Молекулярная динамика белков и полипептидов. Исследование методом релаксационной и обменной ЯМР-спектроскопии.
advertisement
Казанский Институт Биохимии и Биофизики Казанского Научного Центра Российской Академии Наук На правах рукописи Крушельницкий Алексей Германович Молекулярная динамика белков и полипептидов. Исследование методом релаксационной и обменной ЯМР-спектроскопии. 01.04.07 – физика конденсированного состояния Диссертация на соискание ученой степени доктора физикоматематических наук Научный консультант доктор физико-математических наук, профессор Федотов Владимир Дмитриевич Казань, 2006 Содержание 5 Введение ГЛАВА 1. ЯМР-МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ДИНАМИКИ БЕЛКОВ И ПРИМЕРЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ (литературный обзор) 1.1. 1.2. 15 Природные зонды, дающие информацию о молекулярной динамике посредством ядерного магнитного резонанса 15 Форма линии спектра ЯМР твердого тела, обусловленная анизотропией химического сдвига 17 1.3. Вращение образца под магическим углом 22 1.4. Двумерные обменные ЯМР-эксперименты 26 1.5. Одномерные обменные ЯМР-эксперименты 34 1.6. ЯМР-релаксация 40 1.7. Корреляционная функция молекулярного движения и безмодельный подход 43 1.8. ЯМР и химический обмен в белковых растворах 47 1.9. Особенности проведения ЯМР-экспериментов различных магнитных ядрах на 1.10. Конформационная динамика белков 51 54 1.10.1. Белки в растворе 54 1.10.2. Белки в твердом состоянии 57 1.10.3. Обобщающие замечания 75 ГЛАВА 2. БРОУНОВСКАЯ ДИНАМИКА И МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ЭЛЕКТРОСТАТИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БЕЛКОВ В РАСТВОРЕ 79 2.1. Качественная модель межмолекулярных электростатических взаимодействий 79 2.2. ЯМР-релаксационные эксперименты на протонах белков в растворах тяжелой воды 85 2.2.1. Методы измерения и анализа времен релаксации 85 2.2.2. Результаты экспериментов и их обсуждение 93 2.3. Анализ дисперсий времен релаксации воды в растворах белков 101 2.4. Диэлектрические эксперименты в растворах миоглобина 108 2.5. Теоретические оценки энергии межмолекулярного электростатического взаимодействия белков и компьютерное моделирование броуновской динамики электрических диполей 2 112 2.6. Заключение ко второй главе 118 ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ВНУТРЕННИХ КОНФОРМАЦИОННЫХ ДВИЖЕНИЙ БЕЛКОВ И ПОЛИПЕПТИДОВ В ТВЕРДОМ СОСТОЯНИИ 120 3.1. Расширение частотного диапазона твердотельного ЯМРэксперимента по релаксации во вращающейся системе координат для случая гетероядерной дипольной релаксации 120 3.1.1. Использование отстройки от резонанса частоты поля спин-лока 122 3.1.2. Использование дипольной развязки от протонов во время действия спин-лока 129 Сравнение внутренней динамики белков в микрокристаллическом и гидратированном порошкообразном состояниях 134 3.2.1. Постановка задачи 134 3.2.2. Условия эксперимента 136 3.2.3. Результаты и обсуждение 137 3.2. 3.3. Исследование динамики биополимеров с помощью ЯМРрелаксации на ядрах 1Н и 13С естественного содержания 3.3.1. Полилизин – релаксация на ядрах 13С естественного содержания 144 144 3.3.1.1. Условия эксперимента и методы анализа 145 3.3.1.2. Динамика боковых цепей 150 3.3.1.3. Динамика основной цепи 155 3.3.1.4. Выводы 156 3.3.2. Сравнительный анализ динамики полилизина и лизоцима по данным релаксации на ядрах 13С естественного содержания 158 3.3.2.1. Результаты 158 3.3.2.2. Обсуждение 161 3.3.3. Полилизин – сравнительный релаксации на ядрах 1Н и 13С анализ ЯМР166 3.3.3.1. Преимущества и особенности сравнительного анализа ЯМР-релаксации на ядрах 1Н и 13С в биополимерах 167 3.3.3.2. Условия эксперимента и методы анализа. 168 3.3.3.3. Результаты и обсуждение 173 3 3.4. Применение твердотельной обменной ЯМРспектроскопии для исследования низкочастотной внутренней динамики белков 187 3.4.1. Исследование динамики основной цепи барстара и полиглицина с помощью последовательности trODESSA 187 3.4.1.1. Условия эксперимента и результаты 187 3.4.1.2. Спиновая диффузия 191 3.4.1.3. Молекулярное барстара движение основной цепи 197 3.4.2. Совместный анализ обменных и релаксационных ЯМР-данных – метод SREDA 200 3.4.2.1. Условия эксперимента 201 3.4.2.2. Математическое описание метода SREDA. 203 3.4.2.3. Результаты и обсуждение 206 3.4.3. Эффект зависимости скорости спиновой диффузии между ядрами 15N от частоты ВМУ 215 Основные выводы и результаты 224 Благодарности 228 Ссылки 229 4 Введение Наряду с ДНК белки являются основными биологическими макромолекулами, благодаря которым на Земле существует жизнь во всех ее формах. Они выполняют множество важных для живых организмов функций – транспортных, ферментативных, регуляторных, механохимических и других. Белок представляет собой длинную одномерную полимерную цепь, состоящую из звеньев – аминокислот. Всего существует 20 различных типов природных аминокислот, которые различаются друг от друга химическим строением боковой цепи. Длина полипептидной цепи для различных белков варьируется от 30-40 до многих сотен и даже тысяч аминокислот. Принципиально важным отличием белков от синтетических полимеров является то, что каждый белок имеет свою уникальную нативную конформацию, то есть пространственную укладку полипептидной цепи, благодаря которой белок способен выполнять свою биологическую функцию. Эта конформация закодирована в первичной структуре белка, т.е. в последовательности аминокислот. В качестве примера на рисунке Схематическое изображение пространственной структуры основной цепи лизоцима Т4. слева изображена структура основной цепи одного из глобулярных белков, лизоцима фага Т4. За последние десятилетия белки стали едва ли не самым популярным биологическим объектом, который интенсивно изучается физическими методами. Основная цель исследования белков – это изучение молекулярных механизмов их биологического функционирования. Иными словами, люди пытаются понять, как белок работает. Кроме того, что это интересно само по себе, эти исследования также имеют и сугубо практическое значение: если знать механизм действия белка, его можно модифицировать или придать ему новые функции. А это очень важно для биотехнологии и медицины. Хотя и очень условно, работы по изучению механизмов функционирования белков можно разделить на два направления. Одно из них – это структурные 5 исследования, другое – изучение молекулярной динамики белков. К настоящему времени не подвергается сомнению, что оба эти фактора крайне важны для понимания молекулярных основ биологической работы белков. Однако исторически сложилось так, что структурные исследования белков начались гораздо раньше, и в этой области науки сделано намного больше, чем в исследованиях по молекулярной динамике. Сильный толчок развитию науки о белках дала первая расшифровка пространственной структуры глобулярного белка (гемоглобина) методом рентгеноструктурного анализа [1], за что в 1962 году Макс Перутц получил Нобелевскую премию. За прошедшее с тех пор время этим методом расшифровано уже много тысяч структур различных белков. Знание пространственной структуры действительно во многом объясняет многие свойства и функциональные возможности белка. Часто это достигается сравнительным анализом структур одного и того же белка в различных биологических состояниях, например, белка дикого типа и мутанта, свободного и связанного с лигандом и т.д. Достижения в структурном анализе обусловили развитие исследований корреляции между первичной и пространственной структурами, что очень важно для понимания механизмов фолдинга (самосборки) белка. Второй всплеск интереса к структурным исследованиям белков пришелся на конец восьмидесятых – девяностые годы прошлого столетия. Он связан с развитием другого мощного метода определения структуры белков – многомерного и мультиядерного ЯМР высокого разрешения в растворах. За эти работы тоже была присуждена Нобелевская премия, которую в 2002 году получил швейцарец Курт Вютрих [2]. И рентгеноструктурный анализ, и ЯМР обладают своими методическими достоинствами и недостатками, но у ЯМР есть одно важное и бесспорное преимущество: в то время как рентгеноструктурный анализ может работать только в монокристаллах белков, ЯМР определяет пространственную структуру белков непосредственно в водных растворах, то есть в их естественной среде. Следует отметить, что в природе существует очень широкий класс белков, которые не кристаллизуются и, в то же время, нерастворимы, как, например, большинство мембранных белков. Для определения их структуры наиболее приемлемым методом является ЯМР твердого тела. Но у твердотельного ЯМР есть 6 несколько существенных методических проблем, которые пока не позволяют использовать его в структурных исследованиях белков так же широко, как рентгеноструктурный анализ и жидкостный ЯМР. Тем не менее, в последние годы идет интенсивное развитие методик твердотельного ЯМР, позволяющих соотносить линии в спектрах и определять расстояния, планарные и торсионные углы между магнитными ядрами [3-5]. Не так давно группой Хартмута Ошкината в Германии была расшифрована первая структура белка в твердом состоянии методом ЯМР твердого тела [6]. И не исключено, что через некоторое время мы будем свидетелями очередного бума структурных исследований. Несмотря на то, что знание пространственного строения полипептидной цепи открывает путь к пониманию очень многих свойств белка, почти сразу же стало ясно, что одной только этой информации недостаточно для полного детального объяснения механизма функционирования белка на молекулярном уровне. Это можно продемонстрировать на примере того же самого гемоглобина. Его биологическая функция состоит в транспортировке кислорода в крови. Молекула кислорода связывается в активном центре белка, геме, и таким образом переносится в нужное место. Детальный анализ пространственной структуры показывает, что щель, соединяющая гем с поверхностью белка, очень узка для молекулы кислорода, и для того, чтобы она сквозь нее "протиснулась", необходимо предположить, что структура белка подвижна. В те моменты, когда щель приоткрывается, гем становится стерически доступным, и тогда возможно связывание белка с молекулой кислорода. Детально роль молекулярной динамики в биологическом функционировании гемоглобина была рассмотрена в серии работ Мартина Карплюса (см. обзор [7] и ссылки в этой работе). Это один из самых простейших и очевидных, но далеко не самый исчерпывающий пример важности динамики для биологической функции. Механизмы вовлечения молекулярной подвижности в работу белка могут быть весьма замысловатыми и не столь легко объяснимыми. Пока не существует, да, наверное, и не может существовать в принципе, единого рецепта или алгоритма связи тех или иных молекулярно-динамических параметров с той или иной биологической функцией. Это очень специфическая проблема, которая должна анализироваться в каждом конкретном 7 случае по-своему. Молекулярным механизмам вовлечения динамики в биологическую функцию посвящен ряд последних обзоров по динамике белков [8-13]. Кроме внутримолекулярной конформационной динамики белков, о которой шла речь выше, для глобулярных белков в растворе существует еще один, практически независимый от внутренней динамики, тип движения. Это броуновская трансляционная и вращательная диффузия белка как целого. Биологическая роль броуновской динамики более проста и прозрачна – обеспечить пространственное сближение и необходимую ориентацию друг относительно друга белка и его субстрата. Частотный диапазон колебаний атомов белка очень широк. Характерное время самых быстрых движений – фемтосекунды, самых медленных – секунды и даже минуты. Фемтосекундная область соответствует колебаниям валентных связей и валентных углов. Пикосекундная область и все, что медленнее, обуславливается конформационными степенями свободы структуры белка – двугранными (торсионными) углами φ и ϕ, обеспечивающими гибкость основной цепи белка, а также двугранными углами χ, определяющими конформацию боковых цепей аминокислотных остатков. Колебания этих углов могут быть очень быстрыми, если речь идет о движении отдельных химических групп. Например, характерное время вращения трех метильных протонов вокруг оси симметрии метильной группы при комнатной температуре составляет единицы пикосекунд. Низкоамплитудные некоррелированные колебания отдельных боковых цепей или небольших участков основной цепи в пределах стерических ограничений могут составлять доли и единицы наносекунд. Крупномасштабные конформационные переходы всегда являются высококоррелированными изменениями многих степеней свободы белка, поскольку обычно белки – довольно плотноупакованные структуры, практически без свободного объема внутри глобулы. Сколько-нибудь заметные смещения одного участка структуры белка могут происходить только при согласованном смещении соседних участков. Характерное время внутренней динамики этого типа находится в микро- и миллисекундном диапазонах. Следует отметить, что временной масштаб этой медленной динамики совпадает с временным масштабом многих молекулярнобиологических процессов, например, таких как связывание с субстратом, катализ, фолдинг и т.п. Поэтому вполне естественно предположить, что именно медленная 8 конформационная динамика наиболее значима для биологической функции белка и именно ее изучение представляет наибольший интерес с точки зрения биологии. Комплекс методов, применявшихся до сих пор для изучения молекулярной динамики белков, включает в себя ЯМР, ЭПР, диэлектрическую, флуоресцентную, инфракрасную и мессбауэровскую спектроскопии, нейтронное рассеяние, компьютерное моделирование и даже рентгеноструктурный анализ, который дает информацию о т.н. В-факторах, т.е. степени "размазывания" координат атомов в пространстве из-за молекулярной подвижности. Не в обиду будь то сказано специалистам из других областей, однако к настоящему времени стало совершенно очевидно, что для белков самым мощным, самым информативным методом, имеющим самый широкий спектр возможностей, является ЯМР. Для этого есть целый ряд причин, самая главная из которых – это селективность структурной и динамической информации, получаемой с помощью ЯМР. Это обусловлено тем фактом, что магнитные ядра, на которых можно проводить эксперименты, прежде всего, протоны, азоты и углероды, распределены по всей структуре белка. А современные методики ЯМР позволяют, хотя, конечно, и не во всех случаях, различать эти ядра и соотносить их с химической структурой белка. Практически все остальные экспериментальные методы дают информацию о природных зондах, которые либо (мессбауэровская локализованы только спектроскопия, в одном флуоресценция, месте ЭПР), белковой глобулы либо являются интегральной характеристикой всей глобулы, не дающей информации о различных ее частях (диэлектрическая спектроскопия, нейтронное рассеяние). Более детальную и обширную по сравнению с ЯМР информацию о молекулярной динамике может дать только компьютерное моделирование. Но этот метод только условно может считаться истинно экспериментальным, поскольку все силовые поля, используемые при моделировании таких сложных молекул как белки, являются только приближением. К настоящему времени накоплен обширный экспериментальный материал, характеризующий динамику многих биополимеров в различных состояниях и при различных экспериментальных условиях. Тем не менее, не до конца решенными остаются несколько важных проблем, которые имеют фундаментальное значение для дальнейшего развития этой области научных исследований. В частности, нет 9 ясного общего представления о том, как межбелковые контакты и взаимодействия влияют на динамическое поведение белков. В живой клетке белки находятся в непосредственном окружении других белков и различных (макро)молекул. Очевидно, что вопрос о влиянии межмолекулярных взаимодействий на различные параметры динамики является очень существенным для выяснения молекулярных механизмов биологического функционирования белков. В растворах очень важным является эффект взаимного электростатического ориентирования биомолекул. Он является ключевым в процессе "докинга" (docking), то есть "причаливания" двух белков (или белка и субстрата) друг к другу. Комплементарные электростатические свойства двух молекул могут на много порядков ускорять процесс нахождения, распознавания и связывания их друг с другом по сравнению с простым механизмом тепловой броуновской диффузии. В то же время, даже электростатической если белки структурой, в растворе их не обладают межмолекулярные комплементарной взаимодействия на относительно длинных расстояниях могут сказываться на характере их броуновской диффузии. До сих пор при анализе различных экспериментальных данных этим эффектом в подавляющем большинстве случаев пренебрегали. Но следует отметить, что без точной информации о вращении белка как целого корректно определить параметры его внутренних движений невозможно. Остается также открытым вопрос о влиянии межмолекулярных контактов на динамические свойства белков в твердых препаратах. Если вопрос об идентичности структур белков в кристаллах и растворах был в целом благополучно разрешен путем сравнения структур, определенных методами рентгеноструктурного анализа и ЯМР высокого разрешения [14], то в отношении динамики ясной картины на этот счет нет. Это, кстати говоря, является одной из причин неоднозначного отношения некоторых исследователей к биологической значимости изучения глобулярных белков в твердом состоянии. Другая проблема – это механизмы влияния гидратной воды на внутреннюю динамику белков. Изучение взаимодействия белков с водой является одним из самых популярных направлений исследований в физике белков, поскольку вода обуславливает их многие биологические свойства. То, что гидратация оказывает значительное влияние на динамические свойства биополимеров, известно очень 10 давно. Но в силу ряда методических причин, которые будут подробно обсуждаться ниже, большинство работ по изучению влияния гидратации на динамику носит качественно-сравнительный характер. Из таких результатов однозначно определить физические факторы и механизмы влияния гидратации на внутреннюю динамику достаточно сложно. Почему на разные биополимеры и на разные параметры динамики гидратная вода влияет по-разному – здесь еще много неясного. Наконец, еще одна очень важная проблема – это определение физической модели молекулярного движения из экспериментальных данных. Практически любой ЯМР-эксперимент, ориентированный на изучение молекулярной динамики, позволяет определить только степень усреднения того или иного типа взаимодействия магнитных ядер либо с внешним полем, либо друг с другом (эта степень часто называется параметром порядка, который был введен Липари и Сзабо в рамках так называемого безмодельного подхода [15,16]) и временной масштаб этого усреднения. В подавляющем большинстве случаев эту степень усреднения невозможно однозначно переформулировать в понятные для описания молекулярной динамики параметры – амплитуды движения, выраженные в ангстремах или градусах, стереометрические модели, степень корреляции между движениями различных элементов структуры. Это принципиальное отличие динамических ЯМРэкспериментов от структурных. В последних конечным результатом являются как раз вполне «осязаемые» для определения структуры параметры – межатомные расстояния и различного рода углы. А конечным результатом динамических экспериментов являются некие промежуточные параметры, чувствительные к молекулярной динамике, но связанные с ней неоднозначно. Кроме того, следует иметь в виду, что сам процесс получения этих промежуточных параметров из эксперимента зачастую неоднозначен. Например, из измерения одного или двух времен релаксации невозможно однозначно определить параметр порядка молекулярного движения и/или времени корреляции. Из формы линии твердотельного спектра, записанного при одной температуре, невозможно однозначно определить параметры реориентации тензора АХС. Для определения этих параметров необходимо или проведение большого числа экспериментов, и/или априорное использование той или иной модели. 11 различных Говоря о медленных конформационных движениях, которые, как мы отметили выше, наиболее интересны с точки зрения биологии, следует упомянуть о еще одной важной методической проблеме, которая существенно усложняет изучение молекулярной динамики этого типа в белковых растворах. Дело в том, что изотропное броуновское вращение белка как целого накладывается на внутреннюю динамику, и все медленные внутренние движения, которые имеют время корреляции длиннее, чем время корреляции броуновского вращения (для большинства белков порядка 10-8 с), становятся практическими невидимыми для физических методов, регистрирующих механическую реориентацию того или иного природного зонда. В число этих методов попадают ЯМР-релаксация, диэлектрическая и флуоресцентная спектроскопии, ЭПР. Впрочем, ситуация не безнадежна, есть эксперименты, позволяющие регистрировать медленные движения и в растворах. Например, метод водородного обмена, который определяет скорость химического обмена лабильных протонов белка на дейтероны растворителя. Хотя и косвенно, он дает информацию о крупномасштабных конформационных переходах, обеспечивающих контакт молекул растворителя с тем или иным доменом структуры белка. Кроме того, ЯМР позволяет регистрировать медленные движения, если они приводят к изменению изотропного химического сдвига магнитного ядра (эти эксперименты будут более подробно рассмотрены в первой главе). Однако эти методы позволяют только зарегистрировать сам факт наличия медленного движения и оценить его время корреляции. Информация об амплитуде и геометрии движений с помощью этих методов недоступна. Решением проблемы здесь может стать только изучение динамики белков в твердом состоянии, то есть в виде порошков или кристаллов, где броуновское вращение отсутствует. На настоящий момент, область изучения динамики биополимеров с помощью твердотельного ЯМР очень привлекательна тем, что она в гораздо большей степени представляет собой terra incognita по сравнению с жидкостным ЯМР и открывает широкий простор для применения новых нестандартных подходов и решений, особенно в методологии ЯМРэкспериментов. Этим исследованиям посвящается бóльшая часть диссертации. Основными задачами данной работы являются, во-первых, изучение влияния межмолекулярных взаимодействий на динамическое поведение белков, как в растворе, так и в твердом состоянии и, во-вторых, разработка способов получения 12 информации о физических моделях динамики биополимеров непосредственно из экспериментальных данных. Диссертация состоит из трех глав. В первой главе дано систематическое изложение основных типов ЯМР-экспериментов и их математического формализма, позволяющих получать информацию о молекулярной динамике. Особое внимание уделено описанию твердотельных одномерных обменных ЯМР-экспериментов с вращением образца под магическим углом. Методика этих экспериментов была разработана совсем недавно и, в отличие от релаксации или анализа формы линии спектра, их пока нельзя причислить к числу рутинных методов исследования молекулярных движений. Поскольку в диссертации этот метод используется в детальном количественном исследовании динамики белков, описание математических основ обменных экспериментов является важной частью первой главы. Кроме того, в первой главе представлен краткий литературный обзор основных направлений исследований динамики белков, как в растворе, так и в твердом состоянии. В этом обзоре описаны основные методические подходы, обобщение ключевых результатов, полученных к настоящему времени, и основные нерешенные проблемы в этой области науки. Вторая глава посвящена изучению влияния межмолекулярных взаимодействий между белками в растворе на характер их броуновской диффузии и построению модели, адекватно объясняющей наблюдаемые в эксперименте особенности движения белков при различных экспериментальных условиях. Для изучения динамики белков в растворе был применен целый комплекс различных физических методов – ЯМР-релаксация, временнáя диэлектрическая спектроскопия и компьютерное моделирование динамики броуновских частиц. Третья глава посвящена изучению внутренней динамики белков и полипептидов в твердом состоянии. Причина проведения экспериментов именно в твердом состоянии была изложена выше. В этой главе было изучено влияние межмолекулярных контактов на внутреннюю динамику нескольких белков, проведено количественное исследование влияния гидратации на динамику полилизина и лизоцима, а также разработано два метода, позволяющих переходить от безмодельного подхода в анализе экспериментальных данных к получению реальных физических моделей молекулярной подвижности. Ключевым моментом в наших методах является совместный количественный анализ данных различных 13 ЯМР-экспериментов, проведенных на одном и том же образце. Хотя разработка новых методических подходов не является основной целью диссертации, методические результаты имеют существенное значение, поскольку именно они позволили в результате получить ту информацию о молекулярной динамике, которая была недоступна с помощью стандартных экспериментов. Работа была выполнена в лаборатории молекулярной биофизики Казанского Института биохимии и биофизики КазНЦ РАН. Все твердотельные ЯМРэксперименты, представленные в диссертации, были проведены в группе ЯМРспектроскопии Университета Мартина-Лютера г. Халле, Германия, в рамках многолетнего сотрудничества между нашими лабораториями. Работа была поддержана рядом инициативных грантов РФФИ и совместных грантов РФФИ и Немецкого Научно-исследовательского Общества (Deutsche Forschungsgemeinschaft). Результаты диссертации докладывались на многих российских и международных конференциях и были опубликованы в различных рецензируемых журналах. 14 ГЛАВА 1. ЯМР-МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ДИНАМИКИ БЕЛКОВ И ПРИМЕРЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ (литературный обзор). 1.1. Природные зонды, дающие информацию о молекулярной динамике посредством ядерного магнитного резонанса. При всем многообразии типов экспериментов и импульсных последовательностей, применяющихся к настоящему времени в ЯМР для получения информации о молекулярных движениях в различных системах, по своему физическому смыслу все они могут быть поделены на три группы по типу природного зонда, по которому можно судить о молекулярной динамике. В первую группу входят эксперименты, регистрирующие изменение изотропного (т.е. усредненного по всем ориентациям) химического сдвига магнитного ядра. Химический сдвиг зависит не только от химической структуры макромолекулы, но и от ее конформации. Причем, не только конформации участка, на котором непосредственно находится магнитное ядро, но и конформации удаленных по числу ковалентных связей (или первичной структуре, если мы говорим о белках), но близких в пространстве участков. Если конформация биополимера подвижна, и если эти движения приводят к заметному изменению химического сдвига (что, впрочем, совсем не обязательно), то это можно заметить по форме спектра ЯМР и/или по дополнительному так называемому обменному вкладу в скорость поперечной магнитной релаксации. Вторая группа ЯМР-экспериментов использует тот замечательный факт, что химический сдвиг - в той или иной степени величина всегда анизотропная. То есть, химический сдвиг зависит от ориентации электронной оболочки магнитного ядра по отношению к внешнему магнитному полю B0. Количественно эта анизотропия B характеризуется тензором 3×3, который, как и изотропный химсдвиг, также зависит от электронной структуры молекулы. Таким образом, при реориентации тензора анизотропии химического сдвига (АХС), вызванного молекулярным движением, происходит изменение химсдвига магнитного ядра, которое можно зарегистрировать с помощью соответствующих ЯМР-экспериментов. 15 Наконец, третья группа ЯМР-экспериментов следит за диполь-дипольным взаимодействием магнитных ядер друг с другом. К этой группе относятся, прежде всего, ЯМР-релаксационные методы. Диполь-дипольное взаимодействие зависит от расстояния между магнитными ядрами и ориентации межъядерного вектора по отношению к внешнему магнитному полю. И то, и другое может модулироваться внутренней молекулярной динамикой. Флуктуации этого взаимодействия вызывают переходы между зеемановскими уровнями, что определяет скорость спинрешеточной магнитной релаксации. По времени релаксации можно в принципе судить как об амплитуде, так и о частоте молекулярного движения. В твердом теле межъядерное диполь-дипольное взаимодействие и степень его усреднения молекулярным движением также определяют и ширину линии в ЯМР-спектре (спинспиновую релаксацию), что тоже дает информацию об амплитуде и частоте движений. Конечно, такое деление всех ЯМР-экспериментов на три группы довольно условно, потому что многие типы экспериментов могут регистрировать движение как одного, так и другого зонда. Например, обменная спектроскопия чувствительна одновременно к изменениям изотропного химсдвига и к реориентации тензора АХС, а скорость спин-решеточной релаксации может определяться одновременно дипольдипольным взаимодействием и вращением тензора АХС и т.д. Но чаще всего получается так, что ЯМР-эксперимент дает информацию в основном об изменениях только одного зонда – изотропного химсдвига, тензора АХС или межъядерного вектора. В Таб. 1.1 перечислены природные ЯМР-зонды, отражающие молекулярную динамику, и основные типы экспериментов, которые их используют для изучения динамики белков. Следует оговориться, что поскольку в данной работе будут представлены ЯМРэксперименты только на ядрах 15N, 13С и 1Н в органических биополимерах, мы здесь не касаемся механизмов магнитной релаксации, которые не будут играть роли для нашего анализа, например, квадрупольной релаксации или релаксации через парамагнитные примеси. Кроме того, мы оставляем в стороне такой метод исследования трансляционной молекулярной подвижности, как ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля, поскольку он не способен регистрировать смещения магнитных ядер на доли и единицы ангстрем – это типичные амплитуды 16 Таблица 1.1. ЯМР-зонды Изотропный химический сдвиг Тензор АХС Диполь-дипольное межъядерное взаимодействие Эксперименты Анализ формы линии Спин-спиновая релаксация в растворах Обменная спектроскопия Анализ формы линии в твердом теле Обменная спектроскопия Спин-решеточная релаксация на высоких резонансных частотах Спин-спиновая и спин-решеточная релаксации внутримолекулярных движений в белках. Что же касается остальных ЯМР-методов по исследованию молекулярной динамики, то ниже мы их рассмотрим подробнее. 1.2. Форма линии спектра ЯМР твердого тела, обусловленная анизотропией химического сдвига. В самом простейшем случае, когда мы имеем в образце только один химический тип магнитных ядер, имеющих одинаковую ориентацию, спад свободной индукции (поперечной намагниченности) выражается так: fid(t ) = M x (t ) + iM y (t ) = M 0 (cos ω 0t + i sin ω 0t )e− t / T2 = M 0eiω0t e− t / T2 , (1.1) где М0 – равновесное значение намагниченности, Т2 - время поперечной релаксации, ω0 - круговая резонансная частота, определяемая внешним магнитным полем B0. B ЯМР-спектр представляет собой Фурье-преобразование спада поперечной намагниченности во временнóй области, что в данном простейшем случае приведет к простой лоренцевой форме линии: ∞ S (ω ) = ∫ M 0eiω0t e − t / T2 dt = 0 17 M0 . i(ω − ω 0 ) + 1 T2 (1.2) Как упоминалось выше, химический сдвиг магнитного ядра может зависеть от ориентации молекулы по отношению к внешнему магнитному полю. Эта ориентационная зависимость определяется тензором АХС, она имеет следующий вид: ω 0 = γ B0σ ZZ , (1.3) где γ – гиромагнитное отношение магнитного ядра, B0 – внешнее постоянное B магнитное поле, а σZZ – zz-элемент матрицы тензора АХС в предположении, что внешнее магнитное поле B0 направлено вдоль оси z. В координатной системе B главных осей тензора АХС, то есть в системе, где недиагональные элементы равны нулю, этот тензор имеет вид σ PAS 0 ⎞ ⎛ σ 11 0 ⎜ ⎟ = ⎜ 0 σ 22 0 ⎟ , ⎜ 0 0 σ 33 ⎟⎠ ⎝ (1.4) где элементы σ11, σ22 и σ33 определяют химический сдвиг магнитного ядра, если направление B0 совпадает соответственно с осями x, y и z этой системы координат B (индекс "PAS" является сокращением от principal axes system). Для перехода из системы главных осей тензора АХС в лабораторную систему используется стандартное преобразование: σ LF = R(α,β,γ)σ PAS R −1 (α,β,γ) , (1.5) где R(α,β,γ) – матрица перехода из одной системы координат в другую (LF – laboratory frame). α, β и γ – углы Эйлера, описывающие последовательные повороты системы координат при переходе в новую систему: α соответствует первому повороту вокруг оси z, β описывает поворот вокруг новой оси x, и, наконец, γ – это поворот вокруг новой оси z. В явном виде эта матрица преобразования выглядит так: sin α cosβ cos γ+cosαsinγ − sin βcosγ ⎞ ⎛ cos α cosβ cos γ-sinαsinγ ⎜ R(α,β,γ) = ⎜ − cos α cosβ sin γ-sinαcosγ − sin α cosβ sin γ+cosαcosγ sin βsinγ ⎟⎟ . (1.6) ⎜ cos α sin β sin α sin β cosβ ⎟⎠ ⎝ 18 Вышеприведенные формулы позволяют определить резонансную частоту магнитного ядра при любой ориентации тензора АХС по отношению к внешнему магнитному полю. Если образец изотропен, то есть он представляет собой аморфное тело, поликристалл или порошок, то в нем существует равномерное распределение тензоров АХС по всем возможным ориентациям, а значит и распределение химических сдвигов. Для того, чтобы определить форму линии ЯМР-спектра для этого случая, необходимо проинтегрировать ур-е (1.2) по всем ориентациям тензора АХС. В результате этой, описанной во многих учебниках по ЯМР, стандартной процедуры получается хорошо известная форма линии спектра статического порошкообразного образца. Примеры таких спектров при различных соотношениях σ11, σ22 и σ33 показаны на Рис. 1.1 (рисунок из монографии [17], в этих расчетах принимается, что 1/T2<<(σ33-σ11)γB0). B Форма спектров, представленная на Рис. 1.1, характерна для ядер, имеющих спин ½. Для ядер же, которые имеют спин 1 (из них для исследования биомакромолекул наиболее важны дейтероны), форма спектра всегда зеркально симметрична относительно изотропного химсдвига (см. пример ниже). Это связано с тем, что из-за квадрупольного расщепления поперечная намагниченность этих ядер состоит из двух компонент, каждая из которых имеет свою частоту прецессии. И тогда в выражении (1.1) eiω0t следует заменить на (eiω0t + e − iω0t ) / 2 . Все остальные детали расчетов остаются без изменений. Рисунок 1.1. Формы спектров твердотельного ЯМР изотропного образца. Частоты ωx, ωy и ωz соответствуют химсдвигам σ11, σ22, и σ33. Ноль на оси х соответствует изотропному (усредненному) химическому сдвигу. Левый рисунок – частный случай аксиально симметричного тензора АХС, когда σ11=σ22. 19 Спектры, показанные на Рис. 1.1, могут дать информацию о параметрах тензора АХС. Но еще большую информативность эти спектры приобретают при наличии в образце молекулярного движения, которое стохастически модулирует ориентацию тензора АХС. В этом случае форма линии претерпевает изменения, и по этим изменениям можно судить о параметрах молекулярной динамики. В предельном случае быстрого (так, что частота молекулярного движения много больше, чем ωzωx) изотропного движения весь спектр "схлопывается" в одну линию на резонансной частоте, соответствующей изотропному химсдвигу: 1 3 ω 0iso = γ B0 (σ 11 + σ 22 + σ 33 ) . (1.7) Именно такие линии мы всегда наблюдаем в растворах. Наиболее сложный, хотя и наиболее интересный, случай имеет место в твердых телах, когда частота молекулярного движения совпадает по порядку величины с АХС, то есть с разницей ωz-ωx. Для того, чтобы рассчитать форму линии для этого случая используется стандартный подход, описанный, например, в монографии [17]. Он состоит в следующем. Допустим, что молекулярное движение состоит из перескоков тензора АХС между N возможными ориентациями. (В случае непрерывного распределения ориентаций N будет стремиться к бесконечности, однако на практике всегда молекулярное движение можно аппроксимировать перескоками между конечным числом дискретных состояний.) Тогда хорошо известные уравнения Блоха несколько модифицируются: движение каждого изохромата намагниченности, соответствующего одной из N ориентаций, определяется двумя процессами. Вопервых, прецессией вокруг внешнего магнитного поля dM j dt = iω j M j (1.8) и, во-вторых, обменом между различными изохроматами dM j dt N = ∑ K jk M k , k =1 20 (1.9) где j – номер одной из N ориентаций, Kjk - при j≠k вероятность перескока в единицу времени из ориентации k в ориентацию j, и Kjj определяет вероятность перехода из состояния j во все остальные ориентации, которая имеет отрицательный знак. ωj есть резонансная частота ориентации j, которая определяется соответствующими эйлеровыми углами. Объединяя ур-я (1.8) и (1.9), можно записать общее уравнение Блоха в векторно-матричном виде: dM = (iω +Κ ) M , dt (1.10) где M - N-размерный вектор, ω - диагональная матрица с элементами ωjk=δikωj, K описанная выше обменная матрица. Интегральная намагниченность образца есть сумма всех изохроматов, которая может быть выражена как N M (t )= ∑ M j (t ) = 1 ⋅ M , (1.11) j =1 где 1=(1,1,...,1) . Отсюда можно получить формальное решение этого дифференциального уравнения: M(t ) = 1 ⋅ ⎡e(iω +Κ )t M (0) ⎤ . ⎣ ⎦ (1.12) Что касается экспоненциальной матрицы в ур-и (1.12), то в явном виде ее можно представить как 0 ⎡ exp( a1t ) ⎢ 0 exp( a2 t ) exp( At ) = R D ⎢ ⎢ ... ... ⎢ 0 ⎣ 0 ⎤ ... 0 ⎥⎥ -1 RD , ... ... ⎥ ⎥ ... exp( a N t ) ⎦ ... 0 (1.13) где a1, a2,...,aN – собственные значения матрицы A, RD –матрица преобразования, приводящая A к диагональному виду. Представленные выше формулы позволяют описать форму линии ЯМР-спектра в произвольном случае, если известны (или заданы) параметры тензора АХС, его возможные ориентации и обменная матрица K. Смысл изучения молекулярной 21 динамики с помощью анализа формы линии твердотельного ЯМР-спектра состоит в том, чтобы подобрать такую модель молекулярного движения (то есть ориентации тензора АХС) и такую его частоту (то есть обменную матрицу K), чтобы расчетная и экспериментальная формы линии спектра совпадали. Необходимо заметить, что этот метод анализа может хорошо работать только в том случае, если ширина линии, обусловленная временем поперечной релаксации Т2 и распределением изотропных химсдвигов пренебрежима по сравнению с величиной АХС. Анализ формы линии может быть информативен только при изучении движений, частота которых сравнима с величиной АХС. В большинстве случаев этот частотный диапазон соответствует единицам-сотням килогерц. Пример изменения формы линии в зависимости от частоты молекулярного движения (иначе говоря, температуры) представлен на Рис. 1.2 (рисунок из монографии [17]). 1.3. Вращение образца под магическим углом. Только что было показано, что АХС является замечательным свойством ЯМР, позволяющим определять параметры молекулярной динамики. В то же время, уширение линии, вызванное эффектом АХС, зачастую не дает возможности отличить в спектре друг от друга химически неэквивалентные ядра, то есть ядра, имеющие различный изотропный химический сдвиг. Что же делать? Почти полвека предложил Рисунок 1.2. Форма линии спектра дейтеронов метильной группы при допущении вращательных скачков между тремя равновероятными положениями вокруг оси симетрии метильной группы. Скорость скачков выражена в единицах величины АХС. 22 назад Рэймонд Эндрю оригинальный способ сужения линий в твердотельных спектрах ЯМР, который с успехом используется и по сей день – механическое вращение образца вокруг оси, направленной под магическим углом (θ m = arccos(1 3) = 54.70 ) по отношению к постоянному магнитному полю B0 [18]. B Поскольку вращение под магическим углом (ВМУ) – один из ключевых моментов в тех экспериментах, которые будут анализироваться в данной работе, мы рассмотрим его подробнее. При механическом вращении образца ур-е (1.1) модифицируется: у резонансной частоты появляется циклическая зависимость от времени: ω0(t)=ω0(t+TR) где TR – период вращения. И тогда спад свободной индукции можно записать таким образом: fid(t ) = M 0eiΘ(0,t )e−t T 2 , (1.14) где Θ(0,t) – фаза прецессирующей намагниченности к моменту времени t: b Θ(a, b) = ∫ ω 0 (t )dt . (1.15) a Резонансная частота ω0 определяется ур-ем (1.3), в котором zz-элемент тензора АХС приобретает временнýю зависимость. Для детального описания этой зависимости мы последуем алгоритму, изложенному в обзоре [19]. Проведем ряд обратных переходов из одной системы координат в другую: лабораторная система (LF) ← система, связанная с ротором ВМУ, ось Z которой совпадает с осью вращения (RF) ← молекулярная система (MF) ← система, в которой тензор АХС диагонален (PAS). В принципе, для рассмотрения только эффекта ВМУ, последнее преобразование излишне, поскольку молекулярную систему можно совместить с PAS. Но так сделать будет удобнее при рассмотрении экспериментов по обменной спектроскопии, так как в этом случае из-за молекулярного движения тензор АХС меняет свою ориентацию и, соответственно, имеет несколько PAS. Первое преобразование: ( ω0 (t ) = γ B0 ⎡⎣σ LF (t ) ⎤⎦ ZZ = ωL ∑ ( R RF,LF ) Zi (σ RF ) R RF,LF ij 23 -1 ) jZ ( ) = ωL I ⋅ σ RF ⋅I , (1.16) где ωL – ларморова частота, а I - единичный вектор, направленный вдоль поля B0 в B системе координат RF, RRF,LF – матрица преобразования из лабораторной системы координат в систему координат ротора. Поскольку оси Z систем LF и RF ориентированы под магическим углом друг к другу, то легко показать, что 2 ⎛ 2 ⎞ I =⎜ cos ωRt , sin ωRt , cos ωRt ⎟ , 3 ⎝ 3 ⎠ (1.17) где ωR – круговая частота механического вращения образца. Следующий переход – из системы координат ротора в молекулярную систему: σ RF = RMF,RF (α , β , γ )σ LF RMF,RF (α , β , γ )−1 , (1.18) β, γ – эйлеровы углы, описывающие это преобразование, а RMF,RF – где α, соответствующая матрица. Подставив результат произведения матриц (1.18) в (1.16), временнýю зависимость резонансной частоты можно представить как LF ω 0 (t ) = ω Lσ iso + ω Lσ aniso (t ) = ω iso + ω aniso (t ) , (1.19) где σ iso = 1 (σ 11 + σ 22 + σ 33 ) , 3 (1.20) σ aniso (t ) = C2 cos(2ω R t + 2γ ) + S 2 sin(2ω R t + 2γ ) + C1 cos(ω R t + γ ) + S1 sin(ω R t + γ ) , (1.21) 1 ⎧3 C2 = ⎨ (σ 33 − σ iso ) sin 2 β − 3 ⎩2 , (1.22a) 1 ⎡1 ⎫ ⎤ − ⎢ (σ 22 − σ 11 ) cos 2α − σ 12 sin 2α ⎥ ( 3 + cos 2 β ) − (σ 13 cos α + σ 23 sin α ) sin 2 β ⎬ 2 ⎣2 ⎦ ⎭ S2 = C1 = 2 ⎧⎡ 1 ⎫ ⎤ ⎨ ⎢ (σ 22 − σ 11 ) sin 2α + σ 12 cos 2α ⎥ cos β + (σ 13 sin α − σ 23 cos α ) sin β ⎬ , (1.22b) 3 ⎩⎣ 2 ⎦ ⎭ 2⎧ 3 ⎨− (σ 33 − σ iso ) sin 2 β − 3 ⎩ 2 ⎫ ⎡1 ⎤ − ⎢ (σ 22 − σ 11 ) cos 2α − σ 12 sin 2α ⎥ sin 2 β + 2 (σ 13 cos α + σ 23 sin α ) cos 2 β ⎬ ⎣2 ⎦ ⎭ 24 , (1.22c) 2 2 ⎧⎡ 1 ⎫ ⎤ ⎨ ⎢ (σ 22 − σ 11 ) sin 2α + σ 12 cos 2α ⎥ sin β − (σ 13 sin α − σ 23 cos α ) cos β ⎬ 3 ⎩⎣ 2 ⎦ ⎭ S1 = (1.22d) элементы тензора σ в (1.22) соответствуют молекулярной системе координат. Производя интегрирование в ур-и (1.15) с учетом (1.19), мы получим: t ∫ (ω iso + ω aniso (t ') ) dt ' = ω iso t + [ Ψ (γ + ω R t ) − Ψ (γ ) ] = Θiso (t ) + Θ aniso (0, t ) , (1.23) ω L ⎛ C2 S2 ⎞ ⎜ sin 2 x − cos 2 x + C1 sin x − S1 cos x ⎟ . 2 ωR ⎝ 2 ⎠ (1.24) 0 где Ψ ( x) = В конце концов, подставляя (1.23) в (1.14) и полагая для простоты M0=1, получаем конечное выражение для спада свободной индукции при вращении образца под магическим углом: fid(t ) = eiωisot e−iΨ (γ ) eiΨ (γ +ωRt ) e−t T2 = eiωisot f * (γ ) f (γ + ω Rt )e−t T2 , (1.25) где f ( x ) = e iΨ ( x ) (1.26) - так называемая f-функция, определяющая фазовую корреляцию поперечной намагниченности. В принципе, выражение (1.25) уже позволяет с помощью фурьепреобразования получить форму линии спектра образца, вращающегося под магическим углом. (Пока, правда, речь идет только о монокристалле, так как не выполнено интегрирование по эйлеровым углам α, β, γ.) С другой стороны, выражение для спада поперечной намагниченности (1.25) можно представить в более наглядном виде, из которого будет понятно, какую форму спектра имеет образец, вращающийся под магическим углом. Проведя интегрирование по одному из эйлеровых углов - γ , и используя известное соотношение ∞ δ ( x) = ∑e − iNx , N =−∞ где δ(x) – дельта функция Дирака, выражение (1.25) можно привести к виду 25 (1.27) fidγ (t ) = eiωisot e −t T2 ∞ ∑e iN ω R t N =−∞ FN* FN , (1.28) где 1 FN = 2π 2π ∫e − iNx f ( x ) dx . (1.29) 0 Фурье-преобразование (1.28) приведет к спектру ЯМР, который будет представлять собой узкие одиночные пики, отделенные друг от друга частотным интервалом ωR. Центральный пик, соответствующий N=0, находится на частоте изотропного химсдвига. Интенсивности этих пиков пропорциональны FN* FN . В литературе эти пики часто обозначаются как ssb (spinning side bands). Ну, а переходя к полностью изотропному образцу, мы увидим, что амплитуды ssb пропорциональны IN = 1 4π 2π ∫ 0 π dα ∫ sin( β )FN* FN d β . (1.30) 0 Когда частота вращения значительно превышает величину АХС, от набора ssb остается только один центральный пик, имеющий ширину линии, которая определяется только временем Т2, но уже никак не АХС. Поэтому ВМУ широко используется в твердотельном ЯМР для значительного сужения линий, что приводит к лучшему разрешению спектров и увеличению отношения сигнала к шуму. Весь математический формализм, изложенный выше, будет использован при рассмотрении обменных ЯМР-экспериментов. 1.4. Двумерные обменные ЯМР-эксперименты. Термин "обмен" довольно многогранен, что иногда может привести к некоторой путанице. Чтобы избежать ее, скажем сразу, что в дальнейшем, если не оговорено иное, под обменом мы будем подразумевать обмен (переход, скачок) между различными ориентациями тензора АХС. То есть, фактически, молекулярное движение. Кому-то может показаться, что "обмен" – не самое подходящее слово для обозначения этого процесса, но так уж сложилось в научной литературе. 26 Ранее мы показали, что АХС позволяет получать информацию о молекулярном движении посредством анализа формы линии спектра. Для этого частота молекулярного движения должно быть сравнима с величиной АХС или больше ее. Но ЯМР-спектроскопия позволяет использовать АХС для исследования и гораздо более медленных молекулярных движений, которые не вызывают никаких изменений в форме линии. Это как раз и реализуется в так называемых обменных экспериментах. Как ни странно, идея обменного ЯМР-эксперимента наиболее проста и понятна при рассмотрении двумерной, а не одномерной версии обменной импульсной последовательности. Самый простейший ее вариант схематически показан на Рис. 1.3. Последовательность состоит из трех 900 импульсов, и трех функционально значимых временных промежутков. Первый импульс кладет вектор намагниченности в плоскость x-y, после чего она за т.н. время эволюции t1 прецессирует с частотой ωa, которая определяется ориентацией тензора АХС в данный момент времени. Второй импульс возвращает вектор намагниченности к направлению вдоль магнитного поля B0, после чего следует так называемое время B смешивания (mixing time) τm. За это время может произойти реориентация тензора АХС, что приведет к изменению резонансной частоты магнитного ядра. Третий импульс опять кладет намагниченность в плоскость x-y, после чего следует регистрация сигнала свободной индукции, то есть частоты прецессии ωb, которая определяется новой ориентацией тензора АХС. В результате этого эксперимента мы имеем двумерный спад свободной индукции, который зависит от t1 и t2. Если время смешивания намного короче времени корреляции молекулярного Рисунок 1.3. Простейшая двумерная обменная последовательность, состоящая из трех 900 импульсов. Пунктирная линия в период времени смешивания схематически изображает процесс спинрешеточной релаксации. 27 движения τc, тогда тензор АХС не успеет за это время повернуться, и ωa будет равно ωb. Двумерное фурье-преобразование по переменным t1 и t2 в этом случае даст двумерный спектр, в котором по диагонали будет находиться простой одномерный спектр и не будет никаких недиагональных пиков. Если же τm≥τc и, соответственно, ωa≠ωb, то в двумерном спектре появляются недиагональные пики (кросс-пики), расположенные симметрично относительно диагонали с координатами (ωa,ωb) и (ωb,ωa). Измеряя зависимость амплитуды кросс-пиков (которая определяется разностью ωa-ωb) от времени смешивания можно получить информацию, как о времени корреляции молекулярного движения, так и о его амплитуде. В этом случае эксперимент становится, строго говоря, трехмерным. С его помощью можно регистрировать движения, имеющие времена корреляции короче или сравнимые со временем релаксации Т1. Это связано с тем, что в период времени смешивания намагниченность ориентирована вдоль поля B0, а значит, она подвержена процессу B спин-решеточной релаксации, который приводит к затуханию сигнала. Описанная выше последовательность применима как для твердых тел, так и для растворов с той лишь разницей, что в растворе под обменом мы должны подразумевать изменение изотропного химсдвига, потому что в растворе вся АХС усредняется быстрым изотропным броуновским вращением. Переходя от единственного магнитного ядра, изображенного на Рис. 1.3 к изотропному образцу, в котором возможны все ориентации тензора АХС, мы, естественно, столкнемся с распределением резонансных частот ωa и ωb, что приведет к усложнению формы линии двумерного спектра. В качестве очень красивой и наглядной иллюстрации этого факта на Рис. 1.4 Рисунок 1.4. Обменные ЯМР спектры на ядрах 13С полиоксиметилена при различных временах смешивания и температурах. 28 (рисунок из показана серия обменных спектров, книги [17]) двумерных снятых на статическом образце полиоксиметилена при различных температурах и временах смешивания. Из этого рисунка видно, что при низкой температуре и коротком времени смешивания мы наблюдаем стандартный одномерный спектр изотропного порошка, размещенный по диагонали. При увеличении температуры и времени смешивания этот спектр начинает "расплываться" в сторону от диагонали, что однозначно свидетельствует о реориентации тензора АХС с характерным временем порядка времени смешивания. Хотя такие спектры достаточно сложны для анализа, однако с помощью численных методов расчета двумерных спектров они могут дать богатую информацию о геометрических и частотных параметрах молекулярного движения. Основной недостаток измерения двумерных обменных спектров на статических образцах – слишком большое время, необходимое для проведения этих экспериментов. Практически они выполнимы только на образцах, дающих хорошую чувствительность сигнала ЯМР и не имеющих широкой дисперсии изотропных химсдвигов. Гораздо более применимы для практики обменные эксперименты, проводимые при вращении образца под магическим углом. В этом случае двумерный обменный спектр будет состоять из центральных пиков и пиков ssb, размещенных на диагонали и, при наличии обмена, недиагональных кросс-пиков. Переход от "размазанного" двумерного спектра к одиночным пикам значительно повышает отношение сигнала к шуму, а значит и сокращает время накопления сигнала. Этот тип эксперимента мы сейчас рассмотрим более подробно. Импульсная последовательность двумерного обменного эксперимента с ВМУ показана на Рис. 1.5. Кроме импульсов, воздействующих на наблюдаемые ядра (15N и 13 С), на Рис. 1.5 также показаны импульсы, воздействующие на протоны. Это связано с тем, что в до сих пор в белках обменные эксперименты проводились только на ядрах 13С и 15N, которые в твердотельном ЯМР обычно регистрируются с применением стандартных методик кросс-поляризации и «декаплинга», т.