Полипептиды актиний, их взаимодействие с биологическими

Вестник ДВО РАН. 2014. № 1
УДК 577.112+577.122
М.М. МОНАСТЫРНАЯ, Е.В. ЛЕЙЧЕНКО, И.Н. ГЛАДКИХ,
Е.А. ЗЕЛЕПУГА, В.М. ТАБАКМАХЕР, О.В. СИНЦОВА,
Р.С. КАЛИНА, А.Н. КВЕТКИНА, Э.П. КОЗЛОВСКАЯ
Полипептиды актиний, их взаимодействие
с биологическими мишенями
Приводятся краткие сведения о результатах изучения биологически активных полипептидов, продуцируемых ядовитыми морскими кишечнополостными актиниями: анемонотоксинов, пептидных APETx2-подобных и
пороформирующих токсинов, полипептидов Кунитц-типа. Описывается их взаимодействие с биологическими
мишенями.
Ключевые слова: актиния, анемонотоксины, актинопорины, APETx2-подобные токсины, ингибиторы Кунитц-типа, ионные каналы, цитоплазматические мембраны, сериновые протеиназы.
Sea anemone polypeptides, interaction with biological targets. M.M. MONASTYRNAYA, E.V. LEYCHENKO,
I.N. GLADKIKH, E.A. ZELEPUGA, V.M. TABAKMAKHER, O.V. SINTSOVA, P.S. KALINA, A.N. KVETKINA,
E.P. KOZLOVSKAYA (G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).
The results of the study of biologically active polypeptides produced by certain poisonous marine cnidarians, sea
anemones: anemonotoxins, APETx2-like peptide toxins, pore-forming toxins, Kunitz-type polypeptides, as well as of
their interaction with biological targets are presented in this paper.
Key words: sea anemone, anemonotoxins, actinoporns, APETx2-like toxins, Kunitz-type inhibitors, ion channels,
cytoplasmic membranes, serine proteinases.
На протяжении последних 30 лет основным объектом исследований лаборатории химии пептидов ТИБОХ ДВО РАН являются биологически активные полипептиды,
продуцируемые ядовитыми морскими гидробионтами актиниями (тип Coelenterata, класс
Anthozoa). Эти ядовитые организмы, изучение которых началось в начале прошлого столетия, представлены сегодня несколькими десятками видов, обитающих преимущественно в тропических и субтропических регионах Мирового океана [57].
Актинии – это сидячие животные, прикрепляющиеся к твердому грунту. Для охоты
и/или защиты от хищников они используют специализированные жалящие органеллы нематоцисты, локализованные в клетках щупалец, которые имеют сложную анатомическую
структуру, позволяющую впрыскивать ядовитый секрет в тело проплывающего мимо организма-мишени. Продуцируемые актиниями яды представляют собой сложные смеси
биологически активных соединений, среди которых для исследователей наибольший интерес представляют нейротоксины, пороформирующие токсины (актинопорины), а также
ингибиторы протеиназ. Эти белковые токсичные компоненты ядовитого секрета работают
в синергизме и выполняют важную роль в морском биоценозе. Являясь уникальными по
*МОНАСТЫРНАЯ Маргарита Михайловна − доктор химических наук, ведущий научный сотрудник, ЛЕЙЧЕНКО Елена Владимировна – кандидат химических наук, старший научный сотрудник, ГЛАДКИХ Ирина Николаевна – кандидат химических наук, старший научный сотрудник, ЗЕЛЕПУГА Елена Александровна – кандидат
физико-математических наук, старший научный сотрудник, ТАБАКМАХЕР Валентин Михайлович – младший
научный сотрудник, СИНЦОВА Оксана Владимировна – аспирант, КОЗЛОВСКАЯ Эмма Павловна – доктор
химических наук, заведующая лабораторией (Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова
ДВО РАН, Владивосток), КАЛИНА Римма Сергеевна – студентка, КВЕТКИНА Александра Николаевна – студентка (Дальневосточный федеральный университет, Владивосток). *E-mail: rita1950@mail.ru
Работа выполнена при финансовой поддержке программы ДВО РАН «Дальний Восток» (проект № 14-III-В-05-102).
103
специфичности и эффективности действия молекулами, они способны влиять на различные физиологические процессы в организме жертвы или потенциального хищника [57].
В 1980 г. в рамках государственной программы «Нервный импульс» в лаборатории химии пептидов ТИБОХ ДВО РАН было начато изучение структуры и механизма действия
анемонотоксинов – потенциальных молекулярных инструментов исследования процессов, связанных с передачей нервных импульсов. К этому времени уже было установлено,
что в процессах восприятия, обработки и передачи сигналов по нервам, а также других
стимулов основную роль играет перенос ионов (Na+, K+, Са2+, Сl-) потенциалчувствительными ионными каналами – сложными белковыми структурами, пронизывающими электровозбудимые мембраны нервных и мышечных клеток, которые специфически активируются деполяризацией клеточной мембраны. Были открыты натриевые (Navs), калиевые
(Kvs), кальциевые (Cavs) каналы (каждое семейство каналов имеет ряд изоформ, разных
у биологических видов и в разных частях нервной системы); разработаны электрофизиологические методы изучения проходящих через них токов (проводимости каналов);
установлена аминокислотная последовательность Nav-канала [51], предложена гипотетическая модель 3D-структуры натриевого канала (кристаллическая структура канала NavAb
бактерии Arcobacter butzleri впервые была установлена лишь в 2011 г. [52]), что позволило
получить представление о том, как работают Nav-каналы. В огромной степени этому способствовало изучение структуры и функции природных токсинов, в том числе пептидной и полипептидной природы, обнаруженных в ядах пресмыкающихся, членистоногих,
морских моллюсков (конусов), актиний [45]. Было показано, что модификация ионных
каналов белковыми токсинами изменяет их функциональную активность и что одним их
богатейших и перспективных источников таких токсинов являются актинии.
В результате 30-летних исследований в лаборатории химии пептидов ТИБОХ ДВО
РАН были найдены новые источники биологически активных полипептидов среди актиний, выделено несколько десятков новых полипептидов, установлена структура и биологическая активность большинства из них, изучена нуклеотидная последовательность
кодирующих их генов, проведен биоинформационный и структурно-функциональный
анализ полипептидов с целью дальнейшего конструирования новых потенциальных фармакологических препаратов направленного действия.
1. Нейротоксины Radianthus
1.1. Анемонотоксины структурного типа 2
Во время 11-й и 12-й морских экспедиций НИС «Профессор Богоров» в Индийский океан (1979–1981 гг.) обнаружено несколько видов актиний, проявляющих высокую
токсичность для млекопитающих. Один из наиболее широко распространенных в тропиках видов актиний, Radianthus macrodactylus (современное название Нeteractis crispa),
был собран в количествах, позволивших в дальнейшем провести широкомасштабное исследование структуры и функций биологически активных полипептидов, продуцируемых
этим видом.
Методами гидрофобной хроматографии на полихроме-1, ионообменной хроматографии на Bio-Rex 70 и SP-Sephadex C-25, обращенно-фазовой ВЭЖХ на Silasorb C18 выделено в индивидуальном состоянии пять высокотоксичных анемонотоксинов RTX-I – RTX-V
(молекулярная масса около 5 кДа). Значения летальных доз токсинов для млекопитающих
варьировали от 3000 (RTX-I) до 40 и 25 мкг/кг (RTX-IV и RTX-III, соответственно).
Методами структурной химии белка были установлены аминокислотные последовательности пяти анемонотоксинов RTX-I – RTX-V [4–6, 8] (рис. 1).
