Диссертация - Институт молекулярной и клеточной биологии СО
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК На правах рукописи Разум Кристина Владимировна ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА И ПАЛЛАДИЯ С ЭУКАРИОТИЧЕСКИМИ КЛЕТКАМИ IN VITRO И IN VIVO 03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: профессор, д.б.н. Рябчикова Елена Ивановна Новосибирск – 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ….……………………………....5 ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………….……...6 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………..……..…………………………14 1.1. Визуализация и характеризация наночастиц в суспензии….....….16 1.2. Визуализация взаимодействия наночастиц с клетками……......….20 1.3. Проникновение наночастиц в клетки посредством прямого пересечения мембран……………………………………………..…………23 1.4. Пути поглощения веществ клетками…………………………….....24 1.5. Проникновение наночастиц в клетки посредством эндоцитоза ………………………………………………………………………………...31 1.5.1. Контакт наночастиц с плазматической мембраной клеток......31 1.5.2. Клатрин-зависимый эндоцитоз наночастиц…………….…......34 1.5.3. Кавеолин-зависимый эндоцитоз наночастиц……………….....36 1.5.4. Клатрин-кавеолин-независимый эндоцитоз наночастиц…......36 1.5.5. Фагоцитоз наночастиц…………………………………………..37 1.5.6. Макропиноцитоз наночастиц…………………………….……..39 1.5.7. «Судьба» наночастиц в клетках………………………………...39 1.6. Токсические эффекты наночастиц…….…………………………....40 1.7. Заключение.…………………………………………………………..44 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..……………………………………..46 2.1. Материалы …………………………………………………….....…..46 2.2. Приборы………………………………………………………...…….47 2.3. Синтез наночастиц………………………………………..………….47 2.4. Модификация наночастиц…………………………………….……..48 2.5. Методы характеризации наночастиц….………………………....…49 2.6. Изучение поведения наночастиц в культуральных средах………..50 2.7. Работа с животными…….…………………………………………...51 3 2.8. Культуры клеток……………………….……………………….....…51 2.9. Обработка наночастиц для исследований на культурах клеток….52 2.10. Исследование токсичности наночастиц in vitro…………………..53 2.11. Изучение взаимодействия наночастиц с клетками методом световой микроскопии………………………….……………………….......54 2.12. Изучение взаимодействия наночастиц с клетками методом просвечивающей электронной микроскопии……………………………..55 2.12.1. Культивирование клеток………………………………….......55 2.12.2. Приготовление препаратов для ультраструктурного исследования………………………………………………………………...56 2.13. Изучение способности наностержней золота вызывать фототермолиз в клетках ВНК-21 и В16 при облучении лазером in vitro …….…………………………..........................................................................56 2.14. Исследование способности наностержней золота вызывать фототермолиз меланомы мыши В16 при облучении лазером in vivo ………………………………………………….………………………….....58 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ……………...……………………………………..60 3.1. Физико-химические характеристики препаратов наночастиц…...60 3.2. Поведение наночастиц палладия в культуральных средах..………..………………………………………………………......….62 3.3. Поведение наносфер и наностержней золота в культуральных средах………………………………………………………………....…...….66 3.4. Изучение ультраструктурных характеристик суспензий наносфер и наностержней золота в культуральных средах………………….…….…...69 3.5. Морфология культур клеток, использованных в работе.…….........73 3.6. Взаимодействие наносфер золота с перитонеальными макрофагами и клетками культуры MDCK ………………………………………….……75 3.7. Взаимодействие наночастиц палладия с клетками культуры MDCK и с перитонеальными макрофагами..…..………………………..…………80 4 3.8. Взаимодействие наносфер и наностержней золота с клетками культур ВНК-21 и В16………….…………………………………………..85 3.9. Исследование способности наностержней золота вызывать фототермолиз в клетках ВНК-21 и В16 при облучении лазером in vitro………………………………………….….……………………….....…92 3.10. Исследование способности наностержней золота вызывать фототермолиз меланомы мышей В16 при облучении лазером in vivo……………………………………………………………………..……..95 Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ…………………………….….101 ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………….114 ВЫВОДЫ……..…………………………………………………………….117 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………...………………….118 5 СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) - культуральная среда Игла в модификации Дульбекко IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium) - культуральная среда Дульбекко в модификации Исковым БСА - бычий сывороточный альбумин БСА-НСЗ - наностержни золота, покрытые бычьим сывороточным альбумином БСА-НЧЗ - наночастицы золота, покрытые бычьим сывороточным альбумином ДСР – динамическое светорассеяние НСЗ – наностержни золота НСЗ760 – наностержни золота с поверхностным плазмонным резонансом на длине волны 760 нм НСЗ840 – наностержни золота с поверхностным плазмонным резонансом на длине волны 840 нм НЧ – наночастицы НЧЗ – сферические наночастицы золота (наносферы) НЧП – наночастицы палладия ПВП - поливинилпирролидон ПЭГ – полиэтиленгликоль ПЭИ – полиэтиленимин ПЭИ-НСЗ – наностержни золота, покрытые полиэтиленимином ПЭИ-НЧЗ – наночастицы золота, покрытые полиэтиленимином ПЭМ – просвечивающая электронная микроскопия ЦТАБ - цетилтриметиламмоний бромид ЦТАБ-НСЗ - наночастицы золота, стабилизированные цетилтриметиламмонием бромидом 6 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. В настоящее время нанобиомедицина и нанотехнологии активно развиваются, интерес к этим областям обусловлен возможностью разработки систем направленного действия на основе наночастиц, что открывает новые перспективы в обнаружении и лечении заболеваний, в том числе - злокачественных (Menon et al. 2013; Schröfel et al. 2014; Shah et al. 2014). Значимой проблемой является выяснение механизмов взаимодействия наночастиц с клетками, понимание которых необходимо для разработки лечебных препаратов с адресной доставкой на уровне клетки, а также для оценки возможных негативных эффектов наночастиц, с которыми сталкиваются живые организмы. Однако, механизмы проникновения наноматериалов в клетки, их распределение в клеточных структурах, динамика и объемы накопления и, в целом, «судьба» наночастиц после попадания в клетки, остаются непонятыми (Teske, Detweiler et al. 2015), что определяет актуальность данной работы. Другим важным аспектом, определяющим актуальность данного исследования, является потенциальная опасность вредного воздействия наночастиц на окружающую среду и здоровье человека. Бурное развитие нанотехнологий и внедрение наноматериалов во все области жизнедеятельности человека приводит к увеличению контактов людей и животных с наноразмерными объектами, мутагенными, канцерогенными и другими которые могут негативными обладать свойствами (Супотницкий 2013; Khlebtsov, Dykman 2011; Maurer-Jones et al. 2013). Наночастицы используются в лекарственных препаратах, косметике и продуктах повседневного использования (Schröfel et al. 2014). Хорошо известно, что вдыхание загрязненного воздуха, содержащего микро- и наноформы металлов, оказывает вредное воздействие на здоровье людей, приводящее к сердечно-сосудистым и респираторным заболеваниям (Kampa, Castanas 2008). Ряд исследований показывает нарастание в окружающей 7 среде количества наночастиц металлов, являющихся результатом деятельности человека или следствием экологических и природных катастроф (Whiteley, Murray 2003; Buzea et al. 2007; Leopold et al. 2008; Roy et al. 2014), большой «вклад» в этот процесс вносят наночастицы, попадающие в воздух при работе автомобильных двигателей. Механизмы воздействия таких наночастиц на клетки не исследованы, что является еще одним фактором, определяющим актуальность данного исследования. Цели и задачи исследования. Целью данной работы явилось исследование взаимодействия наночастиц золота и палладия с макрофагальными, эпителиальными, фибробластоидными и опухолевыми клетками. В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1. Изучить структурные и физико-химические параметры препаратов наносфер, наностержней золота и наночастиц палладия в различных жидкостях, включая культуральные среды; 2. Исследовать взаимодействие наносфер золота и наночастиц палладия с перитонеальными макрофагами первичной культуры и в условиях организма; 3. Исследовать взаимодействие наносфер золота и наночастиц палладия с клетками эпителиальной культуры MDCK; 4. Изучить взаимодействие наностержней золота с клетками культуры ВНК-21 и клетками меланомы В16; 5. Исследовать способность наностержней золота вызывать фототермолиз клеток меланомы В16 в культуре и на животных при облучении лазером. 8 Научная новизна. В настоящей работе впервые описаны механизмы проникновения наносфер, наностержней золота и наночастиц палладия в эукариотические клетки. Впервые выявлены прямое пересечение мембран клеток MDCK наночастицами палладия и эндоцитоз наностержней золота посредством циркулярных дорзальных складок. Впервые показано, что модификация наностержней золота различными веществами не влияет на механизм их эндоцитоза. Установлена «судьба» наносфер и наностержней золота в клетках, которые накапливаются в фагосомах и лизосомах, и не выходят за их пределы. Выявлено накопление наночастиц палладия в ядре и, в меньшей степени, в цитоплазматических органеллах. Впервые показана определяющая роль природы клеток в реализации механизмов взаимодействия наночастиц палладия с клетками. Установлена связь между пересечением клеточных мембран наночастицами палладия и их повреждающим действием на модели эпителиальных клеток. Впервые показан фототермический эффект наностержней золота, модифицированных линейным полиэтиленимином, на меланоме мышей, открывающий новые перспективы использования наностержней золота в ветеринарной и медицинской практике. Научно-практическая значимость исследования. В данной работе получены новые фундаментальные знания о «поведении» в разных жидкостях и механизмах проникновения наносфер и наностержней золота, а также наночастиц палладия в эукариотические клетки и о «судьбе» этих наночастиц в клетках. Результаты исследования могут быть использованы (1) при разработке систем адресной доставки медицинских препаратов на основе наночастиц золота и (2) в разработке методов лечения поверхностных опухолевых образований с помощью направленного фототермолиза клеток с применением наностержней золота и лазерного облучения. Данные о свойствах наностержней золота, модифицированных новым методом, позволят расширить область применения этих уникальных наночастиц в 9 области нанобиомедицины. наночастиц палладия с Результаты макрофагами исследования и взаимодействия эпителиальными клетками раскрывают механизмы потенциального вреда наночастиц, образуемых в результате антропогенного воздействия, и позволяют прогнозировать «судьбу» наночастиц в условиях организма. Разработанные экспериментальные модели изучения взаимодействия наночастиц с клетками могут быть использованы для изучения «биологических» свойств наночастиц других металлов. Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения и заключения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в котором содержится 190 ссылок. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 2 таблицы и 32 рисунка. Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах и 6 тезисов конференций. Статьи: 1. Razum K.V., Troitski S.Y., Pyshnaya I.A., Bukhtiyarov V.I., Ryabchikova E.I. Macrophages and epithelial cells differently respond to palladium nanoparticles // Micro and Nanosystems. – 2014. - Vol. 6. - N 2. - P. 133-141. 2. Pyshnaya I.A., Razum K.V., Poletaeva J.E., Pyshnyi D.V., Zenkova M.A., Ryabchikova E.I. Comparison of behaviour in different liquids and in cells of gold nanorods and spherical nanoparticles modified by linear polyethyleneimine and bovine serum albumin // BioMed Res Int. – 2014. – Vol. 2014. – P. 1-13. 10 3. Разум К.В., Троицкий С.Ю., Пышная И.А., Бухтияров В.И., Рябчикова Е.И. эпителиальными Взаимодействие клетками наночастиц MDCK и палладия с перитонеальными макрофагами in vitro // Ж. Российские нанотехнологии. - 2014. - Т. 9. - № 11-12. - С. 83-88. 4. Полетаева Ю.Е., Разум К.В., Пышная И. А., Марченко А. К., Пышный Д. В., Зенкова М. А., Рябчикова Е. И. Взаимодействие наночастиц золота с эукариотическими клетками в культуре и в условиях организма // Ж. Нанотехнологии и охрана здоровья. – 2014. - Т. 6. - № 1. - С. 36-46. Тезисы конференций: 1. Spitsyna Y.E., Pyshnaya I.A., Marchenko A.K., Razum K.V., Pyshnyi D.V., Ryabchikova E.I. Pathways of gold nanoparticles internalization by different types of eucaryotic cells // The Eighth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure/Systems Biology, June 25-29, 2012, Novosibirsk, Russia, 2012, P. 165. 2. Razum K, Pyshnyi D, Pyshnaya I, Goncharova E, Ryabchikova E. Polyethylenimine-coated gold nanorods: biocompatibility and photothermal effect // Second International School-Conference “Applied Nanotechnology and Nanotoxicology”, August 15-19, 2013, Listvyanka, Baikal Lake, Irkutsk Region, Russia: Book of Abstracts, ed.: Dr. Aleksey Vedyagin, Boreskov Institute of Catalysis SB RAS, Novosibirsk, Russia, 2013, 192 p. ISBN 978-5-9902557-8-5 P. 56-57. 11 3. Razum K, Trouzhkyi S, Bukhtiyarov V, Ryabchikova E. Palladium nanoparticles: effects on macrophages and epithelial cells // Second International School-Conference “Applied Nanotechnology and Nanotoxicology”, August 15-19, 2013, Listvyanka, Baikal Lake, Irkutsk Region, Russia: Book of Abstracts, ed.: Dr. Aleksey Vedyagin, Boreskov Institute of Catalysis SB RAS, Novosibirsk, Russia, 2013, 192 p. ISBN 978-5-9902557-8-5 P. 93-94. 4. Пышная И.А., Разум К.В., Ломзов А.А., Пышный Д.В., Рябчикова Е.И. Фототермические эффекты наностержней золота в системах in silico, in vitro и in vivo // Физика и радиоэлектронника в медицине и экологии: Доклады 11-й международной научной конференции. Книга 1. Владимир, 1-3 июля, 2014 г. ISBN 978-5905527-08-1. С. 204-209. 5. Ryabchikova E., Razum K., Pyshnaya I. Nature of nanoparticles calls for studies with cells at nanolevel // 21th Annual CSCM – WORLD CONGRESS ON CBRNe SCIENCE & CONSEQUENCE MANAGEMENT. Tbilisi, Georgia, 1-5 June 2014. 6. Разум К.В., Пышная И.А., Троицкий С.Ю., Рябчикова Е.И. Закономерности взаимодействия наночастиц золота и наночастиц палладия с эукариотическими клетками на ультраструктурном уровне // I Международная конференция молодых ученых: биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов, 7-8 октября, 2014, Наукоград Кольцово: Сб. тез. / Новосиб. гос. ун-т. Новосибирск: РИЦ НГУ, 2014. 155 с. ISBN 978-5-4437-0297-1 С. 35-39. 12 Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 8й международной конференции по биоинформатике, регуляции генома и структурно-системной биологии (Новосибирск, 2012), на 2-й международной школе-конференции «Прикладная нанотехнология и нанотоксикология» (Иркутск, 2013), на 11-й международной научной конференции (Владимир, 2014), на 21-м ежегодном всемирном конгрессе по науке и ликвидации последствий (Тбилиси, Грузия, 2014) и на 1-й международной конференции молодых ученых: биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов «OpenBio» (Новосибирск, 2014). Вклад автора. Эксперименты по светооптическому и электронномикроскопическому изучению взаимодействия наночастиц с клетками были выполнены автором самостоятельно. Синтез и модификация наносфер и наностержней золота были осуществлены к.х.н. И.А. Пышной (лаб. бионанотехнологии, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН), синтез наночастиц палладия проведен к.х.н. С.Ю. Троицким (лаб. гетерогенного катализа, Институт катализа СО РАН). Характеризация наночастиц методом динамического светорассеяния проведена к.х.н. И.А. Пышной. Работа с культурами клеток проводилась под руководством вед. инженера А.В. Владимировой (лаб. биохимии нуклеиновых кислот, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН). Облучение лазером культур клеток проведено под руководством д.х.н. Д.В. Пышного (зав. лаб. бионанотехнологии, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН), облучение лазером меланомы мышей выполнено к.ф.-м.н А.А. Ломзовым (лаб. бионанотехнологии, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН) совместно с д.х.н. Д.В. Пышным. Меланома В16 мышам была привита к.б.н. Е.П. Гончаровой (лаб. биохимии нуклеиновых кислот, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН). 13 Благодарность. Автор глубоко признателен всем сотрудникам группы микроскопических исследований под руководством проф. Е.И. Рябчиковой и лаборатории биохимии нуклеиновых кислот под руководством проф. М.А. Зенковой за помощь в выполнении настоящей работы. Особую благодарность автор выражает своему научному руководителю проф. Е.И. Рябчиковой за постановку задачи, научное руководство, помощь в подготовке диссертации и всестороннюю поддержку. Автор выражает огромную благодарность д.х.н. Д.В. Пышному и к.х.н. И.А. Пышной (лаб. бионанотехнологии) за участие в планировании, проведении и реализации экспериментов с наночастицами. Автор благодарен вед. инженеру А.В. Владимировой (лаб. биохимии нуклеиновых кислот) за обучение и помощь в работе с культурами клеток, а также зав. виварием ИХБФМ СО РАН А.Г. Можной за руководство в работе с животными. Автор признателен проф. М.А. Зенковой и к.б.н. Е.П. Гончаровой за участие в планировании и осуществлении эксперимента по изучению фототермолиза наностержней золота при облучении лазером. Данная работа поддержана междисциплинарным интеграционным проектом СО РАН № 57 «Нанобиобезопасность: эффекты наночастиц на разных уровнях биологической организации – от молекул до организма», 2012-2014 гг. и государственным заданием Минобрнауки (НИР 4.3924.2011) «Исследование тонких механизмов взаимодействия наночастиц металлов с эукариотическими клетками in vitro и in vivo». 14 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Открытие новых свойств у привычных материалов при их переходе к нанометровым размерам привело к бурному развитию нанотехнологий, в том числе к внедрению нанотехнологических подходов в промышленности и биомедицинских исследованиях. Применение в лечении заболеваний крошечных частиц, способных взаимодействовать с отдельными клетками, из области фантастики переходит в научные исследования, направленные, в первую очередь, на разработку систем доставки эффекторных молекул к пораженным болезнью клеткам и органам. Новая область науки, называемая «нанобиотехнология», бурно развивается, предлагая все новые наночастицы (НЧ) с уникальными свойствами. В настоящее время термин «наночастица» подразумевает отдельный твердофазный объект, имеющий отчетливо выраженную границу с окружающей средой, размеры которого в двух или трех измерениях находятся в диапазоне от 1 до 100 нм и который харакетризуется появлением новых свойств, отличных от свойств объемной фазы того же материала (Фатхутдинова и др. 2009). Наночастицы применяют при создании и производстве медицинского инструментария и оборудования, новых перевязочных материалов (Allaker 2010; Liao et al. 2010), важное место занимают разработки лекарственных препаратов и средств диагностики с использованием НЧ (Jain et al. 2008; Ткачук 2009; Schröfel et al. 2014). Обширную нишу занимают НЧ золота, возможность применения которых исследуется в таких областях, как клеточная визуализация и диагностика (Imura et al. 2004; El-Sayed et al. 2005; Jain et al. 2008; Pissuwan et al. 2008), направленная доставка лекарственных препаратов (Paciotti et al. 2004; ElSayed et al. 2005; Bergen et al. 2006; Jelveh, Chithrani 2011), а также фототермическая терапия раковых заболеваний (Huang et al. 2006; Huff et al. 2007; Huang et al. 2008;Alkilany et al. 2011; Menon et al. 2013). Малый размер НЧ позволяет сочетать в одной единице вещества различные полезные свойства и, соответственно, предполагает создание эффективных 15 комбинированных препаратов. В настоящее время наночастицы находят успешное применение в технике, при производстве косметики и в качестве наполнителей в пищевой и фармацевтической промышленности (Yin et al. 2013), тогда как их использование в лечении и диагностике заболеваний остается на стадии разработок. Использование НЧ в биомедицинских целях требует понимания механизмов их взаимодействия с клетками и органами человека, а также изучения потенциального вреда, который могут нанести НЧ живым организмам. В настоящее время эта область знаний существенно отстает от исследований, направленных на прикладные аспекты применения НЧ, априори предполагается, что НЧ обладают только позитивными свойствами (Doane, Burda 2012). Тем не менее, в обществе и в среде ученых существуют серьезные опасения по поводу возможного негативного влияния НЧ на живые организмы. Бурное развитие нанотехнологий и внедрение наноматериалов во все области жизнедеятельности человека приводит к росту контактов людей и животных с наноразмерными объектами, которые могут обладать мутагенными, канцерогенными и другими негативными свойствами (Maurer-Jones et al. 2013). К сожалению, в настоящее время не уделяется должного внимания проблеме безопасности использования НЧ и, несмотря на успехи, достигнутые при их изучении, сложившиеся представления о процессах, протекающих с участием НЧ на клеточном уровне и в организме, ограничены. Несомненно, объективное представление о влиянии НЧ на живые организмы можно составить только на основе комплексных исследований на различных уровнях организации жизни, в том числе и на клеточном уровне, и эти исследования еще предстоит провести. Интересно, что в фармацевтической промышленности НЧ изначально включали в препараты для снижения их токсичности и уменьшения побочных эффектов, и долгое время не принималось во внимание, что несущие наносистемы сами по себе могут быть опасны для пациента (De Jong, Borm 2008). В настоящее время в ходе экспериментов in vitro и in vivo 16 ведется интенсивный поиск экспериментальных моделей и информационных тестов, которые могли бы использоваться в будущих исследованиях НЧ. Размеры НЧ сопоставимы с размерами клеточных структур и макромолекул, что определяет принципиально иной характер их взаимодействия с клетками, нежели взаимодействие обстоятельство клеток определяет с микро- безусловную и макрообъектами. необходимость Это исследований тонких механизмов взаимодействия НЧ с клетками и выявление их потенциально негативных эффектов на субмикроскопическом уровне. Данный обзор научной литературы посвящен анализу поведения наночастиц в различных биологических системах. 1.1. Визуализация и характеризация наночастиц в суспензии Наночастицы, используемые в биомедицинских исследованиях, синтезируют из разнообразных материалов: золота, серебра, железа, титана, меди, кремния и др. Исследователи разработали методы получения НЧ разной формы и сложности: сферические, нанооболочки, наностержни, нанотрубки, нанозвезды, нанокоробочки и др. Наиболее распространены в биомедицинских исследованиях НЧ, приготовленные из инертного для организма металла золота (Pissuwan et al. 2008; Menon et al.,2013; Shah et al. 2014). Методы синтеза НЧ представляют собой отдельную область науки, представленную сотнями публикаций, которая не является предметом наших исследований и не будет освещена в данном обзоре. Важной характеристикой препаратов НЧ, предназначенных для применения в биомедицинских исследованиях, является соответствие критериям безопасности и стандартизации (Каркищенко 2009). Изучение препаратов НЧ начинают с их визуализации, определения размеров и формы. Увидеть НЧ можно с помощью атомно-силовой, растровой и просвечивающей электронной микроскопии (Красовский и др. 2009). Для определения размеров НЧ используют также непрямые методы, в частности, динамическое светорассеяние и спектроскопию. Метод динамического 17 светорассеяния (ДСР) наиболее распространен в научной практике, однако, он позволяет установить лишь гидродинамический размер НЧ в диапазоне от 5 мкм до 3 нм, который может существенно отличаться от истинного (Arnida et al. 2011; Mikhaylov, Vasiljeva 2011). Достоинством этого метода является возможность получения интегральных оценок препарата НЧ и определение соотношения НЧ разных размеров (Красовский и др. 2009). Оптимальным подходом к характеризации препаратов НЧ является сочетание непрямых методов и электронной микроскопии. Сведения о физико-химических характеристиках НЧ являются необходимой отправной точкой в нанобиомедицинских исследованиях, а их набор определяется задачами исследования и возможностями приборной базы. Необходимым и немаловажным в характеризации препаратов НЧ является изучение их дисперсности и ее изменений в зависимости от величины рН, заряда НЧ, а также исследование сохранения структуры и размеров НЧ в биологических средах (Pérez-Juste et al. 2005; Jiang et al. 2009; Samim et al. 2011). Синтез НЧ, как правило, сопровождается использованием агрессивных химических веществ и сред с высокой кислотностью, что делает полученные препараты НЧ несовместимыми с живыми клетками. Для использования синтезированных НЧ в медико-биологических исследованиях необходима специальная подготовка, обеспечивающая получение высокодисперсной суспензии НЧ в растворе, имеющем физиологическую величину рН (7,2–7,4). Такой препарат будет пригоден для внесения в культуры клеток и для введения животным, однако, его получение сопряжено с рядом сложностей. Так, рутинное разведение препаратов НЧ фосфатным буфером зачастую приводит к их выраженной агрегации с образованием макроформ и, соответственно, потерей нано-свойств (Арсентьева и др. 2007; Jiang et al. 2009). Для повышения биосовместимости препаратов НЧ с клетками и уменьшения агрегации используют добавление сыворотки крови (Elder et al. 2007; Pelka et al. 2009) или сывороточного альбумина (Casals et al. 2010; 18 Dominguez-Medina et al. 2013). Очевидно, это приводит к изменению физикохимических свойств НЧ. Опубликованы многочисленные исследования поведения НЧ в таких растворах, целью которых является стремление понять, как будут изменяться свойства НЧ при попадании в культуру клеток, а также в кровь животных и человека. Кровь и культуральная среда, в которой растут системами, клетки, являются содержащими питательные вещества, сложными электролиты, метаболиты и белки, многокомпонентными липиды, различные другие активные соединения. Понимание химических и физических аспектов взаимодействия НЧ с компонентами крови и культуральной среды является первоочередной задачей при изучении взаимодействия НЧ с живыми организмами. В условиях организма и в культуре клеток на поверхности НЧ могут адсорбироваться ионы или биомолекулы с образованием слоя разной толщины, который называется, соответственно, ионной (Xu et al. 2012) или белковой «короной» (Cedervall et al. 2007A; Monopoli et al. 2011). Формирование «короны» вокруг НЧ неизменно ведет к увеличению их размеров и изменению композиционного состава. Изменение размеров НЧ можно зарегистрировать путем измерения их гидродинамического диаметра с помощью метода динамического светорассеяния, однако без электронномикроскопического исследования будет невозможно понять, связан этот прирост с появлением «короны», или обусловлен агрегацией НЧ (формирование кластеров) (Schäffler et al. 2013). С помощью электронного микроскопа можно прямо измерить размер отдельных частиц и толщину «короны» на их поверхности, а также оценить степень агрегации НЧ. Сочетание этих двух методов позволяет достаточно точно описать поведение НЧ при их внесении в ту или иную биологическую жидкость. О способности НЧ адсорбировать на своей поверхности белки было известно давно, однако особое внимание этому факту стали уделять в последние 10-15 лет, что связано с ростом числа исследований биологических свойств наночастиц (Cedervall et al. 2007A; Cedervall et al. 19 2007Б). Было замечено, что одни и те же наноматериалы могут вызывать различные биологические реакции в зависимости от того, присутствует или отсутствует на их поверхности «корона» (Lesniak et al. 2012). Кроме того, условия проведения экспериментов могут влиять на уровень поглощения НЧ клетками и обуславливать различия во внутриклеточной локализации НЧ и их воздействии на клетки (Maiorano et al. 2010). Формирование сопровождается макромолекулярного смещением слоя на инфракрасного поверхности пика НЧ поверхностного плазмонного резонанса, изменением поверхностного заряда и увеличением гидродинамического диаметра (Casals et al. 2010), которые регистрируются методами динамического светорассеяния, плазмонного резонансного светорассеяния и спектроскопии поглощения в ультрафиолетовой и видимой областях света (Maiorano et al. 2010). Электрофорез в полиакриламидном геле и масс-спектроскопия позволяют определить основные компоненты «короны» (Casals et al. 2010; Maiorano et al. 2010). При характеризации «короны» НЧ нередко определяют и такие параметры, как скорость ее формирования и время «жизни» (Lesniak et al. 2012). Связывание белков с поверхностью НЧ происходит обычно посредством водородных связей, сольватационных эффектов или Ван-дерВаальсовых взаимодействий (Saptarshi et al. 2013). В целом, формирование комплекса наночастица-белок является многофакторным процессом и зависит как от характеристик НЧ, так и от белков окружающей среды. Композиция «короны» НЧ in vitro и in vivo различается (Monopoli et al. 2011). В условиях организма, попав в кровь, НЧ немедленно покрываются белками сыворотки (Lundqvist et al. 2008; Lynch, Dawson 2008; Dobrovolskaia et al. 2009; Lynch et al. 2009), тогда как in vitro НЧ могут долгое время не контактировать с сывороточными белками (Mahmoudi et al. 2011). Установлено, что состав «короны» зависит от соотношения доступной для белков поверхности НЧ и от используемого при синтезе НЧ материала (Monopoli et al. 2011), на адсорбцию белков также влияют поверхностные 20 характеристики и размер НЧ (Cedervall et al. 2007А; Lundqvist et al. 2008; Maiorano et al. 2010; Ashkarran et al. 2012). Белковая «корона» динамична, ее состав меняется с течением времени из-за непрерывного процесса присоединения и отсоединения белков (Casals et al. 2010; Barrán-Berdón et al. 2013), причем состав «короны» вокруг НЧ не всегда отражает количественное содержание белка в окружающей жидкости (Cedervall et al. 2007Б; Casals et al. 2010; Maiorano et al. 2010; Barrán-Berdón et al. 2013). Например, сначала в составе «короны» преобладают человеческий сывороточный альбумин и фибриноген, но впоследствии они замещаются белками с более низкой концентрацией, но более высоким сродством к поверхности НЧ, например, аполипротеином Е (Cedervall et al. 2007Б). Основным компонентом белковой «короны» НЧ золота считается альбумин сыворотки, второстепенными компонентами могут выступать иммуноглобулины и транспортные белки сыворотки (Casals et al. 2010; Schäffler et al. 2013). Формирование «короны» может способствовать стабилизации НЧ в богатых солевых растворах, предотвращая их агрегацию и выпадение в осадок (Dominguez-Medina et al. 2013) либо, наоборот, вызывать агломерацию НЧ (Verma, Stellacci 2010). Формирование «короны» на поверхности НЧ является важным фактором, влияющим на взаимодействие НЧ с биологическим окружением и, в результате, определяющим «судьбу» НЧ в организме (Schäffler et al. 2013; Fleischer, Payne 2014). Несмотря на большое число публикаций, посвященных изучению взаимодействия НЧ с компонентами крови, вопрос, как связывание биомолекул с поверхностью НЧ влияет на их взаимодействие с клетками кровеносной системы и с организмом в целом, не выяснен. 