Folie 1 - Global Fertility Academy
advertisement
Слайд 1 Исследования по бесплодию 3. Неинвазивная диагностика человеческих эмбрионов с помощью протеомики и метаболомики Francisco Dominguez, д.м.н. Университет Валенсии, кафедра по фундаментальным исследованиям в репродукции человека, Испания Предлагаем Вашему вниманию главу …. Эта глава называется «Неинвазивная диагностика человеческих эмбрионов с помощью протеомики и метаболомики». Автор — д-р Francisco Dominguez Слайд 2 Цели обучения • Обсудить новые методики неинвазивной оценки и диагностики человеческих эмбрионов • Узнать больше о секретоме человеческого эмбриона • Объяснить различия между протеомным и метаболомным подходами • Представить различные метаболомные технологии В данном уроке поставлены следующие цели обучения: • Обсудить новых методики оценки и диагностики жизнеспособности эмбриона • Узнать больше о секретоме человеческого эмбриона • Объяснить различия между протеомным и метаболомным подходами • Представить различные метаболомные технологии Слайд 3 Основные вопросы Основным вопросом в репродукции человека является отбор наиболее подходящих эмбрионов для переноса В настоящее время повсеместно для используется морфологическая оценка отбора наилучших эмбрионов Но морфологически «хорошие» эмбрионы могут иметь хромосомные аномалии или другие причинные факторы, которые обуславливают нарушение их имплантации Original image Оригинальное изображение Мы знаем, что одним из важнейших вопросов в репродукции человека является отбор подходящих эмбрионов для переноса. На сегодняшний день повсеместно для отбора наилучших эмбрионов используется морфологическая оценка. Мы должны отметить, что иногда даже морфологически "хорошие" эмбрионы все равно могут хромосомные аномалии или другие причинные факторы, обуславливающие неудачи имплантации. Поэтому необходимы надежные и неинвазивные методы оценки, чтобы быть уверенным в качестве и отсутствии патологии у эмбриона. Слайд 4 Неинвазивная диагностика Неинвазивные методы позволяют избежать биопсии эмбриона Вместо этого для дифференциальной диагностики используется кондиционированная среда, в которой культивируются эмбрионы Original image Оригинальное изображение Неинвазивные методы позволяют избежать биопсии эмбриона. Вместо этого, для дифференциальной диагностики используется кондиционированная среда, в которой культивируются эмбрионы. В этом случае у эмбриона не проводится биопсия бластомеров. Он остается нетронутым, потому что анализируется кондиционированная среда, которая окружает эмбрион. Слайд 5 От генотипа к фенотипу: эра системной биологии Transcriptome Транскриптом Proteome Протеом Metabolite profiling Определение метаболомического профиля Pathway identification Определение пути Как Вы знаете, уже полностью описан человеческий геном и коды для тысячи отличительных признаков, которые и обуславливают у каждого человека уникальный фенотип. Для получения этого уникального фенотипа гены по-разному транскриптируются во времени и пространстве, образуя то, что мы называем транскриптом. В последние годы мы подробно описали профиль экспрессии генов эндометрия, а на моделях животных исследовали транскриптом эмбриона. Чтобы достичь конечного фенотипа, эти гены должны быть преобразованы в белки, ферменты и другие молекулы на разных стадиях развития и с различной локализацией в организме. В конечном счете, эти белки ответственны и за дефекты или недостатки физиологии организма, так как они принимают участие в различных метаболомических путях, которые приводят к появлению тех или иных метаболитов в зависимости от ситуации, в которой находится клетка. Таким образом, в ближайшие годы мы должны сосредоточиться на изучении протеома (или метаболома) эмбрионов и эндометрия, чтобы ответить, наконец, на все вопросы репродуктивной медицины, включая проблему бесплодия и разработку новых неинвазивных методов диагностики. Слайд 6 Что мы знаем Отбор наиболее подходящего эмбриона для селективного переноса одного эмбриона - одна из основных целей репродуктивной медицины в последние годы (Poikkeus P. Human Reprod.2007) До сих пор единственным способом оценки потенциальных возможностей развития и имплантации эмбриона человека во всем мире является оценка морфологии (Sjöblom P, Fertil Steril. 