Впервые было показано, что нейротоксины Radianthus принадлежат к новому 2-му типу
так называемых длинных анемонотоксинов, имеющих общий анцестральный ген, значительно дивергировавший в ходе эволюции [45], проявляют высокую специфичность
104
Рис. 1. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей анемонотоксинов 1-го и
2-го структурных типов ATX-II и ATX-V (Swiss-Prot, P01528.1, P01529.1) из Anemonia sulcata, AP-A и AP-B
(Swiss-Prot, P01530.1, P01531.1) из Anthopleura xanthogrammica, AP-C (Swiss-Prot, P01532.1) из Anthopleura
elegantissima, RTX-I – RTX-V из Heteractis crispa, Sh-I (Swiss-Prot, P19651.1) из Stichodactyla helianthus, Rp-II
(Swiss-Prot, P01534.1) из Radianthus paumotensis. На сером фоне показаны идентичные аминокислотные остатки
в последовательностях анемонотоксинов 1-го и 2-го структурных типов
связывания с NaV-каналами электровозбудимых мембран. Большинство анемонотоксинов структурного типа 1 (из актиний семейства Actiniidae) содержит 47 аминокислотных
остатков (а.о.) [34], в то время как анемонотоксины 2-го типа (из актиний семейства Stichodactylidae) – 48 а.о. Представители обоих типов имеют одинаковое расположение трех
дисульфидных связей (рис. 2А, см. вклейку) [6].
Как видно из рис. 1, высокая степень гомологии (до 98 %) аминокислотных последовательностей наблюдается в пределах каждого типа нейротоксинов, в то время как между
представителями разных типов она не превышает 40 %. Характерная особенность анемонотоксинов 2-го структурного типа – отсутствие одного N-концевого остатка и наличие
3–4 оснóвных С-концевых остатков. В последовательностях анемонотоксинов этого типа
содержится больше заряженных и ароматических остатков, что обусловливает их бóльшее
сродство к своим мишеням – NaV-каналам различных типов.
В сотрудничестве с австралийским ученым Р. Нортоном методом спектроскопии ЯМР
Н1 впервые была определена пространственная структура самого токсичного анемонотоксина RTX-III [39]. Установлено, что вторичная структура анемонотоксинов актиний представляет собой уникальный жесткий ββββ-фолд, обнаруженный только у этих соединений
(рис. 2Б, В). Считается, что именно эта структура обеспечивает высокую конформационную стабильность, рН- и термоустойчивость анемонотоксинов актиний.
Первое систематическое исследование структурно-функциональных взаимоотношений анемонотоксинов 2-го типа было проведено с наиболее токсичным представителем
нейротоксинов Radianthus – RTX-III. В экспериментах использовали химическую модификацию аминогрупп Lys и Arg, N-концевого глицина, карбоксильных групп восьми заряженных а.о., включая С-концевой лизин, а также остатков триптофана и сульфгидрильных
групп [15–17]. Полученные данные позволили установить отсутствие в последовательности RTX-III остатка, абсолютно необходимого для функциональной активности полипептида. Это не противоречит классической концепции взаимодействия активного центра молекулы анемонотоксина (с остатком аргинина13 в качестве центра связывания)
с Na+-каналом [33]. Было показано, что разрушение дисульфидных связей приводит к полному падению активности RTX-III, связанному с изменением пространственной структуры, а для проявления функциональной активности анемонотоксина важно наличие протонированных карбоксильных и аминогрупп. Результаты изменения активности RTX-III
после модификации заряженных а.о. молекулы свидетельствовали о том, что его взаимодействие с потенциалчувствительным Na+-каналом в большой степени определяется электростатическими силами и носит многоточечный характер, при котором блокирование
105
одних функционально важных остатков не мешает токсину связываться с каналом другими функционально значимыми остатками [16, 17].
Согласно данным электрофизиологических исследований, RTX-III замедляет фазу реполяризации потенциала действия мышечных и нервных волокон и таким образом ингибирует процесс инактивации NaV-каналов [2]. При этом, как было показано позднее [47],
анемонотоксин взаимодействует с сайтом-3 канала, аминокислотные остатки которого
локализованы на наружной поверхности NaV-канала и не принадлежат его воротному механизму, который локализован во внутриклеточном сегменте поры и отвечает за инактивацию канала. Таким образом, показано, что эффект замедления кинетики инактивации
NaV-канала токсином RTX-III (рис. 2Г) обусловлен аллостерическим взаимодействием аминокислотных остатков полипептида и канала [23], что недавно подтверждено расчетными
данными, показавшими появление межмолекулярных гидрофобных контактов, стабилизирующих образующийся белок-белковый комплекс RTX-III–NaV-канал. Визуализацию
значительных гидрофобных областей на поверхности молекулы RTX-III отражает рис. 2В.
1.2. APETx2-подобные токсины
Из этанольного экстракта нематоцистов H. crispa методами многостадийной
жидкостной хроматографии выделен пептидный токсин (рис. 3), названный π-AnmTX
Hcr 1b-1 [13]. Токсин проявлял высокую летальность на крабах и умеренную – на млекопитающих. Его молекулярная масса составила, согласно данным МАЛДИ ТОФ МС
спектрометрии, 4537 Да.
Рис. 3. Профиль элюции токсина π-AnmTX Hcr 1b-1 на различных стадиях выделения: А – на полихроме-1, Б –
на Cellulose CM-32, В – на Biogel P-6, Г – на BioRex 70, Д – ВЭЖХ на колонке Jupiter C5, Е – ВЭЖХ на колонке
Vydac C18
106
Аминокислотная последовательность, состоящая из 39 N-концевых аминокислотных
остатков, была установлена деградацией полипептидной цепи по методу Эдмана, а два
оставшихся C-концевых остатка были определены с помощью МАЛДИ масс-спектрометрического анализа пептида, частично фрагментированного экзопротеиназой CPY. Таким
образом, токсин π-AnmTX Hcr 1b-1 состоит из 41 аминокислотного остатка:
GTPCKCHGYIGVYWFMLAGCPNGYGYNLSCPYFLGICCVDR.
Поиск гомологов токсина из других видов актиний с помощью алгоритма BLAST
показал, что π-AnmTX Hcr 1b-1 относится к группе APETx2-подобных пептидов-гомологов актиний, таких как APETx2 из Anthopleura elegantissima, представляющих собой токсин-модулятор протончувствительного натриевого канала ASIC3, APETx1 из
A. elegantissima – токсин-модулятор Кv11.1-канала (HERG), BcIV и BcV из Bunadasoma
caissarum – селективные ингибиторы калиевых каналов Kv3.1 и Kv3.2, BgK – ингибитор
калиевых каналов Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3 (Shaker-типа), BсgII и BсgIII из Bunadasoma cangicum –
токсины с неизвестными мишенями. Несмотря на умеренную гомологию аминокислотных последовательностей, все APETx2-подобные токсины имеют общие структурные
мотивы (рис. 4).
Рис. 4. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей APETx2-подобных пептидных токсинов: π-AnmTX Hcr 1b-1 из H. crispa, Bcg III 31.16, Bcg III 28.78 и Bcg III 29.21 из B. cangicum (P86461, P86462
и P86464); BcV из B. caissarum (P84919 и P86470); APETx1 – токсин-модулятор Кv11.1-канала (HERG) (P61541)
и APETx2 – токсин-модулятор ASIC3 канала (P61542) из A. elegantissima. Выделены несовпадающие с последовательностью π-AnmTX Hcr 1b-1 а.о. Темно-серым цветом показаны различающиеся а.о. в последовательности
функционально родственного полипептидного токсина APETx2. Подчеркнуты функционально значимые заряженные а.о. π-AnmTX Hcr 1b-1 и APETx2
Установлено, что токсин π-AnmTX Hcr 1b-1 имеет с APETx2 не только структурное, но
и функциональное подобие: оба токсина оказывают ингибирующее действие на каналы
ASIC3, экспрессированные в ооцитах лягушки Xenopus laevis. Показано, что при аппликации пептида и изменении рН среды проходящий через каналы ток значительно уменьшается (рис. 5А) [13]. Однако измеренная ингибирующая активность π-AnmTX Hcr 1b-1
(IC50 5,5 ± 1,0 мкM) оказалась ниже, чем активность токсина APETx2, которая зависела также и от субъединичного состава протончувствительного канала (IC50 колебалась от 63 нM
для гомомерного ASIC3-канала до 2 мкM для гетеромерных ASIC1a–ASIC3-каналов).