1.2. Визуализация взаимодействия наночастиц с клетками Изучение взаимодействия НЧ с клетками очень важно: без понимания того, как «ведут» себя наночастицы в клетках, невозможно найти пути управления этим поведением и оценить возможный риск применения НЧ. В 21 настоящее время идет накопление знаний о том, какие НЧ способны проникать в клетки и каким образом; какое действие они оказывают на клетки; как изменяются НЧ внутри клеток, и с какими клеточными структурами они взаимодействуют. Изучение различных аспектов взаимодействия НЧ с клетками осложняется малыми размерами частиц, тем не менее, современная научно-техническая база позволяет проводить эти исследования. Визуализация НЧ внутри живых клеток возможна с помощью флуоресцентной и конфокальной микроскопии, резонансного упругого или фотонного рассеяния света плазмонными НЧ (конфокальная микроскопия резонансного рассеяния или двухфотонной люминесценции) (Дыкман, Хлебцов 2011). Флуоресцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ флуоресцировать при освещении ультрафиолетовым или синим светом. Конфокальная микроскопия позволяет визуализировать флуоресцирующие молекулы в одной плоскости, что обеспечивает большее увеличение, уменьшение фонового свечения и, соответственно, хорошее качество изображения. При исследовании наноматериалов флуоресцентную метку связывают с НЧ, что позволяет визуализировать их перемещение и накопление в клетках (Shapero et al. 2011). К сожалению, не проводилось исследований влияния используемой метки на поведение НЧ в клетках. При всех своих достоинствах, флуоресцентная и конфокальная микроскопия позволяют визуализировать только определенные структуры, меченные люминесцентными реагентами, что осложняет исследование сложных клеточных систем, таких, как ткани и органы. При исследовании тканей и органов светооптического возникает исследования, необходимость когда дополнительного гистологическими красителями окрашиваются срезы тканей и органов и проводится идентификация клеток. Достоинствами фазово-контрастной и интерференционной микроскопии, основанной на преломлении и дифракции видимого света, является возможность наблюдать живые клетки: их деление, развитие и перемещение 22 (Wang T. et al. 2012). Эти методы широко используются в инвертированных микроскопах для наблюдения изменений структуры монослоя клеток при обработке их НЧ. Оценить в суспензии количество клеток, содержащих меченые НЧ, позволяет проточный цитофлюориметр (Thurn et al. 2011). Несмотря на имеющиеся достоинства, перечисленные методы позволяют только приблизительно определить локализацию НЧ внутри клеток: по размерным характеристикам органелл, их цитоплазматическому расположению либо по свечению тех или иных введенных маркеров. Кроме того, обработка НЧ флуоресцирующим веществом может значительно изменять механизмы проникновения и внутриклеточное распределение НЧ, что было показано при изучении проникновения НЧ золота (1,9 нм) в клетки DU145 рака простаты человека и в клетки MDA-MB-231 рака молочной железы (Coulter et al. 2012). Растровая микроскопия обладает высокой разрешающей способностью и позволяет изучать поверхность НЧ и клеток, а также их взаимодействие (Tomić et al. 2014), однако, данный метод не позволяет визуализировать процессы, происходящие внутри клеток. Изучение тонких механизмов взаимодействия НЧ с клетками проводят на ультратонких срезах с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), которая позволяет визуализировать и НЧ, и клеточные структуры (Lévy et al. 2010; Tomić et al. 2014). С помощью этого метода можно по морфологическим признакам установить пути проникновения НЧ в клетки и их перемещение внутри клеток. Электронная микроскопия ультратонких срезов предоставляет наибольшие возможности для изучения взаимодействия НЧ с клетками. В настоящее время электронные микроскопы оснащают цифровыми камерами и специализированными компьютерными программами, которые упрощают прямые измерения линейных размеров частиц и клеточных структур, а также получение снимков высокого качества. Несомненно, комплекс методов - это оптимальный подход к изучению взаимодействия НЧ с клетками и клеточными структурами, однако 23 визуализация НЧ с помощью просвечивающей электронной микроскопии позволяет получить наиболее полную картину событий, происходящих на макромолекулярном уровне. 1.3. Проникновение наночастиц в клетки посредством прямого пересечения мембран Плазматическая мембрана клеток представляет собой селективно проницаемую мембрану, которая ограничивает и поддерживает постоянство среды внутри клеток. Молекулы небольшого размера (кислород, углекислый газ, вода) могут диффундировать сквозь липидный бислой плазматической мембраны, тогда как ионы и макромолекулярные структуры (нанометровых размеров или более) в норме не способны пересекать внешнюю мембрану клеток самостоятельно плазматической (Verma, Stellacci 2010). Прямое пересечение мембраны клеток является неспецифическим путем проникновения, при котором задействуются физико-химические свойства мембраны, а «биологические» механизмы (например, рецепторы или транспортные каналы) не работают. Благодаря своим размерам (до 100 нм), НЧ могут непосредственно взаимодействовать с белками (диапазон размеров: 5-50 нм) и с липидным бислоем плазматической мембраны клеток (толщина около 10 нм). Неудивительно, что возможность прямого пересечения НЧ плазматической мембраны, без участия специализированных структур, обсуждалась в научной литературе с самого начала изучения НЧ, однако доказательства этого феномена были получены сравнительно недавно. Непосредственное пересечение плазматической мембраны клеток, или пассивное проникновение, показано для небольшого числа НЧ размером до 5 нм и, в основном, для катионных частиц: металлических НЧ и квантовых точек (Leroueil et al. 2008; Laurencin et al. 2010; Verma, Stellacci 2010; Wang T. et al. 2012). Так, НЧ золота (1,9 нм) способны пересекать плазматическую мембрану и ядерную оболочку клеток MDA-MB-231 рака молочной железы человека (Coulter et al. 2012), а НЧ серебра (2 нм) - плазматическую 24 мембрану фибробластов десны человека (Inkielewicz-Stepniak et al. 2014). Наночастицы серебра (8-10 нм) способны непосредственно проникать в прокариотические клетки, пересекая Staphylococcus aureus и двойную клеточную стенку и мембрану Salmonella мембрану typhimurium (Grigor’eva et al. 2013). Прижизненное наблюдение процесса пересечения НЧ плазматической мембраны клеток существующими методами невозможно. Данный механизм проникновения НЧ выявляется посредством анализа ультратонких срезов с помощью ПЭМ (Coulter et al. 2012) либо при изучении проникновения НЧ через модельные мембраны с помощью конфокальной микроскопии, инфракрасной Фурье-спектроскопии и методов электрохимии (Roiter et al. 2008; Wang T. et al. 2012). Установлено, что квантовые точки способны изменять свойства модельной плазматической мембраны, вызывая формирование временных пор, через которые частицы и проникают внутрь клетки (Wang T. et al. 2012). Нередко прямое пересечение НЧ клеточных мембран приводит к формированию постоянных пор в липидном бислое и, как следствие, к нарушению ионно-водного баланса и повреждению клеток (Leroueil et al. 2008). Результатом пассивного проникновения является накопление НЧ в любых компартментах клетки, в том числе непосредственно в цитозоле (Inkielewicz-Stepniak et al. 2014) и в ядрах клеток (Coulter et al. 2012). Как правило, проникновение НЧ путем пересечения плазматической мембраны приводит к повреждению клеточных структур. 1.4. Пути поглощения веществ клетками Эндоцитоз, который определяется как поглощение внеклеточных компонентов посредством пузырьков, формируемых плазматической мембраной (Canton, Battaglia 2012), является основным путем активного поглощения различных веществ макромолекулярных структур. поглощаются внеклеточные как В клетками процессе и, в первую эндоцитоза компоненты, так очередь, одновременно и фрагменты 25 плазматической мембраны. Функции эндоцитоза многогранны и включают контроль состава плазматической мембраны, формы клеток, а также реакции клеток на внешние воздействия. Выделяют два класса эндоцитоза: микроэндоцитоз - поглощение малых доменов плазматической мембраны в виде небольших (около 100 нм) пузырьков или трубочек, и макроэндоцитоз – поглощение крупных (более 1 мкм) доменов плазматической мембраны, в ходе этого процесса формируются крупные пузыри (вакуоли). Микро- и макроэндоцитоз может быть заблокирован селективными ингибиторами, воздействующими на отдельные этапы эндоцитоза. Например, диназор блокирует сборку динамина, а цитохолазин Д препятствует сборке актина в клетках (Dutta, Donaldson 2012). Наиболее изученным типом микроэндоцитоза является клатринзависимый эндоцитоз, при котором специфически интернализуются лигандрецепторные комплексы. Клатрин-зависимый эндоцитоз визуализируется и однозначно идентифицируется на ультратонких срезах, благодаря наличию «зубчиков» клатрина на цитоплазматической стороне плазматической мембраны, которые придают эндоцитозным ямкам и пузырькам «опушенный» вид. После отделения «опушенного» пузырька клатрин деполимеризуется, и пузырек становится «гладким» (Parkar et al. 2009; Mulcahy et al. 2014). Сформировавшийся пузырек мигрирует от плазматической мембраны в цитоплазму и сливается с ранней эндосомой. Ранние эндосомы являются стационарной структурой эндосомально- лизосомальной системы и всегда присутствуют в цитоплазме клеток (Jovic et al. 2010; El-Sayed, Harashima 2013). Другой тип микроэндоцитоза – кавеолин-зависимый эндоцитоз. Данный тип эндоцитоза опосредуется особым типом липидных рафтов – кавеолами. Кавеолы имеют вид фляжки размером 50-80 нм и могут располагаться по всей поверхности клетки, образуя цепочки и кластеры (Orlichenko et al. 2006). Кавеолин-зависимый эндоцитоз вовлечен в различные клеточные процессы, включая передачу сигналов, эндоцитоз, 26 трансцитоз и транспорт холестерина. Кавеолы отсутствуют в нейронах и лимфоцитах, но в большом количестве обнаруживаются в эндотелии, жировых и мышечных клетках (Parkar et al. 2009). С помощью электронного микроскопа на ультратонких срезах можно однозначно отличить кавеолы и «опушенные» пузырьки от других клеточных структур. Вещества, поглощенные клеткой путем кавеолин-зависимого эндоцитоза, также попадают в раннюю эндосому. Выделяют еще один тип микроэндоцитоза - клатрин-кавеолиннезависимый эндоцитоз. Данный путь активируется в клетках при блокировании клатрин-зависимого и кавеолин-зависимого путей эндоцитоза. Кроме того, он зависит от наличия холестерина и связан с определенной композицией липидов в плазматической мембране, в связи с чем, носит и другое название - рафт-зависимый эндоцитоз. С помощью данного типа эндоцитоза поглощаются внеклеточная жидкость, некоторые вирусы, токсины, сфинголипиды, гормон роста, эндотелин и многие другие белки (Mayor, Pagano 2007; El-Sayed, Harashima 2013). Морфологически рафтзависимый эндоцитоз выглядит как интернализация трубочек и кольцеобразных структур. По длине трубчатые инвагинации могут достигать 200-600 нм и в ширину – 30-50 нм. Выделяют несколько подвидов рафтзависимого эндоцитоза: эндоцитоз рецептора интерлейкина 2β, Arf6– зависимый эндоцитоз и флотиллин-зависимый эндоцитоз (Doherty, McMahon 2009; Canton, Battaglia 2012). Молекулярные механизмы вариантов рафтзависимого эндоцитоза точно не установлены, постоянно появляются новые данные (Mulcahy et al. 2014). Таким образом, существует несколько типов микроэндоцитоза, которые различаются по молекулярным и структурным параметрам и в большинстве случаев однозначно определяются по морфологии на ультратонких срезах под электронным микроскопом. Фагоцитоз - наиболее хорошо изученный тип макроэндоцитоза, обеспечивающий захват клетками крупных частиц, бактерий, разрушенных и 27 целых клеток. Морфологически фагоцитоз определяется по захватывающим внеклеточный материал цитоплазматическим выростам. После смыкания выростов формируется крупный пузырек – фагосома (0,5-10 мкм), который содержит фагоцитированный материал и межклеточную среду (Russell et al. 2009). После слияния с лизосомой образуется фаголизосома, в которой поглощенный материал разрушается под действием кислых гидролаз. Макропиноцитоз – тип макроэндоцитоза, при котором образуются многочисленные длинные и тонкие выросты плазматической мембраны, захватывающие большие объемы внеклеточной жидкости. После смыкания выросты формируют крупный пузырек – макропиносому, содержащую внеклеточные компоненты и среду (Doherty, McMahon 2009; Canton, Battaglia 2012). Макропиносомы крупнее других эндоцитозных везикул, их размеры варьируют от 0,5 до 10 мкм. Данный тип эндоцитоза однозначно идентифицируются микроскопии, а с помощью также с ПЭМ и помощью сканирующей прижизненной электронной конфокальной микроскопии. Описан еще один тип макроэндоцитоза – эндоцитоз, опосредованный циркулярными дорзальными складками. Циркулярные дорзальные складки (или волны) – динамичные транзиторные плоские выросты на поверхности культивируемых мезенхимального подвижных происхождения, которые клеток эпидермального развиваются в ответ и на стимуляцию разными факторами роста. Затем эти мембранные складки погружаются внутрь клетки, постепенно уплотняясь и сужаясь в плотное кольцо, прежде чем исчезнуть с поверхности. Эти структуры формируются единожды в ответ на стимуляцию, и весь процесс занимает не более 10-20 минут. С помощью методов иммунофлуоресценции и ПЭМ на срезах визуализируются многочисленные протяженные трубчатые структуры и выросты по периферии цитоплазмы (Orth et al. 2006). Считается, что это один из механизмов реакции клетки на избыточную или неадекватную 28 стимуляцию, дорзальные складки одномоментно интернализуют около 50% рецепторов плазматической мембраны (Hoon et al. 2012). Макроэндоцитоз, таким образом, представляет собой цитофизиологический процесс, в ходе которого в клетки поступает основной объем внеклеточной жидкости и растворенных в ней питательных веществ, кроме того, это - единственный механизм очищения тканей от остатков погибших клеток. Рис. 1.1 Типы эндоцитоза (с изменениями из Mulcahy et al. 2014). Процесс эндоцитоза подразделяют на стадии: (1) контакт с плазматической мембраной и формирование углубления; (2) отделение эндоцитозного пузырька; (3) миграция пузырька в цитоплазме; (4) слияние с ранней эндосомой или лизосомой; (5) сортировка эндоцитированного материала; (6) возвращение в плазматическую мембрану рецепторов и белков посредством сортирующей (рециркулирующей) эндосомы; (7) деградация 29 захваченного материала по мере накопления кислых гидролаз в поздней эндосоме и её превращение в лизосомы, либо выброс захваченного материала клетки на стадии поздней эндосомы (экзоцитоз) (Conner, Schmid 2003; Doherty, McMahon 2009; Oh, Park 2014). Рис. 1.2 Эндосомально-лизосомальная система клетки (с изменениями из El-Sayed, Harashima 2013). Эндосомально-лизосомальная система очень важна для клетки, она определяет «судьбу» поглощенного материала, однако, перемещение поглощенного материала по её структурам нередко остается за пределами анализа исследователей. Первой «станцией» транспортного потока при эндоцитозе поглощенных является ранняя лигандов, эндосома, которые где происходит направляются на сортировка деградацию или рециркуляцию (Jovic et al. 2010). Ранние эндосомы – это мембранные структуры округлой формы размером до 1 мкм в диаметре с длинными трубчатыми выростами, рН в просвете эндосомы около 6. Ранние эндосомы выявляют с помощью антител к белку ранних эндосом, либо определяют по 30 морфологии на ультратонких срезах. Разные части ранней эндосомы выполняют различные функции: предназначенные для рециркуляции белки и рецепторы накапливаются в трубчатых элементах эндосомы (pH 6,5), тогда как в везикулярной части («тело» эндосомы) (pH 5,5-6,2) происходит формирование мелких пузырьков. Из трубчатой части ранней эндосомы формируется рециркулирующая эндосома, а везикулярная часть ранней эндосомы отделяется с формированием поздней эндосомы. Рециркулирующие (сортирующие) эндосомы – это трубчатые мембранные структуры диаметром около 60 нм, с которыми сливаются транспортные обеспечивающие пузырьки и активное от которых сообщение отделяются между пузырьки, рециркулирующими эндосомами, ранними эндосомами и аппаратом Гольджи (Doherty, McMahon 2009; El-Sayed, Harashima 2013). Поздние эндосомы, или мультивезикулярные тельца (МВТ), - это мембранные структуры размером до 1 мкм, в просвете которых содержатся многочисленные везикулы размером 50-60 нм. «Созревание» ранней эндосомы до МВТ занимает некоторое время и сопровождается закислением содержимого до pH 5 за счет работы протонной АТФазы, а также утратой рецепторов RAB5 и приобретением RAB7 и RAB9, которые вместе с рецептором маннозо-6-фосфата являются маркерами поздних эндосом. Мультивезикулярные тельца делятся на «деградирующие», связанные с расщеплением белков цитоплазмы и эндоцитированного материала, и «секретирующие», выделяющие содержимое из просвета органеллы во внеклеточное пространство (экзоцитоз) (Baixauli et al. 2014; Oh, Park 2014). «Деградирующие» МВТ принимают кислые гидролазы и возвращают рецептор маннозо-6-фосфата в аппарат Гольджи, постепенно превращаясь в лизосомы, а также могут сливаться со «зрелыми» лизосомами клетки. Лизосомы – это мембранные структуры размером до 1 мкм, в функции которых входит разрушение находящихся внутри них молекул и частиц, в том числе попавших с помощью эндоцитоза. Главным отличием лизосом от 31 поздних эндосом является отсутствие рецептора маннозо-6-фосфата и наличие кислых гидролаз (около 40 видов), способных расщеплять белки, нуклеиновые кислоты и липиды (Doherty, McMahon 2009). Обычно pH в полости лизосом составляет около 4,5-5, что существенно ниже, чем в цитоплазме. Мембрана лизосом устойчива к действию «своих» ферментов благодаря высокому уровню гликозилирования белков с внутренней поверхности мембраны лизосом. Таким образом, эндосомально-лизосомальная система включает ранние эндосомы, сортирующие эндосомы, поздние эндосомы (МВТ) и лизосомы, которые различаются по строению и выполняемым функциям. 1.5. Проникновение наночастиц в клетки посредством эндоцитоза Несмотря на большой интерес к проблеме взаимодействия НЧ с клетками, детальные исследования механизмов проникновения НЧ в клетки единичны. Представление единой картины процессов, происходящих на границе взаимодействия наночастиц и биологических объектов, осложняется тем, что многие опубликованные результаты невозможно сопоставить в силу различных условий экспериментов, большого разнообразия используемых биологических объектов, а также значительной вариабельности физикохимических характеристик исследуемых НЧ. В данном разделе анализируются опубликованные к началу 2015 г. сведения о механизмах проникновения различных НЧ в клетки посредством эндоцитоза и закономерностях этого процесса. 1.5.1. Контакт наночастиц с плазматической мембраной клеток Начальной стадией эндоцитоза является контакт (адсорбция) лиганда с плазматической мембраной клеток. Плазматическая мембрана заряжена отрицательно, благодаря особой организации липидного бислоя, углеродных «хвостов» и мембранных белков, поэтому положительно заряженные лиганды быстрее вступают в контакт с поверхностью клеток и, 32 соответственно, с большей эффективностью поглощаются клетками, чем отрицательно заряженные (Verma, Stellacci 2010; Mulcahy et al. 2014). Аналогичная закономерность была выявлена для НЧ металлов, имеющих поверхностный заряд. Так, положительно заряженные НЧ оксида железа (Fe2O3) (65-70 нм) активно взаимодействуют с плазматической мембраной мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и проникают в них, накапливаясь в цитоплазме, тогда как накопление отрицательно заряженных ( НЧ оксида железа того же размера существенно меньше (Jo et al. 2010). Положительно заряженные НЧ золота в широком размерном диапазоне (от 16 до 58 нм) поглощаются клетками печени человека HepG2, неспособными к фагоцитозу, активнее, чем отрицательно заряженные НЧ; в клетки же макрофагальной линии RAW264,7 и те, и другие НЧ проникают с одинаковой эффективностью посредством фагоцитоза и накапливаются в фагосомах (Liu et al. 2013). Приведенный пример не противоречит существующим представлениям, так как при фагоцитозе цитоплазматические выросты захватывают скопления НЧ, свободно расположенные в межклеточном пространстве, обходя электростатические взаимодействия заряженного лиганда с плазматической мембраной клетки. Проникновение в клетку отрицательно заряженных НЧ металлов связывают с наличием небольшого количества положительно заряженных сайтов в липидном бислое (Wilhelm et al. 2003; Verma, Stellacci 2010; Liu et al. 2013), что объясняет более низкие показатели поглощения отрицательно заряженных НЧ, по сравнению с положительно заряженными. Исходный заряд НЧ считается решающим фактором таких событий, как адсорбция НЧ на плазматической мембране, инициация эндоцитоза, накопление частиц в клетке, предопределяя, в большинстве случаев, интернализацию НЧ клетками. Однако, опубликованы работы, показывающие, что исходный заряд не всегда играет определяющую роль в поглощении клетками НЧ. В первую очередь, на связывание НЧ с плазматической мембраной клеток могут влиять макромолекулярные комплексы «биологической» среды, способные 33 адсорбироваться на поверхности НЧ. Показано, что отрицательно заряженные НЧ оксида железа (Fe2O3), покрытые бычьим сывороточным альбумином (БСА), характеризуются сниженными показателями эндоцитоза, по сравнению с немодифицированными НЧ (Wilhelm et al. 2003). Однако, влияние БСА на интернализацию НЧ неоднозначно. Так, модификация с помощью БСА отрицательно заряженных полистирольных НЧ, квантовых точках и коллоидных наносфер золота подавляет их взаимодействие с клетками, а аналогичная модификация положительно заряженных НЧ увеличивает их связывание с клетками (Fleischer, Payne 2014). При этом данные эффекты не зависят ни от размера НЧ, ни от типа клеток. Объяснение заключается в различных механизмах связывания БСА с плазматической мембраной клеток в зависимости от исходного заряда НЧ. Так, альбумин, ассоциированный с отрицательно заряженными НЧ, связывается с альбуминовыми рецепторами, а альбумин на поверхности положительно заряженных НЧ вступает во взаимодействие с рецепторами-мусорщиками (Fleischer, Payne 2014). Изучение влияния совокупности нескольких факторов на эндоцитоз наносфер золота показало зависимость скорости поглощения и интенсивности накопления от исходного заряда НЧ, а не от приобретенного вследствие модификации поверхности или формирования короны в среде с сывороткой (Hühn et al. 2013). Другие исследования демонстрируют влияние адсорбированного на поверхности НЧ слоя биомолекул, в частности, сывороточного альбумина, на скорость связывания частиц с плазматической мембраной клеток (Verma, Stellacci 2010). Например, НЧ диоксида кремния (SiO2) в отсутствие сывороточных белков имеют более высокое сродство к плазматической мембране клеток и интернализуются с большей эффективностью, чем НЧ, вокруг которых в среде с сывороткой формируется белковая корона (Lesniak et al. 2012). Интересно, что НЧ могут вызывать изменения в липидном бислое, вступая с ним в контакт. Так, нанокластеры диоксида титана (4-5 нм) с кристаллической структурой брукит, 34 взаимодействуя с плазматической мембраной клеток MDCK, изменяют ее жидкостные свойства, блокируя тем самым эндоцитоз (Ismagilov et al. 2012). Таким образом, взаимодействие НЧ с плазматической мембраной клеток является сложным и многофакторным процессом, который зависит от физико-химических свойств НЧ и от состава среды, в которой происходит это взаимодействие. 