СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ХОНДРОПРОТЕКТОРНЫХ
advertisement
УДК 619 : 616 – 092. 19 + 636. А.А. МАКЕЕВ, кандидат биологических наук, доцент кафедры Новосибирский государственный педагогический университет e-mail: mahkeev-aleksandr@rambler.ru СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ХОНДРОПРОТЕКТОРНЫХ СВОЙСТВ АНТИОКСИДАНТА ТИОФАНА И α-ТОКОФЕРОЛА НА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА Представлены результаты сравнительного изучения антиоксидантного эффекта тиофана и α-токоферола на модели окислительного стресса у крыс, вызванного преднизолоном. Установлен протективный эффект антиоксиданта тиофана на клетки и матрикс пластинки роста тела позвонка в условиях преднизолоновой нагрузки. Ключевые слова: свободнорадикальное перекисное окисление липидов, антиоксидант тиофан, α-токоферол, окислительный стресс, тело позвонка. Окислительный стресс – часть неспецифической генерализованной реакции организма, развивающейся при действии на него повреждающих факторов физической или химической природы. В результате формируется система защитных реакций, направленных на удаление или инактивацию повреждающего фактора, разрушение активированных кислородных метаболитов и пероксидно модифицированных макромолекул, восстановление внутриклеточного гомеостаза [1, 2]. Однако чрезмерная активация процессов свободнорадикального окисления приводит к развитию целого ряда патологических состояний организма человека и животных. Образующиеся цитотоксические продукты свободнорадикального окисления разобщают окислительное фосфорилирование, нарушают работу встроенных в мембрану ионных каналов и насосов, нарушают структуру ДНК [1]. Клетки органов, испытывающих дефицит ферментов антиоксидантной защиты, являются «мишенями» для агрессивных свободнорадикальных соединений. Хондроциты – основные клетки пластинки роста (ПР), для которых свойственен эволюционно закрепившийся дефицит ферментов антиоксидантной защиты, обусловленный отсутствием кровеносных сосудов и 1 пониженной оксигенацией хрящевой ткани [3]. Указанные особенности метаболизма позволяют рассматривать хрящ в качестве мишени для продуктов свободнорадикального окисления. Цель настоящего исследования – изучить в сравнительном аспекте хондропротекторный эффект антиоксидантов тиофана и α-токоферола в эксперименте на модели окислительного стресса. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальная часть работы выполнена на половозрелых самцах крыс линии Вистар массой 300–350 г. Лабораторные животные в течение всего эксперимента получали стандартные экструдированные комбикорма ПК-121-2 и ПК 121-1 для лабораторных крыс и мышей (сертификаты соответствия № РОСС RU. ПН 16. В 00091 ГОСТ Р 51166–98 п. 3.3. и № РОСС RU. ПН 16. В 00091 ГОСТ Р 51166–98 п. 3.1.). Уход за животными, экспериментальные процедуры и выведение из эксперимента проводили конференции по защите в соответствии позвоночных с правилами животных, Европейской используемых для экспериментальных и научных целей [4]. Для изучения влияния окислительного стресса на морфофункциональное состояние ПР тела позвонка сформировали три группы экспериментальных животных по 10 гол. в каждой. Согласно общепринятой методике у крыс моделировали развитие окислительного стресса путем ежедневного внутрижелудочного введения в течение 14 сут преднизолона в дозе 50 мг/кг [5]. Животных 1-й опытной группы не лечили; крысам 2-й и 3-й через 3 ч после введения преднизолона на протяжении всего эксперимента вводили в дозе 100 мг/кг антиоксидант тиофан и α-токоферол соответственно. Контрольных животных содержали в стандартных условиях вивария и специальных манипуляций с ними не проводили. На 15-е сутки всех животных под эфирным наркозом выводили из эксперимента. Для проведения морфологического и гистохимического анализа препарировали позвоночный столб и выделяли сегменты грудного отдела 2 позвоночника. Образцы исследуемых тканей фиксировали в 10%-м растворе нейтрального формалина, декальцинировали в насыщенном растворе трилона Б и после обезвоживания в спиртах возрастающей