Испытание анальгетической активности π-AnmTX Hcr 1b-1 на «кислотной» модели in
vivo показало, что препарат токсина (в дозе 12,5 мкг/100 мкл физраствора) снижает порог
болевой чувствительности экспериментальных животных. Интересно, что π-AnmTX Hcr
1b-1 показывает анальгетический эффект, сравнимый с действием анальгина (рис. 5В),
при этом его эффективная доза была в 80 раз ниже [19].
Более низкую ингибирующую активность токсина π-AnmTX Hcr 1b-1 можно объяснить
отсутствием в его структуре заряженных аминокислотных остатков (рис. 4), имеющихся
у APETx2, которые, согласно методу компьютерного моделирования, функционально значимы для связывания с различными субъединицами ASICs каналов. Информация о структуре и функции нового представителя пептидных APETx2-подобных токсинов актиний
может иметь важное значение для поиска новых типов ASICs каналов, их сравнительного
107
Рис. 5. Измерение ингибирующей (анальгетической) активности π-AnmTX Hcr 1b-1. А – записи токов через
мембрану с экспрессированными ASIC3 каналами человека, вызванных изменением рН буфера до значения 4,0.
Б – кривая изменения величины пикового компонента тока по сравнению с контролем от концентрации токсина
(по результатам 3 независимых измерений). Непрерывная линия – аппроксимационная кривая при свободном
значении коэффициента Хилла (nHill), равном 0,74 ± 0,09, прерывистая – при nНill = 1. В – анальгетический
эффект π-AnmTX Hcr 1b-1 («кислотная» модель). Ось абсцисс – количество корчей у животного за 15-минутный период времени с момента инъекции раствора уксусной кислоты. Ось ординат: 1 – контрольная группа
животных с предварительной инъекцией анальгина; 2 – контрольная группа животных, инъецированных 1%-м
раствором кислоты; 3 – экспериментальная группа животных, инъецированных 1%-м раствором кислоты после
предварительной инъекции π-AnmTX Hcr 1b-1; 4 – контрольная группа животных, инъецированных равным объемом физраствора. Результаты, обработанные по правилам вариационной статистики, представлены как средние
значения, полученные из 6 независимых экспериментов ± среднеквадратичное отклонение. Достоверность различий вычислена t-критерием Стьюдента, достоверным считается значение при p < 0,05
исследования, а также установления топографии активных центров связывания с пептидными лигандами.
Проведенные нами исследования нейротоксинов Radianthus (Heteractis) внесли значительный вклад в токсинологию. В настоящее время редкая публикация, посвященная
нейротоксинам ядовитых морских кишечнополостных, не цитирует данные по их структурно-функциональным взаимоотношениям, полученные в лаборатории химии пептидов
ТИБОХ ДВО РАН. Поскольку упомянутые выше токсины H. crispa оказались эффективными модификаторами некоторых типов и подтипов ионных NaV-каналов (дисфункции
которых связаны с рядом серьезных заболеваний – каналопатий), можно считать их базисными структурами для создания in silico «дизайнерских» молекул с желаемой селективностью и видоспецифичностью, которые, будучи полученными генно-инженерными методами, помогут создать на их основе потенциальные лекарства, способные направленно
регулировать активность этих каналов.
2. α-Пороформирующие токсины
К настоящему времени из 40 видов актиний выделено и охарактеризовано
немногим более двух десятков индивидуальных актинопоринов, которые принадлежат
к семейству α-пороформирующих токсинов (α-ПФТ) [30]. Литическое действие α-ПФТ
связано с их способностью формировать поры в цитоплазматических мембранах эукари108
от, содержащих сфингомиелин, что обусловливает многие фармакологические эффекты
данных полипептидов [57].
Методами гидрофобной хроматографии (полихром-1), гель-фильтрации (акрилекс П-4),
ионообменной хроматографии (Cellulose CM-32), ионообменной и обращенно-фазовой
HPLC (Ultropac TSK CM-3SW и Silasorb C18, соответственно) из актинии H. crispa нами
выделено четыре индивидуальных актинопорина – RTX-A, RTX-G, RTX-S, RTX-SII
(17–19 кДа) [44, 49]), из Oulactis orientalis – два актинопорина – Or-A и Or-G (17 кДа) [10]),
а также два низкомолекулярных цитолизина – RmI и RmII (6 кДа) [9]. Было установлено,
что цитолитическая активность RTX-A, -G, -S и -SII на 2–3 порядка выше активности
низкомолекулярных цитолизинов [48]. Гемолитическая активность высокомолекулярных
актинопоринов Heteractis (1,0  104–5,0  104 ГЕ/мг) и актинопоринов Oulactis (3,2  103,
3,3  103 ГЕ/мг) ингибируется экзогенным сфингомиелином, активность низкомолекулярных цитолизинов (1,0  103, 1, 3  103 ГЕ/мг) – фосфатидилхолином [9].
Аминокислотная последовательность нативных актинопоринов RTX-A, RTX-SII, Or-A
и Or-G (рис. 6) была установлена сочетанием методов структурной химии белка и молекулярной биологии [11, 41, 44]. Последовательности актинопоринов Heteractis и Oulactis,
а также всех известных на сегодняшний день представителей семейства a-ПФТ актиний
имеют высокую степень структурной гомологии [48]. Интересной структурной особенностью актинопоринов Or-A и Or-G являются укороченные N-концевые фрагменты.
Рис. 6. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей Or-A, Or-G (Swiss-Prot, Q5I4B8,
Q5I2B1) из O. orientalis; RTX-A, RTX-SII (Swiss-Prot, P58691, P0C1F8.1) из H. crispa; EqtII (код Genbank, P17723)
из Aсtinia equinа. На сером фоне показаны идентичные а.о. Выравнивание выполнено с помощью программы
CLUSTALW
Методами молекулярной биологии с применением прямых и вырожденных праймеров
и техники быстрой амплификации кДНК концов (3`, 5`-RACE) установлены нуклеотидные последовательности генов, кодирующих 25 высокогомологичных изоформ актинопоринов Heteractis с N-концевым остатком Ser (рис. 7), принадлежащих к мультигенному
семейству Hct-S [26, 27], которые образуют комбинаторную библиотеку α-ПФТ актинии
H. crispa. Степень идентичности структур новых представителей актинопоринов и ранее
выделенных нативных изоформ RTX-A и RTX-SII составляет от 89 до 99 %.
Согласно модели пространственной 3D-структуры актинопорина RTX-A, построенной
методами гомологичного моделирования, пространственная форма полипептидной цепи
молекулы состоит из двенадцати антипараллельных β-тяжей и представляет собой β-сэндвичевую структуру с двумя короткими α-спиралями (рис. 8А, см. вклейку). N-концевая
α-спираль (16–25 а.о.) принадлежит амфифильному фрагменту (1–28 а.о.), который соединен с белковым β-кором подвижной и высокозаряженной петлей SRK/KRK, С-концевая
α-спираль – высококонсервативному ароматическому кластеру
104-FSVPYDYNWYSNWWNVRIYKGKRRADQRMYEELYY-138,
так называемому РОС-сайту связывания [46], а.о. которого (согласно расчетным данным –
это тирозины 113, 133, 137, 138, а также аргинин 53) участвуют на первом этапе порообразования в связывании с мембранным интерфейсом за счет возникновения прочных
109
Рис. 7. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей актинопоринов семейства Hct-S.
