид–
ДНК-комплексы, которые могут слиться с плазматической мембраной клетки, обеспечивая проникновение ДНК внутрь клетки. Инъекцию клеток проводили в зону зародышевого серпа суточных эмбрионов. В ходе эксперимента было получено три трансгенных эмбриона, причем интеграция гена в гонады была показана на эмбрионе не подвергавшегося УФ облучению, по разработанной нами методике. Однако эффективность трансфекции у стерили-
71
зованных реципиентов была выше и составила 25% по сравнению с контрольными эмбрионами с эффективностью в 17% . Таким образом, положительное влияние ультрафиолета на трансфекцию, скорее всего, отразилось не
на ППК, а на всем пуле клеток и наличие интеграции в гонаде еще не говорит
о том, что она была в ППК, а не произошла контаминация кровью трансгенного эмбриона [Сураева Н.М. и др., 2010]. В работе опубликованной в 1998
году [Hong Y.H., et al., 1998] были трансфецированы с помощью липофекции
in vitro гонадные клетки, после инъекции клеток эффективность интеграции,
как и в наших экспериментах составила 17%, однако применение нами обработки эмбрионов ультрафиолетом позволило повысить эффективность
трансфекции до 25%.
При проведении инъекции ППК наряду с трансфецированными клетками в зону зародышевого серпа попадал и липидный комплекс с ДНК, поэтому логично предположить, что наблюдаемая интеграция гена происходила
и непосредственно в собственные клетки эмбрионов – реципиентов.
Не менее результативным методом получения трансгенной птицы
представляется использование линий первичных половых клеток и бластодермальных клеток кур для трансфекции in vitro и трансплантации клонов
стволовых клеток со стабильной интеграцией встроенного гена.
В нашей работе при культивировании ППК, выделенных из гонад эмбрионов на 6 сутки инкубации, было выявлено два лимитирующих фактора,
влияющих на процесс пролиферации ППК: смена среды и сворачивание фидерного монослоя стромальных клеток. Если смена среды только задерживала рост ППК на несколько суток, то сворачивание фидерного слоя вместе с
ППК значительно сокращало число не только ППК, но и самих стромальных
клеток, концентрация которых была уже недостаточной для эффективного
роста ППК.
Максимальная продолжительность культивирования ППК от индивидуальных эмбрионов птицы в наших экспериментах составила 2 месяца, при
72
этом ППК сохраняли свои специфические характеристики, а именно, большой размер, наличие многочисленных гранул, и позитивное окрашивание на
гликоген (pис. 3). Согласно литературным данным, ППК с данными характеристиками способны дать рост половым химерам после трансплантации реципиенту [Han J.Y., et al., 2002].
Через 2 месяца культивирования клетки фидерного слоя начинали погибать. В статье, опубликованной в 2000 году, была исследована возможность культивирования ППК на подслое клеток STO [Park T.S. and Han J.Y.,
2000].
Для увеличения срока культивирования ППК пассировали на фидерный монослой клеток STO до сворачивания стромального монослоя на 5-7
сутки культивирования и после сворачивания, когда ППК вновь начинали активно делиться на оставшихся стромальных клетках. Было показано, что
ППК, выделенные из гонад, не способны пролиферировать на митотически
неактивном STO монослое. Однако согласно полученным нами данным деление клеток происходит. Следует отметить, что в последнее время было сообщено о получении постоянных линий ППК из крови также с использованием STO [van de Lavoir M.C., et al., 2006]. Скорее всего, определяющим фактором является не тип фидерного монослоя, а возможность контроля его роста
и поддержания жизнеспособности в качестве подложки, но не как источника
каких-либо факторов.
Было показано, что в присутствии куриной сыворотки в культуральной
среде, большая часть ППК не прикреплялась к монослою стромальных клеток, представляя собой суспензионную культуру. В отсутствие куриной сыворотки, ППК образовывали прикрепленные колонии от 5-8 до 20-30 клеток
и больше. Таким образом, добавление куриной сыворотки существенно увеличивало конечный выход ППК.[Сраева Н.М. и др., 2008] Аналогичные
свойства суспензионной культуры были показаны для линий ППК, выделенных из крови 2,5 суточных эмбрионов кур [van de Lavoir M.C., et al., 2006].
73
Другой используемый подход для получения химерной трансгенной птицы базируется на методе инъекции донорских трансфецированных бластодермальных клеток в бластодерму реципиента. Так, например, первые половые химеры кур были получены при пересадке клеток из неинкубированного
яйца [Petitte J.N., et al., 1990], кроме того, бластодермальные (ES) клетки по
сравнению с ППК, получаемые из крови и гонад, технически легче выделить
и трансфецировать.
В наших экспериментах по культивированию бластодермальных клеток после двух пассажей клетки начинали дифференцироваться и приобретать вид фибробластов с очень активным ростом или погибали. Проблема
довольно быстрого перехода клеток к дифференцировке обсуждалась во всех
работах, публикуемых в этой области исследований. Были высказаны предположения о влиянии трипсина, смены среды, недостаточной концентрации
клеток и ряда других факторов в качестве сигнала к дифференциации, однако
каждый из них в отдельности все же не был определяющим [van de Lavoir
M.C. and Mather-Love C., 2006]. При этом результат часто зависел от исследователя, принимающего решение о той или иной манипуляции с клетками.
В то же время, покрытие дна лунок желатином, наличие STO фидера и добавление или продуцирование сами же стволовыми клетками определенных
факторов роста являлись практически бесспорными необходимыми компонентами культивирования ЭСК. В качестве фактора роста чаще использовался LIF, который добавляли как коммерческий препарат или в составе кондиционированной среды, полученной после культивирования клеток линии
BRL. Однако в наших экспериментах коммерческий LIF поддерживал культуру не более 2-х пассажей, а добавление таких факторов, как основной фактор роста фибробластов (bFGF) и фактор стволовых клеток (SCF), используемых при культивировании ППК, приводил к остановке трансформации бластодермальных клеток в ЭСК, несмотря на присутствие LIF. На основании
изложенного, можно предположить, что LIF не является определяющим фак-
74
тором роста, скорее всего сами стволовые клетки способны нарабатывать
факторы аутокринной регуляции пролиферации. Поэтому снижение количества клеток, смена среды и разрушение трипсином приводит к уменьшению
его содержания и, как следствие, к дифференциации клеток.