концентрации заливали в целлоидин – парафин. На санном микротоме изготавливали серийные срезы толщиной 5–7 мкм и монтировали на предметные стекла. Для изучения общей морфологической картины срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Кислые гликозаминогликаны (ГАГ) выявляли альциановым синим по Стидмену, коллаген – по Маллори, локализацию кальция в клетках – по Коссу. Экспрессию белков гена р-53 и вcl-2 определяли методом иммуногистохимического анализа в реакции с вторичными антителами. Интенсивность реакции на активированные кислородные метаболиты (АКМ) в образцах нативной хрящевой ткани ПР тел позвонков оценивали в реакции с нитротеразолиевым синим на криостатных срезах [6]. Дифференциальное определение свободнорадикального оксида азота в хрящевой ткани ПР осуществляли по локализации его селективного маркера – фермента NOсинтазы на замороженных срезах [7]. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты морфогистохимического анализа свидетельствуют, что у животных 1-й опытной группы, находившихся в условиях глюкокортикоидной нагрузки, так же, как и у контрольной, идентифицируются все зоны пластинки роста (см. рисунок, а, б). Однако имеются некоторые различия, касающиеся как толщины определенных зон, так и их морфологии. Типичным для животных 1й опытной группы является увеличение толщины слоя пролиферирующего хряща, обусловленного увеличением как количества клеток, так и их площади. Хондроциты этого слоя крупные, располагались в широких лакунах округлой формы, которые по морфологической характеристике приближались к клеткам гипертрофированного хряща. Цитоплазма клеток слабо выражена, неравномерно окрашена эозином и содержала многочисленные мелкие, оптически прозрачные вакуоли. В цитоплазме клеток, территориальном и межтерриториальном матриксе реакция на суммарные гикозаминогликаны 3 (ГАГ) характеризовалась как следовая. В центральной части зоны пролиферации отмечена инвазия клеток и матрикса сосудистыми каналами, что приводит к деструкции хрящевого матрикса (см. рисунок, б). В цитоплазме клеток эндотелия кровеносных сосудов и хондробластов зоны пролиферации определялась интенсивная реакция на АКМ и NO-синтазу. Хондроциты способны одновременно с NO продуцировать супероксид-анион. Взаимодействие этих двух радикалов приводит к образованию пероксинитрита – долгоживущего и мощного медиатора повреждения тканей. В цитоплазме хондробластов регистрировали высокое содержание кальция в ионизированной форме. Иммуногистохимически выявлялся высокий уровень экспрессии белка р53, а маркер белка bcl-2 определялся лишь в единичных клетках. Считается, что высокая внутриклеточная концентрация ионов кальция повышает чувствительность хондроцитов к действию свободнорадикального NO [8, 9]. Именно этим объясняется высокая гибель хондроцитов путем апоптоза и свободнорадикальное повреждение компонентов хрящевого матрикса. Дистрофия клеток и матрикса вокруг сосудистых каналов в толще зоны пролиферации пластинки роста приводят к оссификации и остеогенезу, а в конечном итоге к морфологическому разобщению пластинки роста и замыкательной пластинки. При этом на месте гибнущего хряща формируются костные балки (см. рисунок, б). Указанные особенности могут рассматриваться как ответная реакция клеток на повреждение. Это согласуется с результатами исследований В.Н. Павловой, согласно которым зона пролиферации является центром фокального поражения хряща и может рассматриваться как интегральный показатель действия на ткань повреждающих факторов [3]. Колонковые структуры по сравнению с контрольными образцами искривлены, местами сужены, а в отдельных случаях не определялись (см. рисунок, б). С нашей точки зрения, регистрируемое снижение интенсивности гистохимической реакции с альциановым синим в территориальном и межтерриториальном матриксе – реакция межклеточного вещества на 4 повреждение свободнорадикальным NO, который способен ингибировать синтез данных соединений. В зоне гипертрофированных клеток пластинки роста происходила глубокая инвазия кровеносными сосудами хрящевого