Физические методы исследования макромолекул и б б

Доцент кафедры оптики и биофотоники СГУ,
СГУ
канд. физ.-мат. наук Генина Э.А.
Физические методы
исследования
макромолекул и
б
биологических
объектов
б
Лекции 1-6
Список рекомендуемой литературы
•
Тучин В.В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях /
Москва: Физматлит, 2010, 488 с.
•
Нолтинг Б. Новейшие методы исследования биосистем - М.
М.: Техносфера,
2005, 256 с.
•
Оптическая биомедицинская диагностика в 2 т. / под ред. В.В. Тучина - М.:
Физматлит, 2007.
•
Давид Р. Введение в биофизику - М.: Мир, 1982, 207 с.
•
Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. Применение физико
физико-химических
химических
методов в биохимии и молекулярной биологии - М.: Мир, 1980, 582 с.
•
Гладкова Н.Д., Сергеев А.М. Руководство по оптической когерентной
томографии – М.
М.: Физматлит, 2007.
•
Хилл К., Бэмбер Дж., Хаар Г. Ультразвук в медицине. Физические основы
применения – М.: Физматлит, 2008.
•
Ремизов А.Н., Максина А.Г., Потапенко А.Я. Медицинская и биологическая
физика / М.: Дрофа, 2003, 560 с.
•
Шендрик А.Н. Инструментальные методы исследования в биохимии http://www.donnu.edu.ua/chem/student/methodic/phys_methods/index.html#0
•
Физическая энциклопедия - http://dic.academic.ru/contents.nsf/enc_physics
2
Список курсовых работ
1 И
1.
Использование динамики спеклов при визуализации
церебрального кровотока
2. Спекл-визуализация
у
биопотоков
3. Лазерный доплеровский анемометр
4. Исследование оптической анизотропии макромолекул
5. Цифровая голографическая фазовая микроскопия
6. Измерение микрорельефа поверхности отражающих
объектов в интерференционном микроскопе
7. Тепловизор
8. Флуоресцентная спектроскопия
9. КР-спектроскопия клетки
10.Спектрофотометрия
11 Фотометрическое наблюдение гемолиза
11.
12.Эритемомеланинометр
13.Отражательная
3.Отражательная спектроскопия
14.Оптическая когерентная томография
3
Лекция №1
Введение.
д
Классификация физических
методов исследования
4
1 1 Введение
1.1.
Физические методы исследования - ряд
современных инструментальных методов,
которые разработаны физиками и
используются в химии, биологии и
медицине
5
Характерные признаки физического метода:
1) осуществляется
у
взаимодействие
падающего излучения, потока частиц или
какого-либо поля с объектом
2) измеряется результат этого
взаимодействия
д
6
Прямая задача физического метода
1) Известны свойства объекта
2) Исследуются прошедшее,
отраженное
р
или
рассеянное объектом
излучение
?
?
?
?
Об
Обратная
задача физического метода
1) И
Известен результат
взаимодействия излучения
и объекта
?
2) Определить свойства
объекта
7
1.2. Классификация
ф
ф
физических
методов исследования
• Спектроскопические
С
р
методы
Оптические
методы
•
•
•
•
•
•
•
•
Магниторезонансные
методы
• ядерный магнитный резонанс
колориметрия
• электронный парамагнитный
флуоресцентные методы
резонанс
пламенная спектроскопия
УФ-спектроскопия
УФ
спектроскопия
ИК-спектроскопия
спектроскопия комбинационного рассеяния
колебательная
б
спектроскопия
8
электронная спектроскопия
Исследуется зависимость интенсивности излучения (I),
прошедшего через вещество или рассеянного
веществом, от длины волны или частоты падающего
излучения то есть исследуют функцию I(λ,ν)
I(λ ν)
Ко
оэффици
иент отра
ажения
0 36
0,36
Спектр отражения
кожи человека
0 30
0,30
Коэффициент отражения:
0,24
,
R = 1 – T = 1 – I/Io
0,18
400
450
500
550
600
650
700
Длина волны, нм
Д
9
• Колориметрия и абсорбционная фотометрия
– позволяют определить концентрацию
растворенного вещества, зная интенсивность
поглощенного раствором света с данной
длиной волны
• Флуоресцентные
Ф
методы – дают
информацию об изменении конформации
макромолекул под влиянием окружения,
либо связывания с другими молекулами
• Пламенная спектроскопия позволяет
определить концентрацию элемента по
интенсивности излучения, индуцированного
тепловым возбуждением атомов этого
элемента
10
• Значение УФ-спектроскопии обусловлено
тем, что большинство биохимических
соединений, не поглощающих свет в
видимой области, поглощают ультрафиолет
р
позволяет
• ИК-спектроскопия
идентифицировать многие биохимические
соединения
д
и изучить
у
их свойства по
полосам поглощения, находящимся в ИКобласти спектра
р
• Спектроскопия комбинационного рассеяния
позволяет различить структурные модели
молекул. По интенсивности полос можно
судить о концентрации вещества
11
• В колебательной спектроскопии частоты
молекулярных колебаний используются
для расчета силовых полей молекул,
молекул то
есть для определения различного типа сил
взаимодействия атомов в молекуле
• Э
Электронная спектроскопия используется
для изучения кинетики реакций,
количественных анализов, изучения
строения молекул, исследования
таутомерии и других превращений
й
12
• Метод
д ядерного
д р
магнитного р
резонанса
является структурным методом анализа и
основан на взаимодействии магнитного и
радиочастотного полей с ядрами, которые
имеют отличный от нуля
у собственный
магнитный момент
• Суть явления электронного парамагнитного
резонанса заключается в резонансном
поглощении электромагнитного излучения
неспаренными электронами.