Выделены функционально значимые фрагменты последовательностей, N-концевой (1–28 а.о.) и POC-сайты связывания (104–138 а.о.)
водородных связей, ионного и от одного до трех С-Н...π-взаимодействий с фосфорилхолиновыми головками мембранного сфингомиелина (СМ) и/или фосфатидилхолина (ФХ)
(рис. 8Б, см. вклейку) [50].
Вслед за этим происходят конформационные перестройки N-концевого фрагмента
(рис. 8В), затрагивающие петлю SRK/KRK, которая, подобно шарниру, разворачивает его
и переводит в водно-липидный интерфейс мембраны. Этот процесс сопровождается удлинением α-спирали и завершается ее включением в мембрану, где N-концевые фрагменты
четырех молекул формируют функциональную пору (рис. 8Г) [46].
Для актинопоринов мультигенного семейства Hct-S характерна высокая консервативность остатков, входящих в POC-сайт связывания, а также ряд замен а.о. в области функционально значимого N-концевого фрагмента молекул (рис. 7), определяющего величину
их пороформирующей активности. Во всех последовательностях актинопоринов Heteractis
присутствует трипептид 143ArgGlyAsp145, так называемый RGD-мотив, который, как известно, является сайтом связывания ряда внеклеточных адгезивных белков с мембранными рецепторами, интегринами [55].
Нами показано, что оплодотворенные яйцеклетки морского ежа Strongylocentrotus
intermedius, в мембранах которых отсутствует сфингомиелин, устойчивы к действию
RTX-А, в то время как незрелые яйцеклетки после прединкубации с актинопорином не
110
способны к оплодотворению [48, 50]. Ранее методом дифференциальной сканирующей
калориметрии было установлено, что действие RTX-А на эритроцитарную мембрану вызывает реорганизацию ряда мембранных белков и вымывание из мембраны актина – одного из основных белков цитоскелета [53], который, как известно [35], прочно связан с
мембранными интегринами. Полученные нами данные свидетельствуют о способности
RGD-мотива актинопорина взаимодействовать с внеклеточным доменом интегрина, что
приводит к разрыву связи интегрин–актин, а в случае неоплодотворенной яйцеклетки – к
ее неспособности взаимодействовать со сперматозоидом. Показано, что процесс оплодотворения запускается связыванием RGD-мотива поверхностных белков головки сперматозоида с сайтом связывания интегрина, локализованным между его внеклеточными α- и
β-субъединицами [58], что инициирует дальнейшую дифференцировку и развитие яйцеклетки (рис. 9).
Рис. 9. Взаимодействие актинопорина RTX-A и спермиев морского ежа S. intermedius с яйцеклетками ежа. А –
схема процесса оплодотворения яйцеклетки. Б – действие RTX-A на оплодотворенную яйцеклетку. В – действие
RTX-A на неоплодотворенную яйцеклетку, ингибирующее процесс оплодотворения [50]
Изучено противоопухолевое действие RTX-A по отношению к опухолевым клеткам
линий HeLa, THP-1, MDA-MB-231 и SNU-C4 [36], мембраны которых, как известно, содержат интегрины. Обнаруженный нами эффект можно объяснить не только пороформирующим действием актинопорина, но и сопровождающим его белок-белковым взаимодействием полипептида с этими мембранными рецепторами. Это согласуется с литературными
данными, свидетельствующими об антиопухолевой активности RGD-содержащих пептидов и полипептидов, специфически взаимодействующих с мембранными интегринами
опухолевых клеток [43].
Нами исследован также механизм мембранолитического действия актинопоринов на
биологические (эритроциты млекопитающих, яйцеклетки морского ежа) и модельные
мембраны (липосомы и бислойные липидные мембраны различного липидного состава).
Показано, что актинопорины формируют в мембранах ионные каналы – поры диаметром
около 1–2 нм (рис. 10), селективные для катионов [10, 14, 20].
К настоящему времени выполнена экспрессия и охарактеризованы рекомбинантные
актинопорины rHct-S3, rHct-S5 и rHct-S6 [26, 27], гемолитическая активность которых
составляет 1,0  10-3, 1,0  10-3 и 3,3  10-4 ГЕ/мг белка, соответственно.
Данные о первичной структуре актинопоринов Heteractis и результаты, полученные
при их биохимических и биофизических исследованиях, позволили высказать гипотезу об
111
Рис. 10. Проводимость БЛМ, индуцированная актинопоринами H. crispa и O. orientalis. Запись тока через БЛМ:
А – в присутствии RTX-A, Б – в присутствии Or-A и Or-G при мембранном потенциале 40 мВ
альтернативном взаимодействии актинопоринов (в отсутствие сфингомиелина в мембране) с интегринами, белковыми рецепторами мембран, что хорошо объясняет проявляемые
ПФТ фармакологические эффекты (антиопухолевый, антипаразитарный, кардиотропный)
[18]. Согласно литературным данным, актинопорины представляют собой привлекательный объект для конструирования и биотехнологического получения на их основе фармакологических агентов, которые способны проявлять антиопухолевое, антипаразитарное,
антимикробное действие на клетки-мишени без повреждения здоровых клеток [32, 56].
3. Полифункциональные ингибиторы протеиназ семейства Кунитца
В последние годы проводимые в лаборатории химии пептидов ТИБОХ ДВО
РАН интенсивные комплексные исследования полипептидов актиний нацелены главным
образом на их прикладное использование в будущем. В частности, было установлено, что
огромное количество полипептидов, продуцируемых актинией H. crispa, структурно гомологичны ингибиторам протеиназ семейства Кунитца. Оказалось, что некоторые из них
способны модифицировать болевой ваниллоидный TRPV1 рецептор и потенциалзависимые калиевые каналы некоторых типов (KVs).
Комбинацией традиционных методов очистки белков (гидрофобная хроматография на
полихроме 1, гель-фильтрация на биогеле P-4, ионообменная хроматография на SP-Sephadex G-25 и обращенно-фазовая ВЭЖХ на колонке Nucleosil C18) из актинии H. crispa нами
выделены новые нативные полипептиды Jn-IV, InhVJ, HCPR1, HCPR2, APHC1, APHC2 и
APHC3, из тропической актинии Heteractis magnifica – три новых ингибитора сериновых
протеиназ (HMI1, HMI2 и HMI3). После алкилирования, трипсинолиза и секвенирования
полученных пептидов по методу Эдмана была определена полная аминокислотная последовательность полипептидов Jn-IV [7], InhVJ [37], APHC1, APHC2, APHC3 [1, 12, 31] и
частичная – полипептидов HCPR1, HCPR2 [22], HMI1, HMI2 и HMI3 [21] (рис. 11).
Полипептиды имеют от одной до нескольких точечных замен в аминокислотных последовательностях, и по высокой степени гомологии, консервативному расположению
остатков цистеина, значениям молекулярных масс (около 6 кДа) и наличию трипсинингибирующей активности они были отнесены к семейству ингибиторов сериновых протеиназ
Кунитц-типа. Помимо трипсинингибирующей активности полипептиды APHC1, APHC2 и
APHC3 проявляли анальгетическое действие в экспериментах in vivo [1, 12, 31].
