Роль морфологической оценки ооцита и эмбриона при

doi: 10.17116/repro20152154-58
Роль морфологической оценки ооцита и эмбриона при использовании
вспомогательных репродуктивных технологий (обзор литературы)
К.м.н. О.Е. КРАСНОЩОКА1, д.м.н., в.н.с. В.Ю. СМОЛЬНИКОВА2, д.м.н., рук. отд. Е.А. КАЛИНИНА2,
к.б.н., эмбриолог, рук. отд. В.В. ЕЛАГИН1
ООО Медицинский центр «МирА» (гл. врач — Н.П. Какучая), Москва, Россия, 119334; 2ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии
и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» (дир. — акад. Г.Т. Сухих) Минздрава России, Москва, Россия, 117997
1
В обзоре приведены данные о существующей классической практике визуальной морфологической оценки ооцитов и
эмбрионов в современной клинической репродуктологии. Приведены структурно-функциональные временно-обусловленные
особенности ооцита и эмбриона в условиях наблюдения in vitro, влияющие на наступление беременности в программе ЭКО.
Ключевые слова: ооцит, эмбрион, качество гамет, морфологическая оценка.
The role of morphological evaluation of oocyte and embryo quality in ART programs
(a review)
O.E. KRASNOSCHOKA1, V.YU. SMOLNIKOVA2, E.A. KALININA2, V.V. ELAGIN1
1
Medical Center «MirA», Moscow, Russia, 119334; 2Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Acad. V.I.
Kulakov of the Ministry of Healthcare of Russia, Moscow, Russia, 117997
The review describes the data on existing classical practice of visual morphological assessment of oocytes and embryos provided in
modern clinical assisted reproduction. Structural and functional characteristics of oocytes and embryos in vitro influencing the
pregnancy outcomes after ICSI are described.
Key words: oocyte, embryo, gamete quality, morphological evaluation.
В настоящее время существуют различные системы оценки качества гамет и эмбрионов в условиях
in vitro. При этом основная роль принадлежит морфологической оценке на эмбриологическом этапе
программы экстракорпорального оплодотворения и
переноса эмбрионов (ЭКО и ПЭ) [1].
Процессы раннего эмбрионального развития, по
данным литературы, рассматриваются с позиции
перехода от ооцита к эмбриону (oocyte-to-embryo
transition), что обусловливает необходимость качественного отбора ооцитов на преконцепционном
этапе с целью получения эмбрионов, имеющих высокий шанс к имплантации [2].
Цель настоящего обзора — продемонстрировать
структурно-функциональные последовательно изменяющиеся морфологические особенности ооцитов, эмбрионов, полученных в результате оплодотворения, и обосновать необходимость проведения динамического наблюдения в программе ЭКО.
Важным аспектом программы ЭКО является получение зрелых ооцитов, находящихся на стадии
мейоза II (МII), способных к оплодотворению in vitro
[3, 4]. Существуют различные классификации, описывающие структурные особенности женских гамет.
54
По данным отечественных источников [5], существует ограниченное количество работ, посвященных данной теме, при этом отсутствуют указания на
взаимосвязь тех или иных критериев качества с основными показателями результативности ЭКО. Относительно недавно в клиническую практику стала
внедряться система оценки ооцитов на стадии MII
— MOMS (MII oocyte morphological score), которая
продемонстрировала значимую взаимосвязь уровня
баллов по шкале MOMS и наступления беременности [6].
Наиболее точную оценку ооцита возможно произвести после денудации ооцита из ооцит-кумулюсного комплекса в программе интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ) [6—
8].