электронами ЭПР позволяет
изучать объекты, обладающие такими
электронами: свободные радикалы и
13
соединения, включающие ионы
• Дифракционные методы
измеряют зависимость интенсивности
рассеянного излучения от угла рассеяния
• рентгенография
йтро о рафи
• нейтронография
• электронография
14
Р
Рентгеновские
лучи: 0
0.07
07 – 0.2
0 2 нм
Нейтронные лучи: 0.15 нм
0.1 – 0.25 нм
Электронные лучи: 0.005 нм
15
• Метод рентгеноструктурного анализа
позволяет определять координаты атомов в
трехмерном пространстве кристаллической
решетки веществ
Применение
р
РСА для установления
у
пространственной структуры белков:
1) Получение высокоочищенного белка
2) Получение кристаллов белка
16
3) Получение дифрактограммы (рентгенограммы)
h
http://www.donnu.edu.ua/chem/student/methodic/phys_methods/index.html#0
//
d
d
/ h / d
/
h d / h
h d / d h l#0
Ренгенограмма от кристалла миоглобина кашалота
17
4)) Построение
р
на основе р
рентгенограммы
р
карты
р
распределения электронной плотности в
элементарной ячейке белкового кристалла
http://www.donnu.edu.ua/chem/student/methodic/phys_methods/index.html#0
Карта распределения электронной плотности в миоглобине
18
5) Установление на основе карты электронной
плотности координат отдельных атомов белковой
молекулы в пространстве элементарной ячейки и
размещение молекулы в элементарной ячейке с
изображением трехмерной структуры этой
молекулы
http://www.donnu.edu.ua/chem/student/methodic/phys_methods/index.html#0
Упаковка молекул миоглобина
в элементарных ячейках
кристаллической решетки
Компьютерные модели
пространственной структуры
молекулы миоглобина
19
• Ионизационные методы
в результате взаимодействия
й
какого-либо
б
падающего излучения или потока частиц с
объектом,
б
молекулы последнего
ионизируются и из них формируется новый
поток частиц, который
й направляется на анализ
• масс-спектрометрия
• р
рентгеновская электронная
р
спектроскопия
р
((РЭС))
• ультрафиолетовая электронная спектроскопия (ФЭС)
20
Принципиальная схема масс-спектрометра
http://www.donnu.edu.ua/chem/student/methodic/phys_methods/index.html#0
21
• Рентгеновское излучение выбивает
электроны с внутренних оболочек. Метод
РЭС позволяет определять энергию связи
внутренних электронов с остовами атомов
• Методом ФЭС определяют
р
последовательные потенциалы ионизации,
т.е энергию электронов на различных
молекулярных орбиталях
22
Лекция №2
2. Теоретические основы
2
спектроскопических методов
исследования
23
Попов И.А.
И А Физические методы исследования http://bio.fizteh.ru/student/files/fizmetody/
http://bio fizteh ru/student/files/fizmetody/
24
Частота, Гц
Длина волны
Гамма лучи
Х-лучи
Ультрафиолет
1 ангстрем, Å
1 нанометр, нм
УФ-С (100-280 нм)
УФ-В (280-315 нм)
УФ А (315
УФ-А
(315-400
400 нм))
Терапевтическое
окно (600-1300 нм)
1 микрон, мкм
Видимый (400-760 нм)
Инфракрасные
фр р
волны
1 миллиметр, мм
Микроволны
Ближний ИК (760-1400 нм)
1 сантиметр, см
1 метр, м
Стандартное радиовещание
1 километр, км
Длинные волны
25
Электрическое
р
поле
x
Магнитное
поле
y
z
Направление
распространения
волны
λ
Энергия фотона: E = hν = hc/λ
где h - постоянная Планка (6.623·10-34 Дж·с/моль),
ν – частота волны,
волны
λ – длина волны,
с – скорость света (2.998×108 м/c – скорость света в вакууме)
26
Изменение величины вектора напряженности электрического поля
электромагнитной волны описывается во времени функцией:
E = E0sin(ωt - kx - φ)
где Φ
(2.1)
= (ωt
( - kx
k - φ)) – фаза колебания (фаза волны)
27
• Две волны являются когерентными, если разность их
фаз постоянна во времени
• Интерференция волн - это наложение когерентных
волн, при котором наблюдается
б
устойчивое
й
во
времени взаимное усиление в одних точках
пространства и ослабления в других точках в
зависимости от соотношения между фазами этих
волн
• Дифракция волн - это совокупность обусловленных
волновой природой
р р
электромагнитного
р
излучения
у
явлений, которые наблюдаются при распространении
волны в среде с резко выраженной неоднородностью
• Излучение,
И
в котором содержится электромагнитная
волна одной длины (частоты), называется
монохроматическим
28
Для того чтобы происходило поглощение
электромагнитной волны веществом (атомами,
молекулами) величина кванта энергии этой волны
должна быть равной или большей разности
энергий двух уровней (ΔЕ), соответствующих
различным состояниям молекулы
ΔE = hc/λ = hν
(2.2)
29
2.1. Фундаментальные
у
оптические
свойства
Основные фотофизические процессы:
• Преломление
р
• Рассеяние
• Поглощение
30
Основные параметры излучения:
• Показатель преломления, n (λ)
• Поперечное
р
сечение р
рассеяния, σs
dσ s
• Дифференциальное
фф р
поперечное
р
сечение
dΩ
dΩ
рассеяния,
• Поперечное сечение поглощения, σа
31
2.1.1. Преломление
Комплексный показатель преломления:
n ( λ ) = n ( λ ) − iα ( λ )
(2.3)
α(λ) – затухание волны за счет поглощения (и рассеяния, если среда неоднородная)
Показатель преломления:
р
Re ⎡⎣ n ( λ ) ⎤⎦ = n ( λ )
Фазовая скорость
р
света в среде:
р д
cm ( λ ) =
с = 2.998×108 м/c – скорость света в вакууме и nвак = 1
Длина волны света в среде:
Частота световой волны:
Энергия фотонов:
c
n (λ )
λ
λm =
n (λ )
c cm
ν= =
λ
Е = hν
((2.4))
(2 5)
(2.5)
(2.6)
λm
32
Отражение
р
и преломление
р
на
границе раздела сред
Закон Снелла:
n1
sin θ 2 = sin θ1
n2
((2.7))
Доля прошедшей энергии:
4n1n2
T=
( n1 + n2 )
(2.8)
Доля отраженной энергии:
n1 − n2 )
(
R = 1− T =
2
( n1 + n2 )
2
(2.9)
33
2.1.2. Рассеяние
Рассеяние с локальным включением
падающая волна
рассеянная волна
34
Поперечное сечение рассеяния
Pin – падающая мощность
Pout – прошедшая мощность
Pscatt – рассеянная мощность
Падающий луч
площадь = σs
площадь = A - σs
I0 – интенсивность луча
Прошедший
р
луч
у
А – поперечная площадь
луча
Поперечное сечение
рассеяния:
σ s ( sˆ ) =
ŝ
Pscatt
I0
((2.10))
- направление
распространения плоской
волны относительно
рассеивателя
35
Дифференциальное поперечное
сечение рассеяния
Дифференциальное
поперечное сечение рассеяния:
Рассеянный
фотон
dσ s
( sˆ, sˆ ')
dΩ
Рассеиватель
Угол
рассеяния θ
Падающий
фотон
(2.11)
sˆ ' - определяет ось конуса телесного угла,
б
берущего
начало от рассеивателя
Траектория
фотона
Акт
рассеяния
Поперечное сечение рассеяния
не зависит от относительной
ориентации падающего луча и
рассеивателя
σ s ( sŝ ) = σ s
dσ s
dσ s
dσ s
ˆ
ˆ
s
s
=
=
θ
,
'
cos
( )
(
)
( sˆ ⋅ sˆ ')
dΩ
dΩ
dΩ
(2 12)
(2.12)
((2.13))
36
Коэффициент рассеяния
Коэффициент
фф
р
рассеяния является площадью поперечного
р
сечения
рассеяния на единицу объема среды:
μ s = ρσ s
(2 14)
(2.14)
ρ - числовая концентрация рассеивателей
Средняя длина свободного пробега рассеяния - среднее расстояние
пролета фотона между последовательными актами рассеяния:
ls =
1
μs
(2.15)
37
Типы рассеяния:
• Р
Релеевское рассеяние – размер
рассеивателя мал по сравнению с длиной
волны света
• Рассеяние Ми – размер рассеивателя
сравним с длиной волны света
• Геометрический предел – длина волны
много меньше рассеивателя
38
Рассеяние Релея
Рассеяние Релея
(< 100 нм)
39
Рассеяние Ми
Теория
р Ми описывает рассеяние
р
света сферическими
ф р
рассеивателями
р
Рассеяние Ми (0.5 – 1 мкм)
40
2 1 3 Поглощение
2.1.3.