матрикса. Дистрофия матрикса и кальцификация осуществлялась вплоть до клеток зоны созревания. Это привело к практически полному исчезновению гипертрофических клеток и интенсивному замещению хряща в зоне созревания и гипертрофии первичной грубоволокнистой костной тканью, которая плотно перекрывала ПР на уровне зоны пролиферации. В зоне энхондрального остеогенеза формирующиеся костные балки не имели строгой векторной направленности по сравнению с соответствующими образцами животных интактной группы. При постановке реакции с альциановым синим трабекулы содержали значительные включения хрящевой ткани, которая проявляла интенсивную положительную реакцию на кислые ГАГ. На гистологических препаратах крыс, которым на фоне глюкокортикоидной нагрузки вводили антиоксидант тиофан, пластинка роста имела равномерную толщину (см. рисунок, в). В отличие от крыс 1-й опытной группы зона пролиферирующего хряща содержала хондроциты преимущественно овальной формы. Цитоплазма клеток обильная, умеренно окрашивалась гематоксилином. Матрикс хорошо развит и характеризовался гомогенным умеренно базофильным окрашиванием. Положительную реакцию на АКМ и NO регистрировали лишь в единичных клетках. В хондробластах данной зоны снижался уровень экспрессии апоптотического белка р53. Однако при постановке реакции с альциановым синим в территориальном и межтерриториальном воспринимающие матриксе краситель. определялись Указанные локальные признаки участки, свидетельствуют не о незначительном нарушении клеток и матрикса хрящевой ткани. Зона колонковых структур и гипертрофированного хряща увеличена по сравнению с животными 1-й опытной группы (см. рисунок, в). Клетки данной зоны сохраняли типичную морфологию. В межтерриториальном матриксе 5 выявлялись тонкие гематоксилином. Их волокнистые структуры, направление умеренно соответствовало окрашенные продольной оси позвоночника. На препаратах отчетливо заметно, что кровеносные сосуды инвазируют лишь матрикс, прилежащий к гипертрофированным клеткам. Следует отметить, что в зоне энхондрального остеогенеза формирующиеся костные балки по сравнению с образцами крыс 1-й опытной группы располагались параллельно продольной оси тела позвонка. На поверхности трабекул находились многочисленные остеобласты и определялись отложения остеоида. Межклеточное вещество содержало незначительные включения хрящевой ткани, которая интенсивно окрашивалась альциановым синим. А а а а Б 6 Г В Пластинка роста тела позвонка крыс: группы: а –контрольная; опытные: б – 1-я; в – 2-я; г – 3-я. Белой стрелкой обозначена зона пролиферации; черной – колонковые структуры; двойной черной – зона гипертрофированных клеток; двойной белой – кровеносные сосуды; головкой стрелки – костная ткань в зоне пролиферации. Реакция по Маллори. Ув. ×100 (а, в); ув. ×40 (б, г) Исследования показали, что морфология ПР у животных, получавших αтокоферол на фоне преднизолоновой нагрузки, не имела выраженных различий с аналогичными образцами крыс 1-й опытной группы. Характерной реакцией хрящевой ткани на повреждение оставались инвазия матрикса в зоне пролиферации кровеносными сосудами, повышенная пролиферация и гибель хондроцитов на периферии сосудов (см. рисунок, г). По направлению к колонковым структурам увеличивалось количество бесклеточных лакун, заполненных бесструктурным интенсивно базофильным веществом. Данные признаки сопровождались искривлением колонковых структур, что является тканевым эквивалентом нарушения процесса роста. В межклеточном веществе этой зоны обнаруживались широкие сосудистые каналы с кровеносными сосудами. В ряде случаев кровеносные сосуды 7 расширены, заполнены плазмой и клетками крови. Эритроциты были с признаками сладж-феномена. Вокруг сосудистых каналов определяются кластеры из 4–5 клеток в лакуне с базофильной цитоплазмой и центрально расположенным ядром. Эти хондроциты представляют собой типичные клетки изогенной группы, которые не формируют колонковые структуры. В данных хондроцитах выявлялась интенсивная реакция на АКМ и NO-синтазу. Иммунохимически определялся высокий уровень экспрессии белка