В циклах стимуляции суперовуляции встречаются ооциты с различными повреждениями [9]. Аномалии ооцита можно условно разделить на экстрацитоплазматические и цитоплазматические. К экстрацитоплазматическим относятся нарушение формы и
e-mail: mydiss@mail.ru
Проблемы репродукции, 1, 2015
организации прозрачной оболочки ооцита, дебрис в
перивителлиновом пространстве, аномалии первого
полярного тельца (расположение, увеличение в размере, фрагментация, дегенерация), а также нарушение симметрии цитоплазматической мембраны
ооцита. К цитоплазматическим аномалиям, определяемым на световом уровне, относят зернистость
цитоплазмы, агрегаты гладкого эндоплазматического ретикулума, рефрактерные тела, вакуоли, нарушение вязкости цитоплазмы [6—9]. При помощи поляризационной микроскопии возможна визуализация
веретена деления [10]. Для качественного ооцита веретено деления ооцита стадии МII не должно быть в
позиции перед первым полярным тельцем, при этом
изменение температуры в пределах 1 °С может значительно изменить структуру веретена деления. У
некоторых ооцитов, имеющих первое полярное
тельце, может не быть видимого в поляризационном
микроскопе веретена деления. Поляризационная
микроскопия дает возможность оценки веретена деления и позволяет прогнозировать течение процесса
оплодотворения и последующего дробления развившегося в результате оплодотворения эмбриона [11,
12].
Качество ооцита является важным прогностическим фактором, так как ядерная и цитоплазматическая зрелость клетки напрямую связана с эффективностью цикла ИКСИ [8, 13]. Основными причинами
выявляемых изменений являются анеуплоидии
ооцитов и гипоксия. Предполагают, что интрафолликулярная гипоксия ведет к снижению рН в течение мейоза, что отражается на формировании веретена деления, приводит к повышению частоты анеуплоидий [14].
В ранних исследованиях плоидности зрелых
ооцитов стадии МII показано, что частота анеуплоидий составляет более 50% [10]. Анеуплоидии в ооците происходят вследствие нерасхождения хромосом,
задержки анафазы, преждевременного движения
центриолей в течение преовуляторного мейоза [15].
Вследствие хромосомных дефектов происходят
специфические нарушения на клеточном уровне в
виде цитоплазматического дисморфизма, описанного для ооцитов [10]. Значительное кластирование органелл коррелирует с высокой степенью анеуплоидии, другие аномалии связаны с нарушением сегрегации эндоплазматического ретикулума и митохондрий [16—18].
В качестве основной причины самопроизвольного прерывания беременности ранних сроков отмечают нарушение морфологии ооцита [10, 19]. При
повторных неудачах программ ЭКО и ПЭ явление
клеточного дисморфизма — аномалий устройства
цитоплазмы, может быть причиной идиопатического бесплодия, в основе которого лежит хроническая
анеуплоидия [20]. Присутствие в ооците генетических дефектов на хромосомном и геномном уровне в
некоторых случаях может не оказывать влияние на
фенотип эмбриона, который по морфологическим
характеристикам может не уступать остальным нормальным эмбрионам на 2—3-и сутки дробления [14].
Сочетание световой и поляризационной микроскопии позволяет оценивать специфические морфологические характеристики полученных ооцитов [5, 8].
По данным последнего систематического обзора
L. Rienzi и соавт. [6], анализ 50 публикаций за последние 15 лет продемонстрировал необходимость
пристального внимания эмбриолога к комплексу
наиболее значимых критериев качества ооцита —
оценка ооцит-кумулюсного комплекса, прозрачной
оболочки, перивителлинового пространства, морфологии первого полярного тельца, формы ооцита,
структуры цитоплазмы, веретена деления. Рассматриваемые по отдельности, эти параметры имеют
низкую диагностическую эффективность.
Оценка эмбриона по морфологическим
параметрам
В настоящее время в клинической практике проводится оценка качества эмбрионов по морфологическим характеристикам на основании системы динамического наблюдения (sequential embryo selection,
SES) [22, 23, 26—28].
Представляет интерес морфологическая оценка
качества эмбрионов на основании кумулятивного
эмбрионального счета (cumulative embryo score,
CES), разработанного C. Steer и соавт. в 1992 г. и модифицированного в 2007 г. группой ученых под руководством J. Holte путем добавления к CES интегративного морфологического описания дробящихся эмбрионов [23, 27]. Данная классификация оценивает совокупность скорости дробления эмбрионов, симметричности бластомеров, степени цитоплазматической фрагментации, мультинуклеарности бластомеров и присваивает эмбриону баллы по
каждому критерию. По данным L. Rienzi и соавт.
[29], система MOMS имеет преимущества перед CES
по частоте наступления беременности и родов.