2006) Совершенствование методов культивирования эмбрионов с использованием систем с последовательным или совместным культивированием и уменьшение числа переносимых эмбрионов привело к сокращению проблем, связанных с многоплодной беременностью, однако частота имплантации при ЭКО не повысилась за последнее десятилетие (Nyboe и соавт. , 2009). С одной стороны конечная цель изучения протеома или секретома эмбриона человека - это понять его физиологию. С другой стороны, важно найти новые подходы для улучшения технологий экстракорпорального оплодотворения. Хорошо известно, что в последние годы одна из основных целей репродуктивной медицины заключалась в отборе наиболее подходящего эмбриона для селективного переноса одного эмбриона. До сих пор единственным способом оценки потенциальных возможностей развития и имплантации эмбриона человека во всем мире является оценка морфологии. Совершенствование методов культивирования эмбрионов с использованием систем с последовательным или совместным культивированием и уменьшение числа переносимых эмбрионов привело к сокращению проблем, связанных с многоплодной беременностью, хотя частота имплантации при ЭКО не повысилась за последнее десятилетие. Poikkeus P, Gissler M, Unkila-Kallio L, Hyden-Granskog C, Tiitinen A. Obstetric and neonatal outcome after single embryo transfer. Hum Reprod 2007 Apr;22(4):1073-9 Sjöblom P, Menezes J, Cummins L, Mathiyalagan B, Costello MF. Prediction of embryo developmental potential and pregnancy based on early stage morphological characteristics. Fertil Steril 2006 Oct;86(4):848-61. Nyboe Andersen A, Goossens V, Bhattacharya S, Ferraretti AP, Kupka MS, de Mouzon J, Nygren KG. Assisted reproductive technology and intrauterine inseminations in Europe, 2005: results generated from European registers by ESHRE: ESHRE. The European IVF Monitoring Programme (EIM) for the European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE); European IVF-monitoring (EIM) Consortium for the European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE). Hum Reprod 2009 Jun;24(6):1267-87. Epub 2009 Feb 18 Слайд 7 Протеомный подход – исследования секретома Изучить секретом человеческого эмбриона с помощью кондиционированных сред, полученных до переноса одной бластоцисты Найти связь с изменениями в секретоме эмбрионов с их имплантационными способностями с использованием протеомного подхода Исследовательские работы по секретому направлены на достижение двух основных целей: • Во-первых, изучить секретом человеческого эмбриона с последовательных сред, полученных до переноса одной бластоцисты. помощью • Во-вторых, найти связь с изменениями в секретоме эмбрионов имплантационными способностями с использованием белкового анализа. с их Слайд 8 Секретом эмбриона Секретом эмбриона был определен как группа белков, которые поглощаются или секретируются эмбрионом человека Секретом можно исследовать с помощью кондиционированной среды с использованием протеомных технологий Что такое секретом эмбриона? Секретом эмбриона был определен как группа белков, которые поглощаются или секретируются эмбрионом человека. Gadner и его научная группа представили это определение в своей статье, опубликованной в журнале Fertility and Sterility в 2006 году. Основное преимущество протеома заключается в том, что мы можем изучать профиль секреции и потребления белков, не касаясь бластоцисты, просто изучая состав среды, в которых растет эмбрион (т.е. метод неинвазивный). Мы можем легко обнаружить все белки, которые потребляются или выделяются эмбрионом по их появлению или исчезновению из кондиционированной среды. Katz-Jaffe MG, Gardner DK, Schoolcraft WB. Proteomic analysis of individual human embryos to identify novel biomarkers of development and viability. Fertil Steril 2006 Слайд 9 Белковые чипы В двух экземплярах исследуются 120 белков Среди них: цитокины, хемокины, факторы роста и другие важные для имплантации белки Используют отрицательный и положительный контроль Для анализа секретома в кондиционированных средах некоторые авторы использовали мембранный белковый чип, где в двух экземплярах исследуются 120 белков, в том числе цитокины, хемокины, факторы роста и другие важные для имплантации белки. В мембране были также включены отрицательный и положительный контроль. Каждое пятно соответствует одному антителу к одному известному белку. Для получения белкового профиля в различных анализируемых условиях образцы инкубировали вместе с этими чипами. Слайд 10 Секретом бластоцисты человека в культуральной среде Control media Контрольная среда Conditioned media Кондиционированная среда 5 blastocyst media pool Образцы 5 сред для бластоцист Protein array Белковый чип Data analysis Анализ данных В первой части тестирования мы хотели проанализировать секретом бластоцисты человека в культуральной