Cовременные методы молекулярно-генетической диагностики в

ПРЕИМПЛАНТАЦИОННАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ
ДИАГНОСТИКА
____________________ ГРУППА КОМПАНИЙ МАТЬ и ДИТЯ ______________________
Настоящее и
перспективы
АПРЕЛЬ 2014
МОСКВА
Содержание.
• Преимплантационная генетическая диагностика. Виды.
• Биопсия эмбрионов. Техника. Полярные тельца,
бластомеры, трофектодерма.
• Методы ПГД. Прошлое. Настоящее. Перспективы.
• Результаты собственных наблюдений.
• Выводы.
2
Введение
• Преимплантационная генетическая
диагностика (ПГД) – это комплекс
мероприятий, позволяющих исследовать
генетический статус эмбриона еще до его
попадания в полость матки и
наступления беременности.
3
Виды ПГД
• ПГД хромосомного дисбаланса (скрининг
анеуплоидий, транслокации)
• ПГД моногенных заболеваний
• ПГД+HLA типирование
• ПГД болезней с поздней манифестацией
• ПГД при высокой вероятности развития
онкологических заболеваний
4
ПГД хромосомного дисбаланса
(скрининг анеуплоидий, транслокации)
• Наличие изменений в кариотипе
супругов.
• Старший репродуктивный возраст
• Привычное невынашивание
• Мужской фактор бесплодия
• 3 и более неудачных попытки ЭКО в
анамнезе (при переносе эмбрионов
хорошего качества).
5
ПГД хромосомного дисбаланса
(скрининг анеуплоидий, транслокации)
Изменения в кариотипе:
- Численные аномалии хромосом (45X0, 47 XXY)
- Структурные перестройки (робертсоновские 45XY
t13:14(q10;q10) и реципрокные (46XX t7:9 (p14;q31)
транслокации, инверсии)
- Изменение количества гетерохроматина на плече
одной или нескольких хромосом (9qh+, 16qh+,
21qh+ и др.)
6
ПГД при робертсоновских
и реципрокных транслокациях.
Munne S. et al. reviewing of PGD in ART, 2010
7
Проблемы программ ПГД.
• Низкая настороженность врачей
районных консультаций.
• Недостаточный уровень грамотности
пациентов.
• Отсутствие программ дородового
скрининга.
• Консервативная тактика ведения
пациентов.
8
ПГД моногенных заболеваний.
ЗАЧАТИЕ
АБОРТ
БЕРЕМЕННОСТЬ
ПРЕНАТАЛЬНАЯ
ПРЕНАТАЛЬНЫЙ
ДИАГНОСТИКА
СКРИНИНГ
9
ПГД моногенных заболеваний.
• Медико-генетическое консультирование.
• Подтверждение носительства заболевания в
семье.
• Создание уникальной диагностической панели
для каждого случая.
• Отработка методик на единичных клетках.
• ПГД.
• Пренатальная диагностика!!!
10
ПГД онкологических заболеваний.
• Рак молочной железы и рак яичников
мутации генов BRCA1 и BRCA2
• Рак щитовидной железы
наличие протоонкогена RET
• Рак почки
мутации гена VHL (синдром ХиппельЛандау)
11
ПГД болезней с поздней манифистацией.
• Хорея Хантингтона
• Болезнь
Паркинсона
• Болезнь
Альцгеймера
• Шизофрения
• Сахарный диабет II
типа
• Эпилепсия
12
Показания к ПГД
с HLA типированием
Тяжелые
заболевания
системы
кроветворения,
требующие трансплантации HLA совместимых ГСК
донора.








Талассемия
Анемия Фанкони
Синдром Вискота-Элдрихта
Анемия Даймонд-Блэкфанд
Х-сцепленный гипер IgM синдром
Х-сцепленная адренолейкодистрофия
Х-сцепленная
гипогидротическая
дисплазия с иммунодефицитом
Апластическая анемия
эктодермальная
Для таких заболеваний, как острый лимфолейкоз.
13
Биопсия эмбрионов. Техника.
Полярные тельца, бластомеры,
трофектодерма.
14
Способы локального разрушения
блестящей оболочки
• Механический хэтчинг (блестящая
оболочка надсекается Т- или Х-образно с
помощью острой стеклянной микроиглы)
• Химический хэтчинг (с помощью кислого
раствора Тирода, рН 2.2)
• Лазерный хэтчинг.
15
Варианты хетчинга: Механический
• Технически сложен
• Занимает много
времени
• Необходим третий
микроинструмент
• Дешевизна
16
Варианты хетчинга: химический
• Эмбриотоксичен
• Технически сложен
• Занимает много
времени
• Дешевизна
17
Варианты хетчинга: лазерный
• Прост в применении
• Занимает мало времени
• Позволяет работать с
высокой точностью
• Вызывает изменение
температуры среды
• Требуется дорогостоящее
оборудование
18
Стадии развития эмбриона человека.