Для оценки эмбриона 1-х суток дробления используются методики определения структуры «halo»,
морфологии
пронуклеусов,
предшественников
ядрышек (nucleolar precursor bodies, NPB) [30, 31].
Исследования внутрицитоплазматического движения показали появление полупрозрачной зоны у
перикортикальной мембраны («halo» — сияние).
Этот динамический процесс, описанный как волнообразная активность, или цитоплазматическое волнение, происходящее в течение перисингамической
стадии, свидетельствует о полноценности эмбриона
на стадии зиготы [24].
Мужской и женский пронуклеусы появляются
по периферии ооцита и вращаются относительно
центра 16—18 ч после оплодотворения. Пронуклеусы должны иметь одинаковый размер. При различии
55
Морфологическая оценка ооцита и эмбриона при ВРТ
в размерах пронуклеусов высока вероятность анеуплоидии [31]. Для NPB предложена методика оценки
следующих параметров: числа, позиции, расположения, размера. Равное расположение относительно
оси перекрытия пронуклеусов, оптимальное число
(5—7), размер NPB коррелируют с возможностью
развития эмбриона до стадии бластоцисты [15, 30,
32].
В течение периода развития ооцита, со стадии
примордиального до MII, нуклеоли активно синтезируют протеины и распределяют их по определенным зонам ядра до включения собственного генома
эмбриона. Нуклеоли являются центрами продукции
мРНК [4]. Ростовые факторы и регуляторные белки
также продуцируются в нуклеолях. Эти участки ядра
являются нуклеолярными организационными регионами (nucleolar organization regions, NOR) ядра. Гетерохроматин пяти хромосом 13, 14, 15, 21, 22 сцеплен с NOR. Именно с этими хромосомами связана
наибольшая частота анеуплоидий, что подчеркивает
важность строгой компартментализации ядра, определяющей качество ооцита и эмбриона [32, 33]. Нуклеоли состоят из трех функциональных компонент:
— плотного фибриллярного комплекса DFC
(dense fibrillic complex), который важен для процесса
транскрипции;
— фибриллярного комплекса FC (fibrillic component), который участвует в инактивации транскрипционных факторов;
— гранулярно-цитоплазматического комплекса
GC (granular-cytoplasmatic component) [4].
Визуализация данных структур свидетельствует о
функционировании NPB (так как они и являются
собственно FC регионами) и указывает на присутствие гетерохроматина хромосом 13, 14, 15, 21, 22 в
веретене деления. NPB появляются, когда хроматин
конденсируется в митотическое веретено, что происходит к моменту пенетрации сперматозоида. Появление одного пронуклеуса может означать быструю или, наоборот, отложенную конденсацию
хроматина в ядре, что связано с аномалиями развития, а именно анеуплоидиями [5, 10, 25, 29, 31, 34].
Работами многих авторов [29, 31] показано, что
именно 1-е сутки дробления определяют качество
эмбриона. Оптимальным является время вступления
в первое митотическое деление через 23—24 ч после
инсеминации ооцитов, однако оно может варьировать в сторону увеличения до 4 ч, что не является
плохим прогностическим признаком [29]. После
проникновения сперматозоида формируются пронуклеусы, оплодотворение завершается первым митотическим делением и формированием двухклеточного эмбриона.
Расположение веретена деления влияет на дальнейшее дробление. Если веретено поляризовано, то
это может приводить к формированию эмбриона с
неравными по размеру бластомерами. Аномальный
56
цитокинез может приводить к патологической бластуляции, выражающейся в различиях размеров клеток во внутренней клеточной массе (inner cell mass,
ICM) более чем на 30%, дефектам дальнейшего развития [10, 22, 35, 36]. На четырехклеточной стадии
один из четырех бластомеров продолжает свое развитие в клетки, продуцирующие хорионический гонадотропин (ХГ), что является сигналом для эндометрия и подготовки к имплантации [10]. Достижение
эмбрионом стадии четырех бластомеров происходит
через короткую трехклеточную стадию. Длительная
задержка на стадии трех, четырех бластомеров является неблагоприятным прогностическим признаком
[23]. Важным для развития эмбриона является наличие ядра в каждом бластомере. Отсутствие ядра может свидетельствовать о том, что бластомер находится в переходной стадии. Через 42—44 ч после оплодотворения все бластомеры должны иметь ядра.