Поглощение – это процесс, представляющий собой
уменьшение интенсивности оптического излучения
при прохождении через какую-либо среду за счёт
взаимодействия с молекулами вещества, в результате
которого световая энергия переходит в другие виды
энергии
или
в
оптическое
излучение
другого
спектрального состава
41
• Переход молекулы или атома с более низкого на
более высокий энергетический уровень называется
возбуждением и сопровождается поглощением
количества энергии фотона,
фотона равного разнице
энергий между двумя уровнями (см. (2.2):
hν = ΔE
• Переход с более высокого уровня на более низкий
сопровождается освобождением энергии,
энергии равной
разнице энергий между двумя уровнями
безизлучательный
(нагрев)
и / или излучательный
(люминесценция)
42
• С квантовой точки зрения фотоны
поглощаются атомами и молекулами
по специальным переходам, и
энергия фотонов используется для
увеличения их внутренних
энергетических состояний
й
• Области спектра, где это явление
возникает, называются полосами
поглощения
43
Три основных типа процессов
поглощения:
• Электронный (атомы, молекулы)
• Колебательный (молекулы)
• Вращательный (молекулы)
44
Поперечное сечение поглощения
Pabs
σa =
I0
(2 17)
(2.17)
Pabs – поглощенная мощность,
I0 - интенсивность первоначально однородной плоской волны
45
Коэффициент поглощения
Коэффициент
фф
поглощения среды
р
с однородным
р
распределением
р
р
идентичных поглощающих частиц:
μa = ρσ a
(2 18)
(2.18)
ρ - числовая концентрация поглотителей
Средняя длина свободного пробега поглощения (длина поглощения) –
средняя протяженность путешествий фотона до его поглощения:
la =
1
μa
(2.19)
46
Для среды коэффициент поглощения определяется следующим
соотношением:
dI = − μ a Idz
(2.20)
dI – дифференциальное изменение интенсивности коллимированного светового
пучка, проходящего бесконечно малый путь dz сквозь однородную среду с
коэффициентом поглощения μa
Закон Бугера-Ламберта-Беера:
или
I = I 0 exp [ − μa z ]
(2.21)
I = I 0 exp [ −ε λ az ]
(2.22)
ελ - молярный коэффициент экстинкции [см2⋅моль-1] на длине волны λ
а– молярная концентрация поглощающих объектов [моль⋅см-3]
z – толщина [см]
ελ = μa/a
- вероятность поглощения света одним молем вещества
47
Пропускание (Transmittance):
Затухание (Absorbance):
Оптическая плотность
(Optical Density):
T = I / I0
A = ln ( I 0 / I ) = − ln (T )
D = log10 ( I 0 / I ) = − log10 (T )
(2.23)
(2 24)
(2.24)
(2.25)
48
Поглощение
Обмен
Об
кинетической
энергией
й
(нагрев среды)
Эмиссия фотонов
(люминесценция)
Флуоресценция – быстрое
Ф
б
излучение
Фосфоресценция –
задержанное излучение
49
Лекция №3
2 2 Взаимодействие света с
2.2.
биотканью
50
51
Виды взаимодействия лазерного
излучения с биотканью
Флуоресценция
Фотобиохимические
реакции
Акустические волны
Обратное
рассеяние
Рассеяние
вперед
р
Пропускание
Лазерный пучок
По ощ н
Поглощение
Прямое
ц
отражение Абляция
Тепловая
коагуляция
Биоткань
52
Взаимодействие лазерного
излучения с биообъектами
• Невозмущающие
ущ щ процессы
р
• Процессы, в которых проявляется
фотохимическое или тепловое действие
• Процессы, приводящие к фоторазрушению
(абляция фотокоагуляция)
(абляция,
53
Влияние света на
функционирование живой материи
Интен
нсивностть излуч
чения
• Разрушение биосистемы
• Происходят частично необратимые
процессы
• Включение общих адаптационных и
регуляционных механизмов
• Возмущения локального гомеостаза
• Не затрагивается гомеостаз биосистемы
54
Параметры сравнения:
• П
Плотность мощности ((интенсивности))
(Вт/см2)
• Плотность энергии (Дж/см2)
• Спектральная плотность мощности (Вт/см2·нм)
нм)
• Спектральная плотность энергии (Дж/см2·нм)
55
Интегральная плотность мощности излучения
Солнца в зените в диапазоне 250 — 2500 нм
составляет 85 мВт/см2
Спектральная
плотность
мощности
в
максимуме
у
кривой
р
излучения
у
на λ = 500 нм —
0.13 мВт/см2·нм
56
2 3 Р
2.3.