19
Генетический материал для
исследования.
•1 и 2 полярные тельца
•Бластомеры
•Трофектодерма
20
Биопсия полярного тела.
www.glowm.com
21
Биопсия бластомера.
22
Техника биопсии ТЭ
Вариант 1: Эмбрион с уже имеющимся отверстием в
zona pellucida с выступающими клетками вдали от ВКМ
• Захват и тракция выступающих клеток биопсийной пипеткой
• Отделение клеток с помощью лазера
• Механическое отделение клеток с помощью пипеткихолдинга
J.Taylor, NewLife, Epsom, UK, Research Instruments
23
Техника биопсии ТЭ
Вариант 2: Бластоциста без выступающих
клеток/начала хэтчинга
• Перфорация zona pellucida с помощью лазера
• Культивирование бастоцисты с контролем начала хетчинга
• Использование тонкой пипетки для биопсии (14µm)
J.Taylor, NewLife, Epsom, UK, Research Instruments
24
Техника биопсии ТЭ
Вариант 3: ВКМ расположена непосредственно в
месте вылупления или около него
• Расширение имеющегося отверстия zona pellucida
• Второе отверстие в zona pellucida на расстоянии от
вылупляющейся ВКМ
• Полный хетчинг бластоцисты
J.Taylor, NewLife, Epsom, UK, Research Instruments
25
Биопсия трофектодермы.
26
Проблемы
• Техническая сложность выполнения
• Слишком короткое время для проведения
генетического анализа, выход за рамки «окна
имплантации»
• Малое количество либо отсутствие бластоцист на
5-6 сутки культивирования
• На 2010 год примерно 90% случаев PGD
выполнено на 3-сутки (Harper et al., 2010)
27
Условия
• Отработанная современная лабораторная
технология культивирования эмбрионов до 5-х
суток
• Лазерная установка
• Высокоэффективная технология
криоконсервации биологического материала
(витрификация)
• Обученный персонал
• Адекватные методы генетического анализа
(PCR, FISH, CGH)
28
Преимущества
• Большее количество клеток для анализа
• Меньшая травматизация эмбриона (Treff
N.R., Ferry K.M. et al., 2011), отсутствие
риска фатальных последствий для
эмбриона в следствие его «полярности»
• Меньшее количество эмбрионов на
биопсию, работа с заведомо
развивающимися эмбрионами
29
Биопсия эмбрионов. День 3 или 5?
30
Биопсия эмбрионов. День 3 или 5?
31
Методы ПГД. Прошлое. Настоящее. Перспективы.
32
Методы ПГД.
Флуоресцентная гибридизация in situ
Преимущества:
Самый распространенный метод исследования
Имеются готовые коммерческие наборы, высокая воспроизводимость
результатов.
Недостатки:
Существенные ограничения метода. Токсичность.
Необходимость заказа специфических зондов для диагностики
транслокаций.
Сложности с интерпретацией результатов.
Относительная дороговизна.
Невозможность проведения ПГД моногенных заболеваний.
33
Методы ПГД.
Количественная флуоресцентная ПЦР.
Преимущества:
 Возможность выполнения всех видов ПГД
 Дешевизна расходных материалов
 Скорость выполнения исследований.
Возможность одновременного проведения ПГС и ПГД.
Недостатки:
 Отсутствие коммерческих наборов.
 Необходимость валидации метода.
 Высокая доля интеллектуального труда
34
Методы ПГД.
Сравнительная геномная гибридизация (aCGH)
Преимущества:
Возможность молекулярного кариотипирования эмбрионов
Возможность выявления протяженных дупликаций и делеций
Наличие коммерческих продуктов
Конкуренция производителей (относительно невысокая стоимость
оборудования)
Недостатки:
Невозможность диагностики моногенных заболеваний.
Ограничение по количеству анализируемых эмбрионов.
 Высокая стоимость расходных материалов.
35
Методы ПГД.
Next Generation Sequencing (NGS), aSNP
Преимущества:
Возможность молекулярного кариотипирования эмбрионов
Возможность выявления микро и макро перестроек (от 10 п.н.)
Возможность одновременной диагностики моногенных заболеваний
Низкая себестоимость расходных материалов
Недостатки:
Высокая стоимость оборудования
Необходимость разработки ПО для анализа данных
Высокое давление со стороны производителей aCGH 
36
aCGH или SNP (NGS)
37
Результаты собственных наблюдений.
2008-2013
38
РЕЗУЛЬТАТЫ.