Фрагментация ядер бластомеров коррелирует с низким качеством эмбриона и неблагоприятным исходом ЭКО и ПЭ [22, 30, 31]. Увеличение количества
ядер происходит при аномальном кариокинезе или
вследствие аномальной сегрегации хромосом, более
70% мультинуклеарных эмбрионов являются анеуплоидными [30].
По достижении четырехклеточной стадии бластомеры уменьшаются в 2 раза и до стадии восьми
бластомеров не увеличиваются в размерах. Оценка
эмбриона происходит на 3-и сутки дробления (64—
66 ч после инсеминации ооцитов) в течение перехода
от шести к восьми бластомерам, что может происходить очень быстро. На этой стадии исследуют число
бластомеров (в норме 6—8), фрагментацию (в норме
отсутствует или менее 10%), размер и соотношение
бластомеров, количество ядер в бластомерах [29, 37].
Для 4-х суток дробления (66—112 ч после инсеминации ооцитов) характерной чертой эмбрионов
является компактизация бластомеров и формирование морулы. Работами многих авторов показано, что
ранняя компактизация и достижение стадии морулы
в конце 3-х суток дробления, а также раннее начало
процесса кавитации (формирования полостей между
клетками морулы) являются благоприятными прогностическими признаками в отношении хорошего
качества эмбриона [38].
На 5-е сутки дробления (113—116 ч после инсеминации ооцитов) происходит формирование бластоцисты. Работами многих авторов показана связь
морфологии бластоцисты с исходом программ ВРТ
[30, 32]. Эмбрион, развивающийся аномально в 1—3-и
сутки дробления, может формировать нормальную
по морфологии бластоцисту [39]. Признаками бластоцисты хорошего качества являются неповрежденные клетки, отсутствие гранулярных включений, хороший контакт между клетками, четкие контуры у
80% клеток, оптимальное соотношение бластоцели и
клеточной массы. Наиболее используемой в настоя-
Проблемы репродукции, 1, 2015
щее время является классификация бластоцист по
D. Gardner и W. Schoolcraft [40].
Морфологические критерии для ооцитов и эмбрионов постоянно дополняются и совершенствуются. Несмотря на это, по мнению J. Gerris и соавт.
[10], эмбрионы с анеуплоидиями in vitro имеют характеристики, сходные с эуплоидными.
Наряду с морфологической оценкой в клиническую практику внедряются новые технологии, направленные на улучшение селекции эмбриона. Среди них можно выделить инвазивные и неинвазивные
методы. К инвазивным относится преимплантационная генетическая диагностика, осуществляемая с
использованием методов флюоресцентной гибридизации in situ (FISH), полимеразной цепной реакции с
обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), анализа микроокружения, сравнительной геномной гибридизации. Объектами исследования при применении данных методов являются: полярное тельце ооцита, бластомер или клетки трофэктодермы эмбриона, ядро
сперматозоида. Данные методы доказали свою эффективность и нашли применение в практике у пациенток старшего репродуктивного возраста при неоднократных неэффективных попытках ЭКО. Вместе с тем продолжают развиваться неинвазивные
методы, позволяющие выбрать для переноса эмбрионы, имеющие высокий имплантационный потенциал. В настоящее время в работу многих центров
репродуктивной медицины начинают внедряться
системы непрерывного автоматического наблюде-
ния за эмбрионами, которые, оценивая параметры
цитокинеза, митоза, позволяют на основе многофакторного анализа выбрать наиболее перспективный
эмбрион с точки зрения дальнейшего развития. Применяются технологии «-омик»: геномика, транскриптомика, протеомика, метаболомика. По мнению E. Forman и соавт. [41], полный геномный
скрининг при селективном переносе эмбриона улучшит результаты ВРТ и снизит частоту невынашивания беременности.
Таким образом, анализ данных литературы показал, что морфологическая оценка играет основную
роль в определении качества ооцитов и эмбрионов в
процессе динамического наблюдения in vitro. Несмотря на это, субъективная оценка должна дополняться
данными, характеризующими гаметы и эмбрион с
морфофункциональной позиции. Внедрение технологий непрерывного наблюдения за эмбрионами, в
основе работы которых лежит система фиксации
структурных изменений эмбрионов во времени, позволит автоматизировать процесс отбора эмбрионов
и дополнит классическую морфологическую оценку.