1.5.2. Клатрин-зависимый эндоцитоз наночастиц Клатрин-зависимый эндоцитоз НЧ описан в исследованиях методами флуоресцентной, конфокальной и просвечивающей электронной микроскопии (Shukla et al. 2005; Wang T. et al. 2012). Показано, что клатринзависимый эндоцитоз НЧ золота (14 нм) и полистирольных НЧ (40 нм) подавляется при 40С или в АТФ-обедненной среде (Chithrani, Chan 2007; Lesniak et al. 2013). Культивирование в среде, не содержащей ионы калия, на 70% подавляет эндоцитоз латексных шариков (50 нм) в клетках меланомы В16 (Rejman et al. 2004). Клатрин-зависимый эндоцитоз также подавляется хлорпромазином и диназором (Dutta, Donaldson 2012; Mulcahy et al. 2014), которые нередко используются в исследованиях. В работе Tomic с соавторами применение диназора позволило подтвердить, что в дендритные клетки человека НЧ золота различного размера проникают посредством эндоцитоза (Tomić et al. 2014), но не позволило установить тип эндоцитоза, поскольку диназор «выключает» сразу несколько путей интернализации, нарушая полимеризацию динамина. Хлорпромазин блокирует полимеризацию клатрина и считается специфичным ингибитором клатринзависимого эндоцитоза. эндоцитоз латексных Например, шариков хлорпромазин (50 нм), что на 70% подавлял свидетельствует о преимущественном проникновении данных НЧ с помощью клатринзависимого эндоцитоза (Rejman et al. 2004). Клатрин-зависимый эндоцитоз описан для частиц, размер которых не превышает 200 нм, оптимальным размером для реализации этого типа 35 эндоцитоза считают 25-50 нм (Coulter et al. 2012). Преимущественное проникновение в клетки НЧ в диапазоне размеров от 14 до 100 нм посредством клатрин-зависимого эндоцитоза было показано на латексных шариках (Rejman et al. 2004), НЧ диоксида титана (TiO2) (Thurn et al. 2011), углеродных нанотрубках (Kam et al. 2006; Jin et al. 2009), полистирольных НЧ (Kuhn et al. 2014) и НЧ золота (Chithrani et al. 2006; Mironava et al. 2010). Помимо размера, на проникновение НЧ посредством клатрин-зависимого эндоцитоза влияет форма частиц: наносферы золота размером около 50 нм интернализуются клетками посредством клатрин-зависимого эндоцитоза быстрее и в большем количестве, чем НЧ другой формы (Chithrani et al. 2006; Tomić et al. 2014). Широко обсуждается влияние «короны», т.е. поверхностного слоя адсорбированных белков, на клатрин-зависимый эндоцитоз НЧ (Verma, Stellacci 2010). Известно, что скорость проникновения наносфер золота, покрытых трансферрином (Chithrani et al. 2006; Chithrani, Chan 2007) или БСА (Arnida et al. 2011), одинакова, но исходные непокрытые НЧ золота проникают в клетки быстрее. Основываясь на этих данных, клатринзависимый эндоцитоз НЧ золота считается пассивным процессом, поскольку не происходит специфического распознавания рецептором плазматической мембраны лиганда короны или лиганда модифицирующего покрытия (Verma, Stellacci 2010; Cleal et al. 2013). Тем не менее, в некоторых случаях с помощью модификации поверхности можно управлять процессом интернализации НЧ. Например, НЧ диоксида титана (TiO2) проникают в дендритные клетки посредством клатрин-зависимого эндоцитоза, тогда как модификация этих частиц парааминобензойной кислотой блокирует данный тип эндоцитоза (Migdal et al. 2010). Клатрин-зависимый эндоцитоз наночастиц завершается в ранних эндосомах, что было показано на НЧ диоксида титана (Ryabchikova et al. 2010), НЧ золота (Tomić et al. 2014) и нанометровых латексных шариках (Rejman et al. 2004). В последующем эндоцитированные НЧ золота и 36 латексные шарики обнаруживаются в поздних эндосомах и лизосомах (Rejman et al. 2004; Tomić et al. 2014). 1.5.3. Кавеолин-зависимый эндоцитоз наночастиц Кавеолин-зависимый эндоцитоз НЧ, несмотря на однозначно идентифицируемые морфологические структуры на ультратонких срезах, описывается достаточно редко. Мембраны кавеол богаты холестерином, сфинголипидами и кавеолинами, соответственно, кавеолин-зависимый эндоцитоз чувствителен к истощению холестерина, а также к действию филипина или метил-β-циклодекстрина (Mulcahy et al. 2014). Так, проникновение латексных шариков (50 нм) в клетки меланомы В16 посредством кавеолин-зависимого эндоцитоза было подтверждено с помощью филипина и генистеина, которые блокировали интернализацию НЧ более чем на 50%, а также с помощью белков-маркеров, позволивших определить колокализацию антител к кавеолину и латексных шариков в структурах клеток методом конфокальной микроскопии (Rejman et al. 2004). С помощью ингибитора метил-β-циклодекстрина был показан кавеолинзависимый эндоцитоз полистирольных НЧ (40 нм) клетками культуры альвеолярного эпителия А549 (Kuhn et al. 2014). Таким образом, опубликованы единичные сообщения о кавеолинзависимом эндоцитозе НЧ; чаще всего данный тип эндоцитоза упоминается в отношении более крупных частиц (больше 100 нм), которые не являются предметом данного обзора. 1.5.4. Клатрин-кавеолин-независимый эндоцитоз наночастиц Клатрин-кавеолин-независимый эндоцитоз объединяет несколько подтипов, которые опосредуются липидными рафтами и дифференцируются в зависимости от участия тех или иных молекул. Наиболее изученными являются флотилин-зависимый интерлейкина 2β (Canton, эндоцитоз Battaglia 2012), и эндоцитоз однако в рецептора отношении 37 интернализации НЧ посредством клатрин-кавеолин-независимого эндоцитоза известно совсем немного. С помощью конфокальной микроскопии и ПЭМ было установлено, что посредством липидных рафтов в дендритные клетки человека активно проникают наносферы золота размером 10 и 50 нм, при этом скорость поглощения и интенсивность накопления НЧ меньшего размера была выше (Tomić et al. 2014). 1.5.5. Фагоцитоз наночастиц Фагоцитоз НЧ легко визуализируется микроскопическими методами, поскольку связан с поглощением больших участков плазматической мембраны (Aderem, Underhill 1999). Однако, для наблюдения фагоцитоза НЧ в клетках исследователями чаще применяются методы флуоресцентной и конфокальной микроскопии в сочетании с ингибитором сборки актина цитохалазином Д (Kuhn et al. 2014). Фагоцитоз является одним из вариантов макроэндоцитоза и обеспечивает поглощение крупных объектов от 100 нм до нескольких мкм, тем не менее, фагоцитоз НЧ упоминается в публикациях достаточно часто. С одной стороны, это связано с тем, что существует несоответствие между терминами, которые используются авторами, и наблюдаемыми явлениями. Так, в большинстве опубликованных работ указывается средний размер НЧ, полученный путем анализа частиц в суспензии, а на размер поглощаемых путем фагоцитоза скоплений НЧ внимание обращается редко. С другой стороны, обособленные частицы могут случайно захватываться цитоплазматическими выростами вместе с жидкостью или детритом, в этом случае правомерно употребление размеров НЧ, полученных при исследовании частиц в суспензии. Однако, в биологической среде нередко отмечается агломерация и агрегация НЧ, т.е. формирование скоплений, размеры которых существенно превосходят размер одиночных НЧ, и которые являются подходящими объектами для фагоцитоза. 38 Фагоцитоз различных НЧ отмечен в макрофагальных клетках. Так, фагоцитируются клетками макрофагальной линии RAW264.7 наносферы золота (50 нм) и наностержни золота (10х45 нм) (Arnida et al. 2011), причем скорость поглощения сферических НЧ превосходит скорость поглощения наностержней. В макрофаги мыши J774A.1 посредством фагоцитоза проникают полистирольные НЧ размером как 40 нм, так и частицы размером 1 мкм (Kuhn et al. 2014). Положительно и отрицательно заряженные НЧ золота (40 нм) фагоцитируются макрофагальными клетками RAW264.7 с одинаковой интенсивностью, соответственно, заряд НЧ не является определяющим фактором интернализации НЧ посредством фагоцитоза (Liu et al. 2013). Клетки не макрофагального типа также способны к фагоцитозу НЧ: показан фагоцитоз НЧ золота (13 нм) клетками HeLa (Khan et al. 2007) и фибробластами кожи человека (Mironava et al. 2010). Выявлен фагоцитоз НЧ диоксида титана (5-10 нм) эпителиальными клетками MDCK (Ryabchikova et al. 2010) и агрегатов НЧ диоксида титана (размером 50 нм в суспензии) клетками альвеолярного эпителия человека A549 (Stearns et al. 2001). Известно, что некоторые белки в составе короны могут способствовать фагоцитозу НЧ, в частности, фибриноген, иммуноглобулин G и фактор комплемента, а другие, наоборот, могут снижать проникновение НЧ в клетки (человеческий сывороточный альбумин и аполипротеины) (Monopoli et al. 2011). Выявлено, что механизмы фагоцитоза НЧ могут различаться. Так, полистирольные НЧ (100 нм), покрытые иммуноглобулином, фагоцитируются альвеолярными макрофагами крысы NR8383 посредством Fc-рецепторов, в то время как непокрытые частицы адсорбируют белки из культуральной среды с сывороткой, и фагоцитируются рецепторамимусорщиками (Champion, Mitragotri 2006). Фагоцитоз НЧ чаще всего завершается в фагосомах (Ryabchikova et al. 2010; Liu et al. 2013); реже фагоцитированные НЧ обнаруживаются в лизосомах (Stearns et al. 2001). 39 1.5.6. Макропиноцитоз наночастиц Поглощение НЧ посредством макропиноцитоза сопутствует процессу поглощения клеткой внеклеточной жидкости, при этом внутри макропиносом оказываются как одиночные НЧ, так и их скопления. Работы, посвященные проникновению НЧ посредством макропиноцитоза, немногочисленны, в них обычно используют белки-маркеры макропиноцитоза или его блокаторы. Нередко в исследованиях применяют соединения, которые одновременно подавляют и фагоцитоз, и макропиноцитоз, разрушая актиновые микрофиламенты (Mulcahy et al. 2014). Макропиноцитоз и фагоцитоз полистирольных НЧ (40 нм) макрофагами мыши J774A.1 выявлен методом конфокальной микроскопии при использовании ингибитора цитохалазина Д (Kuhn et al. 2014). Сочетание методов конфокальной микроскопии и ПЭМ позволило показать макропиноцитоз дендритными клетками человека скоплений НЧ диоксида титана (5-6 нм), модифицированных парааминобензойной кислотой (Migdal et al. 2010). Проникновение в макрофагальные клетки RAW264.7 наносфер золота (3-4 нм) путем макропиноцитоза было показано с помощью атомносиловой микроскопии (Shukla et al. 2005). Попавшие в клетки посредством макропиноцитоза НЧ золота (Shukla et al. 2005) и НЧ диоксида титана (Migdal et al. 2010) накапливаются в лизосомах. 1.5.7. «Судьба» наночастиц в клетках Под «судьбой» НЧ в клетках понимают накопление, распределение и превращение, т.е. финальную стадию их взаимодействия с клеткой. Большинство эндоцитированных НЧ последовательно перемещаются по эндосомально-лизосомальной системе клеток и накапливается в лизосомах. Этот путь показан для НЧ золота (Shukla et al. 2005; Chithrani, Chan 2007; Tomić et al. 2014), диоксида титана (Stearns et al. 2001; L'Azou et al. 2008; Migdal et al. 2010) и диоксида кремния (Shapero et al. 2011; Lesniak et al. 40 2012). Считается, что интенсивность накопления НЧ в клетках может зависеть от размера, формы и заряда частиц (Verma, Stellacci 2010; Tomić et al. 2014). Так, средняя масса поглощенных НЧ золота размером 50 нм на клетку превышает таковую для НЧ золота размером 10 нм, а по количеству частиц на клетку наибольшие показатели были получены для НЧ золота размером 10 нм (Tomić et al. 2014). С помощью проточной цитофлуорометрии показано, что НЧ диоксида кремния (SiO2) размером 50 и 100 нм достигают лизосом, в которых и остаются, распределяясь между дочерними клетками в процессе деления (Shapero et al. 2011). В отдельных работах описываются «неклассические конечные станции» эндоцитоза. Так, сообщается, что часть эндоцитированных НЧ золота (10 нм) может мигрировать из эндоцитозного компартмента в цитозоль дендритных клеток человека (Tomić et al. 2014). Описан экзоцитоз (выброс из клетки) НЧ золота, причем наностержни выделяются клетками активнее наносфер (Chithrani et al. 2006; Pissuwan et al. 2008), а крупные НЧ – активнее более мелких частиц (Chithrani et al. 2006). 1.6. Токсические эффекты наночастиц Повреждающее действие НЧ на живые организмы в нашей стране изучается давно, поскольку они нередко образуются в условиях промышленного производства. Широкое внедрение нанотехнологий в практику с новой остротой поставило вопрос о токсическом действии НЧ. Изучение токсических свойств НЧ и препаратов на их основе в настоящее время проводят в соответствии с алгоритмом исследований токсичности химических препаратов. Согласно существующим нормам и правилам, изучение токсического действия НЧ включает выявление чувствительных органов-мишеней, определение зависимости выявленных эффектов от дозы и степень их обратимости, определение соотношения пользы, ожидаемой от применения НЧ и риска возможных нежелательных реакций (Гуськова 2003). Исследование токсичности веществ на уровне организма – это большая, 41 затратная и комплексная работа, поэтому необходимым предварительным этапом является изучение поведения препаратов в культуре клеток. Соответственно, в экспериментах in vitro первоначально исследуют физикохимические свойства наноматериала и его взаимодействие с клетками, анализируют токсические эффекты и, в случае лекарственных препаратов, выбирают диапазон терапевтических доз. Наиболее широко используемыми методами оценки влияния препаратов на жизнеспособность клеток in vitro являются: (1) прижизненное окрашивание трипановым синим и исследование с помощью светового микроскопа для подсчета доли клеток с поврежденной плазматической мембраной и (2) колориметрический анализ культуры клеток, окрашенных тетразолиевым красителем (например, МТТ), который выявляет активность митохондрий (Marquis et al. 2009). Метод окрашивания трипановым синим и МТТ позволяют оценить токсичность НЧ и жизнеспособность популяции клеток в культуре. Однако, воздействие НЧ на клетку отличается от воздействия химических реагентов. Ввиду малых размеров (до 100 нм) повреждающее действие НЧ реализуются на уровне отдельных клеток и их структур и может не быть простой суммой эффектов. Субмикроскопические размеры мишеней наночастиц определяют необходимость изучения их эффектов адекватными методами и, в первую очередь, методом просвечивающей электронной микроскопии. Трудности оценки рисков использования НЧ, прежде всего, связаны с разнообразием их химической природы, формы и размера, которые влияют на взаимодействие НЧ с биологическими объектами. Анализ опубликованных работ показывает, что токсичность НЧ зависит не только от химической природы материала, но и от размера, формы, кривизны поверхности, заряда, кристаллической структуры и модифицирующего вещества (Yang, Cui 2008; Maurer-Jones et al. 2013). Эти характеристики присущи именно нанообъектам и еще раз указывают на необходимость 42 специальных подходов к изучению повреждающего действия наночастиц. Потенциальную токсичность НЧ связывают с увеличением разности потенциалов на границе наночастица-среда-клетка, с образовнаием активных форм кислорода, с ростом реакционной способности и каталитических свойств, а также с изменением растворимости и повышением удельной площади поверхности. Многие НЧ обладают гидрофобными свойствами или несут электрический заряд, что усиливает как их связывание с плазматической мембраной, так и их проникающую способность. Из литературных источников следует, что, нередко, активное накопление НЧ в клетках коррелирует с высокой повреждающей способностью НЧ (Tomić et al. 2014). Токсичность НЧ золота является предметом пристального внимания. Исторически НЧ золота считались инертными во взаимодействии с биологическими системами, однако позднее была показана неправомерность такого суждения. Например, нетоксичными для большинства клеток являются концентрации НЧ золота (12-14 нм) до 1х1012 частиц в 1 мл (или 10 мкг/мл) (Khlebtsov, Dykman 2011; Tomić et al. 2014), тогда как НЧ золота размером 10 нм и менее, в концентрации 50 мкг и выше способны нарушать созревание и функционирование дендритных клеток человека и подавлять Тклеточный противоопухолевый ответ (Tomić et al. 2014). Аналогично, НЧ золота размером 4 нм в концентрации 200 нМ угнетают рост аксонов клеток феохромоцитомы крысы PC12, тогда как в меньших дозах (10 нМ) подобные эффекты отсутствуют (Soenen et al. 2012). Токсичность НЧ может определяться размером частиц, однако прямая корреляция между этими параметрами пока не доказана. Так, НЧ золота размером 3-4 нм нетоксичны для макрофагальных клеток RAW264.7 и даже снижают продукцию активных форм кислорода (Shukla et al. 2005). НЧ золота размером 13 и 45 нм могут вызывать повреждение цитоскелета в фибробластах кожи человека, однако это повреждение является обратимым, и клетки способны восстанавливаться (Mironava et al. 2010). Токсичность НЧ золота нередко 43 зависит и от их поверхностного заряда: положительно заряженные НЧ золота обладают большим повреждающим действием, чем отрицательно заряженные, что связывают с более активным поглощением первых клетками (Hühn et al. 2013). Известно, что наностержни золота обладают выраженным повреждающим действием, в отличие от наносфер, однако, данный эффект обусловлен не формой частиц, а используемым стабилизирующим веществом при синтезе. Показано, что именно несвязанные молекулы поверхностно-активного вещества цетилтриметиламония бромида (ЦТАБ), которые всегда присутствуют в суспензии синтезированных наностержней золота, и определяют токсичность этих частиц (Connor et al. 2005; Yu et al. 2007Б; Alkilany et al. 2009). Более того, замещение ЦТАБ другими модифицирующими веществами позволяет уменьшить токсические эффекты наностержней золота (Niidome et al. 2006; Yu et al. 2007Б; Menon et al. 2013). На токсичность НЧ золота могут также влиять условия культивирования клеток: НЧ золота (15 нм) в среде RPMI обладают большей цитотоксичностью, чем в среде DMEM, что было показано на двух клеточных линиях HeLa и U937 (Maiorano et al. 2010). Токсические эффекты НЧ диоксида титана (TiO2) определяются кристаллической структурой (Ryabchikova et al. 2010) и формой (Hamilton et al. 2009). Наночастицы диоксида титана с кристаллической структурой анатаз способны индуцировать образование активных форм кислорода и разрушать клетки (Cheng-Yu et al. 2008; Liu et al. 2010). Показано, что длинные НЧ диоксида титана более токсичны для клеток, чем короткие, индуцируя воспалительные реакции и высвобождение воспалительных цитокинов первичными альвеолярными макрофагами мыши (Hamilton et al. 2009). Наночастицы серебра токсичны в широком диапазоне размеров и концентраций (Suresh et al. 2012). Так, НЧ серебра диаметром 2 нм индуцируют образование активных форм кислорода и вызывают дисфункцию митохондрий в фибробластах десны человека (InkielewiczStepniak et al. 2014). Наночастицы серебра диаметром 5-10 нм индуцируют 44 оксидативный стресс и апоптоз по митохондриальному типу в клетках печени человека (Piao et al. 2011). Особую группу наноматериалов представляют НЧ природного или антропогенного происхождения, которые содержаться выбросах заводов и котельных, в вулканической пыли и в выхлопных газах автомобилей (Buzea et al. 2007). С такими НЧ человек и животные сталкиваются непроизвольно, а с увеличением объемов производства растет и риск негативного воздействия. Достаточно привести пример с ростом количества автомобилей и, соответственно, объема выбрасываемых выхлопных газов. В автомобильных выбросах, среди прочих частиц, содержатся НЧ металлов платиновой группы, которые обладают высокой токсичностью по отношению к живым организмам (Wiseman, Zereini 2009). Выявлено, что во фракции выбрасываемых с выхлопными газами НЧ металлов платиновой группы только 10% являются биорастворимыми, но именно они представляют риск для окружающей среды и здоровья человека (Moldovan et al. 2002; Wiseman, Zereini 2009). Наибольшим потенциальным риском среди НЧ металлов платиновой группы обладают НЧ палладия (Jarvis 2001; Sures 2001; Moldovan 2002; Wilkinson 2011). 1.7. Заключение Анализ опубликованных исследований показывает, что НЧ металлов способны проникать в клетки посредством эндоцитоза либо прямого пересечения плазматической мембраны. Описаны различные пути эндоцитоза НЧ, среди которых чаще упоминаются клатрин-зависимый эндоцитоз и фагоцитоз, которые легко визуализируются и идентифицируются. Поглощение клетками НЧ зависит от их физикохимических свойств (размер, форма, заряд, поверхностные свойства, дисперсность), от типа клеток и экспериментальных условий. Микро- и макроэндоцитоз являются естественными процессами для клеток, однако, это не означает, что все НЧ способны проникать в клетки, 45 опубликованы сообщения, свидетельствующие о неспособности некоторых клеток поглощать НЧ (Verma, Stellacci 2010; Полетаева и др., 2014). Анализ опубликованных работ не дает полного представления о механизмах эндоцитоза и «судьбе» НЧ в клетках, но убедительно свидетельствует о разнообразии клеточных реакций на наночастицы. Между тем, выяснение механизмов взаимодействия НЧ с клетками и определение их дальнейшей «судьбы» в клетках совершенно необходимы для разработки лекарственных препаратов на основе НЧ с адресной доставкой, а также для оценки возможных негативных эффектов НЧ. Важной проблемой, активно обсуждаемой в научной литературе и далекой от разрешения, являются токсические эффекты наночастиц, которые зависят от целого ряда факторов, включая физико-химические свойства НЧ и свойства биологических объектов, с которыми они взаимодействуют. Контакты человека с наноматериалами могут быть случайными, вследствие ухудшения экологической обстановки, или намеренными, при потреблении товаров, содержащих НЧ. Для понимания реальной опасности НЧ необходимо детальное изучение их взаимодействия с клетками, на уровне субклеточных мишеней НЧ. Таким образом, исследование взаимодействия наночастиц с клетками на наноразмерном уровне является актуальной и общественно необходимой задачей. Решение этой задачи позволит приблизиться к безопасному использованию наночастиц в наномедицине и нанобиотехнологии, а также к оценке реальной опасности наночастиц, присутствующих в окружающей среде, для здоровья человека. 46 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Материалы В работе были использованы следующие химические вещества: золотохлористоводородная кислота (HAuCl4⋅3H2O) (Aurat, Россия); раствор цитрата натрия (Fluka); цетилтриметиламмонийбромид (ЦТАБ, > 99%) (Fluka); борогидрид натрия (NaBH4, 99%) (Panreac, Испания); нитрат серебра (AgNO3; 99,8%) (Fluka); аскорбиновая кислота (99%) (Fluka); бычий сывороточный альбумин (БСА, 66 кДа, Sigma-Aldrich); фосфатный буфер (0,01 М; рН 7,3-7,5; Biolot); бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5дифенилтетразолия (МТТ, Sigma); диметилсульфоксид (ДМСО); полиэтиленгликоль (ПЭГ; 3,2 кДа; Iris Biotech); поливинилпирролидон (ПВП, 58 кДа, Acros); тиогликолят (Brewer, Sigma-Aldrich); 2%-ный раствор уранилацетата (Fluka) в дистиллированной воде; 0,25%-ный раствор формвара (SPI-CHEMTM) на дихлорэтане (Fluka). Линейный полиэтиленимин (ПЭИ, 87 кДа; ≥99,5%) в форме гидрохлорида был синтезирован А.В. Рогоза (ИХБФМ СО РАН) из поли(2-этил-2-оксазолин). Во всех экспериментах была использована Milli-Q дистиллированная вода (18МОм/см). В работах с культурами клеток использованы следующие материалы: культуральные среды Игла в модификации Дульбекко (DMEM) (Gibco, Германия) и Дульбекко в модификации Исковым (IMDM) (Gibco, Германия); инактивированная бычья сыворотка (Gibco, Германия); культуральные планшеты (TTP, Швейцария); культуральный скребок (Falcon cell scraper, Corning Incorporated, США); заливочная среда BioMount (Bio-Optica, Италия); пробирки объемом 1,5 и 2 мл (Eppendorf, Германия); чашки Петри диаметром 25 мм (Nunc, Дания); набор для окрашивания гематоксилин-эозином (BioVitrum, Россия); эпон-аралдитовые смолы (SPI-CHEMTM, США); алмазный нож (Diatome, Switzerland); и среда Histomix (BioVitrum, Россия). 47 2.2. Приборы Работа выполнена на следующих приборах: (1) просвечивающий электронный микроскоп JEM 1400 (Jeol, Япония) с цифровой камерой Veleta (Olympus Soft Imaging Solutions, Германия) и программным обеспечением iTEM версия 5.2 (Jeol, Япония); (2) просвечивающий электронный микроскоп высокого разрешения JEM-2010 (Jeol, Япония); (3) прибор для характеризации суспензий НЧ Zetasizer NanoZS (Malvern, Англия); (4) световой микроскоп Leica DM2500 со встроенной камерой DFC420 C (Leica, Германия); (5) ваккумная напылительная установка для напыления сеточек углеродом JEE-420 (Jeol, Япония); (6) ультразвуковая ванна Bandelin DT31 (Германия); (7) спектрофотометр Multiscan RC (Labsystems, Финляндия); (8) спектрофотометр Shimadzu UV-2100 (Япония); (9) ультрамикротом EM UC7 (Leica, Германия); (10) автомат для гистологической проводки тканей TussueTEK II (Sakura, Япония); (11) микротом Leica RM 2255 (Германия). 2.3. Синтез наночастиц Наночастицы палладия были синтезированы к.х.н. С.Ю. Троицким (Институт катализа СО РАН) в соответствии с методом промежуточного синтеза полиядерных гидроксокомплексов палладия (II) в жидкой фазе (Троицкий и др. 1995; Симакова и др. 2012). В раствор палладийхлористоводородной кислоты H2PdCl4 (1,25 мМ) по каплям, при энергичном перемешивании, добавляли раствор NaOH (1,0 М) в мольном соотношении 1:2. Восстановление полиядерных гидроксокомплексов до металлического состояния проводили концентрированным раствором гидразингидрата N2H4•H2O в 5-кратном избытке в течение 30 мин при 40оС, после чего раствор в течение часа доводили до кипения и выдерживали 10 мин. Полученные НЧП отмывали большим избытком дистиллированной воды, и после центрифугирования и декантации добавляли фосфатный буфер (0,01 М, pH 7,3-7,5) до концентрации 5 мг/л. Хранили НЧП в фосфатном буфере при 4 ºС. 48 Наночастицы золота были синтезированы к.х.н. И.А. Пышной (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН) по протоколу синтеза цитратным методом (Grabar et al. 1995). Раствор цитрата натрия (5 мл; 38,8 мM) добавляли, перемешивая, в кипящий раствор HAuCl4•3H2O (45 мл; 1,1 мM). Через 20 мин интенсивного перемешивания смесь охлаждали до комнатной температуры, выдерживали в течение 24 ч и пропускали через 0,45 мкм фильтр. Полученную суспензию НЧЗ (0,6 мг/л) хранили при 4oС. Наностержни золота были синтезированы к.х.н. И.А. Пышной (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН) по протоколу Nikoobakht и El-Sayed с модификациями (Nikoobakht, El-Sayed 2003). Для приготовления «затравки» водный раствор ЦТАБ (5 мл; 0,20 М) обрабатывали ультразвуком (20 мин, 40oС) и смешивали с HAuCl4•3H2O (5,0 мл; 0,25 мМ). Затем, перемешивая, добавляли охлажденный боргидрид натрия NaBH4 (0,60 мл; 0,010 М). После минутного перемешивания смесь оставляли при 25oС на 30 мин. Получившиеся «зерна», покрытые ЦТАБ, в дальнейшем использовали на стадии роста наностержней: HAuCl4•3H2O (0,5 мл; 0,10 мМ) смешали со ЦТАБ (10 мл; 0,10 М) при 25 oС и затем добавили нитрат серебра AgNO3 (0,20 мл; 0,60 мМ). Для получения «ростового» раствора, осторожно перемешивая, добавили аскорбиновую кислоту (100 мл; 0,08 М). На заключительном этапе синтеза смешали «затравку» (12 мл) с «ростовым» раствором (10 мл) при 40oС. Через 3 ч смесь сконцентрировали путем двукратного центрифугирования (11000 об/мин, 20 мин). Данная процедура также позволила удалить несвязанный ЦТАБ. Осажденные ЦТАБНСЗ разводили дистиллированной водой, полученную суспензию хранили при 4oС. 2.4. Модификация наночастиц Наночастицы были модифицированы к.х.н. И.А. Пышной (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН). 