В работе, опубликованной в 2006 [Wang Y., et al., 2006] году было показано, что эмбриональный экстракт способен поддерживать стабильность
бластодермальных клеток даже в небольшом количестве. Эмбриональный
экстракт, полученный из тканей 7 суточных эмбрионов, был использован
нами в качестве основной добавки к ростовой среде. Действительно с помощью экстракта удалось дважды пассировать бластодермальные клетки, однако, таких же результатов по получению стабильной пассируемой культуры и
получение с ее помощью химерной птицы, как было показано в вышеуказанной работе, добиться не удалось. Возможно сама процедура приготовления
эмбрионального экстракта, процессы выделения и концентрирования бластодермальных клеток требует доработок и стандартизации, т.к. отмечались различия роста клеток при использовании экстракта от разных партий приготовления и при культивировании клеток от разных доноров. Эта работа требует
дальнейшего изучения [Сураева Н.М. и др., 2009]
Идея получения трансгенных животных с использованием сперматозоидов в качестве вектора заданной генной конструкции очень привлекательна
кажущейся простотой метода [Кузнецов А.В., 1995]. Способность сперматозоидов связывать чужеродную ДНК впервые была показана в работе B.G.
Brackett et al. [1971]. В 1989 году M.C. Lavitrano с сотрудниками сообщили о
получении трансгенных мышей при использовании сперматозоидов в качестве вектора для переноса чужеродной ДНК в яйцеклетку, при ее оплодотворении.
В последнее время успешный перенос экзогенного гена с помощью
сперматозоидов был показан на нескольких видах животных, включая птицу
[Frumkin A., et al., 1991], свиней [Gandolfi F., et al., 1989], различных видов
75
рыб [Chen T.T., et al., 1991; Muller F., et al., 1992]. Однако работ, в которых
сообщалось об экспрессии чужеродных генов, было немного. Чаще всего, если ДНК не была интернализирована в ядро сперматозоида, а только переносилась сперматозоидом в цитоплазму яйцеклетки, копии плазмиды были обнаружены на ранних стадиях развития эмбриона, но не выявлялись у взрослых животных.
Использование сперматозоидов петуха для проведения экспериментов,
связанных с длительной инкубацией подразумевает применение методов
удаления семенной жидкости. Также немаловажным является и количественный состав сперматозоидов в дозе спермы для проведения искусственного
осеменения. Такие исследования до настоящего времени не проводились.
Образец семени (эякулят) состоит из семенной жидкости (плазмы),
сперматозоидов, иммунных и эпителиальных клеток, клеточного дебриса и
бактерий. Каждый из этих компонентов оказывает значительное влияние на
выживаемость сперматозоидов. Боле того, было показано, что может происходить полная потеря оплодотворяющей способности спермиев после 30минутного пребывания в семенной плазме [Ожин Ф.В. и др., 1977].
По полученным нами данным наилучшими условиями проведения экспериментов являлось центрифугирование при 220g на протяжении 5 минут
(82% оплодотворенных яиц) и 500 млн. сперматозоидов в дозе осеменения.
При необходимости трехкратного центрифугирования спермиев было получено 50 % оплодотворенных яиц (таблица 3).
Нами впервые изучались индивидуальные различия производителей по
эффективности осеменения после проведения манипуляционных воздействий, связанных с подготовкой сперматозоидов к трансфекции, и были отобраны петухи и курицы для дальнейших экспериментов по трансгенезу (таблицы 4 и 5). Оказалось, что такие различия были выявлены у куриц, т.к. процент оплодотворенных яиц от разных особей разнился от 19 до 81%. в дальнейшем птица с наилучшими показателями по оплодотворению и использо-
76
валась в экспериментах по трансгенезу. Что же касается петухов, то у них не
было выявлено резких различий по оплодотворяющей способности спермы,
однако при использовании смешанного семени от трех производителей отмечалась тенденция к увеличению числа оплодотворенных яиц. Необходимо
отметить, что в современном птицеводстве также применяется смешанная
сперма при проведении искусственного осеменения куриц [Давтян А.Д.,
1999].
В наших экспериментах инкубация плазмидной ДНК со сперматозоидами петуха, с проведением последующего искусственного осеменения куриц, не дала обнадеживающих результатов из–за отсутствия интеграции чужеродного гена (таблица 6). Этот факт согласовывается с результатами исследований других авторов на других видах животных, в которых данный
метод демонстрировал низкую воспроизводимость результатов, эписомное
встраивание трансгена и отсутствие передачи гена потомкам [Yonezawa T., et
al., 2001; Wu Z., Li Z., and Yang J., 2008].
Было показано, что липосомы, переносчики (моноклональные антитела, DMSO и др.), электропорация, микроинъекция комплекса ДНК с липосомами значительно повышают эффективность хромосомного встраивания
плазмид. Однако сравнение различных комплексов липосом с геном при инъекции в семенники крыс показало, что не любой коммерческий препарат способен встраивать экзогенную ДНК [Yonezawa T., et al., 2001].
В ходе наших экспериментов по трансгенезу также была выявлена разница в эффективности трансфекции при изучении 2-х препаратов липосом «Lipofectin®» и «Lipofectamin® 2000».
«Lipofectin®» продемонстрировал возможность получения трансгенных особей, но процент эмбрионов с интегрированной чужеродной ДНК по
результатам ПЦР анализа оказался невысоким и составил 3,4% (таблица 7).
С целью увеличения эффективности трансфекции нами был применен
новый препарат на основе липосом «Lipofectamin® 2000». Оказалось, что с
77
помощью этого препарата удалось повысить эффективность получения
трансгенов в 10 раз (33.3 % трансгенных эмбрионов) (таблица 8).
Стабильное встраивание гена с помощью «Lipofectamin® 2000» было
продемонстрировано нами и при получении трансгенных цыплят с геном
ГКСФ человека. Интеграция гена методом ПЦР была продемонстрирована у
двух цыплят (Рис. 10) и что характерно эффективность трансгенеза, как и в
опытах по получению трансгенных эмбрионов, также составила 33,3% (таблица 10). При применении липидных комплексов для получения трансгенов
со спермой, результаты, полученные в нашей лаборатории, превосходят ранее опубликованные результаты [Yang C.C. et al., 2004], при получении которых также использовались липосомы и спематозоиды в качестве переносчиков чужеродной ДНК, где выход трансгенных куриц составлял 9,5 %.
С целью проверки экспрессии введенного гена сыворотка крови полученной трансгенной птицы анализировалась иммунологическим методом на
присутствие ГКСФ человека (таблица 11). Оказалось, концентрация ГКСФ
человека в крови трансгенных куриц не была постоянной и менялась в зависимости от возраста птицы. Концентрация человеческого белка в сыворотке
крови была у одной курицы от 70 до 220 пкг/мл, а у другой 50 – 70 пкг/мл.
Данные показатели соответствуют и даже превышают физиологические концентрации ГКСФ в крови человека. Такая динамика экспрессии характерна
для трансгенных животных.