Применение современных методов позволяет комплексно подходить к выбору эмбриона с высоким
потенциалом к имплантации в программе ЭКО и
ПЭ, принимая во внимание исходный статус гамет и
клинико-анамнестические данные супружеских пар
с бесплодием.
Авторы заявляют об отсутствии возможных конфликтов интересов.
ЛИТЕРАТУРА
1.
Кулаков В.И., Леонов Б.В., Кузьмичев Л.Н. Лечение женского и
мужского бесплодия. М: МИА 2005.
10. Gerris J. et al. Single embryo transfer. Cambridge University Press
2009.
2.
Ikawa M. et al. Mechanisms of sperm — egg interactions emerging
from gene-manipulated animals. Int J Dev Biol 2008; 52: 5—6:
657—664.
11.
3.
Gianaroli L. et al. Oocyte euploidy, pronuclear zygote morphology
and embryo chromosomal complement. Hum Reprod 2007; 22:
241—249.
12. Marteil G., Richard-Parpaillon L., Kubiak J.Z. Role of oocyte quality in meiotic maturation and embryonic development. Reprod
Biol 2009; 9: 203—224.
4.
Swain J.E., Pool T.B. ART failure: oocyte contributions to unsuccessful fertilization. Hum Reprod Update 2008; 14: 5: 431—446.
5.
Высоцкий А.Ю. Морфологические варианты комплекса
ооцит-кумулус, зигот, эмбрионов человека и критерии прогноза успешности экстракорпорального оплодотворения:
Автореф. дис. … канд. биол. наук. Новосибирск 2005.
13. Yang Y.J., Zhang Y.J., Yuan L. Ultrastructure of human oocytes of
different maturity stages and the alteration during in vitro maturation. Fertil Steril 2009; 92: 396.e1—396e.6.
Madaschi C. et al. Zona pellucida birefringence score and meiotic
spindle visualization in relation to embryo development and ICSI
outcomes. Reprod Biomed Online 2009; 18: 681—620.
14. Van Blerkom J., Davis P., Alexander S. Differential mitochondrial
distribution in human pronuclear embryos leads to disproportionate inheritance between blastomeres: relationship to microtubular
organization, ATP content and competence. Hum Reprod 2000;
15: 2191—2633.
6.
Rienzi L., Vajta G., Ubaldi F. Predictive value of oocyte morphology
in human IVF: a systematic review of the literature. Human Reprodn Update 2011; 17: 1: 34—45.
7.
Rienzi L., Balaban B., Ebner T., Mandelbaum J. The oocyte. Hum
Reprod 2012; 27: 1: 2—21.
15. Findikli N., Kahraman S., Kumtepe Y. Assessment of DNA fragmentation and aneuploidy on poor quality human embryos. Reprod Biomed Online 2004; 8: 2: 196—206.
8.
Макарова Н.П., Калинина Е.А. Критерии оценки качества
ооцита в циклах ИКСИ: взгляд клинического эмбриолога.
Гинекология 2012; 14: 3: 24—28.
16. Balaban B., Urman B. Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation. Reprod Biomed Online 2006; 12:
608—615.
9.
Petersen C.G. et al. Relationship between visualization of meiotic
spindle in human oocytes and ICSI outcomes: a metaanalysis. Reprod Biomed Online 2009; 18: 235—243.
17.
Balaban B., Ata B., Isiklar A., Yakin K., Urman B. Severe cytoplasmic abnormalities of the oocyte decrease cryosurvival and subse-
57
Морфологическая оценка ооцита и эмбриона при ВРТ
quent embryonic development of cryopreserved embryos. Hum
Reprod 2008; 23: 1778—1785.
29. Rienzi L. et al. Significance of metaphase II human oocyte
morphology on ICSI outcome. Fertil Steril 2008; 90: 1692—1700.
18. Brenner C. What is the role of mitochondria in embryo competence? Essential IVF: Basis Research and Clinical Applications.
Eds. J. Van Blerkom, L. Gregory. Boston: Kluwer Academic Publishers 2004; 273—290.