е. дипольной развязки от протонов. Основное отличие импульсных последовательностей, изображенных на Рис. 1.3 и 1.5, состоит в том, что в последнем случае время смешивания должно составлять целое число периодов вращения ротора. Причина этого условия очевидна – через целое число периодов вращения образец возвращается в свою изначальную ориентацию. В противном 29 Рисунок 1.5. Импульсная последовательность твердотельного двумерного обменного обменного ЯМР эксперимента с ВМУ. "СР" – кросс-поляризация (cross-polarisation), "DC" – «декаплинг» (decoupling), TR – период вращения ротора. случае мы не сможем различить реориентацию тензора АХС, вызванную молекулярным движением, от реориентации, вызванной механическим вращением образца. Практически это условие реализуется с помощью синхронизации первого и третьего 900-импульсов с переменным сигналом от системы стабилизации вращения ротора. Теперь обратимся к математическому описанию этого эксперимента. К моменту окончания периода эволюции (время t1) поперечная намагниченность магнитных ядер, тензор АХС которых находится в ориентации j, выражается как fid j (t1 ) = Pjeq eiΘ j (0,t1 ) −t1 T2 e , (1.31) где Θj(0,t1) определяется ур-ем (1.15), а Pjeq - равновесная населенность ориентации j, которая, в свою очередь, определяется больцмановским распределением. Допустим, за период времени смешивания часть тензоров АХС за счет молекулярного движения перепрыгнула из ориентации j в ориентацию i. Для них поперечная намагниченность к окончанию периода t2 будет выражаться как: 30 fid ij (t1 , τ m , t2 ) = Qij (τ m )eiΘ j (0,t1 ) iΘi ( t1 +τ m ,t1 +τ m + t2 ) − ( t1 + t2 ) T2 e e , (1.32) где Qij (τ m ) = Pij (τ m ) Pjeq e−τ m T1 . (1.33) В ур-и (1.33) Pij(τm) обозначает вероятность перескока тензора АХС из ориентации j в ориентацию i за время τm. Эти вероятности можно определить из дифференциального матричного уравнения d P(t ) = K P(t ) , dt (1.34) где K – обменная матрица идентичная той, которая была представлена ранее в ур-ях (1.9-1.12). Решение (1.34) сводится к стандартному P (t ) = eKt P (0) , (1.35) откуда видно, что вероятности Pij(τm) определяются как ( Pij (τ m ) = eKτ m ) ij . (1.36) Что же касается экспоненциальных матриц, то их явный вид был представлен выше (см. ур-е (1.13)). Вспоминая определение f-функции (ур-е (1.26)), выражение (1.32) можно переписать в следующем виде: j fid ij (t1 ,τ m , t2 ) = Qij (τ m )e − ( t1 +t2 ) T2 eiωisot1 f j* (γ ) f j (γ + ω R t1 ) × i ×eiωisot2 f i* (γ + ω R t1 + ω Rτ m ) f i (γ + ω R t1 + ω Rτ m + ω R t2 ) . (1.37) Индексы i и j около f-функций обозначают, что они соответствуют ориентациям i и j тензора АХС, и для них, соответственно, будут разные коэффициенты C1, C2, S1 и S2 31 (ур-я (1.22)), которые и определяют f-функцию. Имея в виду, что время смешивания составляет целое число периодов ВМУ, и что f(x+2πn)=f(x), это выражение несколько упрощается: j i fid ij (t1 , τ m , t2 ) = Qij (τ m )e − ( t1 + t2 ) T2 eiωisot1 eiωisot2 × × f j* (γ ) f j (γ + ω R t1 ) f i* (γ + ω R t1 ) f i (γ + ω R t1 + ω R t2 ) . (1.38) Далее, аналогично переходу от ур-я (1.25) к ур-ю (1.28), представляющих в разном виде выражение для спада свободной индукции при ВМУ, мы таким же образом представим и двумерный спад свободной индукции в случае обменного эксперимента, проинтегрированный по одному из эйлеровых углов, γ [19]: fidγij (t1 , τ m , t2 ) = Qij (τ m )e −( t1 +t2 ) T2 eiωisot1 eiωisot2 ∑ eiM ω R t1 eiNω R t2 FMj FMij − N FNi* , (1.39) j i M ,N где коэффициенты FMi определяются ур-ем (1.29), а FMij − N выглядят так: FMij − N = 1 2π 2π ∫e − i( M − N ) x f j ( x ) f i* ( x) dx . (1.40) 0 Из выражения (1.39) видно, что амплитуда кросс-пика в двумерном спектре (без учета спин-решеточной релаксации), находящегося в точке с координатами (ωiso+MωR,ωiso+NωR), и соответствующая ядрам, чьи тензора АХС до времени смешивания были в ориентации j, а после – в ориентации i (или наоборот, это все равно), с учетом интегрирования по оставшимся двум эйлеровым углам равна I ij NM 1 = 4π 2π π ∫ ∫F j M FMij − N FNi * sin β d β dα . (1.41) 0 0 Ну а полная интенсивность этого кросс-пика будет определяться комбинацией всех ориентаций i и j с учетом вероятностей перехода за время смешивания из одной ориентации в другую: 32 ij INTNM (τ m ) = ∑ Qij (τ m ) I NM . (1.42) i, j Легко показать, что в самом простейшем случае обмена между двумя равновероятными ориентациями тензора АХС зависимость интенсивности кросспика от времени смешивания будет определяться следующим выражением: INTNM (τ m ) = ⎡⎣1 − e −2 kτ m ⎤⎦ 11 12 I NM + I NM e−τ m T1 , 2 (1.43) где k – скорость обмена между ориентациями 1 и 2, которая входит в обменную матрицу, представленную в ур-ях (1.9) и (1.34). Здесь будет уместно сделать четыре замечания о свойствах и природе обменного эксперимента с ВМУ. Первое – очевидно, что амплитуда кросс-пиков определяется геометрическими параметрами молекулярного движения. Причем, в первом приближении можно сказать, что чем меньше угловая амплитуда реориентации тензора АХС, тем меньше и амплитуда кросс-пика. В предельном случае, когда обе ориентации совпадают, в ур-и (1.40) fj(x)=fi(x), и тогда используя (1.27), легко показать, что сумма в выражении (1.39) становится пропорциональной дельта-функции с аргументом (M-N), откуда следует, что в этом случае на спектре появятся только пики, для которых M=N, то есть диагональные, а недиагональных пиков не будет. Эта зависимость амплитуды кросс-пиков от геометрии реориентации тензора АХС дает возможность получать информацию не только о частотных, но и об амплитудных параметрах молекулярной динамики. Второе – из определения функции Ψ(x) (1.24), которая, в свою очередь определяет f-функцию (1.26), видно, что амплитуда кросс пика зависит как от резонансной частоты ωL, так и от частоты ВМУ ωR. Следовательно, чтобы получить максимальную диагональному интенсивность пику, кросс-пика необходимо по отношению использовать к максимально центральному возможную резонансную частоту и вращать образец как можно медленнее. Что касается выбора резонансной частоты, то он определяется только имеющимся в распоряжении исследователя набором ЯМР-спектрометров и, увы, редко бывает слишком широким. Ну а скорость ВМУ должна выбираться также и с учетом возможности 33 хорошего спектрального разрешения и как можно большего отношения сигнала к шуму, так что выбор ωR –это всегда результат компромисса. Третье – двумерный обменный эксперимент позволяет отслеживать как реориентацию тензора АХС, о чем мы до сих пор в основном и вели речь, так и процессы химического обмена, то есть изменение изотропного химического сдвига. Это видно из ур-я (1.39): кроме различных ориентаций тензора АХС появление кросс-пиков может обусловить и изменение изотропного химсдвига. Именно i поэтому в ур-и (1.39) ωiso и ωisoj в общем случае могут быть и разными. Хотя справедливости ради следует заметить, что в большом числе случаев изменение изотропного химсдвига, вызываемое конформационной динамикой, пренебрежимо по сравнению с изменением химсдвига, вызываемым реориентацией тензора АХС. Четвертое - даже при отсутствии каких-либо молекулярных движений кросспики все равно могут возникать благодаря такому хорошо известному явлению в магнитном резонансе, как спиновая диффузия. Строго говоря, сам по себе обменный эксперимент не может различить реориентацию тензора АХС (или изменение изотропного химсдвига) от диффузии намагниченности (так называемый флип-флоп процесс) от одного магнитного ядра к другому. При очевидной разнице в физической природе этих процессов, их проявление в обменном эксперименте и математическое описание, приведенное выше, абсолютно одинаково. Единственное, на что могут уповать экспериментаторы, это измерение температурной зависимости времени обмена. Время корреляции молекулярной подвижности от температуры зависит, а вот скорость спиновой диффузии – практически нет, поскольку последняя определяется только системой межъядерных расстояний в образце. Как мы покажем ниже, это обстоятельство однажды выручит и нас в нашей работе. 1.5. Одномерные обменные ЯМР-эксперименты. При всей привлекательности описанного выше двумерного обменного эксперимента с ВМУ он по-прежнему страдает существенным недостатком – во многих случаях он требует слишком долгого времени измерения. Он хорошо работает на простых модельных молекулах, имеющих узкие линии в спектре и хорошую чувствительность ЯМР-сигнала. Но для сложных полимерных молекул, имеющих множество химически неэквивалентных магнитных ядер, проведение 34 двумерного эксперимента при достаточном количестве времен смешивания, даже не говоря о температурных зависимостях, может растянуться на многие недели, если не месяцы, даже при использовании современных высокопольных ЯМР-спектрометров. А нельзя ли сократить размерность этого эксперимента при сохранении объема и качества информации о молекулярной динамике? Оказывается – можно. Интенсивная разработка одномерных модификаций обменного твердотельного ЯМР-эксперимента с ВМУ началась примерно с середины 90-х годов прошлого столетия и продолжается до сих пор. Основные усилия в этих методических разработках были в основном сделаны такими исследователями как З. Луз (Реховот, Израиль), П. Текели (Нанси, Франция), Д. Райхерт (Халле, Германия), К. Шмидт-Рор (Эймс, США), Т. Бонагамба и Э. де Азеведо (Сао Карлос, Бразилия). К настоящему времени предложено уже несколько вариантов импульсных последовательностей одномерного обменного эксперимента, каждая из которых обладает своими достоинствами и недостатками [20-26]. Хотя сама по себе это достаточно завлекательная область ЯМР, но не она является основной темой настоящей работы. Поэтому мы ограничимся приведением только основных сведений об одномерных обменных экспериментах, которые впоследствии будут нужны нам для интерпретации наших экспериментов. Основная идея, лежащая в переходе от двумерного обменного эксперимента к его одномерным модификациям, заключается в фиксировании времени t1 (Рис. 1.5). Тогда эффект обмена будет проявляться в изменении интенсивностей линий одномерного спектра в зависимости от времени смешивания, без учета эффекта спин-решеточной релаксации. Один из таких одномерных экспериментов имеет аббревиатуру trODESSA (Time-Reverse One Dimensional Exchange Spectroscopy by Ssb Alternation) [21]. Импульсная последовательность этого эксперимента представлена на Рис. 1.6. В нем время t1 всегда равно половине периода ВМУ, время смешивания составляет нечетное число полупериодов ВМУ, а регистрация сигнала свободной индукции начинается через половину периода ВМУ после последнего 900 импульса. Важную роль в этом эксперименте играет фазовый цикл импульсов и частоты детектирования сигнала свободной индукции, который подробно описан в [21]. Этот фазовый цикл обеспечивает то, что при любом времени смешивания, как в отсутствие, так и при наличии обмена, центральные и ssb пики всех химически35 Рисунок 1.6. Импульсная последовательность одномерного твердотельного обменного ЯМР эксперимента tr-ODESSA неэквивалентных магнитных ядер имеют положительные амплитуды. В предшествующей версии этого эксперимента [20] амплитуды центрального и ssb пиков изменяются по закону (-1)N, где N – номер ssb пика (N=0 соответствует центральному пику). При наличии нескольких химически неэквивалентных ядер это может существенно усложнить вид ЯМР-спектра и анализ молекулярной динамики. Спад свободной индукции для ядер, имеющих ориентации i и j до и после времени смешивания, соответственно, проинтегрированный по эйлеровому углу γ, в эксперименте trODESSA выражается следующим образом: i j i fid γij (τ m , t ') = Qij (τ m )e −( t +TR ) T2 ei(ωiso −ωiso )TR 2 eiωisot × × ∑ eiN ωR t ∑ (−1)( M − N ) FMj FMij − N FNi* . N (1.44) M А интенсивность центрального и ssb пиков определяется как ij I NtrODESSA = ∑∑ Qij (τ m )(−1) M − N I NM , i, j M 36 (1.45) ij где обозначения Qij(τm), M, N и I NM играют ту же самую роль, что и в рассмотренном выше двумерном обменном эксперименте. Таким образом, в эксперименте trODESSA пик в одномерном спектре является суммой пика простого одномерного спектра и всех кросс-пиков спектра двумерного обменного эксперимента, расположенных вдоль одной вертикали (или, что то же самое, горизонтали) с чередующимися знаками. Если в двумерном эксперименте об обмене можно судить по наличию недиагональных кросс-пиков, то в эксперименте trODESSA об обмене свидетельствует изменение амплитуды пика в спектре при изменении времени смешивания. При этом следует оговориться, что изменение интенсивности происходит также и вследствие спин-решеточной релаксации. Поэтому для корректного разделения этих двух эффектов необходимо также провести отдельный эксперимент по измерению времени релаксации Т1, впрочем, это справедливо для обменных экспериментов всех типов. Преобразование двумерного обменного эксперимента к его одномерной модификации позволяет сократить время накопления сигнала при одном и том же наборе времен смешивания в несколько раз при сохранении качества и количества информации о молекулярной динамике. Это принципиально расширяет применимость обменного эксперимента для детального изучения молекулярной динамики в сложных полимерных системах. Как отмечалось выше, для максимального проявления эффекта обмена в спектре необходимо использовать как можно меньшие скорости ВМУ. В то же время, для повышения чувствительности сигнала и спектрального разрешения более предпочтительно вращать образец как можно быстрее. Это противоречие частично снимается в самой последней модификации одномерного обменного эксперимента, которая имеет броское название CODEX (Centerband-Only Detection of EXchange) [25,26]. Импульсная последовательность этого эксперимента представлена на Рис. 1.7. Ее главная особенность состоит в том, что до и после времени смешивания на спины воздействует цикл из m 1800 импульсов (m – строго нечетное число), разделенных между собой полупериодом ВМУ. Физический смысл этих импульсов состоит в том, что они не позволяют усреднить АХС даже при очень быстром ВМУ. Их действие в некотором смысле аналогично действию 1800 импульсов в хорошо известной последовательности Карра-Парселла, где они компенсируют эффект неоднородности магнитного поля. В данном же случае 1800 импульсы компенсируют 37 Рисунок 1.7. Импульсная последовательность одномерного твердотельного обменного ЯМР эксперимента CODEX. эффект ВМУ за счет того, что каждые полпериода ВМУ они меняют знак фазы прецессирующей намагниченности. В результате АХС в периоды до и после времени смешивания не усредняется, что позволяет получать информацию о реориентации тензора АХС, и в то же время благодаря быстрому ВМУ спектр ЯМР имеет более интенсивные центральные пики, что улучшает отношение сигнала к шуму и спектральное разрешение. Аналог ур-я (1.44) для эксперимента CODEX имеет следующий вид: fidγij ( m, TR , τ m , t ) = Qij (τ m )e − ( t + ( m +1)TR ) T2 eiωisot ∑ eiNω R t C Nij (α , β ) , i (1.46) N где C (α , β ) = ∑ e ij N i( M − N )π M ⎡ 1 ×⎢ ⎣ 2π 2π ∫e -i(M − N )ϑ (f j ⎡ 1 ⎢ ⎣ 2π 2π iM γ i* j* i ∫ e f (γ ) ( f (γ ) f (γ ) ) 0 (ϑ ) f (ϑ ) ) i* m +1 0 38 ⎤ ⎡ 1 dϑ ⎥ × ⎢ ⎦ ⎣ 2π 2π ∫e 0 -iN φ m +1 ⎤ dγ ⎥ × ⎦ ⎤ f (φ )dφ ⎥ ⎦ i . (1.47) Ну а интенсивность центрального и ssb пиков без учета спин-решеточной релаксации выражается как: INTN (τ m ) = ∑ Qij (τ m ) I Nij ,CODEX , (1.48) i, j где I Nij ,CODEX = 1 4π 2π π 0 0 ij ∫ dα ∫ CN (α , β ) sin β d β . (1.49) Эксперимент CODEX работает так же, как и trODESSA – обмен проявляется в зависимости амплитуды пиков спектра от времени смешивания, которая, опять же, должна быть откорректирована с учетом спин-решеточной релаксации. Чем больше m, тем чувствительнее эксперимент к обмену (т.е. тем сильнее зависимость амплитуды пиков от времени смешивания). В эксперименте trODESSA подобное увеличение может быть достигнуто только уменьшением скорости ВМУ, что, как упоминалось выше, приводит к ухудшению отношения сигнала к шуму и разрешению спектра. В то же время, увеличение частоты ВМУ и числа m в эксперименте CODEX также имеет естественные пределы – при высоких скоростях ВМУ длительность 1800 импульса становится сравнимой с периодом вращения, что крайне усложняет количественный анализ данных. Еще одна особенность этого эксперимента состоит в том, что он, в отличие от trODESSA, не чувствителен к химическому обмену, т.е. изменению изотропного химсдвига, а отражает только реориентацию тензора АХС. Это происходит благодаря наличию 1800 импульсов, которые нивелируют разность скоростей прецессии намагниченности до и после времени смешивания, возникающую вследствие разности изотропных химсдвигов. Это хорошо известное свойство последовательности Карра-Парселла. Вследствие этого в ур-и (1.46) отсутствует множитель e j i i(ωiso −ωiso )TR 2 (см. ур-е (1.44)), который отвечает за чувствительность обменного эксперимента к химическому обмену. В заключение отметим, что хотя изложенная выше информация о свойствах обменных твердотельных ЯМР-экспериментах не является исчерпывающей, она вполне достаточна для количественного анализа экспериментальных данных, которые будут представлены ниже. 39 1.6. ЯМР-релаксация. Обменные эксперименты мы описали достаточно подробно, потому что последние методические разработки в этой области магнитного резонанса не успели попасть в монографии и пока не вышли из категории методических новинок. Что же касается ядерной магнитной релаксации, то она стала использоваться в молекулярно-динамических исследованиях практически сразу после открытия ЯМР, и к настоящему времени она является рутинным методом. Поэтому здесь мы ограничимся в основном только приведением основных формул, которые в дальнейшем будут нужны нам для анализа экспериментальных данных. Начнем с того, что если речь идет о ЯМР-релаксации на ядрах 13С, 15N и 1Н в биополимерах без парамагнитных включений, то из всех механизмов ядерной магнитной релаксации в подавляющем большинстве случаев определяющую роль играет диполь-дипольный механизм. Диполь-дипольное взаимодействие между магнитными ядрами определяется расстоянием между ними и углом между вектором, их соединяющим, и внешним магнитным полем. Молекулярное движение может модулировать обе эти величины, что и обуславливает механизм дипольдипольной релаксации. Времена релаксации Т1 и Т2, обусловленные гомоядерным диполь-дипольным взаимодействием (т.е. взаимодействием между одинаковыми магнитными ядрами) определяются следующим образом: 1 2 = T1 5 1 1 = T2 5 2 γ 4 I ( I + 1) ( J (ω0 ) + 4 J (2ω0 ) ) , (1.50) γ 4 I ( I + 1) ( 3 J (0) + 5 J (ω0 ) + 2 J (2ω0 ) ) , (1.51) 2 где ħ - постоянная Планка, деленная на 2π, γ - гиромагнитное отношение ядер, I – спин ядра, ω0 – круговая резонансная частота, а J(ω) – спектральная плотность движения, о которой пойдет речь ниже. Аналогичные формулы для гетероядерного диполь-дипольного взаимодействия между спинами S и I выглядят так: 40 1 2 = T1 15 2 γ I2γ S2 S ( S + 1) ( J (ω I − ωS ) + 3 J (2ω I ) + 6 J (ω I + ωS ) ) , 1 1 = T2 15 2 γ I2γ S2 S ( S + 1) ( 4 J (0) + J (ωI − ωS ) + + 3 J (2ω I ) + 6 J (2ωS ) + 6 J (ωI + ωS ) ) , (1.52) (1.53) где ωI и ωS – резонансные частоты для ядер I и S, соответственно. (Данные формулы описывают времена релаксации ядра I.) Следует заметить, что формулы (1.51) и (1.53) для поперечной релаксации справедливы только для изотропного движения, то есть для растворов или расплавов, для твердых тел они неприменимы. Для изучения молекулярной динамики в растворах, кроме того, часто используются измерения величины ядерного эффекта Оверхаузера: NOE = 1 + γI 6 J (ωI + ωS ) − J (ωI − ωS ) . γ S J (ωI − ωS ) + 3J (2ωI ) + 6 J (ωI + ωS ) (1.54) Следует оговорить, что приведенные выше выражения для времен релаксации соответствуют парному взаимодействию магнитных ядер. В случае коррелированного взаимодействия трех и более ядер выражения для времен релаксации могут усложниться, поскольку диполь-дипольное взаимодействие, строго говоря, величина не аддитивная. Однако как показано в книге Абрагама [27] (глава 8), взаимодействие трех или даже четырех магнитных ядер вызывает крайне незначительные изменения, как формы релаксационного спада, так и среднего времени релаксации. Поэтому в дальнейшем мы этим будем пренебрегать и полагать, что скорость релаксации, вызываемая взаимодействием магнитного ядра с двумя другими магнитными ядрами, одинаковыми или нет, равна сумме скоростей релаксации, которые вызываются взаимодействием с этими ядрами по отдельности. Что касается измерения Т2 или, что то же самое, ширины линии в твердом состоянии, то эта величина определяет диполь-дипольное взаимодействие магнитных ядер, усредненное молекулярными движениями, имеющими времена корреляции много короче, чем Т2. Преимущество поперечной релаксации в твердом теле состоит в том, что за одно недолгое и несложное измерение можно сразу 41 определить степень усреднения диполь-дипольного взаимодействия молекулярным движением (параметр порядка, см. ниже) дающую представление об амплитуде движения. Хотя такой одиночный эксперимент сам по себе не содержит никакой информации о временах корреляции движения, кроме того, что оно короче, чем Т2. Двумерные последовательности WISE [28] и DIPSHIFT [29], в детали которых мы сейчас вдаваться не будем, позволяют измерять константы дипольных взаимодействий 1Н-1Н и 1Н-13С, соответственно, селективно для различных протонов (углеродов). Селективность обеспечивается изотропными химическими сдвигами различных углеродов. Это, безусловно, увеличивает ценность получаемой с помощью этих экспериментов динамической информации, но ее физическая суть – усреднение дипольного взаимодействия молекулярным движением – остается все той же. Кроме стандартных времен продольной и поперечной релаксации для исследования молекулярной динамики в микросекундной области также используются измерения времени спин-решеточной релаксации во вращающейся системе координат T1ρ. В этом эксперименте прецессирующая намагниченность ориентируется вдоль переменного поля B1, которое становится осью квантования. B Тогда измеряемое время релаксации наиболее чувствительно к тем молекулярным движениям, частота которых близка к резонансной частоте во вращающейся системе координат. Последняя определяется полем B1, которое по величине на несколько B порядков меньше B0. Для гомоядерного дипольного взаимодействия время B релаксации T1ρ имеет вид 1 1 = T1ρ 5 2 γ 4 I ( I + 1) ( 3J (2ω1 ) + 5 J (ω0 ) + 2 J (2ω0 ) ) , (1.55) где ω1 – круговая резонансная частота во вращающейся системе координат. Для гетероядерного взаимодействия Т1ρ определяется выражением 1 1 = T1ρ 15 2 γ I2γ S2 S ( S + 1) ( 4 J (ω1 ) + J (ω I − ωS ) + + 3 J (ωI ) + 6 J (ωS ) + 6 J (ω I + ωS ) ) 42 . (1.56) Важным условием применимости ур-й (1.55) и (1.56) в твердом теле является условие ω1>>ωloc, где ωloc – круговая резонансная частота, соответствующая локальному магнитному полю, т.е. полю, которое наводят друг на друга взаимодействующие магнитные ядра. Если это условие не соблюдается, то экспериментально наблюдаемая скорость релаксации T1−ρ1 включает в себя дополнительный, так называемый спин-спиновый вклад в релаксацию, который существенно затрудняет количественный анализ релаксационных данных, и делает измерения времени релаксации T1ρ практически неприменимыми для исследования молекулярной динамики [30]. Эта проблема будет подробно рассмотрена нами в последующем. 1.7. Корреляционная функция молекулярного движения и безмодельный подход. Одно из ключевых понятий, используемое в вышеприведенных формулах, спектральная плотность молекулярного движения J(ω). Именно связь между экспериментально измеряемыми временами релаксации и спектральной плотностью позволяет использовать ЯМР-релаксацию для исследования параметров молекулярной динамики. Спектральная плотность является Фурье-преобразованием корреляционной функции диполь-дипольного взаимодействия, которая выражается следующим образом: C (t ) = 1 1 1 1 (3cos 2 ϑ (0) − 1) 3 ⋅ (3cos 2 ϑ (t ) − 1) 3 , 2 r (0) 2 r (t ) (1.57) где r(t) – расстояние между магнитными ядрами в момент времени t, ϑ(t) - угол между межъядерным вектором и постоянным внешним магнитным полем в момент времени t, угловые скобки обозначают усреднение по времени и/или по ансамблю. Если взаимодействующие магнитные ядра принадлежат одной химической группе, то расстояние между ними фиксировано, и величина r может быть вынесена за скобки. Кроме того, для изотропных образцов корреляционная функция может быть преобразована к следующему виду: 43 C (t ) = 1 1 (3cos 2 θ (0, t ) − 1) , 6 r 2 (1.58) где θ(0,t) – угол между одним и тем же межъядерным вектором в моменты времени 0 и t. Корреляционная функция содержит самую детальную информацию о молекулярной динамике, которую можно извлечь с помощью экспериментальных методов. Более детальную информацию может дать только компьютерное моделирование, однако, как отмечалось выше, оно может быть отнесено к экспериментальным методам только с определенными натяжками. В самом простейшем случае нормированная на единицу корреляционная функция имеет вид затухающей экспоненты: ( C (t ) = exp − t ) τ , (1.59) где τ – время корреляции, характеризующее временной масштаб молекулярного движения. Корреляционная функция вида (1.59) соответствует изотропному броуновскому вращению жесткой шарообразной частицы в вязкой среде. Но чаще всего она, конечно же, имеет гораздо более сложный вид. Одна из основных методических проблем, встречающихся при анализе молекулярной динамики с помощью релаксационных ЯМР-экспериментов, извлечение формы корреляционной функции из времен релаксации. Строго говоря, получить функцию из одного или ограниченного набора чисел, т.е. времен релаксации, нельзя. Чтобы решить эту проблему, форма корреляционной функции обычно аппроксимируется несколькими параметрами, характеризующими молекулярную динамику, а те уже, в свою очередь, тем или иным способом определяются из экспериментально измеряемых времен релаксации. Наиболее известный способ подобной аппроксимации в исследованиях динамики белков методом ЯМР-релаксации – это так называемый безмодельный подход, предложенный Липари и Сзабо [15,16]. Основная идея этого подхода – разделение корреляционной функции анизотропного молекулярного движения на усредняемую и неусредняемую части: ( C (t ) = S 2 + (1 − S 2 ) exp − t 44 ) τ , (1.60) где S2 – параметр порядка, определяющий долю усреднения диполь-дипольного взаимодействия молекулярным движением. S2 меняется от 0 до 1. При S2=0 движение полностью усредняет межъядерное взаимодействие, что соответствует изотропному движению. Если говорить о белках, то полностью изотропное движение может наблюдаться только в растворах. S2=1 означает отсутствие движения вообще. Исходя из определения корреляционной функции (1.58), параметр порядка можно представить в следующем виде: S2 = 1 (3cos 2 θ (0, ∞) − 1) . 2 (1.61) Параметр порядка S2 играет роль безразмерной амплитуды молекулярного движения: чем меньше S2, тем больше амплитуда. Определение «безмодельный» к этому способу анализа ЯМР-релаксационных данных приписывается, потому что одна и та же степень усреднения диполь-дипольного взаимодействия может реализоваться в различных моделях движения, например, в скачках между двумя или тремя положениями, реориентации в конусе или в пределах одной плоскости и т.д. Зная модель движения, мы всегда однозначно можем определить S2, но обратную задачу однозначно решить нельзя, см. Рис. 1.8. Это является одной из основных проблем при анализе времен релаксации, и ее решение будет одной из основных задач диссертации. Поскольку в работе Липари и Сзабо речь шла об анализе ЯМР-релаксационных данных в растворах белков, то общая корреляционная функция движения записывалась как произведение корреляционной функции внутреннего движения на корреляционную функцию броуновского вращения белка как целого, которая имела вид (1.59): ( ) ⎛ ⎞ C (t ) = ⎜ S 2 + (1 − S 2 ) exp ⎛⎜ − t ⎞⎟ ⎟ exp − t τ τR = i ⎠⎠ ⎝ ⎝ ( = S exp − t 2 τR ) ( + (1 − S ) exp − t 2 τ' ) , (1.62) где τR и τi – времена корреляции броуновского вращения и внутреннего движения, соответственно. Время τ’ определяется как 45 Рисунок 1.8. Параметр порядка S2 как функция угловой амплитуды для различных моделей движения. 1 1 1 = + . τ ' τ R τi (1.63) Уравнение (1.63) наглядно демонстрирует невозможность использования ЯМРрелаксации в растворах для изучения внутренних молекулярных движений белков, время корреляции которых длиннее, чем τR, поскольку при любом τi всегда будет выполняться неравенство τ’<τR. Эта проблема упоминалась выше. Выражение (1.62) предполагает, что форма корреляционной функции может быть параметризована тремя параметрами – S2, τR и τi. В растворах на одной резонансной частоте чаще всего измеряются три релаксационных параметра - Т1, Т2 и NOE. Таким образом, задача определения микродинамических параметров из данных по ЯМР-релаксации в принципе может быть решена. Следует сказать, что безмодельный подход применялся за последние 20 лет очень широко. Со временем он несколько усложнился за счет введения дополнительной компоненты в корреляционную функцию внутреннего движения [31] и учета несферической 46 формы белковой глобулы [32], но чаще всего он по-прежнему соотносится с именами Липари и Сзабо. Работы [15,16] без сомнения являются самыми цитируемыми в статьях по ЯМРрелаксационным исследованиям динамики белков, а имена их авторов стали почти что нарицательными для специалистов в этой области. Однако крайне любопытно отметить, что, по сути, тот же самый безмодельный подход был предложен четырьмя годами ранее в статье Кинга и Жардецкого [33]. Тем не менее, судьба этой работы оказалась менее счастливой. Дело в том, что когда Олег Жардецкий применил свой подход для анализа данных по ЯМР-релаксации ядер 13 С в растворе ингибитора бычьего панкреатического трипсина [34], он допустил явную и очевидную ошибку: из наблюдаемых в эксперименте трех компонент корреляционной функции движения самую медленную он отнес к медленным внутренним движениям, а среднюю – к броуновскому вращению белка как целого, что, как мы только что показали, невозможно в принципе. Эта ошибка была упомянута в работах [15,16] и, видимо, не в последнюю очередь по этой причине, при упоминании безмодельного подхода большинство исследователей традиционно ссылаются на Липари и Сзабо. Хотя справедливости ради стоит заметить, что идея формального разделения величины диполь-дипольного взаимодействия на усредняемую и неусредняемую молекулярным движением части встречалась и ранее, в частности, в книге Абрагама [27] и в других работах. Ну а что касается медленной компоненты корреляционной функции движения в белковых растворах [34], то она будет детально рассмотрена нами в дальнейшем. 1.8. ЯМР и химический обмен в белковых растворах. Несмотря на эффект «обрезания» корреляционной функции внутреннего движения изотропным броуновским вращением белка как целого, см. ур-я (1.62) и (1.63), ЯМР, тем не менее, позволяет получать информацию и о гораздо более медленных по сравнению с броуновским вращением внутренних молекулярных движениях. Как упоминалось в самом начале этой главы, это возможно благодаря модуляции изотропного химического сдвига магнитных ядер внутримолекулярными конформационными переходами. Если характерное время последних составляет доли и единицы секунд, то в ЯМР-спектре 47 видны отдельные линии, соответствующие различным конформерам, и тогда процесс молекулярной динамики доступен для изучения методами обменной двумерной спектроскопии, описанными выше. Хотя при исследовании динамики белков более распространен случай, когда время корреляции медленных движений находится в микро- миллисекундном диапазоне. Это соответствует условию быстрого обмена, и тогда в спектре проявляется только одна линия с усредненным химсдвигом. Хотя в спектре химический обмен сам по себе непосредственно не проявляется, его характеристики можно определить с помощью измерения скорости спин-спиновой релаксации R2. Дело в том, что случайные модуляции резонансной частоты, происходящие во время спада свободной индукции, вызывают дополнительную дефазировку прецессирующей намагниченности, что приводит к увеличению экспериментально наблюдаемой скорости R2. В начале 90-х годов исследователи стали замечать, что во многих случаях ЯМР-релаксационные данные в белках невозможно адекватно объяснить без учета дополнительного вклада в скорость поперечной релаксации, отвечающего за химический обмен. Этот вклад обозначают как Rex. Чаще всего, Rex вводится в анализ времен релаксации как дополнительный неизвестный подгоночный параметр, наряду с параметрами порядка и временами корреляции. Такой анализ имеет существенные недостатки. Во-первых, введение дополнительного подгоночного параметра ведет к большей неопределенности величин других микродинамических параметров. Во-вторых, величина Rex сама по себе ничего не может сказать о характеристиках медленного молекулярного движения, кроме того, что оно есть. Во второй половине 90-х годов получили широкое распространение ЯМРметоды, позволяющие более детально исследовать химобмен в белках в микромиллисекундном диапазоне [11,35,36]. Это, прежде всего, измерение R2 как функции задержки между рефокусирующими 1800-импульсами в хорошо известной последовательности Карра-Парсела-Мейбума-Гилла (КПМГ) и измерение R1ρ (скорости спин-решеточной релаксации во вращающейся системе координат) как функции величины поля B1 (поле спин-лока). При аппроксимации процесса обмена B простейшей состояниями, моделью скорость скачков между поперечной двумя химически релаксации, неэквивалентными измеренную с помощью последовательности КПМГ, в пределе быстрого обмена можно выразить как [37,38]: 48 ⎡ ⎛τ τ R2 = R2 dd + p (1 − p )Δω 2τ ex ⎢1 − 2 ex tanh ⎜ CPMG τ CPMG ⎝ 2τ ex ⎣ ⎞⎤ ⎟⎥ , ⎠⎦ (1.64) где R2dd – диполь-дипольный вклад в релаксацию, p –равновесная населенность одного из состояний, Δω - разница между химическими сдвигами двух состояний, τex – время обмена, τCPMG – задержка между 1800-импульсами. Если исследуемая система такова, что экспериментально достижимы предельные случаи τCPMG>>τex и τCPMG<<τex, то из зависимости R2(τCPMG) можно извлечь следующие параметры: R2dd, τex, и произведение p(1-p)Δω2. Из-за эффекта «обрезания» корреляционной функции (см. ур-я (1.62) и 1.63)), в растворе выполняется равенство J(0)=J(ω1), и потому скорости R2 и R1ρ равны. При этом следует отметить, что при измерении R1ρ очень часто частота поля спин-лока ω1 сравнима с разбросом химсдвигов различных ядер в ЯМР-спектре. Поэтому в общем случае экспериментально наблюдаемая скорость R1ρ определяется следующим образом: R1ρ = R1 cos2 θ + R2 sin 2 θ , (1.65) где R1 – скорость спин-решеточной релаксации, θ - угол между вектором B1 и B внешним магнитным полем B0. Более того, в импульсных последовательностях для B измерения R1ρ, которые используются в последние годы [39,40], специально вводится значительная отстройка частоты поля B1 от резонанса. В этом случае B эффективная частота поля спин-лока определяется как ω1e = ω12 + δω 2 , (1.66) где δω – величина отстройки от резонанса. Этот прием позволяет в несколько раз увеличить амплитуду поля спин-лока, а значит и диапазон частот ω1, без увеличения мощности передатчика, который может привести к перегреву образца. Так же, как и в случае последовательности КПМГ, химический обмен вызывает дополнительный вклад в скорость R2, который зависит от частоты ω1. С учетом этого, в приближении 49 быстрого обмена между двумя состояниями ур-е (1.65) можно переписать в следующем виде [41,42]: ⎡ ⎤ τ ex 2 R1ρ = R1 cos θ + sin θ ⎢ R2 dd + p(1 − p)Δω 2⎥, 1 + (ω1eτ ex ) ⎥⎦ ⎢⎣ 2 2 (1.67) где параметры R2dd, p и Δω имеют тот же смысл, что и в ур-и (1.64). Из анализа дисперсий R1ρ(ω1e) можно определить те же самые параметры, что и в эксперименте КПМГ. Разница между этими двумя экспериментами заключается в том, что последовательность КПМГ более удобна для исследования химобмена со временами корреляции в миллисекундном диапазоне, а измерения R1ρ – в микросекундном. В последние несколько лет появились методы, позволяющие регистрировать не просто изменения изотропного химсдвига, а коррелированные изменения химсдвигов двух близко расположенных магнитных ядер [43,44]. Эти эксперименты позволяют определить протяженность участков белка, подверженных одному и тому же медленному движению. Тем не менее, несмотря на интересные методические разработки, всем ЯМРметодам, регистрирующим изменение изотропного химического сдвига, присущ один весьма существенный недостаток, который невозможно исправить в обозримом будущем. Этот недостаток заключается в том, что величина химического сдвига, как и амплитуда его изменения, зависит от очень большого числа структурных и химических свойств исследуемой макромолекулы. До настоящего времени не создано надежных алгоритмов расчета химического сдвига по структурным данным, и уж тем более не решена обратная задача. Соответственно, определяемое из эксперимента изменение химсдвига в принципе не может дать никакой информации об амплитудных или геометрических характеристиках медленных молекулярных движений. Более того, непосредственно из эксперимента невозможно определить, подвержено ли движению само магнитное ядро, за которым наблюдает исследователь, или окружение этого ядра (например, бензольное кольцо ближайшей ароматической группы), что также может вызывать изменение химсдвига. Хотя все эти недостатки подразумеваются сами собой, тем не менее, данные эксперименты 50 применяются в белковых растворах для изучения медленных молекулярных движений достаточно широко – просто за неимением лучшего. 1.9. Особенности проведения ЯМР-экспериментов на различных магнитных ядрах. Описанные выше эксперименты в принципе могут быть проведены на всех магнитных ядрах без исключения. Но на практике по ряду причин разные ядра в разной степени подходят для тех или иных экспериментов. При исследовании структуры и динамики белков методом ЯМР в подавляющем большинстве случаев используется всего четыре типа магнитных ядер – 1Н, 2Н, 13С и 15N. Есть единичные примеры применения 19 F, и, кроме того, при изучении характеристик гидратной воды, исследователи изредка проводят эксперименты на ядрах 17О. В исследованиях липидов довольно часто используются ядра 31 Р, но для белков это, по вполне понятным причинам, экзотика. Эффективность и удобство применения различных магнитных ядер для получения той или иной структурной или динамической информации обуславливают следующие факторы: естественное содержание изотопа, чувствительность ЯМР-сигнала, типичный разброс (дисперсия) изотропных химических сдвигов, типичные величины АХС и, конечно же, локализация магнитного ядра в химической структуре белка или полипептида. Протоны имеют самую высокую чувствительность и почти стопроцентное естественное содержание. ЯМР-эксперименты на протонах легки, быстры и удобны. Но, тем не менее, они не очень подходят для получения детальной селективной информации о динамических свойствах белков. Даже в небольшом белке протонов очень много, а дисперсия их химических сдвигов не слишком большая. Поэтому получить высокое разрешение и полное соотнесение протонного спектра даже в растворе, не говоря уже о твердом теле, практически невозможно, по крайней мере, без применения многомерной ЯМР-спектроскопии. В твердых телах ситуация еще более усложняется за счет очень быстрой спиновой диффузии между протонами. Это приводит к усреднению времен спин-решеточной релаксации различных протонов, а значит, к потере какой-либо селективности динамической информации. Протоны также практически неприменимы для обменных экспериментов – во-первых, из-за все той же спиновой диффузии и, во-вторых, из-за того, что межпротонное диполь51 дипольное взаимодействие намного превышает АХС. Поэтому протоны в исследованиях динамики белков применяются в основном в тех случаях, когда стоит задача быстрого и недорогого получения усредненной по всему белку информации с помощью ЯМР-релаксационных методов. Тем не менее, необходимо отметить, что благодаря своей высокой чувствительности, протоны очень широко применяются для усиления сигнала от менее чувствительных ядер (15N и 13 С) как в растворах (последовательности INEPT и DEPT), так и в твердом теле (кросс-поляризация). Но при этом следует иметь в виду, что в этом случае протоны выступают не как физические зонды, а только как передаточное звено между другими магнитными ядрами и ЯМР-спектрометром. Ядра дейтерия (2Н) имеют низкое естественное содержание и потому проведение ЯМР-экспериментов с ними всегда сопряжено с изотопным обогащением белка. Как и у протонов, дисперсия изотропных химических сдвигов ядер дейтерия в белках очень узкая. Поэтому для получения селективной (т.е. локализованной по структуре) динамической информации с помощью ядер дейтерия не обойтись без селективного изотопного обогащения и/или гетероядерных корреляционных импульсных последовательностей. Основное преимущество дейтеронов перед остальными магнитными ядрами, используемыми в белковых исследованиях, - очень высокая АХС, достигающая сотен килогерц в частотных единицах. Это делает их крайне привлекательными для использования в экспериментах, детектирующих реориентацию тензора АХС. До настоящего времени подавляющее число работ по анализу внутренней динамики белка по форме линии ЯМР-спектра статического образца (см. пункт 1.2) было проведено именно с использованием ядер дейтерия. Одновременно с анализом формы линии, дейтерий можно использовать и в релаксационных экспериментах, что расширяет частотный диапазон исследования внутренней динамики. Кроме молекулярно-динамических исследований ядра дейтерия также очень удобны и, соответственно, широко применяются для определения статической ориентации молекул в макроскопически ориентированных образцах. Преимущества ядер дейтерия очень хорошо и подробно описаны в обзоре [45]. Ядра 13 С имеют, пожалуй, самые оптимальные характеристики для исследования динамики белков. Углеродов в белке существенно меньше, чем 52 протонов, и они имеют широкую дисперсию изотропных химсдвигов, что позволяет получать спектры высокого разрешения даже в твердом теле (разумеется, с использованием ВМУ и протонного «декаплинга»). Хотя одномерной спектроскопии все равно недостаточно для получения полного разрешения и соотнесения линий даже в небольшом белке, всегда можно отличить друг от друга карбоксильные, ароматические, и алифатические углероды, поскольку их химические сдвиги группируются в разных областях ЯМР-спектра. Кроме того, во многих случаях в одномерном спектре можно различить метиновые, метиленовые и метильные углероды. Во многих случаях это позволяет получить селективную динамическую информацию без селективного изотопного обогащения. Естественное содержание изотопа 13 С – всего немногим более одного процента, но этого вполне хватает для получения приемлемого сигнала в современных ЯМР-спектрометрах с использованием метода кросс-поляризации. В то же время, при таком низком содержании спиновая диффузия между ядрами 13 С в большинстве случаев пренебрежимо мала. Во многих случаях используется тотальное либо селективное обогащение белков изотопом 13 С. В современных исследованиях тотальное 13 С/15N обогащение – необходимая процедура для соотнесения линий в многомерных ЯМРспектрах и определения структуры белков. В то же время, применять селективное мечение изотопом 13С для получения селективной динамической информации имеет смысл только для небольших пептидов, поскольку в больших белках сигнал от 100%-обогащенного отдельного углерода все равно будет теряться на фоне сигнала от остальных ядер 13 С естественного содержания. Алифатические углероды имеют небольшую степень АХС, а карбоксильные – наоборот, весьма заметную. Как и в случае ядер дейтерия, проведение ЯМР-экспериментов на ядрах 15 N всегда подразумевает применение тотального либо селективного изотопного обогащения белка, потому что эти ядра имеют низкое естественное содержание и низкую чувствительность. Основное преимущество ядер азота состоит в том, что они распределены вдоль основной цепи по всему белку, и в то же время их гораздо меньше, чем протонов или углеродов. Это позволяет относительно легко добиваться полного соотнесения линий в двумерном растворном ЯМР-спектре для тотально 15Nобогащенных белков молекулярной массой до 30-40 кДа. Ядра 15 N очень часто используются в растворах, в твердом теле – гораздо реже. АХС ядер азота, 53 локализованных на основной цепи, вполне достаточна для проведения обменных экспериментов и экспериментов по анализу формы линии, хотя они и уступают в этом качестве дейтеронам. Ядра 15 N также используются и в ЯМР-релаксационных экспериментах. Благодаря своему низкому гиромагнитному отношению, они имеют наименьшую константу диполь-дипольного взаимодействия с протонами и потому они имеют самые длинные из всех ядер времена релаксации. В некоторых случаях это преимущество, в некоторых – недостаток. Конечно же, в каждом конкретном случае могут быть свои специфические факторы, обуславливающие удобство и привлекательность или наоборот, бесполезность использования тех или иных магнитных ядер для тех или иных целей. В то же время, общей закономерностью является то, что одновременное использование разных магнитных ядер в одном и том же образце может многократно увеличить количество и точность молекулярно-динамической информации. Увы, технически это выполнимо далеко не всегда. 1.10. Конформационная динамика белков. В этой части работы мы приведем примеры применения описанных выше ЯМРэкспериментов для исследования динамики белков в их историческом развитии и опишем основные закономерности, вытекающие из результатов этих исследований. Первым экспериментальным свидетельством конформационной подвижности белков стали данные по водородному обмену [46]. А первые работы по ЯМР-исследованию динамики белков стали появляться примерно в середине 60-х годов ХХ века, однако очень активно ЯМР для этих целей стал применяться только со второй половины 70х годов. 1.10.1. Белки в растворе Важным свидетельством существования крупномасштабной динамики белков стал анализ формы спектров высокого разрешения протонов ароматических колец [47-49], который показал, что в белке есть такие движения, которые приводят к появлению свободного пространства вокруг ароматических колец и позволяют их 180-градусные провороты (флипы) вокруг оси Cβ-Cγ (она также является осью 54 симметрии кольца). Характерное время корреляции этих проворотов составляет доли миллисекунды. Наряду со спектральным анализом, в 70-х - 80-х годах был проведен ряд экспериментов по исследованию динамики белков в растворе методом ЯМРрелаксации на ядрах установлено, что 13 С [34,50-54]. Из анализа релаксационных параметров было кроме крупномасштабных и относительно редких конформационных переходов, описанных выше, в белке есть также более быстрые и малоамплитудные колебания со временами корреляции порядка единиц и долей наносекунды. Типичные значения угловых амплитуд таких движений составляют 100-300, причем боковые цепи имеют бóльшую амплитуду по сравнению с основной цепью, что вполне ожидаемо и объяснимо. Настоящий бум в релаксационных исследованиях динамики белков в растворах пришелся на начало и середину 90-х годов. Толчок ему дало изобретение способа наблюдения ядер, имеющих низкую чувствительность, не напрямую, а через протоны [55]. Такой способ, во-первых, многократно сокращает время накопления сигнала от ядер двумерную разрешение. 13 Си 15 N и, во-вторых, используя гетероядерную корреляционную спектроскопию, Ставшая к позволяет значительно улучшить настоящему времени стандартной спектральное импульсная последовательность HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence) обеспечивает полное разрешение и соотнесение линий в двумерном 1Н-15N корреляционном спектре для белков, имеющих в своем составе до ~200 аминокислотных остатков. Это позволяет проводить релаксационные измерения одновременно сразу для всех ядер азота, находящихся на основной цепи. Существенным в этих экспериментах является то, что они не требуют селективного 15N-изотопного обогащения белка, они позволяют работать на тотально обогащенных образцах. А тотальное обогащение значительно проще и дешевле. Число работ, использующих ядра 13С, пока меньше по той простой причине, что ядер углерода в белке значительно больше, чем ядер азота и, соответственно, получить полное соотнесение линий в этом случае намного сложнее (кроме того, что 13 С изотопы дороже, чем 15 N). С другой стороны, совершенно очевидно, что для детального изучения динамики боковых цепей белка без углеродов не обойтись. 55 Измеренные в эксперименте релаксационные параметры Т1, Т2 и NOE отражают реориентацию вектора N-H и в небольшой степени – вращение тензора АХС азота. В результате анализа всех релаксационных данных можно получить зависимости микродинамических параметров от номера остатка. Если в распоряжении исследователя имеется две или три резонансные частоты, число экспериментальных параметров увеличивается, что, безусловно, позволяет получить более точные значения микродинамических параметров. Известный нам рекорд – четыре резонансные частоты при изучении внутренней динамики методом ЯМР-релаксации высокого разрешения [56,57]. Это дает возможность не только точно определять значения микродинамических параметров, но и графически представить функцию спектральной плотности движения J(ω). Начиная с 1990 года, когда появилась первая работа по изучению динамики основной цепи белка на ядрах 15N с использованием детектирования ядер азота через протоны [31], этим методом было изучено очень много белков. К настоящему времени число подобных работ выросло до такой величины, что процитировать даже малую их толику достаточно затруднительно. Этим работам и применяющимся в них методическим подходам по изучению динамики белков в растворах с помощью релаксационных методов посвящен ряд обзоров [11,12,35,58-62]. При анализе релаксационных данных практически всегда использовался описанный выше безмодельный подход, как в простейшем изначальном варианте, предложенном Липари и Сзабо, так и с модификациями, включающими второе внутреннее движение, учет несферической формы белка и обменный член (см. выше). Конечно, разные белки ведут себя по-разному, тем не менее, из представленных результатов вытекают и общие закономерности, характерные практически для всех без исключения белков. Основная цепь глобулярного белка – относительно жесткая конструкция, общий параметр порядка внутреннего движения чаще всего имеет величину от 0.85 до 0.95. Исключение могут составлять концы полипептидной цепи, экспонированные в растворитель или не вовлеченные во вторичную структуру петли, которые могут иметь параметр порядка доходящий до 0.2-0.3. Хотя корреляционная функция описывалась дискретным набором экспоненциальных компонент, очевидно, что это только экспериментальное упрощение. Тем не менее, 56 можно заключить, что времена корреляции внутренних движений могут иметь широкий спектр - от единиц-десятков пикосекунд до долей и единиц наносекунды. С конца 90-х годов стали появляться работы по детальному исследованию медленной внутренней динамики белков в растворах методами химического обмена – последовательностью Кара-Парселла и измерениями дисперсии R1ρ. Оказалось, что многие (хотя далеко не все) остатки в белках проявляют молекулярную подвижность в микро-миллисекундном диапазоне времен корреляции. Как показывают результаты, во многих случаях характерное время медленного движения белка коррелирует с длительностью единичного каталитического акта. Например, время корреляции медленного движения в активном центре циклофилина А составляет сотни микросекунд и совпадает с продолжительностью каталитического цикла [63]. Аналогичная ситуация наблюдалась и для рибонуклеазы А [64]. Кроме того, во многих случаях наблюдалась корреляция между параметрами медленного движения и биологическим состоянием белка. В частности, уровень медленной динамики ДНК-связывающего домена Х-рецептора ретиноида значительно понижалась при связывании с участком ДНК [65]. Связывание с ДНК подавляет медленную динамику также и в белке Mbp1 [66]. Эти, а также многие другие данные свидетельствуют о непосредственной вовлеченности низкочастотной внутренней динамики белков в их биологическое функционирование. Пока накоплено не так много экспериментальных данных по одновременному исследованию как высокочастотной, так и низкочастотной динамики в одних и тех же белках. Тем не менее, пока никто не заметил какой-либо однозначной корреляции между параметрами быстрых и медленных внутренних движений. Впрочем, это выглядит не слишком неожиданно, поскольку природа этих движений сильно различается. 1.10.2. Белки в твердом состоянии Прежде всего, следует сказать о том, что применение ЯМР-релаксации в твердом теле имеет ограничения по сравнению с растворами. Как упоминалось выше, при исследовании динамики белков в растворе методом ЯМР-релаксации, обычно на каждой резонансной частоте измеряется три релаксационных параметра – Т1, Т2 и NOE. А в твердом теле T2 и NOE зависят не столько от динамики, сколько от структуры молекулы, и потому они не могут быть количественно проанализированы 57 в рамках формализма корреляционных функций, применяемого для анализа времени релаксации Т1. (Хотя, как указывалось выше, по величине Т2 можно судить о степени усреднения межъядерного дипольного взаимодействия молекулярным движением.) Соответственно, при одинаковом наборе резонансных частот (то есть спектрометров) в твердом теле число релаксационных параметров в три раза меньше, чем в растворе. Кроме Т1 еще остается время релаксации Т1ρ, однако и тут возникают затруднения, связанные именно с твердым телом. Дело в том, что в жестких полимерах условие ω1>>ωloc (см. заключительную часть пункта 1.6) очень часто не выполняется и, соответственно, ур-я (1.55) и (1.56) становятся непригодными для количественного анализа времен релаксации Т1ρ. Идеальным инструментом для детального исследования формы корреляционной функции движения является метод измерения времени релаксации Т1 с помощью циклирования магнитного поля (field-cycling) [67,68]. Этот метод позволяет измерять дисперсии (частотные зависимости) времени релаксации Т1 в диапазоне резонансных частот в несколько порядков величины. Но, увы, этот метод измерения невозможно реализовать на стандартных коммерческих ЯМР-спектрометрах, и, кроме того, он обладает низкой чувствительностью и низким спектральным разрешением. До сих пор эксперименты с циклированием магнитного поля на твердых биополимерах были выполнены только на протонах. Одно из самых первых исследований внутренней динамики белков в твердом состоянии методом твердотельного ЯМР [69] показало, что с повышением температуры ширина линии протонного спектра (второй момент) порошках белков уменьшается, причем во влажных белках уменьшается сильнее, чем в сухих. Это означает, что в белках есть внутренние движения в микросекундном диапазоне времен корреляции, и увлажнение увеличивает их амплитуду. В конце 70-х – начале 80-х годов обширный цикл экспериментов по исследованию внутренней динамики белков и полипептидов в твердом состоянии с помощью ЯМР-релаксационных методов был выполнен Эндрю с сотрудниками [7074]. В этих работах изучались температурные зависимости протонных времен релаксации в порошках нескольких белков и гомополипептидов при различной влажности. Измерялись времена релаксации Т1 и Т1D (релаксация в дипольной системе координат, т.