На следующем этапе нашей работы было необходимо установить, передается ли интегрированный ген по наследству, для чего две трансгенные
курицы были осеменены спермой контрольных петухов. И действительно,
по результатам ПЦР анализа ДНК цыплят, полученных в результате осеменения, обе трансгенные курицы передали плазмидную ДНК своим потомкам
(рис. 12) [Сураева Н.М. и др. 2010].
Таким образом, было продемонстрировано хромосомное встраивание
чужеродного гена при проведении опосредованного переноса ДНК спермато-
78
зоидами с помощью липосом, что позволяет в дальнейшем разработать высокоэффективную технологию получения терапевтических рекомбинантных
белков в яйце сельскохозяйственной птицы.
79
5. ВЫВОДЫ
1. Определены параметры для эффективной трансфекции первичных
половых клеток птицы геном ГКСФ человека, включая стерилизацию реципиентов УФ облучением в течение 2,5 часов, инъекции в зародышевый серп
и использование нового поколения препарата на основе липосом «Lipofectamin® 2000». Процент трансгенных эмбрионов составил 25%.
2. Смена среды и сворачивание фидерного монослоя стромальных клеток являются лимитирующими факторами, влияющими на процесс пролиферации ППК при культивировании in vitro.
3. Фидерный монослой линии STO способен поддерживать долгосрочную культуру ППК. Добавление в среду культивирования куринойсыворотки
крови в 2-3 раза увеличивает выход ППК.
4. Наиболее оптимальным способом отделения сперматозоидов петуха
от семенной жидкости является центрифугирование эякулята при 220g в течение 5 минут. Оптимальное число сперматозоидов, используемых для
трансфекции чужеродным геном, составляет 500 млн на дозу.
5. Получена трансгенная птица с геном ГКСФ человека методом искусственного осеменения трансфецированной спермой с применением препарата для трансфекции - «Lipofectamin® 2000». Выход полученных трансгенных цыплят с геном ГКСФ человека птицы составил 33.3%.
6. Продемонстрирована экспрессия гена
ГКСФ человека в крови
трансгенных кур на уровне 50 - 220 пкг/мл. Концентрация ГКСФ человека в
крови трансгенных кур различается у разных животных и зависит от их возраста.
7. В результате осеменения трансгенных куриц (с геном ГКСФ человека) спермой нетрансгенных петухов получено первое поколение трансгенной птицы. При этом наследование чужеродного гена варьировалось от 25 до
50%.
80
6. СВЕДЕНИЯ О ПРАКТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ РЕЗУЛЬТАТОВ
ИССЛЕДОВАНИЯ
Результаты экспериментов вошли в состав наставления «Способ получения генетически модифицированной сельскохозяйственной птицы при использовании сперматозоидов петуха в качестве переносчиков чужеродной
ДНК», рассмотренное и одобренное на заседании секции «Селекции, генетики и биотехнологии сельскохозяйственных животных РАСХН», протокол
№5, от 15 октября 2010г., наставление предназначено для научных сотрудников, аспирантов, специалистов научно-исследовательских институтов.
Разработаны оптимальные приемы культивирования in vitro эмбриональных клеток птицы, позволяющие получить долгосрочные культуры с целью разработки технологии трансгенеза клеток кур.
81
7. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ
ВЫВОДОВ
1. Разработанные методы получения трансгенной птицы рекомендуются для использования в биотехнологии и клеточной инженерии.
2. Для стерилизации реципиентов при проведении инъекции трансфецированных ППК в зону зародышевого серпа рекомендуется облу-чение
оплодотворенных яиц ультрафиолетом в течение 2,5 часов.
3. При проведении долгосрочного культивирования ППК в качестве
фидерного монослоя рекомендуется использовать митотически неактивные
клетки линии STO.
4. Для отделения сперматозоидов петуха от семенной жидкости, рекомендуется центрифугирование эякулята при 220g в течение 5 минут, при
этом оптимальное число сперматозоидов, используемых для трансфекции
чужеродным геном, составляет 500 млн на дозу.
5. Для трансфекции ППК и для получения трансгенной птицы методом
опосредованного переноса чужеродой ДНК сперматозоидами,
рекомен-
дуется использование препарата на основе липосом - «Lipofectamin® 2000».
82
8. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Белоусов Л.В. 1993. Основы общей эмбриологии / Белоусов Л.В. //
М.: Издательство Московского университета. 1993. – 149 С.
2.
Давтян, А.Д. Воспроизводство и искусственное осеменение сель-
скохозяйственной птицы / А.Д. Давтян // ВНИТИП, - 1999 – 240 С.
3.
Кузнецов, А.В. Трансгенные животные. Приемы конструирования /
Кузнецов А.В. // Биотехнология. – 1995. - № 3-4. – С. 3-6.
4.
Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин // М.: Высшая школа. – 1980. –
293 С.
5.
Ожин, Ф.В. Справочник по искусственному осеменению сельскохо-
зяйственных животных / Ф.В. Ожин, Г.В. Паршутин, И.И. Родин, А.Н. и др. //
М.: Россельхозиздат. - 1977. – 243 С.
6.
Прокофьев, М.И. Изучение интеграции, наследования и экспрессии
рекомбинантных генов с молоком кроликов / М.И. Прокофьев, В.В. Елагин //
Сельскохозяйственная Биотехнология. – 2002. - №6. – С. 49-54.
7.
Прокофьев, М.И. Методы получения биоинженерных сельскохозяй-
ственных животных / М.И. Прокофьев, В.И. Захарченко Н.М. Сураева // С-х
биология. – 1994. - № 4. – С. 12-25.
8.
Прокофьев, М.И. Создание трансгенных кроликов, продуцирующих
с молоком человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор /
М.И. Прокофьев, С.И. Городецкий, М.Н. Мезина и др. // Сельскохозяйственная биология. ─ 2003. ─ № 6. ─ C. 49-54.
9.
Рольник В.В. Биология эмбрионального развития птиц /Л.: Изда-
тельство «Наука» - 1968. – 145 С.
10.
Рыбакова Г.А. Техника взятия крови у птиц / Г.А. Рыбакова // Пти-
цеводство. – 1960. - №8. – С. 42-43.
11.
Сураева, Н.М. Выделение и характеристика первичных половых
клеток из гонад 6-9- дневных эмбрионов кур с целью совершенствования
83
метода получения трансгенных птиц / Н.М. Сураева, А.Г. Толмазова // Доклады РАСХН. - 2004. - №2 – C. 29-32.
12.
Сураева, Н.М. Изучение эффективности различных способов транс-
фекции репортерного гена в эмбриональные клетки кур / Н.М. Сураева,
А.Ю. Барышников, В.И. Фисинин и др. // Известия РАН. ─ 2008. ─ №. 1. ─ С.
18─23.
13.