Методом Диксона определены константы ингибирования сериновых протеиназ полипептидом InhVJ. Показано, что InhVJ является высокоспецифичным ингибитором, поскольку связывается только с двумя сериновыми протеиназами, трипсином (с Ki = 7,38 × 10-8 М)
и α-химотрипсином (с Ki = 9,93 × 10-7 М) [37].
Для выяснения молекулярного механизма взаимодействия InhVJ с сериновыми протеиназами методами компьютерного моделирования (молекулярный докинг и молекулярная динамика) была построена модель комплекса InhVJ–трипсин (рис. 12, см. вклейку)
112
Рис. 11. Множественное выравнивание полной аминокислотной последовательности полипептидов Jn-IV,
InhVJ, APHC1, APHC2, APHC3 и частичной – HCPR1, HCPR2, HMI1, HMI2 и HMI3. На сером фоне показаны а.о. цистеина
и определены функционально значимые а.о. реакционного центра и сайта слабых взаимодействий молекулы InhVJ, принимающие участие в связывании.
Установлено, что в каноническом механизме взаимодействия InhVJ с трипсином и
α-химотрипсином участвует также аминокислотный остаток Glu45, локализованный
рядом с сайтом слабых взаимодействий, который вносит значительный отрицательный
вклад в энергию комплексообразования и дополнительно стабилизирует образующийся
комплекс. Анализ механизма взаимодействия, проведенный с помощью программы МОЕ,
показал, что процесс комплексообразования управляется ван-дер-ваальсовыми, гидрофобными и электростатическими взаимодействиями, а комплекс стабилизируется водородными связями [37].
Методами молекулярной биологии при помощи техники быстрой амплификации
кДНК концов (3`, 5`-RACE) с использованием прямых и обратных вырожденных праймеров установлены нуклеотидные последовательности 33 генов, кодирующих высокогомологичные аминокислотные последовательности с N-концевым остатком глицина, которые представляют собой мультигенное семейство зрелых полипептидов Кунитц-типа,
названных нами HCGS-полипептидами [28], которые так же, как и актинопорины семейства Hct-S, образуют комбинаторную библиотеку Кунитц-полипептидов актинии H. crispa
(рис. 13).
Все выведенные аминокислотные последовательности имеют высокую степень гомологии (до 98 %) с последовательностями известных нативных ингибиторов сериновых протеиназ Кунитц-типа как из H. сrispa, так и из других видов актиний. Последовательность
нативного полипептида InhVJ оказалась аналогична последовательности HCGS 1.27. Но,
в отличие от большинства выведенных последовательностей (рис. 13), в P1 позиции реакционного центра молекул нативных ингибиторов InhVJ, Jn-IV, APHC1, APHC2 и APHC3
локализован остаток треонина. Для установления функциональной специализации представителей библиотеки был проведен структурно-функциональный и филогенетический
анализ HCGS-полипептидов, а также всех известных ингибиторов Кунитц-типа из других
видов актиний. Построено их NJ-филогенетическое дерево (рис. 14А, см. вклейку), методом гомологичного моделирования построены высокоточные модели пространственных
структур, рассчитан молекулярный электростатический потенциал (МЭП) и построены
эквипотенциальные поверхности, представляющие собой трехмерную визуализацию
МЭП (рис. 14B), который является важной характеристикой белковой молекулы и определяет ее специфичность и кинетику молекулярного связывания с мишенью [42].
Как видно из рис. 14, последовательности нативных полипептидов APHC1, APHC2,
APHC3, InhVJ, Jn-IV, образуют совместно с несколькими выведенными последовательностями отдельный кластер, названный нами анальгетическим. На основании проведенного
113
Рис. 13. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей HCGS-полипептидов актинии
H. сrispa. SHPI-I и SHPI-II – нативные ингибиторы Кунитц-типа из актинии Stihodactyla helianthus. Звездочками
показано местоположение функционально значимых а.о. полипептидов, реактивного центра (12–17 а.о.), сайта
слабых взаимодействий (33–38 а.о.) и а.о. в Р1 положении реактивного центра
структурно-функционального и филогенетического анализа высказано предположение, что
все HCGS-полипептиды произошли от одного гена-предшественника и эволюционировали вследствие тандемной дупликации генов с последующей адаптивной дивергенцией P1
остатка реактивного центра, которая привела к сохранению функциональной специализации одних и диверсификации других представителей комбинаторной библиотеки. Благодаря этому некоторые полипептиды анальгетического кластера стали полифункциональными
и помимо ингибирующей активности по отношению к сериновым протеиназам приобрели
способность оказывать блокирующее действие на болевой TRPV1-рецептор [42].
Для установления механизма взаимодействия входящих в состав комбинаторной
библиотеки HCGS-полипептидов с сериновыми протеиназами методами молекулярного
докинга и биоинформационного анализа изучены теоретические 3D-структуры комплексов ряда представителей комбинаторной библиотеки с трипсином, α-химотрипсином,
114
эластазой нейтрофилов человека (hnE) и катепсином G (CG) (рис. 15–17, см. вклейку)
[25, 38, 59].
Так, для одного из полипептидов комбинаторной библиотеки (HCGS2.23) показано, что
он образует устойчивые комплексы с трипсином (Kd порядка 10-12 М) не только с участием
канонической петли, но и по альтернативному типу связывания, т.е. с участием концевой
α-спирали молекулы полипептида (рис. 15) [38], при котором происходит экранирование
области активного сайта, но нет непосредственного взаимодействия с каталитической
триадой фермента. Данная стратегия обеспечивает еще большее расширение специфичности действия ингибиторов Кунитц-типа.
Следует отметить, что, несмотря на множество мишеней и разнообразие механизмов
ингибирования, большинство ингибиторов протеиназ связывается именно с активным
центром протеиназ. По-видимому, данная стратегия обеспечивает высокую эффективность ингибирования, поскольку родственные протеиназы имеют обычно высокую степень гомологии именно в области активного центра, и субстратоподобное взаимодействие
обеспечивает возможность ингибирования целого ряда протеиназ, тем самым оказывая
влияние на множество биологических процессов.
Расчетные данные, полученные при моделировании (молекулярный докинг) комплексов полипептидов APHC1–APHC3 из анальгетического кластера (рис. 14) [1, 12, 31] с
болевым TRPV1 рецептором, показали, что во взаимодействие с этими полипептидами
вступают две (или более) субъединицы рецептора (рис. 18) [3].
Анализ межмолекулярных контактов в предложенной модели пространственной структуры комплекса APHC1–TRPV1 позволил выявить функционально значимые для образования комплекса и модуляции ингибиторной активности анальгетических полипептидов
аминокислотные остатки и структурные элементы: а.о. Thr14, Tyr16, Phe17, Val31, Glu38 и
Arg/His48 (рис. 19, см. вклейку). Эти результаты коррелируют с ранее полученными данными в экспериментах in vivo [31]. Установлено, что помимо указанных аминокислотных
остатков в образовании комплекса APHC1–TRPV1 принимают участие также Gly1, Glu6
и Arg51 [3].
На основании анализа полученной структурной модели комплекса APHC1–TRPV1
мы предложили гипотезу, объясняющую блокирующее действие анальгетического полипептида его связыванием с внутриклеточными доменами TRPV1, которое препятствует
свободному открытию и закрытию рецептора, что приводит к увеличению времени его
релаксации и ~35%-му ингибированию функциональной активности [3]. Это предположение не противоречит экспериментальным данным, которые свидетельствуют о медленном
возрастании развития анальгетического эффекта под действием полипептида [1]. Таким
образом, отдельные представители комбинаторной библиотеки H. сrispa обладают противовоспалительным действием и могут стать перспективными моделями для разработки
селективных противовоспалительных препаратов направленного действия.