среде. Для этого мы взяли несколько микрокапель контрольных сред (в нашем случае это была ССM) и несколько микрокапель культуральных сред, в которых культивировались эмбрионы (кондиционированные среды). Далее мы инкубировали образцы пяти сред, контрольных и кондиционированных, с мембранным чипом. Затем мы проанализировали каждое белковое пятно с помощью денситометрии и программного обеспечения для анализа изображений, которые позволили получить белковый профиль в каждой конкретной ситуации. Слайд 11 Секретом Содержание белков значимо отличалось (было выше или ниже) в контрольной среде (столбцы с точками) и в среде с бластоцистами (белые столбцы). В результате, сравнивая контрольные и кондиционированные среды, мы получили белковый профиль бластоцисты человека. Мы обнаружили, что среди всех изученных белков только четыре из них подвергались регуляции в присутствии бластоцисты. Три белка (CXCL13, SCF, и MSP-Alpha) «потреблялись» бластоцистой, а sTNFR1 секретировался бластоцистой в среду. Domínguez F, Gadea B, Esteban FJ, Horcajadas JA, Pellicer A, Simón C. Comparative protein-profile analysis of implanted versus non-implanted human blastocysts. Hum Reprod 2008 Sep;23(9):1993-2000 Слайд 12 Секретом бластоцисты человека в последовательных средах Control media Контрольная среда Implanted blastocysts Имплантировавшаяся бластоциста Non-implanted blastocysts Неимплантировавшаяся бластоциста 5 blastocyst media pool Образцы 5 сред для бластоцист Protein array Белковый чип Data analysis Анализ данных Мы решили сравнить белковые профили последовательных сред в соответствии с результатами имплантации. Таким образом, мы проанализировали среды имплантировавшихся и неимплантировавшихся эмбрионов, чтобы посмотреть, можно ли обнаружить некоторые биомаркеры жизнеспособности эмбрионов. Благодаря использованию программы селективного переноса одного эмбриона мы смогли по отдельности проанализировать среды имплантировавшихся и неимплантировавшихся бластоцист. Мы так же проинкубировали образцы пяти сред, контрольных и кондиционированных имплантировавшихся и неимплантировавшихся бластоцист с мембранным чипом. Затем мы проанализировали каждое белковое пятно и получили белковый профиль с помощью денситометрии и программного обеспечения для анализа изображений. Слайд 13 Имплантом Содержание белков значимо отличалось (было выше или ниже) между неимплантировавшимися (черные столбцы) и имплантировавшимися (белые столбцы) бластоцистами На этот раз мы получили то, что мы называем "имплантом". Из 120 изученных белков мы обнаружили только два, CXCL13 и GM-CSF, концентрация которых была ниже в кондиционированных средах от имплантировавшихся бластоцист. Это значит, что каким-то образом имплантировавшийся эмбрион потребляет эти два фактора из культуральной среды. Сейчас мы ждем появления усовершенствованных белковых чипов, чтобы расширить этот имплантом и получить большее число маркеров жизнеспособности эмбрионов. Domínguez F, Gadea B, Esteban FJ, Horcajadas JA, Pellicer A, Simón C. Comparative protein-profile analysis of implanted versus non-implanted human blastocysts. Hum Reprod 2008 Sep;23(9):1993-2000 Слайд 14 Исследования по метаболомике • Разработать неинвазивные методы обнаружения анеуплоидии в человеческих эмбрионах в программах ЭКО. • Проанализировать метаболомический профиль кондиционированных сред до переноса эмбрионов • Изучить метаболомический статус всего эмбриона Целями данного проекта являются: • Разработка неинвазивных методов обнаружения анеуплоидии в человеческих эмбрионах в программе ЭКО • Анализ метаболомического профиля кондиционированных сред до переноса эмбрионов и • Изучение метаболомического статуса всего эмбриона Слайд 15 Неинвазиавный метаболомический профиль Метаболиты представляют собой конечные продукты клеточных регуляторных процессов. Они позволяют определить реакцию биологических систем на генетические факторы, питательные вещества и на влияние окружающей среды Метаболомика зарекомендовал себя как надежная и быстрая постгеномная технология для распознавания и анализа биологических образцов, в том числе ооцитов и эмбрионов (Singh R. и соавт., Theriogenology 2007) Метаболиты представляют собой промежуточные или конечные продукты клеточных регуляторных процессов. Они позволяют определить реакцию биологических систем на генетические факторы, питательные вещества и на влияние окружающей среды. Метаболомика зарекомендовал себя как надежная и быстрая постгеномная технология для распознавания и анализа биологических образцов, в том числе ооцитов и