е. в поле соседних магнитных ядер). Последнее чувствительно 58 к особо медленным движениям, частота которых соответствует частоте локального магнитного поля, которое имеет величину порядка 104 Гц. При недостатке резонансных частот и отсутствии структурных переходов в образце, измерения температурных зависимостей времен релаксации также могут дать детальную количественную информацию о молекулярной динамике. В частности, по форме температурной определить зависимости число времени движений в спин-решеточной исследуемом образце, релаксации можно имеющих сильно отличающиеся времена корреляции. Это число соответствует числу минимумов на этой зависимости. А допуская, что частота молекулярного движения зависит от температуры по закону Аррениуса, можно корреляции, параметр вычислить времена энергии активации, порядка и другие характеристики внутренней динамики. Данные исследования показали, что при низких температурах (ниже 200-250 К) целиком протонная релаксация определяется вращением протонов метильных групп (конечно, только в тех случаях, если они есть в образце) вокруг метильной оси группы, см. симметрии Рис. 1.9 (данные из работы [72]). Это очень специфический тип движения, потому что он всегда присутствует даже в очень жестких полимерах, и он всегда имеет высокую амплитуду вследствие стереохимического строения метильной группы. На фоне этого движения все остальные движения, имеющие корреляции, близкие просто не времена видны в Рисунок 1.9. Температурные зависимости времен релаксации протонов в твердом лизоциме. Три верхние зависимости – время Т1 при резонансных частотах (сверху вниз) 60, 30 и 18 МГц, нижняя зависимость – время релаксации Т1D. 59 протонной релаксации. Как показал количественный анализ, энергия активации вращения метильных протонов имеет величину порядка 10-15 кДж/моль, а время его корреляции при комнатной температуре составляет единицы-десятки пикосекунд. Кроме того, было показано, что единственное время корреляции этого движения не может адекватно описать релаксационные данные – для этого необходимо допустить наличие относительно широкого распределения времен корреляции, что отражает гетерогенность структуры белков. Кроме минимума, соответствующего вращению метильных протонов, при положительных температурах наблюдался перегиб в температурной зависимости Т1, свидетельствующий о наличии еще одного, гораздо более низкочастотного, движения (Рис. 1.9). Тем не менее, точно определить параметры этого движения не представлялось возможным, поскольку до минимума температурные зависимости не доходили, даже в случае измерения Т1D. В дальнейшем, Эндрю с соавторами опубликовали в журнале Solid State Nuclear Magnetic Resonance цикл работ по исследованию динамики различных биомолекул, в которых применялся прежний подход - измерения (в различных комбинациях) протонных Т1, Т1ρ, Т1D и Т2 в широком температурном диапазоне [75-83]. Различные минимумы в температурных зависимостях Т1, Т1ρ и Т1D, а также усреднения второго момента (удлинение Т2) с повышением температуры соотносились с движениями различных протонов в молекуле. Но в этих работах в целом крайне скупо обсуждается физический смысл полученных из релаксационных данных значений микродинамических параметров, что, на наш взгляд, существенно снижает значимость этих работ для понимания физических закономерностей молекулярной подвижности в исследованных веществах. Кроме группы Эндрю измерения протонных времен релаксации в биополимерах в широком температурном диапазоне с последующим их анализом в рамках безмодельного подхода были проведены и в других группах, в том числе и в нашей [84-89]. В этих работах было показано, что для адекватного описания данных необходимо было допустить, что в белках существует три типа молекулярных движений с сильно различающимися временами корреляции, одно из которых – быстрое вращение метильных протонов. В вышеприведенных работах по анализу температурных зависимостей ЯМРрелаксационных параметров всегда полагалось, что параметр порядка молекулярных 60 движений, то есть их амплитуда, не зависят от температуры. Для вращения метильных групп это допущение представляется вполне оправданным. В то же время, данные по мессбауэровской спектроскопии и нейтронному рассеянию [9] однозначно говорят о том, что амплитуда внутримолекулярных движений от температуры зависит, причем нелинейно. Такой характер зависимости объясняется концепцией конформационных подсостояний белка [9,90], вероятность переходов между которыми сильно зависит от температуры. Соответственно, при анализе ЯМР-данных в широком температурном диапазоне это обстоятельство необходимо тем или иным способом учитывать. В противном случае анализ может дать не совсем корректные количественные результаты. Кроме температурных зависимостей необходимо также упомянуть и об измерении подробных частотных зависимостей протонного Т1 в твердых биополимерах с помощью упомянутого выше метода циклирования магнитного поля. Такие эксперименты были в свое время проведены в группе Райнера Киммиха [91]. Были измерены дисперсии Т1 в диапазоне резонансных частот от 104 до 5·108 Гц в порошках нескольких белков и полипептидов. Оказалось, что в логарифмлогарифмическом масштабе эти дисперсии представляют собой прямые за исключением трех участков так называемых «дипов», то есть отрицательных пиков на зависимости Т1 от частоты, которые обусловлены взаимодействием протонов с квадрупольными ядрами 14 N основной цепи белка [92], см. Рис. 1.10 (данные из работы [68]). Во всех случаях время релаксации зависело от резонансной частоты по закону Т1=const·ν0.75±0.05. Даже без количественного анализа такая форма дисперсии свидетельствует о широком спектре времен корреляции внутренних движений. Причем, из-за короткого времени корреляции вращение метильных групп не давало вклада в скорость релаксации при комнатных температурах. Существенным в этой работе является то, что кроме протонной релаксации авторы также использовали анализ формы линии и измерения времен релаксации лабильных дейтеронов основной цепи белка (без использования метода циклирования магнитного поля, на одной частоте). Количественный сравнительный анализ протонной и дейтеронной релаксации показал, что амплитуда движения, определяемая из протонного эксперимента, многократно больше, чем это видно из дейтеронных данных. Хотя это сравнение было не совсем корректным, поскольку 61 сравнивалось движение боковых групп белка (протоны) с движением основной цепи (дейтероны), но разница в амплитудах была настолько большая, что только этим обстоятельством ее объяснить нельзя. Другой причиной этой разницы в амплитудах может служить то, что релаксация дейтеронов отражает только вращательное протонов – и движение, а вращательное, и поступательное движение протонов друг относительно друга. Отсюда следует очевидный вывод о том, что основная цепь белка практически не испытывает реориентационных движений, но при этом Рисунок 1.10. Дисперсии Т1 протонов в альфа-хемотрипсине (уровень гидратации 16% D2O) и сухом полиглицине при 150 С. «Дипы» при 0.68, 2.13 и 2.81 МГц обусловлены взаимодействием амидных протонов с ядрами 14N, одиночный «дип» при 148 кГц – взаимодействием с дейтеронами. При измерении дисперсии в полиглицине частотные области «дипов» сознательно исключались. в белках и полипептидах присутствуют значительные смещения протонов друг относительно друга. В качестве модели движения основной цепи Киммих с соавторами предложили диффузию дефектов, описываемую корреляционной функцией вида C(t)=t0.25 . Фурье-преобразование этой функции приводит к спектральной плотности вида J(ω)~ω0.75, что и объясняет наблюдаемую в эксперименте частотную зависимость Т1. Работа [91] является, к сожалению, единственным примером применения релаксометрии с циклированием магнитного поля для исследования динамики биополимеров в твердом состоянии. Кроме того, это также единственный известный нам пример совместного количественного анализа ЯМР-данных, полученных на различных магнитных ядрах, в рамках единого математического формализма. Проведение подобного анализа представляется нам очень важным, потому что он 62 позволяет получить информацию, которая была бы недоступна в случае раздельного анализа двух типов данных. Гораздо больше примеров использования ЯМР-релаксации для характеристики молекулярной подвижности различных биополимеров при различных условиях в более, так сказать, облегченном варианте – без измерения подробных частотных или температурных зависимостей, а значит и без какого-либо количественного анализа времен релаксации [93-105]. Работы подобного типа, безусловно, имеют смысл для качественного сравнительного анализа динамического поведения биополимеров, особенно, если измерение времен магнитной релаксации сопровождается применением и других экспериментов, но эти релаксационные данные не могут дать абсолютно ничего для количественных оценок параметров молекулярной динамики и для понимания физических механизмов внутренних движений. Одна из главных проблем, которая изучалась в этих работах – исследование влияния гидратации биополимеров на внутримолекулярные движения. Практически во всех случаях изменения релаксационных параметров (укорочение Т1, Т1ρ и удлинение Т2) говорили об увеличении молекулярной подвижности биополимеров. Безусловно, в разных случаях влияние гидратации на времена релаксации проявлялось по-разному. Однако какие именно характеристики внутренней динамики изменялись и каким именно образом – почти ничего сказать было нельзя. Увеличение внутримолекулярной подвижности белков при росте их гидратации – уже несколько десятилетий является хорошо известным фактом. Об этом свидетельствует не только ЯМР, но и многие другие эксперименты [106]. Несмотря на это, на количественном уровне связь гидратации и внутренней динамики до сих пор исследована недостаточно тщательно. Основная причина этого – чисто методические проблемы многих физических методов (в том числе и ЯМР-релаксации), которые дают о динамике белков в твердом состоянии в основном качественную, а не количественную информацию. Стоит отметить, что при исследовании динамики биополимеров при различных влажностях с помощью протонной релаксации в качестве растворителя обычно используют тяжелую воду для того, чтобы протоны воды не давали вклад в сигнал ЯМР, что значительно упрощает анализ данных. Хотя изучение протонной релаксации в системе белок – Н2О также имеет смысл, поскольку такие 63 эксперименты дают информацию о взаимодействии молекул воды с белком [107111]. В этом случае исследователь имеет дело с двумя фракциями протонов с различными динамическими характеристиками, и которые связаны друг с другом. Эта связь обуславливается, во-первых, магнитным дипольным взаимодействием протонов воды и белка и, во-вторых, химическим обменом протонов воды с лабильными протонами белка. Это усложняет физическую картину протонной релаксации в таких системах, и для ее анализа следует применять соответствующий математический аппарат. Благодаря широкой дисперсии химических сдвигов углеродов, влияние гидратации на свойства белков проявляется и непосредственно на форме твердотельных ВМУ-спектров ядер 13 С естественного содержания. В работах [95,112] было обнаружено, что при увеличении влажности белка наблюдалось сужение линий и улучшение разрешения спектра. В принципе, это может быть вызвано как перераспределением изотропных химических сдвигов, так и увеличением внутримолекулярной подвижности, которая приводит к более эффективному усреднению химических сдвигов, соответствующих различным субконформациям, если эта подвижность быстрая на шкале ЯМР. Как было показано в этих работах, диполь-дипольное взаимодействие между протонами и углеродами изменяется с увеличением гидратации незначительно. Следовательно, сужение линий вызывается сужением распределения конформационных подсостояний белка. В то же время, в БСА при тех же условиях аналогичного эффекта не наблюдалось [113], на основании чего авторы делают вывод о разных свойствах лизоцима и БСА. Однако прямое сравнение спектров лизоцима и БСА, на наш взгляд, не совсем корректно – БСА больше лизоцима в четыре раза, а значит, во столько же больше и число линий в ЯМР-спектре ядер 13 С. Соответственно, уменьшение числа конформационных подсостояний может и не проявиться в спектре, поскольку перекрытие линий даже в случае одной единственной конформации будет очень сильным. Эта проблема будет более детально рассмотрена в третьей главе диссертации. По сравнению с релаксацией, анализ формы линии статического или медленно вращающегося под магическим углом образца до недавнего времени представлял гораздо больше возможностей по получению точной количественной информации о 64 параметрах внутренней динамики биополимеров в твердом состоянии. Как упоминалось выше, подавляющее большинство работ по анализу формы линии было проведено на ядрах дейтерия. В отличие от экспериментов на протонах и ядрах 13С естественного содержания, о которых речь шла выше, дейтеронные эксперименты всегда сопровождаются изотопным обогащением образца. Самый простой и дешевый способ провести подобное обогащение в белке – обменять лабильные протоны на ядра дейтерия простым растворением (или увлажнением) белка в тяжелой воде. Такой способ был применен в работе [114], в которой изучалась динамика основной цепи яичного лизоцима в кристаллическом состоянии помощью ЯМР на медленно обменивающихся дейтеронах. Анализ формы линии статического образца сопровождался измерениями времени релаксации Т1 на трех резонансных частотах в диапазоне температур от 200 до 290 К. Такой набор данных позволял провести количественный анализ параметров внутренней динамики, который проводился отдельно для каждой температуры. Исходя из данных по ЯМРрелаксации в растворах, авторы предположили наличие двух движений основной цепи - в пикосекундном и суб-микросекундном диапазонах. Из величины квадрупольного расщепления (анализ формы линии) определялся общий параметр порядка этих двух движений. Средняя угловая амплитуда, соответствующая этому параметру порядка, увеличивалась от 80 при 200 К до 130 при 290 К. Определенный из анализа формы линии параметр порядка затем закладывался как известный параметр в анализ времен релаксации, проводимый в рамках безмодельного подхода. Этот анализ показал, что время корреляции быстрого движения – около 15 пикосекунд, медленного – 0.1-2 мкс. Оба движения имеют высокие S2. Из-за недостатка экспериментальных данных микродинамические параметры определялись с большой неопределенностью. В первом приближении полученные результаты согласуются с результатами растворных экспериментов, которые говорят о том, что основная цепь белка участвует в молекулярных движениях в широком частотном диапазоне, но амплитуда этих движений весьма ограничена. Следует сказать, что такой подход к количественному анализу данных обладает существенным недостатком. В этой работе априори полагалось, что частоты обоих движений были много больше, чем частота квадрупольного расщепления. А это может быть и не так, и наблюдаемое 65 уменьшение S2 с ростом температуры может быть обусловлено не только увеличением амплитуды, но и укорочением времени корреляции медленного движения, которое при низких температурах имело время корреляции длиннее, чем обратная величина частоты квадрупольного расщепления, а при высоких температурах – короче. Не исключено, что именно благодаря этому был получен странный результат: время быстрого движения не проявляет температурной зависимости, даже наоборот, увеличивается с ростом температуры. В работе [115] использовалось селективное мечение изотопами 2Н метильных протонов трех метионинов ингибитора субтилизина стрептомицина. Исследовались образцы, в которых были помечены как все три метионина сразу, так и по отдельности, что позволило характеризовать динамику белка в трех различных позициях. Анализировались времена релаксации Т1, измеренные на одной резонансной частоте и при одной температуре и форма линии статического образца. Быстрое вращение вокруг оси симметрии метильной группы учитывалось только как усредняющий фактор. Эта работа интересна тем, что в ней проводилось сравнительное исследование динамики белка в растворе и твердом теле, в порошке при различных степенях увлажнения и кристаллическом виде, свободного ингибитора и ингибитора в комплексе с субтилизином. Из-за недостатка экспериментальных данных в растворе из величины Т1 оценивалось только одно эффективное время корреляции, а в твердом теле применялась модель скачков между двумя положениями, выбор которой был продиктован исключительно соображениями простоты и удобства. Результаты говорят о том, что в растворе два метионина, локализованные на поверхности белка, имели намного более короткое эффективное время корреляции, чем третий метионин, расположенный внутри белка. На основании анализа Т1 в растворе и твердом теле авторы заключают, что существенных различий в параметрах внутренней динамики между этими двумя состояниями нет. Однако к этому выводу следует относиться с осторожностью, поскольку, опять же из-за недостатка релаксационных данных, он сделан на основании существенных и не слишком обоснованных допущениях. При увеличении гидратации в порошке движение боковых цепей значительно усиливается – время корреляции укорачивается от ~10-4 с до ~10-7 с. Связывание с субтилизином ведет к увеличению эффективного времени корреляции поверхностных остатков в растворе 66 и к более слабой зависимости формы линии 2Н от гидратации в порошке. Наконец, важным результатом этой работы является вывод о том, что твердотельные спектры в увлажненном порошке и кристалле не проявляют сколько-нибудь существенных различий. Селективное мечение изотопом 2Н было применено также и в очень интересной работе, выполненной в группе Энн Макдермотт по изучению подвижности петли, регулирующей доступ лиганда в активный центр триосефосфат-изомеразы [116,117]. Были помечены все протоны индольного кольца одного-единственного триптофана, находящегося на этой петле. В этой работе использовались рентгеноструктурные данные по конформации этой петли в закрытом и открытом состояниях. Таким образом, в анализ формы дейтеронного спектра закладывалась заранее известная геометрия движения триптофана (Рис. 1.11, данные из работы [116]) – скачки между двумя положениями, соответствующими двум субконформациям петли – а из спектра определялись скорость перескоков и населенности этих двух состояний. Анализ данных показал, что движение петли происходит со временем корреляции порядка 100 мкс. Это характерное время процесса катализа, что свидетельствует о важности этого движения для биологической функции белка. Совпадение времен Рисунок 1.11. Изображение конформации основной цепи триосефосфатизомеразы в «закрытом» (темный оттенок) и «открытом» (светлый оттенок) состояниях. Стрелка обозначает перемещение подвижной петли между двумя дискретными положениями. Справа показаны также две конформации индольного кольца тирозина. 67 корреляции движения и каталитического акта обеспечивает то, что лиганд не выйдет из белка до того, как произойдет катализ, и в то же время, не будет задерживаться в активном центре белка после того, как катализ произошел. Оказалось, что характерное время этого движения не зависит от того, связан белок с лигандом или нет, что предполагалось ранее. Но лиганд может менять населенности открытого и закрытого состояний – если белок свободный, то он большей частью в открытом состоянии и наоборот. Аналогичные результаты были получены с помощью жидкостного ЯМР [118] и флуоресценции [119]. Данная работа – очень интересный пример получения точной количественной информации о параметрах внутреннего движения, непосредственно вовлеченного в акт катализа. Тем не менее, нельзя забывать о том, что такой анализ был возможен только с привлечением независимых (в данном случае - рентгеноструктурных) данных, что выполнимо далеко не в каждом случае. Работа [120] представляет собой один из немногочисленных примеров использования селективного 13 С-обогащения для изучения внутренней динамики полипептида. В этой работе изучалась динамика пептида, состоящего из 15 остатков, адсорбированного на твердой поверхности в сухом и гидратированном состояниях. Исследовались образцы, селективно помеченные изотопом 13 С по различным аминокислотным остаткам (в каждом образце метился только один остаток). Наблюдение велось за амплитудой ssb-пиков карбонильных углеродов медленно (3 кГц) вращающегося под магическим углом образца, которые давали информацию о степени усреднения АХС за счет молекулярного движения. Оказалось, что в сухом состоянии амплитуда внутренних движений у всех остатков небольшая, а в гидратированном - усреднение тензора АХС постепенно увеличивается от N-конца к С-концу. Никаких количественных оценок амплитуд или времен корреляции движений не делалось, хотя обсуждалась функциональная роль молекулярной динамики этого пептида. Иногда при исследовании динамики биополимеров используют не один, а несколько типов магнитных ядер, для чего проводят изотопное обогащение образца во всевозможных комбинациях. Например, при исследовании динамики боковых цепей коллагена [121] использовалось обогащение изотопами 2Н метионинов и пролинов, 15 N – лизинов и 19 F – фенилаланинов. Естественно, в этом случае 68 невозможно было получить разрешение линий, соответствующих отдельным аминокислотам, и потому ЯМР на ядрах дейтерия, азота и фтора давал информацию обо всех метионинах и пролинах, лизинах, фенилаланинах, соответственно. При исследовании структуры и динамики мембранных белков – фоторецепторов [122] применялся ЯМР на ядрах 13 С естественного содержания, кроме того, проводилось тотальное обогащение белков изотопом 15N, и селективное – 2Н. В последнем случае обогащались метильные протоны аланинов и один из протонов в кольце тирозинов. Исследования на различных ядрах, конечно же, давали более обширную и комплементарную информацию о структурных и динамических свойствах биополимерах, но данные различных экспериментов анализировались отдельно и сопоставлялись друг с другом только на качественном уровне. Отдельно мы хотели бы отметить работу [123], в которой изучалась динамика основной цепи стафилококковой нуклеазы в кристаллическом виде с помощью ЯМР на ядрах 15N. В отличие от дейтеронов, ядра 15N, локализованные на основной цепи, имеют заметную дисперсию химических сдвигов, что позволяет получить (хотя и не всегда) разрешение и соотнесение линий даже в одномерном твердотельном ВМУспектре при условии, что число линий не слишком велико (обычно, не больше 10). Причем, разрешение наблюдается только в кристаллическом состоянии, если белок находится в виде порошка, то неоднородность микроокружения приводит к «размазыванию» химсдвигов, отчего линии уширяются и спектральное разрешение теряется. В этой работе было исследовано два образца: в одном были помечены валины, в другом – гистидины, которых в нуклеазе девять и четыре, соответственно. В твердотельном спектре отдельно наблюдались практически все помеченные остатки за исключением двух, находящихся на подвижной петле. Химические сдвиги ядер15N в твердом теле и растворе были одинаковы. Эта работа крайне примечательна тем, что в ней наиболее наглядным образом представлено преимущество исследования внутренней динамики белка в твердом состоянии по сравнению с раствором. Авторы измерили Т1 ядер азота на двух резонансных частотах в твердом теле и растворе и графически представили эти данные на одном рисунке как функцию номера остатка (Рис. 1.12). В твердом теле значения Т1 для различных остатков различаются в несколько раз, что отражает динамическую неоднородность основной цепи белка, а в растворе все Т1 практически одинаковы, 69 потому что они определяются в большей степени броуновским вращением белка, которое одинаково для всех остатков, а не внутренней динамикой. С привлечением безмодельного подхода в самом простейшем варианте из времен Т1 были грубо оценены время корреляции и параметр порядка внутреннего движения, которые оказались в пределах 0.2-4 наносекунд и 0.95-1.0, соответственно. В то же время, параметр порядка, определенный из амплитуд ssb-пиков имел значение порядка 0.8-0.9. Релаксационные эксперименты чувствительны к молекулярным движениям в наносекундном диапазоне, а анализ формы Рисунок 1.12. Скорости 15 N валинов релаксации ядер стафилококковой нуклеазы в поле 6.5 Т в растворе (закрашенные кружки) и 5.9 Т в кристаллическом состоянии (незакрашенные кружки) (рисунок а) и в поле 11.8 Т (обозначения символов аналогичны, рисунок b). Левая и правая шкалы относятся к кристаллическому состоянию и раствору, соответственно. спектра статического или, как в данном случае, медленно вращающего под магическим углом образца – ко всем движениям, частота которых сравнима или больше 104-105 Гц. Отсюда следует, что основная цепь белка подвержена движениям не только в наносекундном, но и микросекундном диапазонах. В заключительной части обзора мы приведем примеры применения одномерной твердотельной обменной спектроскопии для изучения медленной динамики белков. Первой в мире работой по использованию одномерной обменной ЯМР-спектроскопии для исследования не простых низкомолекулярных модельных систем, а реальных биополимеров была наша статья, опубликованная в 1999 году в Journal of Magnetic Resonance [124], результаты которой будут детально представлены в третьей главе. В этой работе мы использовали последовательность trODESSA, а боле поздняя и более совершенная 70 версия одномерного обменного эксперимента, последовательность CODEX (см. пункт 1.5), интенсивно применялась в работах группы Мэй Хонг из Университета Айовы. Исследования этой группы интересны тем, что в них применялась технология т.н. «селективного и интенсивного» мечения белков изотопом 13 С [125,126]. По сути, это полуселективное обогащение, при котором метятся только десять из двадцати аминокислот. Это позволяет «прорежать» спектр ЯМР и, вкупе с широким разбросом химсдвигов углеродов, в некоторых случаях получать соотнесение пиков спектра определенным типам углеродов определенных аминокислот. Такой способ не дает сайт-специфического соотнесения линий, т.е. соотнесения линий определенным атомам в глобуле белка, но зато позволяет получить более репрезентативную информацию по сравнению с селективным изотопным мечением. Первый опыт применения последовательности CODEX для изучения медленной динамики белков был описан в работе [127]. Эксперименты проводились на двух белках, имеющих очень разную структуру – убиквитине человека и белке АСА. Убиквитин – очень компактный и жесткий белок, почти 90% цепи которого образуют вторичную структуру, а мультидоменный белок АСА состоит из центральной неупорядоченной части и двух жестких доменов по краям, которые могут двигаться независимо друг от друга. Оба белка были тотально обогащены изотопом 15N, и полуселективно (согласно упомянутой выше методике) – 13С. В этой работе проводился обменный эксперимент на ядрах 15N, но детектирование сигнала проводилось по сигналу углеродов – перед записью ССИ намагниченность от ядер азота передавалась ковалентно связанным альфа-углеродам основной цепи. Цель такой сложной методики – получить частичное разрешение и соотнесение спектра, поскольку спектр 15N тотально обогащенного образца этого сделать не позволяет. В результате было обнаружено, что убиквитин не проявляет никакой динамики в миллисекундной области, а в белке АСА наоборот, в эксперименте CODEX хорошо наблюдается спад в τm-зависимости интенсивности линий спектра со временем корреляции 80 мс. Впоследствии, динамика АСА в миллисекундной области была более подробно изучена в отдельной работе [128]. Медленное движение было соотнесено с реориентацией жестких доменов как целого. Из зависимости амплитуды пиков при длинном времени смешивания (250 мс) от величины mTR (см. 71 Рис 1.7 и Ур-я 1.46 и 1.47) была оценена угловая амплитуда этой реориентации, которая составила около 500. Целый комплекс ЯМР-методов был применен для исследования динамики мембранного белка колицина в свободном и связанном с мембраной виде [129]. Как и в предыдущих случаях, белок был тотально помечен 15N и полуселективно – 13С. В спектре 13 С можно было различить альфа-углероды восьми типов аминокислот и углероды боковых цепей двух типов аминокислот. Проводились измерения констант диполь-дипольного взаимодействия С-Н и Н-Н, эксперимент CODEX на ядрах 15N с детектированием на ядер 13 С, измерения протонного Т1ρ и анализ формы линии спектра 15 N статического образца. Это исследование показало, что в белке есть движения в нано- и микросекундном диапазонах времен корреляции, но обменный эксперимент (CODEX) не проявил никакой подвижности в миллисекундном диапазоне. Связывание с мембраной приводит к существенному увеличению амплитуд молекулярной подвижности как основной, так и боковых цепей. Как предполагают авторы, увеличенная подвижность белка в мембране является необходимым условием его нормальной работы - обеспечения работы канала в мембране. Данная работа – хороший пример применения широкого набора ЯМРэкспериментов, что позволило перекрыть широкий частотный диапазон молекулярных движений. Однако, как и в подавляющем большинстве других случаев, анализ данных различных экспериментов велся отдельно друг от друга, а их результаты сопоставлялись только на качественном уровне. В процитированных выше работах эксперимент CODEX проводился на ядрах 15 N, хотя, в принципе, он также может быть проведен и на карбоксильных углеродах, поскольку они имеют большую АХС, что очень важно для обменного эксперимента. Это было бы удобно, поскольку углеродный эксперимент позволяет обойтись без изотопного обогащения белка, если не стоит задача получения высокоселективной динамической информации. Но с точки зрения получения информации о молекулярной динамике, обменный эксперимент на карбоксильных углеродах основной цепи в полипептидах с естественным изотопным содержанием сопряжен с возможными ошибками. Дело в том, что благодаря диполь-дипольному взаимодействию карбонильных углеродов с ковалентно связанными ядрами 14 N, на τm-зависимости в эксперименте CODEX наблюдается спад, характерное время 72 которого определяется не молекулярным движением, а временем релаксации Т1 ядер 14 N, которое находится как раз в миллисекундной области. Это так называемый RIDER-эффект (Relaxation-Induced Dipolar Exchange with Recoupling) [130,131]. Довольно интересное применение эксперимента CODEX было описано в одной из самых последних работ группы М. Хонг [132]. В этой работе изучалась молекулярная динамика и агрегация антимикробного пептида протегрина-1, встроенного в фосфолипидный бислой, моделирующий биологическую мембрану. Антимикробные пептиды играют важную роль в иммунной системе многих организмов. Они разрушают клеточные стенки чужеродных микроорганизмов. При этом предполагается, что проявлять свою биологическую активность антимикробные пептиды могут только в агрегированном состоянии. Один из параметров, позволяющий судить о степени и природе агрегации пептидов - это время корреляции вращения агрегатов в фосфолипидном бислое как целого. Это время корреляции было определено с помощью эксперимента CODEX, который был проведен на карбонильном углероде одной из аминокислот протегрина-1 (для этого эксперимента пептид был селективно обогащен изотопом химической позиции). Это время корреляции 13 С только в одной оказалось равным 0.7 с. Пренебрежение RIDER-эффектом в данном случае вполне оправдано, поскольку время релаксации Т1 ядер 14N как минимум на порядок короче. Оказалось, что такую медленную реориентацию пептидных агрегатов невозможно описать с помощью простейшей гидродинамической модели, основанной на уравнении Стокса-Эйнштейна. В этом случае размер агрегатов должен быть неправдоподобно большим. Наблюдаемое в эксперименте длинное время корреляции вращения агрегатов авторы объясняют образованием комплексов липидов с пептидными агрегатами и электростатическими взаимодействиями анионных фосфолипидных головок с катионными боковыми цепями аргининов в протегрине-1. В работе [133] исследовалась молекулярная динамика коллагена при различных 13 температурах в сухом и увлажненном виде с помощью ЯМР на ядрах естественного содержания. Измерялись усредненные движением константы С 13 С-1Н диполь-дипольного взаимодействия и с помощью последовательности CODEX исследовалась динамика в миллисекундной области. Из-за RIDER-эффекта анализ 73 интенсивностей линий спектра при различных временах смешивания в эксперименте CODEX проводился только для линий бета и гамма углеродов пролинов и гидроксипролинов, поскольку эти углероды не имеют ковалентно связанных атомов азота. Из-за того, что в коллагене доля пролинов и гидроксипролинов намного больше, чем в большинстве других белков, линии углеродов этих остатков разрешены в спектре коллагена. В то же время степень АХС этих углеродов более чем в четыре раза меньше, чем АХС карбоксильных углеродов, что уменьшает амплитуду спада интенсивности в τm-зависимости. Это, в свою очередь, приводит к необходимости большого числа накоплений, чтобы обеспечить достаточное отношение сигнал/шум. По этой причине, в данной работе сравнивались только два времени смешивания – 1 мс и 100-200 мс, что могло дать информацию только о факте наличия медленного движения, но не о его времени корреляции. Эксперимент CODEX показал, что в сухом коллагене медленных движений практически нет, но гидроксипролины проявляют заметный уровень подвижности в миллисекундной области в увлажненном образце. Константы взаимодействия 13 С-1Н показали, что амплитуда движения в более высокочастотной области сильно зависит от гидратации белка и слабо – от температуры. Тот факт, что в увлажненном коллагене медленные движения, хотя и с трудом, но фиксируются, противоречит результатам работ [127,129], в которых утверждается, что жесткие глобулярные белки не проявляют подвижности в миллисекундной области. Эта разница в динамическом поведении различных белков будет рассмотрена в конце третьей главы. До настоящего времени, одномерные обменные эксперименты не применялись для исследования внутренней динамики белков, за исключением наших и процитированных выше работ. Кроме белков последовательность CODEX в последние несколько лет с успехом использовалась при исследовании синтетических полимеров, где миллисекундные движения фиксировались без особых проблем [134-137]. Однако синтетические полимеры обычно не имеют жесткой пространственной структуры, присущей глобулярным белкам, и потому амплитуды медленных движений в них могут быть значительно больше, что облегчает их наблюдение посредством обменного эксперимента. Скорее всего, в белках миллисекундные движения могут не наблюдаться, прежде всего, изза недостаточной точности эксперимента CODEX. Хотя для полного прояснения 74 ситуации с медленной динамикой белков, безусловно, необходимы дальнейшие исследования. 1.10.3. Обобщающие замечания Результаты проведенных за последние несколько десятилетий исследований однозначно показывают, что конформационная подвижность белков, которая занимает очень широкий частотный диапазон, является их неотъемлемым свойством, как и уникальная свидетельств пространственная непосредственной структура. вовлеченности Множество молекулярных убедительных движений в биологическое функционирование белков вызывают все нарастающий интерес к молекулярно-динамическим исследованиям биополимеров. В зависимости от того, находится белок в растворе или в твердом состоянии, к нему применимы различные наборы экспериментов, позволяющих исследовать молекулярную подвижность. По типу, точности и разнообразию получаемой информации жидкостные и твердотельные подходы различаются достаточно сильно. В одних случаях преимущество имеют эксперименты в растворах, в других – в твердом состоянии. Если в растворах язык безмодельного подхода позволяет, хотя и в рамках определенных приближений, количественно описывать непосредственно саму внутреннюю динамику белка, то в твердом теле из-за недостатка экспериментальных параметров (невозможность анализировать Т2 и NOE таким же образом, как и Т1) применимость безмодельного подхода существенно ограничена, и часто исследователи оперируют только экспериментально измеряемыми параметрами, а не параметрами молекулярной динамики. Этот недостаток твердотельных экспериментов частично компенсируется тем, что практически все исследования динамики белков имеют сравнительный характер. Сравнивается белок свободный и связанный с лигандом, различные локализации в глобуле, поведение при различных температурах, влажностях и т.п. Хотя очень часто подобное сравнение не заходит дальше утверждений типа «подвижность больше – подвижность меньше», тем не менее, даже такая информация может представлять интерес (хотя, честно говоря, уже далеко не всегда). Наиболее популярный параметр, влияние которого на динамику исследуется наиболее интенсивно, – это степень гидратации белка. Это вполне объяснимо, 75 поскольку без взаимодействия с гидратной водой белок не способен выполнять свою функцию. Многочисленными исследованиями было показано, что при увлажнении внутренняя динамика белка усиливается, причем внутренние области и поверхность глобулы, основная и боковые цепи реагируют на увлажнение в разной степени. Но из-за тех же самых методических трудностей до сих пор очень мало количественных данных, показывающих как именно и какие именно параметры внутренней динамики изменяются при увлажнении/высушивании белка. Говоря о сравнении жидкостных и твердотельных ЯМР-экспериментов, отметим, что пока не представлено убедительных доказательств того, что внутренняя динамика белков в растворе и в гидратированном твердом состоянии имеет принципиальную разницу. С другой стороны, следует иметь в виду, что пока нет экспериментов, которые могли бы однозначно сравнить одни и те же динамические параметры белка в двух состояниях. В связи с этим, крайне интересны работы, в которых изучается динамика одного и того же белка в двух состояниях. К сожалению, таких исследований почти нет. Очень большое значение при исследовании динамики белков в твердом состоянии методами ЯМР имеет выбор магнитных ядер и модель изотопного обогащения образца. Условно можно выделить три подхода к этой проблеме: - использование естественного содержания магнитных ядер (относится только к протонам и углеродам-13); - полуселективное обогащение, когда метится только одна группа ядер в белке, например, только основная цепь и только определенные типы аминокислот, которые не различаются в спектре (причем, ядра 13С во многих случаях позволяют добиться «полуселективности», а в гомополипептидах получить полное разрешение и соотнесение спектра и без изотопного обогащения); - селективное обогащение, при котором ЯМР-сигнал соотносится с конкретным ядром в белке. Это может быть как мечение одного единственного магнитного ядра, так и нескольких ядер, линии которых в спектре, тем не менее, разрешены. Тип изотопного обогащения выбирается в зависимости от поставленных задач. Хотя, конечно же, с точки зрения молекулярной биологии наибольший интерес представляют работы с использованием селективного мечения, а неселективные 76 эксперименты на протонах к настоящему времени представляют научную новизну уже далеко не во всех случаях. В связи с вопросом об изотопном обогащении необходимо упомянуть о том, что в последние несколько лет для соотнесения линий в спектре и определения структуры белков стало применяться и тотальное 13 С/15N обогащение. Использование современных многомерных ЯМР-методик и белковых образцов в виде микрокристаллов обеспечивает сравнимое с растворами разрешение спектров. Было бы очень заманчиво использовать такие образцы для изучения не только структуры, но и динамики, поскольку с ними можно получить одновременно и высокую селективность, и высокую репрезентативность динамической информации. Но, к сожалению, это невозможно из-за быстрой спиновой диффузии между близко расположенными магнитными ядрами. В релаксационных экспериментах спиновая диффузия усредняет релаксационные спады, что лишает нас селективности, а в обменных экспериментах вызывает появление компоненты в τm-зависимости интенсивностей линий спектра, на фоне которой молекулярные движения попросту не видны (см. третью главу). Поэтому в обозримом будущем исследователи обречены на использование селективного изотопного мечения, если стоит задача получения селективной информации о внутренней динамике белков с помощью упомянутых выше методов. Наконец, последнее замечание касается сравнительной характеристики преимуществ и недостатков релаксационной и обменной ЯМР-спектроскопии. Эти эксперименты чувствительны к различным частотным диапазонам, чем друг друга очень хорошо дополняют. Основной недостаток релаксационных экспериментов состоит в том, что из одного или ограниченного числа времен релаксации невозможно определить форму корреляционной функции движения без использования каких-либо допущений и/или данных других экспериментов. А обменная ЯМР-спектроскопия позволяет получить форму корреляционной функции реориентации тензора АХС непосредственно из эксперимента, безо всяких допущений. С другой стороны, релаксация гораздо более удобна для наблюдения низкоамплитудных движений. Уменьшение амплитуды молекулярного движения приводит к удлинению времени релаксации, которое, тем не менее, может быть измерено с той же точностью, что и более короткое релаксационное время. А при 77 проведении обменного эксперимента низкая амплитуда движения требует практически прецизионного измерения интенсивностей пиков в спектре при различных временах смешивания, что во многих случаях невозможно. Типичная величина погрешности при измерении интенсивностей линий в ЯМР-спектроскопии – около пяти процентов, и ее существенное уменьшение за счет количества накоплений может привести продолжительности эксперимента, делающей его практически невозможным. В заключение заметим, что решением многих методических проблем при исследовании динамики белков методами твердотельного ЯМР мог бы стать одновременный количественный анализ данных различных экспериментов – релаксации, формы линии статического (или медленно вращающегося) образца и обменной спектроскопии – в рамках единого математического формализма. Кроме того, мы полагаем, что крайне информативным мог бы стать совместный количественный анализ экспериментов, выполненных на различных магнитных ядрах в одном и том же образце. К сожалению, число таких работ пока очень незначительно. До сих пор практически всегда количественная информация о внутренних движениях белков в твердом состоянии была получена либо на основе каких-либо допущений (например, о конкретной модели движения) либо с помощью привлечения данных других экспериментов (например, рентгеноструктурного анализа). Пока самое главное препятствие для такого комплексного подхода к изучению динамики белков – слишком большая продолжительность и дороговизна ЯМР-экспериментов. 78 ГЛАВА 2. БРОУНОВСКАЯ ДИНАМИКА И МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ЭЛЕКТРОСТАТИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БЕЛКОВ В РАСТВОРЕ. 2.1. Качественная модель межмолекулярных электростатических взаимодействий. В самом простейшем случае вращение шарообразной броуновской частицы в вязкой среде описывается строго одноэкспоненциальной автокорреляционной функцией со временем корреляции, которое определяется хорошо известной формулой Стокса-Эйнштейна: τR = ηV kT , (2.1) где V – объем частицы, η - вязкость среды, k – постоянная Больцмана, T – абсолютная температура. эллипсоида, обладающего Корреляционная осевой функция симметрией, броуновского описывается вращения суммой трех экспоненциальных компонент, а несимметричного эллипсоида (то есть с тремя разными осями) – суммой пяти компонент [138]. Существует математический аппарат, который адаптирует безмодельный подход Липари-Сзабо [15,16] к случаю белка эллипсоидальной формы [32]. Тем не менее, чаще всего именно одноэкспоненциальное экспериментальных приближение данных по применяется магнитной при анализе релаксации, различных флуоресцентной спектроскопии и некоторых других экспериментов в растворах белков. Не слишком тяжелые глобулярные белки редко имеют форму, которая бы очень сильно отличалась от шарообразной, и потому эта аппроксимация дает в большинстве случаев вполне приемлемые результаты. В случае неразбавленных растворов, характер броуновской диффузии может существенно усложниться за счет взаимодействия белков друг с другом. Следует отметить, что ЯМР-эксперименты в растворах белков обычно проводятся при концентрациях в несколько мМ, а при таких концентрациях среднее расстояние между ближайшими глобулами сравнимо с их размерами, и межмолекулярное взаимодействие может заметно отражаться как на вращательной, так и на трансляционной броуновской диффузии. 79 Во многих случаях при анализе экспериментов явно или неявно предполагается, что увеличение концентрации белкового раствора приводит к увеличению времени корреляции τR, но форма корреляционной функции при этом остается одноэкспоненциальной [139-141]. В случае чисто механического взаимодействия шарообразных частиц такое предположение выглядит вполне естественным и обоснованным. Но белки в растворе практически всегда обладают достаточно большим электрическим дипольным моментом и общим ненулевым зарядом, который зависит от рН раствора. Межбелковые электростатические взаимодействия – одна из актуальных тем исследований в современной молекулярной биофизике [142-144]. Электростатические взаимодействия играют ключевую роль в образовании и стабилизации белковых комплексов и агрегатов, а также в формировании белковых кристаллов. Однако эти взаимодействия проявляются не только когда белки находятся в непосредственной близости друг от друга. Электростатика может влиять на поведение белков в растворе и не приводя к образованию комплексов или агрегатов. Если молекулы белков не обладают комплементарной электростатической структурой (что очень часто бывает в гомогенных белковых растворах), они практически не образуют стабильных димеров или других белковых комплексов. В то же время, электростатические взаимодействия могут вызывать взаимное отталкивание одинаково заряженных белков и их взаимное ориентирование. Межмолекулярное электростатическое взаимодействие может привести не только к изменению времени корреляции броуновского вращения, но и к усложнению формы автокорреляционной функции. В частности, в работах по изучению т.н. диэлектрического трения между молекулами полярных жидкостей было показано, что межмолекулярное электростатическое взаимодействие приводит именно к изменению формы корреляционной функции вращения молекул [145-148]. Дальнодействующие межбелковые взаимодействия и их влияние на вращательную и трансляционную броуновскую диффузию белков остаются менее исследованной областью физики белковых растворов. Как отмечалось во Введении, знание точных параметров броуновской диффузии в некоторых случаях может быть очень важным для правильного определения других физических параметров. В частности, времена магнитной релаксации белков в растворе определяются как вращением белка как 80 целого, так и внутренними конформационными движениями. Получить из экспериментальных данных параметры внутренней динамики невозможно без корректного учета броуновского вращения. Кроме того, изучение влияния электростатических взаимодействий на характер броуновской диффузии частиц, обладающих электрическими зарядами и дипольными моментами, представляет собой самостоятельную проблему физической химии, исследование которой может быть интересно не только для белков. Каким же образом межмолекулярное электростатическое взаимодействие может отражаться на броуновском вращении белков? Для ответа на этот вопрос рассмотрим концентрационную зависимость времен релаксации Т1 и Т2 протонов лизоцима в растворе тяжелой воды, представленную на Рис. 2.1 (методика определения времен релаксации будет описана ниже). Из этого рисунка видно, что с увеличением концентрации увеличивается отношение T1/T2. Для того, чтобы проверить, может ли это увеличение быть объяснено только увеличением вязкости раствора, т.е. простым увеличением времени корреляции броуновского вращения τR, мы рассчитали времена релаксации по хорошо известным формулам: ⎞ 1 σ '⎛ 2τ R 8τ R = ⎜ + ⎟, T1 3 ⎜⎝ 1 + (ω0τ R )2 1 + ( 2ω0τ R )2 ⎠⎟ (2.2) ⎞ 1 σ '⎛ 5τ R 2τ R = ⎜ 3τ R + + ⎟ 2 2 , T2 3 ⎜⎝ 1 + (ω0τ R ) 1 + ( 2ω0τ R ) ⎟⎠ (2.3) где ω0 – круговая резонансная частота, σ’ – средний второй момент протонов белка, частично усредненный быстрыми внутренними движениями. В процессе расчетов сначала были определены τR и σ’ из величин T1 и T2 при низких концентрациях. В результате было получено: τR=9.1 ns, σ’=5.94⋅109 s-2. При данном значении σ’ с помощью ур-я (2.2) было определено τR для каждого T1. Затем, используя полученные значения τR, по ур-ю (2.3) были рассчитаны величины Т2 для каждой концентрации. Эта зависимость Т2 показана на Рис. 2.1 сплошной линией. Таким образом, совершенно очевидно, что увеличением τR объяснить концентрационную зависимость времен релаксации невозможно. 81 Другой возможный процесс, ведущий к увеличению отношения T1/T2, - это частичная димеризация молекул лизоцима. В этом случае наблюдаемые времена релаксации будут определяться формулой T1,2−1 = 1− p p + dimer , monomer T1,2 T1,2 (2.4) где p – доля глобул, образующих димеры, T1,2monomer and T1,2dimer - времена релаксации протонов белка в мономерной и димерной формах, соответственно. релаксации Эти были времена рассчитаны с помощью ур-й (2.2) и (2.3), при τR равном Рисунок 2.1. Концентрационная зависимость времен релаксации протонов белка в растворе лизоцима курицы (рН=3.0, t=200C, резонансная частота 27 МГц). Сплошная и пунктирная линии – рассчитанные величины времен релаксации, см. объяснения в тексте. 9.1 соответственно. и 18.2 Затем нс, мы определили величину p для каждого значения Т1 из концентрационной зависимости (p изменялось от нуля при низких концентрациях до 0.4 при 200 мг/мл) и по этой величине определили Т2 по формуле (2.4). Эта зависимость показана на Рис. 2.1 пунктирной линией. Эти расчеты также показывают, что частичная димеризация лизоцима не может объяснить концентрационную зависимость времен релаксации. Следует заметить, что димеризация лизоцима – хорошо известный факт [149-151], но только не при этом рН. Из Рис. 2.1 видно, что в диапазоне концентраций от 30 до 100 мг/мл Т1 практически не изменяется, а Т2 во всем диапазоне концентраций уменьшается при увеличении концентрации. Постоянство 82 Т1 при малых концентрациях свидетельствует о том, что τR практически не меняется, поскольку при резонансной частоте 27 МГц время релаксации Т1 очень чувствительно к молекулярным движениям со временем корреляции несколько наносекунд (это характерное время броуновского вращения небольших глобулярных белков). Для того, чтобы объяснить разницу в поведении Т1 и Т2 необходимо вспомнить, что в выражение для Т2 (1.51) входит спектральная плотность на нулевой частоте J(0), которой нет в выражении для Т1 (ур-е 1.50). Отсюда несложно сделать вывод о том, что при увеличении концентрации белкового раствора до определенного предела изменяется только спектральная плотность на нулевой частоте J(0), в то время как J(ω0) и J(2ω0) практически не меняются. Отсюда, в свою очередь, можно сделать еще три вывода. Во-первых, кроме броуновского вращения с временем корреляции τR белок участвует еще в одном движении, время корреляции которого как минимум в несколько раз больше τR. Во-вторых, броуновское вращение со временем корреляции τR должно быть анизотропно, хотя бы в очень небольшой степени. В противном случае, медленное движение не могло бы быть зарегистрировано в принципе – см. ур-я (1.62) и (1.63). В-третьих, увеличение концентрации раствора до некоторого значения приводит к изменению характеристик только этого медленного движения, оставляя все остальные параметры динамического состояния белка неизменными. Необходимо отметить, что существует несколько независимых экспериментальных свидетельств того, что корреляционная функция броуновского вращения белков в растворе содержит компоненту, имеющую незначительный относительный вес и время корреляции которой значительно превышает стандартное время τR. Это было показано с помощью релаксации на ядрах 13С [34,152] и 15N [57] белков, методом измерения дисперсии Т1 дейтеронов воды [153], дисперсий Т1 протонов белка [154] и с помощью диэлектрической спектроскопии [155]. Ниже будут приведены также данные, полученные в нашей лаборатории, по ЯМРрелаксации и диэлектрической спектроскопии, однозначно говорящие о существовании более медленного по сравнению с обычным броуновским вращением движения белков. Несферическая форма белковой глобулы не может объяснить такую форму корреляционной функции, поскольку в этом случае соотношение времен корреляции различных компонент корреляционной функции по порядку величины соответствует 83 соотношению длинной и короткой осей глобулы. Для лизоцима соотношение полуосей составляет 1.5. Кроме того, в этом случае форма корреляционной функции не зависела бы от концентрации. Длинная компонента корреляционной функции может быть объяснена частичной олигомеризацией белков, как это сделано, например, в работах [156,157]. Тем не менее, нам кажется маловероятным механизм агрегации, при котором образуются только большие кластеры, но при этом доля димеров или тримеров пренебрежимо мала (в противном случае, это отражалось бы на величине Т1). Безусловно, такой механизм существует, например, во многих шайперонных белках, но такая олигомеризация имеет очень специфическую природу, и она характерна только для отдельных белков при определенных условиях. А в большинстве случаев более понятной и естественной выглядит модель агрегации, при которой вероятность существования кластера уменьшается с ростом его размера. Именно такую картину показывает, например, Монте-Карло моделирование ассоциации молекул лизоцима при различных условиях [158]. Доказательством того, что олигомеризация не может служить причиной появления длинной компоненты, является также тот факт, что такая форма корреляционной функции наблюдалась в релаксационных экспериментах ЯМР высокого разрешения на ядрах 13 С [34,152] и 15 N [57]. В спектрах высокого разрешения линии от олигомеров значительно уширены, потому они там попросту не видны. Хотя частичная олигомеризация или даже загрязнение препаратов белков, безусловно, не могут быть исключены для всех случаев, крайне маловероятно, что это является универсальной причиной появления длинной компоненты корреляционной функции, которая наблюдалась в растворах многих белков при различных условиях различными экспериментальными методами. Для физического объяснения такой форме корреляционной функции броуновского вращения белков в серии работ [159-165] нами была предложена и обоснована следующая модель электростатического взаимодействия белков. Дипольный момент белка, который чаще всего имеет величину порядка нескольких сотен дебай, взаимодействует с электрическим полем, создаваемым зарядами соседних белковых молекул, стараясь развернуться вдоль этого поля. Это создает анизотропию броуновского вращения белка. Причем, внешнее электрическое поле не является постоянным, оно меняется как по величине, так и по направлению 84 вследствие трансляционной диффузии белков друг относительно друга. Исходя из этого, можно корреляционной заключить, функции, что т.