Необходимо отметить, что помимо комбинаторной библиотеки HCGS-полипептидов
у актинии H. сrispa обнаружена также библиотека HCRG-полипептидов, насчитывающая
33 представителя Кунитц-полипептидов с N-концевым аргинином и лизином в положении Р1 реактивного сайта [28]. Они обладают, согласно расчетным и экспериментальным
данным, более высокой, чем HCGS-полипептиды, трипсинингибирующей активностью.
Методами молекулярной биологии получено также 6 аминокислотных последовательностей HCTX-полипептидов Кунитц-типа [28], токсичных по отношению к KV-каналам,
высокогомологичных нативному ингибитору калиевых каналов SHTX III из актинии
Stichodactyla haddoni [40].
Поскольку HCGS-полипептиды анальгетической группы имеют очень высокую степень идентичности остатков в положениях, функционально значимых для взаимодействия
с ТRPV1 рецептором, можно предположить, что они также полифункциональны. Однако
оказалось, что, в отличие от других представителей анальгетического кластера [37], поли115
Рис. 20. Записи токов: А – на различных типах каналов, Б – на TRPV1 рецепторе (конфигурация клетки «wholecell») в электрофизиологическом исследовании ингибиторной активности InhVJ (10 мкM) при проведении контрольных измерений токов, вызываемых модуляторами каналов, капсаицином CAP (2 мкM) и капсазепином CZP
(10 мкM). Горизонтальной линией показан нулевой уровень токов, звездочками – стационарные токи после приложения 50 мкM ингибитора. Отмечается отсутствие модулирующей активности при аппликации InhVJ [31]
пептид InhVJ не проявлял модулирующее действие при электрофизиологическом тестировании на TRPV1 рецепторе и KV-каналах различных типов (рис. 20) [31].
С целью дальнейшего структурно-функционального исследования ингибиторов Кунитц-типа актинии H. crispa были получены рекомбинантные аналоги нативного полипептида InhVJ [29] и двух HCGS-полипептидов комбинаторной библиотеки: HCGS 1.10 и
HCGS 1.36 [24, 54] – представителей анальгетического кластера филогенетического дерева
(рис. 14), обеспечивающих, согласно расчетным данным, специфичность взаимодействия с
сериновыми протеиназами и TRPV1 рецептором. С помощью МАЛДИ ТОФ МС спектрометрии была определена чистота и молекулярная масса рекомбинантов. Нативный InhVJ и его
рекомбинантная форма совпали по хроматографической подвижности, значениям молекулярных масс (6117,23 Да) и констант ингибирования трипсина (0,73 × 10-9 М) [29]. Полученные данные свидетельствуют о функциональной активности rInhVJ. Определены Ki полипептидов rHCGS 1.10 и rHCGS 1.36, величины которых соответствуют Ki нативного InhVJ.
Таким образом, нашими многолетними исследованиями показано, что актиния H. crispa
является богатым и перспективным источником новых разнообразных полипептидов.
Продолжение этих исследований открывает большие перспективы обнаружения новых
нейротоксинов и полифункциональных полипептидов Кунитц-типа. Разработанные методы получения рекомбинантных полипептидов Кунитц-типа актинии позволят использовать их в качестве инструмента исследования функциональной активности протеолитических ферментов, болевого TRPV1 рецептора, ионных Kv-каналов, а также разработки на
их основе лекарственных препаратов нового поколения.
Авторы выражают благодарность бывшим сотрудникам лаборатории химии пептидов ТИБОХ ДВО РАН
Т.А. Зыковой, Е.И. Вожжовой, В.М. Махнырю, Т.В. Швец, О.В. Апаликовой, Н.Н. Кофановой, А.Н. Филитову,
С.А. Захарову, А.П. Ильиной, В.Е. Чаусовой, Е.С. Ткачевой, а также другим сотрудникам института: М.П. Исаевой,
116
Г.Н. Лихацкой, К.В. Гузеву, Т.И. Вакориной, С.Н. Федорову, С.А. Дышловому, О.В. Черникову, П.С. Дмитренку,
С.А. Анастюку, О.Н. Кривошапко – за их значительный вклад в исследование полипептидов актиний.
ЛИТЕРАТУРА
1. Андреев Я.А., Козлов С.А., Козловская Э.П., Гришин Е.В. Анальгетическое действие пептидного
ингибитора TRPV1-рецептора в моделях тепловой стимуляции боли // Докл. АН. 2009. Т. 424, № 5. С. 424–691.
2. Байдан Л.B., Козловская Э.П., Тишин С.М. Действие анемонотоксина на нервно-мышечную передачу в
скелетных и гладких мышцах // Докл. АН СССР. 1981. Т. 259, № 4. С. 1000–1002.
3. Зелепуга Е.А., Табакмахер В.М., Чаусова В.Е., Монастырная М.М., Исаева М.П., Козловская Э.П. Взаимодействие полипептидов Кунитц-типа актинии Heteractis crispa с болевым ваниллоидным рецептором ТRPV1:
in silico исследование // Биоорган. химия. 2012. T. 38, № 2. С. 185–198.
4. Зыкова Т.А., Козловская Э.П. Аминокислотная последовательность нейротоксина I из актинии Radianthus
macrodactylus // Биоорган. химия. 1989. Т. 15, № 10. С. 1301–1306.
5. Зыкова Т.А., Винокуров Л.М., Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Аминокислотная последовательность
нейротоксина III из актинии Radianthus macrodactylus // Биоорган. химия. 1985. Т. 11, № 3. С. 302–310.
6. Зыкова Т.А., Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Аминокислотная последовательность нейротоксинов IV и V из
актинии Radianthus macrodactylus // Биоорган. химия. 1988. Т. 14, № 11. С. 1489–1494.
7. Зыкова Т.А., Винокуров Л.М., Маркова Л.Ф. Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Аминокислотная
последовательность трипсинового ингибитора II из Radianthus macrodactylus // Биоорган. химия. 1985. T. 11,
№ 3. C. 293–301.
8. Зыкова Т.А., Козловская Э.П. Дисульфидные связи в нейротоксине III из актинии Radianthus macrodactylus
// Биоорган. химия. 1989. Т. 15, № 7. С. 904–907.
9. Зыкова T.A., Монастырная M.M., Апаликова O.B., Швец Т.В., Козловская Э.П. Низкомолекулярные
цитолизины и ингибиторы трипсина из актинии Radianthus macrodactylus. Выделение и частичная характеристика
// Биоорган. химия. 1998. Т. 24. С. 509–516.
10. Ильина А.П., Монастырная М.М., Сокотун И.Н., Егоров Ц.А., Назаренко Ю.А., Лихацкая Г.Н., Козловская Э.П. Актинопорины из актинии Японского моря Oulactis orientalis: выделение и частичная характеристика
// Биоорган. химия. 2005. Т. 31, № 1. С. 39–48.
11. Ильина А.П., Монастырная М.М., Исаева М.П., Гузев К.В., Рассказов В.А., Козловская Э.П. Первичная
структура актинопоринов актинии Oulactis orientalis // Биоорган. химия. 2005. Т. 31, № 4. C. 357–362.
12. Козлов С.А., Андреев Я.А., Мурашев А.Н., Скобцов Д.И., Дьяченко И.А., Гришин Е.В. Новые
полипептидные компоненты с анальгетической активностью из морской анемоны Heteractis crispa // Биоорган.
химия. 2009. Т. 35, № 6. С. 789–798.
13. Козлов С.А., Осмаков Д.И., Андреев Я.А., Кошелев С.Г., Гладких И.Н., Монастырная М.М., Козловская Э.П., Гришин Е.В. Полипептидный токсин из морской анемоны, ингибирующий протончувствительный
канал ASIC3 // Биоорган. химия. 2012. Т. 38, № 6. С. 653–659.