30. Scott L. et al. The biological basis of noninvasive strategies for
selection of human oocytes and embryos. Hum Reprod Update
2003; 9: 3: 237—249.
19. Lin Y.C. et al. Human oocyte maturity in vivo determines the outcome of blastocyst development in vitro. J Ass Reprod Genet 2003;
20: 506—512.
31. Tesarik J., Greco E. The probability of abnormal preimplantation
development can be predicted by a single static observation on
pronuclear stage morphology. Hum Reprod 1999; 14: 1318—1323.
32. Veeck L., Zaninovic N. An atlas of human blastocysts. UK: The
Parthenon Publishing Group 2005.
20. Fragouli E. et al. Alteration of gene expression in human cumulus
cells as a potential indicator of oocyte aneuploidy. Hum Reprod
2012; 27: 8: 2559—2568.
33. Henkel R. et al. Influence of deoxyribonucleic acid damage on
fertilization and pregnancy. Fertil Steril 2004; 81: 965—972.
21. Shen Y. et al. Light retardance by human oocyte spindleis positively
related to pronuclear score after ICSI . Reprod Biomed Online
2006; 12: 737—751.
34. Salumets A. et al. The predictive value of pronuclear morphology of
zygotes in the assessment of human embryo quality. Hum Reprod
2001; 16: 2177—2181.
22. Antczak M., Van Blerkom J. Temporal and spatial aspects of
fragmentation in early human embryos: possible effects on
developmental competence and association with the differential
elimination of regulatory proteins from polarized domains. Hum
Reprod 1999; 14: 429—447.
35. Guerif F. et al. Single Day 2 embryo versus blastocyst — stage
transfer: a prospective study integrating fresh and frozen embryo
transfers. Hum Reprod 2009; 24: 1051—1068.
23. Sakkas D. et al. Assessment of early cleaving in vitro fertilized
human embryos at the 2-cell stage before transfer improves embryo
selection. Fertil Steril 2001; 76: 1150—1156.
24. Holte J. et al. Construction of an evidence — based integrated
morphology cleavage embryo score for implantation potential of
embryos scored and transferred on day 2 after oocyte retrieval.
Hum Reprod 2007; 22: 2: 548—557.
36. Guerif F. et al. Treating women under 36 years old without top –
quality embryos on day 2: a prospective study comparing double
embryo transfer with single blastocyst transfer. Hum Reprod 2011;
26: 775—781.
37. Jaroudi K. Day 5 versus day 3 embryo transfer: a controlled
randomized trial. Hum Reprod 2000; 15: 1947—1952.
38. Tao J. et al. The neglected morula/compact stage embryo transfer.
Hum Reprod 2002; 17: 1513—1518.
25. Feil D. et al. Day 4 embryo selection is equal to Day 5 using a
new embryo scoring system validated in single embryo transfers.
Hum Reprod 2008; 23: 1505—1510.
39. Magli M.C. et al. Chromosome mosaicism in day 3 aneuploid
embryos that develop to morphologically normal blastocysts in
vitro. Hum Reprod 2000; 15: 1781—1820.
26. Van Montfoort A. et al. Early cleavage is a valuable addition to existing embryoselection parameters: a study using single embryo transfers. Hum Reprod 2004; 19: 2103—2108.
40. Gardner D.K., Schoolcraft W.B. In vitro culture of human
blastocysts. In: Towards Reproductive Certainty: Infertility and
Genetics Beyond. Eds. R. Jansen, D. Mortimer. Carnforth:
Parthenon Press 1999; 378—388.
27. Gioretti C. et al. Embryo score to predict implantation after IVF:
based on 957 single embryo transfer. Hum Reprod 1995; 10: 2427—
2431.
28. Steer C.V. et al. The cumulative embryo score: a predictive embryo
scoring technique to select the optimal number of embryos to
transfer in an in vitro fertilization and embryo transfer programme.
Hum Reprod 1992; 7: 117—119.
58
41. Forman E.J. et al. Single embryo transfer with comprehensive
chromosome screening results in improved ongoing pregnancy
rates and decreased miscarriage rates. Hum Reprod 2012; 0: 0:
1—6.