Распространение света в
биоткани
57
2.3.1. Распространение
немодулированного света в биоткани
Обратное
рассеяние
Лазерный пучок
Рассеяние
Р
н
вперед
Рассеяние и
поглощение
Коллимированное
пропускание
Прямое
(френелевское)
отражение
р
Биоткань
Диффузное
пропускание
58
Спектр поглощения определяется типом
доминирующих поглощающих центров и
содержанием воды в биоткани
спектр поглощения воды
Yoon G. et al. IEEE I. Quantum Electr., 23(10), 1721-1733, 1987.
59
Моляр
ярный коэф
ффициент экстинкции, см-1/М
М
Длина волны, нм
Спектр
р молярного
р
коэффициента
фф ц
экстинкции
ц
оксигенированного
р
(HbO2) и неоксигенированного (Hb) гемоглобина
Prahl S. Optical Absorption of Hemoglobin, http://omlc.ogi.edu/spectra/hemoglobin/index.html
60
Поглощение и рассеяние лазерного излучения
биологическими тканями
б
35 — 70%
15 — 40%
1-3 клеточных слоев
0.5 — 2.5 мм
8 — 10 мм
а — преобладает поглощение
б — поглощение и рассеяние дают примерно равные вклады
в — преобладает рассеяние
Yoon G. et al. IEEE I. Quantum Electr., 23(10), 1721-1733, 1987.
61
Ослабление лазерного пучка в биоткани:
Закон Бугера-Беера:
I ( z ) = (1 − R ) I 0 exp ( − μt z )
R = [(n–1)/(n+1)]2 - коэффициент френелевского отражения, при
нормальном
р
падении пучка,
у
,
n — относительный показатель преломления биоткани
I0 - интенсивность падающего света
μt=μa+ μs — коэффициент экстинкции (коэффициент взаимодействия
или ослабления)
μa - коэффициент поглощения
μs - коэффициент рассеяния
z - толщина образца
б
Средняя длина свободного пробега однократно рассеянного
фотона в биоткани:
lt =
1
μt
62
Фазовая функция p( sˆ, sˆ′) - функция плотности вероятности для
sŝ′ фотона,
фотона движущегося в направлении sŝ ,
рассеяния в направлении
т.е. характеризует элементарный акт рассеяния
Если рассеяние симметрично относительно направления
падающей волны,
волны тогда фазовая функция зависит только от угла θ
между направлениями
ŝ
и
ŝ′ , т.е. p(sˆ, sˆ′) = p (θ )
Фазовая функция нормируется таким образом, чтобы при
интегрировании по всем направлениям,
направлениям она равнялась единице:
∫ p ( sˆ, sˆ′) dω′ = 1
4π
Простейшая фазовая функция (в случае изотропного рассеяния)
63
имеет вид:
p ( s, s′) = 1 4π
Фактор анизотропии рассеяния g определяет число актов
рассеяния, после которых теряется информация о
рассеяния
первоначальном направлении движения фотона в рассеивающей
среде
Значение g изменяется в пределах от -1 до 1:
g = 0 – изотропное (релеевское) рассеяние,
g = 1 - полное рассеяние вперед (рассеяние Ми на крупных
частицах)
g =-1 – полное рассеяние назад
Д б
Для
биологических тканей
й g = 0.7
0 7 ÷ 0.99
0 99
Для изотропного рассеяния (g = 0) к потере информации
приводит один акт рассеяния
Для среды с фактором анизотропии g число таких актов равно
1/(1 – g)
64
Фазовая функция при различных значениях
фактора анизотропии
90
1.5
120
60
1.2
09
0.9
30
150
0.6
g=
0.3
g=0.3
0.3
g=
05
0.5
g=0.5
0.0
180
0
0.0
g=
07
0.7
g=0.7
0.3
0.6
330
210
0.9
1.2
1.5
240
300
270
65
10
l tr
Рассеивающая среда
б поглощения
без
9
8
фотон
7
1
g = cosθ = 0.90
θ1
2
θ2
6
3
4
1 0 ls
5
θ = 26D
μs′ = μs (1 − g ) = 0.10μs
ltr =
1
μs′
=
10
μs
- транспортный коэффициент рассеяния
- средняя транспортная длина пробега фотона
66
2.3.2. Распространение коротких
импульсов
1 — падающий импульс, 2 — случайная среда, 3 — диффузный компонент,
4 — группа фотонов с зигзагообразными траекториями,
5 — баллистические
б
фотоны
Cai W. et al. Proc. Math. Acad. Sci. USA, 93, 13561-13564, 1996.
67
Типичные схемы для исследования биотканей
с разрешением во времени
а
б
а — режим просвечивания; б — режим обратного рассеяния
А — зондирующий пучок, В — регистрируемое излучение
Затемненный участок в центре рассеивающего слоя — локальная
неоднородность (опухоль)
Cai W. et al. Proc. Math. Acad. Sci. USA, 93, 13561-13564, 1996.
68
2.3.3. Распространение поляризованного
излучения
Электрическое
поле
x
Imax
Магнитное
y поле
Поляризация
Направление
распространения
волны
z
I min
В качестве меры поляризации для частично поляризованного
света принято использовать степень поляризации :
I max − I min
P=
I max + I min
Предельный случай P = 0 (Imax = Imin) соответствует естественному
свету, а другой предельный случай P = 1 (Imin = 0) - линейно
69
поляризованному свету
Степень деполяризации: измеряется отношением интенсивности
компонентов прошедшего слой биоткани света,
света поляризованного
параллельно плоскости поляризации падающего излучения (I|| ) и
перпендикулярно ей (I⊥)
Pdepol = I|| / I⊥
Излучение считается деполяризованным, когда I|| / I⊥ =2
Длина пути света в ткани lp, на которой происходит
деполяризация света (I|| / I⊥ =2), называется длиной
деполяризации
Длина деполяризации lp ≈ ltr средней транспортной длине
пробега
р
фотона
ф
Поскольку ltr определяется значением транспортного
коэффициента рассеяния μ s′ = μs (1 - g), lp зависит от параметра
анизотропии рассеяния g
70
Возможные режимы с сохранением или разрушением
линейной поляризации в зависимости от размера
частиц, составляющих биоткань, и их концентрации
71
Экспериментально установлено, что линейная поляризация
сохраняется в пределах 2.5 ltr
Для кожи в красном и ближнем ИК диапазоне:
μa ≅ 0.4
0 4 см–1
μ s′ ≅ 20 см–1
ltr ≅ 0.48 мм
свет может
мо
р
распространяться
ро р н
н
на длине
л н ≅ 1.2
1 2 мм,
мм сохраняя
охр н еще
щ
линейную поляризацию.