р53. Можно предположить, что локализация в матриксе хряща вокруг сосудистых каналов кластеров из четырех и более клеток в одной лакуне – это реакция хондроцитов на повреждение АКМ, в частности свободнорадикальными NO. Толщина зоны гипертрофических клеток значительно сужена и представлена 2–3 слоями клеток против 5–6 в норме. В зоне энхондального остеогенеза происходила глубокая инвазия кровеносными сосудами хрящевого матрикса. Вновь образованные костные балки истончены и теряли характерную векторную направленность. Межклеточное вещество трабекул неравномерно окрашивалось эозином. При постановке гистохимической реакции на суммарные ГАГ в примитивных костных балках отмечались значительные включения хрящевой ткани. Результаты проведенного морфогистохимического анализа позволяют заключить, что длительное применение глюкокортикоида преднизолона приводит к развитию окислительного стресса. Интенсивная гибель клеток и деструкция матрикса хрящевой ткани ПР – отражение локального проявления окислительного стресса, что в конечном итоге обусловливает нарушение роста осевого скелета крыс. Применение фенольного серосодержащего антиоксиданта тиофана в условиях преднизолоновой нагрузки оказывает протективный эффект на клетки и матрикс пластинки роста, что указывает на свободнорадикальный механизм нарушения структурно-функциональной организации хрящевой ткани ПР. Наиболее тиофана по выраженный сравнению с хондропротекторный α-токоферолом 8 эффект антиоксиданта объясняется уникальностью химического строения данного активности aнтирадикальной противопероксидным соединения. его действием Синергическое фенольных сульфидной сочетание фрагментов группы с обусловливает полифункциональность данного антиоксиданта. Отличительная особенность антиоксиданта тиофана – способность эффективно инактивировать не только свободные радикалы, но и нейтрализовать гидроперекси. ВЫВОДЫ Использование преднизолона в модели окислительного стресса 1. приводит к нарушению морфофункциональной организации пластинки роста тела позвонка крыс, обусловленную изменением пролиферации и дифференцировки хондроцитов. Антиоксидант тиофан оказывает протективный эффект на клетки и 2. матрикс пластинки роста тела позвонка крыс в условиях глюкокортикоидной нагрузки. Ведущим механизмом нарушения морфофункциональной организации пластинки роста являются активные кислородные метаболиты. Использование 3. α-токоферола не оказывает положительного эффекта на структуру и функцию пластинки роста тела позвонка крыс в условиях глюкокортикоид-индуцированного окислительного стресса. БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 1. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.З. Окислительный стресс. Патологические заболевания и состояния. – Новосибирск, 2008. – 283 с. 2. Лущак В.И. Свободнорадикальное окисление белков и его связь с функциональным состоянием организма // Биохимия. – 2006. – Т. 72, вып. 8. – С. 995–1017. 3. Павлова В.Н. Хрящ. – М.: Медицина, 1988. – 320 с. 4. European convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purpose: Council of Europe 18.03.1986. – Strasbourg, 1986. – 52 p. 9 5. изучение Зиганшина Л.Е., Бурнашева З.А., Валеева И.Х. Сравнительное эффективности димефосфона и ксидофона при стероидном остеопорозе у крыс // Эксперим. и клинич. фармакология. – 2002. – № 6. – С. 55–56 . 6. Hill K.S., Kennedy M., Achinders C. Nitroblue tetrazolium (NBT) activity in human leucocytes after freezing, // Pathology. – 1978. – Vol. 10. – N 1. – Р. 69–75. 7. Mayer B. Biochemistry and molecular pharmacology of nitric oxide synthases. – Ed. Vincent S. London: Acad. Press, 1995. – P. 21–42. 8. Notoya K., Jovanovic V., Reboul P. et al. The induction of cell death in human osteoarthritis chondrocytes by nitric oxide is related to the production of prostaglandin E2 via the induction of cyclooxygenase-2 D. // J. Immunol. – 2000. – Vol. 165. – P. 3402–3410. 9. Laufer S. Role of eicosanoids in structural degradation in osteoarthritis // Curr Opin Rheumatol. – 2003. – Vol. 15 – P. 623–627. Поступила в редакцию 09.12.2009 10