Сураева, Н.М. Получение, характеристика и долгосрочное культи-
вирование примордиальных и бластодермальных клеток кур /Н.М.Сураева,
Е.А. Воротеляк, М.И. Прокофьев и др. //Доклады РАН. – 2008. – Т. 423. - №
3. – С. 408 – 410.
14.
Сураева, Н.М., Самойлов А.В. Получение фармацевтических белков
с помощью трансгенной птицы //Вестник РОНЦ им. Блохина Н.Н. РАМН. –
2009. – Т. 20. - № 4. – С. 19 – 25.
15.
Сураева, Н.М. Трансфекция экзогенной ДНК эмбриональных клеток
птицы / Н.М. Сураева. В.В. Мартиросян, А.З. Кесян и др. //Российский биотерапевтический журнал. – 2010. - № 2. – Т. 9. – С. 59.
16.
Сураева, Н.М. Получение трансгенных кур и геном гранулоцитарно-
го колоние-стимулирующего фактора человека / Н.М. Сураева, В.В. Мартиросян, А.З. Кесян и др. //Российский биотерапевтический журнал. – 2010. - №
2. – Т. 9. – С. 60.
17.
Arnosti, D.N. Analysis and function of transcriptional regulatory
elements: Insights from Drosophila / D.N. Arnosti // Annu. Rev. Ent. – 2003. –
Vol. 48. – P. 579-602.
18.
Arnosti, D.N. Design and function of transcriptional switches in
Drosophila / D.N. Arnosti // Insect Biochem. Mol. Biol. – 2002. – Vol. 32(10). – P.
1257-1273.
19.
Arnosti, D.N. The eve stripe 2 enhancer employs multiple modes of
transcriptional synergy / D.N. Arnosti, S. Barolo, M. Levine, et al. // Development.
– 1996. – Vol. 122. – P. 205-214.
84
20.
Bon, Chul Koo. Production of germline transgenic chickens expressing
enhanced green fluorescent protein using a MoMLV-based retrovirus vector / Bon
Chul Koo, Mo Sun Kwon, Bok Ryul Choi // The FASEB Journal. - 2006. - Vol.
20. – P. 2251-2260.
21.
Bosselman, R.A. Germline transmission of exogenous genes in the
chicken / R.A. Bosselman, R.Y. Hsu, T. Boggs, et al. // Science. 1989, Vol. 243. –
P. 533-535.
22.
Brackett, B.G. Uptake of heterologous genom by mammalian spermato-
zoa and its transfer to ova through fertilization / B.G. Brackett, W. Baranska, W.
Sawicki, et al.// proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1971. – Vol. 68. – P. 353-355.
23.
Chang, I.K. Simple method for isolation of primordial germ cells from
chick embryos / I.K. Chang, A. Tajima, Y. Yasuda, et al. //Cell Biol. Int. Rep. 1992. - Vol. 16. – P. 853-857.
24.
Chang, K. Effective generation of transgenic pigs and mice by linker
based sperm-mediated gene transfer / K. Chang, J. Qian, M.S. Jiang, et al. //BMC
Biotechnol. – 2002. - Vol. 2. – P. 5-10.
25.
Chen, T.T. "Gene-spliced" fish experiments / T.T. Chen, D.A. Powers,
RA. Dunham // Science. – 1991. – Vol. 8. – P. 779.
26.
Clark, A.J. Gene targeting in livestock: a preview / A.J. Clark, S. Burl, C.
Denning, et al. // Transgenic Research. – 2000. – Vol. 9. – P. 263-275.
27.
Cohen, G.N. Remplacement total de la methionine par la seleno-
methionine dans les proteines d’E. coli. / G.N. Cohen, and D.B. Cowie // C. R.
Acad. Sci. - 1973. – Vol. 244. – P. 680-683.
28.
Current Protocols in molecular biology / Ed. Ausdel F. M., Brent R. //
Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, 1987.
29.
Dyck, M.K. Making recombinant proteins in animals─different systems,
different applications / M.K. Dyck, D. Lacroix, F. Porhier, et al. // Trends
Biotechnol. ─ 2003.─Vol. 21.─P. 394─399.
30.
Ebara, F. Reproductive characteristics of transgenic (TG) chickens
85
carrying an exogenous gene / F. Ebara and N. Fujihara // Asian J. Androl. – 1999.
– Vol. 1. – P. 139-144.
31.
Eguma, K. In Vivo transfer of foreigen DNA into primordial germ cells
(PGCs) of chicken embryos / K. Eguma, T. Soh, M. Hattori, et al. // Transgenic
Research – 1999. – Vol. 7. – P. 520-523.
32.
Evans, M. G. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse
embryos / M. G.Evans, M. H. Kaufman // Nature. – 1981. – Vol. 292. – P. 154156.
33.
Eyal-Giladi, H. From cleavage to primitive steak formation: a
complementary normal table and a new look at the first stages of the development
of the chick / H. Eyal-Giladi and S. Kochav // I. General morphology. Dev. Biol. –
1976. – Vol. 49. – P. 321-337.
34.
Fraser, R.A. Efficient incorporation of transfected blastodermal cells into
chimeric chiken embryos / R.A. Fraser, R.S. Carsience, M.F. Clark, et al. // Int. J.
Dev. Biol. – 1993. – Vol. 37. – P. 381.
35.
Frumkin, A. A chicken caudal homologue, CHox-cad, is expressed in the
epiblast with posterior localization and in the early endodermal lineage / A.
Frumkin, Z. Rangini, A. Ben-Yehuda, et al. // Development. – 1991. – Vol. 112(1).
– P. 207-219.
36.
Fuijmoto, T. The origin, migration and morphology of the primordial
germ cells in the chick embryo / T. Fuijmoto, A. Ukeshima and R. Kiyofaji // Anat.
Rec. – 1976. – Vol. 185 – P. 139.
37.
Gagne, M. The use of electroporated bovine spermatozoa to transfer fo
DNA into oocytes / M. Gagne, F. Pothier, M.A. // Sirard Methods Mol. Biol. –
1995. – Vol. 48. – P. 161-166.
38.
Gagné, M.B. Electroporation of bovine spermatozoa to carry foreign
DNA in oocytes / M.B. Gagné, F. Pothier, M.A. Sirard // Mol Reprod Dev. –
1991. – Vol. 29. – P. 6-15.
39.
Gandolfi, F. Sperm-mediated transgenesis / F. Gandolfi // Theriogenol. -
86
1989 – Vol.53. – P. 127-137.
40.
Gandolfi, F. Stimulation of early embryonic development in the sheep by
co-culture with oviduct cells / F. Gandolfi and R.M. Moor // J.Reprod. Fertil. –
2000. – Vol. 81. – P. 23-28.
