КРИОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ ЭМБРИОНОВ КОЗ В ЗАВИСИМОСТИ

УДК 636.39:611.013
Криорезистентность эмбрионов коз в зависимости от стадии
развития
А.-М.М. Айбазов, д.с.-х.н, проф., Т.В. Мамонтова, к.с.-х.н.
ГНУ СНИИЖК Россельхозакадемии
Одним
из
эффективных
биотехнологических
приемов,
направленных на сохранение генофонда высокоценных животных,
является метод криоконсервации гамет. Технология замораживания
спермиев различных животных достаточно хорошо разработана и
успешно применяется в науке и практике животноводства, в том числе и
в международных экспериментах, созданы криобанки спермы [1,2,3]. Что
касается криоконсервации эмбрионов, то этот метод не нашел широкого
применения в нашей стране из-за низкой приживляемости
дефростированных зигот. В то же время преимущество криохранилища
(банка) эмбрионов перед банком половых клеток заключается в том, что
эмбрион представляет собой полноценную биологическую особь,
которую достаточно пересадить самкам-реципиентам, чтобы родилось
потомство.
За рубежом криоконсервация эмбрионов применяется уже
несколько десятилетий (в основном в скотоводстве), однако до сих пор
еще нельзя однозначно трактовать ее как эффективную биотехнологию,
слишком вариабельны результаты и велик процент брака [4]. В нашей
стране предпринимались попытки криоконсервировать эмбрионы
крупного рогатого скота, однако не нашли широкого применения
Что же касается замораживания эмбрионов у коз, то впервые такие
попытки были предприняты нами в 2011 г. При работе с определенным
видом животных вдобавок к общепринятым методам криоконсервации
зародышей появляется необходимость разрабатывать целый пакет
репродуктивных технологий, наиболее подходящий именно для этого
вида.
Методика экспериментов. Исследования проводили на опытной
станции ГНУ СНИИЖК Россельхозакадемии. В половой сезон были
отобраны козы – доноры. У них индуцировали полиовуляцию по
оригинальной схеме: для синхронизации полового цикла в качестве
пролонгаторов лютеиновой фазы использовали
ушные импланты
«Крестар» (действующее вещество норгестамет); для ее прерывания и
стимуляции оогенеза – «Фоллигон» в дозе 500 ед. и «Оваген» в общей
дозе 8 мл. Синхронность овулирования созревших фолликулов
обеспечивали применением «Хорулона» – 300 ед.
В качестве среды для культивирования использовали собственную
среду для криоконсервации эмбрионов коз [5]. Отмывку оттаянных
ооцитов/эмбрионов
после
криопротектора
и
их
дальнейшее
культивирование осуществляли в той же среде.
Для замораживания отбирали оплодотворенные ооциты, эмбрионы
на стадии 2-х, 4-х и более бластомер, а также эмбрионы, достигшие
стадии морулы. После эквилибрации гаметы помещали в пайеты
(соломинки) для замораживания спермы. Соломинки после фасовки в
них гамет запаивали ультразвуком, используя для этого линию по
криоконсервации IMV (Франция). Оттаивание пайет проводили в
водяной бане при 40ºС.
В эксперименте определяли устойчивость эмбрионов к
криоконсервации в зависимости от их стадии развития.
Результаты исследований. В основу оценки качества эмбрионов
коз была положена общепринятая классификация эмбрионов по
качеству:
1-й
день
развития.
Оценивается
наличие
признаков
оплодотворения и качество зигот. Наличие в яйцеклетке 2-х
пронуклеусов (PN) и 2-х полярных тел (PB) указывает на нормальное
развитие
процесса
оплодотворения.
Отмечают:
размер
и
симметричность пронуклеусов, число, количество, равность и
распределение нуклеолей, включения цитоплазмы;
2-й день развития. На 2-е сутки после слияние генетического
материала сперматозоида и яйцеклетки происходит первое дробление.
Отмечают: степень фрагментации, форму и относительные размеры
бластомеров.
Тип А – эмбрион отличного качества без ануклеарных
(безъядерных) фрагментов (4А);
Тип В – эмбрион хорошего качества с содержанием ануклеарных
фрагментов до 20% (4В);
Тип С – эмбрион удовлетворительного качества с содержанием
ануклеарных фрагментов от 21 до 50% (4С);
Тип D – эмбрион неудовлетворительного качества с содержанием
ануклеарных фрагментов более 50% (4D).
3-й день развития. Эмбрион состоит из 6-8 бластомеров.
4-й день развития. Эмбрион состоит из 10-14 бластомеров,
межклеточные контакты уплотняются и поверхность эмбриона
сглаживается (процесс компактизации) - стадия морулы.
В процессе экспериментов были установлены следующие видовые
особенности в морфологии эмбрионов коз:
- яйцеклетка и ранний эмбрион покрыты обильным слоем
внутриклеточного жира. Для объективной оценки и работы с клетками
необходимо их обязательное центрифугирование.
-мужской и женский пронуклеусы в оплодотворенной яйцеклетке
козы одного размера, ядрышки при световой микроскопии, как правило,
не различимы.
Результаты криоконсервации эмбрионов коз представлены в
таблице.
Таблица 1- Результаты криоконсервации эмбрионов разного возраста
Время
культивирования
после дефростации
Восстановление
формы и размера,
шт./%
Через 24 ч., шт./%
Через 48 ч., шт./%
Стадия развития и выживаемость эмбрионов коз
4-х
оплодотв.
2-х бласт.
6-8 бласт.
морулы
бласт.
ооциты
эмбрионы
эмбрионы
эмбрион
(n=5)
(n=4)
(n=2)
(n=3)
ы (n=4)
5/100
3/75
3/75
0/0
2/66,6
5/100
3/60
3/75
2/50
2/50
2/50
-
1/33,3
1/33,3
Из таблицы видно, что восстановление формы и размера
происходило у 100% ооцитов, в то время как все 6-8-бластомерные
зародыши погибли. Через 48 часов культивирования лишь 60% ооцитов
и 50% 2-4-бластомерных эмбрионов остались жизнеспособными.
В эксперименте отмечен интересный факт, требующий своего
объяснения, - эмбрионы на стадии морулы снова приобретали
способность переносить глубокое замораживание.
Таким образом, в результате экспериментов были установлены
дополнительные критерии оценки качества и витабельности эмбрионов
коз, доказана принципиальная возможность обратимого анабиоза гамет
коз после криоконсервации при сверхнизких температурах (-196°С) и
определены оптимальные параметры режима криоконсервации.
Наилучшая устойчивость к криоконсервации была отмечена у ооцитов и
2-4-бластомерных эмбрионов, а также
у морул. Для того чтобы
удостовериться
в
жизнеспособности
эмбрионов,
рекомендуем
культивирование эмбриона/оплодотворенной яйцеклетки в инкубаторе в
5% СО2 в течение 1 суток при 39оС. Если эмбрион продолжает развитие,
он считается пригодным для криоконсервации.