е. относительный мера вес анизотропии длинной броуновского компоненты вращения, определяется силой межмолекулярного электростатического взаимодействия, а время корреляции этой компоненты, т.е. характерное время жизни этой анизотропии, определяется трансляционной диффузией белков. Легко показать, что характерное время трансляционной диффузии, которое можно определить как среднее время сдвига броуновской частицы на расстояние, равное ее размеру, примерно на порядок величины превышает время корреляции вращательного движения. Это и объясняет большую разницу между временами корреляции двух компонент корреляционной функции вращения белков в растворе. Ниже будут представлены различные экспериментальные данные, теоретические оценки и результаты компьютерного моделирования броуновской динамики белков, которые позволят количественно описать электростатическое межбелковое взаимодействие для различных случаев и определить его основные качественные особенности. 2.2. ЯМР-релаксационные эксперименты на протонах белков в растворах тяжелой воды. 2.2.1. Методы измерения и анализа времен релаксации Из-за своей низкой информативности, неселективные протонные релаксационные ЯМР-эксперименты на низких резонансных частотах уже много лет практически не применяются для исследований динамики в растворах белков. Но если целью исследования является не внутренняя динамка белка, а его броуновское вращение, то такие эксперименты как нельзя более кстати. Они удобны, быстры, дешевы и, благодаря этому, позволяют за относительно небольшой промежуток времени исследовать большое количество образцов. Очень важно также то, что измерения на низких резонансных частотах наиболее чувствительны к движениям с характерным временем броуновского вращения белка как целого. В течение нескольких лет мы провели цикл экспериментов [159-164] по измерению спин-спиновой и спин-решеточной протонной релаксации на нескольких резонансных частотах в растворах нескольких белков при различных условиях (температура, рН, концентрация и т.д.). Все измерения проводились в растворах 85 тяжелой воды для того, чтобы сигнал от протонов воды не подавлял сигнал от протонов белка. Измерения времени спин-решеточной релаксации проводились с помощью импульсной последовательности 1800-τ-900, а измерения времени спинспиновой релаксации – последовательностью Карра-Парселла-Мейбума-Гилла (КПМГ). Времена релаксации Т2 не зависели от временнóй задержки между 1800импульсами в КПМГ-последовательности в диапазоне от 0.2 до 3 миллисекунд. Измерения проводились при трех резонансных частотах – 10.8, 27 и 90 (или 100) МГц. На 10.8 и 27 МГц эксперименты проводились на самодельном ЯМРрелаксометре, на 90 (100) МГц – на спектрометрах Брукер CXP-100 или Тесла. На 90 или 100 МГц измерялась только продольная релаксация, а на 10.8 и 27 МГц продольная и поперечная релаксации. Измерения проводились в диапазоне температур от 30-50 до 400-500 С для различных белков, т.е. при температурах, при которых все белки сохраняют свою нативную структуру. Хотя белки растворялись в тяжелой воде, спад как поперечной, так и продольной протонной намагниченности содержал компоненту с относительным весом от 20 до 40 процентов (Рис. 2.2), относящуюся к остаточным протонам воды [166]. Эта компонента имела время релаксации (как Т1, так и Т2), значительно Рисунок 2.2. Типичный спад поперечной намагниченности (раствор лизоцима, резонансная частота 27 МГц, комнатная температура, рН 3.0, концентрация 45 мг белка на 1 мл раствора). Штриховая линия – экстраполированная к нулевому времени компонента, относящаяся к протонам воды. 86 превышающее время релаксации протонов белка и легко вычиталась из общего спада. Эта компонента не влияет на время релаксации протонов белка, поскольку спиновая система остаточных протонов воды очень сильно разбавлена, химический и и потому магнитный обмен между протонами воды и белка крайне незначителен, что подтвердили наши эксперименты на образцах с различным остаточных Рисунок 2.3. Спады продольной (вверху) и поперечной (внизу) намагниченности протонов белка. Экспериментальные условия те же, что и на Рис. 2.2. Штриховые линии показывают наклон релаксационного спада в начальной точке. содержанием протонов воды [164]. На Рис. 2.3 представлены типичные спады продольной и поперечной релаксации протонов белка после вычета компоненты, относящейся к протонам воды. Оба спада имеют неэкпоненциальную форму, которая объясняется динамической неоднородностью структуры белка. Разложение спада на компоненты и соотнесение их различным фракциям протонов белка (см. например [150]) – весьма неоднозначная процедура, которая к тому же явно не подходит для совместного анализа Т1 и Т2, поскольку спады продольной и поперечной намагниченности имеют заметно разную кривизну (Рис. 2.3). Поэтому из спадов определялись только средние для всех протонов времена релаксации по начальному участку спадов, как это показано на Рис. 2.3. Эти времена релаксации мы бы получили при условии быстрого спинового обмена, как это имеет место в твердом теле. Поскольку целью исследований является, прежде всего, броуновская динамика белка как целого, то неучет кривизны спада намагниченности для нас 87 никакой роли не играет. Точность определения времен релаксации на частотах резонанса 27 и 90 МГц составляла 5-7%, на частоте 10.8 МГц – 10-13%. Количественный анализ времен релаксации основан на выражениях (1.50) и (1.51) и безмодельном подходе, описанном в первой главе. В растворе корреляционная функция движения белка состоит из произведения корреляционных функций двух независимых типов движений – вращения белка как целого и внутренних локальных движений: C0 (t ) = CR (t ) ⋅ Cl (t ) . В подходе Липари-Сзабо корреляционная функция (2.5) локального движения записывалась как сумма константы (параметра порядка) и одноэкспоненциального спада усредняемой части корреляционной функции, ур-е (1.60). В общем же случае эта корреляционная функция должна записываться так: C (t ) = Sl2 + (1 − Sl2 )ϕ (t ) , (2.6) 2 где ϕ(t) – монотонно спадающая от единицы до нуля функция, Sl - параметр порядка внутреннего движения. Эта функция может иметь довольно сложный вид, особенно в случае анализа неселективных релаксационных данных, когда времена релаксации интегральным образом отражают все типы внутренних движений в белке. Предсказать вид функции ϕ(t) заранее практически невозможно, поэтому при анализе времен релаксации мы использовали феноменологическую функцию распределения времен корреляции Фуосса-Кирквуда [167,168]: ∞ ⎛τ ⎞ ⎛ t⎞ ⎟ exp ⎜ − ⎟dτ , ⎝ τ⎠ ⎝ τl ⎠ ϕ (t ) = ∫ ρ ⎜ 0 ⎛ τ ⎞ ⎛ πβ ⎞ cos ⎜ ⎟ cosh ⎜ β ⋅ ln ⎟ τl ⎠ ⎛τ ⎞ β ⎝ 2 ⎠ ⎝ , ρ⎜ ⎟= ⎝ τ l ⎠ πτ sin 2 ⎛ πβ ⎞ + sinh 2 ⎛ β ⋅ ln τ ⎞ ⎜ ⎜ ⎟ τ l ⎟⎠ ⎝ 2 ⎠ ⎝ 88 (2.7a) (2.7b) где τl – среднее время корреляции молекулярного движения, β – феноменологический параметр ширины распределения времен корреляции. β изменяется от нуля (бесконечно широкое распределение) до единицы (функция распределения становится дельта-функцией). Удобство использования такого вида функции ϕ(t) состоит в том, что эта функция параметризуется только двумя параметрами - τl и β. Следует сказать, что существует еще несколько феноменологических функций распределения времен корреляции, аналогичных функции Фуосса-Кирквуда [168], которые часто применялись при анализе данных по ЯМР и диэлектрической релаксации в различных полимерах (например, распределения Кола-Кола, Хаврилиака-Негами). Однако эти функции не имеют принципиально значимых различий, и выбор типа распределения для анализа данных основывается в основном на субъективном вкусе исследователя. Фурье-преобразование функции (2.7), то есть спектральная плотность, имеет простой аналитический вид: β (ωτ l ) J (ω ) = ⋅ . ω 1 + (ωτ l )2 β β (2.8) В некоторых случаях (это мы покажем ниже) возникает необходимость проводить численное интегрирование выражения (2.7). В этом случае будет удобно провести замену переменных z=ln(τ/τl) и тогда функция ϕ(t) может быть выражена следующим образом ϕ (t ) = ∞ ⎛ t ⎞ ∫ Ρ ( z) exp ⎜⎝ − exp( z )τ l ⎠⎟dz , (2.9a) 2β cos( βπ / 2) cosh( β z ) . π ( cosh(2β z ) + cos( βπ) ) (2.9b) −∞ P( z ) = Такая форма записи значительно более удобна для проведения численного интегрирования. Что касается функции корреляции броуновского вращения CR(t), то исходя из рассмотренной выше модели электростатических взаимодействий белков в растворе, мы записываем ее в следующем виде: 89 ⎛ t CR (t ) = exp ⎜ − ⎝ τS ⎞⎡ 2 ⎛ t 2 ⎟ ⎢ S R + (1 − S R ) exp ⎜ − ⎝ τR ⎠⎣ ⎞⎤ ⎟⎥ , ⎠⎦ (2.10a) где S R2 - параметр порядка обычного броуновского вращения белка, τS – время корреляции медленной компоненты корреляционной функции. Параметр определяет степень межмолекулярным анизотропии броуновского электростатическим вращения, взаимодействием. которая Учитывая, S R2 вызвана что τR значительно короче, чем τS, CR(t) может быть записана следующим образом: ⎛ t ⎞ ⎛ t ⎞ CR (t ) = S R2 exp ⎜ − ⎟ + (1 − S R2 ) exp ⎜ − ⎟ . ⎝ τR ⎠ ⎝ τS ⎠ (2.10b) Таким образом, общая корреляционная функция движения белка в растворе выглядит так: ∞ ⎡ 2 ⎛ ⎞ ⎤ t 2 C0 (t ) = CR (t ) ⋅ Cl (t ) = ⎢ Si + (1 − Si ) ∫ Ρ ( z ) exp ⎜ − ⎟dz ⎥ × ⎝ exp( z )τ l ⎠ ⎦ −∞ ⎣ ⎡ ⎛ t ⎞ ⎛ t ⎞⎤ × ⎢ S R2 exp ⎜ − ⎟ + (1 − S R2 ) exp ⎜ − ⎟ ⎥ ⎝ τ R ⎠⎦ ⎝ τS ⎠ ⎣ . (2.11) А фурье-образ выражения (2.11) записывается в виде: ∞ ⎛ ⎞ τS τR τ' 2 + − ⋅ 1 ( ) J (ω ) = (1 − S R2 ) ⎜ Sl2 ⋅ S P z dz , ⎟ + S R2 ⋅ Sl2 ⋅ ( l ) ∫ 2 2 2 ⎜ ⎟ + + 1 1 ' ωτ ωτ ωτ 1+ ( ) ( ) ( ) −∞ R S ⎝ ⎠ (2.12) где τ '= exp( z )τ lτ R . exp( z )τ l + τ R Выше отмечалось, что время корреляции τS может примерно на порядок величины превышать τR, а это значит, что на резонансных частотах порядка 107 Гц и выше справедливо неравенство ωτS>>1. Кроме того, степень анизотропии броуновского вращения очень невелика, то есть S R2 <<1. Это приводит к тому, что второе слагаемое в выражении (2.12) пренебрежимо по сравнению с первым. Это объясняет тот факт, что медленное движение никак не проявляет себя в величине Т1. В то же время, 90 время релаксации Т2 чувствительно к медленному движению благодаря спектральной плотности на нулевой частоте (см. ур-е (1.51)): ∞ ⎛ ⎞ J (0) = (1 − S R2 ) ⎜ Sl2 ⋅τ R + (1 − Sl2 ) ⋅ ∫ P( z )τ 'dz ⎟ + S R2 ⋅ Sl2 ⋅τ S . −∞ ⎝ ⎠ (2.13) В этом случае из-за большого τS второе слагаемое в выражении (2.13) становится сравнимо с первым, несмотря на то, что S R2 <<1. Из этого выражения совершенно очевидно, что из времен релаксации Т1 и Т2, измеренных на относительно высоких резонансных частотах, определить параметры S R2 и τS отдельно невозможно, можно определить только произведение S R2 τS. Численные вычисления интегралов в выражениях (2.12) и (2.13) при обработке данных проводилось методом Симпсона. Далее, мы полагаем, что температурные зависимости всех времен корреляции определяются законом Аррениуса: τ l = τ l (293 0 ⎡ El ⎣R K ) exp ⎢ τ R = τ R (293 τ S = τ S (293 1 ⎞⎤ ⎛1 ⎜ − ⎟⎥ , 0 ⎝ T 293 K ⎠ ⎦ (2.14) ⎡ ER ⎣R 1 ⎞⎤ ⎛1 ⎜ − ⎟⎥ , 0 ⎝ T 293 K ⎠ ⎦ (2.15) ⎡ ES ⎣R 1 ⎞⎤ ⎛1 ⎜ − ⎟⎥ , 0 ⎝ T 293 K ⎠ ⎦ (2.16) 0 K ) exp ⎢ 0 K ) exp ⎢ где τl(2930K), τR(2930K), τS(2930K) – времена корреляции внутреннего локального, броуновского вращательного и медленного движений при температуре 200 С, El, ER и ES – энергии активации для этих трех движений, Т – абсолютная температура, R – универсальная газовая постоянная. При этом мы допускаем, что параметры порядка Sl2 и S R2 , а также параметр ширины распределения времен корреляции внутренних движений β от температуры не зависят. Безусловно, это допущение явно несправедливо в отношении параметра S R2 , но поскольку в эксперименте мы все равно регистрируем только произведение S R2 τS, мы должны иметь в виду, что 91 энергия активации ES отражает не только температурную зависимость времени корреляции τS, но и S R2 . При анализе данных величина среднего второго момента протонов белка, которая наряду со спектральными плотностями движений входит в выражения для времен релаксации, принималась равной 0.75·1010 с-2. Она была определена из измерения ширины линии протонов белка в замороженном растворе при температурах от -1500 до -1000 С. Следует отметить, что эта величина второго момента уже включает усреднение быстрым вращением протонов метильных групп (см. первую главу). Таким образом, параметры внутренних движений, которые были получены с использованием этой величины, характеризуют другие, более медленные конформационные движения белка. Позднее величина второго момента протонов белков, как для жесткой решетки, так и усредненная вращением метильных протонов, была определена нами расчетом по структурным данным нескольких белков [87]. Таким образом, вышеописанный математический формализм позволяет описать времена релаксации протонов белка в растворе, измеренные при различных резонансных частотах и температурах, набором восьми микродинамических параметров: Sl2 , S R2 τS, τl, τR, El, ER, ES и β. Обработка данных заключалась в минимизации квадратов отклонения RMSD = 1 N 2 i i ⎛ Texp ⎞ - Tsim ⎟⎟ , ⎜⎜ ∑ i Texp i =1 ⎝ ⎠ N (2.17) где N – число экспериментально измеренных времен релаксации при всех температурах и резонансных частотах, Texp и Tsim – экспериментальные и расчетные времена релаксации, соответственно. Минимизация («подгонка») проводилась на основе симплекс-метода или метода Монте-Карло. В результате обработки данных мы получали набор микродинамических параметров, при которых получается наилучшее описание частотно-температурных зависимостей времен релаксации. Необходимо отметить, что разные параметры определялись из подгонки с разной точностью. Наименее определенными параметрами являются характеристики внутреннего движения: время корреляции τl, энергия активации El и параметр 92 ширины распределения времен корреляции β. На фоне компоненты корреляционной функции, относящейся к броуновскому вращению, вклад внутреннего движения в скорость релаксации из-за короткого τl невелик, и потому измерения на низких резонансных частотах слабо чувствительны к локальной подвижности белков. Во всех случаях время корреляцииτl попадало в диапазон от 0.05 нс до 0.3 нс, энергия активации El – от 1 до 5 ккал/моль, а параметр β – от 0.35 до 0.65. Далее мы не будем приводить и анализировать значения этих параметров для различных белков. Важно то, что неопределенность в этих трех параметрах никак не сказывалась на точности определения всех остальных параметров, прежде всего параметров вращения белка как целого. Точность определения из подгонки остальных пяти параметров составляла 10-15%. 2.2.2. Результаты экспериментов и их обсуждение. Всего нами было исследовано девять различных растворов белков: 1) Яичный лизоцим, рН 3.0, концентрация 45 мг/мл; 2) Яичный лизоцим, рН 3.0, концентрация 100 мг/мл; 3) Яичный лизоцим, рН 5.5, концентрация 45 мг/мл; 4) Рибонуклеаза А, рН 2.7, концентрация 45 мг/мл; 5) Рибонуклеаза А, рН 6.5, концентрация 45 мг/мл; 6) Бактериальная рибонуклеаза из бактерий Bacillus intermedius 7P (биназа), рН 2.5, концентрация 50 мг/мл; 7) Биназа, рН 6.0, концентрация 50 мг/мл; 8) Триптофан-репрессор, рН 6.0, концентрация 45 мг/мл; 9) Бычий сывороточный альбумин, рН 7.0, концентрация 50 мг/мл. Лизоцим, рибонуклеаза А и бычий сывороточный альбумин были закуплены в фирме «Сигма» и использовались без дополнительной очистки. Биназа была получена от завода медицинских препаратов Института органического синтеза АН Латвии. Триптофан-репрессор был выделен и очищен в Стенфордской лаборатории магнитного резонанса (Стенфорд, США). В качестве примера на Рис. 2.4 и 2.5 представлены температурно-частотные зависимости времен магнитной релаксации для растворов лизоцима и бычьего сывороточного альбумина. Качество подгонки экспериментальных данных во всех остальных случаях было практически 93 Рисунок 2.4. Температурные зависимости времен релаксации протонов белка в растворе лизоцима (рН 3.0, кон-я 45 мг/мл). Обозначения значков: ○ – Т1 (частота указана на рисунке) ∆ – Т2 на 10.8 МГц + – Т2 на 27 МГц Рисунок 2.5. Температурные зависимости времен релаксации протонов белка в растворе БСА (рН 7.0, кон-я 50 мг/мл). Обозначения значков: ○ – Т1 (частота указана на рисунке) □ – Т2 на 10.8 МГц ∆ – Т2 на 27 МГц идентичным. Результаты обработки данных представлены в Таб. 2.1. Кроме микродинамических параметров в этой таблице для некоторых белков также представлены величины электрического дипольного момента, которые были определены экспериментально или теоретически, они будут обсуждаться ниже. Из Таб. 2.1 видно, что амплитуда внутренних движений (параметр Sl2 ) несколько различается для разных белков. Амплитуда быстрых (т.е. в субнаносекундном диапазоне времен корреляции) внутренних движений определяется 94 Таблица 2.1. Микродинамические параметры, определенные из подгонки температурных зависимостей времен протонной релаксации на трех частотах резонанса. Времена корреляции соответствуют 200 С. Лизоцим pH 3.0, 45 мг/мл Лизоцим pH 3.0, 100 мг/мл Лизоцим pH 5.5, 45 мг/мл Рибонуклеаза А pH 2.7, 45 мг/мл Рибонуклеаза А pH 6.5, 45 мг/мл Биназа рН 2.5, 50 мг/мл Биназа рН 6.0, 50 мг/мл Триптофанрепрессор рН 6.0, 45 мг/мл БСА pH 7.0, 50 мг/мл τR ES ккал/ моль ER ккал/ моль S R2 τS 5.9 4.9 3.1 7.8 0.6 5.9 4.9 7.3 8 0.61 5.9 4.9 9.5 7.6 0.6 5.9 4.8 5.0 7.5 0.51 6 4.9 11.2 8 0.49 5.5 5.2 4.5 7.0 0.58 5.5 6.5 9.5 10.2 0.54 8.5 5.3 80 23.5 0.35 700 5.0 4.8 55 38 0.37 450 нс Sl2 нс Дипольный момент, D 200 300 170 прежде всего свободным пространством вокруг кинетической единицы структуры белка (боковой цепи или химической группы), которая, в свою очередь определяется плотностью упаковки белка [169,170]. Из наших данных следует, что плотность упаковки лизоцима выше, чем плотность упаковки рибонуклеазы А. Аналогичный вывод можно сделать и из анализа рентгеноструктурных данных по лизоциму и рибонуклеазе S (разница в структуре между рибонуклеазой А и рибонуклеазой S незначительна). Данные по стерической доступности различных атомов белка молекулам растворителя [171] говорят о том, что доступность метиленовых углеродов (движение метиленовых групп дает основной вклад в амплитуду движения, наблюдаемую в протонной релаксации) больше в рибонуклеазе, чем в лизоциме на 38%. Это подтверждает адекватность представленных в Таб. 2.1 результатов. Более полная статистика для нескольких белков по корреляции 95 амплитуды внутренних движений и локальной плотности упаковки белка представлена в работе [170]. Однако внутренние движения не являются основной целью данного исследования, наибольший интерес для нас представляют параметры вращения белка как целого. За исключением триптофан-репрессора, отношения времен корреляции броуновского вращения τR для различных белков соответствуют отношению их молекулярных масс, что и должно быть в соответствии с законом Стокса. Отметим, что без учета длинной компоненты корреляционной функции это соответствие соблюдалось бы существенно хуже. Причинами завышения времени корреляции броуновского вращения триптофан-репрессора могут являться следующие обстоятельства. Во-первых, это сложная и ассиметричная форма триптофанрепрессора, возможно, с отличными от других белков фрактальными свойствами поверхности, что искажает закон Стокса-Эйнштейна [172]. Во-вторых, триптофанрепрессор может иметь более сильные электростатические взаимодействия с молекулами воды, что также искажает закон Стокса-Эйнштейна [173,174]. Наконец, наиболее вероятной причиной замедления броуновского вращения нам представляются два относительно длинных (по 12 аминокислотных остатков) неструктурированных N-терминальных конца полипептидной цепи, не соотнесенные в спектре высокого разрешения [175]. Они экспонированы в растворитель и явно замедляют броуновское вращение белка. При изменении концентрации в растворах лизоцима изменяется величина только произведения S R2 τS, а все остальные параметры остаются практически неизменными. Опять же следует сказать, что если не учитывать длинную компоненту корреляционной функции вращения белка (т.е. полагать, что S R2 =0), то мы получим зависимость параметра порядка внутренних движений от концентрации: в этом случае параметр Sl2 будет равен 0.71 и 0.49 для растворов лизоцима 45 и 100 мг/мл, соответственно. Параметр порядка, как упоминалось выше, зависит в основном от плотности упаковки глобулы белка. Очевидно, что от концентрации раствора она зависеть не может. При изменении рН в растворах лизоцима и рибонуклеазы А также меняется только произведение S R2 τS, что свидетельствует о том, что длинная компонента корреляционной функции зависит от электростатических взаимодействий, поскольку рН раствора влияет прежде всего на 96 распределение зарядов в структуре белка. При увеличении рН в растворе биназы с 2.5 до 6 также происходит изменение параметров длинной компоненты, но при этом изменяются также время корреляции броуновского вращения τR и энергия активации ER. Наиболее вероятная причина этого – частичная димеризация белка при нейтральных рН [162], что приводит к увеличению τR, а энергия активации в этом случае отражает не только температурную зависимость τR, но и температурную зависимость соотношения мономеров-димеров. Также следует отметить тот факт, что время корреляции лизоцима из таблицы 2.1 (примерно 8 нс) отличается от времени корреляции, определенного из отношения Т1/T2 (9.1 нс, см. Рис. 2.1). Это означает, что электростатические межбелковые взаимодействия проявляются даже при достаточно малых концентрациях. В последней колонке Таб. 2.1 представлены величины дипольных моментов некоторых белков. Для БСА, рибонуклеазы А, лизоцима и биназы они были измерены экспериментально в нашей лаборатории на установке временнóй диэлектрической спектроскопии [176]. Дипольный момент триптофан-репрессора был оценен теоретически по методике, основанной на основных положениях работы [177]. Дипольный момент белка представлялся как векторная сумма дипольных моментов пептидных связей (3.5 D, направленных вдоль связи С=О) и дипольного момента, обусловленного заряженными аминокислотами - глутаминовыми и аспарагиновыми кислотами, гистидинами, лизинами и аргининами. рК этих аминокислот полагались равными соответственно 4, 4, 6.5, 10 и 12. Хотя в реальности рК заряженных аминокислот в белке могут отклоняться от базовых значений, но эти отклонения редко превышают 1-1.5 единицы рН. Учитывая, что рН раствора было равно 6, можно заключить, что только ошибка в рК гистидинов существенна для вычисления дипольного момента. Но число гистидинов по сравнению с остальными заряженными аминокислотами достаточно мало и это не может значительно исказить величину дипольного момента. Величина дипольного момента в первом приближении хорошо коррелирует с произведением S R2 τS, что подтверждает справедливость предложенной модели. Однако только величиной дипольного момента нельзя объяснить разницу в произведении S R2 τS для различных белков. Белки, представленные в Таб. 2.1, имеют различные молекулярные массы, это влияет на скорость трансляционной диффузии 97 белков, а значит, и на время корреляции τS. С другой стороны, при одинаковой весовой концентрации, растворы разных белков имеют разную молярную концентрацию, следовательно, разное среднее расстояние между молекулами в растворе. Это влияет на силу взаимного ориентирования белков, т.е. в конечном счете, на параметр порядка S R2 . Кроме размеров белков и их концентрации в растворе на межмолекулярные электростатические взаимодействия также влияют и характеристики растворителя, в частности величина рН. Как видно из Таб. 2.1, при повышении рН для растворов лизоцима, рибонуклеазы А и биназы сила межмолекулярного электростатического взаимодействия увеличивается. Мы это объясняем эффектом кулоновского взаимного отталкивания белков. Изоэлектрические точки (т.е. значения рН, при которых суммарный электрический заряд белка равен нулю) для лизоцима, рибонуклеазы А и биназы находятся в области щелочных рН, где эти белки образуют агрегаты. Таким образом, при увеличении рН раствора (т.е. при приближении к изоэлектрической точке) суммарный заряд белков уменьшается. В частности, заряд лизоцима при рН 3.0 составляет +15, а при рН 5.5 – +9 [178]. Уменьшение заряда белка приводит к уменьшению силы кулоновского взаимного отталкивания, глобулы белков подходят друг к другу на более близкое расстояние и взаимодействуют более эффективно. Иначе говоря, уменьшение заряда приводит к уменьшению среднего расстояния между соседними белками в растворе. Для проверки этого предположения мы исследовали подробную рН зависимость времен релаксации Т1 и Т2 протонов БСА на частоте резонанса 27 МГц при комнатной температуре (Рис. 2.6). БСА – очень удобный белок для этой цели, поскольку его изоэлектрическая точка находится при рН 4.95. Скачок в зависимости времен релаксации при рН 4 однозначно говорит о наличии рН-зависимого (обратимого по нашим данным) конформационного перехода в БСА, что соответствует результатам других исследований [179]. Но наиболее интересной особенностью представленных на Рис. 2.6 данных является то, что в диапазоне рН от 4 до 7 Т1 практически постоянно, а Т2 имеет явный минимум при рН~5. Постоянство времени продольной релаксации свидетельствует о том, что параметры броуновского вращения и внутреннего движения не претерпевают какихлибо существенных изменений в этом диапазоне рН, поскольку время Т1 на данной 98 частоте резонанса чувствительно, как упоминалось выше, именно к этим типам движений. Следовательно, изменения Т2 можно отнести только за счет наиболее медленного движения, вызываемого электростатическими взаимодействиями. Поскольку время релаксации Т2 обратно пропорционально произведению S R2 τS, величина этого максимальна при произведения рН 5, т.е. в изоэлектрической точке. Концентрация и размеры БСА постоянны в диапазоне рН от 4 до 7, значит время корреляции τS не должно существенно изменяться. Таким образом, Рис. 2.6 подтверждает Рисунок 2.6. рН зависимость времен релаксации Т1 и Т2 протонов БСА на резонансной частоте 27 МГц, t=300 С. предположение о влиянии кулоновского отталкивания белков на их броуновское вращение. Кроме величины рН, на взаимное электростатическое взаимодействие белков может влиять также и ионная сила раствора. Согласно теории Дебая-Хюккеля, ионы раствора экранируют электростатическое поле вокруг белков, уменьшая силу их взаимодействия. Измеряя времена релаксации протонов лизоцима и рибонуклеазы А при различных ионных силах раствора при кислых и нейтральных рН мы обнаружили, что времена релаксации никак не зависят от ионной силы при концентрациях KCl от 0 до 1 М (неопубликованные данные). На первый взгляд, эти результаты противоречат предложенной модели межмолекулярных взаимодействий. Однако это противоречие может быть также объяснено с учетом кулоновского отталкивания белков. Ионное экранирование приводит к уменьшению не только взаимного ориентирования белков, но и их взаимного отталкивания. Эти два эффекта противонаправлены и в сумме они могут в значительной степени компенсировать друг друга. Чтобы 99 проверить это предположение, мы провели измерения времен релаксации Т1 и Т2 БСА на частоте резонанса 27 МГц при комнатной температуре при различных концентрациях KCl в растворе в изоэлектрической точке (Рис. 2.7). В этом случае мы изначально исключаем эффект кулоновского отталкивания белков и наблюдаем только результат ионного экранирования. Как видно из Рис. 2.7, время Т1 не зависит от концентрации соли в растворе, а время Т2 проявляет хотя и слабый, но хорошо заметный рост с увеличением ионной силы раствора. Отсюда следует, что величина произведения S R2 τS уменьшается при увеличении ионной силы. Поскольку Рисунок 2.7. Зависимость времен релаксации Т1 и Т2 протонов БСА от концентрации KCl в растворе (pH 4.95, резонансная частота 27 MHz, t=300 C). при увеличении концентрации соли вязкость растворителя и размеры белка вряд ли существенно изменяются, свидетельствует постоянство о чем Т1, время корреляции τS скорее всего достаточно слабо зависит от ионной силы. Это значит, что уменьшение произведения S R2 τS с ростом ионной силы следует отнести прежде всего за счет уменьшения анизотропии броуновского вращения - параметра S R2 . Таким образом, данный эксперимент подтверждает предположение о природе зависимости межмолекулярных электростатических взаимодействий от ионной силы раствора и объясняет отсутствие этой зависимости в растворах белков, обладающих ненулевым суммарным зарядом. Следует отметить, что представленная выше модель межбелковых взаимодействий в растворе и интерпретация экспериментов имеют только качественный характер. Легко показать, что для 5% раствора БСА расстояние между белками примерно 100 ангстрем, если предположить, что белки находятся в узлах кубической решетки. В то же время диаметр молекулы БСА составляет 50-60 100 ангстрем. Поэтому рассматривать белки как точечные заряды и диполи в этих условиях - безусловно, очень сильное упрощение. Для строгого количественного рассмотрения влияния электростатических взаимодействий на броуновское вращение белков, конечно же, необходимо учитывать реальное распределение зарядов в структуре белка. Это гораздо более сложная проблема и она пока не решена. 2.3. Анализ дисперсий времен релаксации воды в растворах белков. В представленном выше анализе времен релаксации протонов белков в растворах тяжелой воды информация о медленном движении содержится только в одном определяемом из эксперимента параметре – произведении S R2 τS. Для того, чтобы определять степень анизотропии броуновского вращения и характерное время этой анизотропии отдельно друг от друга, необходимо исследовать растворы белков физическими методами, чувствительными к движениям в низкочастотном диапазоне. Мы использовали для этой цели измерения дисперсий времен релаксации Т1 протонов воды в белковых растворах и эксперименты по временнóй диэлектрической спектроскопии. Простое понижение резонансной частоты в релаксационных ЯМР- экспериментах с целью исследования медленных движений невозможно из-за проблемы с чувствительностью. Но измерять релаксацию при низких полях можно с помощью метода циклирования магнитного поля [67,68]. Необходимо отметить, что чувствительность экспериментов с циклированием магнитного поля обычно существенно ниже, чем чувствительность релаксационных экспериментов, выполняемых на стандартных спектрометрах. Протоны белка в не сильно концентрированных растворах тяжелой воды обычно дают очень слабый сигнал для того, чтобы можно было измерить дисперсии Т1 с приемлемой точностью. Только совсем недавно развитие аппаратуры позволило измерить дисперсии Т1 протонов белка в растворе [154]. Эксперименты с циклированием магнитного поля – не самый лучший способ зафиксировать медленную компоненту корреляционной функции: дисперсионная ступенька, соответствующая медленному движению, имеет маленькую амплитуду, и потому приемлемое описание частотных зависимостей Т1 может быть получено и при допущении S R2 =0. С этой точки зрения измерение 101 температурных зависимостей времен релаксации – более надежный способ. Наличие минимумов в зависимостях Т1 (см. данные при 10.8 и 27 МГц на Рис. 2.4) позволяет определить время корреляции τR с очень высокой точностью, а зная τR, можно также очень точно определить наличие медленного движения (т.е. произведение S R2 τS) из отношения Т1/Т2. Именно так и происходит в процессе подгонки времен релаксации. Исследовать броуновское вращение белков можно и с помощью релаксационных измерений на магнитных ядрах растворителя. Принципиальная возможность этого основана на том экспериментально установленном факте, что часть молекул воды связывается с глобулой белка и испытывает те же движения, что и белок. С другой стороны, время жизни молекул воды в гидратном состоянии существенно короче, чем время релаксации, что обеспечивает быстрый обмен между гидратной и свободной фракциями воды. Поэтому релаксационный спад протонов (как и дейтеронов, и ядер 17 О) воды всегда одноэкспоненциален, а частотная зависимость времени релаксации воды определяется не только движением молекул воды, но и движением глобул белка. Существует несколько физических моделей гидратации белков, предполагающих тот или иной набор динамических процессов в белковом растворе, которые могут объяснить экспериментально наблюдаемую форму дисперсии Т1 воды [140,141,180-185]. Однако как показали Денисов и Халле [186,187], время жизни молекул воды в гидратном слое составляет всего несколько десятков пикосекунд, и потому они не могут дать информацию о броуновском вращении белка, время корреляции которого находится в наносекундном диапазоне. Сравнение данных по БПТИ и убиквитину [186,187] показало, что наблюдаемая форма дисперсий Т1 в растворах белков обусловлена очень ограниченным количеством молекул воды, которые находятся в полостях внутри глобулы белка, и которые обмениваются со свободной водой за время от долей микросекунды до миллисекунд. Другой механизм, обеспечивающий возможность получения информации о движении белка через протоны (или дейтероны) воды, это обмен лабильных протонов (дейтеронов) белка, экспонированных в растворитель. Скорость этого обмена зависит от рН [188]. Что касается магнитного обмена между протонами белка и воды, то он незначителен [188]. Физическая природа гидратации белков не играют важной роли для цели настоящего исследования. Для нас важно лишь то, что некоторая часть молекул воды (или лабильных протонов) вращается вместе с белком 102 и благодаря этому по времени релаксации воды можно судить о броуновской динамике белка. Мы измеряли дисперсии протонов воды в растворах лизоцима в обычной воде при различных температурах (40 и 200 С), рН (3.0 и 5.0) и, имея в виду не очень высокую чувствительность экспериментов с циклированием магнитного поля, при относительно выскоих концентрациях (130 и 200 мг/мл). Эксперименты были проведены на самодельном релаксометре с циклированием магнитного поля в группе проф. Райнера Киммиха в Университете Ульма (Германия). В условии быстрого обмена наблюдаемое время спин-решеточной релаксации воды можно записать как T1−1 = 1 − ph ph + , T1 f T1h (2.18) где ph – доля протонов связанной с белком (гидратной) воды и лабильных протонов, T1f и T1h – времена релаксации свободной и гидратной воды, соответственно. Автокорреляционная функция движения молекул гидратной воды может быть записана аналогично корреляционной функции внутреннего движения (ур-е (2.5)): Ch (t ) = CR (t ) ⋅ Clh (t ) , (2.19) где Сlh(t) – корреляционная функция локального движения молекул гидратной воды на поверхности (или внутри глобулы) белка. Используя принятые выше обозначения, ур-е (2.19) можно переписать следующим образом: ⎛ t ⎞ ⎡ ⎛ t Ch (t ) = exp ⎜ − ⎟ ⋅ ⎢ S R2 + (1 − S R2 ) exp ⎜ − ⎝ τR ⎝ τS ⎠ ⎣ ⎛ t ⎞⎤ ⎡ 2 2 ⎟ ⎥ ⋅ ⎢ S h + (1 − S h ) exp ⎜ − ⎠⎦ ⎣ ⎝ τ lh ⎞⎤ ⎟⎥ , ⎠⎦ (2.20) где S h2 и τlh – параметр порядка и время корреляции локального движения гидратной воды. При условии τS>>τR>>τlh, выражение для спектральной плотности движения будет выглядеть так: J h (ω ) = (1 − S h2 ) τ lh τR τS . + S h2 (1 − S R2 ) + S h2 S R2 2 2 2 1 + (ωτ S ) 1 + (ωτ lh ) 1 + (ωτ R ) 103 (2.21) Если анализировать релаксацию только при низких резонансных частотах, при которых выполняется неравенство ωτlh<<1, то выражение для времени релаксации сведется к следующему: ⎡ ⎞⎤ ⎛ ⎞ 2⎛ 2τ S 8τ S 2τ R 8τ R T1−1 = D + A ⎢(1 − S R2 ) ⎜ S + + + ⎟⎥ , ⎟ ⎜ R ⎜ 1 + (ωτ )2 1 + ( 2ωτ )2 ⎟ ⎜ 1 + (ωτ )2 1 + ( 2ωτ )2 ⎟ ⎥ ⎢⎣ R R S S ⎠⎦ ⎝ ⎠ ⎝ (2.22) где D= 1 − ph 10 2 + ph (1 − Sh2 )τ lh (δω0 h ) , T1 f 3 (2.23) A= 1 2 ph S h2 (δω0 h ) , 3 (2.24) где (δω0h)2 – усредненный второй момент протонов гидратной воды. Используя эти уравнения, дисперсии времен релаксации воды можно описать набором из пяти параметров: A, D, τR, S R2 и τS. Если S R2 =0 (случай стандартного изотропного броуновского вращения), то дисперсии описываются только тремя параметрами: A, D и τR. Следует отметить, что самое сильное допущение, сделанное при выводе выражений (2.22-2.24), это допущение о единственном времени корреляции локального движения молекул гидратной воды τlh. Безусловно, движение молекул гидратной воды имеет сложный характер, и его корреляционная функция вряд ли может быть представлена одной экспонентой. Но это важно только для анализа релаксации на относительно высоких резонансных частотах, порядка 10 МГц и выше. Эти резонансные частоты чувствительны к движениям со временами корреляции ~1 нс и короче. Нас же сейчас интересует низкочастотное крыло дисперсии, которое отражает броуновское вращение белка и медленное движение. А на эту часть дисперсии быстрые локальные движения молекул гидратной воды никакого влияния не оказывают. На Рис. 2.8 представлены дисперсии скорости релаксации T1−1 протонов воды в растворах лизоцима, измеренные при 40 С при различных рН и концентрациях. В Табл. 2.2. представлены микродинамические параметры τR, τS и S R2 , полученные в результате подгонки частотных зависимостей Т1 (значения параметров A и D не представлены, поскольку они сейчас не представляют интереса). В качестве еще 104 одного доказательства необходимости включения медленной компоненты корреляционной функции в анализ ЯМР-релаксационных данных в растворах белков, обработка дисперсий была проведена в двух вариантах: в одном случае все пять параметров подгоночными, полагалось в были другом S R2 =0, и подгонка шла только по трем параметрам (см. выше). Результаты обоих вариантов представлены в Таб. 2.2. Из Рис. 2.8 видно, что удовлетворительное описание низкочастотной части дисперсий можно получить только при S R2 >0. Если полагать S R2 =0, то удовлетворительное формы описание дисперсии получить, только распределение можно допуская времен корреляции τlh (сейчас мы не обсуждаем вопрос о физической природе этого распределения). Но при этом определяемое из подгонки время корреляции τR превышает определяемую величину, по Стокса-Эйнштейна −1 1 Рисунок 2.8. Дисперсии T протонов воды в растворе лизоцима при 40 С (остальные экспериментальные условия указаны на рисунке). Сплошные и штриховые линии – подгоночные кривые, соответствующие подгонкам при свободном параметре S R2 и при S R2 =0, соответственно. 105 уравнению (2.1) на порядок величины и более, что невозможно объяснить с физической точки зрения, даже учитывая димеризацию частичную лизоцима при Таблица 2.2. Параметры вращения белка как целого, определенные из подгонки дисперсий Т1 протонов воды в растворах лизоцима при различных условиях. Звездочкой отмечены величины времени корреляции τR, полученные при условии S R2 =0. Точность определения параметров из подгонки составляет 15-25%. τR*, нс τS, нс τR, нс S R2 τR*, нс τS, нс τR, нс S R2 рН=3, t=200 С 130 мг/мл 42 89 7.7 0.04 рН=3, t=200 С 200 мг/мл 40 82 10.2 0.061 рН=5, t=200 С 130 мг/мл 52 77 7.9 0.076 рН=5, t=200 С 200 мг/мл 62 81 9.6 0.129 рН=3, t=40 С 130 мг/мл 39 117 15 0.05 рН=3, t=40 С 200 мг/мл 60 122 21 0.142 рН=5, t=40 С 130 мг/мл 59 141 15.1 0.078 рН=5, t=40 С 200 мг/мл 89 157 20 0.161 рН=5 [149-151]. Таким образом, результаты по дисперсиям времени релаксации протонов воды полностью соответствуют выводам, сделанным из анализа релаксации протонов белка. Интересно сравнить результаты экспериментов по релаксации протонов воды и белка, описанные выше. Поскольку и те, и другие эксперименты проводились на лизоциме при очень схожих экспериментальных условиях, мы можем сравнивать параметры броуновского вращения лизоцима напрямую. По времени корреляции τR при 200 С, эти два типа экспериментов соответствуют друг другу практически идеально, см. Таб. 2.1 и 2.2. Рост τR при увеличении концентрации от 130 до 200 мг/мл легко объясняется механическими контактами глобул в растворе, что отражается также в концентрационной зависимости Т1 протонов лизоцима (Рис. 2.1). Для того, чтобы разделить произведение S R2 τS, определенное из данных по релаксации протонов лизоцима, на два отдельных параметра, мы воспользовались данными по релаксации протонов воды в тех же растворах. На Рис. 2.9 представлена концентрационная зависимость параметра S R2 , построенная по данным из Таб. 2.2. Допуская, что эта зависимость линейная, мы определили S R2 для концентраций 45 и 106 100 мг/мл при рН 3 и 5.5 (при этом мы пренебрегли разницей в рН между 5.0 и 5.5). Затем, используя величину S R2 , мы определили время корреляции τS. Результаты представлены в Таб. 2.3. Следует заметную отметить разницу между величинами τS, определенными из экспериментов по релаксации протонов белка и воды: в последнем случае τS существенно короче. Одной Рисунок 2.9. Концентрационная зависимость параметра S R2 при 200 С, построенная по данным из Таб. 2.2. Обозначения символов: * - экспериментальные данные; ○ – оценка для раствора лизоцима при концентрациях 45 и 100 мг/мл. из возможных причин этого количественного расхождения может быть обмен между гидратной и свободной водой. Если среднее время жизни молекулы воды в связанном с белком состоянии сравнимо или короче, чем истинное τS, релаксация протонов Таблица 2.3. Параметры S R2 и τS, определенные из данных, представленных на Рис 2.9 и Таб. 2.1. pH=3 рН=3 рН=5.5 45 мг/мл 100 мг/мл 45 мг/мл τS, нс 240 260 315 S R2 0.013 0.028 0.03 воды дает заниженную величину τS. Таким образом, сравнение данных по релаксации протонов воды и белка позволяет нам сделать вывод о том, что среднее время жизни молекул воды в связанном с белком состоянии составляет величину порядка 100 нс, что согласуется с другими оценками [189,190]. Но с другой стороны, следует иметь в виду, что протонная релаксация воды при кислотных рН в очень значительной степени определяется обменом лабильных протонов, время жизни которых на белке находится в миллисекундном диапазоне [188]. Поэтому причиной количественного 107 расхождения в величинах S R2 τS, определенных из двух типов экспериментов, также может быть не совсем корректная процедура феноменологической экстраполяции в сторону низких концентраций (Рис. 2.9) и более сложная форма длинной компоненты корреляционной функции. Последнее представляется вполне вероятным, поскольку биэкспоненциальное описание дисперсий не совсем точно соответствует экспериментальным данным при низких частотах (Рис. 2.8). 2.4. Диэлектрические эксперименты в растворах миоглобина. Другую возможность получить подробную информацию о форме корреляционной функции вращения белка в растворе предоставляет временнáя диэлектрическая спектроскопия (ВДС). Подробно возможности этого экспериментального метода описаны в серии работ [176,191,192]. ВДС регистрирует функцию дипольной корреляции (ФДК), которую можно выразить так: Cd (t ) = M (0) M (t ) , (2.25) где M (t ) - макроскопический дипольный момент образца. Если представить M (t ) в виде суммы дипольных моментов отдельных молекул M (t ) = ∑ μi (t ) , то тогда ФДК i можно записать следующим образом: Cd (t ) = ∑ μi (0) μi (t ) + ∑ μi (0) μ j (t ) . (2.26) i≠ j i Первое и второе слагаемые в ур-и (2.26) являются авто- и кросс-корреляционными ФДК, соответственно. В разбавленных растворах, когда межмолекулярное взаимодействие пренебрежимо, кросс-корреляционной ФДК обычно пренебрегают. В нашей лаборатории в 90-е годы И.В. Ермолиной была проведена серия экспериментов по временнóй диэлектрической спектроскопии в растворах нескольких белков с целью сравнения ЯМР и диэлектрических данных и изучения ФДК белка при различных концентрациях [160,193-195]. Наиболее подробно и детально были изучены растворы миоглобина лошади. Анализ формы ФДК 108 (примеры ФДК представлены на Рис. 2.10) показал, что при концентрации раствора меньше, чем 4-5% (по весу), ФДК может быть описана суммой двух экспоненциальных компонент. Время корреляции наиболее медленной из этих компонент было отнесено к броуновскому вращению белка как целого. Размеры глобулы Рисунок 2.10. ФДК для раствора миоглобина при концентрации 50 (а) и 150 (b) мг/мл. Измерения проводились при t=200 C, рН=7. Штриховая линия обозначает длинную компоненту корреляционной функции. миоглобина - 45×35×25 Å [196], то есть форма белка не очень сильно отличается от шарообразной. Поэтому описание компоненты ФДК, относящейся к вращению белка как целого, одной экспонентой вполне резонно. Короткая компонента относится к более быстрым по сравнению с τR локальным флуктуациям дипольного момента глобулы белка, вызываемым внутренними движениями. При концентрациях более 5% для удовлетворительного описания ФДК необходимо ввести еще одну, самую медленную компоненту, которую, исходя из приведенного выше анализа ЯМРрелаксационных данных, мы относим к медленному движению, появляющемуся благодаря межбелковым электростатическим взаимодействиям. Таким образом, ФДК может быть представлена как сумма трех экспоненциальных компонент, аналогично корреляционной функции, используемой для анализа ЯМР- релаксационных данных, см. ур-е (2.8). Единственная разница между анализом ЯМРрелаксационных и диэлектрических данных заключается в том, что в последнем случае мы не использовали распределение времен корреляции локального движения, а аппроксимировали короткую компоненту ФДК одной экспонентой. Скорее всего, распределение времен корреляции существует и для ФДК (хотя совсем не обязательно такое же, как и для случая ЯМР-релаксации), но ошибка эксперимента не позволяла достоверно определять форму спада короткой компоненты, и потому мы пользовались одноэкспоненциальным приближением. 109 Рисунок 2.11. Концентрационная зависимость времен корреляции трех компонент ФДК в растворе миоглобина. Измерения проводились при рН растворов от 6.8 до 7.2, t=200 C. Рисунок 2.12. Концентрационная зависимость параметров S R2 и Sl2 . Экспериментальные условия те же, что и на Рис. 2.11. На Рис. 2.11 и 2.12 представлены результаты анализа ФДК в растворах миоглобина – концентрационные зависимости времен корреляции τl, τR и τS, а также параметров порядка S R2 и Sl2 . Эти данные полностью подтверждают выводы, сделанные из анализа ЯМР-релаксации. Если допустить, что увеличение концентрации белка в растворе приводит только к увеличению τR, но форма корреляционной функции броуновского вращения белка при этом не изменяется, то в результате мы получим рост параметра порядка Sl2 , то есть амплитуды внутренних движений, от концентрации раствора, что объяснить с физической точки зрения практически невозможно. Что же касается величины Sl2 0.9±0.05 (Рис. 2.12), то она близка к другим независимым оценкам доли электрического дипольного момента глобулы белка, которая усредняется за счет быстрых внутренних движений [177,197]. Необходимо напомнить, что время корреляции диффузионного вращательного движения, определяемое методом диэлектрической спектроскопии ровно в 3 раза длиннее, чем время корреляции того же движения, определенное методом ЯМР [27]. С учетом этого, время корреляции τR для миоглобина ~30 нс (Рис. 2.11) и для 110 лизоцима 8 нс (Таб. 2.1 и 2.2) соответствуют друг другу очень хорошо, если принять во внимание молекулярные массы этих белков – 17800 и 14200, соответственно. (Здесь мы не касаемся проблемы соответствия экспериментально определяемых времен корреляции вращательного движения белков стоксовским величинам. Этому посвящен ряд работ [172-174,198-200]). Что касается других микродинамических параметров, определенных из ЯМР и ВДС экспериментов, то их прямое сравнение будет не совсем корректным. ЯМР и ВДС используют разные природные зонды, поэтому совершенно очевидно, что сопоставлять параметры внутренних движений белков Sl2 и τl напрямую нельзя. А обсуждая параметры медленной компоненты корреляционной функции вращения как целого, необходимо иметь в виду, что ЯМР дает только авто-корреляционную функцию, в то время как ВДС – сумму авто- и кросс-корреляционных функций, см. ур-е (2.26). Если мы предполагаем межмолекулярное электростатическое взаимодействие белков, то пренебрегать кросс-корреляционным слагаемым в ур-и (2.26), безусловно, нельзя. В заключение отметим, что чувствительность ЯМР и диэлектрической спектроскопии к медленной компоненте корреляционной функции разная. Это следует из того факта, что частотная зависимость диэлектрической проницаемости ε´(ω) (диэлектрическая спектроскопия) и спектральная плотность движения J(ω) (ЯМР) для нескольких динамических процессов выглядят как ε '(ω ) ∼ ∑ i J (ω ) ∼ ∑ i pi 2 , (2.27) 2 , (2.28) 1 + (ωτ i ) piτ i 1 + (ωτ i ) где pi и τi – относительный вес и время корреляции i-го динамического процесса. Отсюда легко видеть, что диэлектрическая спектроскопия может регистрировать длинную компоненту только в том случае, если ее относительный вес больше типичной ошибки эксперимента, то есть примерно 5-10%. В случае же анализа ЯМРрелаксационных данных, играют роль не относительные веса динамических процессов, а произведения piτi. Поскольку, несмотря на очень малую величину S R2 , 111 произведения S R2 τS и (1- S R2 )τR сравнимы, медленная компонента корреляционной функции в ЯМР определяется более достоверно, чем в диэлектрическом эксперименте. 2.5. Теоретические оценки энергии межмолекулярного электростатического взаимодействия белков и компьютерное моделирование броуновской динамики электрических диполей. Представленная выше модель, описывающая влияние электростатических взаимодействий на характер броуновского вращения белков, может считаться справедливой только при очевидном условии – энергия этих взаимодействий должна быть как минимум сравнима с величиной кТ (к – постоянная Больцмана, Т абсолютная температура). Для оценки энергии взаимодействий воспользуемся следующей упрощенной моделью. Представим себе белки в виде точечных зарядов и диполей и допустим, что межмолекулярное электростатическое взаимодействие обуславливается только парным взаимодействием ближайших друг к другу частиц. В этом случае средняя энергия заряд-дипольного взаимодействия выражается следующим образом: EQ − μ = Qμ ε ∞ 1 ∫r 2 h( r ) dr , (2.29) 0 где Q – суммарный заряд белка, μ - его электрический дипольный момент, ε диэлектрическая распределения проницаемость расстояния до среды (для ближайшей воды ε=80), h(r) – функция частицы. Функция h(r) для невзаимодействующих частиц была получена, в частности, в книге [201]: ⎛ 4 ⎞ h( r ) = 4π Nr 2 exp ⎜ − π Nr 3 ⎟ , ⎝ 3 ⎠ (2.30) где N - среднее число частиц в единице объема (концентрация). Следует иметь в виду, что в случае одноименно заряженных частиц функция h(r) может измениться за счет кулоновского отталкивания белков. Для его учета мы ввели в эту функцию 112 больцмановский множитель, учитывающий отталкивание, и тогда функция h(r) может быть записана в виде h( r ) = ⎛ Q2 1 ⎛ 4 ⎞ 4π Nr 2 exp ⎜ − π Nr 3 ⎟ exp ⎜ − A ⎝ 3 ⎠ ⎝ ε rkT ⎞ ⎟, ⎠ (2.31) где А – нормировочный множитель, определяемый из условия ∞ ∫ h(r )dr = 1 . (2.32) 0 Вычисления для раствора лизоцима при рН 3.0, концентрации 45 мг/мл (Q=+15e, μ=180 D, N =1.42·1018 см-3) и комнатной температуре приводят к результату EQ − μ = 0.4kT . То есть энергия межмолекулярного электростатического взаимодействия в белковом растворе по порядку величины вполне достаточна для того, чтобы оказывать влияние на броуновское вращение белков. Аналогичным образом можно было бы оценить и энергию диполь-дипольного взаимодействия, т.е. для случая, когда суммарный заряд белка Q близок к нулю [160]. Однако в этом случае из-за отсутствия кулоновского отталкивания белки могут подходить друг к другу достаточно близко, и потому приближение точечных зарядов и диполей может дать очень далекий от действительности результат. В этом случае необходимо учитывать реальное распределение зарядов в структуре белка, но это уже гораздо более сложная задача. Если известно внешнее постоянное электрическое поле, воздействующее на электрический диполь, то можно определить параметр порядка S R2 . Этот параметр для случая ЯМР и диэлектрической спектроскопии определяется как S 2 R − NMR = 3 cos 2 β − 1 2 S R2 − DS = cos β , 113 , (2.33) (2.34) где β - угол между ориентациями межъядерного вектора (для ЯМР) и вектора дипольного момента (для диэлектрической спектроскопии) в моменты времени 0 и ∞. Причем, следует иметь в виду, что для случая неселективной протонной релаксации усреднение, обозначаемое угловыми скобками, должно включать также и усреднение по различным межпротонным векторам в белке. Поскольку протонов в белке очень много, мы предполагаем, что направления всех межпротонных векторов распределены изотропно в молекулярной системе координат. Вычисления параметров порядка (2.33) и (2.34) были проведены И.