Такой
Т
й путь в б
биоткани соответствует временной
й задержке
порядка 5.3 пс, что позволяет получать поляризационные
образы
р
макронеоднородностей
р
р
биоткани
72
Лекция №4
3. Оптические методы
3
исследования биотканей и
биожидкостей
73
3.1. Спектрометр
р
р
www.techob.ru
www.bizator.by
www.openexpo.ru
www.oceanoptics.com
www.spectroservice.kz
74
Типы спектроскопических измерений:
• Поглощение (методы УФ, видимой и ИК
поглощательной спектроскопии)
• Упругое рассеяние (методы упругого
р
рассеяния)
н )
• Неупругое рассеяние (методы
комбинационного
б
рассеяния))
• Излучение
у
((методы ф
флуоресцентной
у р
и
фосфоресцентной спектроскопии)
75
Базовый спектрофотометр в основном
состоит из следующих компонентов:
• Источник возбуждающего излучения
• Дисперсионное устройство (оптический
фильтр монохроматор или полихроматор)
фильтр,
• Образец (обычно в комплекте с держателем
образца)
б
)
• Фотометрический детектор (оборудованный
устройством
й
считывания информации))
76
Устройство для измерения поглощения
дисперсионный
элемент
источник
излучения
детектор
образец
77
Устройство
р
для измерения
р
у
упругого
ру
рассеяния
дисперсионный
элемент
образец
источник
излучения
детектор
78
Устройство для измерения неупругого
рассеяния
дисперсионный
элемент
источник
излучения
у
образец
дисперсионный
м т
элемент
детектор
79
Устройство для измерений излучения
образец
источник дисперсионный
р
излучения
элемент
возбуждения
дисперсионный
элемент
излучения
детектор
р
80
Основные классы спектрофотометров:
О
• Фильтрующие устройства
• Монохроматорные устройства
• Многоканальные устройства
81
Важные особенности спектрометра:
• интенсивность источника излучения
разрешение
р
и пропускная
р у
способность
• р
монохроматора
• чувствительность детектора
• надежность электронных компонентов
• повторяемость и точность механизма
сканирования
• возможность удаления случайной
й й
засветки монохроматора
82
3.2. Инструментальные
ру
компоненты
3.2.1. Источники излучения
Типы источников излучения:
• линейный
• непрерывный
Режимы источников излучения:
• непрерывный
• импульсный
83
Дуговые лампы высокого
давления
Излучение:
от УФ (<200 нм) до
ближнего ИК (>1000 nm)
Мощность:
от нескольких ватт до нескольких киловатт
Особенности:
О
б
период прогрева ~30 мин
требует
б
осторожности при работе
б
Использование:
универсальный источник излучения
Спектр ртути
Спектр ксенона
84
Лампы низкого давления (ртутные)
Излучение:
линейное
й
Мощность:
малая
Особенности:
простота в использовании
Использование:
источник сравнения для калибровки
спектрометров
85
Лампы накаливания
Излучение:
у
гладкий непрерывный спектральный
р ф
профиль
Особенности:
имеют малый выход УФ
Использование:
калибровка интенсивности
86
Твердотельные источники излучения
Излучение:
широкий
й диапазон длин волн от 400 до 700 нм
Мощность:
малая
Особенности:
мало тепла
амплитудно-модулируемые до сотен мегагерц
Использование:
источники света для многих маломощных приложений 87
фотоники
Лазеры
1 — активная среда
2 — энергия накачки лазера
3 — непрозрачное зеркало
4 — полупрозрачное
у р р
зеркало
р
5 — лазерный луч
http://ru.wikipedia.org/
88
Трёхуровневая схема накачки активной среды лазера
время жизни ~ 1 мс
основной
й уровень
http://ru.wikipedia.org/
89
http://ru.wikipedia.org/
Гелий-неоновый лазер
90
LASER – Light
A lifi ti b
Amplification
by
Stimulated
Emission of
Radiation
91
Преимущества использования лазеров в
П
качестве источников возбуждения:
•
•
•
•
•
•
монохроматичность
р
пространственная когерентность
высокая степень коллимированности
р
поляризованность
высокая интенсивность
короткая длительность импульса (для импульсных
лазеров)
• перестраиваемость длины волны
• ф
формирование
р р
спекл–картины
р
92
Монохроматичность обеспечивает:
- проведение спектрального анализа с
разрешением
р
р
на много порядков
р
превышающим
р
разрешение традиционных спектрометров
- высокую степень селективности возбуждения
б
определенного сорта молекул в их смеси
- реализацию голографических,
дифрактометрических
фр
р
и интерферометрических
рф р
р
методов диагностики биообъектов
93
Пространственная когерентность дает возможность:
- получать пучки света с высокой степенью их
направленности (коллимированности)
-ф
фокусировать
у р
их на объекте д
до чрезвычайно
р
малых
размеров, что обеспечивает:
- дистанционность анализа изучаемых объектов,
- локальность исследований
й
- эффективность транспортировки излучения по
волоконным световодам
Лазеры излучают пространственно
пространственно–когерентные
когерентные
гауссовы пучки, т.е. пучки, в которых интенсивность
р пучка
у
описывается гауссовой
у
фу
функцией
поперек
94
Гауссова функция : I(r, z) = I(0, z) exp{–2[r/w(z)]},
(3.1)
I(0,
(0 z) – интенсивность в центре пучка (r = 0);
0)
w(z) – радиус пучка лазера;
r – поперечная
р
координата;
р
z – продольная координата
Угол расходимости гауссова пучка:
θ = λ / πw
w(0)
(3 2)
(3.2)
λ— длина волны излучения;
w(0) — радиус пучка в перетяжке при z = 0 (наиболее узкой части
пучка, которая обычно находится внутри резонатора лазера или на
выходном зеркале)
Гауссов пучок имеет минимально возможную расходимость
95
Г б
Глубина
резкости фокусировки определяет продольный
й
размер объема сфокусированного пучка:
Δ=±d2/λ
(3.3)
d - диаметр пучка в фокусе
При d ≈ λ Δ ≈ d ≈ λ
При d > λ глубина резкости больше размера пучка в
фокусе
96
Лазеры характеризуются высокой степенью
поляризованности излучения
Тип поляризации связан со свойствами оптического
резонатора, а иногда с особенностями активной
среды
Д лазеров
Для
р с анизотропным
р
р
резонатором
р
степень
поляризованности:
I|| : I⊥ =500:1
500 1 ((линейная)
й
)
Для лазеров с изотропным резонатором степень
поляризованности:
I|| : I⊥ =1:1 (круговая)
97
Высокая интенсивность позволяет вызвать:
- многофотонные и другие нелинейные процессы в
биологической среде
- локальный
й тепловой
й нагрев
- быстрое испарение
- гидродинамический взрыв и т.д.