эмбрионов. Singh R, Sinclair KD. Metabolomics: approaches to assessing oocyte and embryo quality. Theriogenology 2007 Sep 1;68 Suppl 1:S56-62 Слайд 16 Метаболомические технологии Metabolomic analysis Метаболомический анализ Metabolomics Метаболомика GС- MS Газовая масс-спектрометрия LC-MS Жидкостная масс-спектрометрия NMR Ядерно-магнитный резонанс sample Высокая чувствительность, подготовка образца, количественный анализ, определение метаболитов. Временные затраты – 5-140 мин metabolomics Неинвазивный метод определения метаболического профиля эмбриональной культуральной среды с помощью рамановской и ближней инфракрасной спектроскопии, коррелирует с репродуктивным потенциалом эмбрионов у женщин, проходящих лечение методом ЭКО Botros и соавт., Mol Hum Reprod 2007 Sensitive detection, preparation…… Noninvasive profiling…… Rapid global analysis…… Быстрый глобальный анализ, требующий минимальной подготовки образца, используется для классификации образцов, имеют ограниченные возможности для количественной оценки метаболитов и их идентификации, за исключением ЯМР В метаболомике отсутствует какая-то одна ведущая технология. У нас есть различные методы оценки метаболомического профиля. Мы можем разделить все методы на две группы. • Первая группа включает в себя методы масс-спектрометрии, как газовой, так и жидкостной. Эта группа имеет очень хороший высокочувствительный диагностический спектр, включает в себя сложный этап предварительной подготовки образца и его количественного анализа с использованием дорогой аппаратуры и с конечным выявлением метаболитов. Время анализа колеблется от 5 до 140 мин. • Вторая группа включает в себя такие методы, как спектроскопию, в том числе ядерномагнитный резонанс (ЯМР) и инфракрасную технологию (инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье). Это методы быстрого глобального анализа, требующие минимальной подготовки образца, используются для классификации образцов, имеют ограниченные возможности для количественной оценки метаболитов и их идентификации, за исключением ЯМР. В последнее время отбор жизнеспособных эмбрионов проводится с помощью ближней инфракрасной спектроскопии. Botros L, Sakkas D, Seli E. Metabolomics and its application for non-invasive embryo assessment in IVF. Mol Hum Reprod 2008 Dec;14(12):679-90 Слайд 17 Опубликованные исследования по метаболомике Некоторые исследования по метаболомике уже опубликованы. Все публикации принадлежат исследовательской группе доктора Sakkas. Данные были получены с помощью рамановской и инфракрасной спектроскопии для прогнозирования репродуктивого потенциала отобранных эмбрионов. Для оценки имплантационного потенциала они вычисляли индекс жизнеспособности, основанный на исследовании метаболомики кондиционированных сред. В данное исследование было включено в общей сложности 333 пациентки, у которых планировалось проведение экстракорпорального оплодотворения с селективным переносом одного эмбриона. Отбор эмбрионов для переноса проводился на основании морфологических критериев на 2-й и 3-й день культивирования, а супернатант культуральной среды был проанализирован с помощью ближней инфракрасной спектроскопии. . Слайд 18 Опубликованные исследования по метаболомике Хотя в метаболомических исследования наиболее часто использовалась рамановская спектрометрия, применялись и другие методы, такие как ядерно-магнитный резонанс. В исследованиях другой рабочей группы под руководством д-ра Бернса для оценки корреляции с имплантационным потенциалом кондиционированные среды анализировали с помощью ЯМР. Слайд 19 Выводы • Чтобы найти маркеры развития эмбриона и имплантации можно использовать протеомный подход с анализом секретома эмбриона. • Для определения маркеров развития эмбриона и имплантации могут быть использованы метаболомные подходы с применением различных технологий и анализом сред, в которых культивировались эмбрионы. • Неинвазивные подходы являются новым потенциальным инструментом по исследованию жизнеспособности эмбрионов и их имплантации в клиниках ЭКО. В заключение следует отметить, что из этой главы мы узнали, что • Чтобы найти маркеры развития эмбриона и имплантации можно использовать протеомный подход с анализом секретома. • Для определения маркеров развития эмбриона и имплантации могут быть использованы метаболомные подходы с применением различных технологий и анализом сред, в которых культивировались эмбрионы. • Неинвазивные подходы являются новым потенциальным инструментом по исследованию жизнеспособности эмбрионов и их имплантации в клиниках ЭКО.