41.
Gordon,
J.W.
Genetic
transformation
of
mouse
embryos
by
microinjections of purified DNA / J.W. Gordon, G.A. Scangos, D.J. Plotkin, et al.
// Proc. Natl. Acad. USA. – 1980. – Vol. 77. – P. 7380-7384.
42.
Han, J.Y. Production of germline chimeras by transfer of chicken
gonadal primordial germ cells maintained in vitro for an extended period / J.Y.
Han, T.S. Park, Y.H. Hong, et al. // Theriogenology. - 2002. – Vol. 58. – P. 15311539.
43.
Han, J.Y. Gene transfer by manipulation of primordial germ cells (PGCs)
in the chicken / J.Y. Han, R.N. Shoffner and K.S. Guise // As.-Aus. J. Anim. Sci. –
1994. – Vol. 7. – P. 427-434.
44.
Harel-Markowitz, E. Use of Sperm Plasmid DNA Lipofection Combined
with REMI (Restriction Enzyme-Mediated Insertion) for Production of Transgenic
Chickens Expressing eGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) or Human
Follicle-Stimulating Hormone/ E. Harel-Markowitz, M. Gurevich, L.S. Shore, et
al. // Biology of Reproduction. – 2009. – Vol. 80. – P. 1046-1052.
45.
Hong, Y.H. Improved transfection efficiency of chicken gonadal
primordial germ cells for the production of transgenic poultry / Y.H.Hong, Y.K.
Moon, D.K. Jeong, et al. // Transgenic Research. – 1998. – Vol. 7. – P. 247-252.
46.
Houdebine, L.M. The methods to generate transgenic animals and to
control transgene expression / L.M. Houdebine // J. Biotechnol. ─ 2002.─Vol. 98
─ P. 145─160.
47.
Ivarie, R. Avian transgenesis: progress toward the promise / R. Ivarie //
Trends in Biotechnol. - 2003. – Vol. 21. - P. 14-19.
48.
Jefferies, H. B. Elongation factor-1 alpha mRNA is selectively translated
fol-lowing mitogenic stimulation / H. B. Jefferies, and G. Thomas // J. Biol. Chem.
87
– 1994. – Vol. 269. – P. 4367-4372.
49.
Jonak, J. Sperm-mediated preparation of transgenic Xenopus laevis and
transgenic DNA to the next generation / J. Jonak // Mol. Repr. Dev. ─ 2000. ─
Vol. 56. ─ P. 298─300.
50.
Khoo, Y.W. Sperm-mediated gene transfer studies on zebrafish in
Singapore / Y.W. Khoo // Mol. Reprod. Dev. ─ 2000. ─ Vol. 75. ─ P. 278 ─ 280.
51.
Lavitrano, M. Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into
eggs Genetic transformation of mice / M. Lavitrano, A. Camaioni, V.M. Fazio, et
al. // Cell. - 1989. – Vol. 57. – P. 717-723.
52.
Lavitrano, M. Sperm-mediated gene transfer: Production of pigs
transgenic for a human regulator of complement activation / M. Lavitrano, M.
Forni, V. Varzi, et al. // Transplant. Proc. ─ 1997. ─ Vol. 29. ─ P. 3508 ─ 3509.
53.
Lis, J T. New heat shock puffs and β-galactosidase activity resulting form
transformation of Drosophila with an hsp 70-lacZ hybrid gene / J T. Lis, J. A.
Simon, and C. A. Sutton // Cell. – 1983. – Vol. 35. – P. 403–410.
54.
Ma S.Jevnikar, A.M. Transgenic rise for allergy immunotherapy / A.M.
Ma S. Jevnikar // Proc. Natl Acad Sci. ─ 2003. ─ Vоl. 23. ─ P. 559─65.
55.
Maione, B. Sperm-mediated gene transfer in mice / B. Maione, M.
Lavitrano, C. Spadafora, et al. // Mol. Reprod. Dev. – 1998. – Vol. 50. – P. 406409.
56.
Markaki, M. Stable expression of human Growth Hormone over 50
generation in transgenic insect larvae / M. Markaki, D. Drabek, I. Livadaras, et al.
// Transgenic Res. ─ 2007.─ Vol. 16. ─ P. 99 ─ 107.
57.
Martin, G. R. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells:
formation of embryoid bodies in vitro / G. R. Martin, M. J. Evans // Proc Natl
Acad Sci USA. 1975. V. 72. № 4. P. 1441-1445.
58.
Mather-Love, C. Comparison of three nonviral transfection methods for
foreign gene expressions in early chicken embryo in ovo / C. Mather-Love, B.S.
Heyer, R. Bradshaw, et al. // Spring Harbor, New York. – 1972. – P. 352–355.
88
59.
Mozdziak, P.E. Development of transgenic chickens expressing bacterial
β-galactosidase / P.E. Mozdziak, S. Borwornpinyo, D.W. McCoy, et al. //
Developmental Dynamics. ─ 2003 ─ Vоl. 226. ─ P. 439 ─ 445.
60.
Muller, F. Introducing foreign genes into fish eggs with electroporated
sperm as a carrier / F. Muller, Z. Ivics, F. Erdélyi, et al. // Mol Mar Biol
Biotechnol. – 1992. – Vol. Aug-Oct;1(4-5). – P. 276-81.
61.
Naito, M. Embryonic expression of beta-actin-lacz domestic chicken / M.
Naito, K. Agata, K. Otsuka, et al. // Theriogenology. ─ 1993. ─ Vol. 40. ─ P. 509
─ 519.
62.
Naito, M. Introduction of exogenous DNA into somatic and germ cells of
chickens by microinjection into the germinal disc of fertilized ova / M. Naito, E.
Sasaki, M. Ohtaki, et al.// Mol. Reprod. Dev. – 1994. – Vol. 37. – P. 167-171.
63.
Naito, M. Production of germline chimeric chickens, with high
transmission rate of donor-derived gametes, produced by transfer of primordial
germ cells / M. Naito, A. Tajima and T. Kuwana // Mol. Reprod. Dev. – 1994. –
Vol. 39. – P. 153 – 161.
64.
Naito, M. Efficient transfection of chicken blastoderms in vivo by
lipofection and electroporation using green fluorescent protein gene as a marker /
M. Naito, A. Sano, T. Tagami, et al. // Anim. Sci. J. - 2000. – Vol. 71(4). – P. 377
– 385.
65.
Naito, Mitsuro. Efficient transfection of chicken blastoderms in vivo by
lipofection and electroporation using green fluorescsnt protein gene as a marker /
Mitsuro Naito, Sano Akiko, Tagami Takahiro, et al. // Animal Science Journal. –
2000. – Vol. 71(4). – P. 377-385.
66.