тд
Спектральная плотность интенсивности излучения
при
р равных
р
мощностях, приходящихся
р
на одинаковые
площади поверхности, оказывается существенно
выше у лазерного источника, чем у теплового
98
Одним из замечательных свойств лазеров является
возможность получения импульсов пикосекундной
и субпикосекундной длительности
Чем короче импульс, тем шире его спектр,
Δν⋅τи ≈ 1 или Δλ⋅τи ≈ λ2/с,
т.е. при τи = 100 фс и λ = 500 нм, Δλ ≈ 8 нм, а в случае
приближения к теоретическому пределу τи ≈ 2 фс,
Δλ ≈ 400 нм, что перекрывает всю видимую область,
б
т.е. лазер излучает белый свет
99
Возможность перестраивать длину волны позволяет:
р в качестве спектрометров
р
р
-использовать лазеры
ультравысокого разрешения
- селективно возбуждать практически любые
состояния биомолекул
б
и отдельных ее фрагментов
100
Способность формировать спекл
спекл–картину
картину при
отражении когерентного света от шероховатой
поверхности
р
Спекл–картина:
р
101
Лекция №5
3 2 2 Дисперсионные устройства и
3.2.2.
оптические волокна
102
Оптические фильтры
Оптический фильтр является одноволновым
селектирующим устройством
Фильтры используются
• для селекции возбуждающего
у
света (ф
(фильтры
р
возбуждения)
• для удаления рассеянного возбуждающего света из
эмиссионного излучения (эмиссионные фильтры)
103
Основные категории:
• Нейтральные – используются для одинакового
ослабления света по всем д
длинам волн
• Ограничивающие – используются для удаления
паразитного излучения
• Полосные – используются для выделения
интересующей
й спектральной
й области
б
для
возбуждения или детектирования
104
про
опускание (%) пропу
ускание (%)) пропускание (%)
Схематическая диаграмма кривых пропускания
различных типов фильтров
фильтров:
(А) – фильтр верхних частот; (В) – фильтр нижних частот;
(С) – полосный фильтр
фильтр верхних частот
фильтр нижних частот
полосный фильтр
длина волны
105
пропускан
ние (%)
Типичные кривые пропускания голографического и
диэлектрического фильтров
голографический
диэлектрический
длина волны (нм)
106
Типы работы:
http://dic academic ru/dic nsf/ruwiki/941029
http://dic.academic.ru/dic.nsf/ruwiki/941029
• Поглощение (цветное стекло, желатин,
химические р
растворы,
р , газ,, сапфир
ф рищ
щелочногалоидные материалы)
• Интерференция (запыленные в вакууме слои
диэлектрика
р
и металла))
• Двулучепреломление (поляризаторы и
фазовые пластинки)
107
Монохроматоры
Монохроматоры
• используются
у
для
д разложения
р
полихроматического или белого света по
различным ц
р
цветам
• характеризуются спектральной дисперсией,
дисперсией
эффективностью и уровнями рассеянного
светового излучения
108
Монохроматоры
р
р на основе
призмы
http://us.fotolia.com/tag/ocular
Дисперсия света происходит за счет изменения
показателя преломления материала призмы с длиной
волны падающего света
Угловая дисперсия D определяется выражением
dθ dn dθ
D=
=
d λ d λ dn
θ - угловое отклонение,
отклонение n – показатель преломления
материала призмы, λ - длина волны источника света
(3.4)
109
Монохроматоры на основе
дифракционной
й решетки
падающий свет
ширина щели период решетки
d
www.ualberta.ca
дифрагированный свет
падающий свет
нормаль
решетки
дифрагированный свет
период решетки
110
Дисперсия происходит благодаря зависимости
угла дисперсии от длины волны
Основная формула ДР:
sin θ + sin θ ′ = k
λ
d
= knλ
(3.5)
где θ - угол падения, θ ′ - угол дифракции, n – число
штрихов на единицу длины, d – период решетки, k –
порядок дисперсии
111
Спектральная дисперсия DS :
DS =
dλ 1
=
dl l f
(3.6)
lf – фокальная длина линзы или зеркала
Разрешающая способность R :
R=
λ w
= ( sin θ + sin θ ′ )
Δλ λ
(3.7)
w – ширина решетки
Комбинируя уравнения (3.5)
(3 5) и (3.7),
(3 7) получим (для
k = 1)
R = wn
((3.8))
Спектральная полоса пропускания BS :
d′
BS =
l f DS
d ′ - расстояние, измеренное поперек щели
(3.9)
112
Угол блеска – это угол, под которым
штрихи нанесены на поверхность решетки,
решетки а
блеск – это длина волны, на которой
сконцентрирована максимальная
эффективность решетки
Пропускная способность света для
различных стандартных ДР варьируется от
50 до 90% и увеличивается с ростом
плотности штрихов
113
Оптическая конфигурация
ф ур
вогнутой
у
и
плоской дифракционных решеток
вогнутая
дифракционная
решётка
выходная щель
входная
д
щ
щель
выходная
хо н щ
щель
коллимирующее
зеркало
плоская решетка
входная щель
114
Оптические волокна
Оптические волокна обеспечивают оптическую связь
между
ду спектроскопическими
р
инструментами
ру
и
удаленным образцом
Типы волоконных
световодов:
а — световод без оболочки;
б — ступенчатый многомодовый
световод;
в — градиентный многомодовый
световод;
г — ступенчатый одномодовый
световод;
д — одномодовый
й световод с
сохранением поляризации типа
РАNDА;
е — волоконный жгут пучкового
115
типа
Полное внутреннее отражение света в
оптическом волокне
θc
β
полное внутреннее отражение
n0
падающий
й свет
оболочка
б
с показателем преломления n2
сердцевина с показателем преломления n1
Половина приемного угла: sin β = n12 − n22 / n0
(3.10)
n0 – показатель преломления среды, с которой граничит конец волокна
Ч
Числовая
апертура: NA ≡ n0 sin β = n12 − n22
(3.11)
116
Источник Дихроичный
света
фильтр
Возбуждение
Образец
Возбуждение
Эмиссия
Фильтр
Эмиссия
Оптика
Детектор
в
а
Возбуждение
Возбуждение
у
Возбуждение
Эмиссия
Эмиссия
Эмиссия
б
г
117
117
3.2.3. Поляризаторы
р
р
Поляризаторы пропускают свет, у которого вектор
напряженности электрического поля сонаправлен с
осью поляризации, и блокируют свет с
перпендикулярным
р
у р
направлением
р
поляризации
р
Поляризатор Глэна-Томпсона - обыкновенная
компонента луча испытывает полное внутреннее
отражение, а необыкновенная проходит
Поляроидные пленки сделаны из материалов,
поглощающих свет, поляризованный
р
в одном
направлении более сильно, чем в ортогональном
направлении
118
Лекция №6
119
3 2 4 Детекторы
3.2.4.