В. Ивойловым [160,193,194] и в результате были получены следующие выражения: S R2 − NMR = 1 3⎛ L( x) ⎞ ⎛ 1 L( x) ⎞ + ⎜1 − 2 ⎟⎜ − 3 ⎟, 20 10 ⎝ x ⎠⎝ 2 x ⎠ (2.35) S R2 − DS = L2 ( x ) , (2.36) где x=μE/kT – отношение энергии взаимодействия диполя с внешним полем Е к тепловой энергии кТ, L(x)=cth(x)-1/x – функция Ланжевена. Зависимости (2.35) и (2.36) графически представлены на Рис. 2.13. Сильная разница между этими зависимостями объясняется в основном не разной природой методов, а дополнительным усреднением по различным ориентациям межпротонных векторов для случая ЯМР. Анализ данных показывает, что оценка параметра x (0.4, см. выше) и зависимость параметра порядка S R2 (x), ур-е (2.35), не соответствуют экспериментальным данным, см. Таб. 2.2. Теоретические оценки дают величину S R2 существенно ниже результатов эксперимента. Это, по-видимому, объясняется допущениями, которые мы сделали в процессе расчета, прежде всего представлениями о белке, как о точечном заряде и диполе и рассмотрением только парных, а не многочастичных белковых взаимодействий. Другой способ теоретического изучения межмолекулярных электростатических взаимодействий – компьютерное моделирование броуновской динамики (БД) частиц со встроенными в их структуру электрическими зарядами. Алгоритм моделирования БД был описан, в частности, в работе [202]. Если координата частицы i в момент времени t была r(t), то в момент времени t+τ она будет 114 ri (t + τ ) = ri (t ) + Dtτ kT N ∑F j =1 ij + Ri (τ ) , (2.37) где Dt – коэффициент трансляционной диффузии, Fij – сила взаимодействия между частицами i и j, Ri(τ) – вектор случайного трансляционного сдвига частицы, который броуновскую обеспечивает диффузию Согласно частицы. флуктуационно- диссипационной теореме, случайные сдвиги Рисунок 2.13. Зависимости параметров порядка S R2 для ЯМР и диэлектрической спектроскопии от величины внешнего электрического поля. Графики построены по формулам (2.35) и (2.36). распределены нулевым средним нормально значением с и дисперсией Ri R j = 2 Dtτδ ij , (2.38) где δij – символ Кронекера. Аналогичным образом записывается и вращательное движение частицы: Wi (t + τ ) = Wi (t ) + Drτ kT N ∑T j =1 ij + Si (τ ) , (2.39) где W(t) – вектор, описывающий ориентацию диполя, Tij – момент силы, вызываемый взаимодействием частиц i и j, Dr – коэффициент вращательной диффузии, S(τ) – случайный некоррелированный поворот частицы, описывающий вращательную броуновскую диффузию. Как и для R(τ), для S(τ) можно записать: Si (τ ) = 0; Коэффициенты трансляционной и Si2 (τ ) = 2 Drτ . вращательной (2.40) диффузии определяются уравнениями Стокса-Эйнштейна: Dt = kT 6πη R 115 , (2.41) Dr = kT , 4πη R 3 (2.42) где R – радиус частицы, η - вязкость среды. В наших расчетах белки моделировались как сферы со встроенными в их центр электрическими диполями. Учитывались два типа взаимодействий между частицами – электростатические и смещенное взаимодействие Леннарда-Джонса, которое не позволяло частицам проникать друг в друга. Потенциал последнего представлялся в виде 1 1 ⎡⎛ σ ⎞12 ⎛ σ ⎞6 1 ⎤ U LJ ( r ) = 4ξ ⎢⎜ ⎟ − ⎜ ⎟ + ⎥ при r ≤ 2 6 σ ; U LJ ( r ) = 0 при r > 2 6 σ , ⎝ r ⎠ 4 ⎥⎦ ⎢⎣⎝ r ⎠ где ξ - коэффициент, регулирующий силу отталкивания (2.43) частиц при соприкосновении, σ – сумма радиусов двух сблизившихся частиц. Мы использовали значение σ=32 Å, что соответствует размеру глобулы миоглобина. Коэффициент ξ был определен путем сравнения концентрационной зависимости Dt, определенной из результатов моделирования и из экспериментов по измерению самодиффузии с помощью ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля [203]. Наилучшее соответствие между моделированием и экспериментом достигается при ξ=1.5 kT. Сила взаимодействия между диполями Fij и момент силы Tij описывались по стандартным формулам [204]: Fij = 3μ 2 rij4 ⎡ ⎛ rij ⎢( cos γ ij − 5cos θi cos θ j ) ⎜⎜ ⎢⎣ ⎝ rij Tij = − μ2 ⎡ ⎢ei × e j − 3cos θ j r ⎢⎣ 3 ij ⎤ ⎞ ⎟⎟ + ei cos θ j + e j cos θ i ⎥ , ⎥⎦ ⎠ ei × rij ⎤ ⎥, rij ⎥⎦ (2.44) (2.45) где μ – дипольный момент, ei – единичный вектор, направленный вдоль направления диполя частицы i, rij и rij – вектор, соединяющий диполи i и j и его скалярная величина, соответственно, θi – угол между векторами rij и ei, γij – угол между векторами ei и ej. 116 Число частиц (диполей) в системе было 256, моделирование проводилось в кубе с периодическими граничными условиями. Размер куба изменялся от 200 до 750 Å, чем регулировалась концентрация. Временнóй шаг моделирования был 5 пикосекунд, длина траектории БД была от 1 до 5 микросекунд. Программа моделирования БД была написана Е.А. Ермаковой, она же проводила анализ полученных траекторий. Результаты моделирования при различных концентрациях и величинах дипольного момента подробно описаны в работе [165]. Основной вывод, который можно сделать из этой работы состоит в том, что межмолекулярные электростатические диполь-дипольные взаимодействия не просто замедляют вращательную диффузию частиц, но и изменяют форму корреляционной функции. На Рис. 2.14 представлена корреляционная функция вращения (определенная для случая диэлектрической спектроскопии, т.е. C(t)=<cosθ(0,t)>, где θ(0,t) – угол между направлениями диполя в моменты времени 0 и t) при двух разных значениях дипольного момента частиц. На Рис. 2.15 и 2.16 представлены результаты биэкспоненциальной аппроксимации C(t), полученной из моделирования БД при различных концентрациях (дипольный момент частиц составлял 660 Дебай). На Рисунок 2.14. Вращательная корреляционная функция, полученная из моделирования БД. Условия моделирования: объемная концентрация 35%, дипольный момент частиц 0 (×) и 480 (●) дебай. Сплошная линия – биэкспоненциальная аппроксимация корреляционной функции (ур-е 2.7) с параметрами τR=7.8 нс, τS=48 нс, S R2 =0.82. 117 Рисунок 2.15. Концентрационная зависимость времен корреляции τR и τS. качественном уровне поведение Рисунок 2.16. Концентрационная зависимость параметра порядка S R2 . параметров τR, τS и S R2 аналогично экспериментальным зависимостям (Рис. 2.11 и 2.12), за исключением уменьшения τR при увеличении концентрации. С одной стороны, эта особенность поведения времени корреляции τR может быть вызвана некорректностью разложения корреляционной функции сложной формы только на две экспоненты. Но с другой стороны, увеличение коэффициента броуновской вращательной диффузии при росте силы межмолекулярного диполь-дипольного электростатического взаимодействия было продемонстрировано в работе [205]. Следует сказать, что явного противоречия между нашими результатами и результатами работы [205] нет, поскольку в последней рассматривался случай только невысоких концентраций, при которых анизотропия броуновского вращения, вызываемая электрическим полем соседних молекул, очень невелика. Напрямую сравнивать результаты моделирования БД с ЯМР или диэлектрическим экспериментом можно конечно же только при условии учета реального расположения зарядов в структуре белка. 2.6. Заключение ко второй главе. Анализ множества независимых экспериментальных данных по ЯМР и диэлектрической спектроскопии показывает, что корреляционная функция броуновского вращения белков в неразбавленных растворах содержит компоненту 118 со временем корреляции, превышающим время корреляции броуновского вращения белка как целого. Относительный вес этой компоненты в большинстве случаев очень мал, так что определить ее параметры можно только с помощью очень скрупулезного количественного анализа данных. Характеристики этой компоненты зависят от концентрации, рН и ионной силы белкового раствора, откуда можно заключить, что причиной усложнения характера броуновского вращения белков являются межмолекулярные электростатические взаимодействия. Предложена качественная модель этих взаимодействий, которая объясняет наблюдаемую в эксперименте форму корреляционной функции броуновского вращения белков. Взаимодействие электрического диполя белка с электрическим полем, создаваемым на данном белке зарядами соседних молекул, вызывает анизотропию броуновского вращения, что приводит к появлению длинной компоненты корреляционной функции вращения. Характерное время спада этой компоненты определяется временем корреляции изменения вектора внешнего электрического поля. Последнее, в свою очередь, зависит от трансляционной диффузии белков и превышает время корреляции обычного броуновского вращения примерно на порядок величины. Хотя для простоты мы описывали эту корреляционную функцию суммой двух экспонент, очевидно, что в реальности она имеет более сложную форму. Упрощенные теоретические оценки показывают, что энергия межмолекулярного электростатического взаимодействия при типичных значениях дипольных моментов белков и концентраций в несколько процентов сравнима по величине с энергией теплового движения. Компьютерное моделирование броуновской динамики частиц, обладающих электрическим дипольным моментом, подтвердило эффект появления длинной компоненты корреляционной функции и показало, что электростатическое взаимодействие в целом приводит к замедлению вращения белков в растворе. Что касается внутренних движений белков в суб-наносекундном диапазоне, то релаксационные данные в растворах позволяют определить их характеристики с очень невысокой точностью. Информация о более медленной внутренней динамике недоступна из этих данных в принципе. 119 ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ВНУТРЕННИХ КОНФОРМАЦИОННЫХ ДВИЖЕНИЙ БЕЛКОВ И ПОЛИПЕПТИДОВ В ТВЕРДОМ СОСТОЯНИИ. 3.1. Расширение частотного диапазона твердотельного ЯМР-эксперимента по релаксации во вращающейся системе координат для случая гетероядерной дипольной релаксации. Как указывалось во Введении, основное преимущество изучения динамики белков в твердом состоянии – возможность детального исследования внутренних движений в микро- и миллисекундном диапазонах, которые наиболее интересны с точки зрения биологической функциональности белков. Время спин-решеточной релаксации во вращающейся системе координат T1ρ является одним из основных экспериментально измеряемых параметров, дающих информацию о движениях в этом временнóм диапазоне. Однако очень часто применение этих экспериментов в твердых органических веществах с небольшим уровнем амплитуды молекулярной динамики ограничено наличием дополнительного, т.н. спин-спинового вклада в релаксацию, обусловленного диполь-дипольным резервуаром протонов. Эта проблема была достаточно подробно проанализирована в классической работе ВандерХарта и Гарровея [30], впоследствии обсуждалась также и в некоторых других работах [206,207]. Термодинамическая иллюстрирующая схема, пути релаксации в эксперименте по измерению T1ρ, представлена на Рис. 3.1 [30]. Релаксация от зеемановского резервуара ядер 13 Рисунок 3.1. Термодинамическая схема релаксационных стоков в эксперименте по измерению спин-решеточной релаксации во вращающейся системе координат. 120 С и 15 N (здесь мы будем говорить только о них) во вращающейся системе координат в решетку идет по механизму собственно спин-решеточной релаксации, скорость которого определяется величиной T1−ρ1 , и одновременно через диполь-дипольный резервуар протонной системы. Этот резервуар очень сильно связан с решеткой, время релаксации T1d во вращающихся со скоростью несколько килогерц образцах составляет всего 10-20 микросекунд [206]. В этом случае экспериментально наблюдаемая скорость релаксации будет равна [30]: -1 -1 T1*-1 ρ = T1ρ + TCH , (3.1) а время кросс-релаксации между двумя резервуарами определяется как -1 TCH = 1 (2) πM CH τD sin 2 θ exp(- γ C B1τ D ) , 2 (3.2) (2) где M CH - второй момент дипольного взаимодействия углеродов с протонами (здесь и в дальнейшем для простоты мы не будем упоминать ядра 15 N, хотя для них этот анализ справедлив так же, как и для углеродов), τD – время корреляции дипольных флуктуаций протонов, γC – гиромагнитное отношение для углеродов, θ - угол между РЧ полем B1 и постоянным внешним магнитным полем B0, который определяется как B tgθ = B1 , B0 − ω γ C (3.3) где ω - круговая частота спин-лок поля B1. Как было показано ВандерХартом и B Гарровеем [30], при недостаточно высоких амплитудах поля B1 сток релаксации B через дипольный протонный резервуар работает эффективнее, чем релаксация -1 напрямую в решетку. Скорость кросс-релаксации TCH не содержит явной информации о молекулярной динамике, и потому этот спин-спиновый вклад в релаксацию существенно ограничивает применение экспериментов по измерению T1ρ для количественного исследования молекулярных движений. Стоит отметить, 121 что такая же проблема существует при измерении не только гетероядерной, но и гомоядерной дипольной релаксации во вращающейся системе координат [208]. Наиболее простой способ подавить этот вклад – просто увеличить амплитуду -1 B1. В этом случае согласно ур-ю (3.2) скорость TCH значительно уменьшится. Но эта B идея практически реализуема далеко не всегда, поскольку это требует большой мощности РЧ поля, что может быть опасно для передатчика спектрометра, измерительной головки и образца. Ранее предлагались способы учесть скорость -1 релаксации TCH с помощью измерения зависимости T1ρ от амплитуды B1 [206] или B уменьшить ее за счет гомоядерного протонного декаплинга [207]. Однако эти способы не решают проблему полностью и применимы далеко не во всех случаях. В своей работе [209] мы предложили два способа, которые позволяют исключить нежелательный спин-спиновый вклад в релаксацию во вращающейся системе координат и в то же время расширить частотный диапазон релаксационных измерений, что существенно увеличивает информативность этого типа экспериментов. Первый способ основан на введении отстройки от резонанса частоты спин-лок поля. Это позволяет значительно увеличить амплитуду B1 без увеличения B мощности передатчика. Второй способ заключается в применении дипольной развязки от протонов (декаплинг) во время действия спин-лок поля на резонансной частоте углеродов. «Декаплинг» разрывает связь между зеемановским резервуаром углеродов и дипольным резервуаром протонов и таким образом исключает спинспиновый вклад в релаксацию. Подробное описание этих методов и их применение к некоторым модельным системам представлены ниже. 3.1.1. Использование отстройки от резонанса частоты поля спин-лока. Хорошо известно, что если частота РЧ импульса отличается от частоты резонанса магнитного ядра, то эффективная амплитуда переменного поля будет выражаться как B1e = B12 + (2πΔν / γ C ) 2 , (3.4) где Δν - разница между частотой резонанса и частотой поля B1. А угол между B1 и B0 B B B определяется выражением (3.3). Именно на этом основана идея повышения 122 амплитуды РЧ поля без увеличения мощности передатчика. Надо сказать, что идея эта довольно старая, для случая гомоядерной релаксации во вращающейся системе координат она была выдвинута еще в середине 60-х [210]. В настоящее время отстройка от резонанса широко применяется в измерениях Т1ρ в растворах белков при изучении процессов химобмена в микросекундной области [39,40]. В то же время, в экспериментах по измерению гетероядерной релаксации в твердых телах отстройка от резонанса частоты поля спин-лока до недавнего времени не применялась. Импульсная последовательность для измерения Т1ρ релаксации с отстройкой от резонанса представлена на Рис. 3.2. Она является модификацией хорошо известной последовательности по измерению времени релаксации Т1, предложенной Деннисом Торчиа [211]. Модификация заключается в импульсе спин-лок поля B1, вставленном B внутрь переменной релаксационной задержки, который имеет частоту, отличную от частоты резонанса. После стандартного кросс-поляризационного возбуждения намагниченности ядер углерода (азота) первый 900 импульс поворачивает вектор намагниченности вдоль оси Z. Сразу после этого частота передатчика переключается Рисунок 3.2. Импульсная последовательность для измерения спинрешеточной релаксации с отстройкой поля спин-лока от частоты резонанса. Затенённые импульсы соответствуют нерезонансному РЧ облучению образца. 123 на частоту поля B1 и начинается адиабатическое нарастание спин-лок импульса за B время τa. После достижения желаемой амплитуды следует вариабельная релаксационная задержка τd, а потом – адиабатическое уменьшение амплитуды спин-лок поля. Второй (уже опять резонансный) 900 импульс кладет вектор намагниченности в плоскость X-Y для регистрации ССИ при условии дипольной развязки от протонов. Фазовый цикл импульсов полностью соответствует циклу, приведенному в [211], который обеспечивает спадание амплитуды сигнала до нуля при очень длинных релаксационных задержках. Последнее очень важно, поскольку освобождает от необходимости измерять амплитуду нулевой линии: очень длинные задержки τd в измерениях T1ρ могут привести к выходу из строя передатчика, головки или перегреву образца. Потеря фазовой когерентности между первым и вторым 900 импульсами, которая возникает вследствие переключения частоты передатчика, не играет никакой роли, поскольку до и после импульса спин-лока намагниченность ориентирована вдоль оси Z. Цель адиабатического нарастания и уменьшения амплитуды поля спин-лока состоит в ориентации вектора намагниченности вдоль вектора эффективного поля спин-лока B1e, а затем обратно вдоль оси Z. Если включать спин-лок резко, то амплитуда сигнала будет пропорциональная cos2θ (сначала от намагниченности остается только проекция вектора, ориентированного вдоль оси Z, на вектор B1e, а B потом его проекция обратно на ось Z), что приведет к уменьшению отношения сигнал/шум. Длительность адиабатического нарастания/спада τa должна удовлетворять условию T1ρ>>τa>>(γB1e)-1. Следует отметить, что в системах с коротким T1ρ выбрать оптимальное значение τa иногда бывает довольно трудно. Поэтому в последних работах вместо адиабатического нарастания/спада поля спинлока мы использовали π/4-импульсы, сдвинутые по фазе на 900 относительно фазы поля спин-лока [212]. Они также ориентируют вектор намагниченности почти вдоль вектора B1e, а затем – вдоль оси Z. B Также следует упомянуть о том, что резкое включение поля спин-лока приводит к появлению затухающих осцилляций, соответствующих спин-спиновой релаксации в наклоненной (т.е. с отстройкой от резонанса) системе координат (Рис. 3.3). Время релаксации T2ρ также может быть оценено из такого спада и использовано для анализа параметров молекулярной динамики. Резкий вариант включения поля спин124 Рисунок 3.3. 15N релаксационные спады в 15N-обогащенном глицине при τa=0 (сплошная линия) и τa=0.2 ms (пунктирная линия). Амплитуда поля B1e, выраженного в частотных единицах, составляет 16.3 кГц, θ=200. лока также очень важен для калибровки амплитуды B1e. Обязательно следует иметь в B виду, что при отстройке от резонансной частоты характеристики РЧ катушки измерительной головки изменяются, и потому амплитуда B1 при увеличении B частотной отстройки уменьшается даже при использовании одинаковой мощности передатчика. Поэтому для точного определения амплитуды B1e и угла θ необходимо B проводить калибровку по частоте биений затухающих колебаний (Рис. 3.3). Отметим также еще одну практическую деталь. Если для ядер достаточно длинное, то для ядер 15 N время релаксации T2ρ 13 С оно намного короче, биения затухают очень быстро и точность определения B1e может быть недостаточно высокой. В этом B случае можно использовать протонный «декаплинг» во время действия спин-лока по углеродам, который позволяет увеличить T2ρ как минимум на порядок величины и провести калибровку безо всяких проблем. Для применения времени спин-решеточной релаксации в наклоненной вращающейся системе координат (далее обозначаемое как T1off ρ ) для анализа параметров молекулярной динамики, необходимо определить T1off как функцию ρ 125 спектральной плотности молекулярного движения. Эта работа была проведена Р.Х. Курбановым. На основе метода получения выражения T1off ρ для случая гомоядерной дипольной релаксации [210] была получена следующая формула [209]: ⎡ 1 1 1 ⎤ ⎥, + sin 2 θ ⎢ Δ − T1 ⎢ T1ρ 2T1 ⎥ ⎣ ⎦ (3.5) 1 2δ = [ J ( ω S − ω I ) + 3 J (ω I ) + 6 J ( ω S + ω I ) ] , T1 15 (3.6a) 1 T1off ρ = где 1 T1Δρ δ= = 2δ [ 2 J (ω1e ) + 3J (ωS )] , 15 γ 2I γ 2S = 2 r6 S ( S + 1) , (3.6b) (3.6c) ω1e – круговая резонансная частота в наклоненной вращающейся системе координат. Ур-е (3.6а) соответствует ур-ю (1.52), все остальные обозначения соответствуют обозначениям ур-я (1.52). Разница между ур-ми (1.52) и (3.6а) заключается в том, что множитель 1/r6 в последнем случае включен в параметр δ, а не в определение спектральной плотности. Это сделано, потому что углеродная и азотная релаксация в белках определяется взаимодействием только с ковалентно связанными протонами, в этом случае межъядерное расстояние является константой, и потому его проще включить в константу дипольного взаимодействия δ. Легко видеть, что в предельных случаях θ=00 и θ=900 формула (3.5) обращается соответственно в стандартные выражения для Т1 (1.52) и T1ρ (1.56). Кроме исключения нежелательного спин-спинового вклада в релаксацию, преимущество применения отстройки от резонанса в экспериментах по измерению T1off ρ состоит также и в том, что она позволяет существенно расширять частотный диапазон экспериментов и измерять дисперсии времен релаксации. В первой главе шла речь о дисперсиях Т1 как об очень информативном средстве изучения молекулярной динамики в различных системах. Но эти эксперименты в твердых телах можно проводить только на протонах (по крайней мере, пока) и только на 126 специально разработанных для этой цели релаксометрах. Применение отстройки от резонанса же позволяет проводить эксперименты по измерению дисперсий T1off ρ на стандартных коммерческих спектрометрах (хотя, конечно же, в гораздо более узком диапазоне частот) и в принципе на любых магнитных ядрах. зависит как от резонансной Из ур-я (3.5) видно, что время релаксации T1off ρ частоты ν1e=ω1e/2π, так и от угла θ. Зависимость от частоты (т.е. дисперсия) представляет гораздо бóльший интерес, поскольку она содержит гораздо больше информации о параметрах молекулярной динамики, чем зависимость от угла θ. Тестирование этого метода проводилась на 15N-обогащенном глицине, на ядрах естественного содержания и низкомолекулярная система, 13 С 15 N. Этот образец удобен тем, что это простая в которой явно не может быть медленных конформационных движений в микросекундном диапазоне времен корреляции. Единственная степень свободы в молекуле глицина – быстрое (в пикосекундном диапазоне) вращение протонов концевой NH3+ группы вокруг оси симметрии этой группы. Таким образом, T1off ρ от частоты ν1e зависеть никак не должно, и тогда спинспиновый вклад в релаксацию, который от частоты зависит очень сильно, должен быть хорошо виден. Именно это мы и наблюдаем на Рис. 3.4, на котором 13 15 представлены дисперсии T1off ρ , измеренные для ядер С и N при различных углах θ и скоростях ВМУ. * при Совпадение экспериментально наблюдаемого времени релаксации T1off ρ высоких ν1e с Т1 подтверждает тот факт, что в данном образце нет медленных молекулярных движений (легко показать, что в противном случае наблюдалась бы разница). Из Рис. 3.4 легко видеть, что для данного образца спин-спиновый вклад в *-1 скорость релаксации T1off ядер ρ 13 С и 15N пренебрежим при частотах ν1e выше 100 кГц и 60 кГц, соответственно. * имеет зависимость от Также любопытно отметить, что профиль дисперсии T1off ρ скорости ВМУ. Это объясняется тем, что время релаксации T1d (Рис. 3.1) зависит от скорости ВМУ [206]: чем ниже скорость, тем длиннее T1d. Конечно, только за счет понижения скорости ВМУ спин-спиновый 127 вклад в релаксацию сделать *-1 Рисунок 3.4. T1off дисперсии, измеренные для альфа-углерода (естественное ρ содержание 13С) и азота (15N обогащение) в глицине при t=200 C, различных углах θ и скоростях ВМУ. Пунктирная линия обозначает скорость спинрешеточной релаксации, которая была измерена отдельно стандартным методом. пренебрежимо малым нельзя: зависимость этого вклада от частоты ν1e намного *-1 сильнее. Также на Рис. 3.4 видны максимумы скорости релаксации T1off ядер 15N, ρ приходящиеся на частоты, кратные частоте ВМУ. Скорее всего, это следствие т.н. эффекта дипольного «рекаплинга», однако для нас он не представляет большого 128 интереса, потому что при таких низких частотах резонанса скорость релаксации *-1 T1off в любом случае не может быть использована для исследования молекулярных ρ движений. 3.1.2. Использование дипольной развязки от протонов во время действия спинлока. Использование протонного «декаплинга» во время спин-лока импульса по углеродам (азотам) приведет к усреднению протон-углеродного дипольного (2) взаимодействия, то есть к усреднению параметра M CH в ур-и (3.2). Это, в свою очередь, «разорвет» связь между зеемановским и дипольным резервуарами (Рис. 3.1), потому что вызовет значительное удлинение времени кросс-релаксации TCH, уре (3.2). Импульсная последовательность для измерения T1ρ с протонным «декаплингом» представлена на Рис. 3.5. Важной деталью является то, что при одновременном действии спин-лок поля по углеродам и протонного «декаплинга» следует избегать соблюдения условия Хартмана-Хана γ H B1H / γ C B1C =1. Если это условие будет соблюдаться, то схема релаксации углеродов будет слишком запутанной и непригодной для анализа молекулярной динамики. Чтобы «развязать» друг от друга зеемановские резервуары углеродов и протонов соотношение Рисунок 3.5. Импульсная последовательность для измерения времени релаксации T1ρ с протонным «декаплингом» во время действия спин-лок импульса по углеродам (азотам). 129 γ H B1H / γ C B1C должно быть порядка 10 или более. (Много меньше единицы это соотношение быть не может, потому что технически невозможно создать поле B1 на B углеродах амплитудой в частотных единицах порядка нескольких сотен килогерц.) Несмотря на кажущуюся простоту идеи включения протонного «декаплинга» во время действия углеродного спин-лок импульса, она до недавнего времени не была реализована. Существует две проблемы, которые затрудняют анализ времен релаксации Т1ρ, измеренные таким способом. Во-первых, при низких полях спинлока частота резонанса νe становится сравнимой с частотой ВМУ, что влияет на скорость релаксации. Теоретически этот случай был рассмотрен в работе [213], где было получено следующее выражение для скорости релаксации во вращающейся системе координат: T1-1 ρ = 4δ ⎛ 1 1 1 1 ⎞ ⎜ J (ω1 + 2ωr ) + J (ω1 + ωr ) + J (ω1 - ωr ) + J (ω1 - 2ωr ) ⎟ , 15 ⎝ 6 3 3 6 ⎠ (3.7а) где ωr – круговая частота ВМУ. При ω1>>ωr ур-е (3.7а) превращается в стандартное выражение (1.56), допуская, что J(ω1)>>J(ωI,ωS,ωI±ωS). Вторая проблема гораздо более серьезная. Протонный «декаплинг» не только разрывает связь между зеемановским и дипольным резервуарами, но также и усредняет взаимодействие 13 C-1H, что делает классический подход к анализу релаксации неприменимым. Стандартный метод получения выражения для времени релаксации с помощью основного уравнения для матрицы плотности применим только тогда, когда неусредненное 13C-1H дипольное взаимодействие, выраженное в частотных единицах, мало по сравнению с частотой резонанса ν1 [214]. В нашем случае это условие не соблюдается, поскольку величина взаимодействия 13 C-1H составляет примерно 20 кГц, а спин-лок поле (см. ниже) – примерно единицы килогерц. Правильное выражение для времени релаксации в этом эксперименте может быть получено на основе подходов, описанных, например, в работах [215,216]. Здесь будет крайне уместно упомянуть о том, что для случая гомоядерного дипольного взаимодействия подобная схема измерения релаксации в низком поле спин-лока при подавлении локального поля была уже реализована А.Е. Мефедом 130 (Институт радиоэлектроники, г. Фрязино) в экспериментах по релаксации в дважды вращающейся системе координат (ДВСК) [217]. В этом очень остроумном методе поле B1e, имеющее амплитуду порядка 100 кГц, ориентировано под магическим B углом по отношению к B0, чем достигается усреднение гомоядерного дипольB дипольного взаимодействия. При этом за счет фазовой модуляции частоты ν1 на образец подается поле B2, которое и определяет ДВСК. По амплитуде B2 меньше B1e B B на один-два порядка, но оно больше усредненной величины гомоядерного дипольдипольного взаимодействия. Усреднение гомоядерного дипольного взаимодействия позволяет понизить резонансную частоту релаксационных измерений до величин ниже неусредненного локального поля и тем самым изучать более низкочастотные молекулярные движения. Между релаксацией в ДВСК и предложенным нами методом измерения релаксации ядер 13С и 15N во вращающейся системе координат с протонным «декаплингом» есть прямая аналогия, различие только в способах усреднения гомо- и гетероядерного дипольных взаимодействий. Метод релаксации в ДВСК на протонах был применен нами для исследования динамики порошкообразного альфа-кристаллина в сухом и увлажненном состояниях [218]. Хотя эксперименты в ДВСК позволили дойти до минимума в температурной зависимости T1ρρ, соответствующего медленному движению в увлажненном белке (см. Рис. 1.9), они не дали никакой принципиально новой информации о динамике белка по сравнению со стандартными измерениями температурных зависимостей Т1 и Т2 протонов [86,87]. Несмотря на свое изящество, метод релаксации в ДВСК в его настоящем виде мало перспективен для исследования биополимеров, потому что он пригоден только для протонов, а значит, он не позволяет получать селективную динамическую информацию. Кроме того, он сопряжен с некоторыми техническими и методическими проблемами, затрудняющими корректный количественный анализ данных. Поэтому излагать подробно результаты нашего исследования динамики альфа-кристаллина с помощью релаксации в ДВСК [218] мы здесь не будем. Для релаксации в ДВСК есть теория, которая определяет время релаксации T1ρρ как функцию от спектральной плотности движения при частотах ν1e и ν2 [216]. Для гетероядерной релаксации с протонным декаплингом такой теории пока еще, увы, нет, поэтому строгий количественный анализ времен релаксации пока невозможен. Несмотря на это, мы предложили феноменологический подход для анализа времени 131 релаксации T1ρ с протонным «декаплингом» (далее это время релаксации будет обозначаться как T1ρd ). Время релаксации T1ρd можно использовать для определения времени корреляции медленных молекулярных движений по профилю температурной зависимости. Для анализа данных мы использовали ур-е (3.7) предполагая, что параметр δ усредняется до некоторой величины протонным «декаплингом» и, таким образом, становится неизвестным подгоночным параметром. В этом случае выражение для T1ρd может быть переписано таким образом: T1-1 ρ = Xa 4δ ⎛ 1 1 1 1 ⎞ ⎜ J (ω1 + 2ωr ) + J (ω1 + ωr ) + J (ω1 - ωr ) + J (ω1 - 2ωr ) ⎟ , 15 ⎝ 6 3 3 6 ⎠ (3.7b) где Xa – неизвестный подгоночный параметр. Для проверки обоснованности и применимости такого допущения были измерены температурные зависимости времени релаксации T1ρd ядер 13 С естественного содержания при нескольких величинах спин-лок полей и скоростей ВМУ в диметилсульфоне (ДМС) (Рис. 3.6). ДМС – небольшая молекула, в которой существует обмен в миллисекундном временнóм диапазоне между двумя равновероятными конформациями. Параметры этого конформационного обмена хорошо изучены, и ДМС часто служит очень удобным образцом для тестовых экспериментов, позволяющих изучать медленную молекулярную динамику. Сплошные линии на Рис. 3.6. были рассчитаны согласно ур-ю (3.7b). Спектральные плотности представлялись в простейшем виде J(ω)=τc/(1+(ωτc)2), а время корреляции τc при различных температурах мы брали из независимого эксперимента по анализу формы линии спектра 13 С (т.н. динамический ЯМР) в образце ДМС с не очень высокой скоростью ВМУ [219]. Единственным подгоночным параметром при расчете кривых на Рис. 3.6 был параметр Xa. Соответствие теоретических расчетов и экспериментальных температурных зависимостей T1ρd выглядит на удивление хорошим, несмотря на тот факт, что время релаксации в минимумах сравнимо по величине со временем корреляции. Следует обратить внимание на то, что при скоростях ВМУ 1 и 3 кГц степень усреднения дипольного взаимодействия различна. Скорее всего, это объясняется тем, что кроме 132 Рисунок 3.6. Температуные зависимости времени релаксации T1ρd ядер углерода в ДМС. Символы соответствуют следующим экспериментальным параметрам: ○ - ωr/2π=1 кГц, ω1/2π=300 Гц; ● - ωr/2π=3 кГц, ω1/2π=300 Гц; △ - ωr/2π=1 кГц, ω1/2π=2.5 кГц. Амплитуда протонного «декаплинга» 70 кГц, резонансная частота для углеродов 50.2 МГц. Сплошные линии рассчитаны по ур-ю (3.7) (см. объяснения в тексте), параметр Xa (ур-е 3.7а) равен 0.15 и 0.33 для скорости ВМУ 1 и 3 кГц. дипольного механизма релаксации здесь работает и механизм релаксации за счет АХС, эффективность которого зависит от скорости ВМУ. Этот вклад не учитывается в ур-и (3.7). В принципе, вклад в скорость релаксации за счет АХС можно вычленить за счет измерения релаксации при различных полях B0 (этот вклад пропорционален B квадрату B0), однако при резонансной частоте для углеродов 100.5 МГц и при не B очень высоких скоростях ВМУ ширина центрального и ssb пиков спектра ДМС становится очень большой из-за неполного усреднения АХС за счет совпадения скорости ВМУ и частоты молекулярного движения [220]. А если ширина линии, будь она вызвана неоднородным распределением химических сдвигов, неполным усреднением АХС или дипольного межъядерного взаимодействия, больше чем 133 величина спин-лок поля, то анализ времени релаксации T1ρd становится некорректным. Из ур-я (3.7) следует, что при ω1≈ωr (или ω1≈2ωr) можно экспериментально исследовать и гораздо более медленные движения, чем в миллисекундной области. Возможно, оно так и есть, но без теории, объясняющей все закономерности этого эксперимента, сделать это практически невозможно. В частности, при частотах спинлок поля, близких к единичной или двойной частоте ВМУ наблюдались сильные осцилляции на спаде намагниченности. Поэтому в дальнейшем при проведении экспериментов по измерению T1ρd мы всегда выбирали амплитуду спин-лок поля, не равную кратной величине частоты ВМУ. Несмотря на остающиеся нерешенные вопросы, связанные с теорией эксперимента по измерению T1ρd , Рис. 3.6 убедительно показывает, что температурные зависимости T1ρd могут быть использованы для определения времен корреляции медленных молекулярных движений (но не их амплитуд!) с помощью феноменологического анализа, описанного выше. 3.2. Сравнение внутренней динамики белков в микрокристаллическом и гидратированном порошкообразном состояниях. 3.2.1. Постановка задачи. Один из ключевых вопросов, встающих при исследовании глобулярных белков в твердом состоянии, который был кратко затронут во Введении, состоит в следующем: насколько влияют межбелковые контакты, которые отсутствуют в естественном для глобулярных белков водном окружении, на структурные и динамические свойства белка? Иначе говоря, насколько правомочно применять информацию, полученную из твердотельных экспериментов, для объяснения молекулярно-биологических свойств белков, которые они проявляют в растворах? Что касается структуры, то уже достаточно давно было показано, что структуры одних и тех же белков, определенных рентгеноструктурным (твердое тело) и ЯМР (растворы) методами, за исключением отдельных специфических случаев одинаковы [14]. Можно ожидать, что и динамика белков в двух состояниях тоже одинакова, но систематических исследований на эту тему до сих пор никто не проводил. 134 Как хорошо известно, одна из основных методических проблем в изучении белков методами твердотельного ЯМР – очень низкое спектральное разрешение. Для того, чтобы получить разрешение, сравнимое с растворами, необходимо применять не только ВМУ и протонный «декаплинг», но также и приготовление белковых образцов в виде микрокристаллов [6,221-224]. Неоднородное микроокружение белковых молекул в аморфном состоянии (коим является лиофилизованный порошок) вызывает неоднородное распределение изотропных химических сдвигов, уширяя линии и ухудшая спектральное разрешение. Хотя, если получение сайтспецифической информации не является целью исследования, эксперименты очень часто проводятся и на порошках (см. 1.10.2). Как упоминалось выше, есть много примеров исследования порошков белков при различных степенях увлажнения, в которых было убедительно показано, что внутренняя динамика критически зависит от уровня гидратации, см. обзоры [106,225]. Часто многие исследователи неявным образом предполагают, что динамика в полностью гидратированном белке в порошкообразном состоянии и белке в кристалле (в кристалле, как известно, белки тоже находятся в гидратированном состоянии) одинакова, хотя сомнения на этот счет тоже существуют [221]. Нам известна только одна экспериментальная работа, в которой внутренняя динамика одного и того же белка сравнивалась в порошкообразном и микрокристаллическом состояниях [115]. В этой работе сравнивалась форма линии метильных дейтеронов трех метионинов ингибитора субтилизина в статическом состоянии (без ВМУ). Анализ показал, что динамика этих метильных дейтеронов в двух состояниях одинакова. Однако этот результат относится только к нескольким локализациям в структуре белка и к ограниченному частотному диапазону молекулярных движений. В работе, о которой пойдет речь ниже, мы предприняли систематическое сравнение внутренней регидратированного динамики лиофильно трех высушенного различных порошка белков и в форме микрокристаллов. 13 Индикаторами молекулярной динамики были времена релаксации Т1 и T1off ρ ядер С естественного содержания. Напомним, что эти параметры чувствительны к молекулярной динамике в нано- и микросекундном диапазонах времен корреляции, соответственно. Широкий разброс химических сдвигов химически неэквивалентных углеродов позволяет проводить анализ динамики для основной и боковых цепей по 135 отдельности. В качестве объектов исследования были выбраны следующие белки: барстар, лизоцим белка куриных яиц и лизоцим фага Т4. Основной целью данной работы было выяснить, насколько критично влияние микроокружения белковой молекулы на параметры внутренней динамики и насколько разные белки специфичны к влиянию этого микроокружения. 3.2.2. Условия эксперимента. Барстар и яичный лизоцим были естественного изотопного содержания, в то время как лизоцим Т4 был селективно обогащен изотопом 15 N по тирозинам. Яичный лизоцим был закуплен в фирме Sigma и использован без дополнительной очистки. 15 N-Tyr лизоцим Т4 и барстар были получены согласно методикам, описанным в [226] и [227], соответственно. Стоит подчеркнуть, что несмотря на одинаковое название, лизоцим белка куриных яиц и лизоцим фага Т4 – белки очень разные [228], поэтому априори ожидать, что они обладают схожими динамическими свойствами нельзя. Как известно, гидратация является очень важным фактором, влияющим на внутреннюю динамику белка, поэтому корректное сравнение динамики может быть произведено, только если в аморфном состоянии (порошок) белок полностью гидратирован, так же, как и в кристаллическом состоянии. В наших экспериментах порошкообразные образцы белков были гидратированы в вакуумном эксикаторе до уровня 0.5 г Н2О на грамм сухого препарата. Уровень гидратации определялся по взвешиванию образца. Этот уровень гидратации обеспечивает как минимум одну мономолекулярную гидратную оболочку вокруг каждой глобулы белка. Дальнейшее увеличение гидратации может привести к возможности проворотов белка как целого, поскольку объем воды может заметно превышать объем пустот между белками, иначе говоря, из состояния увлажненного порошка образец может перейти в состояние очень концентрированного раствора. Для приготовления микрокристаллических образцов, для каждого белка была проведена серия отсеивающих экспериментов с целью определения наиболее оптимальных условий кристаллизации: рН, состав буфера, концентрация белка и температура. В качестве исходных условий мы исходили из протоколов по выращиванию монокристаллов барстара [229], лизоцима Т4 [230] и куриного лизоцима [231] для рентгеноструктурного анализа. Качество микрокристаллов 136 Рисунок 3.7. Фотография микрокристаллов яичного лизоцима. контролировалось с помощью оптической микроскопии. В качестве примера на Рис. 3.7 представлены микрокристаллы яичного лизоцима. Вся работа по выращиванию, очистке белков и приготовлению микрокристаллов была выполнена Ю.В. Гоголевым ЯМР-эксперименты были проведены на спектрометре Varian INOVA 400 с резонансной частотой для ядер 13 С 100.5 МГц. Кроме того, спектры образцов барстара для сравнения были записаны на спектрометре Bruker Avance 750 с резонансной частотой для углеродов 188.5 МГц. Анализировались релаксационные спады только для алифатических углеродов. Спин-решеточная релаксация измерялась стандартным методом Торчиа [211], а релаксация в наклоненной вращающейся системе координат ( T1off ρ ) измерялась по методу, описанному в части 3.1.1. Для всех образцов эффективная резонансная частота ν1e и угол θ между B1e и B B0 были одинаковыми и равными соответственно 108-112 кГц и 190±0.50. Разброс в B этих значениях определяется разбросом химических сдвигов различных алифатических углеродов, который для данной резонансной частоты составлял примерно 5 кГц. Частота ВМУ составляла 3 или 4 кГц, все эксперименты были проведены при температуре 80±20 C. 3.2.3. Результаты и обсуждение. На Рис. 3.8-3.10 представляют спектры трех белков в аморфном и микрокристаллическом состояниях. Спектры барстара были записаны при двух 137 Рисунок 3.8. Спектры барстара в двух состояниях при двух резонансных частотах (степень увлажнения порошка 0.5). Отрезки A-D обозначают участки спектра, по которым строились релаксационные спады интегральных интенсивностей данных участков. Узкие линии при 71 и 65 м.д. в спектрах микрокристаллов относятся к углеродам полиэтиленгликоля, который был составной частью кристаллизационного раствора. Рисунок 3.9. Спектры лизоцима Т4, аморфный порошкообразный образец был измерен при трех уровнях увлажнения. Резонансная частота для углеродов – 100.5 МГц. Отрезки A-D имеют то же значение, что и на Рис. 3.8. резонансных частотах, а спектры лизоцима Т4 в порошкообразном состоянии – при трех уровнях увлажнения (h=0, 0.23 и 0.5). Хорошо видно, что в микрокристаллическом состоянии спектральное разрешение для всех трех белков лучше, чем в порошкообразном. Тем не менее, эта разница очень мала по сравнению с наблюдениями, сделанными Мартином и Зилмом 138 Рисунок 3.10. Спектры яичного лизоцима. Резонансная частота 100.5 МГц, степень увлажнения порошка – 0.5. Отрезки A-D имеют то же значение, что и на Рис. 3.8. [232] и Паули с соавт. [233]. В этих работах наблюдалась очень сильная визуальная разница между спектрами 13 С естественного содержания различных белков в форме лиофильно высушенного порошка и микрокристаллов. В обеих этих работах не было приведено уровня увлажнения порошкообразных образцов, однако из описания процедуры приготовления ясно, что степень увлажнения была не очень высокой. Мы уверены в том, что эта разница в спектральном разрешении была обусловлена в первую очередь не разницей между кристаллической и аморфной фазой, а уровнем гидратации. Сильное влияние гидратации на форму ЯМР-спектра белков уже было многократно отмечено в литературе, см. например [87,95,112,234]. На примере лизоцима Т4 мы здесь продемонстрировали это еще раз, см. Рис. 3.9. В то же время, очень интересно отметить, что изменение гидратации имеет не очень большое влияние на форму спектра ядер 13 С естественного содержания такого белка, как бычий сывороточный альбумин [113]. На основании этого факта авторы сделали вывод о том, что лизоцим и БСА по-разному ведут себя при увеличении гидратации. А по нашему мнению, наиболее близкой к истине причиной, объясняющей разную гидратационную зависимость формы спектра БСА и лизоцима, является число линий в спектре. БСА примерно в 4 раза больше лизоцима, значит число линий в спектре тоже намного больше. Даже будучи узкими, эти линии перекрывают друг друга и 139 потому спектральное разрешение с увеличением гидратации улучшается ненамного. Большое число линий в спектре – основная причина того, что разница между спектрами микрокристаллического (даже 15 Рисунок 3.11. Спектры N селективно обогащенного лизоцима Т4 в микрокристаллическом и порошкообразном состояниях. и сильно гидратированного) порошкообразного образцов совсем небольшая, Рис. 3.83.10. С другой стороны, если число линий невелико и эффект перекрывания не столь значителен, разница между спектрами белка в микрокристаллическом и аморфном состояниях может быть очень даже впечатляюща. Это как раз показывает Рис. 3.11, на котором представлены спектры 15N селективно 15N-Tyr-обогащенного лизоцима Т4 в двух состояниях (всего в лизоциме Т4 шесть тирозинов). Рис. 3.11 снимает все сомнения в качестве микрокристаллов и наглядно демонстрирует, что одномерная ЯМР-спектроскопия ядер 13С естественного содержания в белках – не очень подходящий инструмент для оценки качества белковых кристаллов. Для построения релаксационных спадов в спектрах (Рис. 3.8-3.10) были определены четыре спектральные полосы A-D, по которым определялись интегральные интенсивности (площадь участка спектра) при различных релаксационных задержках. Эти релаксационные спады представлены на Рис. 3.12 и 3.13. Полосу А составляют в основном метиновые (СН) альфа-углероды основной цепи, полосу B - метиленовые (СН2) углероды боковых цепей, полосы C и D – метильные (СН3) углероды с некоторой долей метиленовых углеродов в С полосе. Благодаря такому разбросу химических сдвигов мы можем характеризовать динамику основной и боковых цепей отдельно друг от друга. Есть несколько исключений, которые не подпадают под соотнесение полос А-D, например, углероды основной цепи глициновых остатков находятся в полосе B, а не А, но 140 число таких исключений невелико, и самое главное, они в целом абсолютно идентичны для порошкообразного и микрокристаллического состояний, потому сравнение релаксационных спадов двух совершенно Напомним, прямое образцов корректно. что группы метильные подвержены быстрому (в пикосекундном диапазоне) вращению вокруг оси симметрии метильной группы, поэтому спады спинрешеточной релаксации полос C и D очень быстрые во всех случаях. Все релаксационные спады имеют мультиэкпоненциальную форму, Рисунок 3.12. Релаксационные спады Т1 спектральных полос A-D. Закрашенные и незакрашенные значки обозначают микрокристаллические и аморфные образцы, соответственно. Обозначения символов: ■ □ – яичный лизоцим (верхние кривые) ▲ △ – лизоцим Т4 (средние кривые) ● ○ – барстар (нижние кривые) следствием что является неоднородного распределения динамических параметров углеродов, линии которых входят в ту или иную спектральную полосу. Количественно определять времена релаксации Т1 и T1off ρ из спадов на Рис. 3.12 и 3.13 особого смысла нет, поскольку в этих экспериментах не проводилось подробных температурно-частотных зависимостей времен релаксации, и корректное определение динамических 141 параметров в этом случае невозможно. Оценить качественную разницу динамического состояния белка в двух состояниях просто по можно визуальному сравнению формы релаксационных спадов. Такое визуальное сравнение ясно показывает, что динамика как основной, так и боковых цепей в кристаллическом и аморфном состояниях одинакова. Это справедливо для трех всех белков и для всего частотного диапазона молекулярных движений, к чувствительны релаксации Т1 и Рисунок 3.13. Релаксационные спады T1off ρ четырех спектральных полос. Обозначения символов аналогичны Рис. 3.12. основной результат которому времена T1off ρ . Это данного исследования. Из этого можно сделать вывод, что либо воздействие белок-белковых взаимодействий на внутреннюю конформационную динамику в аморфном и кристаллическом состояниях одинаково, либо это воздействие незначительно. Последнее нам представляется гораздо более вероятным и правдоподобным, поскольку геометрия межбелковых контактов и тип взаимодействия между соседними белками в этих двух типах образцов неодинаковы. Таким образом, полученный результат является косвенным свидетельством того, что внутренняя динамика глобулярного белка в твердом состоянии и в растворе тоже одинакова, конечно, при условии, что в твердом состоянии белок полностью гидратирован. Справедливости ради необходимо заметить, что проведенные 142 эксперименты по своей природе являются интегральными, и нельзя исключить, что в определенных ограниченных участках структуры белка межбелковые взаимодействия могут приводить к каким-то специфическим изменениям в динамике, но, в то же время, очевидно, что такие изменения, если и существуют, не носят глобального характера. По нашему убеждению, данный результат хотя бы частично снимает сомнения по поводу биологической значимости изучения белков в твердом состоянии. Разница в релаксационных спадах между разными белками – другой интересный результат данной работы. Из Рис. 3.12 видно, что спады Т1 углеродов боковых цепей (полосы В и С) в барстаре быстрее, чем в курином лизоциме и лизоциме Т4. Более заметную разницу можно наблюдать в спадах T1off ρ : углероды основной цепи (полоса А) барстара релаксируют быстрее, чем углероды основной цепи двух остальных белков. Из спадов T1off ρ (Рис. 3.13) также видно, что боковые цепи (полосы В и С) барстара тоже наиболее подвижны в микросекундной области из всех трех белков, а боковые цепи яичного лизоцима – наиболее жесткие. Такая разница в динамическом поведении различных белков особого удивления не вызывает, поскольку каждый белок имеет свою специфическую структуру и специфическую систему взаимодействий, которая эту структуру стабилизирует. Однако этот результат для нас особенно интересен в связи с обменными экспериментами на барстаре, о которых речь пойдет ниже. Одномерные обменные эксперименты на ядрах 15 N отчетливо детектируют низкочастотные конформационные движения основной цепи барстара [124,235]. Но с другой стороны, аналогичные эксперименты, проведенные на убиквитине [127] и колицине [129], такого движения основной цепи белка не обнаруживают. С одной стороны, причиной различных результатов в этих работах могут быть чисто методические проблемы обменных экспериментов: в отличие от релаксации они плохо детектируют малоамплитудные движения, см. 1.10.3 и обзор [225]. С другой стороны, полученные нами результаты говорят о том, что разница между барстаром с одной стороны и убиквитином и колицином с другой – объясняется, скорее всего, спецификой этих белков, а не методическими артефактами. Барстар – очень подвижный белок, что объясняется его электростатическими свойствами, обеспечивающими с одной стороны высокое сродство с барназой, а с другой – 143 нестабильность структуры из-за кулоновского отталкивания одноименно заряженных аминокислотных остатков активного центра. Это очевидно и объясняет разницу в динамическом поведении барстара по сравнению с другими белками. 3.3. Исследование динамики биополимеров с помощью ЯМР-релаксации на ядрах 1Н и 13С естественного содержания. 3.3.1. Полилизин – релаксация на ядрах 13С естественного содержания. Приведенные выше результаты по изучению внутренней подвижности белков в микрокристаллическом и аморфном состояниях являются типичным примером качественно-сравнительного подхода к изучению динамики. Поскольку переход от экпериментально измеряемых параметров к параметрам, характеризующим динамику, зачастую неоднозначен, исследователи при анализе оперируют именно экспериментальными параметрами (в данном случае – релаксационными спадами), сравнивая их для различных образцов или различных условий. Такое сравнение может привести к важным выводам, но оно, тем не менее, не позволяет провести никакой количественной характеристики молекулярной подвижности. В этой части работы на примере исследования динамики модельной системы, полилизина, будут продемонстрированы возможности подхода, который позволяет количественно определить параметры молекулярной динамики, привлекая минимальный набор априорных допущений. Этого можно достичь за счет проведения целого набора различных ЯМР-экспериментов на одном и том же образце и, что очень важно, одновременного количественного анализа всех данных в рамках единого математического формализма. Полилизин – очень удобная модельная система для исследования динамики биополимеров. В стандартном твердотельном спектре с ВМУ и протонным «декаплингом» линии всех пяти углеродов прекрасно разрешены. Это позволяет получить селективную информацию о динамике каждого углерода без дорогой и долгой процедуры селективного изотопного обогащения. Известно, что преимущественный тип вторичной структуры полилизина в твердом состоянии зависит от гидратации [236]: при увеличении гидратации в лиофильно высушенном препарате происходит переход от неупорядоченной конформации к бета-слою (при гидратации ~20% по весу) и затем к альфа-спирали (при гидратации ~40%). 144 Наиболее детальное изучение динамики твердого полилизина методом ЯМР до наших работ [237,238] было проведено Свансоном и Брайантом [94], которые измеряли ширины линий, времена кросс-поляризации и времена релаксации T1 и T1ρ для различных линий спектра 13С при уровнях гидратации от 0 до 50%. Эти данные говорят о том, что основная цепь полилизина в бета-конформации намного более жесткая по сравнению с боковыми цепями, и что подвижность боковой цепи увеличивается по мере увеличения гидратации и увеличения расстояния от основной цепи. Но авторы признают, что их данные не позволяют сделать никаких количественных оценок, поэтому ни амплитуды, ни частоты молекулярных движений не были оценены даже приблизительно. Главный результат этой работы – было продемонстрировано, что полилизин обладает молекулярной подвижностью в широком частотном диапазоне, и что параметры молекулярных движений сильно зависят от гидратации. 3.3.1.1. Условия эксперимента и методы анализа В наших исследованиях набор экспериментов был значительно шире, чем в работе [94], а именно измерялись следующие релаксационные параметры ядер 13С: 1) Измерения времени релаксации Т1 при резонансных частотах 50.3 и 100.5 МГц (для углеродов); 2) Измерения времени релаксации T1off ρ при частотах спин-лок поля 115-125 и 205-225 кГц; 3) Измерение времени релаксации T1ρd при частоте спин-лок поля 5.5 кГц. Все релаксационные измерения проводились в диапазоне температур от 0 до 500С. Условия эксперимента: частота поля протонного «декаплинга» 70-80 кГц, контактное время кросс-поляризации 0.5-1.5 мс, длительность 900-импульсов 4-5 и 34 мкс для углеродов и протонов, соответственно, время записи ССИ 12-20 мс. Скорость ВМУ была 1.5 кГц для экспериментов по измерению T1ρd и 4 кГц для всех остальных экспериментов. Точность температурной стабилизации ±10 C. Эксперименты проводились на образцах с уровнем гидратации h=0, 0.05, 0.12 и 0.2 г Н2О на г сухого полилизина. Увлажнение проводилось в вакуумном эксикаторе. 145 Количественный анализ данных корреляционных функций с Нормализованная корреляционная проводился использованием функция в рамках безмодельного внутреннего формализма подхода. движения (т.е. реориентации межъядерных векторов) записывалась в виде ∞ ⎛ t⎞ ⎛ τ ⎞ ⎜− ⎟ C (t ) = S + (1 − S ) ∫ ρ ⎜ ⎟ e⎝ τ ⎠ d τ , τ 0 ⎝ 0⎠ 2 2 (3.8) ⎛ τ ⎞ ⎟ ⎝ τ0 ⎠ где S2 – параметр порядка, смысл которого был описан в предыдущих главах, ρ ⎜ - функция распределения времен корреляции молекулярного движения, τ0 – среднее время корреляции. Важно отметить, что при одинаковом математическом описании может быть два различных физических описания распределения времен корреляции. В одном случае распределение может быть следствием сложного характера молекулярного движения, которое приводит к сложной форме корреляционной функции. В другом случае распределение может отражать физическую гетерогенность образца, т.