Naito, M. Effect of soft X-ray irradiation on the migratory ability of
primordial germ cells in chickens / M. Naito, T. Harumi, T. Minematsu, et al. //
British Poultry Science. – 2007. – Vol. 48. – P. 121-126.
67.
Nakanishi, A. Gene transfer in the chicken by sperm-mediated methods /
A. Nakanishi and A. Iritani // Mol. Repr. Dev. ─ 1993. ─ Vol. 36. ─ P. 258 ─ 261.
89
68.
Nieukoop, P.D. Primordial germ cells in the chordates: embryogenesis
and phylogenesis / P.D. Nieukoop and L.A. Sutasurya // Cambridge University
Press. 1979.
69.
Ono, T. Transfer of male or female primordial germ cells of quail into
chicks embryonic gonads / T. Ono, R. Yokoi and H. Aoyama // Exp. Anim. 1996. – Vol. 45. – P. 347 - 352.
70.
Pain, B. Chicken embryonic stem cells and transgenic strategies / B.
Pain, P. Chenevier, J. Samarut // Cells Tissues Organs. – 1999. – Vol. 165(3-4) - P.
212-219.
71.
Paldi, A. cisEffect of lacZ sequences in transgenic mice / A. Paldi, L.
Deltour and J. Jami // Transgenic Res. – 1993. – Vol. 2. – P. 325-329.
72.
Palmiter, R.D. Heterologous introns can enchance expression of
transgenes in mice / R.D. Palmiter, E.P. Sandgren, M.R. Avarbock, et al. // Proc.
Natl. Acad. Sci. USA – 1991. – Vol. 88. – P. 478-482.
73.
Park, T.S. Derivation and characterization of pluripotent embryonic germ
cells in chicken / T.S. Park and J.Y. Han // Molecular Reproduction and
development. – 2000. – Vol. 56. – P. 475-482.
74.
Peshon, J.J., Spermatid-specific expression of protamine 1 in transgenic
mice / J.J. Peshon, R.R. Behringer // Proc. Acad. Sci. – 1987. – USA. – Vol. 84. –
P. 5316-5319.
75.
Peltola, H. The elimination of indigenous measles, mumps and rubella
from Finland by a 12-year, two-dose vaccination program / H. Peltola, O.P.
Heinonen, M. Valle, et al. // New Engl J Med. – 1994. – Vol. 331. – P. 1397-402.
76.
Petitte, J.N. Producing of somatic and germline chimeras in the chicken
by transfer of early blastodermal cells / J.N. Petitte, M.E. Clark, G. Liu, et al. //
Development. – 1990. – Vol. 12. – P. 185-189.
77.
Petitte, J.N. Accessing the genome of the chicken using germline
chimeras. In Manipulation of the Avian Genome / J.N. Petitte, C.L. Brazolot, M.E.
Clark, et al. // CRC Press Inc. – 1993. - P. 81-102.
90
78.
Pettite, J.N. Growth factors during early event in avian embryo
development / J.N. Petitte // J.Poult. Sci. – 2002. – Vol.39, №4. – P. 205-228.
79.
Petitte, J.N. Avian pluripotent stem cells / J.N. Petitte, G. Liu, Z. Yang //
Mechanisms of Development. – 2004. – Vol. 121. – P. 1159-1168.
80.
Prasher, D.C. Primary structure of the Aequorea victoria green-
fluorescent protein / D.C. Prasher, V.C. Eckenrode, W.W. Ward // Gene. – 1992. –
Vol. 111. – P.229 - 233.
81.
Prasher,
D.C.
Nucleoside
phosphotransferase
from
barley.
Characterization and evidence for ping pong kinetics involving phosphoryl enzyme
/ D.C. Prasher, M.C. Carr, D.H. Ives, et al. // J. Biol. Chem. – 1982. – Vol.
257(9). – P. 4931-4939.
82.
Resnick, J. L. Long-term proliferation of mouse primordial germ cells in
culture / J.L. Resnick, L.S. Bixler, L. Cheng, et al. // Nature. – 1992. – Vol. 292. –
P. 550-551.
83.
Rieth, A. Electroporation of bovine spermatozoa to carry DNA
containing highly repetitive sequences into oocytes and detection of homologous
recombination events / A. Rieth, F. Pothier, M.A. Sirard.// Mol. Reprod. Dev. –
2000. – Vol. 57(4). – P. 338-345.
84.
Rottmann, O.J. Liposome mediated gene transfer via spermatozoa into
avian egg cells / O.J. Rottmann, R. Antes, P. Hoefer, et al.// J. Anim. Breed. Gen. –
1992. – Vol. 109. – P. 64-70.
85.
Rottmann, O. Liposome-mediated gene transfer via sperm cells. High
transfer efficiency and persistance of transgenes by use of liposome and sperm
cells and a murine amplification element / O. Rottmann, R. Antes, P. Hofer, et al.
// J. Anim. Breed.Gener. – 1996. – Vol. 113. – P. 401-411.
86.
Royer, C. Biosynthesis and cocoonexport of recombinant globular
protein in transgenic silkworms / C. Royer, A. Jalabert, M. Da Rocha, et al. //
Transgenic Res. ─ 2005. ─ Vol. 14. ─ P. 463 ─ 472.
87.
Salter, D.W. Gene insertion into the chick germline by retroviruses /
91
D.W. Salter, E.J. Smith, S.H. Hughes, et al. // Polt. Sci. – 1986. – Vol. 65. – P.
1445-1458.
88.
Shemesh, M. Gene integration into bovine sperm genome and its
expression in transgenic offspring / M. Shemesh, M. Gurevich, E. HarelMarkowitz, et al. // Mol. Reprod. Dev. – 2000. – Vol. 56. – P. 306-308.
89.
Shyu, A.B. The double lives of shuttling mRNA binding proteins / A.B.
Shyu and M.F. Wilkinson // Cell. – 2000. – Vol. 102. – P. 135-138.
90.
Simkiss, K. Transfer of primordial germ cell DNA between embryos / K.
Simkiss, K. Rowlett, N. Bumstead, et al.// Protoplasma. - 1989. – Vol. 151. – P.
164-166.
91.
Simon, G. Lillico. Transgenic chickens as bioreactors for protein-based
drugs / Simon G. Lillico., Michael J. McGrew., Adrian Sherman, et al.// Drug
discovery today. – 2005. – Vol.10. – P. 191 – 196.
92.
Taboit-Dameron, F. Association of the 5'HS4 sequence of the chicken
beta-globin locus control region with human EF1 alpha gene promoter induces
ubiquitous and high expression of human CD55 and CD59 cDNAs in transgenic
rabbits / F. Taboit-Dameron, B. Malassagne, C. Viglietta, et al. // Transgenic Res.