49 Наночастицы золота модифицировали линейным ПЭИ по методике «слой-за-слоем» (Takahashi et al. 2008). Для этого водный раствор БСА (150 мкл, 1 мг/мл) добавляли в суспензию синтезированных НЧЗ (1,35 мл; 1,16 нM). Затем смесь одну минуту перемешивали и концентрировали центрифугированием (11000 об/мин, 10 мин). Осажденные НЧЗ повторно диспергировали в 50 мкл дистиллированной воды и добавляли в раствор линейного ПЭИ (200 мкл, 87 кДа, 1 мас%) при перемешивании. Через 6 ч раствор центрифугировали (11000 об/мин, 10 мин). Осажденные НЧЗ, покрытые ПЭИ (ПЭИ-НЧЗ), повторно диспергировали в 100 мкл дистиллированной воды и дважды центрифугировали (9000 об/мин, 20 мин) для удаления несвязанного ПЭИ. Для получения БСА-НЧЗ цитратные НЧЗ (0,9 мл 1,16 нМ) инкубировали с раствором БСА (0,1 мл 0,01мМ) в фосфатном буфере (10 мМ, pН 7.4) в течение 1 ч при комнатной температуре. Получившуюся смесь центрифугировали (11000 об/мин, 15 мин), осадок разводили фосфатным буфером и хранили при 4оС. Наностержни золота модифицировали ПЭИ или БСА по методике «слой за слоем» (Takahashi et al. 2008; Wang J. et al. 2012). Для этого суспензию ЦТАБ-НСЗ (50 мкл) по каплям добавляли в водный раствор линейного ПЭИ (200 мкл; 1 мас%) или в раствор БСА (150 мл, 1 мг/мл) в фосфатном буфере (10 мМ; pH 7,4) при перемешивании. Затем смеси энергично перемешивали в течение 6 ч при 25оС. Полученные суспензии ПЭИ-НСЗ и БСА-НСЗ трижды центрифугировали (12000 об/мин, 15 мин) для удаления избытка ПЭИ или БСА. Осадок ресуспендировали в дистиллированной воде. Модифицированные НСЗ (1 мг/мл) хранили при 4oС. 2.5. Методы характеризации наночастиц Суспензии НЧ исследовали методом динамического светорассеяния (ДСР) и электрофоретического светорассеяния для определения гидродинамического размера и дзета-потенциала НЧ, а также частоты встречаемости фракций различного размера. Каждый образец 6 раз измеряли 50 при комнатной температуре, затем полученные значения усредняли. Спектры поглощений НЧ регистрировали в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см на спектрофотометре Shimadzu UV-2100. Морфологию и размеры НЧ в суспензии, а также их поведение в различных средах изучали с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ). Для этого суспензии НЧ сорбировали в течение 30 сек на медные сетки, покрытые формваровой пленкой с углеродным напылением. Излишки жидкости отбирали фильтровальной бумагой и высушивали сетки на воздухе, либо контрастировали 2%-ным раствором уранилацетата в течение 7 сек. Все электронно-микроскопические исследования проводили при ускоряющем напряжении 80 кВ. Средний размер НЧ определяли путем измерения 100 частиц с четкими границами на мониторе цифровой камеры с помощью программы iTEM, версия 5.2 (Olympus Soft Imaging Solutions, Germany). Кристаллическую структуру НЧП изучали с помощью ПЭМ высокого разрешения после нанесения суспензий НЧП с помощью ультразвукового распылителя на сетки, покрытые углеродом. Данное исследование выполнено Е.Ю. Герасимовым (Институт катализа СО РАН). 2.6. Изучение поведения наночастиц в культуральных средах Для изучения поведения НЧЗ и НСЗ в различных растворах, используемых при выращивании клеток, суспензии НЧ центрифугировали (11000 об/мин, 10 мин), а осадок исходных НЧЗ и ПЭИ-НЧЗ, ЦТАБ-, БСА- и ПЭИ-НСЗ разводили 1:9 следующими растворами: (1) среда DMEM с 10% сыворотки; (2) кондиционированная среда DMEM; (3) 10%-ный водный раствор сыворотки; и (4) фосфатный буфер. Полученные суспензии НЧ обрабатывали ультразвуком в течение 15 мин (35 кГц, 240 Вт) и сразу, или после инкубации при 37оC в течение 24 ч изучали с помощью ДСР и ПЭМ. Поведение НЧП в различных растворах анализировали в следующем порядке: (1) исходная суспензия синтезированных НЧП, (2) суспензия НЧП 51 при разведении 1:2 и 1:9 фосфатным буфером, а также (3) влияние ультразвукового воздействия на дисперсность НЧП. Далее изучали влияние разведения суспензии НЧП 1:2 или 1:9 следующими растворами: (1) 1%-ный раствор БСА в фосфатном буфере; (2) 1%-ный раствор ПЭГ в карбонатном буфере; (3) 1%-ный водный раствор ПВП; (4) культуральная среда DMEM; (5) культуральная среда IMDM; (6) среды DMEM и IMDM с 10% сыворотки; (7) кондиционированные среды DMEM и IMDM (собранные после 48часового культивирования). Все перечисленные выше суспензии НЧП подвергали ультразвуковому воздействию в течение 15 мин и изучали с помощью ДСР и ПЭМ. Применялись такие параметры обработки, при которых побочные эффекты от ультразвука были минимальными (Meißner et al. 2014). Для этого плотно закрытые пробирки объемом 1,5 мл, содержащие 50 мкл приготовленной суспензии, размещали в плавающие держатели только в центре ультразвуковой ванны и воздействовали ультразвуком с частотой 35 кГц и мощностью 240 Вт. 2.7. Работа с животными Линии мышей были получены из ИЦИГ СО РАН (CBA) и ИМБТ ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (C57BL). Животных содержали при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище. Эксперименты проводили в соответствии с Хельсинской декларацией Второй медицинской ассоциации (1964), «Международными положениями проведения биомедицинских исследований с использованием животных» (1985) и «Правил лабораторной практики в Российской Федерации» (Приказ Минздрава РФ №267 от 19.06.2003). 2.8. Культуры клеток Культуры клеток меланомы мыши (B16); клеток почек сирийского хомячка (Baby Hamster Kidney cells, BHK-21); и эпителиальных клеток почек коккер-спаниэля (Madin-Darby Canine Kidney cells, MDCK) были получены 52 из Института Цитологии РАН (Санкт-Петербург, Россия). Для исследований культуры клеток MDCK, ВНК-21 и меланомы В16 были подготовлены А. В. Владимировой (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН). Для получения первичной культуры макрофагов из перитонеальной полости мышей линии CBA (22–25 г) выделяли клетки после предварительной стимуляции 2%-ным раствором тиогликолята в 1 мл стерильного 0,9%-ного раствора NaCl, в соответствии с протоколом (Zhang et al. 2008). Забор клеток проводили через 3 дня путем 2-х разового промывания перитонеальной полости стерильным фосфатным буфером. Взвесь клеток от разных мышей объединяли и хранили во льду. Затем собранные клетки центрифугировали (3000 об/мин, 5 мин), осадок ресуспендировали в 2 мл фосфатного буфера и определяли количество жизнеспособных клеток после окрашивания трипановым синим путем подсчета неокрашенных клеток в камере Горяева с помощью светового микроскопа. Для отделения макрофагов от других клеток, собранные клетки инкубировали в среде DMEM с 10% сыворотки в термостате (37оС; 5% СО2) в течение 2 ч. Клетки, не прикрепившиеся к субстрату, смывали фосфатным буфером. Процент макрофагов по результатам ПЭМ-анализа составлял не менее 95%. Макрофаги идентифицировали по размеру, наличию многочисленных выростов цитоплазмы и фагосом, а также по отсутствию лейкоцит- специфических гранул. Все клетки инкубировали в среде DMEM с 10% сыворотки и добавлением пенициллина (100 Ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл) и амфотерицина (0,25 мкг/мл) при 37°С во влажной атмосфере с 5% СО2. 2.9. Обработка наночастиц для исследований на культурах клеток Перед добавлением в культуры клеток суспензию НЧП и НЧЗ разводили 1:2 кондиционированной средой DMEM (собранной с клеток после 48-часового культивирования) и обрабатывали ультразвуком 15 мин. 53 Для исследований ПЭИ-НЧЗ, ПЭИ- и БСА-НСЗ центрифугировали (11000 об/мин, 10 мин), отбирали надосадочную жидкость и разводили средой DMEM, содержащей 10% сыворотки. 2.10. Исследование токсичности наночастиц in vitro Токсичность НЧ оценивали с помощью МТТ-теста, позволяющего выявить количество жизнеспособных клеток по изменению оптической плотности раствора (Sylvester 2011). Данный метод основан на способности митохондриальных дегидрогеназ восстанавливать неокрашенные формы МТТ-реагента до голубого кристаллического формазана, растворимого в диметилсульфоксиде; поэтому интенсивность окрашивания напрямую отражает активность митохондрий. Клетки культуры MDCK высевали в 96-луночный культуральный планшет (3х103 клеток/лунку, 4 повтора для каждой группы) и инкубировали в течение 24 ч в 100 мкл среды DMEM с 10% сыворотки. Затем среду в лунках заменяли порцией свежей, а в экспериментальные лунки добавляли НЧП, итоговая концентрация которых составляла от 5x10-1 до 5x10-11 мг/л (последовательные 100-кратные разведения). Клетки культур В16 и BHK-21 высевали в 96-луночный культуральный планшет (3х103 клеток/лунку, 4 повтора для каждой группы) и инкубировали в течение 24 ч в 100 мкл среды DMEM с 10% сыворотки. Затем среду в лунках заменяли порцией свежей средой или средой, содержащей наностержни золота в концентрации от 2 до 0,0002 мг/л (последовательные 10-кратные разведения). Необработанные НЧ клетки служили контролем. После добавления НЧ планшеты с клетками помещали в термостат на 48 ч и 72 ч (через 48 ч среду заменяли). По окончании инкубации в каждую лунку добавляли МТТ до концентрации 0,5 мкг/мл, и планшеты помещали в термостат еще на 3 ч. Далее среду отбирали и добавляли по 100 мкл диметилсульфоксида в каждую лунку. После растворения кристаллов формазана (через 5-10 мин) измеряли оптическую плотность на 54 многоканальном спектрофотометре Multiscan RC на длинах волн 570 и 620 нм. Жизнеспособность клеток выражали в процентах, которые рассчитывали по изменению оптической плотности в экспериментальных лунках относительно контрольных. 2.11. Изучение взаимодействия наночастиц с клетками методом световой микроскопии Для светооптического исследования клетки культуры MDCK (5х10 4 клеток/лунку в 0,5 мл среды) высевали в 24-луночные культуральные планшеты, на дно которых помещали обезжиренные покровные стекла, и инкубировали в течение 24 ч. Затем добавляли НЧ в концентрации 0,05 мкг/л и инкубировали еще 30 мин, 5 и 24 ч. По окончании этого времени среду в лунках заменяли 4%-ным раствором параформальдегида (pH 7,3-7,4) и помещали планшеты с клетками на 24 ч в холодильник при 4оС. После фиксации клетки окрашивали гематоксилин-эозином, для чего покровные стекла с клетками вынимали из планшетов, переносили в специальную посуду для окрашивания и 3 раза промывали дистиллированной водой. Для повышения проницаемости мембран клеток образцы последовательно помещали в 50%-ный раствор ацетона (2 мин), абсолютный ацетон (2 мин) и снова в 50%-ный раствор ацетона (2 мин). Далее окрашивали гематоксилином (15 сек), промывали в проточной воде (1 мин) и 2 раза в дистиллированной воде. Эозином окрашивали в течение 1 мин, затем быстро промывали 70%-ным раствором этанола и помещали в 96%-ный раствор этанола (2 мин) и в ксилол (2 мин). Клетки заключали в среду BioMount, для этого покровные стекла помещали на каплю среды, нанесенной на предметное стекло, клетками вниз. Полученные препараты изучали с помощью светового микроскопа. 55 2.12. Изучение взаимодействия наночастиц с клетками методом просвечивающей электронной микроскопии 2.12.1. Культивирование клеток Клетки культуры В16 и ВНК-21 высевали в 12-луночные культуральные планшеты (1х105 клеток/лунку) и инкубировали в течение 24 ч в 1 мл среды DMEM с сывороткой. Затем среду отбирали и добавляли порцию свежей. В экспериментальные лунки добавляли ПЭИ-НЧЗ, БСА- и ПЭИ-НСЗ в концентрации 0,1 мкг/л. Планшеты помещали в инкубатор на 30 мин, 3 и 24 ч. Необработанные НЧ клетки служили контролем. Клетки культуры MDCK высевали в 12-луночные культуральные планшеты (2х105 клеток/лунку в 1 мл среды) и инкубировали в течение 24 ч. По истечении этого времени среду заменяли и в экспериментальные лунки добавляли подготовленные НЧЗ или НЧП в концентрации 0,3 мкг/л, после чего планшеты инкубировали 10, 30 мин, 3, 5 и 24 ч. По окончании инкубации клетки культур MDCK, В16 и ВНК-21 снимали с помощью трипсина (200 мкл на лунку), который инактивировали 500 мкл среды с 10% сыворотки, переносили в пробирки объемом 1,5 мл и центрифугировали (3000 об/мин, 5 мин). Для изучения взаимодействия НЧ с перитонеальными макрофагами in vitro макрофаги высевали в чашках Петри диаметром 25 мм (3х106 клеток/чашку) в 3,5 мл среды DMEM с 10 % сыворотки. Через сутки среду заменяли на свежую и добавляли подготовленные НЧЗ или НЧП в концентрации 0,1 мкг/л. Контролем служили необработанные НЧ клетки. Через 10 и 30 мин, 3, 5 и 24 ч инкубации клетки снимали культуральным скребком, переносили в пробирки объемом 1,5 мл и осаждали центрифугированием (3000 об/мин, 5 мин). Для изучения взаимодействия НЧЗ с перитонеальными макрофагами in vivo мышам линии CBA после предварительной стимуляции 2%-ным раствором тиогликолята (как описано выше) вводили в перитонеальную 56 полость подготовленную суспензию НЧЗ (0,1 мкг/мышь в 0,5 мл 0,9%-ного раствора NaCl). Забор клеток из перитонеальной полости проводили через 10, 30 мин, 3, 5 и 24 ч после введения НЧЗ путем смыва 0,9%-ным раствором NaCl. Далее клетки осаждали центрифугированием (3000 об/мин, 5 мин). Контролем служили клетки, взятые от мышей, которым не вводили НЧЗ. Все полученные осадки клеток фиксировали в 4%-ном растворе параформальдегида при 4оС в течение 24 ч. 2.12.2. Приготовление препаратов для ультраструктурного исследования Фиксированные осадки промывали 3 раза средой и дофиксировали 1%ным раствором четырехокиси осмия. Через 1 ч осадки промывали 3 раза средой и последовательно добавляли 30%-ный раствор этанола на 5 мин; 2 раза 50%-ный раствор этанола по 5 мин; 3 раза 70%-ный раствор этанола по 10 мин и 3 раза 96%-ный этанол по 10 мин. Затем 4 раза промывали абсолютным ацетоном по 15 мин. Далее осадки на 24 ч оставляли в пропитке (смесь ацетона со смолой 1:1). Для приготовления смолы смешивали 7,50 мл аралдита (Araldite 502), 11,25 мл смолы эпон (SPI-PON 812) и 27,75 мл смягчителя (DDSA). После высушивания на воздухе осадки помещали в конические формочки и заливали смолой, смешанной с катализатором (DMP30, 100 мкл на 5 мл смолы). Для полимеризации образцы выдерживали 7 ч при 30оС, 12 ч при 42оС и 2 суток при 54оС. На ультрамикротоме делали ультратонкие срезы, которые контрастировали растворами уранилацетата и цитратом свинца. Часть срезов не контрастировали для лучшей визуализации НЧ небольшого размера. Изучали ультратонкие срезы с помощью ПЭМ. 2.13. Изучение способности наностержней золота вызывать фототермолиз в клетках ВНК-21 и В16 при облучении лазером in vitro Клетки B16 и BHK-21 (по 5×104 клеток/лунку в 0,5 мл DMEM) высевали в 48-луночные культуральные планшеты, на дно которых клали 57 покровные стекла, и культивировали в течение 24 ч до формирования монослоя с плотностью 70-80%. В контрольных лунках заменяли среду. В экспериментальных лунках отбирали среду и добавляли суспензию НСЗ, модифицированных БСА или ПЭИ, до концентрации 0,05 мкг/л. Через 24 ч клетки облучали лазером. Параметры облучения: полупроводниковый лазер ближнего ИК диапазона с длиной волны 808 нм или 650 нм при плотности мощности лазерного излучения 0,7 Вт/см2, продолжительность воздействия 15 мин при комнатной температуре. Вне СО2-инкубатора контрольные и экспериментальные образцы находились одинаковое время. Было сформировано 4 группы (по 8 лунок в каждой группе): (1) контрольные клетки; (2) клетки, обработанные НСЗ; (3) клетки, облученные лазером; (4) клетки, обработанные НСЗ и облученные лазером. Сравнение лазеров с разными длинами волн проводили на культуре клеток BHK-21 (соответственно, исследовалось 8 групп). Клетки меланомы В16 облучали только лазером с длиной волны 808 нм. После облучения препараты готовили для светооптического анализа тремя способами: (1) клетки на покровных стеклах (по 2 стекла на группу) сразу же окрашивали трипановым синим и фиксировали 4%-ным раствором парафольмадегида и помещали в среду BioMount; (2) клетки на покровных стеклах (по 2 стекла на группу) фиксировали в течение суток 4%-ным раствором парафольмадегида, окрашивали гематоксилин-эозином и заключали в среду BioMount; (3) клетки (по 4 стекла на группу) помещали в СО2-инкубатор на 24 ч и окрашивали трипановым синим или гематоксилинэозином. По результатам сравнения в световом микроскопе плотности монослоя клеток контрольных и экспериментальных образцов делали заключение о повреждающем действии лазера в присутствии или в отсутствии НСЗ. Для электронно-микроскопического анализа клетки B16 и BHK-21 (по 5×104 клеток на лунку в 0,5 мл DMEM, по 2 лунки на группу) высевали в 48луночные культуральные планшеты и культивировали в течение суток, затем 58 заменяли среду в лунках и в экспериментальные лунки добавляли НСЗ в концентрации 0,05 мкг/л. Через 24 ч образцы облучали лазером. Клетки отделяли путем обработки трипсином, который инактивировали средой с сывороткой. Суспензию клеток центрифугировали (3000 об/мин, 5 мин) и фиксировали в 4%-ном растворе парафольмадегида в течение суток при 4оС. Далее образцы обрабатывали, как описано выше, и изучали с помощью ПЭМ. 2.14. Исследование способности наностержней золота вызывать фототермолиз меланомы мыши В16 при облучении лазером in vivo Модель меланомы получали путем подкожного введения мышам C57Bl/6 (самки, 18-20 г) клеток меланомы B16 (1,5x105 клеток/мышь в 0,5 мл стерильного фосфатного буфера) (Overwijk, Restifo 2001). Данная часть работы выполнена к.б.н. Е. П. Гончаровой (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН). Суспензии клеток хранили во льду. Предварительно с участка кожи, куда вводили клетки, удаляли волосяной покров. На 10-й день, когда размеры опухоли составляли примерно 0,5 см в диаметре, внутрь опухоли вводили ПЭИ-НСЗ (0,2 мг/мышь в 100 мкл стерильного 0,9%-ного раствора NaCl). Мышам вводили 2 типа ПЭИ-НСЗ: с продольным плазмонным резонансом на длине волны 760 или 808 нм. Контрольной группе мышей вводили такое же количество стерильного 0,9%ного раствора NaCl. В итоге были сформированы следующие группы мышей по 5 животных в каждой, которым: (1) вводили стерильный 0,9% раствор NaCl (контроль); (2) вводили ПЭИ-НСЗ; (3) вводили стерильный 0,9%-ный раствор NaCl и облучали лазером; и (4) вводили ПЭИ-НСЗ и облучали лазером. Через двое суток после введения НСЗ, опухоль облучали лазером с длиной волны 650 нм (0,1 Вт/см2) и 808 нм (0,1 Вт/см2) в течение 5 мин. Воздействие лазером проводили под авертиновым наркозом (200 мг 2,2,2 трибромоэтанола и 2-метилбутанола-2 разводили в 40 мл стерильного 0,9%ного раствора NaCl и вводили мышам по 300 мкл на 20 г веса). Контрольным 59 мышам также вводили авертин. Для облучения мышей помещали на горизонтальную поверхность и направляли лазер непосредственно на выступающий участок опухоли. Разогревание опухоли регистрировали д.х.н. Д. В. Пышный и к.ф.-м.н. А. А. Ломзов (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН) с помощью тепловизора производства ИФП СО РАН (Россия). В последующие дни проводили мониторинг опухолевого роста. Объем опухолей рассчитывали по формуле: объем = ½ (длина опухоли) х (ширина опухоли)2. На 4-й день после облучения, опухолевую ткань иссекали, фиксировали в 4%-ном растворе параформальдегида и готовили образцы для световой и электронной микроскопии. Зафиксированные опухоли разрезали, кусочки тканей обезвоживали в растворах этилового спирта возрастающей концентрации и осветляли в ксилоле с помощью автомата для гистологической проводки тканей. Образцы заключали в среду Histomix, срезы делали на микротоме. Полученные препараты изучали с помощью светового микроскопа. Для ПЭМ кусочки опухолей промывали 3 раза в культуральной среде и дофиксировали 1%-ным раствором четырехокиси осмия OsO4 в течение 3 ч. Далее проводили обезвоживание в растворах этилового спирта возрастающей концентрации и в ацетоне, при этом время, приведенное для клеточных осадков, увеличивали в 2 раза. После пропитки образцы заключали в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме EM UC7 и контрастировали растворами уранилацетата и цитратом свинца. 60 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1. Физико-химические характеристики препаратов наночастиц Препараты наночастиц (НЧ) принято характеризовать по следующим параметрам: химический состав, форма, размер, дзета-потенциал, однородность и дисперсность суспензии. Препарат наночастиц золота (НЧЗ) в дистиллированной воде был представлен сферическими частицами (Рис. 3.1 Б), которые имели размеры 13,4±1,3 нм, максимум поглощения наблюдался на длине волны 520 нм (Рис. 3.1 А). Значение дзета-потенциала составляло -42,8±1,4 мВ. Для изучения влияния модифицирующего покрытия на взаимодействие НЧЗ с клетками был исследован препарат НЧЗ, покрытых полиэтиленимином (ПЭИ-НЧЗ), состоящий из обособленных сферических частиц размером 15,9±2,1 нм; дзета-потенциал равнялся 34,0±1.0 мВ. Для изучения поведения НЧЗ в культуральных средах был также изучен препарат НЧЗ, покрытых бычьим сывороточным альбумином (БСА-НЧЗ), состоящий из обособленных сферических частиц (13,8±2,7 нм); значение дзета-потенциала соответствовало −22,4±0,5 мВ. Спектры поглощения ПЭИ-НЧЗ и БСА-НЧЗ представлены на (Рис. 3.1). Препарат наностержней золота (НСЗ), стабилизированных ЦТАБ (ЦТАБ-НСЗ), в дистиллированной воде был представлен палочковидными частицами (Рис. 3.2 Б), которые имели размеры 53,8±5,9 х 20,9±2,7 нм; продольный поверхностный плазмонный резонанс регистрировался на длине волны 760 нм (НСЗ760) (Рис. 3.2 А). Для изучения взаимодействия с клетками и способности НСЗ вызывать фототермолиз клеток были исследованы НСЗ760, покрытые бычьим сывороточным альбумином (БСА-НСЗ) или линейным полиэтиленимином (ПЭИ-НСЗ), которые имели палочковидную форму. В дистиллированной воде БСА-НСЗ имели размеры 56,3±5,3 х 20,2±2,9 нм, значение дзета-потенциала соответствовало −9,1±0,4 мВ;. ПЭИНСЗ имели размеры 53,8±7,6 х 19,2±2,7 нм, значение дзета-потенциала 61 соответствовало 53,0±0,8 мВ. Спектры адсорбции НЧЗ и НСЗ были идентичны до и после модификации ПЭИ или БСА (Рис. 3.1 А и 3.2 А). Также были исследованы ПЭИ-НСЗ, имеющие размеры 35,1±5,8 х 7,8±1,3 нм, с продольным плазмонным резонансом при 840 нм (НСЗ840). Рис. 3.1 Наночастицы золота: спектр поглощения (А) и электронномикроскопическое изображение при адсорбции суспензии на сетку (Б). Рис. 3.2 Наностержни золота: спектр поглощения (А) и электронномикроскопическое изображение при адсорбции суспензии на сетку (Б). 62 Препарат наночастиц палладия (НЧП) в дистиллированной воде состоял из агломератов НЧП размером около 200 нм (Рис. 3.3 А и 3.4 А) и обособленных частиц размером 5,8±1,6 нм, имеющих близкую к сферической форму с четкими очертаниями (Рис. 3.4 Г). Значение дзета-потенциала соответствовало 42,8±1,4 мВ. 3.2. Поведение наночастиц палладия в культуральных средах В фосфатном буфере значение дзета-потенциала НЧП было отрицательным (-19,0±1,2 мВ); анализ дисперсного состояния частиц в суспензии с помощью ДСР выявил их полную агрегацию. ПЭМ показала большие (до 10 мкм) агрегаты НЧП (этот термин подразумевает отсутствие видимого пространства между НЧ) высокой электронной плотности, обособленные НЧП отсутствовали. Данные агрегаты не разрушались ультразвуковым воздействием. Таким образом, НЧП в фосфатном буфере (pH 7,2-7,4) активно агрегировали, и агрегаты были устойчивы к интенсивному взбалтыванию и пипетированию, а также к воздействию ультразвуком. Получение высокодисперсной и стабильной суспензии НЧП в фосфатном буфере было первоочередной задачей, поскольку данный раствор используется для приготовления культуральных сред и для разведения препаратов НЧ. С этой целью мы исследовали влияние модификации БСА, полиэтиленгликолем (ПЭГ) и поливинилпирролидоном (ПВП) на дисперсность НЧП (Рис. 3.3). Электронно-микроскопический анализ показал, что БСА-НЧП агломераты размером от 0,1 до 2 мкм (Рис. 3.3 Б). Наночастицы палладия, модифицированные с помощью ПЭГ или ПВП, адсорбировались на сетке, в основном, агломератами размером 200-500 нм, и более крупными агломератами (около 8-10 мкм), которые покрыты ПЭГ (Рис. 3.3 В) или ПВП (Рис. 3.3 Г). Обособленные НЧП при данных модификациях обнаружены не были. Таким образом, модификация поверхности НЧП БСА, 63 ПЭГ или ПВП не позволяет получить высокодисперсную суспензию НЧП при физиологических pH (Табл. 3.1). Рис. 3.3 Характеристики препаратов наночастиц палладия, разведенных в различных жидкостях: дистиллированная вода (А); раствор бычьего сывороточного альбумина (Б); раствор полиэтиленгликоля (В); раствор поливинилпирролидона (Г); среда DMEM с 10% сыворотки (Д) и кондиционированная среда (Е). Приведено электронно-микроскопическое изображение суспензии при адсорбции на сетку и интенсивность светорассеяния НЧП в суспензии. Исследования на культурах клеток проводятся с использованием питательных сред, которые являются сложными буферными системами. Мы изучили поведение НЧП в культуральных средах DMEM и IMDM и 64 обнаружили, что разведение в среде DMEM существенно снижает агломерацию НЧП (Табл. 3.1). Значение дзета-потенциала в среде DMEM составляло -10,6 мВ. Исследование с помощью ПЭМ показало, что НЧП, разведенные средой DMEM, диспергированы сильнее, чем разведенные в среде IMDM. В экспериментах in vitro используется инактивированная бычья сыворотка для обогащения среды ростовыми факторами и питательными веществами, поэтому мы также изучили влияние среды с сывороткой, на поведение НЧП. Оказалось, что НЧП, разведенные в среде DMEM с 10% сыворотки, формируют рыхлые агломераты размером около 50-120 нм, окруженные гомогенной субстанцией средней электронной плотности (Рис. 3.3 Д). Таким образом, разведение средой DMEM с сывороткой позволило получить стабильную суспензию НЧП, пригодных для использования в экспериментах с культурами клеток. Рис. 3.4 Изображение скопления наночастиц палладия в кондиционированной среде (А) и его увеличенные фрагменты (Б-Г), полученные с помощью ПЭМ высокого разрешения. 65 Интересно, что при разведении НЧП средой DMEM, собранной с клеток после 48 ч инкубации (кондиционированная среда), дисперсность НЧП была выше, чем после разведения свежеприготовленной средой DMEM, содержащей 10% сыворотки (Табл. 3.1). Электронно-микроскопический анализ показал, что при разведении НЧП кондиционированной средой DMEM частицы адсорбируются на сетки поодиночке, в окружении субстанции средней электронной плотности (Рис. 3.3 Е). При хранении этой суспензии при 40С в течение 24 ч отмечалось медленное осаждение НЧП; однако, частицы легко диспергировались под воздействием ультразвука. Похожие результаты были получены при разведении НЧП кондиционированной средой и хранении суспензии при 4 0С в течение 7 дней. Таким образом, можно добиться необходимой дисперсности и стабильности НЧП путем их разведения в кондиционированной среде, полученная суспензия будет пригодна для использования в работах с культурами клеток. Табл. 3.1 Дисперсность препаратов наночастиц палладия Используемый раствор для разведения суспензии НЧП Дистиллированная вода (pH 7,0) Фосфатный буфер (pH 7,3-7,5) 1% раствор БСА в фосфатном буфере (pH 7,3-7,5) 1% водный раствор ПВП (pH 7,0) 1% раствор ПЭГ в карбонатном буфере (pH 8,3) Среда DMEM (pH 7,4) Среда DMEM с 10% сыворотки Кондиционированная среда DMEM Кондиционированная среда DMEM после недельного хранения Диапазон размеров, нм 80-700 600-10000 Средний размер, нм 203,9 906,2 95-2000 335,9 70-10000 760,0 80-8000 198,6 50-1000 10-500 20-200 169,0 57,1 51,9 20-200 49,1 66 Электронно-микроскопический анализ показал, что НЧП до и после обработки были одного размера (около 6 нм) и формы. ПЭМ высокого разрешения подтвердила, что разведение суспензии НЧП кондиционированной средой не влияет на их структуру, которая имеет кристаллическую конфигурацию (Рис. 3.4) с Брэгговским расстоянием 2,25 Å, что соответствует кубической решетке металлического палладия в наноразмерных кластерах (Berger et al. 2010). 