е. разные времена корреляции в разных молекулах. Эти два типа распределения называются однородным и неоднородным, соответственно. Безусловно, следует иметь в виду, что в реальности очень часто наблюдается одновременно и тот, и другой тип распределения. Как и в случае с анализом релаксационных данных в растворах (см. Главу 2), в ⎛ τ ⎞ ⎟ мы использовали распределение Фуосса-Кирквуда (ур-я 2.7 ⎝ τ0 ⎠ качестве функции ρ ⎜ и 2.9). Спектральная плотность движения для этого типа корреляционной функции записывается так: β β (ωτ 0 ) . J (ω ) = (1 − S 2 ) ⋅ ⋅ 2β ω 1+ (ωτ 0 ) (3.9) Если межъядерный вектор одновременно участвует в двух независимых типах движений со значительно различающимися временами спектральную плотность можно записать в следующем виде 146 корреляции, тогда β2 β1 (ωτ 2 ) (ωτ1 ) β β , J (ω ) = (1 − S22 ) ⋅ 2 ⋅ + S22 (1 − S12 ) ⋅ 1 ⋅ 2 β 2β ω 1+ ω 1+ (ωτ 2 ) (ωτ1 ) 2 (3.10) 1 здесь предполагается, что τ1>>τ2. В нашем анализе мы допускали, что параметры S2 и β не зависят от температуры, а температурная зависимость времен корреляции определялась законом Аррениуса, аналогично ур-ям (2.14-2.16). Строго говоря, амплитуда движения от температуры зависеть должна, но исследования температурной зависимости параметра порядка для ядер азота и карбонильных углеродов основной цепи белка показывают, что параметр порядка изменяется всего лишь примерно на 5% при изменении температуры в пределах 30 градусов [239,240], соответственно, это допущение выглядит вполне оправданным. Второй момент дипольного взаимодействия 1Н-13С (параметр 4δ/3, см. ур-е 3.6) полагался равным 2.12⋅1010 с-2 на одну ковалентную связь Н-С (эта величина может быть рассчитана из известной длины связи Н-С, которая составляет 1.09 Å). Таким образом, каждый тип внутреннего движения количественно характеризуется набором четырех микродинамических параметров: параметр порядка, время корреляции, параметр ширины распределения времен корреляции и энергия активации. Соответственно, времена релаксации T1, T1off ρ и T1dρ определяются 4Nm микродинамических параметров, не считая подгоночного параметра Xa (ур-е 3.7b), где Nm – число независимых молекулярных движений, в которых участвует межъядерный вектор. Конкретная функциональная зависимость времен релаксации от микродинамических параметров определяется математическим формализмом, представленным выше. Эти параметры определялись из компьютерной минимизации суммы квадратов отклонения (подгонки) RMSD = 1 N 2 i i ⎛ Texp ⎞ - Tsim ⎟ , ⎜⎜ ∑ i Texp ⎠⎟ i =1 ⎝ N (3.11) где N – число экспериментально измеренных времен релаксации, Texp и Tsim – значения экспериментальных и рассчитанных по микродинамическим параметрам времен релаксации. Минимизация проводилась по алгоритму Монте-Карло, из минимизационной траектории определялись 147 как средние величины микродинамических параметров, которые обеспечивали наилучшее качество подгонки, так и среднеквадратичные отклонения от средних значений. Спектры алифатических углеродов полилизина при различных уровнях гидратации представлены на Рис. 3.14. Очень хорошо видно, что изначальный лиофилизованный препарат (от фирмы Sigma) находится в неупорядоченной конформации, что приводит к несимметричным широким пикам и невозможности разрешить линии от всех углеродов. При увлажнении полилизин переходит в бетаслой [236,241], что очень хорошо отражается на спектре. Очень важно, что при последующем высушивании полилизин не переходит обратно в неупорядоченную конформацию, а остается в конформации бета-слоя (Рис. 3.14), что дает возможность исследовать образец при различных уровнях гидратации, но обладающий одной и Рисунок 3.14. ЯМР спектры алифатических ядер 13С естественного содержания полилизина (с ВМУ и «декаплингом») в процессе последовательных шагов гидратации-высушивания-регидратации: "а" изначальный сухой лиофилизованный препарат, "b" гидратированный до уровня 0.2 г Н2О на грамм сухого полилизина, "с" высушенный под вакуумом в течение 24 ч при комнатной температуре, "d" и "e" гидратированные до уровней 0.05 и 0.12 г воды на грамм сухого полилизина, соответственно. 148 той же вторичной структурой. Спектры на Рис. 3.14 идентичны спектрам, представленным Свансоном и Брайантом [94]. Примеры релаксационных спадов представлены на Рис. 3.15. Практически всегда они имели неэкспоненциальную форму, что объясняется неоднородностью микроокружений, т.е. неоднородным распределением микродинамических параметров (см. выше). Для того, чтобы образцы с различными распределениями можно было сопоставлять друг с другом, из каждого релаксационного спада определялось только одно среднее время релаксации по начальному участку спада. Для этого спады разлагались на сумму двух экспоненциальных компонент A(t) = Pa exp(- t t ) + Pb exp(- ) , Ta Tb (3.12) а затем среднее время релаксации определялось по стандартной формуле T1,1ρ −1 = 1 ⎛ Pa Pb ⎞ ⎜ + ⎟. Pa + Pb ⎝ Ta Tb ⎠ (3.13) Преимущество такого метода анализа состоит в том, что при заметной неоднозначности разложения спада на две компоненты среднее время релаксации Рисунок 3.15. Типичные примеры релаксационных спадов для различных углеродов при различных уровнях гиратации. Экспериментальные условия указаны на рисунке. 149 (3.13) определяется с минимальной ошибкой. Типичные примеры наборов температурных зависимостей времен релаксации представлены на Рис. 3.16. Времена релаксации T1off ρ для альфа-углерода при ν1e=205225 кГц не могли быть определены с достаточной точностью, поскольку они были слишком длинными. Для их измерения необходимо было использовать очень длинные спин-лок импульсы, что было опасно для усилителя и измерительной головки спектрометра. Всего из экспериментов нами было получено 20 наборов времен релаксации: пять углеродов при четырех уровнях гидратации. (Времена релаксации для карбонильного углерода были очень длинными и потому они экспериментально не определялись.) Все эти двадцать наборов анализировались с помощью подхода, описанного выше. Рисунок 3.16. Примеры температурных зависимостей для различных углеродов и уровней гидратации. Сплошные линии - подгоночные кривые, построенные по параметрам, представленным на Рис. 3.17 и 3.18. Пунктирные линии на среднем графике – подгоночные кривые, построенные при допущении единственного типа движения. 3.3.1.2. Динамика боковых цепей Прежде всего, следует определиться с вопросом – сколько типов независимых движений необходимо для того, чтобы адекватно (как с точки зрения качества описания экспериментальных данных, так и с точки зрения физической интерпретации результатов) описать экспериментальные времена релаксации. Как 150 показал анализ данных, это зависит от уровня гидратации. Данные при уровнях гидратации h=0.12 и 0.2 могли быть хорошо описаны с помощью только одного типа молекулярного движения, т.е. когда спектральная плотность движения записывалась в виде ур-я (3.9). Но обработка данных при уровнях гидратации h=0 и 0.05 приводила к неадекватным результатам. Во-первых, качество подгонки было достаточно низким, пример представлен на среднем графике Рис. 3.16. Во-вторых, энергия активации движения в этом случае имела значение всего 2-6 кДж/моль, что неправдоподобно мало по сравнению с типичными величинами энергий активации молекулярных движений в макромолекулярных системах. Поэтому данные при двух низких уровнях гидратации обрабатывались при допущении двух типов движений, т.е. спектральная плотность представлялась в виде ур-я (3.10). Параметр Xa, входящий в выражение для времени релаксации T1dρ (ур-е 3.7b) имел величину в пределах от 0.05 до 0.2. Однако мы не будем анализировать значения этого параметра, поскольку он имеет чисто феноменологическую природу. Значения всех остальных микродинамических параметров углеродов боковой цепи полилизина, полученных из подгонки наборов времен релаксации, представлены на Рис. 3.17. Данные, представленные на Рис. 3.17, говорят о том, что в сухом полилизине боковые цепи участвуют в двух типах низкоамплитудных молекулярных движений, со временами корреляции 10-9 с и 10-4 с. Величины этих времен корреляции, а также их энергии активации характерны для так называемых γ (быстрое движение) и β (медленное движение) процессов, которые хорошо известны из физики синтетических полимеров [242]. Быстрый процесс – локальные движения небольшой кинетической единицы полимерной цепи в пределах стерических ограничений, образованных геометрией химических связей и Ван-дер-Ваальсовыми взаимодействиями с соседними атомами. Это движение связано с изменением очень небольшого числа степеней свободы (двугранных углов) локального участка полимера. Медленный процесс – редкие конформационные переходы более объемных структурных единиц, связанные с коррелированными высокоамплитудными изменениями бóльшего числа степеней свободы. Такая картина динамики может наблюдаться только в плотно упакованных полимерных системах. Следует сказать, что наличие двух различных типов движений с разными 151 Рисунок 3.17. Гидратационные зависимости параметра порядка (слева вверху), времен корреляции (справа вверху), параметра ширины распределения (слева внизу) и энергии активации (справа внизу) для четырех углеродов боковой цепи полилизина. Закрашенные и незакрашенные значки при уровнях гидратации 0 и 0.05 соответствуют параметрам быстрого и медленного движений, соответственно. временами корреляции в белках также следует и из анализа данных по протонной релаксации [85,86]. Отдельного комментария заслуживают абсолютные величины энергии активации медленного движения. Они являются слишком высокими, высота активационного барьера 100-150 кДж/моль не может соответствовать времени корреляции этого движения в микросекундном диапазоне при комнатной температуре (Рис. 3.17). Но следует отметить, что такие высокие значения энергии активации часто наблюдаются для динамических процессов и в синтетических полимерах [242]. Это видимое противоречие объясняется тем, что полученная из подгонки энергия активации не является высотой активационного барьера, она только определяет температурную зависимость времени корреляции медленного движения. Активационный барьер медленного движения определяется стерическими контактами соседних элементов структуры полипептида, то есть его плотностью 152 упаковки. В то же время, из-за теплового движения форма потенциальной ямы вокруг каждой кинетической единицы (в данном случае, боковой цепи) является величиной непостоянной. Изменяя температуру, мы, естественно, изменяем характер подвижности формы этой потенциальной ямы. Это, в свою очередь, приводит к тому, что энергия активации движения начинает зависеть от температуры. Тогда зависимость времени корреляции от температуры в аррениусовских координатах (lg(τ) – 1/T) не будет являться прямой линией. Хотя закон Аррениуса все равно можно применять для описания температурной зависимости времени корреляции в относительно узком температурном диапазоне, но при этом следует иметь в виду, что энергия активации при этом не будет иметь смысл активационного барьера. Эта проблема была рассмотрена А. Слуцкером с соавторами [243,244]. В этой работе, в частности, показано, что реальная энергия активации (т.е. активационный барьер) может быть в несколько раз меньше «кажущейся» энергии активации, определенной по наклону температурной зависимости времени корреляции. (Хотя справедливости ради следует сказать, что при условии непостоянства формы потенциального профиля, возникающего из-за молекулярной подвижности элементов структуры полимера, понятие активационного барьера выглядит не столь прозрачным и однозначным, как, например, в случае активационных барьеров вращения вокруг химических связей.) Реальная энергия активации, оцененная по соотношению времени корреляции при комнатной температуре и при бесконечно высокой температуре (10-12 – 10-13 с) [243,244], имеет величину в пределах 35-50 кДж/моль (для сухого полипептида). Таким образом, это противоречие может быть объяснено. Заметим, что данный комментарий относится к медленному движению не только боковых цепей полилизина, но и его основной цепи, и белков, результаты по которым будут представлены ниже. Существенные изменения в динамике происходят при увеличении гидратации. Во-первых, существенно возрастают амплитуды обоих движений. Это легко объяснимо высокой гидрофильностью полилизина – молекулы воды легко проникают в промежутки между боковыми цепями и действуют как «пластификаторы» [245], способствуя увеличению подвижности боковых цепей. Наиболее сильное влияние гидратация оказывает на время корреляции медленного движения. Увеличение h с 0 до 0.05 приводит к укорочению этого времени 153 корреляции примерно на два порядка величины, а при более высоких уровнях гидратации времена корреляции двух движений становятся неотличимыми друг от друга и потому все данные могут быть описаны только одним типом движения. Таким образом, увеличение уровня гидратации полилизина от нуля до чуть более десяти процентов вызывает укорочение времени корреляции медленного движения боковых цепей примерно на пять порядков величины! Хотя этот результат может показаться неправдоподобным, но значительное укорочение времени корреляции медленного движения при увеличении гидратации мы также наблюдали до того и по данным протонных экспериментов [87,218]. Увеличение уровня гидратации от 0.12 до 0.2 сопровождается только незначительным укорочением времени корреляции молекулярного движения. Более того, изучение динамики боковых цепей полилизина в растворах показывает, что время корреляции их движения также находится в наносекундном диапазоне [246,247]. Отсюда следует, что наиболее значимые изменения в динамике боковых цепей полилизина происходят при изменении уровня гидратации от нуля до 0.12. Заметим, что уровень h=0.12 соответствует примерно одной молекуле воды на один лизиновый остаток в полипептиде. В отличие от медленного движения, время корреляции быстрого движения не проявляет практически никакой гидратационной зависимости. Такую разницу в поведении объяснить несложно: время корреляции быстрого движения зависит в первом приближении в основном только от температуры и размера кинетической единицы, которая участвует в этом движении (одна – две химические группы). Само собой, эти параметры от гидратации не зависят. Что же касается медленного движения, то его скорость определяется, прежде всего, высотой энергетических барьеров между различными конформационными подсостояниями, а эта высота как раз очень сильно зависит от присутствия молекул воды в микроокружении боковой цепи. Как мы увидим ниже, основная цепь полилизина участвует в молекулярном движении со временем корреляции в микросекундном диапазоне при всех уровнях гидратации. Поскольку боковые цепи ковалентно связаны с полипептидным остовом, они тоже должны участвовать в этом медленном движении даже при высоких уровнях гидратации. Но его амплитуда настолько мала, что это движение 154 невозможно детектировать на фоне высокоамплитудного движения в наносекундном диапазоне. Поэтому при h=0.12 и 0.2 из релаксационных данных можно получить достоверную информацию только о быстром движении. В предшествующих исследованиях полилизина [94,246] был сделан вывод о том, что подвижность боковой цепи увеличивается по мере удаления от остова. Наши данные (Рис. 3.17) показывают, что это справедливо только для быстрого движения. Что касается динамики в микросекундной области, то тут самой подвижной частью является середина боковой цепи. Природа этого движения будет рассмотрена ниже на основе совместного анализа данных по углеродной и протонной релаксации. 3.3.1.3. Динамика основной цепи В отличие от боковых цепей, для адекватного описания времен релаксации альфа-углерода необходимо допущение о двух типах движений при всех уровнях гидратации. Результаты подгонки (микродинамические параметры) для альфауглерода представлены на Рис. 3.18. Из сравнения Рис. 3.17 и 3.18 видно, что Рисунок 3.18. Микродинамические параметры, полученные из обработки релаксационных данных для альфа-углерода полилизина. Закрашенные и незакрашенные символы обозначают параметры быстрого и медленного движений, соответственно. 155 динамика основной и боковых цепей в сухом образце имеет очень близкие параметры. Величина параметра порядка быстрого движения (~0.95-0.96) очень хорошо соответствует типичной величине этого параметра, которая методами ЯМРрелаксации определяется для движения основной цепи белков в растворах [35,58] и в твердом состоянии [123]. Эта величина соответствует угловой амплитуде колебаний межъядерного вектора примерно в 70. Имеющиеся данные не позволяют сделать однозначных выводов о природе медленного движения основной цепи. Но, скорее всего, это движение может быть связано с низкоамплитудными колебаниями участков бета-слоев полипептида как целого. Некоторое увеличение амплитуды этого движения – наиболее заметное изменение в динамике, которое вызывается увеличением гидратации полилизина. Все остальные параметры динамики основной цепи от гидратации почти не зависят. 3.3.1.4. Выводы. Как основная, так и боковые цепи полилизина участвуют в двух типах молекулярных движений. Быстрое движение имеет время корреляции порядка нескольких наносекунд, относительно небольшую энергию активации и узкое распределение времен корреляции. Это движение соответствует колебаниям очень небольших фрагментов полипептидной цепи (скорее всего, 1-2 химические группы) внутри одногй потенциальной ямы, границы которой формируются взаимодействиями с соседними участками цепи. Медленное движение имеет более высокую энергию активации и более широкое распределение времен корреляции. Это движение является коррелированными высокоамплитудными перескоками между различными конформационными минимумами. Время корреляции этого движения в сухом полипептиде имеет величину порядка 10-4 с как для основной, так и для боковых цепей. Но гидратационная зависимость времени корреляции этого движения для основной и боковых цепей совершенно различна. Время корреляции медленного движения основной цепи практически не изменяется во всем диапазоне исследованных уровней гидратации, в то время как время корреляции медленного движения боковых цепей укорачивается примерно на 5 порядков величины. При уровнях гидратации больше 10% быстрое и медленное движение экспериментально друг от друга неразличимы. Амплитуда медленного движения основной цепи 156 увеличивается с ростом гидратации, но это увеличение незначительное, и даже при максимальном уровне гидратации амплитуда остается достаточно низкой. Амплитуда быстрого движения основной цепи не проявляет практически никакой зависимости от гидратации. Все изменения в динамике полилизина, происходящие при увеличении уровня гидратации, не могут быть отнесены за счет гидратационно-зависимых конформационных переходов: данные по ИК-спектроскопии [237] (эксперименты проведены Д.А. Файзуллиным) показывают, что при всех исследованных уровнях гидратации полилизин не меняет своей вторичной структуры, оставаясь преимущественно в конформации бета-слоя. Исходя из этого, объяснить различную гидратационную зависимость динамики основной и боковых цепей совсем не трудно. При всех уровнях гидратации основная цепь стабилизирована системой водородных связей, которая ограничивает ее движение вне зависимости от присутствия молекул воды. Что касается боковых цепей, то они, в отличие от нативной структуры глобулярных белков, не имеют строго определенной пространственной структуры. Это позволяет молекулам воды свободно проникать внутрь структуры полилизина и таким образом способствовать увеличению подвижности боковых цепей. Отдельно результатов. следует Большое отметить количество методическое значение экспериментальных представленных параметров (времен релаксации), измеренных на одном и том же образце, позволило с привлечением минимального числа априорных допущений, во-первых, достаточно достоверно определить минимальное количество молекулярных движений, необходимых для адекватного описания всего набора экспериментальных данных, и, во-вторых, количественно определить параметры этих движений. Без такого широкого набора данных детальное количественное исследование молекулярной динамики было бы невозможно. А качественная демонстрация эффекта изменения динамики при изменении каких-либо экспериментальных условий (в данном случае – уровня гидратации) в настоящее время представляет уже очень ограниченный научный интерес. 157 3.3.2. Сравнительный анализ динамики полилизина и лизоцима по данным релаксации на ядрах 13С естественного содержания. Выше неоднократно упоминалось о важной роли гидратной воды, которая обеспечивает функциональные свойства белков. Существует множество экспериментальных свидетельств того, что при увеличении степени гидратации уровень подвижности глобулярных белков увеличивается [86,87,98,106,218,234,248,249]. Также хорошо известно, что уровень внутренней динамики коррелирует с функциональностью белков [98,106]. Однако, как уже упоминалось в первой главе, подавляющее большинство исследований гидратационной зависимости динамики белков имело качественный характер, поскольку исследовалось ограниченное число экспериментально измеряемых параметров, связанных с параметрами молекулярной динамики неоднозначным образом. Основная цель данной части диссертации – применить тот же экспериментальный подход для исследования динамики яичного лизоцима при различных степенях увлажнения, что был использован при изучении полилизина. Это позволит охарактеризовать динамику белка детально и количественно и, что самое главное, напрямую сравнить динамические (а не экспериментально измеряемые!) параметры двух биополимеров различной природы и физически интерпретировать наблюдаемую разницу в их динамическом поведении. Результаты этого исследования были подробно изложены в нашей работе [212]. 3.3.2.1. Результаты. В работе исследовался лизоцим белка куриных яиц (Sigma) без дополнительной очистки. Так как параллельно с экспериментами на ядрах 13 С мы проводили релаксационные эксперименты на протонах, белок был предварительно растворен в тяжелой воде и лиофильно высушен для замещения лабильных протонов белка на дейтероны. Измерения проводились на максимально дегидратированном и увлажненном в вакуумном эксикаторе до уровня 0.4 г тяжелой воды на грамм белка. Методика измерения времен релаксации и их математического анализа была полностью идентична описанному выше исследованию динамики полилизина. Все эксперименты были проведены на спектрометре Varian Unity с резонансной частотой для протонов 200 МГц. 158 Рис. участок 3.19 представляет спектра алифатических углеродов лизоцима при двух уровнях гидратации. Эти спектры идентичны спектрам лизоцима, опубликованным ранее [95,112]. Как было показано в этих работах, сужение спектральных линий при увеличении гидратации является следствием сужения распределения Рисунок 3.19. Спектры алифатических углеродов-13 естественного содержания в сухом и увлажненном до уровня 0.4 г D2O на г сухого белка лизоциме. Отрезки наверху обозначают спектральные полосы, по которым определялись интегральные интенсивности для построения релаксационных спадов. химсдвигов отдельных углеродов. На спектрах можно различить три основных пика, которые в основном относятся к СН, СН2 и СН3углеродам. При релаксационных построении спадов определялась интегральная интенсивность этих трех спектральных полос, как это показано на Рис. 3.19. Линии карбонильных и ароматических углеродов нами не анализировались, поскольку первые имели слишком длинное время релаксации, которое было трудно измерить, а вторые – слишком низкую интенсивность для приемлемого отношения сигнал/шум. Таким образом, из одного релаксационного эксперимента определялось сразу три релаксационных спада, для CH, CH2 и CH3углеродов. На Рис. 3.20 представлены типичные примеры релаксационных спадов. Из них определялось среднее время релаксации по начальному участку, аналогично процедуре, описанной в пункте 3.3.1.1 (ур-я 3.12-3.13). А температурные зависимости времен релаксации для сухого и увлажненного лизоцима представлены на Рис. 3.21. Количественный анализ времен релаксации показал, что как для сухого, так и для увлажненного белка описать температурные зависимости времен релаксации всех типов углеродов только одним типом движения (спектральная плотность в форме ур-я (3.9)) невозможно, что, впрочем, неудивительно. Ранее в 159 нашей лаборатории уже было показано [86,87], что в белке наблюдаются типа три отдельных движения с различающимися сильно временами корреляции. Два из них по своим характеристикам близки к тем движениям, наблюдались которые в сухом полилизине (см. выше), а третье движение – это быстрое вращение протонов метильных групп вокруг оси симметрии со временем корреляции в пикосекундном диапазоне при комнатной температуре. В процессе подгонки мы полагали, что все вектора С-Н Рисунок 3.20. Релаксационные спады углеродов СН (квадраты), СН2 (кружки) и СН3 (треугольники) химических групп в сухом (закрашенные символы) и увлажненном (незакрашенные символы) образцах лизоцима. Данные измерения проведены при 250 С. принимают участие в двух типах движения. Строго говоря, для метильных следует углеродов вводить три типа движения, однако при этом число подгоночных параметров становилось бы слишком большим, и неопределенность в их определении становится слишком большой. Углеродный параметр порядка вращения метильных протонов имеет величину около 0.1, что можно рассчитать из геометрии метильной группы, и на фоне этого высокоамплитудного движения мелкомасштабное движение в наносекундном диапазоне экспериментально детектировать практически невозможно. Таким образом, мы анализировали релаксацию СН3-углеродов с помощью такого же формализма, что и релаксацию СН и СН2-углеродов, то есть, предполагая наличие только двух типов 160 движения. Результаты подгонки Рисунок 3.21. Температурные зависимости времен релаксации углеродов сухого (закрашенные символы) и увлажненного (незакрашенные символы) лизоцима. Квадраты, окружности, треугольники и ромбы соответствуют 0 off временам релаксации Т1, T1off ρ при ν1e=170 kHz и θ=13 , T1ρ при ν1e=113 kHz и θ=220 и T1dρ при ν1= 5.9 kHz and νr=1.35 kHz (см. обозначения времен релаксации в части 3.2). Сплошные линии – подгоночные кривые, построенные по параметрам, представленным в Таб. 3.1. представлены в Таб. 3.1. Подгонка данных метильных углеродов проводилась двумя способами. В одном случае подгонялись все микродинамические параметры, во втором – параметр порядка быстрого процесса полагался равным 0.1 и не подгонялся. Но как видно из Таб. 3.1, фиксирование величины этого параметра сказывается только на уменьшении неопределенности подгонки остальных параметров, в целом же результаты двух вариантов обработки практически одинаковы. Поскольку алифатические СН и СН2-углероды локализованы на основной и боковых цепях, соответственно, это дает возможность оценивать динамику основной и боковых цепей по отдельности. 3.3.2.2. Обсуждение. Результаты, представленные в Таб. 3.1, показывают, что основная и боковые цепи лизоцима участвуют в движениях со временами корреляции 10-9-10-8 и 10-5-10-4 161 Таблица 3.1. Микродинамические параметры, полученные из подгонки времен релаксации, представленных на Рис. 3.21. Звездочками помечены строчки, в которых представлены параметры движения метильных углеродов, полученные при фиксированном значении параметра порядка быстрого процесса. Быстрое движение S2 τ, c (200 C) β Ea. кДж/моль CH, h=0 0.978±0.003 (11.5±6.5)·10-9 0.35±0.09 13±3 CH2, h=0 0.947±0.005 (26.2±1.6)·10-9 0.97±0.05 6.5±1.5 CH3, h=0 0.17±0.14 (2.3±2.2)·10-12 0.41±0.025 19±1.5 *CH3, h=0 0.1 (1.5±0.4)·10-12 0.41±0.03 19±1.5 CH, h=0.4 0.947±0.007 (12±1.9)·10-9 0.93±0.05 18.7±2.2 CH2, h=0.4 0.873±0.015 (7.6±1.7)·10-9 0.77±0.07 16.2±3.5 CH3, h=0.4 0.16±0.11 (4.3±2.6)·10-12 0.42±0.03 7.5±1.5 *CH3, h=0.4 0.1 (3.3±0.8)·10-12 0.42±0.03 7±1.5 Медленное движение S2 τ, c (200 C) β Ea. кДж/моль CH, h=0 0.981±0.005 (9.6±3.5) ·10-5 0.26±0.06 96±20 CH2, h=0 0.965±0.005 (28.2±27.8) ·10-5 0.23±0.04 67±14 CH3, h=0 0.87±0.15 (1.4±3.2) ·10-3 0.25±0.09 72±20 *CH3, h=0 0.89±0.055 (5.6±21) ·10-3 0.21±0.08 81±13 CH, h=0.4 0.71±0.08 (9.3±3.0) ·10-5 0.84±0.12 30±6 CH2, h=0.4 0.67±0.09 (16.5±8.5) ·10-5 0.71±0.11 35±5.5 CH3, h=0.4 0.61±0.23 (4.0±0.4) ·10-5 0.86±0.11 20.2±3.5 *CH3, h=0.4 0.58±0.075 (4.1±0.4) ·10-5 0.84±0.11 20.5±4 c (кроме вращения метильных протонов). В сухом белке амплитуды обоих этих движений очень малы. Боковые цепи имеют несколько бóльшую амплитуду, что выглядит вполне естественным. Оба движения имеют широкое распределение времен корреляции, что является следствием динамической гетерогенности структуры белка. Разница в энергиях активации связана с различной природой этих движений, которая была описана выше. Важно отметить, что увеличение уровня гидратации не приводит к сколько-нибудь заметному изменению времен корреляции 162 молекулярных движений. Что касается остальных параметров, то увеличение гидратации вызывает: - увеличение амплитуд быстрого и медленного процессов, причем этот эффект более заметен для медленного движения; - уменьшение энергии активации медленного движения; - сужение распределения времен корреляции медленного движения. Сужение распределения времен корреляции очень хорошо согласуется с результатами работ [95,112], в которых анализировалась гидратационная зависимость формы спектра углеродов лизоцима. В этих работах было показано, что увеличение гидратации вызывает сужение распределения конформационных подсостояний белка, что приводит к сужению распределения химических сдвигов углеродов и в конечном итоге – к сужению линий спектра. Увеличение амплитуд внутренних движений предсказуемый белка результат, при увеличении который ранее гидратации наблюдался – тоже легко многократно [98,133,234,248,249]. Самое новое и интересное в полученных результатах – возможность количественного сравнения динамического поведения глобулярного белка и синтетического гомополипептида (полилизина) при различных уровнях гидратации. Такого рода количественного анализа, насколько нам известно, до сих пор не проводилось. Итак, если сравнивать данные представленные на Рис. 3.17 и 3.18 (полилизин) и в Таб. 3.1 (лизоцим), то становится очевидным, что динамика лизоцима и полилизина отличается в значительной степени. В сухом состоянии оба образца характеризуются очень близкими параметрами молекулярной динамики – и лизоцим, и полилизин проявляют минимальную подвижность во всем диапазоне частот молекулярных движений. При увеличении уровня гидратации динамика боковых цепей полилизина претерпевает наиболее существенные изменения: время корреляции медленного движения укорачивается на примерно пять порядков величины, и при уровне гидратации около 10% быстрое и медленное движения становятся экспериментально неотличимыми друг от друга. Параметр порядка этого движения уменьшается с 0.9 в сухом образце до 0.4 в увлажненном до уровня h=0.2. В то же время, параметр порядка этого движения в основной цепи уменьшается только с 0.98 до 0.92, а все остальные микродинамические параметры остаются 163 практически неизменными. Напомним, что при увеличении гидратации до 20% вторичная структура полилизина никаких изменений не претерпевает [237]. Такая разница в зависимости характера внутренней динамики боковых цепей от уровня гидратации для лизоцима и полилизина может быть объяснена следующим образом. Структура нативного глобулярного белка имеет, как правило, очень плотную упаковку с очень малым количеством пустот внутри. Молекулы воды не могут свободно проникать внутрь структуры, и в то же время, плотность упаковки белка в сухом и гидратированном состоянии отличается не очень сильно. Таким образом, гидратация может влиять на внутреннюю динамику белка в основном благодаря поверхностным эффектам, то есть взаимодействию молекул воды с боковыми группами, находящимися на поверхности белка. Для полилизина же картина совсем иная. Хотя основная цепь полилизина образует бета-слой, его боковые группы не образуют жесткой плотной упаковки. Из-за очень высокой гидрофильности полилизина молекулы воды легко проникают между боковыми цепями и тем самым увеличивают конформационную свободу, как для быстрого, так и для медленного движений. Что касается динамики основной цепи лизоцима и полилизина, то в сухом состоянии основная цепь обоих биополимеров очень жесткая. При увеличении гидратации амплитуда быстрого (наносекундного) движения основной цепи лизоцима почти не изменяется, а амплитуда медленного (микросекундного) движения наоборот, растет очень сильно по сравнению с полилизином. В отличие от полилизина только около 40% основной цепи лизоцима образуют участки вторичной структуры, альфа-спирали и бета-слои [250]. Корреляция между амплитудой медленного движения и долей основной цепи, образующей вторичную структуру, приводит к выводу о том, что это медленное движение по видимому не связано с разрывом водородных связей, которые стабилизируют бета-слои и альфа-спирали. В противном случае, такая корреляция вряд ли наблюдалась бы. Как упоминалось выше, медленное (микросекундное) движение связано с редкими высокоамплитудными конформационными переходами. Естественно, такое движение требует определенного свободного пространства вокруг глобулы белка, поскольку оно связано с некоторым изменением формы и объема глобулы. Гидратная оболочка вокруг белка обеспечивает такой свободный объем. Также 164 важно и то, что гидратная вода обеспечивает правильную для нативной конформации конфигурацию водородных связей лиофильных поверхностных групп, чем понижает энергетические барьеры крупномасштабных конформационных переходов. В то же время амплитуда быстрого движения определяется локальными стереохимическими ограничениями. Эти ограничения зависят от гидратации в очень небольшой степени, поскольку плотность упаковки структуры в сухом и гидратированном белке отличается несильно. Только поверхностные группы могут увеличивать свою подвижность благодаря гидратной оболочке. Это, скорее всего, и объясняет разницу в гидратационной зависимости параметров порядка быстрого и медленного процессов, которая видна из Таб. 3.1: с увеличением гидратации параметр порядка медленного процесса изменяется гораздо сильнее, чем параметр порядка быстрого процесса. Таким образом, представленные выше результаты говорят о том, что при увлажнении подвижность боковых цепей сильнее увеличивается в полилизине, а основной цепи – в лизоциме. Эта разница в динамическом поведении объясняется различной природой этих двух биополимеров. С одной стороны, лизоцим имеет жесткую плотноупакованную структуру, внутрь которой молекулы воды свободно проникать не могут, а у полилизина такой структуры нет. Это объясняет разницу в подвижности боковых цепей. С другой стороны, почти вся пептидная цепь полилизина включена в образование вторичной структуры (бета-слоя), а у лизоцима только 40% основной цепи образует альфа-спирали и бета-слои. Следствием этого, по нашему мнению, является различная низкочастотная динамика основной цепи этих двух биополимеров. Обобщая эти результаты, можно сказать, что механизм влияния гидратной воды на конформационную динамику биополимеров сводится к созданию свободного объема вокруг кинетической единицы, будь то отдельная боковая цепь или более объемный элемент структуры белка, например, альфаспираль. Поскольку молекулы воды не имеют свободного доступа к гидрофобному ядру белка, поэтому подвижность боковых цепей белка возрастает только благодаря поверхностным эффектам. В то же время, если полипептидная цепь стабилизирована системой водородных связей, образующих вторичную структуру, то добавление воды и создание свободного объема уже роли не играет – цепь остается жесткой. 165 Кроме углеродных экспериментов, мы также провели в лизоциме и протонные релаксационные измерения. Однако для лизоцима нам не удалось получить информации того типа, что мы получили для полилизина (см. ниже). Из-за быстрой спиновой диффузии между протонами, релаксационные эксперименты не позволяют получать динамическую информацию отдельно для различных групп протонов. Поэтому при обработке данных необходимо было вводить сразу три (с учетом быстрого вращения протонов метильных групп), а не два типа движения. Но при этом, неопределенность в определении величин микродинамических параметров становилась такой большой, что их интерпретация теряла смысл. Тем не менее, нам удалось показать, что корреляционные функции движения, определенные из углеродных и протонных экспериментов, существенно различаются. Очевидно, что такое различие является следствием того, факта, что углеродные и протонные эксперименты отражают движение различных межъядерных векторов, об этом подробно говорилось выше. Тем не менее, протонные эксперименты на лизоциме представляют существенно меньший интерес и новизну по сравнению с углеродными, и потому мы здесь останавливаться на них подробно не будем. 3.3.3. Полилизин – сравнительный анализ ЯМР-релаксации на ядрах 1Н и 13С. Представленные выше результаты по динамике полилизина и лизоцима имеют один недостаток, типичный для безмодельного подхода к анализу релаксационных данных. Этот недостаток упоминался в самом начале диссертации. Анализ времен релаксации ядер одного типа даже в самом благоприятном случае может дать информацию только о корреляционной функции движения. Что же представляет собой это движение с физической точки зрения, определить невозможно, поскольку переход от параметра порядка S2 к конкретной физической модели движения неоднозначен. Это принципиальное ограничение, характерное, кстати, далеко не только для ЯМР-релаксации. Однако получить представление о физической природе молекулярного движения все-таки можно, для этого необходимо сопоставить как минимум два параметра порядка, которые характеризуют одно и то же движение, и которые получены независимо друг от друга. Получить такие параметры порядка можно, например, из экспериментов на различных магнитных ядрах. Именно об этом и пойдет речь в этой части диссертации. 166 3.3.3.1. Преимущества и особенности сравнительного анализа ЯМР-релаксации на ядрах 1Н и 13С в биополимерах. Основная проблема при анализе данных по твердотельной протонной магнитной релаксации состоит в том, что спиновая диффузия между протонами в органических молекулах очень быстрая (если протоны в процессе получения образца не были замещены на дейтероны). Из эксперимента можно определить только одно среднее для всех протонов время релаксации, поэтому количественный анализ протонных релаксационных данных будет иметь смысл только для максимально простых и однородных систем, где усреднение времен релаксации различных протонов не приводило бы к чрезмерному усложнению и неопределенности анализа данных. С этой точки зрения полилизин – очень удобный образец. Во-первых, он находится преимущественно в одной конформации (бета-слой, см. выше), во-вторых, восемь из девяти нелабильных протонов находятся на боковой цепи, в третьих, в полилизине нет метильных групп, следовательно, быстрое вращение метильных протонов не будет мешать наблюдению за другими молекулярными движениями этого диапазона времен корреляции. Совместная обработка релаксационных данных, полученных на ядрах 1Н и 13С, позволяет значительно снизить неопределенность величин микродинамических параметров, получаемых из подгонки времен релаксации (см. например [251]). Однако наибольший интерес в совместном анализе 1Н и 13С релаксации представляет сопоставление параметров порядка одного и того же движения, которые были получены из экспериментов на этих двух типах магнитных ядер. Времена протонной и углеродной магнитной релаксации определяются различными магнитными взаимодействиями, а именно межъядерными диполь-дипольными взаимодействиями 1 Н-1Н и 13 С-1Н, соответственно. Таким образом, в зависимости от геометрии молекулы (или ее участка) и геометрии молекулярного движения, динамика межъядерных векторов 1Н-1Н и 13С-1Н может быть совершенно различна, а значит и различны параметры порядка одного и того же движения. Для органических молекул эта разница имеет еще одну очень важную особенность. Дело в том, что в химических группах CH2 и CH3 расстояния C-H и HH равны соответственно 1.08 Å и 1.78 Å. В то же время, наиболее короткое расстояние между атомами разных химических групп примерно 2.3-2.5 Å. Поскольку 167 величина диполь-дипольного взаимодействия обратно пропорциональна межъядерному расстоянию в шестой степени, то отсюда очень легко оценить, что релаксация углеродов определяется практически полностью взаимодействием с ковалентно связанными протонами одной и той же химической группы (СН, СН2 или СН3). А в случае протонов, магнитная релаксация определяется взаимодействием между протонами не только одной и той же химической группы, но и между протонами различных химических групп. Как показали расчеты по известным пространственным структурам нескольких белков, межгрупповое диполь-дипольное взаимодействие может составлять примерно 30-40% от общего среднего второго момента протонов белков [87]. Отсюда следует, что углеродная релаксация отражает только реориентационные (т.е. вращательные) движения участков цепи полимера, в то время как протонная релаксация вдобавок к этому также чувствительна и к возвратно-поступательным движениям различных участков цепи относительно друг друга. Именно эта разница в свойствах углеродной и протонной релаксации и поможет нам получить более ясную и наглядную физическую картину молекулярной динамики твердого полилизина. 3.3.3.2. Условия эксперимента и методы анализа. Протонные эксперименты были проведены на твердом образце полилизина с различными степенями увлажнения тяжелой водой. Для обеспечения структурной гомогенности образца и предварительного обмена лабильных (NH) протонов на дейтероны перед проведением ЯМР-экспериментов с образцом были проведены следующие манипуляции. Порошок полилизина был растворен в тяжелой воде и затем лиофилизирован. После лиофилизации образец был помещен в ротор и увлажнен в вакуумном эксикаторе до уровня 25%, выдержан в течение одного часа при 500 С (естественно, герметически изолированный от атмосферы) и затем высушен под вакуумом в течение 24 часов. После проведения ЯМР-релаксационных экспериментов на протонах с сухим образцом, полилизин был последовательно увлажнен тяжелой водой в вакуумном эксикаторе до уровней 0.054, 0.13 и 0.215 г D2O на грамм сухого полипептида. При каждом уровне гидратации проводились одни и те же ЯМР-эксперименты. Уровни гидратации, указанные выше, соответствуют молярным уровням гидратации полилизина обычной водой, которые 168 использовались в экспериментах по углеродной релаксации (см. выше), с учетом поправки на разницу в молекулярной массе H2O и D2O. ЯМР-эксперименты были выполнены на спектрометре Varian Unity с резонансной частотой для протонов 200 МГц. Были измерены времена релаксации Т1 и Т1ρ с отстройкой частоты поля спин-лока от резонанса при нескольких температурах. Импульсные последовательности измерения протонных Т1 и Т1ρ представлены на Рис. 3.22. Смысл применения отстройки от резонанса поля спинлока в протонных экспериментах – абсолютно такой же, как и в описанных выше углеродных экспериментах. Импульсная последовательность, представленная на Рис 3.22, позволяет определять времена релаксации, измеряя только начальный участок спада, не доходя до нулевой линии, что необходимо при применении стандартных способов измерения. Это стало возможным благодаря составному π-импульсу в начале последовательности, вторая половина которого имеет чередующуюся фазу. Фазовый цикл протонных импульсов обеспечивает то, что сигнал при очень Рисунок 3.22. Импульсная последовательность для измерения протонных времен релаксации Т1 и Т1ρ с отстройкой от резонанса через сигнал от углеродов. При измерении Т1 спин-лок импульс не подавался. Буквами «X» и «Y» с соответствующими знаками обозначены фазы импульсов, воздействующих на протоны. π/4-импульсы до и после импульса спин-лока ориентируют вектор протонной намагниченности вдоль поля B1e (первый импульс) и затем вдоль поля B0 (второй импульс). «СР» обозначает кроссполяризационную секцию. 169 длинных релаксационных задержках равен нулю. Этот прием аналогичен циклу инверсии спиновой температуры в релаксационных экспериментах на ядрах, возбуждаемых с помощью кросс-поляризации [211]. Соответственно, нет необходимости использовать длинные релаксационные задержки для регистрации нулевой линии. Для измерения Т1 длинные задержки не являются большой проблемой, а вот длинные (порядка сотен миллисекунд) спин-лок импульсы в экспериментах по измерению Т1ρ могут привести к перегреву образца и попросту сжечь измерительную головку и выходной каскад усилителя спектрометра. Поэтому фазовый цикл протонных импульсов имеет важное значение. Регистрация сигнала проводилась через сигнал от ядер 13 С (Рис. 3.22) потому что время ССИ углеродов намного длиннее, чем ССИ протонов (15-20 мкс) и его легче регистрировать, хотя принципиального значения это не имело. Проводились эксперименты и с регистрацией непосредственно протонного сигнала, времена релаксации при этом были, естественно, совершенно одинаковые. Спады релаксации были во всех случаях одноэкспоненциальными. Измерения времени релаксации Т1ρ были проведены при частотах резонанса в наклоненной вращающейся системе координат ν1e 105±3 и 194±4 кГц, угол θ между полями B0 и B1e при этом был соответственно B B 350±30 и 180±20. Времена протонной релаксации анализировались по формулам, полученным Джонсом [210]. Первоначальный (довольно громоздкий) вид этих выражений был сведен к более лаконичной записи проф. Хорстом Шнайдером (Университет Халле, Германия): ⎡ 1 1 1 3 ⎤ ⎥, = + sin 2 θ ⎢ Δ − T1ρ T1 ⎢ T1ρ 4T1 ⎥ ⎣ ⎦ (3.14) 1 2 = K HH ( J (ω0 ) + 4 J (2ω0 ) ) , T1 3 (3.15а) 3 ⎛ ⎞ = K HH ⎜ cos 2 θ ⋅ J (ω1e ) + sin 2 θ ⋅ J (2ω1e ) + J (ω0 ) ⎟ , 2 ⎝ ⎠ (3.15b) где 1 T1Δρ KHH – второй момент протонов, который рассчитывается по формуле 170 K HH = 1 9 2 4 N 1 =γ ∑ 6, N 20 i ≠ j rij (3.16) где γ - гиромагнитное отношение протонов, rij – расстояние между протонами i и j, N – число протонов в образце. Формулы (3.14-3.15) являются аналогами формул (3.53.6) для случая гомоядерной магнитной дипольной релаксации. Следует оговорить, что при такой записи предполагается, что межпротонные расстояния постоянны, а спектральная плотность J(ω) отражает только вращательные движения межпротонных векторов. Однако для корректного анализа необходимо учитывать также и изменение межпротонных расстояний, ниже будут представлены соответствующие выражения. Спектральная плотность движения J(ω) при анализе данных по протонной релаксации записывалась таким же образом, как и при анализе углеродной релаксации (см. 3.3.1.1.). Кроме анализа времен ЯМР-релаксации в данной работе мы также использовали и компьютерное Монте-Карло моделирование динамики полилизина. Эти расчеты проводились с помощью программы HyperChem 6, с использованием силового поля amber96 в вакууме при температуре 300 K. Моделирование каждой молекулярной системы (они будут описаны ниже) состояло из 5⋅105 шагов, принятых в соответствии с критерием Метрополиса [252]. На диск записывались и впоследствии анализировались координаты каждой тысячной структуры из МонтеКарло траектории. Полученные из моделирования траектории использовались для расчета вторых моментов протонов KHH по формуле: K HH = 1 M ∑ ( K HH )i , M i=1 (3.17) где M – число шагов (записанных структур) в траектории и (KHH)i – второй момент для i-той структуры, рассчитанный по ур-ю (3.16). Лабильные протоны (ковалентно связанные с азотами на основной и боковых цепях) не учитывались, поскольку в эксперименте эти протоны были замещены на дейтероны. По своему определению, параметр порядка равен отношению усредненного движением второго момента ко второму моменту жесткой решетки: 171 S2HH = ( K HH )averaged . ( K HH )rigid lattice (3.18) Знаменатель в ур-и (3.18) определяется по формуле (3.17), а усредненную величину второго момента можно рассчитать из траектории Монте-Карло по следующему выражению: ( K HH )averaged = 2 1 M M N 1 ∑∑∑ M(M + 1) N n =1 m = n i ≠ j ( rij3 ) 1 m (r ) 3 ij n 1 3cos 2 (θij ) mn − 1) , ( 2 (3.19) где ( rij3 )n - куб расстояния между протонами i и j в n-ном шаге траектории, (θij)mn – угол между межъядерным вектором i-j в структуре (шаге Монте-Карло траектории) номер n и тем же самым вектором в структуре номер m. Используя такую запись для вычисления усредненной величины второго момента, мы предполагаем, что изменения длин межпротонных векторов не коррелированы с изменением их ориентаций. Строго говоря, усреднение второго момента молекулярным движением должно определяться по более сложной формуле: ( K HH )averaged = 2 2 2 1 M M N 3cos ( ϑij )m − 1 3cos ( ϑij )n − 1 , ⋅ ∑∑∑ M(M + 1) N n =1 m = n i ≠ j B∫0 2 ( rij3 ) 2 ( rij3 ) m (3.20) n где (ϑij)n – угол между i-j межпротонным вектором и внешним полем B0 в шаге B траектории номер n. Интегрирование по B0 является стандартным т.н. порошковым B усреднением. Но использование ур-я (3.20) вместо (3.19) занимает гораздо больше времени. Мы провели сравнительный анализ обработки на примере одной относительно короткой траектории и получили практически идентичные результаты. Таким образом, предположение о статистической некоррелированности изменений межпротонных расстояний и ориентаций межпротонных векторов выглядит вполне правдоподобным, и потому большинство расчетов усреднения вторых моментов проводилось по формуле (3.19). Из Монте-Карло траекторий также определялись и параметры порядка для углеродной релаксации. Поскольку углеродная релаксация определяется взаимодействием углерода только с ковалентно связанными протонами 172 (см. 3.3.3.1), а длина химической связи постоянна, то в этом случае учитывать межъядерное расстояние не обязательно. Соответственно, этот параметр порядка определялся по более простой формуле: 2 = SCH 2 1 M M NH 1 3cos 2 (θi ) mn − 1) , ( ∑ ∑ ∑ M(M + 1) N n =1 m = n i=1 2 (3.21) где (θi)mn – угол между ориентациями вектора, соединяющего углерод с i-тым протоном в шагах траектории m и n. NH определяется числом ковалентно связанных протонов равно 1 для α-углерода и 2 для β,γ,δ и ε углеродов. Применяя ур-е (3.21) для расчета параметра порядка для углеродной магнитной релаксации, мы допускаем, что механизм релаксации через АХС (анизотропию химического сдвига) пренебрежим по сравнению с диполь-дипольным механизмом релаксации. В самом деле, АХС алифатических углеродов боковых цепей аминокислот составляет примерно 25-30 м.д. [253], что соответствует 2.5-3 кГц на резонансной частоте 100 МГц. В то же время величина С-Н дипольного взаимодействия – около 20 кГц. Поскольку скорость релаксации пропорциональна квадрату взаимодействия, выраженного в частотных единицах, пренебрежение механизмом релаксации через АХС представляется вполне обоснованным. 3.3.3.3. Результаты и обсуждение. Рис. 3.23 представляет температурные зависимости времен протонной магнитной релаксации при четырех уровнях гидратации полилизина. В отличие от данных по углеродной релаксации (см. выше), температурные зависимости времен протонной релаксации во всех случаях могут быть достаточно хорошо описаны с помощью только одного типа движения. Результаты подгонки представлены в Таб. 3.2. Как говорилось выше, заметная доля среднего второго момента протонов зависит от взаимодействия между протонами соседних химических групп, расстояние между которыми заранее неизвестно. Поэтому величина KHH также является неизвестной. Поэтому вместо параметра порядка в Таб. 3.2 представлена абсолютная часть диполь-дипольного 173 взаимодействия протонов, которая усредняется молекулярным движением, то есть которое 2 (1- S HH )ΚHH, произведение может быть однозначно определено из подгонки данных. В случае экспериментов мы протонных имели экспериментальных сравнению данных с по углеродными экспериментами, поэтому неопределенность значений меньше в получении микродинамических параметров из подгонки здесь была, естественно, выше. В то же время, значения всех четырех параметров очень высоко коррелированы. Если зафиксировать величину только одного Рисунок 3.23. Температурные зависимости времен протонной магнитной релаксации Т1 и T1ρ с отстройкой от резонанса при различных уровнях гидратации. Сплошные линии – подгоночные кривые, построенные по уравнениям (3.14)-(3.15) и параметрам из Таб. 3.2. Экспериментальная ошибка в измерении времен релаксации менее 10%. параметра, то оставшиеся три будут определяться из подгонки с гораздо более высокой точностью. Например, минимальное значение произведения 2 (1- S HH )ΚHH соответствует минимальным значением τ293K и β и максимальному значению Еа, и наоборот. Эти два набора предельных значений микродинамических параметров, при которых можно получить хорошее качество подгонки, представлены в Таб. 3.2 в двух строчках для каждого уровня гидратации. Единственное исключение составляет максимальные уровень гидратации h=0.215, при котором не минимальное, а максимальное значение 2 произведения (1- S HH )ΚHH соответствует предельным значениям трех остальных параметров, упомянутых выше (см. Таб. 3.2). Сравнивая величины микродинамических параметров Ea, β и τ, представленных в Таб. 3.2, с параметрами, полученными из анализа углеродных времен релаксации 174 Таблица 3.2. Минимальные и максимальные значения микродинамических параметров, при которых можно получить хорошее (среднеквадратичное отклонение между экспериментальными и теоретическими данными менее 10%) описание температурных зависимостей времен релаксации (Рис. 3.23). h, г D2O на г полипетида 0 0.054 0.13 0.215 (1- S2HH )KHH, τ293K, 1010 с-2 нс 0.6 1.2 0.38 20 1.2 7.5 0.85 3 0.76 2.0 0.39 30 2.0 10 1.0 9 0.89 0.9 0.39 40 1.08 4 0.6 18 1.0 0.3 0.47 50 0.91 1 0.53 25 β Ea, кДж/моль (Рис. 3.17), легко заметить, что релаксационные эксперименты на протонах и углеродах детектируют одно и тоже движение боковых цепей в наносекундном диапазоне времен корреляции. Обозначим это движение римской цифрой I. Тот факт, что протонные времена релаксации могут быть описаны только одним (быстрым) типом движения, строго говоря, не означает того, что боковые цепи не подвержены динамике в микросекундной области, как это следует из данных по углеродам. В случае анализа углеродных данных информация о медленных движениях была получена в основном из температурных зависимостей времени релаксации T1dρ (см. 3.1.2.), которое наиболее чувствительно к медленным движениям. В случае измерений на протонах у нас не было аналога такому эксперименту. Для того, чтобы определить, насколько чувствительны протонные времена релаксации к медленному движению, мы искусственно ввели второй тип движения при описании данных по сухому полилизину (спектральная плотность J(ω) при этом записывалась в виде ур-я (3.10)) с закрепленными параметрами медленного движения τ=50 мкс, β=0.1 и Ea=120 кДж/моль. Эти величины были определены из данных по углеродной релаксации, см. Рис. 3.17. Проводя такую процедуру, мы допускали, что хотя геометрия движения межъядерных векторов С-Н и Н-Н может 175 быть разной, временные характеристики этих движений должны быть если не идентичными, то, по крайней мере, достаточно близкими. Моделирование температурных зависимостей времен протонной релаксации при данных значениях параметров практически не меняло качество подгонки и параметры движения I, если произведение S2f(1-S2S)KHH, то есть величина усредняемого этим медленным движением дипольного взаимодействия (S2f и S2S – параметры порядка быстрого и медленного движений, соответственно) не превышает (5-7)⋅108 с-2. Если эта величина больше, то появляется заметное систематическое отклонение подгоночных кривых от экспериментальных зависимостей. Таким образом, было показано, что видимое противоречие между углеродными и протонными данными, первые из которых показывают наличие микросекундной динамики боковых цепей, а вторые – нет, можно объяснить различным набором экспериментально измеряемых времен релаксации. Этот тип движения мы обозначаем цифрой II. Наиболее важной и интересной стороной совместного анализа данных по протонной и углеродной релаксации было бы сравнение параметров порядка, полученных из этих двух типов экспериментов. Ясно, что это возможно, только если известна величина второго момента протонов KHH, а для этого должна быть известна пространственная структура молекулы. Если речь идет о белках, то структуру многих из них можно получить из Brookhaven Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/). Ранее, используя эти структуры, мы определили, что второй момент протонов жесткой решетки для различных белков примерно одинаков и составляет величину 1.3⋅1010 с-2 [87]. Но для полилизина KHH может иметь более высокое значение, поскольку в полилизине гораздо выше процент СН2 групп, чем в простых белках, а значит выше протонная плотность. Для того, чтобы рассчитать KHH для полилизина, на компьютере была сконструирована соответствующая молекулярная структура. Для этого были использованы следующие известные свойства нашего образца: 1) Полилизин находится преимущественно в конформации анти- параллельного бета-слоя [236,237]; 2) Параметр порядка быстрого движения, определенный из углеродных релаксационных экспериментов в сухом образце, имеет близкую к единице величину (т.