Преимплантационный генетический скрининг
Биопсия
бластомера
Биопсия
трофектодермы
Всего
Пациентов
389
22
Средний возраст пациентов
38±4,7
39 ± 2,9
-
Кол-во диагностик
423
26
449
Получено бластомеров/тэ
3192
92
3284
Не получено результатов
62 (1,9%)
3 (3,3 %)
Проанализировано
эмбрионов(получены данные)
3130
89
3219
Патология
1994 (63,7 %)
53 (59,6 %)
2047 (63,6 %)
Норма
1136 (36,3 %)
36 (40,4 %)
1172 (36,4 %)
39
РЕЗУЛЬТАТЫ.
ПГД робертсоновских транслокаций.
Биопсия
бластомера
Биопсия
трофектодермы
Всего
Пациентов
34
1
Средний возраст пациентов
34±2,9
38
-
Кол-во диагностик
42
1
43
Получено бластомеров/тэ
310
4
314
Не получено результатов
4 (1,2 %)
0
Проанализировано
эмбрионов(получены данные)
306
4
310
Патология
238 (78 %)
3(75 %)
241(78 %)
Норма
68 (22 %)
1 (25 %)
69(22 %)
40
РЕЗУЛЬТАТЫ.
ПГД реципрокных транслокаций.
Биопсия
бластомера
Биопсия
трофектодермы
Всего
Пациентов
48
2
Средний возраст пациентов
33±5,2
34 ± 1,9
-
Кол-во диагностик
62
5
67
Получено бластомеров/тэ
414
19
433
Не получено результатов
8 (1,9%)
1 (5,2 %)
9
Проанализировано
эмбрионов(получены данные)
406
18
424
Патология
337 (83 %)
16 (78%)
353 ( 82,8 %)
Норма
69 (17 %)
4 (22 %)
73 (17,2 %)
41
РЕЗУЛЬТАТЫ.
ПГД моногенных заболеваний.
Биопсия
бластомера
Биопсия
трофектодермы
Всего
Пациентов
53
2
Средний возраст пациентов
38±4,4
31,3
-
Кол-во диагностик
64
2
67
Получено бластомеров/тэ
349
12
361
Не получено результатов*
26 (7,4 %)
2
28
Проанализировано
эмбрионов(получены данные)
323
10
333
Патология
252 (78 %)
7 (70%)
259( 77,7 %)
Норма
71 (28 %)
3 (30 %)
74 (22,3%)
42
Другие ПГД
Показания
PGD+HLA
HLA для СД
Онко (RET)
Пациентов
2
1
1
Средний возраст
пациентов
34,5
36
33
Кол-во диагностик
3
2
1
Получено бластомеров/тэ
34
17
7
Не получено результатов*
2
0
0
Проанализировано
эмбрионов(получены
данные)
32
17
7
Патология
29 (91 %)
12 (70,6 %)
4 (57 %)
Норма
3 (9 %)
5 (29,4 %)
3 (43 %)
43
ВЫВОДЫ
44
ВЫВОДЫ
Квалифицированное медико-генетическое консультирование позволяет
женщине раньше прибегнуть методам ВРТ с ПГД и сохранить репродуктивное
здоровье.
Для каждой поставленной задачи необходимо использовать
определенные методы диагностики, помня об их преимуществах и недостатках.
Необходимо коллегиальное принятие решение врачом, эмбриологом
и генетиком о выборе метода биопсии в каждом конкретном случае.
Диагностика с помощью биопсии трофектодермы дает наиболее полную
картину о генетическом статусе эмбриона.
45
НАШИ ПАРТНЕРЫ
 Клиники ГК Мать и Дитя (ПМЦ, Мать и Дитя, Клиника Здоровья, Мать и Дитя (Уфа)
Мать и Дитя (Иркутск), ИДК (Самара»), Мать и Дитя (Санкт-Петербург),
Мать и Дитя (Пермь))
Москва (ЗАО «Клиника», Эндокринологический научный центр РАМН, ГОсВРТ ЦКБ РАН,
ООО «МЕДЭКО», ООО «МЕДИНВЕСТ», ООО «ЭКО-ЦЕНТР», ЗАО «Поколение NEXT»,
НЦАГиП им. В.И. Кулакова, ООО «ЛЕРА», ООО МЦ «МирА», ООО «НОВЕЛЛА К»,
ОАО «МЕДИЦИНА», ООО МЦ «ВРТ», ЦПСиР)
Самара (ГБУЗ СО КЦКТ, ООО «Клиника ЭКО»
Санкт-Петербург (ООО «МЦРМ»)
Саратов (ЗАО «Клиника Доктора Парамонова»)
Краснодар (ООО СП «Эмбрио»)
Иваново
Новокузнецк
46
Контакты
Михаил Иванов
_________________________________________________________________________
24 к. 1, Севастопольский проспект,
Москва, Россия, 117209
www.mcclinics.com
m.ivanov@mospmc.ru
МЫ ОТКРЫТЫ К
СОТРУДНИЧЕСТВУ.
47