3.3. Поведение наносфер и наностержней золота в культуральных средах Нами было изучено поведение НЧЗ и НСЗ, модифицированных БСА и ПЭИ, в различных растворах (10% раствор сыворотки, культуральная среда DMEM с 10% сыворотки и кондиционированная среда). Размер и заряд НЧ через 40 мин инкубации не отличались от таковых через 24 ч инкубации в одной и той же среде. Изменение гидродинамического размера и дзетапотенциала было выявлено при сравнении различных разведений (Рис. 3.5 и 3.6). По данным ДСР размер цитратных НЧЗ увеличился на 65 и 75 нм после инкубации, соответственно, в исходной и в кондиционированной среде DMEM, при модификации ПЭИ такого рода изменения отсутствовали. Гидродинамический размер НЧЗ, модифицированных БСА, также увеличивался на 30-40 нм в исходной и кондиционированной среде DMEM. Исходные НЧЗ имели отрицательный поверхностный заряд во всех растворах (Рис. 3.5 А), их модификация с помощью ПЭИ приводила к изменению поверхностного заряда на положительный в дистиллированной воде (34,03±1,32 мВ). После инкубации в культуральных средах, растворе сыворотки и в отрицательный фосфатном (Рис. 3.5 буфере А). заряд Значения ПЭИ-НЧЗ сменился дзета-потенциала на НЧЗ, модифицированных ПЭИ или БСА, были близкими по значению и знаку в фосфатном буфере, среде кондиционированной среде. DMEM, растворе сыворотки и в 67 Рис. 3.5 Характеристики препаратов наносфер (А) и наностержней золота (Б) по размеру (круги, ось справа) и дзета-потенциалу (серые столбики, ось слева) в различных жидкостях: 1 – дистиллированная вода, 2 – среда DMEM с 10% сыворотки, 3 – кондиционированная среда, 4 - 10% раствор сыворотки, 5 – фосфатный буфер. 68 Гидродинамический размер ЦТАБ-НСЗ увеличился на 37 и 49 нм в среде DMEM и в кондиционированной среде, соответственно. В дистиллированной воде ЦТАБ-НСЗ исходно имели положительный дзетапотенциал (43,86±1,89), который сменился на отрицательный после инкубации в культуральных средах (Рис. 3.5 Б). После модификации ПЭИ положительный заряд частиц сохранялся в дистиллированной воде (53,09±1,70 мВ), несколько снижаясь по значению в фосфатном буфере (5,35±1,54 мВ). Помещение ПЭИ-НСЗ в культуральные среды приводило к изменению положительного заряда на отрицательный. Следует отметить, что гидродинамические размеры близких по значению и отрицательно заряженных НЧЗ и НСЗ, покрытых ПЭИ, в средах, содержащих сыворотку, резко возрастали (на 90-100 нм), в отличие от ЦТАБ- и БСА-НСЗ. В среде DMEM и в кондиционированной среде НСЗ после модификации как ПЭИ, так и БСА имели отрицательный заряд, близкий по значению (Рис. 3.5 Б). Рис. 3.6 Абсолютные значения изменений дзета-потенциала (столбики) и гидродинамического размера (красные кружочки и треугольники) наносфер и наностержней золота, разведенных в среде DMEM (заливка серым) и в кондиционированной среде (заливка полученных в дистиллированной воде. белым) относительно значений, 69 Таким образом, модификация НЧЗ и НСЗ с помощью ПЭИ или БСА приводит к увеличению их гидродинамических размеров. Инкубация НЧЗ и НСЗ в культуральных средах также приводит к увеличению их гидродинамических размеров (Рис. 3.6). При инкубации модифицированных НСЗ в растворе сыворотке, в культуральной среде и в кондиционированной среде, их гидродинамические размеры существенно возрастают относительно ЦТАБ-НСЗ в тех же средах, тогда как гидродинамические размеры модифицированных НЧЗ соответствуют размерам исходных цитратных НЧЗ. 3.4. Изучение ультраструктурных характеристик суспензий наносфер и наностержней золота в культуральных средах Электронно-микроскопический анализ показал, что сферические НЧЗ в среде DMEM образуют агломераты. В кондиционированной среде и в фосфатном буфере НЧЗ формируют, соответственно, небольшие или крупные агрегаты. В среде DMEM (Рис. 3.7 П) и в кондиционированной среде (Рис. 3.7 Х) было выявлено формирование слоя средней электронной плотности на поверхности НЧЗ. Нам было интересно сравнить поведение НЧЗ, модифицированных ПЭИ, с другими НЧЗ в различных жидкостях. Исследование показало, что ПЭИ-НЧЗ высокодисперсны и адсорбируются на пленку обособленными частицами при разведении в дистиллированной воде, в растворе сыворотки, в свежей и в кондиционированной среде DMEM (Табл. 3.2). «Корона» на поверхности частиц была выявлена в фосфатном буфере (Рис. 3.7 З), в свежей (Рис. 3.7 С) и в кондиционированной среде DMEM (Рис. 3.7 Ч). «Корона» представляла собой слой материала средней электронной плотности толщиной менее 7 нм вокруг НЧ, аналогичный описанному ранее (Tkachenko et al. 2004; Schäffler et al. 2013). Некоторые ПЭИ-НЧЗ в кондиционированной среде были ассоциированы с её компонентами. 70 Рис. 3.7 Репрезентативные электронно-микроскопические фотографии препаратов наносфер и наностержней золота исходных и модифицированных в различных жидкостях: дистиллированная вода, фосфатный буфер, 10% раствор сыворотки, среда DMEM с 10% сыворотки, кондиционированная среда. Масштабная линия соответствует 50 нм. Наночастицы золота, модифицированные БСА, не имели дополнительного покрытия в дистиллированной воде (Рис. 3.7 Б), в фосфатном буфере (Рис. 3.7 Ж), в растворе сыворотки (Рис. 3.7 Л) и в среде DMEM (Рис. 3.7 Р). За исключением фосфатного буфера, БСА-НЧЗ были высокодисперсны во всех жидкостях и адсорбировались на сетки в виде обособленных НЧ (Табл. 3.2). Вокруг БСА-НЧЗ «корона» выявлялась только 71 в кондиционированной среде DMEM, кроме того, большинство частиц были окружены более толстым (20-70 нм) слоем материала неправильной формы (Рис. 3.7 Ц). Табл. 3.2 Дисперсность препаратов наносфер и наностержней золота в различных жидкостях. среда/ НЧ НЧЗ БСАНЧЗ ПЭИНЧЗ ЦТАБ -НСЗ БСАНСЗ ПЭИНСЗ Фосф. Дист. вода буфер Сыворотка DMEM с Конд. сывороткой DMEM частицы - - агломераты агрегаты частицы агломераты частицы частицы частицы частицы агрегаты частицы частицы частицы частицы - - частицы частицы агрегаты агрегаты агломераты частицы агломераты агрегаты частицы + частицы + агломераты агломераты агломерат ы частицы Используемые обозначения: частицы – обособленные наночастицы агломераты – кластеры из небольшого числа НЧ, зазоры между которыми хорошо визуализируются с помощью ПЭМ, но не превышают 2 нм. агрегаты – кластеры из НЧ, настолько плотно прилегающих друг к другу, что промежуток между ними не просматривается. 72 Суспензия дистиллированной ЦТАБ-НСЗ воде, но была и в высокодисперсной не культуральных средах. только в Однако, биологическое применение данных НСЗ невозможно ввиду выраженной токсичности ЦТАБ. Увеличение гидродинамического размера ЦТАБ-НСЗ (Рис. 3.5 Б) соответствовало формированию «короны» в среде DMEM (Рис. 3.7 Т) и 20-40 нм слою вокруг НЧ, а также некоторой агрегации частиц в кондиционированной среде (Рис. 3.7 Ш). Напротив, НСЗ, покрытые ПЭИ, агломерировали в дистиллированной воде, в растворе сыворотки, тогда как в кондиционированной среде ПЭИНСЗ обнаруживались в виде обособленных частиц (Табл. 3.2). Некоторые ПЭИ-НСЗ были ассоциированы с материалом средней электронной плотности в среде DMEM (Рис. 3.7 Ф) и в кондиционированной среде (Рис. 3.7 Э). Следует отметить, что морфология и толщина обволакивающего ПЭИ-НСЗ слоя отличались от слоя вокруг их сферических аналогов: «корона» НЧЗ, модифицированных ПЭИ, была более равномерной. Для НСЗ, покрытых БСА, в среде DMEM и в кондиционированной среде отмечалось формирование «короны» и толстого слоя (20-50 нм); тогда как в дистиллированной воде, в фосфатном буфере и в растворе сыворотки была выявлена агломерация данных НЧ. Следует отметить высокую адгезию материала средней электронной плотности к БСА-НСЗ, которая наблюдалась в среде DMEM (Рис. 3.7 У) и в кондиционированной среде (Рис. 3.7 Щ). Таким образом, разведение НЧЗ и НСЗ, модифицированных ПЭИ или БСА, в кондиционированной среде предотвращает агломерацию частиц. На ультраструктурном уровне были выявлены четкие различия в морфологии формирующегося покрытия на поверхности НЧ в различных средах. В результате исследований были подобраны условия подготовки НЧЗ, НСЗ и НЧП для исследования их взаимодействия с клетками. 73 3.5. Морфология культур клеток, использованных в работе В исследовании мы использовали клетки перевиваемых культур разных типов и первичную культуру перитонеальных макрофагов. Ультраструктура перитонеальных макрофагов не различалась in vitro и in vivo. Перитонеальные макрофаги имеют размер от 2 до 10 мкм в диаметре и неправильную форму. Края клеток неровные, с инвагинациями и выростами цитоплазмы разной величины и формы (Рис. 3.8 А). Четко визуализируются крупные ядра, узкие протяженные цистерны эндоплазматического ретикулума, многочисленные митохондрии, эндосомы, лизосомы и развитый аппарат Гольджи. Обнаружение «опушенных» ямок и пузырьков свидетельствует о реализации клатрин-зависимого эндоцитоза; кластеров кавеол – о кавеолин-зависимом эндоцитозе; скоплений гладкомембранных трубочек – о клатрин-кавеолин-независимом эндоцитозе; по характерным смыкающимся выростам цитоплазмы можно заключить о высокой активности фагоцитоза и макропиноцитоза в клетках. Интактные клетки MDCK в культуре сохраняют свойства эпителиальных клеток: полярные неправильной формы с различными межклеточными контактами (десмосомами и плотными контактами) (Рис. 3.8 Б). Клетки имеют округлые ядра с 2-3 ядрышками, короткие цистерны эндоплазматического ретикулума, редкие лизосомы и аппарат Гольджи. О реализации клатрин- и кавеолин-зависимого эндоцитоза в клетках свидетельствуют опушенные ямки, опушенные везикулы и кавеолы в плазматической мембране. Клетки фибробластоидной культуры BHK-21 округлой или овальной формы, ядра клеток с инвагинациями и несколькими ядрышками (Рис. 3.8 В). Эндоплазматический ретикулум выявляется в широкой зоне вокруг ядра. Комплекс Гольджи хорошо развит, обычно представлен 3-5 структурами на срезе клетки. Митохондрии овальной или округлой формы, кристы располагаются плотно или рыхло. В клетках выявляются «опушенные» ямки 74 и «опушенные» пузырьки (клатрин-зависимый эндоцитоз), много кластеров кавеол (кавеолин-зависимый эндоцитоз). Рис. 3.8 Перитонеальный макрофаг (А), клетки культуры MDCK (Б), клетки культуры ВНК-21 (В) и клетка меланомы В16 (Г). Ультратонкие срезы, ПЭМ. Клетки меланомы B16 в культуре имеют округлую форму с овальным или круглым ядром с несколькими отчетливыми ядрышками (Рис. 3.8 Г). Матрикс цитоплазмы зернистый, средней электронной плотности. Профилей эндоплазматического ретикулума в цитоплазме достаточно много, и они легко идентифицируются. Аппарат Гольджи встречается редко. 75 Митохондрии круглой или овальной формы, кристы большей частью расположены рыхло. Зрелые меланосомы в клетках культуры встречаются редко. Плазматическая мембрана и мембраны органелл выглядят несколько размытыми. Клетки меланомы В16 в опухоли отличаются от клеток в культуре более часто встречающимися профилями эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи и наличием большого количества зрелых меланосом. 3.6. Взаимодействие наносфер золота с перитонеальными макрофагами и клетками культуры MDCK Взаимодействие НЧЗ с перитонеальными макрофагами было изучено in vitro и in vivo. Исследование ультратонких срезов с помощью ПЭМ выявило тесный контакт отдельных НЧЗ и их скоплений с плазматической мембраной макрофагов через 10 и 30 мин после добавления НЧЗ к культуре или после введения в перитонеальную полость. Наночастицы золота обнаруживались в углублениях поверхности макрофагов, по краям которых формировались выросты цитоплазмы, формировалась постепенно полость смыкающиеся, (фагосома), в ограниченная результате чего плазматической мембраной (Рис. 3.9), что свидетельствовало о фагоцитозе НЧЗ. В результате НЧЗ оказывались внутри макрофагов, на срезе одной клетки наблюдалось до 8-10 фагосом, содержащих многочисленные НЧЗ (Рис. 3.9 В и 3.10). Путем фагоцитоза в макрофаги поступала основная часть НЧЗ, однако эти клетки также демонстрировали и способность к макропиноцитозу НЧЗ, картины которого чаще встречались на срезах макрофагов в культуре через 30 мин и 3 ч инкубации. Количество НЧЗ, захватываемых длинными цитоплазматическими выростами, было существенно меньше, чем при фагоцитозе, однако макропиноцитоз обеспечивал поглощение НЧЗ, не связанных с плазматической мембраной. 76 Рис. 3.9 Наночастицы золота в перитонеальном макрофаге (in vivo, 10 мин после введения НЧЗ). Макрофаг в состоянии активного макропиноцитоза, по всей поверхности клетки видны длинные выросты цитоплазмы, НЧЗ в инвагинациях показаны стрелками, внутри органелл звездочкой (А). Фагоцитоз скопления НЧЗ выростами цитоплазмы (Б). Фагосома, содержащая НЧЗ (В). Ультратонкие срезы, ПЭМ. 77 Рис. 3.10 Накопление наночастиц золота в фагосомах перитонеальных макрофагов через 3 ч инкубации in vitro. Ультратонкие срезы, ПЭМ. Микроэндоцитоз НЧЗ в перитонеальных макрофагах in vitro и in vivo был представлен клатрин- и кавеолин-зависимыми типами эндоцитоза, а также клатрин-кавеолин-независимым типом. На ультратонких срезах макрофагов, соответственно, наблюдались НЧЗ в «опушенных» ямках и пузырьках (Рис. 3.11 Б); в гладко-мембранных фляжко-подобных углублениях плазмалеммы (кавеолах) (Рис. 3.11 В) и в гладко-мембранных трубочках (Рис. 3.11 Г). Поступившие в клетку посредством микроэндоцитоза НЧЗ перемещались в ранние эндосомы (Рис. 3.11 Д) и МВТ (Рис. 3.11 Ж), в которых и обнаруживались, начиная с 10 мин эксперимента. На срезах перитонеальных макрофагов через 3 ч эксперимента отмечались фагосомы, содержащие крупные скопления НЧЗ (Рис. 3.10 Б), МВТ и лизосомы (Рис. 3.11 З). По мере инкубации не наблюдалось изменений структуры фагосом, содержащих НЧЗ. Инкубация макрофагов in vitro в течение 24 ч не повлияла на локализацию НЧЗ в клетках, НЧЗ сохранялись в фагосомах и лизосомах. В смывах макрофагов из перитонеальной полости, приготовленных через 5 ч после введения НЧЗ, отмечались единичные клетки, содержащие редкие НЧЗ, а через 24 ч макрофаги с НЧЗ обнаружить 78 не удалось, по-видимому, они мигрировали из перитонеальной полости с током лимфы. Рис. 3.11 Наночастицы золота в перитонеальных макрофагах (in vitro, 10 мин инкубации): контакт скопления НЧЗ с плазматической мембраной (А); НЧЗ в «опушенной» ямке и везикуле (клатрин-зависимый эндоцитоз) (Б); кластер кавеол, в просвете кавеолы видны НЧЗ (кавеолин-зависимый эндоцитоз) (В); НЧЗ в гладко-мембранных трубочках и везикуле (клатринкавеолин-независимый эндоцитоз) (Г); НЧЗ в просвете ранней эндосомы, видна тубулярная часть эндосомы (Д); НЧЗ в просвете сортирующей эндосомы (Е); НЧЗ в просвете эндосомы на начальных стадиях формирования МВТ (Ж); НЧЗ в просвете лизосом (З). Ультратонкие срезы, ПЭМ. 79 Таким образом, макрофаги активно поглощали обособленные НЧЗ, и их скопления локализовались в фагосомах и лизосомах, проникновения НЧЗ в ядро и цитозоль не наблюдалось. Исследование ультратонких срезов макрофагов выявило НЧЗ также в «опушенных» везикулах, что свидетельствует об их проникновении в эти клетки путем клатринзависимого эндоцитоза. В ходе инкубации НЧЗ накапливались в лизосомах (5 и 24 ч инкубации), деструктивные изменения макрофагов не развивались. Рис. 3.12 Наночастицы золота в клетке культуры MDCK (А), связь НЧЗ с кавеолами (Б). Последовательные этапы эндоцитоза НЧЗ: НЧЗ в МВТ (В) и в лизосомах (Г, Д); 24 ч инкубации Ультратонкие срезы без контрастирования, ПЭМ. Исследование взаимодействия НЧЗ с эпителиальными клетками культуры MDCK выявило локализацию НЧЗ в структурах, связанных с процессами эндоцитоза, в апикальной части клеток. На протяжении 24 ч 80 инкубации НЧЗ оставались изолированными от цитозоля и ядра, находясь в окруженных мембраной органоидах эндосомально-лизосомальной системы (Рис. 3.12 В-Д). В клетках MDCK НЧЗ были обнаружены также в кавеолах (Рис. 3.12 Б), что свидетельствует об их проникновении посредством кавеолин-зависимого эндоцитоза, а также в макропиносомах, куда они могли попасть посредством макропиноцитоза. Выявление на ультратонких срезах НЧЗ в поздних эндосомах и лизосомах (Рис. 3.12 В-Д), которые являются «конечной станцией» эндоцитоза, также свидетельствует о проникновении НЧЗ в клетки путем эндоцитоза. Инкубация клеток MDCK с НЧЗ не приводила к видимому повреждению клеток. 3.7. Взаимодействие наночастиц палладия с клетками культуры MDCK и с перитонеальными макрофагами Взаимодействие НЧП с эпителиальными клетками MDCK и перитонеальными макрофагами изучали in vitro после инкубации в течение разных промежутков времени. Использованные в работе НЧП имели малые размеры и сравнительно низкую электронную плотность, поэтому для их однозначной идентификации в ПЭМ были исследованы ультратонкие срезы как после контрастирования уранилацетатом и цитратом свинца, так и без контрастирования. Наночастицы палладия активно контактировали с плазматической мембраной клеток MDCK и оказывались в клетках уже через 10 мин инкубации (Рис. 3.13). Одиночные НЧП и их небольшие группы (до 10 шт) наблюдались в цитозоле, митохондриях, аппарате Гольджи, цистернах ЭПР, в мультивезикулярных тельцах (МВТ), в перинуклеарном пространстве и в ядре (чаще, чем в других структурах). Следует подчеркнуть, что НЧП не выявлялись в органеллах, связанных с процессом эндоцитоза (в «опушенных» пузырьках и везикулах, кавеолах и эндосомах). Полученные данные свидетельствуют, что НЧП проникают в клетки без участия 81 процессов эндоцитоза, непосредственно пересекая плазматическую мембрану. Рис. 3.13 Проникновение наночастиц палладия в клетки культуры MDCK (10 мин инкубации): скопление НЧП, контактирующее с плазматической мембраной (А) и НЧП в цитоплазме (Б, В). Ц – цитоплазма, Контуром обведены НЧП, стрелками показана плазматическая мембрана. Ультратонкие срезы без (А, Б) и после контрастирования (В), ПЭМ. 82 Рис. 3.14 Накопление наночастиц палладия (А) и их повреждающее действие на клетки MDCK (Б). 1 – начальные этапы деструкции клетки, 2 – погибшая клетка; 5 ч инкубации. Стрелкой показан замыкающий комплекс между эпителиальными клетками. Ультратонкие срезы без контрастирования (А) и с контрастированием (Б), ПЭМ. Рис. 3.15 Повреждающее действие наночастиц палладия на монослой клеток культуры MDCK (верхний ряд) в сравнении с необработанными НЧП клетками (нижний ряд): 30 мин (А, Г); 5 ч (Б, Д); и 24 ч (В, Е) инкубации. Прослеживается отчетливое просветление монослоя с изменением его тинкториальных свойств под действием НЧП (Б, В). Световая микроскопия, окрашивание гематоксилином и эозином. 83 Проникновение НЧП в клетки MDCK наблюдали в течение всего периода инкубации (с 10 мин до 24 ч), через 5 ч инкубации отмечалось накопление НЧП в ядрах клеток (Рис. 3.14 А) и в лизосомах. В препаратах, инкубируемых с НЧП, увеличивалось количество разрушающихся клеток, в которых происходило обводнение и деструкция органелл, цитозоля и ядра (Рис. 3.14 Б). Цитотоксическое действие НЧП на клетки MDCK хорошо прослеживалось и на монослое клеток, инкубируемых на покровных стеклах: разрушение клеток усиливалось с увеличением времени инкубации, изменялись их тинкториальные свойства (Рис. 3.15). Оценка жизнеспособности клеток методом МТТ-теста также выявила выраженное повреждающее действие НЧП на эпителиальные клетки культуры MDCK, очевидно, обусловленное повреждением клеточных мембран при проникновении НЧП в клетку и органоиды (Рис. 3.16). Таким образом, НЧП для проникновения в клетки MDCK не использовали механизмы эндоцитоза, протекающие в клетках данной культуры (клатрин- и кавеолин-зависимый эндоцитоз), а проникали посредством прямого пересечения плазматической мембраны, вызывая тем самым необратимые повреждения клеток. Иной характер носило взаимодействие НЧП с перитонеальными макрофагами первичной культуры, в эти клетки НЧП не проникали через плазматическую мембрану. Макрофаги активно поглощали скопления НЧП путем фагоцитоза. Внутри макрофагов НЧП обнаруживались в фагосомах (Рис. 3.17 А) и эндосомах (Рис. 3.17 Б,В) на протяжении всего периода инкубации, и в лизосомах, начиная с 30 мин инкубации (Рис. 3.17 Г). В отличие от эпителиальных клеток культуры MDCK, в макрофагах НЧП выявлялись в ранних эндосомах и МВТ, что свидетельствует о проникновении НЧП в клетку путем микроэндоцитоза. В макрофагах, инкубированных с НЧП в течение 5 и 24 ч, скопления НЧ обнаруживались только структурах, связанных с процессом эндоцитоза; в цитозоле и ядрах клеток НЧП не выявлены. 84 Рис. 3.16 Жизнеспособность клеток культуры MDCK через 72 ч инкубации с наночастицами палладия (МТТ-тест). Жизнеспособность необработанных клеток принята за 100%. Рис. 3.17 Наночастицы палладия в перитонеальных макрофагах: в фагосомах (А), эндосомах (Б, В) и в лизосоме (Г); 24 ч инкубации. Ультратонкие срезы без контрастирования, ПЭМ. 85 Таким образом, НЧП на протяжении 24 ч инкубации оставались внутри эндоцитозных структур макрофагов. Макрофаги, в отличие от клеток MDCK, сохраняли нормальное строение, признаки деструктивных изменений органоидов отсутствовали. 3.8. Взаимодействие наносфер и наностержней золота с клетками культур ВНК-21 и В16 Высокая токсичность НСЗ, стабилизированных ЦТАБ, показана во многих работах (Sylvester 2011; Niidome et al. 2006), поэтому мы использовали НСЗ с модифицированной поверхностью, «закрывающей» слой ЦТАБ. Для лучшего понимания роли поверхностного покрытия, заряда и формы в механизмах взаимодействия НЧ с клетками мы изучили взаимодействие как НЧЗ, так и НСЗ, покрытых ПЭИ или БСА, с фибробластоидными клетками ВНК-21 и клетками меланомы В16. Электронно-микроскопический анализ ультратонких срезов клеток BHK-21 и B16 через 30 мин инкубации с НЧЗ и НСЗ, покрытыми ПЭИ, выявил активное связывание разветвленных цепей НЧ или их рыхлых агломератов с поверхностью клеток (Рис. 3.18 А,В); несвязанные частицы в межклеточном пространстве отсутствовали. В зоне контакта ПЭИ-НСЗ с клетками были отчетливо видны филаменты длиной 1,5-2 нм (Рис. 3.18 Б), по-видимому, соответствующие нитевидным молекулам гликокаликса, расположенным на внешней поверхности клеточных мембран. Наночастицы золота, модифицированные ПЭИ, были также отделены от плазматической мембраны расстоянием 1,5-2 нм, однако структура филаментов была не такой четкой. 86 Рис. 3.18 Проникновение наностержней (ПЭИ-НСЗ) и наносфер золота (ПЭИ-НЧЗ) в клетки культуры ВНК-21. 30 мин инкубации. Контакт НСЗ с клеткой (А), виден фибриллярный материал между частицей и плазматической мембраной (Б). НЧЗ, контактирующие с плазматической мембраной и находящиеся внутри «опушенного» пузырька (клатринзависимый эндоцитоз) (В). Кавеолин-зависимый эндоцитоз: НСЗ (Г) и НЧЗ (Д) внутри кластеров кавеол. Ультратонкие срезы, ПЭМ. Поглощение НЧЗ и НСЗ, модифицированных ПЭИ, наблюдалось через 30 мин инкубации на ультратонких срезах как клеток BHK-21, так и клеток B16. ПЭИ-НСЗ обнаруживались в кавеолах (Рис. 3.18 Г) и в трубчатых липидных рафтах, что свидетельствует о проникновении посредством кавеолин-зависимого и клатрин-кавеолин-независимого эндоцитоза. Нужно подчеркнуть, что признаки клатрин-зависимого эндоцитоза не были выявлены. ПЭИ-НСЗ проникали в клетки BHK-21 более активно, чем в клетки В16 и выявлялись не только в кавеолах, но также в ранних и в поздних эндосомах. При этом число кавеол на срез клетки BHK-21, инкубируемых с ПЭИ-НСЗ, в 1,5 раза превышало показатели контрольных клеток, что позволяет предположить их образование под действием ПЭИ- 87 НСЗ. Сферические ПЭИ-НЧЗ обнаруживались как в одиночно расположенных кавеолах, так и в кластерах кавеол (Рис. 3.18 Д), в редких опушенных ямках и везикулах и в ранних эндосомах клеток культуры BHK21. В клетки В16 ПЭИ-НЧЗ также проникали, где были обнаружены в трубчатых липидных рафтах и в ранних эндосомах. Активное накопление НСЗ, покрытых ПЭИ, наблюдалось в клетках BHK-21 (Рис. 3.19 А), в клетках B16 частицы обнаруживались в меньшем количестве (Рис. 3.19 Б), начиная с 3 ч инкубации. Многочисленные ПЭИ-НСЗ и их агрегаты выявлялись в ранних эндосомах, МВТ и лизосомах (Рис. 3.19). Инкубация клеток BHK-21 со сферическими и стержневидными НЧ, покрытыми ПЭИ, в течение 24 ч приводила к накоплению частиц внутри МВТ и лизосом. Лизосомы и МВТ увеличивались в размере в процессе инкубации, в их полости ПЭИ-НЧ формировали плотные агрегаты. Отмечалось слияние некоторых МВТ, содержащих ПЭИ-НЧ, с плазматической мембраной клеток BHK-21. В клетках В16 ПЭИ-НЧЗ накапливались в МВТ и иногда в меланосомах. Удивительно, что НСЗ, покрытые БСА, не обнаруживались на ультратонких срезах через 30 мин инкубации с клетками BHK-21, хотя концентрация БСА-НСЗ в среде была аналогична концентрации ПЭИ-НСЗ. В препаратах клеток B16 небольшое количество БСА-НСЗ связывалось с детритом, который выявлялся в межклеточном пространстве. Связывание с гранулярными и филаментозными компонентами клеточного детрита было особенностью БСА-НСЗ, которые обнаруживались через 3 ч инкубации на поверхности клеток BHK-21 и B16 и в межклеточном пространстве (Рис. 3.20). Поглощение БСА-НСЗ обеими клеточными линиями было существенно меньше, чем ПЭИ-НСЗ через одинаковое время. В клетках BHK-21 в кластерах кавеол редко обнаруживались НСЗ, и еще реже выявлялись опушенные пузырьки, содержащие НСЗ. В некоторых клетках B16 отмечался фагоцитоз БСА-НСЗ, ассоциированных с компонентами клеточного детрита, кроме того внутри клеток также отмечались редкие ранние эндосомы с несколькими НЧ внутри. Инкубация БСА-НСЗ с клетками 88 BHK-21 и B16 в течение 24 ч привела к накоплению частиц в клетках обеих клеточных линий; однако, количество БСА-НСЗ в клетках было существенно меньше, чем ПЭИ-НСЗ в клетках этих же культур (Рис. 3.21). В клетках меланомы B16 БСА-НСЗ обнаруживались в лизосомах и меланосомах. Рис. 3.19 Наностержни золота (ПЭИ-НСЗ) в клетках культуры BHK-21 (А, В-Е) и меланомы В16 (Б) через 24 ч инкубации. Показаны последовательные стадии интернализации ПЭИ-НСЗ: контакт частиц с плазматической мембраной клетки (В); ПЭИ-НСЗ в ранней эндосоме (Г), мультивезикулярном тельце (Д) и в лизосоме (Е). Ультратонкие срезы, ПЭМ. Интересный морфологический феномен наблюдался в клетках BHK-21 через 3 ч инкубации с БСА-НСЗ: обособленные частицы были связаны с большими скоплениями складчатых мембран в цитоплазме (Рис. 3.22 А). Эти скопления наблюдались во многих клетках и отражали интернализацию больших площадей плазматической мембраны, ассоциированных с БСАНСЗ. Через 24 ч инкубации размеры скоплений мембранных складок и БСАНСЗ уменьшались, становясь более электронно-плотными и похожими на 89 лизосомальные структуры (Рис. 3.22 Б-Г). Морфология мембранных складок в цитоплазме была идентична таковой в клетках В16 после инкубации с НСЗ, модифицированными ПЭИ. Однако, в то время как ПЭИ-НСЗ напрямую контактировали с мембранами клеток В16, взаимодействие между БСА-НСЗ и мембранами клеток BHK-21 всегда было опосредовано компонентами клеточного детрита. Рис. 3.20 Наностержни золота (БСА-НСЗ), связанные с детритом (вставка - увеличенный фрагмент) вблизи поверхности клетки меланомы В16 в культуре через 3 ч инкубации. Ультратонкие срезы, ПЭМ. Таким образом, БСА-НСЗ, добавленные к клеткам монослоя культур BHK-21 и B16 долгое время оставались во взвешенном состоянии в культуральной среде и первоначально вступали в контакт с компонентами детрита, которые выступали посредником, обеспечивая связывание БСА-НСЗ с плазматической мембраной клеток. 90 Рис. 3.21 Различия в накоплении наностержней золота, покрытых полиэтиленимином (ПЭИ-НСЗ) (А) и бычьим сывороточным альбумином (БСА-НСЗ) (Б) в клетках культуры ВНК-21 через 24 инкубации. В рамках показаны увеличенные фрагменты лизосом, содержащих НСЗ. Ультратонкие срезы, ПЭМ. Исследование жизнеспособности клеток при инкубации с НСЗ установило отсутствие цитотоксического действия НСЗ, модифицированных ПЭИ, на исследуемые клеточные линии, на графике представлены данные МТТ-теста на культуре клеток ВНК-21 (Рис. 3.23 А). Электронномикроскопическое изучение клеток BHK-21 и B16 через 24 ч инкубации с НЧ показало отсутствие повреждений. Более того, клетки, обработанные ПЭИНСЗ, продолжали делиться, несмотря на присутствие частиц внутри (Рис. 3.23 Б). Таким образом, в совокупности наши результаты показывают, что НЧ, модифицированные ПЭИ и БСА, биосовместимы, нетоксичны и способны проникать в клетки, где накапливаются в лизосомах и фагосомах. 