Типы детекторов:
• Фотоэмиссионные
• Полупроводниковые
• Тепловые
• Одноканальные
• Многоканальные
120
Одноканальные детекторы
катод
электроны
анод
фотоны
высокая разность
- потенциалов +
Фотоэлектронный умножитель (ФЭУ):
• входная (катодная) камера (образуется поверхностями фотокатода,
фокусирующих электродов, первого динода))
• умножительная динодная система
• анод
• дополнительные электроды
• все элементы размещаются в вакуумном корпусе
121
Достоинства ФЭУ:
•
•
•
•
•
у
усиление
тока до 108 р
раз
высокая спектральная чувствительность
широкий рабочий диапазон
н
низкая
стоимость
относительно простая электроника
Недостаток ФЭУ:
• наличие темнового тока, который может быть
вызван утечкой тока (несовершенство изоляции),
ионизацией
й электронами остаточных газов внутри
трубки и термоионной эмиссией из катода или
динодов
122
Фотодиоды
д д и лавинные фотодиоды
ф
д д
Схема кристалла полупроводника
123
Ф
Фотодиод
(ФД) – полупроводниковое
устройство, электрические свойства которого
изменяются под действием падающего на
него излучения
В результате поглощения фотонов в диоде
продуцируются свободные
б
носители,
которые поддерживают фототок
Недостаточное усиление сигнала
р
использование ФД при
р
ограничивает
высокочувствительных измерениях
www.mathscinet.ru
124
Примесная проводимость полупроводников
полупроводник n -типа
типа
Ge
Р
Ge
Ge
Решетка 4-х валентного
германия с примесью 5
5-ти
ти
валентного атома фосфора
– донора
Si
Si
Ge
Ge
Ge
полупроводник р -типа
типа
Si
Si
B
Si
Si
Решетка 4-х валентного
кремния с примесью 3
3-х
х
валентного атома бора
– акцептора
125
p-n переход
полупроводник
p-типа
полупроводник
n-типа
126
Лавинные фотодиоды (ЛФД) – это
фотодиоды, в которых усиление
первичного фототока достигается за
счет управляемого лавинного
умножения числа носителей заряда
www.elkomponent.ru
При подаче сильного обратного смещения
(близкого к напряжению лавинного пробоя),
происходит усиление фотото
фототока
а (примерно в 100
00
раз) за счёт ударной ионизации (лавинного
умножения) генерированных светом носителей
заряда
127
Достоинства ЛФД:
Д
Д
•
•
•
•
•
•
•
высокий коэффициент усиления (500 – 1000)
б
быстродействие
й
компактность
нечувствительность к магнитным полям
малые токи
не подверженность
д р
перегрузкам
р ру
высокая квантовая эффективность (до 90%)
Недостаток ЛФД:
• значительный темновой ток, который усиливается
ростом напряжения
р
ср
128
Гибридные детекторы
Гибридные ФЭУ и гибридные ФД это устройства,
в которых разные методы регистрации
совмещены в едином приборе
б
www.technoexan.ru
129
Многоканальные детекторы
Видикон – это телевизионный передающий
электронно-лучевой прибор с накоплением заряда,
действие которого
оторого основано на внутреннем
фотоэффекте
Схема видикона :
1- фотопроводящая мишень;
2 - электронный луч;
3 - катод;
4 - ускоряющий анод;
5 - окно;
6 - сетка-коллектор;
р
7 - фокусирующие и
отклоняющие катушки
http://dic.academic.ru/dic.nsf/enc_physics/1972/ПИРОЭЛЕКТРИКИ
130
www chipdip ru
www.chipdip.ru
Видикон
131
Трубки с пироэлектрической мишенью
(пириконы) чувствительны к
инфракрасному излучению в
диапазоне длин волн 8 – 14 мкм
Их применяют в тепловизорах,
предназначенных для наблюдения
слабо нагретых объектов
www.ppu21.ru/article/539.html
www flir su/art/9/13/37 html
www.flir.su/art/9/13/37.html
www.railway.te.ua/energ_ir.htm
132
Фотодиодная матрица (ФДМ) - это электронное
устройство дискретного действия с n входными и m
выходными шинами (проводниками), соединёнными
между собой полупроводниковыми ФД так,
так что
интенсивность света на входах однозначно
соответствуют аналоговому сигналу на выходах
Большинство многоканальных ФДМ
имеют кремниевую основу и
работают в диапазоне от 180 до 1100
нм
С помощью ФДМ может
осуществляться импульсное
детектирование с разрешением по
времени менее 5 нс
www.azimp.ru/
133
В приборе
р
р с зарядовой
р
связью (ПЗС)
считывание электрического
потенциала происходит методом
сд иг заряда
сдвига
з р д от элемента
эл м нт к
элементу
0V
+V
0V
0V
www.polyset.ru/glossary/ПЗС-матрица.php
SiO2
p - Si
пиксел
134
Схема работы ПЗС (CCD)-сканера
Оригинал
Зеркало
Источник света
Зеркало
ПЗС-линейка
Линза
К аналоговоцифровому
преобразователю
http://djvu-soft.narod.ru/scan/scanner_raw.htm
135
Достоинства ПЗС:
•
•
•
•
•
•
•
высокая квантовая эффективность (95
(95-98%),
98%)
быстродействие
возможность построения двухмерного изображения
очень низкий уровень темнового тока
у
устойчивость
компактность
широкий спектральный диапазон
136
В матрице комплементарных металло-оксидных
полупроводников (КМОП-матрице)
(КМОП
) заряд пикселя
преобразуется в напряжение прямо в пикселе, после
чего может быть считан
Достоинства КМОП
КМОП-матрицы
матрицы по
сравнению с ПЗС-матрицей:
•
•
•
•
можно считывать напряжение
отдельных пикселей
нет утечки заряда
ниже энергопотребление
дешевле производство
www.thg.ru
КМОП-технология является доминирующей
КМОП
й
полупроводниковой технологией для изготовления
микропроцессоров памяти и интегральных
микропроцессоров,
микросхем
137
Электронно-оптическая
Электронно
оптическая камера (ЭОК) «streak camera»
работает путем преобразования временного профиля
импульса
у
в пространственный
р
р
профиль
р ф
на детекторе,
р
вызывая зависящие от времени отклонения луча на
детекторе
Достоинства ЭОК:
•
обеспечивает высокоскоростную
временную селекцию с
разрешением по времени от
нескольких пикосекунд до сотен
фемтосекунд
http://nanoscan.ru/
•
может одновременно проводить
измерения временной задержки на
различных длинах волн
138
3.3.