– 1999. – Vol. 8(3). – P. 223-35.
93.
Tang, X. Effects of dehydroepiandrosterone (DHEA) on hepatic lipid
metabolism parameters and lipogenic gene mRNA expression in broiler chickens /
X. Tang, H. Ma, S. Zou, W. Chen. // Lipids. – 2007. – Vol. 42. – P. 1025-1033.
94.
Tajima, A. Study on the concentration of circulating primordial germ
cells (cPGS) in early chick embryos / A. Tajima, H. Hayashi, A. Kamizumi, et al.
// J. Exp. Zool. - 1999. – Vol. 280. – P. 265-267.
95.
Tajima, A. Producing of germline chimeras by transferof primordial
germ cells in the domestic chicken (Gallus domesticus) / A. Tajima, M. Naito, Y.
Yasuda, et al. // Theriogenology. - 1993. – Vol.40(3). – P. 509-19.
96.
Tajima, A. Production of germ-line chimeras by transfer of
cryopreserved gonadal primordial germ cells (gPGCs) in chicken / A. Tajima, M.
92
Naito, Y. Yasuda, et al.// J Exp Zool. – 1998. – Vol. 15. – P. 265-267.
97.
van de Lavoir, M.C. Avain embryonic stem cells / M.C. van de Lavoir
and C. Mather-Love // Methods in enzymology. ─ 2006. ─ Vol. 418. ─ P. 38-64
98.
van de Lavoir, M.C. High-grade transgenic somatic chimeras from
chicken embryonic stem cells / M.C. van de Lavoir, C. Mather-Love, P. Leighton,
et al. // Mechanisms of Development.─2006.─Vol. 123.─P. 31─41.
99.
Vick, L.E. Transgenic birds from transformed primordial germ cells /
L.E. Vick, L. Ying and K. Simkiss // Proc. R. Soc. Lond. S.B. – 1993. – Vol. 251.
– P. 179-182.
100.
Wang, Y. Progress toward the culture and transformation of chicken
blastodermal cells / Y. Wang, C.F. Brooks, S.A. Jones, et al. // Stem Cells. ─ 2006.
─ Vol. 24. ─ P. 1638─1645.
101.
West, A.G Insulators: many functions, many mechanisms / A.G. West,
M. Gaszner, G. Felsenfeld // Genes Dev. – 2002. – Vol. 16. – P. 271-288.
102.
Wu, Z. Transient transgene transmission to piglets by intrauterine
insemination of spermatozoa incubated with DNA fragments / Z. Wu, Z. Li, J.
Yang // Mol Reprod Dev. – 2008. – Vol. 75(1). – P. 26-32.
103.
Yasuda, Y. A method to obtain avian germline chimeras using isolated
primordial germ cells / Y. Yasuda, A. Tajima, T. Fujimoto, et al. // J. Repr. Fert. ─
1992. ─ Vol. 96. ─ P. 521─528.
104.
Yonezawa, T. Detection of transgene in progeny at different
developmental stages following testis-mediated gene transfer / T. Yonezawa, Y.
Furuhata, K. Hirabayashi, et al. // Mol Reprod Dev. – 2001. – Vol. 60(2). – P. 196201.
105.
Young, W.S. In situ hybridization and Northen analyses of the expression
of protein kinase C genes oligodeoxyribonucleotide probes / W.S. Young // Focus.
– 1991. – Vol. 13. – P. 46-49.
106.
Zhan, Y. Predominant transgene expression in exocrine pancreas directed
by the CMV promoter / Y. Zhan, J.L. Brady, A. M. Johnston, et al. // DNA Cell.
93
Biol. – 2000. – Vol. 19. – P. 639-645.
107.
Zhu, L. Production of monoclonal antibody in eggs of chimeric chicken /
L. Zhu, van de M.C. Lavoir, P. Leighton, et al.// Nat. Biotechnol. ─ 2005. ─ Vol.
23. ─ P. 1159-1169.
94
ПРИЛОЖЕНИЯ
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК
95
Государственное научное учреждение
Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства им. В.А. Афанасьева
НАСТАВЛЕНИЕ
«Способ получения генетически модифицированной
сельскохозяйственной птицы при использовании сперматозоидов петуха
в качестве переносчиков чужеродной ДНК».
пос. Родники, Московская обл.
2010 г.
УДК 636.5
96
«Способ получения генетически модифицированной
сельскохозяйственной птицы при использовании сперматозоидов петуха в
качестве переносчиков чужеродной ДНК» подготовлено:
Научным руководителем докторим биол. наук, профессором,
академиком РАСХН Прокофьевым М.И., ответственным исполнителем кандидатом биол. наук, Мартиросян В.В., старшим научным сотрудником Самойловым А.В., старшим научным сотрудником, кандидатом биол. наук Кесян А.З.
1. Введение
97
Технологии получения рекомбинантных белков с использованием
трансгенной птицы открывают новый, эффективный путь производства белковых фармацевтических препаратов.
Белок яйца содержит около 4г белка, половина которого представлена
одним белком – овальбумином. Следовательно, с помощью овальбуминового
промотора можно было бы получить до грамма рекомбинантного белка с
25% чистотой в стерильном естественным образом белке яйца. В отличие от
крупного рогатого скота, овец, коз и кроликов было показано, что птица и
человек в качестве компонентов своих гликопротеинов используют остатки
сиаловой кислоты одинаковой структуры. Получение рекомбинантных протеинов из белка яйца трансгенной птицы стало возможным благодаря развитию новых методов введения чужеродных генов в клетки животных.
Однако существуют значительные различия в физиологии воспроизводства птицы и млекопитающих, а именно: сингамия или слияние пронуклеусов у птицы происходит через 3-4 часа после овуляции в проксимальной части яйцевода; пронуклеусы находятся на 22-52 мкм ниже поверхности
и не могут быть визуализированы без фиксации, а к моменту снесения яйца
эмбрион развивается до 60000 клеток, закрывая зародышевую полость. Ввиду этого использование традиционных методов получения трансгенных млекопитающих, основанных на микроинъекции генных конструкций в яйцеклетку, применимо к птице является затруднительным и малоэффективным.
Проблемы, связанные с совершенствованием технологии получения трансгенной птицы, широко изучаются в нашей стране и за рубежом. На сегодняшний день рядом лабораторий мира используются методики внедрения
чужеродной ДНК (чДНК) в геном птицы, основанные на применении эмбриональных клеток, вирусных векторов и сперматозоидов петуха в качестве переносчиков чДНК.
Разработка и совершенствование способа получения генетически модифицированной сельскохозяйственной птицы, в котором сочетаются использование
98
сперматозоидов петуха и современных препаратов для трансфекции на основе липосом, существенно повысит потенциал получения рекомбинантных
белков для медицины и ветеринарии.