91 Рис. 3.22 Крупные скопления складчатых мембран в цитоплазме клеток BHK-21 через 3 ч инкубации с наностержнями золота (БСА-НСЗ); видны частицы, ассоциированные со складчатыми мембранами (А). Образование лизосом, содержащих БСА-НСЗ, в результате сжатия складчатых мембран (Б-Г). Ультратонкие срезы, ПЭМ. 92 Рис. 3.23 Жизнеспособность клеток ВНК-21, инкубация с наносферами (ПЭИ-НЧЗ) и наностержнями золота (БСА-, ПЭИ-НСЗ) в течение 48 ч (МТТтест) (А). Жизнеспособность клеток представлена в процентах от контрольных значений для каждой конкретной точки. Справа – делящаяся клетка, содержащая наностержни золота (ПЭИ-НСЗ) (Б). Стрелки указывают на хромосомы, во вставках – увеличенные фрагменты лизосом, содержащих ПЭИ-НСЗ. Ультратонкий срез, ПЭМ. 3.9. Исследование способности наностержней золота вызывать фототермолиз в клетках ВНК-21 и В16 при облучении лазером in vitro Известно, что наностержни золота имеют два пика поглощения, которые обусловлены поверхностно-плазмонными колебаниями свободных электронов (Dickerson et al. 2008; Huang et al. 2010). Для наночастиц металлов размером 10-100 нм поверхностный плазмонный резонанс наблюдается в видимой области спектра и в ближнем инфракрасном диапазоне. Его положение и интенсивность зависит от размера, формы частиц и локального диэлектрического окружения. Облучение НСЗ с определенным соотношением размеров в диапазоне волн ближней инфракрасной области, проникающих в биологические ткани, приводит к локальному разогреву, генерируемому НСЗ. Данное свойство НСЗ может использоваться для деструкции злокачественных клеток и тканей, например, солидных опухолей 93 (Huang et al. 2010; Park et al. 2010; Menon et al. 2013). Ввиду того, что эксперименты in vivo являются дорогостоящими и длительными по времени, предварительно новые препараты тестируют in vitro. В случае фототермической терапии с использованием наностержней золота необходим подбор режимов лазерного облучения и наночастиц с различными физикохимическими свойствами, а также эффективной дозы, достаточной для фототермолиза клеток. Весь этот спектр работ удобнее проводить на культурах клеток, что позволяет оптимизировать дальнейшие исследования на животных. Рис. 3.24 Клетки культуры ВНК-21 на покровных стеклах: контроль (А, Г); облученные лазером (Б, Д); после инкубации с наностержнями золота (ПЭИ-НСЗ760) и облучения лазером (В, Е). Облучение лазером с длиной волны 808 нм в течение 15 мин. Зона облучения выделена окружностью. Световая микроскопия, трипановым синим (Г-Е). окрашивание гематоксилин-эозином (А-В) и 94 Исследование способности НСЗ к индукции фототермолиза было начато с облучения лазером (λ=808 нм, 15 мин) культур клеток ВНК-21 и меланомы В16 на покровных стеклах в присутствии или в отсутствии НСЗ с продольным поверхностным плазмонным резонансом на длине волны 760 нм (НСЗ760). Параллельно проводилось сравнение эффективности НСЗ, покрытых ПЭИ или БСА, в одинаковых условиях облучения. Оказалось, что при данных параметрах облучения повреждение монослоя развивалось только в присутствии ПЭИ-НСЗ760 (Рис. 3.24). Сужение области облучения с 5 до 2 мм приводило к уменьшению площади зоны повреждения, клетки, содержащие ПЭИ-НСЗ760, буквально «сваривались» под лазером (Рис. 3.25). Фототермический эффект ПЭИ-НСЗ760 на клетках меланомы B16 в условиях in vitro был несколько слабее, чем на клетках культуры BHK-21. Облучение лазером с длиной волны 650 нм не вызывало повреждения ни интактных клеток, ни обработанных НСЗ. В присутствии БСА-НСЗ760 состояние монослоя клеток обеих культур после облучения не отличалось от контрольных групп, поэтому в дальнейших экспериментах данные частицы не использовались. Рис. 3.25 Зоны повреждения клеток культуры BHK-21 (А) и меланомы В16 (Б) после облучения лазером (808 нм, 15 мин) в присутствии наностержней золота (ПЭИ-НСЗ760). Световая микроскопия, окрашивание гематоксилин-эозином. 95 Электронно-микроскопический анализ ультратонких срезов клеток культур ВНК-21 и В16, инкубируемых с ПЭИ-НСЗ760 в течение 24 ч и облученных лазером (λ=808 нм, 15 мин), выявил изменения в морфологии клеток по сравнению с контролем. В клетках культуры ВНК-21 после облучения отмечалась вакуолизация цистерн эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи, дезорганизация и просветление цитозоля, появление крупных (до 1 мкм) лизосом с электронно-плотными содержимым внутри и конденсация хроматина в ядре, что свидетельствовало о развитии некроза. В межклеточном пространстве выявлялся клеточный детрит. Предварительная обработка этих клеток ПЭИ-НСЗ760 усилила повреждающее действие лазера, что выражалось в усилении деструкции клеток и в расширении зоны некроза. Помимо вакуолизации эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи, отмечалась вакуолизация эндосом и лизосом, внутри которых обнаруживались ПЭИ-НСЗ760. Сравнение двух культур показало, что повреждающий эффект лазерного облучения в присутствии ПЭИ-НСЗ760 выражен сильнее на клетках ВНК-21, чем на клетках меланомы В16. 3.10. Исследование способности наностержней золота вызывать фототермолиз меланомы мышей В16 при облучении лазером in vivo Меланома является самой опасной формой рака кожи, частота встречаемости которой растет с каждым годом. Исследование меланомы В16 на мышиной модели удобно: клетки меланомы В16 легко поддерживаются в культуре, а после прививки мышам формируют опухоль с известным онтогенезом (Avram et al. 2012; Smilowitz et al. 2013), что и определило выбор этой модели. На 10 день после прививки меланомы мышам, когда опухоль достигала 5 мм в диаметре (V=62,5 мм3), вводили ПЭИ-НСЗ с продольным поверхностным плазмонным резонансом на длине волны 760 (ПЭИ-НСЗ760) или 840 нм (ПЭИ-НСЗ840). Облучение лазером проводили на 2-е сутки после введения НСЗ. Облучение лазером (λ=650 нм, 5 мин) вызывало разогрев 96 опухоли до 44-450С в присутствии ПЭИ-НСЗ760 (Рис. 3.26) и только поверхностные повреждения опухолей. Наблюдался отек и дезинтеграция опухолевой ткани, развитие некроза (Рис. 3.27). Отмечалось повреждение кровеносных сосудов с выходом эритроцитов в опухолевую ткань. В меланомах контрольных животных (которым не вводили ПЭИ-НСЗ) после облучения были выявлены только небольшие зоны некроза, без других описанных выше патологических изменений. Рис. 3.26 Разогрев опухоли, термограммы мышей: до облучения (А) и в момент облучения лазером (λ= 650 нм, 5 мин) мышей контрольной группы (∆5,2oC) (Б) и мышей, в опухоль которых вводили наностержни золота (ПЭИ-НСЗ760) (∆8,5оС) (В). Наиболее успешным оказалось введение ПЭИ-НСЗ840 с максимумом спектра поглощения при 840 нм и использование лазера с длиной волны 808 нм. Уже через 1 мин тепловизор зарегистрировал разогрев опухоли на 11,5 oС относительно исходной температуры, в результате, температура в опухоли достигала 470С. При изучении гистологических срезов были выявлены обширные области некроза, которые затрагивали более глубокие зоны меланомы, чем при облучении лазером с длиной волны 650 нм. Глубина повреждения достигала 5 мм при диаметре опухоли 9 мм, что соответствовало повреждению опухоли на 68,5% (Рис. 3.28 В). На срезах были отчетливо видны отек и дезинтеграция опухолевой ткани, а также обширный некроз (Рис. 3.28 В,Е). Столь выраженные поражения не 97 обнаруживались в опухолях, которые облучали лазером в отсутствие ПЭИНСЗ840 (Рис. 3.28 Д). Детальное изучение гистологических срезов показало, что ПЭИ-НСЗ760 и ПЭИ-НСЗ840 активно распределяются по опухоли: НСЗ выявлялись не только в зоне введения, но в других участках ткани. Электронно-микроскопический анализ ультратонких срезов меланомы мыши В16 после введения ПЭИ-НСЗ760 и ПЭИ-НСЗ840 и облучения лазером (λ=808 нм, 5 мин) выявил нарушения, затрагивающие все клеточные структуры. Происходило расширение просвета цистерн эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи и накопление в нем гомогенного вещества средней электронной плотности (Рис. 3.29 Б); отложение электронноплотного материала на мембранах аппарата Гольджи; дезорганизация крист и просветление матрикса митохондрий; гомогенизация и увеличение электронной плотности периферического гетерохроматина, матрикса ядра и, в особенности, ядрышек. Клетки теряли контакты друг с другом, а в межклеточном пространстве отмечались фрагменты цитоплазматических мембран. Помимо клеток с описанными изменениями, на ультратонких срезах опухоли выявлялись обширные зоны клеточного детрита (Рис. 3.30). Таким образом, облучение лазером (λ=808 нм) в присутствии ПЭИ-НСЗ760 приводит к выраженным повреждениям монослоя клеток культур B16 и BHK-21 in vitro и меланомы мыши В16. Наибольшую способность к индукции фототермолиза меланомы мыши В16 показали ПЭИ-НСЗ840 с продольным поверхностным плазмонным резонансом на длине волны 840 нм при облучении лазером с длиной волны 808 нм в течение 5 мин. В отсутствие НСЗ опухоли не повреждаются при тех же параметрах облучения и времени воздействия, что подтверждает решающий фототермическое повреждении меланомы мыши В16. вклад ПЭИ-НСЗ в 98 Рис. 3.27 Гистологический срез меланомы В16 после введения наностержней золота (ПЭИ-НСЗ760, скопления черных точек) и облучения лазером (λ=650 нм, 5 мин): (1) – неповрежденная опухолевая ткань; (2) – зона деструкции опухолевой ткани. На вставке - увеличенные скопления ПЭИНСЗ. Световая микроскопия, окрашивание гематоксилин-эозином. 99 Рис. 3.28 Гистологические срезы меланомы В16 мыши: контрольный образец (А, Г); после облучения лазером (Б, Д); после введения наностержней золота (ПЭИ-НСЗ840) и облучения лазером (В, Е). Отчетливо видна глубина повреждения опухоли (В), дезинтеграция и обводнение ткани (Е). Облучение лазером с длиной волны 808 нм в течение 5 мин. Световая микроскопия, окрашивание гематоксилин-эозином. 100 Рис. 3.29 Меланомы В16 мыши после облучения лазером (λ=808 нм, 15 мин) в присутствии наностержней золота (ПЭИ-НСЗ840), которые выявлялись в виде скоплений в клетках опухоли (показаны стрелками) (А, Б). Ультратонкие срезы, ПЭМ. Рис. 3.30 Меланома В16 мыши после облучения лазером (λ=808 нм, 15 мин) в присутствии наностержней золота (ПЭИ-НСЗ840). Зона разрушенных клеток, ультратонкий срез, ПЭМ. 101 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Наночастицы представляют большой интерес для нанобиотехнологии и наномедицины, количество публикаций, сообщающих о перспективах создания новых диагностических и лекарственных препаратов на основе НЧ, постоянно растет (Arvizo et al. 2012; Beija et al. 2012; Doane, Burda 2012; Kumar et al. 2013; Mieszawska et al. 2013). Одновременно с этим отмечается отставание в изучении тонких механизмов взаимодействия НЧ с клетками, не разработано общепринятых методов оценки потенциального вреда для живых организмов и эффективности нанопрепаратов (Maurer-Jones et al. 2013; Roy et al. 2014; Teske, Detweiler et al. 2015). Любой препарат, применяемый в медицинских целях, должен быть стандартизован по определенным параметрам. Для НЧ такими параметрами, в первую очередь, являются их размерные, морфологические и дисперсные характеристики (Pérez-Juste et al. 2005; Jiang et al. 2009; Samim et al. 2011), поэтому разработка любого препарата НЧ начинается с исследования этих характеристик. Полученные в результате химического синтеза суспензии НЧ металлов зачастую находятся в агрессивной или несовместимой с живыми клетками среде, что определяет необходимость дополнительной их обработки, которая должна сохранить нано-свойства и обеспечить отсутствие негативного воздействия на организм. С этой целью проводится изучение поведения НЧ в условиях, приближенных к физиологическим, и разработка методов, сохраняющих нано-свойства препаратов и снижающих их токсичность (Gupta A.K., Gupta M. 2005). Наше исследование показало, что все препараты наносфер и наностержней золота, а также НЧ палладия стабильны и дисперсны в дистиллированной воде, но водные суспензии НЧ непригодны для внесения в среду, где культивируются клетки. Самым простым разбавителем является фосфатный буфер, входящий в состав всех культуральных сред. Однако, многие НЧ в фосфатном буфере агрегируют и агломерируют, причем образующиеся агрегаты часто устойчивы и не 102 поддаются ультразвуковому воздействию. Агломерация металлических НЧ в богатых солевых растворах, таких как фосфатный буфер, является общим свойством нанообъектов ввиду наличия активных атомов на их поверхности (Jiang et al. 2009; Harraz et al. 2012; Dominguez-Medina et al. 2013). Макрочастицы, образующиеся при агрегации НЧ, теряют наноразмерные свойства (Jiang et al. 2009), что определяет необходимость подбора условий, сохраняющих нано-свойства материала. Проведенные нами эксперименты позволили установить условия получения высокодисперсной суспензии НЧП, пригодной для исследований на культурах клеток, путем разведения НЧП в культуральной среде DMEM с 10% сыворотки и последующей обработки ультразвуком. Аналогичный подход к получению высокодисперсной суспензии применялся для НЧ платины (5-10 нм), которые разводили средой DMEM с 1% телячьей сыворотки (Pelka et al. 2009) и НЧ платины размером около 35 и 20 нм, которые разводили фосфатным буфером с добавлением 1% телячьей сыворотки (Elder et al. 2007). Считается, что стабилизирующим агентом может выступать альбумин, содержащийся в большом количестве в сыворотке, который и предотвращает агрегацию НЧ путем взаимодействия с их поверхностью (Orts-Gil et al. 2013; Wang et al. 2013). Были испробованы и другие методы подготовки НЧП (модификация с помощью БСА, ПЭГ или ПВП), которые оказались менее эффективными (Verma, Stellacci 2010; Bryaskova et al. 2011). Наше исследование показало, что наилучшие результаты дает разведение НЧП кондиционированной средой DMEM, собранной после 2-суточного культивирования клеток: полученная суспензия имела наибольшие стабильность и дисперсность. Этот эффект свидетельствует о влиянии небелковых факторов, возможно, продуктов жизнедеятельности клеток, на стабильность и дисперсность суспензии, поскольку содержание сывороточных белков в кондиционированной среде меньше, чем в свежеприготовленной среде. Мы впервые использовали кондиционированную среду, по сути - «отходы» культивирования клеток, для получения биосовместимых и стабильных при 103 физиологических pH металлических НЧ. Мы полагаем, что данный подход позволит решить проблему подготовки суспензий металлических НЧ для биологических исследований. Другой проблемой использования НЧ металлов в биологических исследованиях является высокая токсичность соединений, применяемых при их синтезе. Так, ЦТАБ, без которого невозможно получить частицы стержневидной формы, обеспечивает токсичность наностержней золота. ЦТАБ является катионным поверхностно-активным веществом, молекулы которого проникают в клетки и повреждают митохондрии, индуцируя апоптоз (Pérez-Juste et al. 2005). Цитотоксичность НСЗ может быть снижена с помощью модификации их поверхности (Menon et al. 2013). Например, для того, чтобы НСЗ были нетоксичны для мышей, используют полиэтиленгликоль (ПЭГ) (Lin et al. 2010; Park et al. 2010), но применение ПЭГ-покрытия снижает доставку НСЗ в клетки. В целом проблема получения нетоксичных НСЗ, которые стабильны в биологических жидкостях и способны активно проникать в клетки, не решена. Мы исследовали НСЗ, синтезированные в ИХБФМ, для покрытия которых впервые был использован линейный полиэтиленимин (ПЭИ), для анализа эффекта покрытия были приготовлены покрытые ПЭИ наносферы золота. Для сравнения использовали наносферы и наностержни золота, покрытые бычьим сывороточным альбумином (БСА). Изучение поведения модифицированных ПЭИ и БСА НЧЗ и НСЗ в разных жидкостях выявило увеличение их гидродинамических размеров через 40 мин и 24 ч инкубации. Полагают, что такое увеличение может быть обусловлено связыванием компонентов культуральной среды с поверхностью НЧ, либо агрегацией или агломерацией частиц в растворе (Dobrovolskaia et al. 2009; Schäffler et al. 2013). Методы динамического и электрофоретического светорассеяния выявляет изменение поверхностного заряда и гидродинамического диаметра НЧ в суспензии, а метод просвечивающей электронной микроскопии позволяет понять, в чем фактически заключается это изменение. Мы 104 использовали оба метода для характеризации препаратов НЧЗ, НСЗ и НЧП в различных жидкостях по всем возможным параметрам (структура, форма, размер, дисперсность, наличие «короны»). Оказалось, что увеличение гидродинамического размера в кондиционированной среде вызвано в культуральных средах формированием «короны» на поверхности НЧЗ и НСЗ, модифицированных ПЭИ и БСА, а растворе сыворотки и фосфатном буфере агломерацией или агрегацией частиц. По литературным данным формирование белкового слоя на поверхности НЧ металлов, включая НЧЗ, способно их стабилизировать (Dominguez-Medina et al. 2013). Опубликованные электронно-микроскопические описания «короны» бедны. С физико-химической точки зрения «короной» называется любой выявляемый слой произвольной толщины вокруг НЧ (Casals et al. 2010; Treuel et al. 2014). Однако, вокруг НЧЗ и ЦТАБ-НСЗ в среде DMEM, и вокруг ПЭИ-НЧЗ в среде DMEM и в кондиционированной среде мы выявляли равномерный по толщине слой, не превышающий 7 нм и полностью покрывающий поверхность НЧ. Вокруг же ПЭИ- и БСА-НСЗ в среде DMEM и в кондиционированной среде обнаруживался неравномерный по толщине слой (от 10 до 40 нм), лишь частично связанный с поверхностью этих НЧ. Целесообразно различать эти два варианта покрытия, и мы предлагаем использовать термин «корона» для первого случая, и «облако» - для второго. Интересно, что вокруг НЧЗ и БСА-НЧЗ в кондиционированной среде формировалось «облако» вокруг «короны». В целом, обнаруженное нами связывание вещества, находящегося в среде с сывороткой, с поверхностью частиц, соответствует существующему представлению, что при попадании НЧ в биологическое окружение их поверхность покрывается белками и другими биомолекулами (Stebounova et al. 2011; Cohen et al. 2012; Mahon et al. 2012; Mirshafiee et al. 2013). Несомненно, формирование покрытия на поверхности НЧ является молекулярным событием, которое может оказывать влияние на биологические реакции при нанотоксикологических и других исследованиях НЧ на клетках (Maiorano et al. 2010). Очевидно, избежать 105 этого невозможно, так как НЧ в среде с клетками будут взаимодействовать с компонентами среды, однако, это явление необходимо учитывать при планировании экспериментов и анализе полученных данных. Мы использовали одни и те же среды для культур клеток, что обеспечило одинаковое окружение НЧ палладия и золота и позволило стандартизовать условия экспериментов. Многочисленные исследования показывают, что многие НЧ активно поглощаются нормальными и опухолевыми клетками, однако, механизмы этого взаимодействия в настоящий момент изучены не в полной мере. В рамках данной работы впервые детально исследовано взаимодействие НЧП, НЧЗ и НСЗ с эукариотическими клетками in vitro и in vivo. В качестве экспериментальных моделей были выбраны перитонеальные макрофаги мыши и клеточные культуры MDCK, ВНК-21 и меланомы В16. Первичная культура перитонеальных макрофагов широко используется в разнообразных исследованиях в силу доступности этих клеток и их способности к культивированию, отмечено применение этой экспериментальной модели в исследованиях НЧ серебра (Shavandi et al. 2011; Xu et al. 2013) и оксида железа (Moore et al. 1997). Главной функцией макрофагов в организме является захват и переваривание в фагосомах крупных частиц, включая бактерии и обломки клеток. Эта функция в полной мере реализовалась перитонеальными макрофагами мышей в отношении скоплений НЧЗ в культуре и в условиях организма, для НЧП - в культуре. Макрофаги продемонстрировали все известные механизмы микро- и макроэндоцитоза. Результаты нашего исследования показали, что макрофаги способны не только к фагоцитозу и макропиноцитозу НЧ (Krpetić et al. 2010; França et al. 2011), но и к микроэндоцитозу. Следует отметить, что не наблюдалось изменений структуры фагосом с НЧ, характерных для процесса деградации поглощенного материала (превращение в фаголизосомы), по-видимому, металлические НЧ не запускали соответствующие механизмы в клетках. При исследовании на 106 животных было обнаружено, что через 5 и 24 ч макрофаги, нагруженные НЧЗ, исчезают из перитонеальной полости, очевидно, путем лимфатического дренажа. Важным установленная результатом идентичность проведенного механизмов исследования проникновения явилась НЧЗ в перитонеальные макрофаги в условиях культуры и организма. Исследование взаимодействия НЧП с клетками эпителиальной культуры MDCK обнаружило НЧП в цитозоле, аппарате Гольджи, митохондриях и в других органеллах, а также в ядре, что свидетельствовало об их способности пересекать и плазматическую и цитоплазматические мембраны, включая мембраны ядерной оболочки. Полагают, что способность НЧ металлов пересекать мембраны и накапливаться в цитозоле и в ядре, связана с их малыми размерами (до 5-10 нм) (Oberdörster et al. 2010; Coulter et al. 2012; Inkielewicz-Stepniak et al. 2014), тогда как НЧ металлов большего размера обычно захватываются клетками с помощью эндоцитоза (Canton, Battaglia 2012). НЧП размером около 10 нм активно поглощались клетками первичной культуры бронхиального эпителия PBEC посредством эндоцитоза, не попадая в ядра (Wilkinson et al. 2011). Мы впервые выявили непосредственное пересечение НЧП (диаметром около 6 нм) мембран клеток MDCK, которое вызывало повреждение органоидов. Следует отметить, что небольшое количество НЧП наблюдалось и в специфичных для эндоцитоза органеллах – лизосомах, в которые НЧП, по-видимому, попадали путем аутофагоцитоза участков цитоплазмы и органелл, содержащих НЧП. Аутофагоцитоз является естественным процессом для эукариотических клеток и обеспечивает их очищение от поврежденных органелл (Xie, Klionsky 2007). Аутофагоцитоз активируется при негативных воздействиях на клетку, и НЧП могли вызвать этот процесс. Индукция аутофагоцитоза отмечена в клетках легочного эпителия А549 при воздействии НЧ диоксида кремния (Nowak et al. 2014), в клетках HeLa – нанокристаллов оксида ванадия (Zhou et al. 2013); в клетках Neuro 2a, PC12 и HeLa – наностержней гидроксида европия (Wei et al. 2014). 107 Наночастицы палладия являются уникальным классом гетерогенных катализаторов, которые широко используются в промышленных установках. Однако, применение НЧП в катализаторах, обеспечивающих дожигание выхлопных газов в автомобилях (Nishihata et al. 2002; Colombo et al. 2008; Goncalves et al. 2008), приводит к нарастанию содержания палладия в окружающей среде. Повышенный уровень металлов платиновой группы выявлен в воздухе (Gomez et al. 2002), в дорожной пыли (Gomez et al. 2001) и в придорожных почвах (Whiteley, Murray 2003; Leopold et al. 2008). Хорошо известно, что вдыхание загрязненного воздуха, содержащего микро- и наноформы металлов платиновой группы, оказывает вредное воздействие на здоровье людей и приводит к сердечно-сосудистым и респираторным заболеваниям, особенно подвержены риску больные астмой и другими хроническими заболеваниями легких (Kampa, Castanas 2008). В организм человека металлы платиновой группы могут попадать через обонятельный эпителий, кожу, желудочно-кишечный тракт, глаза (Colombo et al. 2008; Geiser, Kreyling 2010; Супотницкий 2013). Наибольший потенциальный риск среди металлов платиновой группы представляет палладий (Jarvis et al. 2001). Опубликованы данные о накоплении НЧП в живых организмах (Moldovan et al. 2001; Sures et al. 2001), об индукции апоптоза в клетках первичной культуры бронхиального эпителия PBEC под действием НЧП (около 10 нм) (Wilkinson et al. 2011). Влияние НЧП на отдельные клетки и внутриклеточные структуры не исследовано. Мы исследовали воздействие НЧП, аналогичных содержащимся в выхлопных газах, на клетки разной природы. Полученные результаты свидетельствуют, что перитонеальные макрофаги в условиях in vitro устойчивы к повреждающему действию НЧП. Макрофаги не только не разрушаются при инкубации с НЧП, но и способны очищать среду, захватывая и блокируя НЧ внутри фагосом. Эти данные позволяют предположить, что в условиях организма макрофаги могут очищать легкие от НЧ металлов, попавших при вдыхании загрязненного воздуха. Напротив, 108 эпителиальные однослойного клетки культуры MDCK, сохраняющие эпителия, оказались чувствительны морфологию к повреждающему действию НЧП. Аналогичные клетки легких, очевидно, могут повреждаться НЧП, содержащимися в загрязненном воздухе. Таким образом, существует различный характер взаимодействия НЧП с эпителиальными клетками и макрофагами, по-видимому, особенностями клеток, что обусловленный необходимо морфофункциональными учитывать при проведении аэрозольных экспериментов и при анализе их результатов. Наностержни золота можно синтезировать только с применением ЦТАБ, что делает их токсичными для клеток. Предприняты попытки модифицировать НСЗ с помощью БСА (Choi et al. 2012), ПЭГ (Lin et al. 2010; Park et al. 2010) или разветвленным ПЭИ (Patnaik, Gupta 2013). Мы сравнили взаимодействие наностержней золота, покрытых ПЭИ и БСА, и наносфер золота, модифицированных ПЭИ, с одними и теми же культурами клеток ВНК-21 и меланомы В16 in vitro. Электронно-микроскопический анализ ультратонких срезов показал, что модифицированные ПЭИ наносферы и наностержни золота тесно контактируют со слоем гликокаликса на внешней стороне плазматической мембраны клеток, в отличие от БСА-НСЗ и изученными ранее в нашей лаборатории БСА-НЧЗ. Скорость связывания НЧЗ и НСЗ, модифицированных ПЭИ, с плазматической мембраной клеток ВНК-21 и В16 значительно превосходила таковую для БСА-НСЗ. Так, через 30 мин инкубации все обнаруживаемые на срезах ПЭИ-НЧЗ и ПЭИ-НСЗ контактировали с клетками, тогда как БСА-НСЗ впервые отмечались между клетками только через 3 ч инкубации. Аналогично, в нашей лаборатории было получено, что БСА-НЧЗ не обнаруживаются на ультратонких срезах через 30 мин и 3 ч инкубации с клетками HeLa, хотя через тот же промежуток времени цитратные НЧЗ в большом количестве определяются уже в лизосомах. Совокупность данных свидетельствует о длительной флотации НСЗ и НЧЗ, модифицированных БСА, подтверждая тот факт, что положительно заряженные НЧ достигают клеток быстрее, чем отрицательно 109 заряженные (Hühn et al. 2013). В культуральной среде DMEM, содержащей сыворотку, БСА-НСЗ и ПЭИ-НСЗ приобретают отрицательный заряд; однако, ПЭИ-НСЗ быстрее и эффективнее вступают в контакт с поверхностью клеток, активно проникая в клетки, в отличие от БСА-НСЗ. Это свидетельствует о влиянии поверхностного заряда НЧ, определяемого модифицирующим веществом, на взаимодействие НСЗ с клетками. Также мы можем заключить, что формирование «короны» и, соответственно, изменение поверхностного заряда при инкубации в культуральной среде не играют принципиальной роли в установлении контакта НЧ с плазматической мембраной клеток. Именно поэтому, несмотря на то, что положительно заряженные ПЭИ-НСЗ приобретали отрицательный заряд в культуральной среде DMEM и в кондиционированной среде, они активно проникали в клетки. На основании данных по активности проникновения и накопления ПЭИ-НСЗ и БСА-НСЗ можно заключить, что электрический заряд, обусловленный модификацией частиц, может быть основным фактором, определяющим взаимодействие НЧ с поверхностью клеток и интенсивность их интернализации. Это вывод поддерживает предположение Hühn с соавторами, что различия во взаимодействиях НЧ с клетками объясняются поверхностным зарядом НЧ, определяемым модификацией частиц, а не формированием «короны» (Hühn et al. 2013). Способ проникновения НЧЗ и НСЗ определялся типом клеток, что свидетельствует, скорее всего, о пассивной роли НЧ в их интернализации клетками. Изучение взаимодействия НСЗ с клетками выявило их способность проникать в клетки с помощью эндоцитоза, опосредованного циркулярными дорзальными складками, тогда как сферические частицы такой способностью не обладали. Активация данного вида макроэндоцитоза, очевидно, осуществлялась наностержнями золота, поскольку явление наблюдалось как для БСА-НСЗ, так и для ПЭИ-НСЗ. Эндоцитоз посредством циркулярных дорзальных складок обеспечивает одновременное поглощение больших площадей плазматической мембраны (Orth et al. 2006; Hoon et al. 2012). 