3
3 Методы измерения
оптических параметров
биотканей
139
Методы измерения
• Прямые
р
• Косвенные
140
Прямые
р
методы - в основе лежат базовые
понятия и определения
(закон Бугера – Беера, фазовая функция однократного рассеяния,
эффективная глубина
б
проникновения света))
Измеряемые параметры: коллимированное пропускание и
индикатриса рассеяния или освещенность внутри объемной среды
Достоинство - простота аналитических выражений:
I ( z)
T=
= (1 − R ) exp ( − μt z )
коэффициент экстинкции
I0
1
1− g 2
p (θ ) =
фактор анизотропии рассеяния
4π (1 + g 2 − 2 g cos θ )3/ 2
длина свободного пробега фотона
l ph = 1/ μt
Недостаток – необходимость строгого выполнения условий
эксперимента, соответствующих модели
141
Косвенные методы - решение обратной задачи
К
рассеяния на основе использования той или иной
теоретической
й модели распространения света в среде
142
Методы измерения
• Прямые
• Косвенные
• итерационные
• неитерационные
143
Неитерационные методы используют уравнения,
уравнения в
которых оптические свойства определяются через
параметры, непосредственно связанные с
измеряемыми величинами
Достоинство – нет необходимости в строгом выполнении
условий эксперимента, соответствующих модели
Недостаток – снижение точности за счет использования
упрощений в построении теоретической модели
144
В итерационных методах оптические свойства
выражаются
р
неявно через
р измеряемые
р
параметры
р
р
Величины, определяющие оптические свойства
рассеивающей
й среды, перебираются
б
до тех пор,
пока расчетные значения не будут с заданной
точностью совпадать с измеренными
Достоинство – возможность использования более сложных
оптических моделей, лучше описывающих реальные
биоткани
Недостаток – громоздкость вычислений
145
Измерения
р
с использованием
интегрирующей сферы
И
Интегрирующей
й сферой
й называется полая внутри
сфера достаточно большого диаметра, покрытая
изнутри веществом с альбедо близким к единице
146
Метод двух интегрирующих сфер в сочетании с
измерениями коллимированного пропускания
заключается в последовательном или одновременном измерении
трех параметров: коллимированного пропускания Тс ,
полного пропускания Т = Тс + Тd (Td - диффузное пропускание) и
диффузного отражения Rd
Двойная интегрирующая
сфера
Образец
147
Любые три измерения достаточны для
определения всех трех оптических
параметров (μa, μs, g):
1. полное (или диффузное) пропускание для
коллимированного
р
или диффузного
ффу
облучения,
у
2. полное (или диффузное) отражение для
коллимированного или диффузного облучения,
3. поглощение образца, помещенного внутри
интегрирующей сферы,
4. коллимированное пропускание (нерассеянного
света),
5 угловое распределение рассеянного образцом
5.
б
излучения.
148
Источники погрешностей
р
при
р подсчете
значений оптических коэффициентов:
• физиологическое состояние биологических образцов;
• геометрия облучения;
• согласованность — несогласованность показателя
преломления на границах;
• взаимная ориентация регистрирующих световодов и
световода — источника;
• значения числовой апертуры регистрирующих световодов;
• угловое разрешение фотодетекторов;
• отделение рассеянного вперед излучения от нерассеянного;
• теория,
теория используемая для решения обратной задачи.
задачи
149
Гониофотометрические измерения
Гониофотометрия - это измерение
зависимости интенсивности рассеянного
образцом света от угла рассеяния на выходе из
образца
При
р использовании оптически тонких
образцов (d =1/μt) можно непосредственно
определить коэффициент экстинкции
лазер
кварцеая
пластина
образец
эпидермиса
кварцеая полусфера
μt = − ln( I / I 0 ) / d
где I -интенсивность света, прямо прошедшего
через образец, I0 - интенсивность падающего пучка,
d - толщина образца
р
ткани
детектор со щелью
150
Определение фазовой функции и фактора
анизотропии по результатам
гониофотометрических измерений оптически
тонкого образца ткани
• Измеряется индикатриса однократного рассеяния
fn = f(θn) для набора углов рассеяния θn в диапазоне
(0°, 180°), где n = 1…N
• Фактор
Ф
анизотропии в этом случае:
N
g = π ∑ (sin θ n +1 − sin θ n )( f n +1 + f n )
(3.12)
n =1
151
Измерение показателей преломления
б
биотканей
й
Метод
д лазерной
р
р
рефрактометрии:
фр
р
Закон Снелла (2.7)
(2.7):
sin θ 2 =
n1
sin θ1
n2
Метод регистрации отражения Френеля (2.9):
R = 1− T =
Метод ОКТ:
( n1 − n2 )
2
( n1 + n2 )
2
dслоя=dijnij
Метод временного сдвига сверхкороткого импульса
152