е. движение имеет низкую амплитуду) и примерно одинаков 176 для всех углеродов боковой цепи. Это означает, что локальные колебания одинаково ограничены микроокружением на протяжении всей длины боковой цепи; 3) KHH должно быть максимально большим. Последнее условие следует из оценки параметра порядка быстрого движения для протонов с использованием величины KHH, определенной для белков (1.3⋅1010 с2 ), и произведения (1- S2HH )KHH, представленного в Таб. 3.2. Эта оценка дает величину между 0.1 и 0.55 для сухого образца, что очевидно слишком мало: в дегидратированном образце вряд ли могут существовать движения с такой высокой степенью усреднения дипольного межпротонного взаимодействия, это явно противоречит результатам по углеродной релаксации. Для того, чтобы параметр порядка для протонов был выше, необходимо чтобы и величина KHH была максимально высокой. Монте-Карло моделирование движения изолированной боковой цепи, а также участка цепи полилизина в конформации бета-слоя длиной в 5-7 остатков или даже двух или трех таких цепочек, образующих бета-слой, приводило к величине KHH (1.2-1.4)⋅1010 с-2, к высокой амплитуде движения боковых цепей и к сильной 2 зависимости параметра порядка S CH для углеродов боковой цепи от расстояния до основной цепи. То, что амплитуда движения растет от основания боковой цепи к ее концу, выглядит вполне естественно: боковые цепи соседних лизиновых остатков ориентированы в разные стороны по отношению к плоскости бета-слоя. Соответственно, каждая боковая цепь имеет достаточно свободного пространства в своем микроокружении, что и обуславливает высокую амплитуду движения и ее зависимость от степени удаления от основной цепи. Полученные результаты противоречат экспериментальным данным, соответственно, такие простые системы не могут служить моделями для интерпретации релаксационных экспериментов. Для того, чтобы уменьшить свободный объем вокруг каждой боковой цепи, мы стали рассматривать сразу два противолежащих параллельных бета-слоя, каждый из которых состоял из трех цепочек. При этом боковые цепи каждого бета-слоя были вставлены в промежутки между боковыми цепями противолежащего бета-слоя, как показано на Рис. 3.24. Таким образом, вся структура состояла из шести цепочек, по три на каждый бета-слой. Для убыстрения вычислений в этой модели использовался 177 не полилизин, а пептидная цепочка Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-Gly. боковые цепи Поскольку соседних остатков полилизина ориентированы в разные стороны по отношению к плоскости бета-слоя, цепей, Рисунок 3.24. Часть молекулярной структуры, использованной в МонтеКарло моделировании: две цепи (LysGly)3, принадлежащие двум противолежащим бета-слоям. Полная структура состояла из шести таких цепочек, которые образовывали два параллельных противолежащих бетаслоя, каждый из которых состоял из трех цепочек. динамика которые тех боковых ориентированы наружу, нас не интересует. Поэтому мы заменили эти остатки на глицин, который боковой цепи не имеет. Каждая боковая цепь изначально находилась в энергетически наиболее выгодной конформации «анти», при которой двугранные углы χ, определяющие конформацию боковой цепи, равны 1800. Поскольку молекулы воды в структуру не добавлялись, то результаты моделирования следует соотносить, естественно, с экспериментальными результатами только по сухому образцу. При количественном анализе траектории, т.е. при вычислениях величин дипольдипольного взаимодействия, в расчет принимались только четыре боковые цепи, расположенные в центре структуры, то есть только те, которые с четырех сторон окружены другими боковыми цепями, две из которых принадлежат противолежащей цепочке в другом бета-слое (см. Рис. 3.24), а две другие – соседним цепочкам одного и того же бета-слоя. Для того, чтобы общий электрический заряд системы был равен нулю (в противном случае вся структура очень быстро разлетается на части) заряд концевой NH3 группы был приравнен нулю. Были проведены Монте-Карло моделирования для систем с различными начальными координатами этой системы. Во-первых, мы варьировали расстояние между противолежащими бета-слоями в пределах 1-1.5 Å, и, во-вторых, различным образом располагали бета-слои относительно друг друга, как это показано на Рис. 3.25. Тем не менее, во всех случаях мы получали приблизительно одни и те же результаты. Следует подчеркнуть, что результаты компьютерного моделирования можно соотносить 178 Рисунок 3.25. Две различные позиции двух бета-слоев относительно друг друга. Направления основных цепей пептидов перпендикулярны плоскости рисунка. Слева: боковые цепи противолежащих пептидов находятся в одной плоскости. Справа: боковые цепи расположены в шахматном порядке. Водороды на рисунке не показаны. только с параметрами быстрого движения. Медленное движение – это редкие высокоамплитудные конформационные переходы, и для их наблюдения необходимы очень длинные траектории. Но это, во-первых, очень долго, а во-вторых, при слишком долгом моделировании структура, в конце концов, разваливается. В результате анализа траекторий Монте-Карло мы получили неусредненную величину KHH (1.5-1.7)⋅1010 с-2. Все другие результаты, как анализа траекторий, так и экспериментальных времен релаксации представлены на Рис. 3.26 и 3.27. Из этих рисунков видно, что углеродные параметры порядка, определенные из эксперимента и моделирования, достаточно хорошо согласуются друг с другом. Это говорит о том, что данная молекулярная структура может служить приемлемой моделью для анализа динамики. В то же время, разница между протонными параметрами порядка, определенными из ЯМР-эксперимента и моделирования, намного превышает экспериментальную ошибку. При вычислении параметра порядка для протонов из Монте-Карло траекторий использовалась минимальная величина произведения (1S2HH )KHH, которое представлено в Таб. 3.2 (верхняя строчка), которая дает максимальное значение параметра порядка S2HH . Бóльшие значения этого произведения приводят к меньшим S2HH , что объяснить еще труднее. Для того, чтобы получить соответствие экспериментального и теоретического протонных параметров порядка, второй момент протонов должен иметь величину, близкую к 2.5⋅1010 с-2. Однако ее невозможно получить без перекрытия ван-дер-ваальсовых радиусов протонов, что явно не имеет физического смысла. 179 Как указывалось разница между выше, протонным и углеродным параметрами порядка может объясняться за счет того, что углеродный параметр порядка отражает только реориентационные движения, а протонный – в дополнение к этому еще и относительные возвратнопоступательные движения принадлежащих протонов, различным участкам полимерной цепи. Величина KHH=(1.5-1.7)⋅1010 с-2, полученная из Монте-Карло моделирования, Рисунок 3.26. Углеродные и протонные параметры порядка быстрого движения в сухом полилизине, определенные из времен магнитной релаксации и из моделирования Монте-Карло. Незакрашенные кружки – 2 экспериментальные углеродные S (данные из Рис. 3.17). Размер этих символов соответствует экспериментальной ошибке. Закрашенные кружки – те же самые параметры порядка, полученные из моделирования. Планка погрешностей обозначает разброс значений для симуляций с различными начальными координатами (см. в тексте). Верхний заштрихованный прямоугольник обозначает диапазон значений протонного параметра порядка (усредненного по всем углеродам боковой цепи) для различных вариантов симуляций. Нижний прямоугольник – параметр порядка, определенный из протонных экспериментов с использованием значения KHH (1.5-1.7)⋅1010 s-2 и минимальной величины (1-S2)KHH из Таб. 3.2. 180 может на разделена три быть вклада: взаимодействие протонов внутри одной СН2-группы (0.85⋅1010 с-2), взаимодействие протонов внутри одной и той же боковой цепи за исключением протона одной и той же СН2-группы (0.35-0.45⋅1010 с-2) и взаимодействие протонами, между принадлежащими различным боковым группам (0.30.4⋅1010 с-2). Анализ Монте-Карло траекторий показал, что параметр порядка для первых двух вкладов близок очень к параметрам порядка для углеродов, в то время как дипольное между взаимодействие протонами различных Рисунок 3.27. Экспериментальные параметры порядка быстрого движения (тип I), определенные из углеродных (кружки) и протонных (закрашенные прямоугольники) экспериментов при четырех уровнях гидратации. Данные по углеродам соответсвуют Рис.3.17, а протонные данные получены из верхних строчек колонки (1- S2HH )KHH для каждого уровня гидратации (Таб. 3.2) и величины KHH (1.5-1.7)⋅1010 s-2, которая была опеределена из МонтеКарло моделирования. Ширина закрашенных прямоугольников соответствует разбросу значений KHH (1.5-1.7)⋅1010 s-2. боковых групп (третий вклад в величину КНН) усредняется быстрым движением ощутимо сильнее, т.е. параметр порядка ниже. Благодаря этому эффекту мы наблюдаем небольшую разницу между углеродным и протонным параметрами порядка, которые были определены из анализа Монте-Карло траекторий (Рис. 3.26). Но эта разница намного меньше, чем разница между протонными и углеродными параметрами, определенными из ЯМР-экспериментов. Это несоответствие никак не может быть объяснено ошибкой эксперимента, для этого оно слишком значительно. Одной из возможных причин, которая могла бы объяснить наблюдаемую в эксперименте разницу между углеродными и протонными параметрами порядка, может быть тот факт, что возбуждение протонов и углеродов в эксперименте осуществлялось 900-импульсом и методом кросс-поляризации, соответственно. Если образец динамически гетерогенен, то нельзя исключить того, что кросс-поляризация с разной эффективностью возбуждает более и менее подвижные углероды (уровень подвижности определяет степень усреднения протон-углеродного дипольного взаимодействия, а значит и эффективность кросс-поляризации), в то время как 900181 импульс возбуждает все магнитные ядра одинаково. Для того, чтобы проверить это предположение, мы специально измерили спад спин-решеточной релаксации углеродов с возбуждением не кросс-поляризацией от протонов, а 900-импульсом. В результате оказалось, что способ возбуждения углеродов в релаксационном эксперименте никак не сказывается на скорости спин-решеточной релаксации, то есть это не может служить причиной наблюдаемой разницы в углеродном и протонном параметрах порядка быстрого движения. Следовательно, модель динамики полилизина, которая включает только два типа движения (обозначенные ранее как I и II), не может адекватно объяснить весь набор экспериментальных данных. Очевидно, что в полилизине существует еще один тип движения, который приводит к заметному усреднению протон-протонного дипольного взаимодействия и в то же время не сказывается существенно на величине протон-углеродного взаимодействия. Исходя из описанных выше свойств протонных и углеродных релаксационных экспериментов, можно сделать вывод о том, что этот дополнительный тип движения не связан с реориентацией боковых цепей, а, скорее всего, является возвратно-поступательным движением боковых цепей друг относительно друга. В этой связи крайне уместно вспомнить о работе [91], в которой авторы предложили модель диффузии дефектов вдоль основной цепи полипептидов и белков. В этой работе исследовалась динамика нескольких белков и полипептидов в твердом состоянии с помощью различных экспериментов на протонах и дейтеронах. Напомним, что дейтероны, как и углероды, дают информацию только о реориентационных движениях цепи. Анализ показал, что амплитуда молекулярных движений в очень широкой частотной области, определяемая из дейтеронных и протонных экспериментов разная: протоны показывают значительный уровень молекулярной подвижности, хотя амплитуда вращательных движений (дейтеронные данные) очень низкая. (Именно такую картину наблюдаем и мы при сравнении углеродных и протонных данных в полилизине, хотя в нашем случае пока речь идет только о движениях в наносекундной области.) Это видимое противоречие между двумя типами экспериментов было объяснено моделью диффузии дефектов. Дефект в данном случае понимался как локальное расширение объема структуры, нарушение равновесной геометрии полипептидной цепи. Такой дефект приводит к 182 изменению межпротонных расстояний, но почти не вызывает реориентации участков цепи. В случае полилизина таким дефектом может быть локальное увеличение расстояния между двумя противолежащими бета-слоями. При диффузии вдоль цепи такой дефект вызывает скользящие движения боковых цепей противолежащих бетаслоев друг относительно друга, что не сопровождается значительной их реориентацией. Этот тип движения схематически изображен на Рис. 3.28. Другим возможным механизмом подобного дефекта может быть изгиб полипептидной цепи в плоскости бета-слоя (а не в перпендикулярной к нему плоскости, как показано на Рис. 3.28). Это также может вызвать смещения боковых цепей противолежащих бета-слоев относительно друг друга без заметной реориентации. Очевидно, что движение подобного рода приведет к существенному усреднению дипольного взаимодействия между протонами различных боковых цепей, которое составляет 2025% от общего межпротонного взаимодействия (см. выше) и не приведет к усреднению первых двух вкладов в КНН и протон-углеродного взаимодействия. Обозначим этот тип движения цифрой III. Рисунок 3.28. Схематическое изображение процесса диффузии дефектов вдоль основной цепи полилизиновой структуры, состоящей из параллельных бета-слоев. Таким образом, допущение о третьем типе движения может, по крайней мере, качественно объяснить наблюдаемую в эксперименте разницу между протонным и углеродным параметрами порядка быстрого движения. Мы не можем обнаружить этот тип движения в компьютерном моделировании, поскольку длина цепи (Рис. 3.24) явно слишком коротка для диффузии дефектов. Это движение не связано с преодолением больших энергетических барьеров, вызванных стерическими препятствиями, значит, энергия активации этого движения не слишком высока. Что касается времени корреляции этого движения, то оно определяется не только скоростью диффузии дефектов, но и их концентрацией. Поскольку в протонном 183 эксперименте мы видим только один тип движения со временем корреляции в наносекундной области, следовательно, времена корреляции движений I и III отличаются ненамного. Из Рис. 3.27 видно, что с увеличением уровня гидратации разница между протонным и углеродным параметрами порядка уменьшается. Это говорит о том, что усреднение протон-протонного дипольного взаимодействия движением III становится менее заметным на фоне вращательных движений С-Н векторов боковых цепей. Провести более детальное описание физической природы этого типа движения имеющиеся данные пока не позволяют. Теперь рассмотрим природу медленного движения (тип II). Рис. 3.29 представляет параметры порядка этого движения, полученные из протонного и углеродного экспериментов. Наименьшее значение протонного S2 (нижняя граница закрашенного прямоугольника на Рис. 3.29) было рассчитано из минимальной величины КНН, полученной из моделирования (1.5⋅1010 с-2), произведения (1- S2HH )KHH, равного 0.6⋅1010 с-2 (Таб. 3.2) и максимальной величины произведения S2f(1S2S)KHH 7⋅108 с-2 (см. выше). Таким образом, для медленного движения мы наблюдаем противоположную движения, данных картину: определяемая ниже, чем та амплитуда из протонных же амплитуда, определяемая из углеродных экспериментов. Это означает, реориентации что угловая вектора С-Н амплитуда СН2-группы больше, чем угол реориентация вектора Н-Н той же группы. Заметим, что в конформации «анти» Рисунок 3.29. Параметры порядка медленного движения сухого полилизина, полученные из углеродного (кружки, данные из Рис. 3.17) и протонного (заштрихованный прямоугольник) экспериментов. боковых направление цепей полилизина Н-Н параллельно вектора направлению основной цепи полипептида. Можно предположить, что различие в амплитудах реориентации векторов С-Н и Н-Н 184 может быть вызвано, например, вращательным движением полипептидной цепи вокруг оси, параллельной основной цепи полилизина. В этом случае вектора Н-Н СН2-групп почти не будут вращаться. Однако при этом угловые амплитуды реориентации векторов С-Н были бы одинаковы для всех четырех углеродов боковой цепи, что противоречит экспериментальным данным (Рис. 3.29). Значит, реориентация полилизиновой структуры как целого не может объяснить наблюдаемую разницу в угловых амплитудах движений С-Н и Н-Н векторов. По нашему мнению, наиболее вероятным физическим механизмом медленного движения являются скачкообразные поворотно-изомерные конформационные переходы боковых цепей, показанные на Рис. 3.30. В этом случае все вектора Н-Н будут поворачиваться на 180 градусов, что не будет приводить к усреднению диполь-дипольного взаимодействия внутри одной метиленовой группы (cos2(00)=cos2(1800)=1, см. ур-е 3.19). Такое движение будет приводить к частичному усреднению взаимодействия только между протонами различных боковых цепей. Очевидно, что в этом случае общий параметр порядка медленного движения протонов будет выше, чем для углеродов. Из Рис. 3.30 легко понять, почему параметр порядка медленного движения для бета-углерода существенно выше, чем для остальных углеродов: конформационные переходы, показанные на Рис. 3.30, приводят к реориентации векторов С-Н всех метиленовых групп боковой цепи за исключением бета-группы. Очевидно, что такие переходы связаны с некоторой реориентацией связи Cα-Cβ, поэтому параметр порядка бета-углерода не равен точно Рисунок 3.30. Переходы между конформациями «анти» и «син» боковой цепи полилизина, объясняющие экспериментально наблюдаемое неравенство (S2)protons>(S2)carbons. 185 единице. Угловая амплитуда реориентации векторов С-Н при таких конформационных скачках достаточно большая, поэтому высокое значение параметра порядка объясняется низкой населенностью конформаций «син» боковой цепи. Высокая энергия активации и длинное время корреляции этого движения легко объяснимы стерическими препятствиями в плотноупакованной структуре, которые необходимо преодолевать при таких конформационных переходах. Таким образом, детальный сравнительный анализ данных по протонной и углеродной релаксации, а также результаты компьютерного моделирования динамики полилизина позволили получить подробную физическую картину конформационной динамики полилизина. Мы смогли обнаружить три различных типа движения, физическая природа которых была описана выше. Следует подчеркнуть, что получение такого рода информации в принципе было бы невозможно без совместного анализа данных по релаксации различных магнитных ядер в рамках единого математического формализма. Благодаря именно сравнительному характеру анализа стал возможен переход от безразмерных параметров порядка к наглядным физическим моделям молекулярных движений. В то же время, из-за быстрой спиновой диффузии между протонами и, соответственно, невозможности получить селективную динамическую информацию из протонных экспериментов, такой подход применим только к простым гомогенным системам, таким как гомополипептиды в однородной конформации. Что касается белков, то здесь совместный анализ протонной и углеродной релаксации приводит к очень большой неопределенности в интерпретации данных [212]. Тем не менее, анализ динамики полилизина, описанный выше, наглядно демонстрирует преимущества сравнительного количественного анализа данных ЯМР-экспериментов на различных магнитных ядрах. С теми или иными модификациями, а также с использованием других магнитных ядер (15N и 2H) этот подход может быть использован и в других, более сложных системах. 186 3.4. Применение твердотельной обменной ЯМР-спектроскопии для исследования низкочастотной внутренней динамики белков. 3.4.1. Исследование динамики основной цепи барстара и полиглицина с помощью последовательности tr-ODESSA. В этой части работы будут описаны проведенные нами исследования динамики белков с использованием одномерной обменной твердотельной ЯМР-спектроскопии с вращением под магическим углом. Методология и математическое описание этих методов были подробно описаны в первой главе. Обменная спектроскопия давно и с успехом применяется в жидкостном ЯМР, а в твердом состоянии ее применение было ограничено рядом методических проблем, основной из которых была низкая чувствительность. До конца 90-х годов прошлого столетия твердотельная обменная спектроскопия использовалась только при исследовании простых модельных соединений и некоторых синтетических полимеров. Первой работой, в которой твердотельная обменная спектроскопия была применена для исследования биополимеров, стало наше исследование динамики основной цепи барстара и полиглицина [124]. Основной целью этой работы было выяснение принципиальной возможности детектировать медленные (в миллисекундном - секундном диапазонах) конформационные движения белков с помощью твердотельных обменных экспериментов и идентификация основных методологических проблем при проведении подобных экспериментов. 3.4.1.1. Условия эксперимента и результаты. Белок барстар состоит из 89 аминокислотных остатков, он является внутриклеточным ингибитором внеклеточной эндорибонуклеазы барназы. Барстар связывается с барназой с константой диссоциации 2·10-14 M и тем самым предотвращает активность барназы внутри клетки. Взаимодействие барстара и барназы – одно из наиболее сильных и быстрых известных белок-белковых взаимодействий, и потому эти белки являются удобной и частой используемой модельной системой, на которой такие взаимодействия исследуются различными методами. Барстар был выбран нами для данного исследования по нескольким причинам. Во-первых, биохимические свойства, также как и его структура известны достаточно хорошо [254-257]. Во-вторых, барстар – очень небольшой белок, а это 187 обеспечивает высокую концентрацию метки (магнитных ядер) в образце и, следовательно, высокое отношение сигнала к шуму. Как упоминалось в первой главе, для обменных экспериментов наиболее удобными являются магнитные ядра, имеющие наибольшую степень АХС. В белках таковыми являются ядра, расположенные на основной цепи, прежде всего ядра азота и карбонильные углероды. В данной работе обменные эксперименты проводились в полиглицине на карбонильных углеродоах-13 естественного содержания, а в барстаре – на ядрах 15 N, для чего белок был тотально обогащен изотопом 15 N. Обогащенный барстар был приготовлен Л.О. Ягодиной по методике, разработанной А. Шульгой (Институт Биоорганической Химии им. Шемякина и Овчинникова, Москва). Методика приготовления подробно описана в [124]. Полиглицин был закуплен в фирме Sigma (молекулярный вес 5000-10000) и использован без дополнительной очистки. Как и в случае релаксационных измерений, мы исследовали максимально высушенные и увлаженные до уровня 0.2 г Н2О на г сухого белка (полипептида) образцы в порошкообразном состоянии. Увлажнение проводилось в вакуумном эксикаторе. ЯМР-эксперименты проводились на спектрометре Varian Inova с резонансной частотой для протонов 400 МГц. Использовалась измерительная головка с ВМУ с диаметром ротора 7 мм. Обменные эксперименты проводились с использованием импульсной последовательности trODESSA [21], которая была описана в первой главе (Рис. 1.6). Для каждого образца при каждой температуре параллельно с обменными экспериментами также измерялись и спады спин-решеточной релаксации с помощью стандартного метода [211]. На Рис. 3.31 и 3.32 представлены твердотельные спектры барстара и полиглицина. Для сухих и увлажненных образцов спектры были практически одинаковыми. В полиглицине наблюдается два пика, соответствующие СН2 и СОуглеродам и ssb пики. В спектрах барстара главный пик при 120 м.д. соответствует основной доле ядер азота белка, которые расположены на основной цепи. Два пика при 75 и 30 м.д. соответствуют ядрам азота боковых цепей аминокислотных остатков His, Arg, Lys, Gln, Asn и Trp. При скорости ВМУ 5 кГц все изотропные и ssb пики хорошо разрешены. Однако чувствительность обменного эксперимента к молекулярной динамике зависит от периода эволюции (см. Главу 1), который в 188 эксперименте tr-ODESSA определяется скоростью вращения под магическим углом, он равен половине вращения. периода Таким образом, необходимо вращать образец как можно медленнее, но так, чтобы спектральное разрешение и отношение сигнала к шуму не были слишком качестве низкими. оптимума В скорость вращения была выбрана 2 кГц для барстара (15N) и 3 кГц для полиглицина (13С). Наложение ssb пиков и линий спектра, соответствующих азотам боковых цепей, в данном случае роли не Рисунок 3.31. Твердотельный 15N-спектр 15 тотально N-обогащенного барстара 15 (резонансная частота для ядер N 40.5 МГц, протонный «декаплинг» 70 кГц, t=200 С) при скорости ВМУ 5 кГц (вверху) и 2 кГц (внизу). Обозначения: SC – линии спектра, соответствующие азотам боковых цепей; SSB – spinning side band пики. играет, поскольку анализировалась амплитуда только центрального относящегося к азотам основной цепи. А в случае полиглицина анализировалась амплитуда линии карбонильных углеродов. Рисунок 3.32. Твердотельный спектр ядер 13С естественного содержания в полиглицине. Резонансная частота для углеродов 100.5 МГц, протонный «декаплинг» 70 кГц, скорость ВМУ 3 кГц. Линии спектра без обозначений соответствуют ssb – пикам. 189 пика, Следует отметить, что мы также пробовали провести обменные эксперименты на карбонильных углеродах основной цепи барстара. Но сигнал от ядер естественного содержания был намного меньше сигнала от ядер 13 С 15 N, и потому требовал очень большого времени накопления для регистрации подробных зависимостей амплитуды линии от времени смешивания. Поэтому мы ограничились экспериментами только на ядрах 15N. На Рис. 3.33 представлены типичные обменные (зависимость от времени смешивания в обменном эксперименте) и спин-решеточные релаксационные спады на ядрах 15 N и 13 C соответственно в барстаре и глицине. Простое визуальное сравнение этих спадов показывает, что в обоих образцах существуют обменные процессы с характерным временем короче, чем Т1. Для того, чтобы исключить влияние спин-решеточной релаксации на наблюдаемый обменный процесс, обменные спады для каждого образца при каждой нормализовались решеточной температуре на спады релаксации, представлялись спин- то есть в виде Anorm(τmix)=Aexch(τmix)/ASL(τmix), Aexch и ASL – где соответственно обменные и релаксационные спады, τmix- время смешивания. Поскольку набор времен обменном смешивания эксперименте и набор временных задержек релаксационном эксперименте совпадали, в в не практически нормализация выполнялась за счет Рис. 3.33. Типичные примеры обменных (кружки) и релаксационных (треугольники) спадов в сухом полиглицине и увлажненном барстаре. 190 аппроксимации релаксационных спадов биэкспоненциальной функцией, которая затем подставлялась в ASL(τmix). На Рис. 3.34 Рисунок 3.34. Нормализованные обменные спады для увлажненного (h=0.2) барстара при различных температурах. Сплошная линия на левом рисунке – биэкпоненциальная аппроксимация обменного спада при +500 С во временнóм участке от 20 мс до 8 с. и 3.35 представлены нормализованные обменные спады для сухого и увлажненного барстара при различных температурах. На Рис. 3.36 представлены аналогичные обменные спады для полиглицина. Из этих рисунков видно, что за исключением увлажненного барстара при высоких температурах обменные спады не проявляют никакой температурной зависимости. Это говорит о том, что наблюдаемый обменный процесс является не чем иным, как спиновой диффузией. 3.4.1.2. Спиновая диффузия. Для количественного описания обменного эксперимента мы воспользуемся математическим формализмом, изложенным в первой главе. В общем случае зависимость интенсивности линии от времени смешивания для эксперимента trODESSA определяется ур-ем (1.45). Для простейшего случая обмена (будь то спиновый обмен или реориентация тензора АХС) между двумя равновероятными положениями обменная матрица K, (см. ур-е 1.9), имеет вид: 191 1 ⎛ ⎜ −k − T 1 K =⎜ ⎜ ⎜ k ⎝ ⎞ ⎟ ⎟, 1⎟ −k − ⎟ T1 ⎠ k (3.22) где k – вероятность перескока из одного состояния в другое. Тогда параметры Qij(τm) (см. ур-е 1.45) с учетом ур-й (1.33) и (1.36) будут равны: Qij (τ m ) = τm 1 − T1 e 4 ⎛ 1 + exp ( −2kτ m ) 1 − exp ( −2kτ m ) ⎞ ⎜ ⎟ ⎝ 1 − exp ( −2kτ m ) 1 + exp ( −2kτ m ) ⎠ . (3.23) И в этом случае нормализованный обменный спад будет выглядеть таким образом: ⎛ ⎛ τ I (τ m ) ⎡ = ⎢1 − Pex ⎜⎜1 − exp ⎜ − m I (0) ⎢⎣ ⎝ τ ex ⎝ ⎞ ⎞⎤ ⎛ τm ⎞ ⎟ ⎟⎟ ⎥ exp ⎜ − ⎟ , ⎝ T1 ⎠ ⎠ ⎠ ⎦⎥ I 11 − I 12 (3.24) , I ij = ∑ (−1) M I Mij 0 , а I Mij 0 рассчитываются по где I (0) = I 11 = I 22 , τ ex = 1 2k , Pex = 11 2I M Рисунок 3.35. Нормализованные обменные спады в сухом барстаре при различных температурах. Для сравнения представлен также спад в увлажненном барстаре при 00 С. Рисунок 3.36. Обменные спады карбонильных углеродов в сухом и увлажненном полиглицине при различных температурах. 192 Рисунок 3.37. Схема спинового обмена между двумя магнитными ядрами, которые, в свою очередь, участвуют в молекулярном движении – скачках между двумя равновероятными положениями. ур-ю (1.41) (нижний индекс «0» соответствует центральному пику). Теперь рассмотрим более сложный случай, когда два магнитных ядра участвуют в молекулярном движении и в то же время между этими ядрами происходит спиновый обмен. Схема такого обмена представлена на Рис. 3.37. Два магнитных ядра участвуют в скачках между двумя равновероятными ориентациями – для одного ядра между ориентациями 1 и 2, а для другого ядра – между ориентациями 3 и 4. Для простоты полагается, что параметры молекулярного движения для двух ядер одинаковы. В то же время между двумя ядрами происходит процесс спинового обмена. Сеть обменных процессов между четырьмя положениями обозначена на Рис. 3.37 стрелками. Скорость молекулярной реориентации обозначена как kMR, а спинового обмена – kSE. Обменная матрица для такой системы выглядит следующим образом: ⎛ ⎜ −2k SE ⎜ ⎜ ⎜ K =⎜ ⎜ ⎜ ⎜ ⎜ ⎜ ⎝ − k MR − k MR 1 T1 k MR kSE −2k SE − kMR − k SE k SE k SE k SE 1 T1 kSE −2kSE − k MR − kMR ⎞ ⎟ ⎟ ⎟ k SE ⎟ ⎟ . (3.25) ⎟ k MR ⎟ ⎟ 1⎟ −2k SE − k MR − ⎟ T1 ⎠ k SE 1 T1 При допущениях I 13 = I 14 = I 23 = I 24 и I 12 = I 34 , можно получить следующее выражение для обменного спада: 193 ⎛ ⎛ τ I (τ m ) ⎡ = ⎢1 − P1 ⎜1 − exp ⎜ − m I (0) ⎣⎢ ⎝ τ1 ⎝ где P1 = ⎛ ⎞⎞ ⎛ τ m ⎞ ⎞⎤ ⎛ τm ⎞ ⎟ ⎟ − P2 ⎜ 1 − exp ⎜ − ⎟ ⎟ ⎥ exp ⎜ − ⎟ , ⎠⎠ ⎝ τ 2 ⎠ ⎠ ⎦⎥ ⎝ T1 ⎠ ⎝ (3.26) I 11 + I 12 − 2 I 13 I 11 − I 12 1 1 P = , , τ1 = , τ2 = . Таким образом, 2 11 11 4I 2I 2(k MR + k SE ) 4k SE обменный спад состоит из двух компонент, характерное время одной из них определяется только скоростью спиновой диффузии, а другой – суммой скоростей спиновой диффузии и молекулярной реориентации. Из ур-я (3.26) видно, что молекулярное движение может быть зарегистрировано только если оно быстрее, чем скорость спиновой диффузии, то есть если kMR≥kSE. В противном случае молекулярное движение в принципе не может быть обнаружено с помощью обменного эксперимента. Хотя ур-е (3.26) описывает упрощенную схему (Рис. 3.37), оно наглядно объясняет, почему в увлажненном барстаре при высоких температурах форма обменного спада зависит от температуры, а при низких – нет (Рис. 3.34): при высоких температурах соблюдается неравенство kMR≥kSE, в то время как при низких температурах скорость молекулярной реориентации ниже, чем скорость спиновой диффузии (напомним, что скорость спиновой диффузии от температуры не зависит). Отдельного рассмотрения заслуживает природа обменного спада, которая наблюдалась на карбонильных углеродах в полиглицине (Рис. 3.36). Поскольку форма этого спада не проявляет температурной зависимости, наблюдаемый в полиглицине обменный процесс был первоначально отнесен нами также к спиновой диффузии между ядрами 13С [124]. Однако сейчас мы можем утверждать что это не совсем так. Естественное содержание ядер 13С - немногим более одного процента и среднее расстояние между этими ядрами в полипептиде достаточно большое. Скорость спиновой диффузии имеет очень сильную зависимость от расстояния между ядрами и потому в этом случае она может проявляться только при временах смешивания порядка долей и единиц секунд. Что же касается более коротких времен, то там обменный спад объясняется наличием дипольного взаимодействия углеродов с ковалентно связанными ядрами 14 N, находящимися в пептидной связи. Это взаимодействие может модулировать резонансную частоту так же, как и реориентация тензора АХС. А характерное время этой модуляции определяется скоростью перескока спина ядер 14 N с одного зеемановского уровня на другой, то 194 есть скоростью спин-решеточной релаксации. Поскольку ядра 14N – квадрупольные, их время релаксации Т1 достаточно короткое, оно имеет величину порядка единиц и десятков миллисекунд. Это так называемый RIDER-эффект (Relaxation-Induced Dipolar Exchange with Recoupling) [130,131], упоминавшийся в первой главе. Следовательно, динамика полипептидной цепи может исследоваться с помощью обменных экспериментов на карбонильных и альфа-углеродах только в 15 N- обогащенных образцах (эти ядра имеют очень длинное Т1). В противном случае, взаимодействие 13С-14N должно быть каким-либо образом подавлено. Интересно отметить, что при длинных временах смешивания наблюдается некоторая разница в форме обменного спада между сухим и увлажненным полиглицином (Рис. 3.36) – в увлажненном образце скорость обмена меньше, чем в сухом. Скорее всего, эта разница обусловлена различной плотностью упаковки сухого и увлажненного полиглицина: в увлажненном образце молекулы воды находятся между полипептидными цепями, и потому среднее расстояние между ядрами 13 С несколько больше, чем в сухом образце. Поскольку скорость спиновой диффузии пропорционально расстоянию между ядрами в минус шестой степени, это может объяснить замедление спиновой диффузии в увлажненном образце. Форма обменного спада, обусловленного спиновой диффузией в барстаре (правая часть Рис. 3.34 и Рис. 3.35), не может быть описана одной экспонентой. Это вполне естественно, поскольку в белке существует распределение межъядерных расстояний, соответственно, это приводит к распределению характерных времен спиновой диффузии. Мы попробовали описать форму обменного спада исходя из пространственной структуры барстара. Мы допустили, что любой пары ядер 15 Nв белке вероятность спинового обмена между ними определяется следующим образом: kij = A , rij6 (3.27) где А – подгоночный параметр, он зависит от ряда параметров спиновой системы [258], которые нам априорно не известны. Для того, чтобы построить обменный спад, используя ур-е (1.45), необходимо ij , которые знать интенсивности кросс-пиков двумерного обменного спектра I MN 195 определяются ур-ем (1.41) (поскольку мы анализируем только центральный ij изотропный пик, N=0). Величины I MN зависят от скорости ВМУ, элементов тензора АХС, резонансной частоты и эйлеровых углов, определяющих ориентации тензора АХС в положениях i и j. Диагональные элементы тензора АХС были определены нами по интенсивности ssb-пиков по алгоритму Херцфельда-Бергера [259], в результате было получено: σ11=108 м.д., σ22=-30 м.д. и σ33=-78 м.д. В расчетах мы допустили, что эти элементы одинаковы для всех ядер азота основной цепи. Углы Эйлера для всех ориентаций тензора АХС, соответствующих различным атомам 15N основной цепи, были рассчитаны исходя из известной пространственной структуры барстара (файл 1BTA из Brookhaven Protein Data Bank [257]). Хотя в PDB файле нет информации об ориентации тензоров АХС, для данных расчетов абсолютная ориентация по отношению к молекулярной системе координат нам и не нужна, ij поскольку вычисления интенсивностей I MN предполагают порошковое усреднение. Нам необходимо только знать, как тензора АХС различных ядер ориентированы друг относительно друга. В расчетах ось x тензора АХС в каждом случае ориентировалась вдоль связи N-C (здесь C – карбонильный углерод предыдущего аминокислотного остатка), а ось y была перпендикулярна плоскости C-N-Ca. Расчеты были проведены для 88 аминокислотных остатков барстара (всего в барстаре 89 остатков, но первый в расчет не принимался, поскольку азот концевой NH3 группы имеет почти изотропный АХС и короткое Т1). Суммирование по индексу M в ур-и (1.45) проводилось от -3 до 3, индекс N, как упоминалось выше, был равен 0. Вероятности переходов Qij(τm) были получены путем численной диагонализации обменной матрицы. Размер этой матрицы был 88×88, а ее элементы kij определялись исходя из ур-я (3.27). Межъядерные расстояния были также ij определены из PDB файла. Зная интенсивности I MN и вероятности переходов Qij(τm), обменный спад может быть легко рассчитан, используя ур-е (1.45). Неизвестный параметр А (Ур-е (3.27)) влияет только на степень сжатия-растяжения обменного спада вдоль оси х, а форма распределения характерных времен обмена при этом никак не меняется. Рассчитанный по структурным данным обменный спад спиновой диффузии представлен на Рис. 3.38 вместе с экспериментальными данными. Параметр А (ур-е 196 (3.27)) был выбран таким образом, чтобы обеспечить соответствие наилучшее экспериментальной и теоретической кривых. Но как видно из Рис. 3.38, формы спадов несколько различаются, и ни при каком значении А идеального совпадения получить невозможно. Это несоответствие не является большим сюрпризом, поскольку в расчетах был использован ряд допущений. В частности, мы предполагали, что все ядра имеют одинаковые тензоры АХС, не учитывалась разница между изотропными химическими сдвигами, которая Рисунок 3.38. Обменные спады в барстаре (данные из Рис. 3.34 и 3.35) и теоретическая кривая (сплошная линия), рассчитанная по структурным данным, см. детали в тексте. также может влиять на скорость спиновой диффузии [260]. Кроме того, в расчет не принимался эффект молекулярного движения, то есть предполагалось, что все ядра имеют только одну ориентацию. Однако если все или часть ядер участвуют в медленном молекулярном движении, то размерность обменной матрицы будет не 88×88, а больше. Все это может обусловить разницу между экспериментальной и теоретической кривыми на Рис. 3.38. Параметр А, при котором наблюдалось наилучшее соответствие между экспериментом и расчетом (Рис. 3.38), оказался равным 100-150 Å6с-1. Расстояние между азотами соседних аминокислотных остатков в белке составляет примерно 3 Å. Отсюда по ур-ю (3.27) легко определить, что скорость обмена между соседними азотами – примерно 0.2 с-1. 3.4.1.3. Молекулярное движение основной цепи барстара. Основная цель данного исследования – получить информацию о молекулярном движении основной цепи. Эта информация содержится только в начальном участке 197 обменных спадов увлажненного барстара (левая половина Рис. 3.34). Для определения параметров молекулярного движения необходимо разделить компоненту, относящуюся к спиновой диффузии, от компоненты молекулярного движения. Простое разложение спадов на несколько экспоненциальных компонент может привести к некорректному результату, поскольку компонента спиновой диффузии имеет сложную форму, и наложение нескольких обменных процессов, каждый из которых имеет распределение характерных времен, дает весьма запутанную картину. Для выделения компоненты молекулярного движения была использована следующая феноменологическая процедура. Как видно из Рис. 3.34, при t=500 C компонента молекулярного движения спадает на временнóм участке от 0 до 20 мс, в то время как на более длинных временах смешивания наблюдается в основном только процесс спиновой диффузии, так как от 20 до 100 мс можно наблюдать почти горизонтальное плато в обменном спаде. Обменный спад при 500 С был аппроксимирован суммой двух экспонент на временнóм участке от 20 мс до 8 с. Эта аппроксимация и ее экстраполяция к нулю показаны на Рис. 3.34 сплошной линией. Таким образом была получена компонента спиновой диффузии. Более корректно было бы провести эту процедуру при более высоких температурах, когда скорость молекулярного движения вообще вышла бы за динамический диапазон обменного эксперимента. Мы провели измерения также при 650 и 800 С, но после этого пропала воспроизводимость результатов при более низких температурах (в то время как при нагревании до 500 С последующая воспроизводимость результатов при низких температурах была стабильной). Это свидетельствует о том, что при нагревании до температуры более 500 С с увлажненным белком происходят некие необратимые изменения, скорее всего, термическая денатурация. Поэтому данные при высоких температурах мы не анализировали. Полученная компонента спиновой диффузии вычиталась из обменных спадов при t=500, 370 and 250 C, и таким образом были получена компонента обменного спада, относящаяся к молекулярному движению (Рис. 3.39). Безусловно, описанная выше процедура разделения компонент спиновой диффузии и молекулярного движения – весьма приблизительная и нестрогая, поэтому такой анализ может дать 198 только приблизительное представление о параметрах медленного молекулярного движения. Для количественного анализа спады, представленные на Рис. 3.39, описывались простым феноменологическим выражением: ⎛ ⎛ τ ⎞β ⎞ I (τ m ) = exp ⎜ − ⎜ m ⎟ ⎟ , ⎜ ⎝ τ MR ⎠ ⎟ ⎝ ⎠ (3.28) где τMR – характерное время молекулярной реориентации Рисунок 3.39. Компонента обменного спада, относящаяся к молекулярному движению, при трех ремпературах. Сплошные линии – подгонка по ур-ю (3.28). (т.е. движения), β – параметр, описывающий распределение времен τMR. Из анализа спадов было определено, что β=0.4±0.2 для температур 250 и 370 С, при температуре 500 С спад был очень быстрым, так что β определить было практически невозможно из-за недостатка экспериментальных точек. Времена τMR и оценка энергии активации медленного движения представлены на Рис. 3.40. Длинное время корреляции и высокая энергия активации (напомним, данная энергия активации не является мерой высоты активационного барьера, см. комментарий на эту тему в параграфе 3.3.1.2) свидетельствуют о том, что наблюдаемое движение, скорее всего, имеет характер редких скачкообразных конформационных переходов, а не диффузионных колебаний внутри одного энергетического минимума. Важно отметить, что медленное движение, наблюдаемое в увлажненном барстаре, отсутствует в высушенном белке и в полиглицине. Значит, параметры этого движения специфичны к структуре биополимера и уровню гидратации. Заметим, что важную информацию об этом движении можно также получить и из относительного веса компоненты молекулярного движения. В работе [124] нами были сделаны приблизительные оценки угловой амплитуды реориентации тензора АХС, исходя из относительного веса этой компоненты. Ниже 199 будет представлен более строгое и детальное исследование параметров медленного движения основной цепи барстара на основе совместного анализа данных по обмену и релаксации, поэтому эти оценки мы здесь приводить не будем. Обобщая представленные результаты, заметим, что данная работа представляет, прежде всего, методический интерес. Впервые было наглядно продемонстрировано, обменная спектроскопия Рисунок 3.40. Температурная зависимость времени корреляции τMR, полученная из анализа спадов на Рис. 3.39. Пунктирная линия – подгонка по закону Аррениуса. исследования твердотельная ЯМР- информативна внутренней что для динамики белков в миллисекундном диапазоне. Было показано, что миллисекундная динамика основной цепи зависит от уровня гидратации белка и типа упаковки полипептидной цепи. Один из важных результатов этой работы – демонстрация существенного влияния спиновой диффузии на получаемую из эксперимента информацию о молекулярном движении, что означает необходимость специальных мер, направленных на минимизацию этого эффекта. 3.4.2. Совместный анализ обменных и релаксационных ЯМР-данных – метод SREDA. В этой части диссертации будет описан метод совместного применения обменных и релаксационных ЯМР-экспериментов для исследования динамики основной цепи барстара. В первой главе приводились примеры работ, в которых для исследования динамики одного и того же образца применялось сразу несколько различных ЯМР-методов. Такой комплексный подход позволяет получить более полную и обширную информацию о динамике. В то же время, почти во всех этих 200 работах результаты, полученные различными методами, сопоставлялись только на качественном уровне. Принципиальная новизна данного нашего исследования – количественный совместный анализ данных различных экспериментов. В методическом отношении эта работа во многом совпадает с описанным выше исследованием динамики полилизина с помощью совместного анализа протонных и углеродных релаксационных данных. Оба этих подхода основаны на сопоставлении параметров движения различных физических зондов. В одном случае (исследование динамики полилизина) сопоставлялось движение межъядерных векторов Н-Н и Н-С. В данной же работе сопоставляется движение вектора N-Н и тензора АХС азота основной цепи. Метод совместного анализа обменных и релаксационных данных был назван SREDA – Simultaneous Relaxation and Exchange Data Analysis. Идея этого подхода была опубликована в работе [235]. 3.4.2.1. Условия эксперимента. В данной, как и в предыдущей, работе исследовался 15N-обогащенный барстар. Однако вместо 100% обогащения здесь мы использовали только 15% обогащение белка. Это достигалось использованием смеси 15% 15 N-обогащенного и 85% естественного содержания хлористого аммония как единственного источника азота в среде для роста суперпродуцирующих бактерий. Это было сделано для подавления эффекта спиновой диффузии, который препятствует получению точной информации о молекулярном движении (см. выше): разбавление спиновой системы ядер приводит к увеличению межъядерных расстояний и, следовательно, 15 N к многократному уменьшению скорости спинового обмена kSE (Рис. 3.37). Это позволяло пренебречь влиянием спиновой диффузии, хотя, конечно, уменьшение амплитуды ЯМР-сигнала вело к необходимости значительного увеличения числа накоплений. Эта работа интересна тем, что в ней исследовался барстар в двух состояниях – в виде свободного белка и в форме комплекса с биназой. Это дало возможность сравнения параметров биологических внутренней состояниях. динамики Комплекс барстара барстар-биназа в двух различных приготовлялся путем совместного растворения барстара и биназы в трис-буфере при рН=8.0. Молярная концентрация биназы при этом была в два раза выше по сравнению с барстаром, что 201 обеспечивает комплексообразование для всех молекул барстара. Биназа была с естественным изотопным содержанием, поэтому сигнал от белкового комплекса относился только к барстару, что обеспечивало возможность прямого сравнения данных, полученных на свободном барстаре и на комплексе барстар-биназа. Образцы были в форме лиофильно высушенных порошков, увлажненных в вакуумном эксикаторе до уровня 6%, за исключением нескольких релаксационных экспериментов, которые были проведены на 12% увлажненном образце (см. ниже). ЯМР-эксперименты были проведены на ЯМР-спектрометре Varian Inova 400 с резонансной частотой для ядер 15 N 40.5 МГц. Были измерены спады спин- решеточной релаксации в лабораторной (Т1) и в наклоненной вращающейся ( T1off ρ ) системах координат, а также обменные спады с использованием импульсной последовательности CODEX [25,26]. Измерения T1off проводились по методике, ρ описанной в части 3.2.1., при этом эффективное поле спин-лока B1e и угол θ между B0 и B1e были соответственно 60 кГц и 170. Обменные эксперименты проводились B при частоте ВМУ 3 кГц и одном 1800 импульсе в период эволюции до и после времени смешивания (Рис. 1.7). Таким образом, период эволюции составлял 0.333 мс. Такие значения частоты ВМУ и длительности периода эволюции были выбраны как компромисс между максимально высокой амплитудой центрального пика и максимальной амплитудой обменного спада. Как указывалось в первой главе, последовательность CODEX позволяет выбирать практически любое значение периода эволюции при высоких скоростях ВМУ, но это связано с большим числом 1800 импульсов в периодах до и после времени смешивания. Поскольку эти импульсы неидеальны и их длительность при высоких скоростях ВМУ становится сравнимой с периодом ВМУ, это приводит к искажениям в обменном спаде. Поэтому мы ограничились минимально возможным числом 1800 импульсов. Влияние спин-решеточной релаксации на обменные спады исключалось таким же образом, что и в предыдущей работе: исходные обменные спады делились на спады спин-решеточной релаксации, которые измерялись независимо с помощью стандартной методики [211]. Релаксационные измерения были проведены при трех температурах от 20 до 450 С, обменные спады были измерены только при температуре 250 С. 202 3.4.2.2. Математическое описание метода SREDA. Времена релаксации T1 и T1off ρ ядер азота, как и ядер углерода, обуславливаются диполь-дипольным взаимодействием с ковалентно связанными протонами и описываются ур-ями (3.5) и (3.6). Для ядер 15 N в пептидной цепи белков константа взаимодействия N-H δ равна 3.9⋅109 с-2. Что касается спектральной плотности движения J(ω), то она может быть описана с помощью безмодельного подхода. Этот метод анализа был подробно описан ранее (см. часть 3.3.1.1.). Ключевое положение метода SREDA – применение безмодельного подхода в описании корреляционной функции реориентационного движения одновременно к анализу как релаксационных, так и обменных данных. Поскольку вектор N-H и тензор АХС азота жестко связаны друг с другом, мы предполагаем, что их движение может быть описано одними и теми же временами корреляции. Хотя, строго говоря, форма корреляционной функции для реориентации вектора N-H и тензора АХС не обязательно должна быть одной и той же: если тензор АХС не обладает осевой симметрией и если главная ось не совпадает с направлением N-H вектора, то легко можно придумать такие модели движения, при которых корреляционные функции, относящиеся к движениям вектора и тензора, будут существенно разными. На наше счастье, в реальности тензор АХС ядер 15 N весьма близок к осевой симметрии и направление его главной оси только на ~200 отличается от направления вектора N-H [261]. Поэтому в дальнейшем мы будем пренебрегать этой разницей, хотя для очень точного прецизионного анализа данных несовпадение направлений следует учитывать, и тогда математический анализ данных существенно усложнится. В то же время следует сказать, что при типичной ошибке большинства ЯМР-экспериментов в 5-10% это смысла чаще всего не имеет. Итак, мы полагаем, что форма корреляционной функции, то есть параметры β и τ0, а также энергия активации Ea (см. 3.3.1.1.) одинаковы для релаксации и обмена. А вот что касается параметров порядка для двух типов корреляционной функции (для обменного эксперимента параметр порядка мы определяем как предел нормализованного обменного спада при τm→∞), то они совсем не должны совпадать, потому что даже для одного и того же движения они определяются различными выражениями: 203 π 2π π 2π S2relax = ∫ 0 ∫ ∫ ∫ 0 2 Sexch 0 ρ(θ1 , ϕ1 )ρ(θ2 , ϕ2 ) 0 3(n(θ1, ϕ1 ) ⋅ n(θ2 , ϕ2 )) 2 − 1 dϕ1dθ1dϕ2 dθ2 , 2 π 2π π 2π =∫ 0 I(θ , ϕ , θ , ϕ ) ∫ ∫ ∫ ρ(θ1, ϕ1)ρ(θ2 , ϕ2 ) I(θ11, ϕ11, θ21, ϕ12) dϕ1dθ1dϕ2dθ2 , 0 0 (3.29) (3.30) 0 где ρ(θ,ϕ) - ориентационная функция распределения для вектора N-H (или главной оси тензора АХС), которая, собственно, определяет модель движения, θ и ϕ углы полярной системы координат, n(θ, ϕ) - единичный вектор с ориентацией, определяемой θ и ϕ, I(θ1,ϕ1,θ2,ϕ2) – интенсивность сигнала в обменном эксперименте при условии, что до времени смешивания ориентация главной оси тензора АХС определялась углами θ1 и ϕ1, а после – углами θ2 и ϕ2. Интенсивность I(θ1,ϕ1,θ2,ϕ2) определяется ур-ем (1.49). За счет интегрирования с использованием функции распределения ρ(θ,ϕ), ур-е (3.30) позволяет описывать произвольную модель движения, которая задается функцией ρ(θ,ϕ). (В работе [235] выражение (3.30) было приведено с ошибкой, и часть расчетов была проведена некорректно. Поэтому часть результатов, приводимых в данной части диссертации отличается от результатов, представленных в работе [235].) Напомним, что допущение об осевой симметрии тензора АХС и совпадении главной оси тензора АХС и вектора N-H означает, что функция ρ(θ,ϕ) в ур-ях (3.29) и (3.30) одна и та же. Ранее при анализе релаксационных данных мы описывали каждый тип молекулярного движения набором из четырех микродинамических параметров: параметр порядка, время корреляции, энергия активации и параметр ширины распределения времен корреляции. При совместном анализе релаксационных и обменных данных необходимо уже пять параметров, поскольку для релаксации и обмена параметры порядка различны. С использованием этих параметров, обменный спад в эксперименте CODEX (без учета спин-решеточной релаксации) будет описываться следующим образом: 2 I(τm ) = Sexch 2 + (1 − Sexch ) 204 ∞ ⎛ τm ⎞ ⎛ τ ⎞ ⎜⎝ − τ ⎟⎠ ρ ∫ ⎜⎝ τ0 ⎟⎠ e dτ , 0 (3.31) ⎛ τ⎞ ⎟ - функция распределения времен корреляции, τ0 – время корреляции ⎝ τ0 ⎠ где ρ ⎜ молекулярного движения, температурная зависимость которого определяется законом Аррениуса. Как и в случае с анализом времен релаксации, здесь мы используем функцию распределения Фуосса-Кирквуда (ур-е 2.7b). К сожалению, провести аналитическое интегрирование, как в случае со спектральной плотностью движения, в ур-и (3.31) невозможно. Поэтому при анализе данных приходилось выполнять численное интегрирование, впрочем, с современными компьютерами это не представляет никакой проблемы. При этом проводилась замена переменных, как это описано во второй главе, см. ур-е (2.9). Таким образом, один и тот же набор пяти микродинамических параметров позволяет описать как времена релаксации, так и обменные спады. Конечно, данный математический формализм описания релаксационных и обменных данных наиболее информативен и эффективен для анализа молекулярных движений со временами корреляции в диапазоне 10-4-10-2 с, то есть тем движениям, к которым чувствительны и релаксация, и обмен. Важно отметить, что совместный анализ релаксационных и обменных экспериментов позволяет не только определять безразмерные параметры порядка молекулярных движений, но и получать представление о физической модели 2 движения за счет различной взаимозависимости параметров S2relax и Sexch для различных моделей. Это продемонстрировано на примере четырех различных моделей, представленных в Таб. 3.3. Результаты расчетов, проведенных по ур-ям (3.29) и (3.30), представлены на Рис. 3.41 и 3.42. Из Рис. 3.42 явно видно, что 2 взаимозависимость S2relax и Sexch для разных моделей разная. Безусловно, следует 2 иметь в виду, что если S2relax определяется только самим движением, то Sexch кроме этого зависит и от параметров тензора АХС, резонансной частоты и периода эволюции обменного эксперимента. Поэтому при изменении какого-либо из этих параметров вид кривых на Рис. 3.41 и 3.42 также изменится. Из Рис. 3.42 также 2 хорошо видно, что выбрать модель движения из сопоставления S2relax и Sexch можно только для высокоамплитудных движений, поскольку при высоких параметрах 2 порядка (низких амплитудах) взаимозависимость S2relax и Sexch для разных моделей практически одинакова. 