110 Механизм этого микроскопические типа эндоцитоза описания не единичны. установлен, Мы а наблюдали электронноэндоцитоз мембранных складок в разных типах клеток, которые вступали в контакт с различными типами НСЗ. Характер связывания НСЗ различной модификации с мембранами клеток позволяет предположить, что одновременное и непосредственное взаимодействие многочисленных НСЗ с клеточной поверхностью индуцирует образование мембранных складок. Обнаруженное явление нельзя отнести к особенностям определенных клеток, потому что оно имело место как в клетках ВНК-21, так и в клетках меланомы В16. Мы предполагаем, что масса НЧ, которые одновременно контактируют с поверхностью клетки, может быть определяющим фактором формирования мембранных складок. Действительно, через 30 мин инкубации, поверхность клеток В16 была декорирована многочисленными ПЭИ-НСЗ. Связывание БСА-НСЗ с клеточным детритом могло обеспечить необходимую массу для индукции мембранных складок в клетках BHK-21. Проведенное исследование показало, что синтезированные ПЭИ-НСЗ нетоксичны для клеток, стабильны в культуральных средах и способны проникать в клетки с помощью эндоцитоза, накапливаясь в лизосомах. Благодаря своим свойствам, НСЗ считаются перспективными контрастирующими агентами для фотодетекции (Liopo et al. 2012; Menon et al. 2013), и для фототермической терапии онкологических заболеваний (Terentyuk et al. 2009; Menon et al. 2013). Лазерное излучение, которое используется в фототермической терапии, не оказывает ионизирующего воздействия на организм и не обладает кумулятивными свойствами, что определяет перспективность его использования в клинической онкологии. Наностержни золота обеспечивают конвертацию лазерного излучения в локальную область нагрева в течение короткого периода времени. Соответственно, воздействие лазером на клетки, содержащие НСЗ, вызывает гипертермию на клеточном уровне, в результате которой происходит разрыв водородных и ионных связей в белковых структурах, развиваются 111 необратимые структурные и метаболические нарушения. Показано, что при внутривенном введении НСЗ преимущественно накапливаются в опухолевых тканях (Lin et al. 2010; Park et al. 2010), инъекция же препарата НСЗ непосредственно в опухоль обеспечивает максимальную концентрацию НЧ в опухоли (Dickerson et al. 2008). Целевыми опухолями для фототермической терапии являются подкожные мягкие опухоли, в первую очередь - меланома (Park et al. 2010), поэтому в качестве экспериментальной модели мы выбрали меланому мышей В16. Известно, что инфракрасный свет может проникать в более глубокие ткани (Terentyuk et al. 2009; Menon et al. 2013), поэтому в эксперименте мы использовали лазеры с длинами волн 650 и 808 нм. Способность НСЗ генерировать тепло непосредственно связана с продольным поверхностным плазмонным резонансом стержневидных наночастиц, который возникает вследствие коллективных колебаний поверхностных электронов, возбужденных лазером с определенной длиной волны (Huang et al. 2010). Длина волны, при которой возникает плазмонный резонанс, определяется соотношением размеров наностержня, что позволяет настраивать этот параметр. Мы сравнили эффективность ПЭИ-НСЗ с продольным поверхностным плазмонным резонансом при длине волны 760 (НСЗ760) и 840 нм (НСЗ840) в индукции фототермолиза клеток при облучении лазером. В экспериментах in vitro на одних и тех же культурах клеток было показано, что способность ПЭИ-НСЗ760 вызывать фототермолиз клеток при облучении лазером значительно превосходит способность БСА-НСЗ760. Это полностью согласуется с результатами, полученными при исследовании поглощения НСЗ клетками. Более активное связывание с поверхностью клеток, проникновение и накопление ПЭИ-НСЗ760 в клетках, по сравнению с БСА-НСЗ760, обеспечило более сильно разогревание клеток при воздействии лазера. Способность к индукции фототермолиза при облучении лазером связывают с НСЗ, находящимися не только внутри клеток, но и с локализованными снаружи плазматической мембраны (Tong et al. 2007). 112 Обнаруженные нами различия в степени повреждения опухолей при облучении лазерами с длинами волн 650 и 808 нм, очевидно, связаны с разной способностью излучения проникать в биологические ткани. Известно, что рассеивание снижается с увеличением длины волны, делая более длинные волны идеальным средством доставки энергии в глубокие кожные структуры (Terentyuk et al. 2009; Menon et al. 2013). Сопоставление НСЗ, отличающихся длиной волны продольного поверхностного резонанса, выявило более высокую способность ПЭИ-НСЗ840 вызывать фототермолиз меланомы В16, привитой мышам, при облучении лазером с длиной волны 808 нм, по сравнению с ПЭИ-НСЗ760. Немаловажным фактором, влияющим на эффективность фототермолиза, является наличие зрелых меланосом, содержащих меланин, в клетках меланомы В16, привитой мышам. Меланин является эндогенным хромофором, чувствительным к длинам волн до 900 нм (Eichhorn et al. 2009). Изучение гистологических срезов опухолей, в которые не вводили НСЗ, после облучения лазером не выявило существенных тканевых повреждений, что подтверждает основной вклад ПЭИ-НСЗ в индукцию фототермолиза. Сопоставление зон поражения клеток, обработанных ПЭИ-НСЗ, после облучения in vitro и in vivo показывает, что наличие зрелых меланосом в клетках опухоли В16, привитой мышам, может усиливать повреждающее действие лазера, поскольку в культуре, где клетки практически не содержат зрелых меланосом, при тех же условиях облучения интенсивность повреждения была несопоставимо меньшей. Исследования, проведенные нами in vitro и in vivo, выявили способность ПЭИ-НСЗ вызывать фототермолиз клеток при облучении лазером и показали возможность их использования в фототермической терапии поверхностных злокачественных новообразований. Нами были подобраны оптимальные условия лазерного облучения, при которых происходит выраженное повреждение меланомы В16 у мышей. Наиболее 113 эффективным оказалось сочетание лазера с длиной волны 808 нм и ПЭИНСЗ840 с продольным поверхностным плазмонным резонансом при 840 нм. Выполненное в рамках данной работы комплексное исследование взаимодействия НЧ золота и палладия с эукариотическими клетками выявило несколько значимых аспектов. Интернализация НЧП, НЧЗ и НСЗ является пассивной и определяется типом клеток, за исключением эндоцитоза ПЭИНСЗ и БСА-НСЗ с помощью циркулярных дорзальных складок. Скорость связывания с плазматической мембраной клеток и интенсивность накопления данных НЧЗ и НСЗ внутри клеток определяется исходным поверхностным зарядом частиц. «Конечной станцией» эндоцитоза являются лизосомы, надежно изолирующие попавшие в них НЧ и не позволяющие им достигнуть цитозоля или ядра. Показана избирательность повреждающего действия НЧП на клетки разной природы (эпителиальные и макрофаги). Показана нетоксичность и биосовместимость ПЭИ-НСЗ, а также их способность вызывать фототермолиз клеток меланомы В16 in vitro и in vivo. В совокупности, полученные результаты не только дополняют существующее представление о тонких механизмах взаимодействия НЧ с эукариотическими клетками, но могут иметь и общественно-полезный прикладной характер в плане разработок препаратов направленного действия на основе НЧ металлов и противоопухолевой терапии с использованием наностержней золота. 114 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Детальное изучение взаимодействия наночастиц с клетками на наноуровне необходимо для понимания фундаментальных механизмов их влияния на живые организмы, а также для разработки систем адресной доставки на основе наночастиц к клеткам и органам-мишеням. Несмотря на огромный интерес к нанотехнологиям и наномедицине, знания о механизмах этого взаимодействия и возможном негативном влиянии наночастиц на живые организмы весьма ограничены. Нами было проведено подробное изучение взаимодействия наносфер, наностержней золота и наночастиц палладия с эукариотическими клетками, включающее исследование поведения частиц в культуральных средах, механизмов проникновения наночастиц в клетки, их внутриклеточной «судьбы» и оказываемого на клетки влияния. Установлено, что наночастицы в культуральных средах меняют поверхностный заряд и дисперсность, а на их поверхности формируется молекулярный слой («корона»). Эти данные показывают, что экспериментальные условия, даже на стадии подготовки препаратов, могут играть важную роль во взаимодействии наночастиц с клетками. Сравнение путей проникновения и накопления in vitro и in vivo показало, что наносферы золота одинаково взаимодействуют с перитонеальными макрофагами в культуре и в условиях организма. Основными путями их интернализации являются: (1) фагоцитоз и макропиноцитоз, (2) клатрин-зависимый и (3) кавеолин-зависимый эндоцитоз, а также (4) клатрин-кавеолин-независимый эндоцитоз. Инкубация макрофагов с наносферами золота не оказывает повреждающего действия на клеточные структуры, а частицы остаются заключенными в фагосомы или лизосомы, не выходя в цитозоль и не попадая в ядра клеток. Данный результат не только дополняет фундаментальные знания о путях проникновения НЧ золота в клетки, но и свидетельствует о возможности равноценного использования двух экспериментальных моделей: мышей и 115 первичной культуры перитонеальных макрофагов для изучения эффектов нанопрепаратов на основе наночастиц золота. Наносферы золота и наночастицы палладия по-разному взаимодействуют с эпителиальными клетками культуры MDCK. Первые проникали в клетки MDCK по механизму кавеолин-зависимого эндоцитоза и макропиноцитоза, и не вызывали видимых изменений морфологии клеток. Напротив, наночастицы палладия оказывали выраженный повреждающий эффект на клетки культуры MDCK, который, несомненно, связан с нарушением целостности клеточных мембран при их пересечении данными частицами. Наночастицы палладия накапливались в ядрах клеток и во всех цитоплазматических органеллах, включая аппарат Гольджи, митохондрии и эндоплазматический ретикулум. Уже через 3 ч инкубации с наночастицами палладия мы отмечали необратимое повреждение клеток. Если принять во внимание данные о наличии наночастиц палладия в выхлопных газах автомобилей и в выбросах заводских труб, возникает правомерное опасение по поводу безопасности присутствия данных частиц во вдыхаемом воздухе для людей и животных. Однако, изучение взаимодействия наночастиц палладия с первичной культурой перитонеальных макрофагов показало их устойчивость к агрессивному натиску наночастиц палладия: захватывая скопления наночастиц палладия с помощью фагоцитоза, клетки надежно блокировали частицы внутри мембранных компартментов – в фагосомах. В отличие от клеток MDCK, макрофаги сохраняли нормальное строение, признаки деструктивных изменений отсутствовали. Соответственно, можно предположить, что в условиях организма макрофаги будут вносить вклад в очищение легких от наночастиц металлов, попавших при вдыхании загрязненного воздуха. Исследование наностержней золота, модифицированных линейным полиэтиленимином (ПЭИ-НСЗ), установило активное проникновение и накопление этих наночастиц в клетках культуры ВНК-21 (кавеолинзависимый эндоцитоз и клатрин-кавеолин-независимый эндоцитоз) и 116 меланомы В16 циркулярных (рафт-зависимый дорзальных зндоцитоз, складок). эндоцитоз Сравнение посредством взаимодействия этих наночастиц с наностержнями золота, покрытыми бычьим сывороточным альбумином (БСА-НСЗ) и наносферами золота, модифицированными полиэтиленимином (ПЭИ-НЧЗ), показало, что способ проникновения наностержней зависел от типа клеток. Активное накопление ПЭИ-НСЗ в клетках меланомы В16 определило целесообразность изучения способности наностержней золота вызывать фототермолиз опухолевых клеток при облучении их лазером. Эксперименты показали, что облучение лазером с длиной волны 808 нм в присутствии ПЭИ-НСЗ приводит к выраженным повреждениям монослоя клеток культуры B16 in vitro и меланомы мыши В16. Таким образом, активное накопление ПЭИ-НСЗ в опухолевых клетках обеспечило локальный разогрев при облучении лазером, который привел к значительной деструкции меланомы В16, привитой мышам. Данный результат имеет практическую значимость, открывая новые возможности использования наностержней золота в ветеринарной и медицинской практике. Проведенное исследование взаимодействия наносфер, наностержней золота и наночастиц палладия с эукариотическими клеткам позволило дополнить существующие представления о процессах, происходящих на границе «нано» и «био», о механизмах проникновения наночастиц, их накоплении, распредлении и в целом «судьбе» в клетках, объяснило некоторые аспекты развития повреждений в клетках под действием наночастиц и создало основу для усовершенствования использования наностержней золота в качестве терапевтических агентов. 117 ВЫВОДЫ 1. Внесение наносфер (~14 нм) и наностержней золота (~54х20 нм), а также наночастиц палладия сопровождается (~6 изменением нм) их в культуральную поверхностного среду заряда, гидродинамического размера и дисперсного состояния по сравнению с суспензиями в дистиллированной воде. Поверхностный заряд, определяемый модификацией наночастиц, а не «корона», играет решающую роль в их связывании с плазматической мембраной клеток. 2. В эпителиальные клетки культуры MDCK наночастицы палладия проникают, прямо пересекая плазматическую мембрану, и оказывают выраженное повреждающее действие, накапливаются в ядрах клеток и цитоплазматических органеллах, тогда как наносферы золота интернализуются с помощью кавеолин-зависимого эндоцитоза и макропиноцитоза и не повреждают клетки. В перитонеальные макрофаги и наночастицы палладия, и наносферы золота попадают путем фагоцитоза и микроэндоцитоза (клатрин-, кавеолин- и рафтзависимого эндоцитоза), не вызывая повреждения клеточных структур. 3. Наносферы и наностержни золота, модифицированные линейным полиэтиленимином, проникают в клетки культуры ВНК-21 путем кавеолин- и рафт-зависимого эндоцитоза; в клетки меланомы В16 - с помощью рафт-зависимого. Наностержни золота, модифицированные линейным полиэтиленимином или бычьим сывороточным альбумином, индуцируют в данных клетках эндоцитоз циркулярных дорзальных складок. 4. Наностержни золота, модифицированные линейным полиэтиленимином, вызывают фототермолиз клеток меланомы В16 в культуре и на животных при облучении лазером. 118 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Арсентьева И.П., Байтукалов Т.А., Глущенко Н.Н. Дзидзигури Э.Л., Сидорова Е.Н. Аттестация и применение в медицине наночастиц меди и магния // Материаловедение. – 2007. -№ 4. - С. 54-56. 2. Гуськова Т.А. Токсикология лекарственных средств// М.: Издательский дом «Русский врач». – 2003. - 154 с. 3. Дыкман Л.А., Хлебцов Н.Г. Золотые наночастицы в биологии и медицине: достижения последних лет и перспективы // Acta Naturae. – 2011. - №2. - С. 36-58. 4. Каркищенко Н.Н. Нанобезопасность: новые подходы к оценке рисков и токсичности наноматериалов // Биомедицина. – 2009. - № 1. - С. 5-28. 5. Красовский П. А., Карпов О. В., Балаханов Д. М., Лесников Е. В. // Измерительная техника. - 2009. - № 5. - С. 8-15. 6. Омельянчук Л.В., Гурова О.А., Окотруб А.В. Генотоксическое действие неорганических наночастиц на клетку // Российские нанотехнологии. – 2014. – Т. 9. - № 3-4. – С. 90-97. 7. Симакова И.Л., Просвирин И.П., Кривенцов В.В., Пармон В.Н.. Влияние условий синтеза на каталитические и физико-химические свойства Pd/C в реакции восстановительного дебензилирования // Ж. Сибирского федерального университета: Химия. – 2012. - Т. 3. - № 5. С. 239-250. 8. Супотницкий М.В. Нанообъекты как новая биологическая угроза // Нанотехнологии и охрана здоровья. – 2013. - № 4. - С. 22-41. 9. Ткачук В.А. Нанотехнологии и медицина // Российские нанотехнологии. – 2009. - Т. 4. - № 7–8. - С. 1-13. 10. Троицкий С.Ю., Чувилин А.Л., Кочубей Д.И., Новгородов Б.Н., Коломийчук В.Н., Лихолобов В.А. Структура полиядерных гидроксокомплексов палладия (II), образующихся при щелочном 119 гидролизе его хлоридных комплексов// Известия РАН Сер. Хим. – 1995. - Т. 44. - № 10. - С. 1901-1905. 11. Фатхутдинова Л.М., Халиуллин Т.О., Залялов Р.Р. Токсичность искусственных наночастиц // Казанский Мед. Ж. – 2009. - №4. - С. 578584. 12. Aderem A., Underhill D.M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages // Annu Rev. Immunol. – 1999. – Vol. 17. – P. 593-623. 13. Alkilany A.M., Nagaria P.K., Hexel C.R., Shaw T.J., Murphy C.J., Wyatt M.D. Cellular uptake and cytotoxicity of gold nanorods: molecular origin of cytotoxicity and surface effects // Small. – 2009. – Vol. 5. - N 6. - P. 701708. 14. Alkilany A.M., Thompson L.B., Boulos S.P., Sisco P.N., Murphy C.J. Gold nanorods: their potential for photothermal therapeutics and drug delivery, tempered by the complexity of their biological interactions // Adv. Drug. Deliv. Rev. - 2011. – Vol. 64. – N 2. – P. 190-199. 15. Allaker RP. The use of nanoparticles to control oral biofilm formation// J. Dent. Res. – 2010. – Vol. 89. – N 11. – Р.1175-1186. 16. Arnida, Janаt-Amsbury M. M, Ray A., Peterson C.M., Ghandehari H. Geometry and surface characteristics of gold nanoparticles influence their biodistribution and uptake by macrophages // Eur. J. Pharm. Biopharm. – 2011. – Vol. 77. – N 3. – P. 417-423. 17. Arvizo R.R., Bhattacharyya S., Kudgus R.A., Giri K., Bhattacharya R., Mukherjee P. Intrinsic therapeutic applications of noble metal nanoparticles: past, present and future // Chem. Soc. Rev. – 2012. – Vol. 41. – N 7. – P. 2943-2970. 18. Ashkarran A.A., Ghavami M., Aghaverdi H., Stroeve P., Mahmoudi M. Bacterial effects and protein corona evaluations: crucial ignored factors in the prediction of bio-efficacy of various forms of silver nanoparticles // Chem. Res. Toxicol. – 2012. – Vol. 25. – N 6. – P. 1231-1242. 120 19. Avram M., Bălan C.M., Petrescu I., Schiopu V., Mărculescu C., Avram A. Gold nanoparticle uptake by tumour cells of B16 mouse melanoma // Plasmonics. – 2012. –Vol. 7. – N4. – P. 717-724. 20. Baixauli F., López-Otín C., Mittelbrunn M. Exosomes and autophagy: coordinated mechanisms for the maintenance of cellular fitness // Front. Immunol. – 2014. – Vol. 20. – N 5. – P. 403. 21. Barrán-Berdón A.L., Pozzi D., Caracciolo G., Capriotti A.L., Caruso G., Cavaliere C., Riccioli A., Palchetti S., Laganà A. Time evolution of nanoparticle-protein corona in human plasma: relevance for targeted drug delivery // Langmuir. – 2013. – Vol. 29. – N 21. – P. 6485-6494. 22. Beija M., Salvayre R., Lauth-de Viguerie N., Marty J.D. Colloidal systems for drug delivery: from design to therapy // Trends Biotechnol. – 2012. – Vol. 30. – N 9. – P. 485-496. 23. Bergen J.M., van Recum H.A., Goodman T.T., Massey A.P., Pun S.H. Gold Nanoparticles as a Versatile Platform for Optimizing Physicochemical Parameters for Targeted Drug Delivery // Macromol. Biosci. – 2006. – Vol. 6. – P. 506-516. 24. Berger, D., Traistaru G.A., Vasile B.S., Jitaru I., Matei C. Palladium nanoparticles synthesis with controlled morphology obtained by polyol method // Sci. Bull. B Chem. Mater. Sci. – 2010. – Vol. 72. – P. 113-120. 25. Bryaskova R., Pencheva D., Nikolov S., Kantardjiev T. Synthesis and comparative study on the antimicrobial activity of hybrid materials based on silver nanoparticles (AgNPs) stabilized by polyvinylpyrrolidone (PVP) // J. Chem. Biol. – 2011. – Vol. 4. – P. 185-191. 26. Buzea C., Pacheco II., Robbie K. Nanomaterials and nanoparticles: sources and toxicity // Biointerphases. – 2007. – Vol. 2. – N 4. – P. 17-71. 27. Canton I., Battaglia G. Endocytosis at the nanoscale // Chem Soc Rev. – 2012. – Vol. 41. – N 7. – P. 2718-2739. 121 28. Casals E., Pfaller T., Duschl A., Oostingh G.J., Puntes V. Time evolution of the nanoparticle protein corona // ACS Nano. – 2010. – Vol. 4. – N 7. – P. 3623-3632. 29. Cedervall T., Lynch I., Foy M., Berggård T., Donnelly S.C., Cagney G., Linse S., Dawson K.A. Detailed identification of plasma proteins adsorbed on copolymer nanoparticles // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. – 2007. – Vol. 46. – N 30. – P. 5754-5756. Б. 30. Cedervall T., Lynch I., Lindman S., Berggård T., Thulin E., Nilsson H., Dawson K.A., Linse S. Understanding the nanoparticle-protein corona using methods to quantify exchange rates and affinities of proteins for nanoparticles // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2007. – Vol. 104. – N 7. – P. 2050-2055. А. 31. Champion J.A, Mitragotri S. Role of target geometry in phagocytosis // PNAS. – 2006. – Vol. 103. – N 13. – P. 4930-4934. 32. Cheng-Yu J., Zhu B.-Sh., Wang X.-F., Lu Q.-H. Cytotoxicity of titanium dioxide nanoparticles in mouse fibroblast cells // Chem. Res. Toxicol. – 2008. – Vol. 21. – P. 1871–1877. 33. Chithrani B.D., Chan W.C. Elucidating the mechanism of cellular uptake and removal of protein-coated gold nanoparticles of different sizes and shapes // Nano Lett. – 2007. – Vol. 7. – N 6. – P. 1542-1550. 34. Chithrani B.D., Ghazani A.A., Chan W.C. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells // Nano Lett. – 2006. – Vol. 6. – N 4. – P. 662-668. 35. Chithrani D.B. Optimization of Bio-Nano Interface Using Gold Nanostructures as a Model Nanoparticle System // Insciences J. – 2011. – Vol. 1. – N 3. – P. 115-135. 36. Choi W.I., Sahu A., Kim Y.H., Tae G. Photothermal Cancer Therapy and Imaging Based on Gold Nanorods // Ann. Biomed. Eng. – 2012. – Vol. 40. – N 2. – P. 534-546. 122 37. Cleal K., He L., Watson P.D., Jones A.T. Endocytosis, intracellular traffic and fate of cell penetrating peptide based conjugates and nanoparticles // Curr. Pharm. Des. – 2013. – Vol. 19. – N 16. – P. 2878-2894. 38. Cohen J., DeLoid G., Pyrgiotakis G., Demokritou P. Interactions of engineered nanomaterials in physiological media and implications for in vitro dosimetry // Nanotoxicology. – 2012. – Vol. 7. – P. 417-431. 39. Colombo C., Monhemius A.J., Plant J.A. Platinum, palladium and rhodium release from vehicle exhaust catalysts and road dust exposed to simulated lung fluids // Ecotoxicol. Environ. Saf. – 2008. – Vol. 71. – N 3. – P. 722. 40. Conner S.D., Schmid S.L. Regulated portals of entry into the cell // Nature. – 2003. – Vol. 422. – N 37. – P. 44. 41. Connor E.E., Mwamuka J., Gole A., Murphy C.J., Wyatt M.D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity // Small. – 2005. – Vol. 1. – N 3. – P. 325-327. 42. Coulter J.A, Jain S., Butterworth K.T., Taggart L.E., Dickson G.R., McMahon S.J., Hyland W.B., Muir M.F., Trainor C., Hounsell A.R., O'Sullivan J.M., Schettino G., Currell F.J., Hirst D.G., Prise K.M. Cell typedependent uptake, localization, and cytotoxicity of 1.9 nm gold nanoparticles // Int. J. Nanomedicine. – 2012. – Vol. 7. – P. 2673-2685. 43. De Jong W.H., Borm P.J. Drug delivery and nanoparticle: applications and hazards // Int. J. Nanomedicine. – 2008. – Vol. 3. – N 2. – P. 133-149. 44. Dickerson E.B., Dreaden E.C., Huang X., El-Sayed I.H., Chu H., Pushpanketh S., McDonald J.F., El-Sayed M.A. Gold nanorod assisted nearinfrared plasmonic photothermal therapy (PPTT) of squamous cell carcinoma in mice // Cancer Lett. – 2008. – Vol. 269. – N 1. – P. 57-66. 45. Doane T.L., Burda C. The unique role of nanoparticles in nanomedicine: imaging, drug delivery and therapy // Chem. Soc. Rev. – 2012. – Vol. 41. – N 7. – P. 2885-2911. 46. Dobrovolskaia M.A., Patri A.K., Zheng J., Clogston J.D., Ayub N., Aggarwal P., Neun B.W., Hall J.B., McNeil S.E.. Interaction of colloidal 123 gold nanoparticles with human blood: effects on particle size and analysis of plasma protein binding profiles // Int. J. Nanomedicine. – 2009. – Vol. 5. – N 2. – P. 106-117. 47. Doherty G.J., McMahon H.T. Mechanisms of endocytosis // Annu. Rev. Biochem. – 2009. – Vol. 78. – P. 857-902. 48. Dominguez-Medina S., Blankenburg J., Olson J., Landes C.F., Link S. Adsorption of a Protein Monolayer via Hydrophobic Interactions Prevents Nanoparticle Aggregation under Harsh Environmental Conditions // ACS Sustain Chem. Eng. – 2013. – Vol. 1. – N 7. – P. 833-842. 49. Dutta D., Donaldson J.G. Search for inhibitors of endocytosis: Intended specificity and unintended consequences // Cell. Logist. – 2012. – Vol. 2. – N 4. – P. 203-208. 50. Eichhorn R., Wessler G., Scholz M., Leupold D., Stankovic G., Buder S., Stücker M., Hoffmann K. Early diagnosis of melanotic melanoma based on laser-induced melanin fluorescence // J. Biomed. Opt. – 2009. – Vol. 14. – N 3. – P. 34-33. 51. Elder А., Yang H, Gwiazda R., Teng X., Thurston S., He H., Oberdörster G. Testing Nanomaterials of Unknown Toxicity: An Example Based on Platinum Nanoparticles of Different Shapes // Adv. Mater. – 2007. – Vol. 19. – P. 3124–3129. 52.El-Sayed A., Harashima H. Endocytosis of gene delivery vectors: from clathrin-dependent to lipid raft-mediated endocytosis // Mol. Ther. – 2013. – Vol. 21. – N 6. – P. 1118-1130. 53. El-Sayed I.H., Huang X., El-Sayed M.A. Surface Plasmon Resonance Scattering and Absorption of anti-EGFR Antibody Conjugated Gold Nanoparticles in Cancer Diagnostics: Applications in Oral Cancer // Nano Lett. – 2005. – Vol. 5. – P. 829-834. 54. Fatisson J., Quevedo I.R., Wilkinson K.J., Tufenkji N. Physicochemical characterization of engineered nanoparticles under physiological conditions: 124 effect of culture media components and particle surface coating. // Coll Surf. B Biointerfaces. – 2012. – Vol. 91. – P. 198-204. 55. Fleischer C.C., Payne C.K. Nanoparticle-Cell Interactions: Molecular Structure of the Protein Corona and Cellular Outcomes // Acc. Chem. Res. – 2014. 56. França A., Aggarwal P., Barsov E.V., Kozlov S.V., Dobrovolskaia M.A., González-Fernández Á. Macrophage scavenger receptor A mediates the uptake of gold colloids by macrophages in vitro // Nanomedicine (Lond). 2011. - Vol. 6. – N 7. - P. 1175-1188. 57. Geiser M., Kreyling W.G. Deposition and biokinetics of inhaled nanoparticles // Part Fibre Toxicol. – 2010. – Vol. 7. – P. 1-17. 58. Gómez B., Gómez M., Sanchez J.L., Fernández R., Palacios M.A. Platinum and rhodium distribution in airborne particulate matter and road dust // Sci. Total. Environ. – 2001. – Vol. 269. – P. 131-144. 59. Gómez B., Palacios M.A., Gómez M., Sanchez J.L., Morrison G., Rauch S., McLeod C., Ma R., Caroli S., Alimonti A., Petrucci E., Bocca B., Schramel P., Zischka M., Petterson C., Wass U. Levels and risk assessment for humans and ecosystems of platinum-group elements in the airborne particles and road dust of some European cities // Sci. Total. Environ. – 2002. – Vol. 299. – P. 1-19. 60. Goncalves A., Domínguez J.R., Alvarado J. Determination of Pd, Pt and Rh in vehicles escape fumes by GF-AAS and ICP-OES // Talanta. – 2008. – Vol. 75. – P. 523-527. 61. Grabar K.C., Freeman R.G., Hommer M.B., Natan M.J. (1995) Preparation and Characterization of Au Colloid Monolayers // Anal. Chem. – 1995. – Vol. 67. – P. 735–743. 62. Grigor’eva A., Saranina I., Tikunova N., Safonov A., Timoshenko N., Rebrov A., Ryabchikova E. Fine mechanisms of the interaction of silver nanoparticles with the cells of Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus // BioMetals. – 2013. – Vol. 26. – N 2. – P. 479-488. 125 63. Gupta A.K., Gupta M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications // Biomaterials. – 2005. - Vol. 26. - Р. 3995-4021. 64. Hamilton R.F., Wu N., Porter D., Buford M., Wolfarth M., Holian A. Particle length-dependent titanium dioxide nanomaterials toxicity and bioactivity // Part. Fibre Toxicol. – 2009. – Vol. 6. – P. 1-35. 