14. Козловская Э.П., Иванов А.С., Мольнар А.А., Григорьев П.А., Монастырная М.М., Халилов Э.М.,
Еляков Г.Б. Ионные каналы в мембранах, индуцированные гемолизином из актинии Radianthus macrodactylus
// Докл. АН СССР. 1984. Т. 277, № 6. С. 1491–1493.
15. Махнырь В.М., Козловская Э.П. Модификация нейротоксина из актинии Radianthus macrodactylus
уксусным ангидридом // Биоорган. химия. 1989. Т. 15, № 4. С. 465–470.
16. Махнырь В.М., Козловская Э.П. Модификация нейротоксина RTX-III из морской актинии Radianthus
macrodactylus // Биоорган. химия. 1990. Т. 16, № 5. С. 643–648.
17. Махнырь B.M., Козловская Э.П. Необычный результат модификации анемонотоксина RTX-III малоновым
альдегидом // Химия природ. соединений. 1989. № 3. С. 383–387.
18. Монастырная М.М. Мембраноактивные токсины актиний: характеристика, структура, механизм
действия. Saarbrücken, Germany: Palmarium Acad. Publishing GmbH & Co, 2013. 310 c. – https://www.palmarium-publishing.ru/extern/listprojects
19. Полипептид из морской анемоны Heteractis crispa, обладающий анальгетическим действием: пат.
2475497 Российская Федерация / Э.П. Козловская, М.М. Монастырная, И.Н. Гладких, В.М. Табакмахер,
О.Н. Кривошапко, С.А. Козлов, Д.И. Осмаков, Я.А. Андреев, С.Г. Кошелев, Е.В. Гришин. ТИБОХ ДВО РАН;
ИБХ РАН. Опубл. 20.02.2013, Бюл. № 5.
20. Руднев В.С., Лихацкая Г.Н., Козловская Э.П., Монастырная М.М., Еляков Г.Б. Влияние гемолизина из
морской актинии Radianthus macrodactylus на проводимость липидных мембран // Биол. мембраны. 1984. Т. 1,
№ 10. С. 1019–1024.
21. Синцова О.В., Гладких И.Н., Монастырная М.М., Козловская Э.П. Ингибитор семейства Кунитца
из Heteractis magnifica, потенциальный блокатор болевого ваниллоидного рецептора (TRPV1) // Материалы
V Междунар. науч.-практ. конф. «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в
физиологии и медицине», Санкт-Петербург, 14–15 ноября 2013 г. СПб.: Политехн. ун-т, 2013. С. 88–93.
22. Синцова О.В., Гладких И.Н., Лейченко Е.В., Монастырная М.М., Козловская Э.П. Новые ингибиторы
протеиназ Kунитц-типа из тропических актиний рода Heteractis // Материалы I Межрегион. молодежной школы-
117
конф. «Актуальные проблемы биологических наук», Владивосток, 13–18 мая 2013 г. Владивосток: Русский
остров, 2013. С. 276–278.
23. Сорокина З.А., Чижмаков И.В., Еляков Г.Б., Козловская Э.П., Вожжова Е.И. Исследование механизма
инактивации быстрых натриевых каналов с помощью нейротоксина из актинии Radianthus macrodactylus и
различных химических реагентов // Физиол. журн. 1984. Т. 30, № 5. С. 571–579.
24. Табакмахер В.М., Зелепуга Е.А., Гладких И.Н., Синцова О.В., Монастырная М.М., Козловская Э.П.
Анальгетические полипептиды Кунитц-типа актинии Heteractis crispa: прогнозирование и получение новых
представителей методами генной инженерии // Материалы конф. молодых ученых «Взгляд в будущее»,
Владивосток, 14 ноября 2013 г. Владивосток: ДВО РАН, 2013. С. 52–65.
25. Табакмахер В.М., Гладких И.Н., Монастырная М.М., Зелепуга Е.А. Теоретические пространственные
модели молекулярного комплекса полипептида HCGS-2.23 из актинии Heteractis crispa с трипсином // Материалы
Междунар. заочной науч.-практ. конф. «Актуальные проблемы биологии, химии, физики», Новосибирск, 27 дек.
2011 г. Новосибирск: ЭКОР-книга, 2011. С. 107–114.
26. Ткачева Е.С. Гетерологичная экспрессия, выделение и очистка рекомбинантного белка Hct-A3 актинии
Heteractis crispa // Материалы Междунар. заоч. науч.-практ. конф. «Актуальные проблемы биологии, химии,
физики», Новосибирск, 27 дек. 2011 г. Новосибирск: ЭКОР-книга, 2011. С. 17–22.
27. Ткачева Е.С., Лейченко Е.В., Монастырная М.М., Исаева М.П., Зелепуга Е.А., Анастюк С.Д., Дмитренок П.С., Козловская Э.П. Новые актинопорины из актинии Heteractis crispa: клонирование и функциональная
экспрессия // Биохимия. 2011. Т. 10. С. 1387–1397.
28. Чаусова В.Е. Полипептиды Кунитц-типа актинии Heteractis crispa: структура, функция и причины
многообразия изоформ: дис. … канд. хим. наук / Тихоокеан. ин-т биоорган. химии ДВО РАН. Владивосток, 2012.
128 с.
29. Чаусова В.Е., Табакмахер В.М. Функциональная экспрессия ингибитора сериновых протеиназ Кунитцтипа InhVJ из тропической актинии Heteractis crispa // Материалы Междунар. заочной научно-практ. конф.
«Актуальные проблемы биологии, химии, физики», Новосибирск, 27 дек. 2011 г. Новосибирск: ЭКОР-книга,
2011. С. 49–53.
30. Anderluh G., Maček P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria) // Toxicon. 2002. Vol. 40. P. 111–124.
31. Andreev Y.A., Kozlov S.A., Koshelev S.G., Ivanova E.A., Monastyrnaya M.M., Kozlovskaya E.P., Grishin E.V.
Analgesic compound from sea anemone Heteractis crispa is the first polypeptide inhibitor of vanilloid receptor
1 (TRPV1) // J. Biol. Chem. 2008. Vol. 283, N 35. P. 23914–23921.
32. Avila A.D., Mateo de Acosta C., Lage A. A carcinoembryonic antigen-directed immunotoxin built by linking a
monoclonal antibody to a hemolytic toxin // Int. J. Cancer. 1988. Vol. 42. P. 568–571.
33. Barhanin J., Hugues M., Schweitz H., Vincent J.-P., Lazdunski M. Structure-function relationships of sea
anemone toxin II from Anemonia sulcata // J. Biol. Chem. 1981. Vol. 256, N 11. P. 5764–5769.
34. Bosmans F., Tytgat J. Sea anemone venom as a source of insecticidal peptides acting on voltage-gated Na+ channels // Toxicon. 2007. Vol. 49, N 4. P. 550–560.
35. Burke R.D., Murray G., Rise M., Wang D. Integrins on eggs: the beta C subunit is essential for formation of the
cortical actin cytoskeleton in sea urchin eggs // Develop. Biol. 2004. Vol. 265, N 1. P. 53–60.
36. Fedorov S.N., Dyshlovoy S.F., Monastyrnaya M.M., Shubina L.K., Leychenko E.V., Kozlovskaya E.P., Jin
Jun-O, Kwak J.-Y., Bode A.M., Dong Z., Stonik V.A. The anticancer effects of actinoporin RTX-A from the sea anemone
Heteractis crispa (= Radianthus macrodactylus) // Toxicon. 2010. Vol. 55, N 4. P. 811–817.