В лаборатории трансгенеза отдела «Биотехцентр» ГНУ НИИ Пушного звероводства и кролиководства им. В.А. Афанасьева в течение ряда лет проводятся
исследования по получению трансгенной птицы при использовании сперматозоидов петуха в качестве переносчиков чДНК. В результате проведенных
исследований в ГНУ НИИПЗК им. В.А. Афанасьева получены 6 трансгенных
особей сельскохозяйственной птицы, в том числе 3 особи поколения F1, исследована динамика экспрессии гена ГКСФ человека в сыворотке крови
трансгенной птицы.
2. Способ – методика проведения опыта
2.1. Биологические материалы
В экспериментах целесообразно использовать половозрелых куриц и петухов
в возрасте 6 – 12 мес. В виварии, где намечается применение способа, необходимо оборудовать специальную секцию для индивидуального содержания
птицы в соответствии с зоотехническими требованиями содержания сельскохозяйственной птицы. Яйца после проведения искусственного осеменения
хранить не более 10 дней при температуре +4°С. Оплодотворенные яйца инкубировать в инкубаторе при температуре 37,5-38°С, относительной влажности 60%.
Получение спермы от петухов и ее разбавление осуществлять согласно общепринятому в промышленном птицеводстве методу. Оценку качества спермы и подсчет количества сперматозоидов производить под микроскопом,
при этом учитывать количество сперматозоидов, их подвижность и жизнеспособность.
Для увеличения эффективности трансгенеза необходимо отобрать куриц с
наилучшими показателями оплодотворяемости. Семя, для применения спер-
99
матозоидов в качестве переносчиков чДНК, следует использовать смешанное, от разных производителей (2-3).
Для проведения трансфекции использовать препараты ДНК плазмид содержащие целевые гены, в линеаризированной форме, в виде водного раствора.
2.2. Подготовка сперматозоидов
Дозу спермы (500 млн сперматозоидов) необходимо отмыть от семенной
жидкости путем троекратного центрифугирования при 2000 об/мин, 5 мин с
разбавлением осевших сперматозоидов разбавителем, причем после проведения последней отмывки разбавитель следует заменить на среду для культивирования клеток - ОPTI-MEM (Invitrogen, США). Объем дозы спермы 300
мкл.
2.3 Проведение трансфекции с помощью препаратов «Lipofectine®»
(Invitrogen) или «Lipofectamin® 2000» (Invitrogen)
1. Плазмидную ДНК в количестве 40 мкг растворить в среде ОPTI-MEM –
250 мкл, добавить 40 мкл «Lipofectine®» (Раствор 1). Одновременно приготовить смесь соответствующей рестриктазы с «Lipofectine®» на среде ОPTIMEM, для этого 150 ед рестриктазы смешивали с 150 мкл среды ОPTI-MEM
и добавляли 40 мкл «Lipofectine®» (Раствор 2), инкубировать 40 минут. Затем растворы 1 и 2 добавить к дозе подготовленной спермы, инкубировать 1
час при комнатной температуре и осеменить куриц.
2. Для проведения трансфекции с использованием сперматозоидов с помощью «Lipofectamin® 2000» 20 мкг плазмидной ДНК добавить к 100 мкл среды ОPTI-MEM (Раствор 1). 20 мкл «Lipofectamin® 2000» добавить к 100 мкл
среды ОPTI-MEM (Раствор 2), инкубировать растворы 5 мин, при комнатной
температуре, затем их смешать и инкубировать 20 мин, при комнатной температуре. Затем растворы 1 и 2 добавить к дозе подготовленной спермы, инкубировать 1 час при комнатной температуре и осеменить кур.
100
2.4 Выделение ДНК
Кровь для выделения ДНК следует получать из подкожно-локтевой вены,
используя вакуумные пробирки VACUETTE® (Австрия).
ДНК из цельной крови выделять, используя метод солевой экстракции или
комплект реагентов для универсальной пробоподготовки (ООО «Лаборатория Изоген», Россия), согласно инструкции. Выделенную ДНК либо сразу
использовать для постановки ПЦР, либо хранить при температуре - 20° С.
2.5 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Определение последовательности чужеродной генной конструкции в геномной ДНК следует проводить методом ПЦР. В реакции использовать праймеры и режимы, соответствующие используемой ДНК плазмид. Продукты
ПЦР разделять электрофоретически в агарозном геле с добавлением бромистого этидия и регистрировать в ультрафиолетовом свете.
2.6 Исследование уровня экспрессии ГКСФ человека
у трансгенной птицы
Уровень экспрессии целевого гена у трансгенной птицы исследовать в сыворотке крови. Забор крови для получения сыворотки проводить из подкожнолоктевой вены, используя вакуумные пробирки VACUETTE® (Австрия) соответствующего типа. В дальнейшем кровь обработать согласно наставлению
VACUETTE® по получению сыворотки крови.
Образцы сыворотки анализировать на содержание целевого белка с помощью
соответствующих тест-систем для иммуноферментного анализа.
2.7 Изучение возможности передачи чужеродного гена потомству первичных трансгенных куриц
После достижения трансгенными курицами возраста шести месяцев и начала
101
яйцекладки, следует провести
искусственное осеменение спермой от не-
трансгенных петухов, не подвергавшейся никакой обработке, кроме разбавления. Собрать и проинкубировать яйца до вывода цыплят. Выделить геномную ДНК и проанализировать ее методом ПЦР на наличие интегрированной
чДНК.
3. Основные условия применения способа получения генетически
модифицированной сельскохозяйственной птицы при использовании
сперматозоидов петуха в качестве переносчиков чужеродной ДНК
1. Кормление и содержание подопытной птицы должно строго соответствовать общепринятым зоотехническим требованиям;
2. Применение рекомендуемых методов и искусственное осеменение
куриц должны проводить специалисты высокой квалификации;
3. Лабораторные помещения для проведения экспериментов должны
быть соответственно организованы и оснащены соответствующим
оборудованием и расходными материалами;
4. При отсутствии должных условий содержания подопытной птицы
и организации проведения лабораторной работы применять методы получения генетически модифицированной сельскохозяйственной птицы при использовании сперматозоидов петуха в качестве переносчиков чужеродной ДНК не рекомендуется.
102
Автор выражает благодарность сотрудникам отдела «Биотехцентр»
Мартиросян Валентине Владимировне, Кесян Арпик Завеновне, Бублик Платону Васильевичу и коллегам из других институтов за помощь в работе над
материалами диссертации. Отдельная благодарность выражается фирме ООО
«Биолайн Фармторг», в лице генерального директора Тищенко Александра
Николаевича, за всестороннюю помощь в проведении экспериментов.