65. Harraz F.A., El-Hout S.E., Killa H.M., Ibrahim I.A. Palladium nanoparticles stabilized by polyethylene glycol: Efficient, recyclable catalyst for hydrogenation of styrene and nitrobenzene // J. Catalysis. – 2012. – Vol. 286. – P. 184-192. 66. Hoon J.L., Wong W.K., Koh C.G. Functions and regulation of circular dorsal ruffles // Mol. Cell. Biol. – 2012. – Vol. 32. – N 21. – P. 4246-4257. 67. Huang X., El-Sayed I. H., El-Sayed M. A. Applications of gold nanorods for cancer imaging and photothermal therapy // Methods Mol. Biol. – 2010. – Vol. 624. – P. 343-357. 68. Huang X., El-Sayed I.H., Qian W., El-Sayed M.A. Cancer cell imaging and photothermal therapy in the near-infrared region by using gold nanorods // J. Am. Chem. Soc. – 2006. – Vol. 128. – N 6. – P. 2115-2120. 69. Huang X., Jain P. K., El-Sayed I. H., El-Sayed M. A. Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold nanoparticles // Lasers Med. Sci. – 2008. – Vol. 23. – P. 217-228. 70. Huff T.B., Tong L., Zhao Y., Hansen M.N., Cheng J.X., Wei A. Hyperthermic effects of gold nanorods on tumor cells // Nanomedicine (Lond). – 2007. – Vol. 2. – N 1. – P. 125-132. 71. Hühn D., Kantner K., Geidel C., Brandholt S., De Cock I., Soenen S.J., Rivera Gil P., Montenegro J.M., Braeckmans K., Müllen K., Nienhaus G.U., Klapper M., Parak W.J. Polymer-coated nanoparticles interacting with proteins and cells: focusing on the sign of the net charge // ACS Nano. – 2013. – Vol. 7. – N 4. – P. 3253-3263. 126 72. Imura K., Nagahara T., Okamoto H. Plasmon mode imaging of single gold nanorods // J Am Chem Soc. – 2004. – Vol. 126. – N 40. – P. 12730-12731. 73. Inkielewicz-Stepniak I., Santos-Martinez M.J., Medina C., Radomski M.W. Pharmacological and toxicological effects of co-exposure of human gingival fibroblasts to silver nanoparticles and sodium fluoride // Int. J. Nanomedicine. – 2014. – Vol. 9. – P. 1677-1687. 74. Ismagilov Z.R., Shikina N.V., Mazurkova N.A., Tsikoza L.T., Tuzikov F.V., Ushakov V.A., Ishchenko A.V., Rudina N.A., Korneev D.V., Ryabchikova E.I. Synthesis of nanoscale TiO2 and study of the effect of their crystal structure on single cell response // Sci. World J. – 2012. – Vol. 2012. – P. 498345. 75. Jain P. K., Huang X. H., El-Sayed I. H., El-Sayed M. A. Noble metals on the nanoscale: optical and photothermal properties and some applications in imaging, sensing, biology and medicine // Acc. Chem. Res. – 2008. – Vol. 41. – P. 1578-1586. 76. Jarvis K.E., Parry S.J., Piper J.M. Temporal and spatial studies of autocatalyst-derived platinum, rhodium, and palladium and selected vehiclederived trace elements in the environment // Environ. Sci. Technol. – 2001. – Vol. 35. – N 6. – P. 1031-1036. 77. Jelveh S., Chithrani D.B. Gold Nanostructures as a Platform for Combinational Therapy in Future Cancer Therapeutics // Cancers. – 2011. – Vol. 3. – P. 1081-1110. 78. Jiang J., Oberdörster G., Biswas P. Characterization of size, surface charge, and agglomeration state of nanoparticle dispersions for toxicological studies // J. Nanopart. Res. – 2009. – Vol. 11. – N 1. – P. 77. 79. Jin H., Heller D.A., Strano M.S., Sharma R., Strano M.S. Size-Dependent Cellular Uptake and Expulsion of Single-Walled Carbon Nanotubes: Single Particle Tracking and a Generic Uptake Model for Nanoparticles // ACS Nano. – 2009. – Vol. 3. – P. 149-158. 127 80. Jo J., Aoki I., Tabata Y. Design of iron oxide nanoparticles with different sizes and surface charges for simple and efficient labeling of mesenchymal stem cells // J. Contr. Release. – 2010. – Vol. 142. – N 3. – P. 465-473. 81. Jovic M., Sharma M., Rahajeng J., Caplan S. The early endosome: a busy sorting station for proteins at the crossroads // Histol. Histopathol. – 2010. – Vol. 25. – N 1. – P. 99-112. 82. Kam N.W.S., Liu Z., Dai H. Carbon Nanotubes as Intracellular Transporters for Proteins and DNA: An Investigation of the Uptake Mechanism and Pathway // Angew. Chem. Int. Ed. – 2006. – Vol. 45. – P. 577-581. 83. Kampa M., Castanas E. Human health effects of air pollution // Environ. Pollut. – 2008. – Vol. 151. – N 2. – P. 362-367. 84. Khan J.A., Pillai B., Das T.K., Singh Y., Maiti S. Molecular effects of uptake of gold nanoparticles in HeLa cells // ChemBioChem. – 2007. – Vol. 8. – N 11. – P. 1237-1240. 85. Khlebtsov N., Dykman L. Biodistribution and toxicity of engineered gold nanoparticles: a review of in vitro and in vivo studies // Chem. Soc. Rev. – 2011. – Vol. 40. – P. 1647-1671. 86. Kralj S., Rojnik M., Romih R. Jagodič M., Kos J., Makovec D. Effect of surface charge on the cellular uptake of fluorescent magnetic nanoparticles // J.Nanopar. Res. – 2012. – Vol. 14. – P. 1-14. 87. Krpetić Z., Porta F., Caneva E., Dal Santo V., Scarì G. Phagocytosis of biocompatible gold nanoparticles // Langmuir. - 2010. - Vol. 26. – N 18. P. 14799-14805. 88. Kuhn D.A., Vanhecke D., Michen B., Blank F., Gehr P., Petri-Fink A., Rothen-Rutishauser B. Different endocytotic uptake mechanisms for nanoparticles in epithelial cells and macrophages // Beilstein J. Nanotechnol. – 2014. – Vol. 5. – P. 1625-1636. 89. Kumar A., Zhang X., Liang X.J. Gold nanoparticles: emerging paradigm for targeted drug delivery system // Biotechnol. Adv. – 2013. – Vol. 31. – N 5. – P. 593-606. 128 90. Laurencin M., Georgelin T., Malezieux B., Siaugue J.M., Ménager C. Interactions between giant unilamellar vesicles and charged core-shell magnetic nanoparticles // Langmuir. – 2010. – Vol. 26. – N 20. – P. 1602516030. 91. L'Azou B., Jorly J., On D., Sellier E., Moisan F., Fleury-Feith J., Cambar J., Brochard P., Ohayon-Courtès C. In vitro effects of nanoparticles on renal cells // PartFibre Toxicol. – 2008. – Vol. 5. – P. 1-22. 92. Leopold K., Maier M., Weber S., Schuster M. Long-term study of palladium in road tunnel dust and sewage sludge ash // Environ. Pollut. – 2008. – Vol. 156. – P. 341-347. 93. Leroueil P.R., Berry S.A., Duthie K., Han G., Rotello V.M., McNerny D.Q., Baker J.R Jr, Orr B.G., Holl M.M. Wide varieties of cationic nanoparticles induce defects in supported lipid bilayers // Nano Lett. – 2008. – Vol. 8. – N 2. – P. 420-424. 94. Lesniak A., Fenaroli F., Monopoli M.P., Åberg C., Dawson K.A., Salvati A. Effects of the presence or absence of a protein corona on silica nanoparticle uptake and impact on cells // ACS Nano. – 2012. – Vol. 6. – N 7. – P. 58455857. 95. Lesniak A., Salvati A., Santos-Martinez M.J., Radomski M.W., Dawson K.A., Åberg C. Nanoparticle adhesion to the cell membrane and its effect on nanoparticle uptake efficiency // J. Am. Chem. Soc. – 2013. – Vol. 135. – N 4. – P. 1438-1444. 96. Lévy R., Shaheen U., Cesbron Y., Sée V. Gold nanoparticles delivery in mammalian live cells: a critical review // Nano Rev. – 2010. – Vol. 1. 97. Li F., Weir M.D., Chen J., Xu H.H. Comparison of quaternary ammoniumcontaining with nano-silver-containing adhesive in antibacterial properties and cytotoxicity // Dent. Mater. – 2013. – Vol. 29. – N 4. – P. 450–461. 98. Liao J., Anchun M., Zhu Z., Quan Y. Antibacterial titanium plate deposited by silver nanoparticles exhibits cell compatibility // Int. J. Nanomedicine. – 2010. – Vol. 5. – P. 337-342. 129 99. Lin K.Y., Bagley A.B., Zhang A.Y., Karl D.L., Yoon S.S., Bhatia S.N. Gold nanorod photothermal therapy in a genetically engineered mouse model of soft tissue sarcoma // Nano LIFE. – 2010. – Vol. 1. – N 3. – P. 277-287. 100. Liopo A.V., Conjusteau A., Oraevsky A.A. PEG-coated gold nanorod monoclonal antibody conjugates in preclinical research with optoacoustic tomography, photothermal therapy and sensing // Proc SPIE. – 2012. – P. 8223. 101. Liu S., Xu L., Zhang T., Ren G., Yang Z. Oxidative stress and apoptosis induced by nanosized titanium dioxide in PC12 cells // Toxicology. – 2010. – Vol. 267. – P. 172-177. 102. Liu X., Huang N., Li H., Jin Q., Ji J. Surface and size effects on cell interaction of gold nanoparticles with both phagocytic and nonphagocytic cells // Langmuir. – 2013. – Vol. 29. – N 29. – P. 9138-9148. 103. Lundqvist M., Stigler J., Elia G., Lynch I., Cedervall T., Dawson K.A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts // PNAS – 2008. – Vol. 105. – N 38. – P. 14265-14270. 104. Lynch I., Dawson K.A. Protein-nanoparticle interactions // Nano Today. – 2008. – Vol. 3. – N 1-2. – P. 40-47. 105. Lynch I., Salvati A., Dawson K.A. Protein-nanoparticle interactions: What does the cell see? // Nat Nanotechnol. – 2009. – Vol. 4. – N 9. – P. 546-547. 106. Mahmoudi M., Lynch I., Ejtehadi M.R., Monopoli M.P., Bombelli F.B., Laurent S. Protein-nanoparticle interactions: opportunities and challenges // Chem. Rev. – 2011. – Vol. 111. – N 9. – P. 5610-5637. 107. Mahon E., Salvati A., Baldelli Bombelli F., Lynch I., Dawson K.A. Designing the nanoparticle-biomolecule interface for "targeting and therapeutic delivery" // J. Contr. Release. – 2012. – Vol. 161. – N 2. – P. 164-174. 108. Maiorano G, .Sabella S., Sorce B., Brunetti V., Malvindi M.A., Cingolani R., Pompa P.P. Effects of cell culture media on the dynamic formation of 130 protein-nanoparticle complexes and influence on the cellular response // ACS Nano. – 2010. – Vol. 4. – N 12. – P. 7481-7491. 109. Marquis B.J., Love S.A., Braun K.L., Haynes C.L. Analytical methods to assess nanoparticle toxicity // Analyst. – 2009. – Vol. 134. – N 3. – P. 425439. 110. Maurer-Jones M.A., Gunsolus I.L., Murphy C.J., Haynes C.L. Toxicity of engineered nanoparticles in the environment // Anal. Chem. – 2013. – Vol. 85. – N 6. – P. 3036-3049. 111. Mayor S., Pagano R.E. Pathways of clathrin-independent endocytosis // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. – 2007. – Vol. 8. – P. 603-612. 112. Meißner T., Oelschlägel K., Potthoff A. Dispersion of nanomaterials used in toxicological studies: a comparison of sonication approaches demonstrated on TiO2 P25 // J. Nanopart. Res. – 2014. – Vol. 16. – P. 22-28. 113. Menon J.U., Jadeja P., Tambe P., Vu K., Yuan B., Nguyen K.T. Nanomaterials for photo-based diagnostic and therapeutic applications // Theranostics. – 2013. – Vol. 3. – N 3. – P. 152-166. 114. Mieszawska A.J., Mulder W.J., Fayad Z.A., Cormode D.P. Multifunctional gold nanoparticles for diagnosis and therapy of disease // Mol. Pharm. – 2013. – Vol. 10. – N 3. – P. 831-847. 115. Migdal C., Rahal R., Rubod A., Callejon S., Colomb E., Atrux-Tallau N., Haftek M., Vincent C., Serres M., Daniele S. Internalisation of hybrid titanium dioxide/para-amino benzoic acid nanoparticles in human dendritic cells did not induce toxicity and changes in their functions // Toxicol. Lett. – 2010. – Vol. 199. – N 1. – P. 34-42. 116. Mikhaylov G, Vasiljeva O. Promising approaches in using magnetic nanoparticles in oncology // Biol. Chem. – 2011. – Vol. 392. N 11. P. 955960. 117. Mironava T., Hadjiargyrou M., Simon M., Jurukovski V., Rafailovich M.H. Gold nanoparticles cellular toxicity and recovery: effect of size, 131 concentration and exposure time // Nanotoxicology. – 2010. – Vol. 4. – N 1. – P. 120-137. 118. Mirshafiee V., Mahmoudi M., Lou K., Cheng J., Kraft M.L. Protein corona significantly reduces active targeting yield // ChemCommun. – 2013. – Vol. 49. – N 25. – P. 2557-2559. 119. Moldovan M., Palacios M.A., Gómez M.M., Morrison G., Rauch S., McLeod C., Ma R., Caroli S., Alimonti A., Petrucci F., Bocca B., Schramel P., Zischka M., Pettersson C., Wass U., Luna M., Saenz J.C., Santamaría J. Environmental risk of particulate and soluble platinum group elements released from gasoline and diesel engine catalytic converters // Sci. Total. Environ. – 2002. – Vol. 296. – P. 199-208. 120. Moldovan M., Rauch S., Gómez M., Palacios M.A., Morrison G.M. Bioaccumulation of palladium, platinum and rhodium from urban particulates and sediments by the freshwater isopod Asellus aquaticus // Water Res. – 2001. – Vol. 35. – N 17. – P. 4175-4183. 121. Monopoli M.P., Walczyk D., Campbell A., Elia G., Lynch I., Bombelli F.B., Dawson K.A. Physical-chemical aspects of protein corona: relevance to in vitro and in vivo biological impacts of nanoparticles // J. Am. Chem. Soc. – 2011. – Vol. 133. – N 8. – P. 2525-2534. 122. Moore A., Weissleder R., Bogdanov A. Jr. Uptake of dextran-coated monocrystalline iron oxides in tumor cells and macrophages // J. Magn. Reson. Imaging. – 1997. – Vol. 7. – N 6. – P. 1140-1145. 123. Mulcahy L.A., Pink R.C., Carter D.R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake // J. Extracell. Vesicles. – 2014. – Vol. 3. – P. 114. 124. Niidome T., Yamagata M., Okamoto Y., Akiyama Y., Takahashi H., Kawano T., Katayama Y., Niidome Y. PEG-modified gold nanorods with a stealth character for in vivo application // J. Contr. Release. – 2006. – Vol. 114. – P. 343-347. 132 125. Nikoobakht B., El-Sayed A. M. Preparation and Growth Mechanism of Gold Nanorods (NRs) Using Seed-Mediated Growth Method // Chem. Mater. – 2003. – Vol. 15. – P. 1957-1962. 126. Nishihata Y., Mizuki J., Akao T., Tanaka H., Uenishi M., Kimura M., Okamoto T., Hamada N. Self-regeneration of a Pd-perovskite catalyst for automotive emissions control // Nature. – 2002. – Vol. 418. – N 6894. – P. 164-167. 127. Nowak J.S., Mehn D., Nativo P., García C.P., Gioria S., Ojea-Jiménez I., Gilliland D., Rossi F. Silica nanoparticle uptake induces survival mechanism in A549 cells by the activation of autophagy but not apoptosis // Toxicol. Lett. – 2014. – Vol. 224. – N 1. – P. 84-92. 128. Oberdörster G., Oberdörster E., Oberdörster J. Nanotoxicology: an emerging discipline evolving from studies of ultrafine particles // Environ. Health Perspect. – 2010. – Vol. 118. – N 9. – P. 823-839. 129. Orlichenko L., Huang B., Krueger E., McNiven M.A. Epithelial growth factor-induced phosphorylation of caveolin 1 at tyrosine 14 stimulates caveolae formation in epithelial cells // J. Biol. Chem. – 2006. – Vol. 281. – N 8. – P. 4570-4579. 130. Oh N., Park J.H. Endocytosis and exocytosis of nanoparticles in mammalian cells // Int. J. Nanomedicine. – 2014. – Vol. 9. – Suppl. 1. – P. 51-63. 131. Orth J.D., Krueger E.W., Weller S.G., McNiven M.A. A novel endocytic mechanism of epidermal growth factor receptor sequestration and internalization // Cancer Res. – 2006. – Vol. 66. – N 7. – P. 3603-3610. 132. Orts-Gil G., Natte K., Thiermann R., Girod M., Rades S., Kalbe H., Thünemann A.F., Maskos M., Österle W. On the role of surface composition and curvature on biointerface formation and colloidal stability of nanoparticles in a protein-rich model system // Coll. Surf. B Biointerfaces. – 2013. – Vol. 108. – P. 110-119. 133. Overwijk W.W., Restifo N.P. B16 as a mouse model for human melanoma // Curr Protoc Immunol. – 2001. – Ch. 20. - Unit 20.1. 133 134. Paciotti G.F., Myer L., Weinreich D., Goia D., Pavel N., McLaughlin R.E., Tamarkin L. Colloidal gold; a novel nanoparticle vector for tumor directed drug delivery // Drug Deliv. – 2004. – Vol. 11. – P. 169-183. 135. Park J.H., von Maltzahn G., Ong L.L., Centrone A., Hatton T.A., Ruoslahti E., Bhatia S.N., Sailor M.J. Cooperative nanoparticles for tumor detection and photothermally triggered drug delivery // Adv. Mater. – 2010. – Vol. 22. – N 8. – P. 880-885. 136. Parkar N.S., Akpa B.S., Nitsche L.C., Wedgewood L.E., Place A.T., Sverdlov M.S., Chaga O., Minshall R.D. Vesicle formation and endocytosis: function, machinery, mechanisms, and modeling // Antioxid. Redox Signal. – 2009. – Vol. 11. – N 6. – P. 1301-1312. 137. Patnaik S., Gupta K.C. Novel polyethylenimine-derived nanoparticles for in vivo gene delivery // Expert Opin Drug Deliv. – 2013. – Vol. 10. – N 2. – P. 215-228. 138. Pelka J., Gehrke H., Esselen M., Türk M., Crone M., Bräse S., Muller T., Blank H., Send W., Zibat V., Brenner P., Schneider R., Gerthsen D., Marko D. Cellular uptake of platinum nanoparticles in human colon carcinoma cells and their impact on cellular redox systems and DNA integrity // Chem. Res. Toxicol. – 2009. – Vol. 22. – N 4. – P. 649-659. 139. Pérez-Juste J., Pastoriza-Santos I., Liz-Marzán L.M., Mulvaney P. Gold nanorods: synthesis, characterization and applications // Coord. Chem. Rev. – 2005. – Vol. 249. – P. 1870–1890. 140. Piao M.J., Kang K.A., Lee I.K., Kim H.S., Kim S., Choi J.Y., Choi J., Hyun J.W. Silver nanoparticles induce oxidative cell damage in human liver cells through inhibition of reduced glutathione and induction of mitochondria-involved apoptosis // Toxicol. Lett. – 2011. – Vol. 201. – N 1. – P. 92-100. 141. Pissuwan D., Valenzuela S., Cortie M. B. Prospects for gold nanorod particles in diagnostic and therapeutic applications // Biotechnol. Genet. Eng. Rev. – 2008. – Vol. 25. – P. 93–112. 134 142. Rejman J., Oberle V., Zuhorn I.S., Hoekstra D. Size-dependent internalization of particles via the pathways of clathrin- and caveolaemediated endocytosis // Biochem J. – 2004. – Vol. 377. – N 1. – P. 159–169. 143. Roiter Y., Ornatska M., Rammohan A.R., Balakrishnan J., Heine D.R., Minko S. Interaction of nanoparticles with lipid membrane // Nano Lett. – 2008. – Vol. 8. – N 3. – P. 941-944. 144. Roy R., Kumar S., Tripathi A., Das M., Dwivedi P.D. Interactive threats of nanoparticles to the biological system // Immunol. Lett. – 2014. – Vol. 158. – N 1-2. – P. 79-87. 145. Russell D.G., Vanderven B.C., Glennie S., Mwandumba H., Heyderman R.S. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function // Nat. Rev. Immunol. – 2009. – Vol. 9. – N 8. – P. 594600. 146. Ryabchikova E. I., Mazurkova N. A., Shikina N. V., Ismagilov Z. R. The cristalline forms of titanium dioxide nanoparticles affect their interactions with individual cells // J. Med. CBR Defense. – 2010. – Vol. 8. 147. Samim M, Prashant CK, Dinda AK, Maitra AN, Arora I. Synthesis and characterization of gold nanorods and their application for photothermal cell damage // Int. J. Nanomedicine. – 2011. – Vol. 6. – P. 1825-1831. 148. Saptarshi S.R., Duschl A., Lopata A.L. Interaction of nanoparticles with proteins: relation to bio-reactivity of the nanoparticle // J Nanobiotechnology. – 2013. – Vol. 11. – P. 26. 149. Schäffler M., Semmler-Behnke M., Sarioglu H., Takenaka S., Wenk A., Schleh C., Hauck S.M., Johnston B.D., Kreyling W.G. Serum protein identification and quantification of the corona of 5, 15 and 80 nm gold nanoparticles // Nanotechnology. – 2013. – Vol. 24. – N 26. – P. 265103. 150. Schröfel A., Kratošová G., Safařík I., Safaříková M., Raška I., Shor L.M. Applications of biosynthesized metallic nanoparticles - A review // Acta Biomater. – 2014. – Vol. 10. – N 10. – P. 4023-4042. 135 151. Shah M., Badwaik V.D., Dakshinamurthy R. Biological applications of gold nanoparticles // J. Nanosci. Nanotechnol. – 2014. – Vol. 14. – N 1. – P. 344362. 152. Shapero K., Fenaroli F., Lynch I., Cottell D.C., Salvati A., Dawson K.A. Time and space resolved uptake study of silica nanoparticles by human cells // Mol. Biosyst. – 2011. – Vol. 7. – N 2. – P. 371-378. 153. Shavandi Z., Ghazanfari T., Moghaddam K. N. In vitro toxicity of silver nanoparticles on murine peritoneal macrophages // Immunopharmacol. Immunotoxicol. – 2011. – Vol. 33. – N 1. – P. 135-140. 154. Shukla R., Bansal V., Chaudhary M., Basu A., Bhonde R.R., Sastry M. Biocompatibility of gold nanoparticles and their endocytotic fate inside the cellular compartment: a microscopic overview // Langmuir. – 2005. – Vol. 21. – N 23. – P. 10644-10654. 155. Smilowitz H.M., Sasso D., Lee E.W., Goh G., Micca P.L., Dilmanian F.A. Therapy model for advanced intracerebral B16 mouse melanoma using radiation therapy combined with immunotherapy // Cancer Immunol. Immunother. – 2013. – Vol. 62. – N 7. – P. 1187-1197. 156. Soenen S.J., Manshian B., Montenegro J.M., Amin F., Meermann B., Thiron T., Cornelissen M., Vanhaecke F., Doak S., Parak W.J., De Smedt S., Braeckmans K. Cytotoxic effects of gold nanoparticles: a multiparametric study // ACS Nano. – 2012. – Vol. 6. – N 7. – P. 5767-5783. 157. Stearns R.C., Paulauskis J.D., Godleski J.J. Endocytosis of Ultrafine Particles by A549 Cells // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. – 2001. – Vol. 24. – P. 108–115. 158. Stebounova L., Guio E., Grassian V. Silver nanoparticles in simulated biological media: a study of aggregation, sedimentation, and dissolution // J. Nanopart. Res. – 2011. – Vol. 13. – P. 233-244. 159. Sures B., Zimmermann S., Messerschmidt J., von Bohlen A., Alt F. First report on the uptake of automobile catalyst emitted palladium by European 136 eels (Anguilla anguilla) following experimental exposure to road dust // Environ. Pollut. – 2001. – Vol. 113. – N 3. – P. 341-345. 160. Suresh A.K., Pelletier D.A., Wang W., Morrell-Falvey J.L., Gu B., Doktycz M.J. Cytotoxicity induced by engineered silver nanocrystallites is dependent on surface coatings and cell types // Langmuir. – 2012. – Vol. 28. – N 5. – P. 2727-2735. 161. Sylvester P.W. Optimization of the tetrazolium dye (MTT) colorimetric assay for cellular growth and viability // Methods Mol. Biol. – 2011. - Vol. 716. – P. 157-168. 162. Takahashi H., Niidome T., Kawano T., Yamada T. S., Niidome Y. Surface modification of gold nanorods using layer-by-layer technique for cellular uptake // J. Nanopart. Res. – 2008. – Vol. 10. – P. 221–228. 163. Terentyuk G.S., Maslyakova G.N., Suleymanova L.V., Khlebtsov N.G., Khlebtsov B.N., Akchurin G.G., Maksimova I.L., Tuchin V.V. Laserinduced tissue hyperthermia mediated by gold nanoparticles: toward cancer phototherapy // J. Biomed. Opt. – 2009. – Vol. 14. – N 2. – P. 021016. 164. Teske S.S., Detweiler C.S. The Biomechanisms of Metal and Metal-Oxide Nanoparticles' Interactions with Cells // Int. J. Environ. Res. Public. Health. – 2015. – Vol. 12. – N 2. – P. 1112-1134. 165. Thurn K.T., Arora H., Paunesku T., Wu A., Brown E.M., Doty C., Kremer J., Woloschak G. Endocytosis of titanium dioxide nanoparticles in prostate cancer PC-3M cells // Nanomedicine. – 2011. – Vol. 7. – N 2. – P. 123-130. 166. Tkachenko A.G., Xie H., Liu Y., Coleman D., Ryan J., Glomm W.R., Shipton M.K., Franzen S., Feldheim D.L. Cellular trajectories of peptidemodified gold particle complexes: comparison of nuclear localization signals and peptide transduction domains // Bioconjug. Chem. – 2004. – Vol. 15. – N 3. – P. 482-489. 167. Toebes M.L., van Dillen J.A., de Jong K.P. Synthesis of supported palladium catalysts // J. Mol. Catal. A Chem. – 2001. – Vol. 173. – P. 75-98. 137 168. Tomić S., Ðokić J., Vasilijić S., Ogrinc N., Rudolf R., Pelicon P., Vučević D., Milosavljević P., Janković S., Anžel I., Rajković J., Rupnik M.S., Friedrich B., Colić M. Size-dependent effects of gold nanoparticles uptake on maturation and antitumor functions of human dendritic cells in vitro // PLoS One. – 2014. – Vol. 9. – N 5. – P. е96584. 169. Tong L., Zhao Y., Huff T.B., Hansen M.N., Wei A., Cheng J.X. Gold Nanorods Mediate Tumor Cell Death by Compromising Membrane Integrity // Adv. Mater. – 2007. – Vol. 19. – P. 3136-3141. 170. Treuel L., Brandholt S., Maffre P., Wiegele S., Shang L., Nienhaus G.U. Impact of protein modification on the protein corona on nanoparticles and nanoparticle-cell interactions // ACS Nano. – 2014. – Vol. 8. – N 1. – P. 503-513. 171. Verma A., Stellacci F. Effect of surface properties on nanoparticle-cell interactions // Small. – 2010. – Vol. 6. – N 1. – P. 12-21. 172. Verma S., Ðokić J., Vasilijić S., Ogrinc N., Rudolf R., Pelicon P., Vučević D., Milosavljević P., Janković S., Anžel I., Rajković J., Rupnik M.S., Friedrich B., Colić M. Size-dependent effects of gold nanoparticles uptake on maturation and antitumor functions of human dendritic cells in vitro // PLoS One. – 2014. – Vol. 9. – N 5. – P. e96584. 173. Voigt J., Christensen J., Shastri V.P. Differential uptake of nanoparticles by endothelial cells through polyelectrolytes with affinity for caveolae // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2014. – Vol. 111. – N 8. – P. 2942-2947. 174. Walkey C.D., Chan W.C. Understanding and controlling the interaction of nanomaterials with proteins in a physiological environment // Chem. Soc. Rev. – 2012. – Vol. 41. – N 7. – P. 2780-2799. 175. Wang E., Yu L., Monopoli M.P., Sandin P., Mahon E., Salvati A., Dawson K.A. The biomolecular corona is retained during nanoparticle uptake and protects the cells from the damage induced by cationic nanoparticles until degraded in the lysosomes // Int. J. Nanomedicine. – 2013. – Vol. 9. – N 8. – P. 1159-1168. 138 176. Wang J., Dong B., Chen B., Jiang Z., Song H. Selective photothermal therapy for breast cancer with targeting peptide modified gold nanorods // Dalton Trans. – 2012. – Vol. 41. – P. 11134-11144. 177. Wang T., Bai J., Jiang X., Nienhaus G.U. Cellular uptake of nanoparticles by membrane penetration: a study combining confocal microscopy with FTIR spectroelectrochemistry // ACS Nano. – 2012. – Vol. 6. – N 2. – P. 1251-1259. 178. Wei P.F., Zhang L., Nethi S.K., Barui A.K., Lin J., Zhou W., Shen Y., Man N., Zhang Y.J., Xu J., Patra C.R., Wen L.P. Accelerating the clearance of mutant huntingtin protein aggregates through autophagy induction by europium hydroxide nanorods // Biomaterials. – 2014. – Vol. 35. – N 3. – P. 899-907. 179. Whiteley J.D., Murray F. Anthropogenic platinum group element (Pt, Pd and Rh) concentrations in road dusts and roadside soils from Perth, Western Australia // Sci. Total. Environ. – 2003. – Vol. 317. – P. 121-135. 180. Wilhelm C., Billotey C., Roger J., Pons J.N., Bacri J.C., Gazeau F. Intracellular uptake of anionic superparamagnetic nanoparticles as a function of their surface coating // Biomaterials. – 2003. – Vol. 24. – N 6. – P. 10011011. 181. Wilkinson K.E., Palmberg L.,Witasp E., Kupczyk M., Feliu N., Gerde P., Seisenbaeva G.A., Fadeel B., Dahlén S.E., KesslerV.G. Solution-engineered palladium nanoparticles: model for health effect studies of automotive particulate pollution // ACS Nano. – 2011. – Vol. 5. – P. 5312-5324. 182. Wiseman C.L., Zereini F. Airborne particulate matter, platinum group elements and human health: a review of recent evidence // Sci. Total. Environ. – 2009. – Vol. 407. – N 8. – P. 2493-2500. 183. Xie Z., Klionsky D.J. Autophagosome formation: core machinery and adaptations // Nat. Cell. Biol. – 2007. – Vol. 9. – N 10. – P. 1102-1109. 139 184. Xu L., Liu Y., Chen Z., Li W., Liu Y., Wang L., Liu Y., Wu X., Ji Y., Zhao Y., Ma L., Shao Y., Chen C. Surface-engineered gold nanorods: promising DNA vaccine adjuvant for HIV-1 treatment // Nano Lett. – 2012. – Vol. 12. – N 4. – P. 2003-2012. 185. Xu Y., Tang H., Liu J. H., Wang H., Liu Y. Evaluation of the adjuvant effect of silver nanoparticles both in vitro and in vivo // Toxicol. Lett. – 2013. – Vol. 219. – N 1. – P. 42-48. 186. Yang D.P., Cui D.X. Advances and prospects of gold nanorods // Chem. Asian. J. – 2008. – Vol. 3. – N 12. – P. 2010-2022. 187. Yin Z.F., Wu L., Yang H.G., Su Y.H. Recent progress in biomedical applications of titanium dioxide // Phys. Chem. – 2013. – Vol. 15. – N 14. – P. 4844-4858. 188. Yu C., Varghese L., Irudayaraj J. Surface modification of cetyltrimethylammonium bromide-capped gold nanorods to make molecular probes // Langmuir. – 2007. – Vol. 23. – N 17. – P. 9114-9119. Б. 189. Zhang X., Goncalves R., Mosser D.M. The isolation and characterization of murine macrophages // Curr. Protoc. Immunol. – 2008. – Ch.14. - Unit 14.1. 190. Zhou W., Miao Y., Zhang Y., Liu L., Lin J., Yang J.Y., Xie Y., Wen L. Induction of cyto-protective autophagy by paramontroseite nanocrystals // Nanotechnology. – 2013. – Vol. 24. – N 16. – P. 165102. VO2