37. Gladkikh I.N., Monastyrnaya M.M., Leychenko E.V., Zelepuga E.A., Chausova V.E., Isaeva M.P., Anastyuk S.D., Andreev Y.A., Peigneur S., Tytgat J., Kozlovskaya E.P. A typical Reactive Center Kunitz-Type Inhibitor from
the Sea Anemone Heteractis crispа // Mar. Drugs. 2012. Vol. 10, N 7. P. 1545–1565.
38. Gladkikh I.N., Leychenko E.V., Monastyrnaya M.M., Chausova V.E., Isaeva M.P., Zelepuga E.A., Likhatskaya G.N., Kozlovskaya E.P. Multifunctional group of P1 Thr Kunitz-type inhibitors from the sea anemone Heteractis
crispa // Thes. Reps 9th IST Asia Pacific meeting «Animal, Plant and Microbial Toxins», Vladivostok, Russia, 4–8 sept.
2011. Владивосток: Дальнаука, 2011. P. 49.
39. Hinds M.G., Norton R.S. Solution structure of the eukaryotic pore-forming cytolysin equinatoxin II: implications for pore formation // J. Protein Chem. 1993. Vol. 12, N 3. P. 371–78.
40. Honma T., Kawahata S., Ishida M., Nagai H., Nagashima Y., Shiomi K. Novel peptide toxins from the sea
anemone Stichodactyla haddoni // Peptides. 2008. Vol. 4. P. 536–544.
41. Il’ina A.P., Lipkin A.В., Barsova E.В., Issaeva M.P., Leychenko E.V., Gusev K.V., Monastyrnaya M.M.,
Lukyanov S.А., Kozlovskaya E.P. Amino acid sequence of RTX-A’s isoform actinoporin from the sea anemone
Radianthus macrodactylus // Toxicon. 2006. Vol. 47. P. 517–520.
42. Isaeva M.P., Chausova V.E., Zelepuga E.A., Guzev K.V., Tabakmakher V.M., Monastyrnaya M.M., Kozlovskaya E.P. A New Multigene Superfamily of Kunitz-Type Protease Inhibitors from Sea Anemone Heteractis crispa
// Peptides. 2012. Vol. 34. P. 88–97.
43. Janssen M.L., Oyen W.J., Dijkgraaf I., Massuger L.F., Frielink C., Edwards D.S., Rajopadhye M., Boonstra H.,
Corstens F.H., Boerman O.C. Comparison of a monomeric and dimeric radiolabeled RGD-peptide for tumor targeting
// Cancer Res. 2002. Vol. 62. P. 6146–6151.
118
44. Klyshko E.V., Issaeva M.P., Monastyrnaya M.M., Il’ina A.P., Guzev K.V., Vakorina T.I., Dmitrenok P.S.,
Zykova T.A., Kozlovskaya E.P. Isolation, properties and partial amino acid sequence of a new actinoporin from the sea
anemone Radianthus macrodactylus // Toxicon. 2004. Vol. 44. P. 315–324.
45. Lewis R.J., Garcia M.L. Therapeutic potential of venom peptides // Nat. Rev. Drug Discov. 2003. Vol. 2, N 10.
P. 790–802.
46. Mancheño J.M., Martin-Benito J., Martínez M., Gavilanes J.G., Hermoso J.A. Crystal and electron microscopy
structures of sticholysin II actinoporin reveal insights into the mechanism of membrane pore formation // Structure.
2003. Vol. 11. P. 1–20.
47. Messerli S.M., Greenberg R.M. Cnidarian toxins acting on voltage-gated ion channels // Mar. Drugs. 2006.
Vol. 4. P. 70–81.
48. Monastyrnaya M.M., Leychenko E.V., Issaeva M.P., Likhatskaya G.N., Zelepuga E.A., Kostina E.В.,
Trifonov E.А., Nurminski E.А., Kozlovskaya E.P. Actinoporins from the sea anemones, tropical Radianthus macrodactylus and northern Oulactis orientalis: comparative analysis of structure-function relationships // Toxicon. 2010.
Vol. 56. P. 1299–1314.
49. Monastyrnaya M.M., Zykova T.A., Apalikova O.V., Shwets T.V., Kozlovskaya E.P. Biologically active polypeptides from the tropical sea anemone Radianthus macrodactylus // Toxicon. 2002. Vol. 40. P. 1197–1217.
50. Monastyrnaya M.M., Zelepuga E.A., Leychenko E.V., Likchatskaya G.N., Agafonova I.G., Fedorov S.N.,
Kozlovskaya E.P. Sea anemone actinoporin interaction with membranes: why and how? // Thes. Reps 9th IST Asia Pacific
meet. «Animal, Plant and Microbial Toxins», Vladivostok, Russia, 4–8 sept. 2011. Владивосток: Дальнаука, 2011.
P. 75.
51. Noda M., Shimizu S., Tanabe T., Takai T., Kayano T., Ikeda T., Takahashi H., Nakayama H., Kanaoka Y.,
Minamina N., Kangawa K., Matsuo H., Raftery M.A., Hirose T., Inayama S., Hayashida H., Miyata T., Numa S.
Primary structure of Electrophorus electricus sodium channel deduced from cDNA sequence // Nature. 1984. Vol. 312.
P. 121–127.
52. Payandeh J., Scheuer T., Zheng N., Catterall W.A. The crystal structure of a voltage-gated sodium channel
// Nature. 2011. Vol. 475. P. 353–358.
53. Shnyrov V.L., Monastyrnaya M.M., Zhadan G.G., Kuznetsova S.M., Kozlovskaya E.P. Calorimetric study of
interaction of toxin from Radianthus macrodactylus with erythrocyte membrane // Biochem. Int. 1992. Vol. 26.
P. 219–229.
54. Tabakmakher V.M., Gladkikh I.N., Zelepuga E.A., Monastyrnaya M.M., Osmakov D.I., Kozlovskaya E.P. New
recombinant Kunitz-type polypeptides of sea anemone Heteractis crispa // Thes. Reps of 2th Int. Symp. on Life Sciences,
Vladivostok, Russia, 4–9 sept. 2013. Владивосток: Дальнаука, 2013. P. 78.
55. Takagi J. Molecular Environment of Integrins. Structural basis for ligand recognition by RGD (Arg-Gly-Asp)dependent integrins // Biochem. Soc. Transactions. 2004. Vol. 32. P. 403–406.
56. Tejuca M., Anderluh G., Dalla Serra M. Sea anemone cytolysins as toxic component of immunotoxins // Toxicon. 2009. Vol. 54. P. 1206–1214.
57. Turk T., Kem W.R. The phylum Cnidaria and investigations of its toxins and venoms until 1990 // Toxicon. 2009.
Vol. 54. P. 1031–1037.
58. Yue L.M., Zhang L., He Y.P., Zhang J.H., Zheng J., He Y.F., Zheng Y., Zhang J., Zhang L. Reorganization of
cytoskeletal proteins of mouse oocytes mediated by integrins // Science in China. Ser. C-Life Science. 2004. Vol. 47.
P. 540–544.
59. Zelepuga EA., Tabakmakher V.M., Monastyrnaya M.M., Lukyanov P.A., Kozlovskaya E.P. In silico investigation of interaction between human neutrophil elastase and sea anemone Heteractis crispa Kunitz polypeptide // Proc.
of the 5th intern. conf. «Bioinformatics and biomedical engineering». Wuhan, China, 10–12 may 2011. Wuhan: Institute
of Electrical and Electronics Engineers (IEEE), 2011. P. 1–4. –http://ieeexplore.ieee.org/xpl/articleDetails.jsp?arnumber=5780140.
119