205 Таблица 3.3. Различные модели движения и соответствующие им ориентационные функции распределения. δ(x) обозначает дельта-функцию Дирака, θa обозначает угловую амплитуду для каждой модели. Модель Ориентационная функция распределения ρ(θ,ϕ)=δ(ϕ)(0.5δ(θ)+0.5 δ(θ−θa)) a. Скачки между двумя равновероятными ориентациями ρ(θ,ϕ)=δ(ϕ)(0.2δ(θ)+0.8 δ(θ−θa)) b. Скачки между двумя ориентациями с вероятностями 20% и 80% ρ(θ, ϕ) = c. Диффузионные колебания внутри планарного угла (модель «веер») δ(ϕ) θa ρ(θ,ϕ)=0 ρ(θ, ϕ) = d. Диффузионные колебания внутри конуса при 0<θ<θa при θa<θ<π sin θ 2π (1 − cos θa ) ρ(θ,ϕ)=0 при 0<θ<θa при θa<θ<π Отметим, что до недавнего времени существовал только один подход, позволяющий определять модель внутреннего движения белков непосредственно из ЯМР-данных. Он основан на сравнении амплитуд движения векторов 13C-1H и 1H-1H в СН2 группах. Такие измерения проводились только в растворах, см. работу [262] и ссылки в ней. Этот подход может дать детальную информацию о природе быстрого движения боковых групп в растворах. А метод SREDA позволяет изучать медленные движения основной цепи. 3.4.2.3. Результаты и обсуждение. Рис. 3.43 и 3.44 представляют результаты экспериментов – температурные зависимости времен релаксации Т1 и Т1ρ, а также обменные спады для свободного и связанного с биназой барстара. Даже без какого-либо количественного анализа из Рис. 3.43 и 3.44 можно сделать очевидный вывод: параметры конформационной 206 динамики основной цепи барстара существенно зависят от того, связан барстар с биназой или нет. В самом количественного начале анализа определиться с следует числом молекулярных движений, необходимых для адекватного описания экспериментальных данных. Мы попытались описать температурные зависимости времен Рисунок 3.41. Зависимости параметров 2 порядка S2relax (сплошные линии) и Sexch (пунктирные линии) от угловой амплитуды моделей движения a-d (Таб 2 были проведены при 3.3). Расчеты Sexch значениях скорости ВМУ 3 кГц, АХС Δσ=160 м.д., период эволюции в последовательности CODEX 0.333 мс, резонансная частота для ядер 15N 40.5 МГц. релаксации (Рис. 3.43) допуская существование одного и двух типов молекулярных движений, то есть, используя спектральную плотность движения J(ω) в виде (3.9) и (3.10), соответственно. Из Рис. 3.43 видно, что качество подгонки в первом случае (одно свободного движение) барстара для явно неудовлетворительное. Вдобавок к плохому описанию данных, параметр порядка S2relax , который был получен из подгонки, имел значение около 0.5. Этот результат явно не имеет физического смысла – движение основной цепи с такой высокой амплитудой в нативном глобулярном Рисунок 3.42. Данные Рис.3.41, построенные в координатах (12 S2relax ) - (1- Sexch ). представить очень сложно. Среднее значение параметра порядка быстрого (в субнаносекундном 207 белке диапазоне) Рисунок 3.43. Времена релаксации для свободного (закрашенные значки) и связанного с биназой (незакрашенные значки) барстара. Значки ″×″ обозначают времена релаксации, измеренные для комплекса барстар-биназа при влажности образца 12%. Размер значков соответствует экспериментальной ошибке эксперимента. Пунктирные и сплошные линии – подгоночные кривые, построенные при допущении одного и двух движений, соответственно (см. детали в тексте). движения векторов N-H барстара – примерно 0.9 [263], как и для большинства других глобулярных белков. Таким образом, при анализе данных мы предполагали наличие двух типов молекулярного движения основной цепи с различными временами корреляции. Заметим, что такое предположение хорошо согласуется с результатами анализа динамики полилизина (см. выше). Для комплекса барстарбиназа допущение об одном типе движения приводит к приемлемому качеству подгонки (Рис. 3.43), но для общности мы обрабатывали данные по комплексу также в предположении двух типов движений. Параметр порядка быстрого движения в этом случае близок к единице (см. ниже), и потому введение этого типа движения не оказывает существенного влияния на параметры медленного движения. Для описания данных, представленных на Рис. 3.43 и 3.44, необходимо ввести 2 всего девять микродинамических параметров. Пять из них ( S2relaxS , SexchS , τ0S, βS, EaS) соответствуют медленному движению (буква “S” в индексах обозначает “slow”) и еще четыре ( S2relaxF , τ0F, βF, EaF) относятся к быстрому движению (“F” обозначает 2 “fast”). Очевидно, что вводить параметр SexchF совершенно бессмысленно – 208 Рисунок 3.44. Обменные спады CODEX для свободного (закрашенные значки) и связанного с биназой (незакрашенные значки) барстара в линейном и логарифмическом масштабах при температуре 250 С. Сплошные линии – подгоночные кривые. Подгонка для различных моделей визуально выглядит практически одинаково. обменный эксперимент не может дать никакой информации о наносекундных движениях. Параметры быстрого движения определялись в основном за счет времен релаксации Т1. Совместный количественный анализ обменных и релаксационных данных может быть проведен двумя способами. Во-первых, можно подгонять данные с 2 использованием S2relax и Sexch в виде неизвестных и независимых подгоночных параметров. Затем, исходя из соотношения этих двух параметров порядка, искать наиболее подходящую модель молекулярного движения. Однако из-за недостатка экспериментальных данных и экспериментальной ошибки такой метод в нашем случае приводит к низкой точности определения микродинамических параметров из подгонки. Поэтому мы обрабатывали данные следующим способом. Для каждой из 2 четырех моделей, представленных в Таб. 3.3, зависимости S2relax - Sexch (Рис. 3.42) были аппроксимированы произвольными аналитическими функциями. Использование этих аппроксимаций позволило в процессе подгонки уменьшить 2 число подгоночных параметров на один, поскольку параметр Sexch мог быть 209 выражен (конечно, для каждой модели по-своему) через S2relax . Как показал анализ, это позволило заметно понизить неопределенность результатов подгонки. Хотя, безусловно, при этом для каждой модели движения было необходимо проводить процесс подгонки отдельно. Подгонка заключалась в минимизации среднеквадратичного отклонения ⎡ NR ⎛ T i -T i 1 ⎢ ∑ ⎜ exp i sim RMSD= N R + N C ⎢ i=1 ⎜⎝ Texp ⎣ 2 i ⎞ NC ⎛ Ii*exp -Isim ⎞ ⎟⎟ + ∑ ⎜⎜ max* min* ⎟⎟ ⎠ i=1 ⎝ Iexp − Iexp ⎠ 2 ⎤ ⎥, ⎥ ⎦ (3.32) где NR и NC – число экспериментальных точек в релаксационных и CODEXэкспериментах, соответственно; Texp и Tsim – экспериментальные и теоретически рассчитанные (симулированные) времена релаксации, I*exp и Isim – экспериментальные и теоретические интенсивности центрального (изотропного) max* min* пика при различных временах смешивания в эксперименте CODEX; Iexp и Iexp - максимальная и минимальная экспериментальные интенсивности в обменном эксперименте. Звездочка в параметрах I*exp обозначает коррекцию эффекта спинрешеточной релаксации: Ii* exp = Iiexp ⎛ τ ⎞ exp ⎜ − i ⎟ ⎝ T1 ⎠ , (3.33) где τi – время смешивания для экспериментальной точки i, Iiexp - исходная интенсивность пика, определенная в эксперименте. Величины Isim рассчитывались согласно выражению Iisim = K N I(τi ) , (3.34) где I(τi) – корреляционная функция вращения тензора АХС, ур-е (3.31), KN – нормализовочный коэффициент, пересчитываемый каждый шаг подгонки как 210 NC KN = ∑ Ii*exp i=1 NC ∑ I(τi ) . (3.35) i =1 Минимизация среднеквадратичного отклонения (3.32) проводилась методом Монте-Карло, для каждого набора параметров цикл подгонки состоял из 107 шагов, из Монте-Карло траектории определялись как средние величины микродинамических параметров, так и их среднеквадратичные отклонения. Результаты обработки данных для трех моделей представлены в Таб. 3.4. Результаты для модели “b” (Таб. 3.3) здесь не обсуждаются, поскольку приводят к угловой амплитуде этого движения θa>800, что явно не имеет физического смысла. Временной масштаб и энергии активации двух движений (Таб 3.4) очень хорошо соответствуют параметрам быстрого и медленного движений, которые ранее мы наблюдали в полилизине и лизоциме. Природа этих движений тоже очевидно одна и та же: колебания внутри одного энергетического минимума (быстрое движение) и скачкообразные переходы между различными минимумами (медленное движение). Будет уместно упомянуть, что заметная подвижность основной цепи барстара в низкочастотной области была отмечена ранее при анализе т.н. обменного вклада в скорость поперечной релаксации ядер 15N в растворе [263] (см. часть первой главы 1.8), так что наши твердотельные результаты с ними хорошо согласуются. Одной из причин, объясняющих разницу в динамике свободного и связанного с биназой барстара, может быть различная гидратационная зависимость динамических параметров в этих двух образцах. Чтобы проверить эту возможность, мы провели релаксационные измерения комплекса при одной температуре (250 С) и уровне увлажнения 12% (напомним, что все остальные эксперименты были проведены при 6% увлажнении). Как видно из Рис. 3.43, время релаксации T1ρ при двух уровнях гидратации практически не изменилось. Поскольку T1ρ чувствительно, прежде всего, к низкочастотной динамике, это однозначно свидетельствует о том, что разница в параметрах медленного движения между двумя состояниями барстара вызвана именно образованием белкового комплекса, а не различной гидратационной зависимостью динамики двух образцов. В то же время, время релаксации Т1 211 Таблица 3.4. Микродинамические параметры, полученные из одновременной подгонки релаксационных и обменных данных (Рис. 3.43 и 3.44) для моделей движения a, c и d (Таб. 3.3). Времена корреляции соответствуют температуре 200 С. Угловая амплитуда θa медленного движения была определена из зависимостей, представленных на Рис. 3.41. S2relaxS Скачки между двумя Колебания в планарном угле положениями (модель c) (модель a) свободный барстар- свободный барстарбарстар биназа барстар биназа 0.85±0.01 0.94±0.005 0.84±0.015 0.94±0.005 Колебания в конусе (модель d) свободный барстарбарстар биназа 0.895±0.02 0.94±0.01 θa 26.50±10 16.50±10 480±30 280±10 15.50±1.50 11.50±10 τ0S, мс 0.12±0.08 3.0±1.7 0.1±0.04 2.5±1.5 1.2±1.0 2.8±1.2 0.24±0.01 0.18±0.015 0.25±0.02 0.19±0.02 105±9 190±40 160±40 195±45 0.84±0.05 0.965±0.015 0.89±0.03 0.96±0.02 βS 0.24±0.01 0.18±0.015 EaS, 105±15 200±40 кДж/моль S2relaxF 0.86±0.045 0.96±0.015 τ0F, нс 4±15 130±20 1.0±0.5 120±30 120±100 100±40 βF 0.12±0.05 0.78±0.15 0.12±0.08 0.71±0.14 0.23±0.1 0.73±0.16 10±5 9.5±3 8.5±5 11.5±4 8±4 10±5 RMSD, % 6.2 3.0 6.3 2.9 5.7 2.9 укорачивается при EaF, кДж/моль повышении уровня гидратации (Рис. 3.43). Очевидно, высокочастотная динамика более чувствительна к уровню гидратации. Тем не менее, при 12% увлажнении, Т1 комплекса значительно более длинное, чем Т1 свободного барстара, значит, взаимодействие с биназой явно влияет также и на высокочастотное движение основной цепи. Сравнение результатов по различным моделям (Таб. 3.4) показывает, что все три модели дают одинаковое качество описания результатов и очень близкие значения микродинамических параметров. Это является следствием того, что движение основной цепи белка – низкоамплитудное, а значит, выбрать модель 212 движения непосредственно из экспериментальных данных практически невозможно, см. Рис. 3.42. Тем не менее, можно утверждать, что модель d (колебания в конусе) выглядит наиболее реалистичной. Во-первых, в эксперименте мы наблюдаем интегральный сигнал от всех ядер азота основной цепи, соответственно, модель, наилучшим образом описывающая эксперимент, должна быть интегральной моделью движения всех векторов N-H. Очевидно, что модель скачков между двумя дискретными положениями подходит для этой цели хуже всего, потому что трудно ожидать, чтобы все ядра азота барстара были подвержены скачкам между двумя ориентациями на примерно одинаковый угол. Гораздо логичнее ожидать распределения амплитуд движений для различных участков основной цепи, что в результате должно привести не к дискретной, а к непрерывной модели движения, какими являются модели “c” и “d”. Во-вторых, основная цепь белка является в целом очень жесткой структурой, и модель d представляется наиболее адекватной, поскольку она соответствует наименьшей угловой амплитуде движения θa (Таб. 3.4). Бóльшая часть аминокислотных остатков барстара вовлечена в элементы вторичной структуры, и данные по водородному обмену свидетельствуют о стабильной сети водородных связей для почти всех структурных элементов [263]. Следовательно, относительно большая средняя амплитуда медленного движения основной цепи барстара даже для модели колебаний в конусе может осуществляться, скорее всего, только за счет колебаний элементов вторичной структуры как целого, как это было предположено в работе [263]. Таб. 3.4 показывает, что независимо от модели движения, угловая амплитуда движения основной цепи при переходе от свободного барстара к комплексу уменьшается примерно в полтора раза. Уменьшение амплитуды движения при образовании комплекса – вполне естественный и ожидаемый результат, однако новой и интересной информацией является количественная оценка этого эффекта. Что касается быстрого движения, то можно отметить различие в его временах корреляции, которые в растворах составляют обычно доли наносекунды [35], а мы получаем величины порядка единиц-десятков наносекунд. Есть две возможные причины, объясняющие это расхождение. Во-первых, как уже несколько раз указывалось выше, методами релаксации в растворах можно детектировать только те внутренние движения, которые имеют время корреляции меньше, чем время 213 корреляции броуновского вращения белка как целого. Во-вторых, уровень гидратации белков, использованный в данной работе, недостаточен для полной идентичности динамического поведения белка в твердом состоянии и растворе. Скорее всего, обе эти причины могут играть роль. Низкие величины параметра β (Таб. 3.4), т.е. широкое распределение времен корреляции, объясняются как сложной природой молекулярных движений, так и интегральным характером ЯМР-сигнала: разные участки основной цепи имеют разные динамические параметры, что в результате приводит к уширению распределения времен корреляции, т.е. к уменьшению β. Широкое распределение, в свою очередь, понижает точность определения микродинамических параметров из ЯМР-экспериментов, потому что набор времен смешивания в обменном эксперименте и набор резонансных частот в релаксационном эксперименте ограничены. Это уменьшает шансы сделать обоснованный выбор в пользу той или иной модели движения. В этом смысле данная работа была бы намного более интересной и информативной, будучи выполненной на селективно обогащенном белке с сайт-специфическим соотнесением линий. К сожалению, проведение экспериментов на подобном образце - намного более сложное, долгое и дорогое дело. Это связано как с проведением самих ЯМР-экспериментов (в селективно обогащенном образце намного меньше магнитных ядер, соответственно, необходимо существенно бóльшее накопление сигнала), так и со специальными биохимическими процедурами приготовления образца. Такую работу до сих пор никто не проводил. Обобщая представленные в этой части диссертации результаты, отметим, что предложенный нами подход SREDA дает принципиальную возможность получать представление о физических моделях конформационного движения основной цепи белков непосредственно из экспериментальных данных. Эта возможность основана на том, что релаксационные и обменные эксперименты наблюдают соответственно за движением межъядерного вектора и тензора АХС, которые жестко связаны друг с другом. Это основной принципиально новый результат данной части работы. Хотя выбрать наиболее подходящую модель можно только при условии высокой амплитуды, но даже для низкоамплитудных движений совместный количественный анализ релаксационных и обменных данных позволяет определить микродинамические параметры с гораздо более высокой точностью по сравнению с 214 анализом этих данных отдельно друг от друга. Применение этого метода для исследования динамики основной цепи барстара показало, что в белке существует два типа молекулярных движений со временами корреляции в нано- и в миллисекундном диапазонах. Энергии активации этих движений 10-20 и 100-200 кДж/моль, соответственно (напомним, в случае медленного движения энергия активации имеет смысл не активационного барьера, а наклона температурной зависимости времени корреляции). Вычленение двух типов движения с такими характеристиками довольно типично, оно хорошо согласуется с нашими предыдущими и со многими литературными данными. Связывание барстара с биназой ведет к уменьшению угловой амплитуды медленного движения основной цепи барстара примерно в полтора раза. Это также приводит к значительному уменьшению амплитуды быстрого движения, хотя для наносекундных движений метод SREDA не может дать никаких количественных оценок, поскольку обменный эксперимент не чувствителен к динамике такого временнóго масштаба. Все протестированные модели движения дают одинаковое качество описания данных, однако принимая во внимание усредненный характер динамической информации, извлекаемой из эксперимента, и угловую амплитуду движения, модель колебаний в конусе представляется наиболее реалистичной. Результаты, полученные в этой части диссертации, пока не позволяют делать детальные выводы о роли конформационной динамики в молекулярных механизмах биологического функционирования барстара, но они, безусловно, являются индикатором существования связи между динамикой и функцией в барстаре. 3.4.3. Эффект зависимости скорости спиновой диффузии между ядрами 15 N от частоты ВМУ. При исследовании динамики барстара с помощью обменных методов уже шла речь о спиновой диффузии между магнитными ядрами. Вообще спиновая диффузия – одно из важнейших свойств ядерного магнитного резонанса, интересное как само по себе, так и в качестве инструмента для исследования различных свойств молекул. В частности, именно на спиновой диффузии основан метод определения межъядерных расстояний в твердых образцах, что с недавнего времени позволило определять пространственную структуру таких сложных молекул, как белки 215 [5,6,264]. Но с другой стороны, спиновая диффузия сильно мешает при проведении исследований молекулярной динамики. Выше подробно было описано влияние спиновой диффузии на обменные спады. В релаксационных экспериментах спиновая диффузия – тоже мешающий фактор, поскольку она ведет к выравниванию скоростей релаксации различных магнитных ядер и, соответственно, к потере селективности динамической информации. Поэтому при проведении многих ЯМРэкспериментов стоит проблема подавления спиновой диффузии. Спиновая диффузия между ядрами 13 гомоядерным дипольным взаимодействием гетероядерным взаимодействием 13 15 С или 13 N обусловлена с одной стороны С-13С (или С-1Н (или 15 N-15N), а с другой – 15 N-1Н) с ближайшими протонами. Гетероядерное взаимодействие с протонами обеспечивает равенство расщепления зеемановских уровней (это необходимое условие для флип-флоп процесса между двумя ядрами) для химически неэквивалентных ядер, т.е. ядер имеющих неодинаковый изотропный химический сдвиг, а также ядер с различной ориентацией тензора АХС. осуществляться Соответственно, подавлением подавление либо спиновой гомоядерного 13 С-13С диффузии (15N-15N), может либо гетероядерного 13С-1Н (15N-1Н) взаимодействий. Гомоядерное взаимодействие можно подавить, например, за счет разбавления спиновой системы, то есть, используя естественное содержание магнитных ядер (для 13 С) либо применяя процедуру не- тотального (как для 13С, так и для 15N) изотопного обогащения образца, как это было сделано нами при исследовании динамики барстара, см. выше. Это может решить проблему нежелательной спиновой диффузии, но при этом значительно уменьшается амплитуда сигнала и репрезентативность получаемой информации и, кроме того, становится невозможным проводить корреляционные эксперименты, необходимые для соотнесения линий в спектре, и эксперименты по определению пространственной структуры. Гетероядероное взаимодействие с протонами может быть подавлено стандартным протонным «декаплингом», но этот метод борьбы со спиновой диффузией неприменим по чисто техническим причинам: временные периоды в релаксационных или обменных экспериментах, в течение которых необходимо использовать «декаплинг», составляет единицы и даже десятки секунд. Это совершенно нереально. Более того, в случае обмена между ядрами, имеющими одинаковый изотропный химический сдвиг и одинаковую ориентацию тензора АХС 216 (хотя для белков это довольно редкий случай), протонный «декаплинг» может даже ускорить спиновую диффузию [265]. Другая возможность подавления дипольного взаимодействия – ВМУ, которое является необходимым условием проведения большинства твердотельных ЯМРэкспериментов в белках независимо от спиновой диффузии. Однако в случае ядер 13 С быстрое ВМУ подавляет спиновую диффузию только для углеродов, не имеющих ковалентно связанных протонов, а для алифатических углеродов оно не имеет практически никакого влияния [260]. Очевидно, что причина этого – более сильное взаимодействие алифатических углеродов 13 C-1H (примерно 20 кГц), которое не может быть усреднено практически достижимыми к настоящему времени в стандартных ЯМР-спектрометрах величинами скоростей ВМУ (порядка 20-30 кГц). В случае же ядер 15 N, как гомоядерное 15 N-15N, так и гетероядерное 15 N-1H взаимодействия имеют гораздо меньшую величину, и потому можно ожидать, что в этом случае ВМУ будет более эффективным инструментом подавления спиновой диффузии. Но до недавнего времени этого никто целенаправленно не проверял. Для демонстрации эффекта влияния ВМУ на скорость спиновой диффузии между ядрами 15N мы провели серию обменных экспериментов CODEX на тотально 15 N обогащенном лизоциме из бактериофага Т4. Образец был получен от Проф. Ф. Далквиста (Frederick Dahlquist) из Университета Санта-Барбары, Калифорния, США. Белок был в форме лиофильно высушенного порошка. На примере барстара выше мы уже показали, что в дегидратированном белке молекулярные движения с помощью обменных экспериментов не наблюдаются, а обменный процесс относится только к спиновой диффузии [124]. Для сравнения те же самые обменные эксперименты были проведены на 15 N-обогащенном BOC-глицине (в котором концевая группа NH3 заменена на группу NH, что многократно удлиняет Т1 ядер азота и позволяет исследовать медленные обменные процессы), в котором тоже нет молекулярных движений в миллисекундном и секундном диапазонах времен корреляции. Рис. 3.45 представляет обменные спады, измеренные в этих образцах при различных частотах ВМУ. Для того, чтобы эти спады можно было сравнивать напрямую, период эволюции не зависел от частоты ВМУ, для ВОС-глицина он составлял 0.5 мс, для лизоцима Т4 – 1 мс. Постоянство периода эволюции достигалось за счет различного числа 1800-импульсов до и после времени 217 Рисунок 3.45. Примеры обменных спадов для ВОС-глицина и лизоцима Т4 при различных частотах ВМУ. Сплошные линии – подгоночные кривые, построенные по ур-ю (3.36). Эксперименты были проведены при температурах 200 и 100 соответственно для ВОС-глицина и лизоцима Т4. смешивания при различных частотах ВМУ (см. Рис. 1.7). Влияние спин-решеточной релаксации на обменные спады учитывалось так же, как и раньше (см. 3.4.1 и 3.4.2), т.е. делением обменных спадов на спады релаксационные, которые были измерены отдельно. Эксперименты были проведены на ЯМР-спектрометре Varian INOVA 400 с резонансной частотой для ядер 15 N 40.5 МГц. Измерения, проведенные при нескольких температурах, не обнаружили никакой температурной зависимости для формы обменных спадов, что еще раз подтверждает отнесение наблюдаемого в эксперименте обменного процесса к спиновой диффузии. 218 Для более наглядной демонстрации эффекта зависимости скорости спиновой диффузии от частоты ВМУ обменные спады были подогнаны с использованием выражения: ( ) ⎛ τm I (τ m ) 1 = 1− ⋅ exp ⎜ − I (0) M τ ⎝ SD ⎞ ⎟ ⎠ β + 1 M , (3.36) где τm – время смешивания, I(τm) – интенсивность линии при времени смешивания τm, τSD – характерное время спиновой диффузии, β – феноменологический параметр ширины распределения времен τSD (он имеет тот же смысл и те же граничные значения, что и употребляемый нами ранее параметр β в распределении ФуоссаКирквуда, но математически это другой тип распределения), 1/M – предельное значение нормализованного обменного спада при τm→∞. Если период эволюции достаточно длинный (в нашем случае это условие соблюдается), то М равняется числу ориентаций (или ядер, если речь идет о спиновой диффузии), между которыми происходит обмен [26]. Количественная обработка обменных спадов показала, что в ВОС-глицине β близок к единице, а в лизоциме Т4 β=0.75±0.1. Это говорит о том, в белке существует явно более сложная спиновая система с распределением межъядерных расстояний, что вызывает распределение τSD. Напомним, что скорость спиновой диффузии зависит от диполь-дипольного межъядерного взаимодействия, которое, в свою очередь, обратно пропорционально межъядерному расстоянию в шестой степени. Параметр 1/M оказался равным 0.5±0.06 для ВОС-глицина и 0.14±0.05 для лизоцима Т4. Это означает, что в ВОС-глицине обмен происходит только между двумя ядрами, а в белке число обменивающихся ядер в несколько раз больше. Этот результат подтверждается данными по кристаллографии ВОС-глицина [266]. На Рис. 3.46 представлены четыре молекулы кристаллографической ячейки ВОС-глицина. Две крайние молекулы справа и слева, а также две молекулы в центре рисунка имеют осевую симметрию по отношению друг к другу. Таким образом, в кристалле существует только два типа магнитно-неэквивалентных (т.е. с разной ориентацией тензора АХС) ядер 15 N, что соответствует 1/М=0.5 (ур-е (3.36)). Как видно из Рис. 3.46, наиболее короткое расстояние между ядрами, 3.3 Å, между эквивалентными ядрами, а потому спиновый обмен между ними в обменных спадах 219 Рисунок 3.46. Четыре молекулы ВОС-глицина в кристаллической ячейке (без водородов). Атомы азота обозначены темным цветом. Пунктирные линии со стрелками обозначают межъядерные расстояния (в ангстремах). никак не проявляется, его амплитуда равна нулю. Расстояния между неэквивалентными ядрами составляют 4.8 Å и 5.2 Å. Эти расстояния очень близки, соответственно, времена τSD, соответствующие обмену между этими парами ядер тоже близки, несмотря на зависимость от расстояния в шестой степени. Это приводит к тому, что в эксперименте не наблюдается широкого распределения τSD, и потому β для ВОС-глицина близок к единице. Что касается белка, то там расстояния между азотами соседних аминокислотных остатков меняются от 2.65 Å до 3.65 Å, в зависимости от типа вторичной структуры участка полипептидной цепи. Эти оценки расстояний могут быть легко получены из файлов базы данных Brookhaven Protein Data Bank. Отношение максимального и минимального межъядерных расстояний, возведенное в шестую степень, дает отношение максимального и минимального времен τSD около 7. Это приводит к заметному распределению времен τSD, что мы и наблюдаем в эксперименте. Таким образом, структура основной цепи белка обеспечивает спиновую диффузию вдоль одномерной цепочки, это подразумевает участие в спиновом обмене друг с другом сразу нескольких атомов азота того или иного участка основной цепи. Наибольший интерес в данной работе представляет зависимость τSD от частоты ВМУ. Эти данные для двух образцов представлены на Рис. 3.47. Разница между временами τSD для ВОС-глицина и лизоцима Т4 примерно на порядок величины объясняется различными межъядерными расстояниями в этих образцах, см. выше. Следуя результатам работ [258,260], экспериментальные данные на Рис. 3.47 были 220 описаны линейными зависимостями. Строгий теоретический анализ этих данных хотя и возможен [258], но это не было целью данной работы. Рис. 3.47 наглядно демонстрирует, что использование спиновой диффузии между ядрами 15 N в ЯМР-экспериментах по соотнесению линий и определению структуры белков наиболее эффективно при низких частотах ВМУ: чем ниже частота вращения, Рисунок 3.47. Зависимость τSD от частоты ВМУ для ВОС-глицина и лизоцима Т4. Сплошные линии – описание экспериментальных данных линейными зависимостями. тем быстрее спиновая диффузия. В то же время, эти данные показывают, что точный количественный анализ времен релаксации Т1 в тотально 15 N обогащенных белках сопряжен с возможными существенными ошибками. Время релаксации Т1 ядер азота основной цепи имеет величину порядка 10-50 с [123,235,267], следовательно, при всех частотах ВМУ, использованных в наших экспериментах, соблюдается условие T1≥τSD, то есть спиновая диффузия происходит быстрее, чем спин-решеточная релаксация. Значит, времена Т1 для индивидуальных ядер азота могут быть существенно искажены за счет спиновой диффузии. Спиновая диффузия может быть несколько замедлена за счет использования более высоких резонансных частот и частот ВМУ, тем не менее, в любом случае скорости спиновой диффузии и спин-решеточной релаксации будут, как минимум, сравнимыми. Что касается времен релаксации Т1ρ, то они намного короче (см. Рис. 3.43), и влияние спиновой диффузии на них пренебрежимо. Из Рис. 3.47 видно, что при достаточно высоких частотах ВМУ эффектом спиновой диффузии можно пренебречь и для исследования молекулярных движений в миллисекундном диапазоне обменными методами. 221 В дополнение к представленным результатам будет уместно сделать такое замечание о различных подходах к изотопному обогащению белков для структурных 13 и динамических исследований. Тотальное обогащение изотопами C и 15 N – необходимое условие для соотнесения линий и определения структуры белков. Но для исследования конформационной динамики белков применение тотального изотопного 13 C/15N-обогащения имеет несколько существенных недостатков. Во- первых, мешающим фактором является обсуждаемая здесь спиновая диффузия. Заметим, что из-за более высокого гиромагнитного отношения спиновая диффузия между ядрами получения 13 С существенно быстрее, чем между ядрами селективной динамической информации 15 с N. Так что для использованием релаксационных или обменных ЯМР-экспериментов на ядрах 13 С в тотально обогащенном белке нет никаких шансов. Хотя справедливости ради отметим, что спиновая диффузия не мешает исследованию динамики с помощью анализа формы линии ЯМР-спектра. Во-вторых, если речь идет о релаксации ядер 15N, то в тотально обогащенном белке у каждого 15 N на основной цепи есть две соседа 13 С. Хотя дипольное взаимодействие азота с углеродами существенно меньше, чем с ковалентно связанным протоном, но по порядку величины эти взаимодействия сравнимы. Соответственно, релаксационный механизм становится более запутанным, что значительно усложняет количественный анализ релаксационных данных. В-третьих, получение высокого спектрального разрешения и сайтспецифического соотнесения линий требует проведения двумерных, а иногда и трехмерных экспериментов. Многомерные эксперименты по сравнению с одномерными гораздо более длительные. Если вспомнить, что для детального количественного исследования динамики требуется проведение серии различных экспериментов при различных экспериментальных условиях (резонансная частота, температура и т.п.), то становится ясно, что такого рода исследования невозможно провести в разумный период времени. Правда, недавно был предложен метод детектирования сигнала от ядер 15N через протоны в белках, в которых нелабильные протоны замещены на дейтероны [268]. Но этот метод достаточно сложен технически и в обозримом будущем он вряд ли станет рутинным. Все вышеизложенное приводит нас к выводу о том, что использование селективного изотопного обогащения пока является весьма актуальным и, по нашему мнению, 222 необходимым инструментом в исследовании внутренней динамики белков, несмотря на то, что селективное обогащение обеспечивает существенно худшую репрезентативность информации по белковой молекуле. Мы подчеркиваем этот вывод в связи с тем, что он в некоторой степени противоречит сложившейся в последние несколько лет тенденции в применении твердотельного ЯМР для исследования белков. Повальное увлечение исследователей тотальным обогащением связано, по-видимому, прежде всего с тем, что сейчас основные усилия идут на решение проблем соотнесения линий и определения пространственной структуры. Примеров исследования динамики белков современными твердотельными методами намного меньше. Тем не менее, мы полагаем, что по мере увеличения интереса к динамическим исследованиям следует ожидать и более широкого применения технологий селективного изотопного обогащения белков. 223 Основные выводы и результаты 1. Обнаружена анизотропия броуновского вращения глобулярных белков в водных растворах, вызываемая взаимным ориентированием белков за счет электростатических взаимодействий. Методами ЯМР-релаксации, диэлектрической спектроскопии и моделирования броуновской динамики обнаружена сложная форма корреляционной функции, свидетельствующая об анизотропии броуновского вращения белков. Параметры этой анизотропии различны для разных белков и зависят от концентрации, рН и ионной силы раствора. Для объяснения этого эффекта предложена модель броуновского движения белков, учитывающая взаимодействие электрического дипольного момента белка с электрическим полем, создаваемым ближайшими белковыми молекулами. Это взаимодействие вызывает анизотропию вращения, время жизни которой определяется трансляционной диффузией белков друг относительно друга. Данная модель позволяет на качественном уровне объяснить все наблюдаемые в эксперименте особенности броуновского вращения белков, вызываемые межмолекулярными взаимодействиями. Этот результат диссертации вошел в перечень важнейших результатов Российской Академии Наук в области естественных, технических, гуманитарных и общественных наук за 1997 год. Подробное изложение - во второй главе диссертации. 2. Установлено, что кристаллическом внутренняя и динамика аморфном глобулярных (регидратированный белков в лиофильно высушенный порошок) состояниях в нано- и микросекундном диапазонах времен корреляции одинакова. С помощью измерения спин-решеточной релаксации в лабораторной и вращающейся системах координат на ядрах 13С естественного содержания был проведен сравнительный анализ молекулярной динамики в нано- и микросекундном диапазонах времен корреляции для трех различных белков (лизоцим белка куриных яиц, лизоцим Т4 и барстар) в микрокристаллическом и гидратированном порошкообразном состояниях. Визуальное сравнение релаксационных спадов для всех трех белков показало, что внутренняя динамика как основной, так и боковых цепей в двух состояниях одинакова. Этот результат важен в связи с обсуждающимся в литературе вопросом о корректности применения твердотельных экспериментов для объяснения биологических свойств белка в растворе. Идентичность динамических параметров белка в порошке и кристалле говорит о том, что межбелковые взаимодействия, если белки не образуют специфических комплексов, не оказывают заметного влияния на внутреннюю динамику, в отличие от уровня гидратации, который имеет для белков большое значение. Данный результат является косвенным свидетельством того, что внутренняя динамика глобулярного белка в 224 твердом гидратированном состоянии и в растворе тоже одинакова. Подробное изложение – в части 3.2 диссертации. 3. Разработаны способы определения физических моделей молекулярной динамики, основанные на одновременном количественном анализе степеней усреднения различных магнитных взаимодействий. Одной из основных методических проблем исследования молекулярной динамики методом ЯМР является невозможность однозначного построения физической модели движения из определяемой в эксперименте степени усреднения (параметра порядка) того или иного магнитного взаимодействия. Эту проблему предложено решать путем сопоставления степеней усреднения различных взаимодействий, которые экспериментально измеряются на одном и том же образце. Такой сопоставительный количественный анализ данных ЯМР-экспериментов различного типа позволяет делать обоснованный выбор в пользу той или иной модели движения непосредственно из эксперимента. Данный подход был продемонстрирован двумя разными способами. В полилизине с помощью протонной и углеродной ЯМР-спектроскопии исследовалось движение межъядерных векторов 1Н-1Н и 1Н-13С. Совместный анализ протонных и углеродных данных позволил констатировать наличие в полилизине трех различных динамических процессов и наглядно представить их физические модели. Другой способ реализации этого подхода заключается в одновременном проведении релаксационных и обменных экспериментов (подход SREDA), что позволяет сопоставлять движение межъядерного вектора и тензора анизотропии химического сдвига. Хотя данный метод позволяет определять модели только для высокоамплитудных движений, даже при низких амплитудах динамики совместный анализ обменных и релаксационных данных позволяет проводить гораздо более точную и однозначную количественную характеристику движений по сравнению с анализом этих данных по отдельности. Это было продемонстрировано при изучении динамики основной цепи барстара. Подробное изложение – в частях 3.3.3 и 3.4.2 диссертации. 4. Установлено, что определяющую роль в молекулярном механизме влияния гидратации на внутреннюю конформационную динамику белков играет соотношение между стерической доступностью элементов структуры белка для молекул воды и наличием сети водородных связей, стабилизирующих вторичную структуру. Данный вывод получен из сравнительного анализа гидратационной зависимости параметров внутренней динамики куриного лизоцима и полилизина, который был проведен с помощью релаксационной ЯМРспектроскопии на ядрах 13С естественного содержания. Показано, что при увеличении гидратации полилизина значительно увеличивается подвижность боковых цепей, а подвижность основной цепи почти не 225 изменяется. Важно отметить, что 80% основной цепи полилизина образует бета-слой и, следовательно, связано сетью водородных связей. Для лизоцима наблюдается обратная картина: плотная упаковка структуры не позволяет проникать молекулам воды внутрь структуры белка, и потому увеличение гидратации ведет только к слабому росту подвижности боковых цепей, в основном за счет поверхностных эффектов. А рост амплитуды низкочастотного движения основной цепи, наоборот, по сравнению с полилизином очень значителен. Причиной этой разницы является то, что только 40% основной цепи лизоцима образуют элементы вторичной структуры за счет образования сети водородных связей. Этот результат является шагом от феноменологического описания влияния гидратации на различные свойства белков к детальному анализу молекулярных механизмов этого влияния. Подробное изложение – в частях 3.3.1 и 3.3.2 диссертации. 5. Разработаны две модификации ЯМР-эксперимента по измерению спинрешеточной релаксации во вращающейся системе координат в твердом теле, которые позволяют исключить нежелательный спин-спиновый вклад в релаксацию и существенно расширить частотный диапазон измерений. Дополнительный т.н. спин-спиновый вклад в спин-решеточную релаксацию во вращающейся системе координат в твердых телах – принципиальное препятствие для широкого использования времен релаксации T1ρ в количественном исследовании молекулярной динамики жестких (био)полимеров. Для подавления этого вклада при измерении релаксации, обусловленной гетероядерным (в частности, 13С-1Н или 15N-1Н) диполь-дипольным взаимодействием, предложены две модификации традиционного эксперимента по измерению T1ρ: 1) использование отстройки от резонанса поля спин-лока, что позволяет значительно увеличивать амплитуду спин-лока без увеличения мощности передатчика; 2) использование дипольной развязки от протонов во время действия спинлока на частоте ядер 13С или 15N. Эти эксперименты были опробованы на модельных системах, и было показано, что они, во-первых, позволяют подавить спин-спиновый вклад в релаксацию и, во-вторых, существенно расширить частотный диапазон релаксационных измерений. Эти модификации явились основой для проведения последующих количественных исследований молекулярной динамики нескольких биополимеров. Подробное изложение – в части 3.1 диссертации. 6. Обнаружена зависимость скорости спиновой диффузии между ядрами 15N от частоты вращения образца под магическим углом. Эксперименты по измерению скорости спиновой диффузии между ядрами 15N в тотально обогащенных белке (лизоцим Т4) и поликристаллическом ВОС-глицине, проведенные с помощью одномерной обменной ЯМР-спектроскопии (импульсная последовательность CODEX) показали, что характерное время спиновой диффузии между ядрами 15N 226 линейно растет с ростом частоты ВМУ. Учет этого эффекта важен для осознанного выбора частоты ВМУ при проведении экспериментов, в которых спиновая диффузия может быть как полезным (структурные и корреляционные эксперименты), так и мешающим (динамические эксперименты) явлением. Определение абсолютных значений характерных времен спиновой диффузии в тотально обогащенном изотопом 15N белке показало, что даже при самых высоких экспериментально достижимых скоростях ВМУ спиновая диффузия быстрее, чем спин-решеточная релаксация большинства ядер 15N основной цепи белка. Отсюда следует вывод о том, что получение селективной динамической информации с помощью измерения Т1 ядер 15N в тотально обогащенном белке невозможно, для этого необходимо проводить селективное изотопное обогащение. Подробное изложение – в части 3.4.3 диссертации. 7. Экспериментально продемонстрирована возможность применения одномерной обменной ЯМР-спектроскопии твердого тела с ВМУ для исследования молекулярной динамики белков в миллисекундном диапазоне времен корреляции. Одномерная твердотельная обменная ЯМР-спектроскопия была впервые применена для исследования параметров конформационной динамики основной цепи белка (барстара). Бело показано, что обменный эксперимент (импульсная последовательность tr-ODESSA) способен детектировать движения в белке со временем корреляции порядка миллисекунды. В то же время, анализ данных существенно затрудняет спиновая диффузия, которая накладывается на обменный процесс, связанный с молекулярным движением. На основании анализа обменной схемы, включающей в себя молекулярное движение и спиновую диффузию, было продемонстрировано, что молекулярное движение не может наблюдаться, если оно медленнее, чем спинованя диффузия. Подробное изложение – в части 3.4.1 диссертации. 227 Благодарности. Практически все твердотельные ЯМР-эксперименты, представленные в диссертации, были выполнены на спектрометрах группы спектроскопии ЯМР физического факультета Университета г. Халле (Германия). Автор очень признателен немецким коллегам, прежде всего, профессору Хорсту Шнайдеру (Horst Schneider) и доктору Детлефу Райхерту (Detlef Reichert), за плодотворное многолетнее сотрудничество, которое продолжается и по сей день. Искренняя благодарность – всем коллегам из Казанского Института Биохимии и Биофизики РАН, которые на протяжении многих лет в той или иной форме оказывали поддержку нашим исследованиям. Особо хочется отметить И.В. Ермолину, Ю.Д. Фельдмана, Д.А. Фушмана, Л.С. Киваеву, Ю.Ф. Зуева, Н.Н. Вылегжанину, Е.А. Ступишину, Д.А. Файзуллина, А.Э. Ситницкого, И.В. Несмелову, И.В. Ивойлова, Л.О. Ягодину, Е.А. Ермакову, Р.Х. Курбанова и Ю.В. Гоголева. Особую признательность и благодарность автор выражает своему Учителю, профессору Владимиру Дмитриевичу Федотову, без участия которого эта работа не могла бы состояться. 228 Ссылки 1. Perutz, M. F. Structure of hemoglobin - 3-dimensional fourier synthesis at 5.5-A resolution, obtained by X-ray analysis / M. F. Perutz, M. G. Rossmann, A. F. Cullis, H. Muirhead, G. Will, A. C. T. North // Nature - 1960. - Vol. 185. - P. 416-422. 2. Wuthrich, K. NMR of proteins and nucleic acids / K. Wuthrich - New York: Wiley, 1986. - 292 Р. 3. Fu, R. Q. Solid-state nuclear magnetic resonance investigation of protein and polypeptide structure / R. Q. Fu, T. A. Cross // Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struc. 1999. - Vol. 28. - P. 235-268. 4. McDermott, A.E. Solid state NMR studies of uniformly isotopically enriched proteins / A. E. McDermott // In: Protein NMR for the Millenium / Ed. N. R. Krishna, L. J. Berliner - New York: Kluwer - 2003. - P. 103-120. 5. McDermott, A.E. Structural and dynamic studies of proteins by solid-state NMR spectroscopy: rapid movement forward / A. E. McDermott // Curr.Opin.Struct.Biol. 2004. - Vol. 14. - P. 554-561. 6. Castellani, F. Structure of a protein determined by solid-state magic-angle-spinning NMR spectroscopy / F. Castellani, B. van Rossum, A. Diehl, M. Schubert, K. Rehbein, H. Oschkinat // Nature - 2002. - Vol. 420. - P. 98-102. 7. Karplus, M. Aspects of protein reaction dynamics: Deviations from simple behavior / M. Karplus // J.Phys.Chem.B - 2000. - Vol. 104. - P. 11-27. 8. Gabel, F. Protein dynamics studied by neutron scattering / F. Gabel, D. Bicout, U. Lehnert, M. Tehei, M. Weik, G. Zaccai // Quart.Rev.Biophys. - 2002. - Vol. 35. - P. 327-367. 9. Parak, F.G. Physical aspects of protein dynamics / F. G. Parak // Rep.Progr.Phys. 2003. - Vol. 66. - P. 103-129. 10. Sinha, N. Protein structure to function via dynamics / N. Sinha, S. J. Smith-Gill // Protein Peptide Lett. - 2002. - Vol. 9. - P. 367-377. 11. Kempf, J. G. Protein dynamics from solution NMR - Theory and applications / J. G. Kempf, J. P. Loria // Cell Biochem.Biophys. - 2003. - Vol. 37. - P. 187-211. 12. Wand, A. J. Dynamic activation of protein function: A view emerging from NMR spectroscopy / A. J. Wand // Nature Struct.Biology - 2001. - Vol. 8. - P. 926-931. 13. Daniel, R. M. The role of dynamics in enzyme activity / R. M. Daniel, R. V. Dunn, J. L. Finney, J. C. Smith // Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struc. - 2003. - Vol. 32. - P. 6992. 14. Wuthrich, K. NMR - this other method for protein and nucleic-acid structure determination / K. Wuthrich // Acta Crystallogr.D Biol.Cryst. - 1995. - Vol. 51. - P. 249-270. 15. Lipari, G. Model-free approach to the interpretation of nuclear magnetic resonance relaxation in macromolecules. 1. Theory and range of validity / G. Lipari, A. Szabo // J.Am.Chem.Soc. - 1982. - Vol. 104. - P. 4546-4559. 229 16. Lipari, G. Model-free approach to the interpretation of nuclear magnetic resonance relaxation in macromolecules. 2. Analysis of experimental results / G. Lipari, A. Szabo // J.Am.Chem.Soc. - 1982. - Vol. 104. - P. 4559-4570. 17. Schmidt-Rohr, K. Multidimensional solid-state NMR and polymers / K. SchmidtRohr, H. W. Spiess - London: Academic Press, 1994. - 478 P. 18. Andrew, E. R. Nuclear magnetic resonance spectra from a crystal rotated at high speed / E. R. Andrew, A. Bradbury, R. G. Eades // Nature - 1958. - Vol. 182. - P. 1659-1659. 19. Luz, Z. Slow exchange involving equivalent sites in solids by one-dimensional MAS NMR techniques / Z. Luz, P. Tekely, D. Reichert // Prog.Nucl.Magn.Reson.Spectros. - 2002. - Vol. 41. - P. 83-113. 20. Gerardy-Montouillout, V. ODESSA, a new 1D NMR exchange experiment for chemically equivalent nuclei in rotating solids / V. Gerardy-Montouillout, C. Malveau, P. Tekely, Z. Olender, Z. Luz // J.Magn.Reson. Ser A - 1996. - Vol. 123. P. 7-15. 21. Reichert, D. Time-reverse ODESSA. A 1D exchange experiment for rotating solids with several groups of equivalent nuclei / D. Reichert, H. Zimmermann, P. Tekely, R. Poupko, Z. Luz // J.Magn.Reson. - 1997. - Vol. 125. - P. 245-258. 22. Favre, D. E. Direct determination of motional correlation times by 1D MAS and 2D exchange NMR techniques / D. E. Favre, D. J. Schaefer, B. F. Chmelka // J.Magn.Reson. - 1998. - Vol. 134. - P. 261-279. 23. Reichert, D. PATROS - A new MAS exchange method using sideband separation: Application to poly(n-butylmethacrylate) / D. Reichert, G. Hempel, Z. Luz, P. Tekely, H. Schneider // J.Magn.Reson. - 2000. - Vol. 146. - P. 311-320. 24. Tekely, P. Initial conditions for carbon-13 MAS NMR 1D exchange involving chemically equivalent and inequivalent nuclei / P. Tekely, D. Reichert, H. Zimmermann, Z. Luz // J.Magn.Reson. - 2000. - Vol. 145. - P. 173-183. 25. deAzevedo, E. R. Centerband-only detection of exchange: Efficient analysis of dynamics in solids by NMR / E. R. deAzevedo, W. G. Hu, T. J. Bonagamba, K. Schmidt-Rohr // J.Am.Chem.Soc. - 1999. - Vol. 121. - P. 8411-8412. 26. deAzevedo, E. R. Principles of centerband-only detection of exchange in solid-state nuclear magnetic resonance, and extension to four-time centerband-only detection of exchange / E. R. deAzevedo, W. G. Hu, T. J. Bonagamba, K. Schmidt-Rohr // J.Chem.Phys. - 2000. - Vol. 112. - P. 8988-9001. 27. Абрагам, А. Ядерный магнетизм / А. Абрагам. - М: Изд-во иностр. лит-ры, 1963. 551 С. - Перевод изд: The principles of nuclear magnetism / A. Abragam - Oxford: Clarendon Press, 1961. 28. Schmidt-Rohr, K. Correlation of structure, mobility, and morphological information in heterogeneous polymer materials by 2-dimensional wideline-separation NMRspectroscopy / K. Schmidt-Rohr, J. Clauss, H. W. Spiess // Macromolecules - 1992. Vol. 25. - P. 3273-3277. 29. Kolbert, A. C. Two-dimensional dipolar-chemical shift NMR in rotating solids / A. C. Kolbert, H. J. M. de Groot, M. H. Levitt, M. G. Munowitz, J. E. Roberts, G. S. 230 Harbison, J. Herzfeld, R. G. Griffin // In: Multinuclear Magnetic Resonance in Liquids and Solids - Chemical Applications / Ed. P. Granger, R. K. Harris. - Dordrecht: Kluwer, 1990. - P. 339-354. 30. Vanderhart, D. L. 13C NMR rotating frame relaxation in a solid with strongly coupled protons: Polyethylene / D. L. Vanderhart, A. N. Garroway // J.Chem.Phys. - 1979. Vol. 71. - P. 2773-2787. 31. Clore, G. M. Analysis of the backbone dynamics of interleukin-1b using twodimensional inverse detected heteronuclear 15N-1H NMR spectroscopy / G. M. Clore, P. C. Driscoll, P. T. Wingfield, A. M. Gronenborn // Biochemistry - 1990. - Vol. 29. P. 7387-7401. 32. Daragan, V. A. Using the model free approach to analyze NMR relaxation data in cases of anisotropic molecular diffusion / V. A. Daragan, K. H. Mayo // J.Phys.Chem.B - 1999. - Vol. 103. - P. 6829-6834. 33. King, R. A general formalism for the analysis of NMR relaxation measurements on systems with multiple degrees of freedom / R. King, O. Jardetzky // Chem.Phys.Lett. - 1978. - Vol. 55. - P. 15-18. 34. Ribeiro, A. A. An approach to the mapping of internal motions in proteins. Analysis of carbon-13 NMR relaxation in the bovine pancreatic trypsin inhibitor / A. A. Ribeiro, R. King, C. Restivo, O. Jardetzky // J.Am.Chem.Soc. - 1980. - Vol. 102. - P. 4040-4051. 35. Palmer, A. G. Nuclear magnetic resonance studies of biopolymer dynamics / A. G. Palmer, J. Williams, A. McDermott // J.Phys.Chem. - 1996. - Vol. 100. - P. 1329313310. 36. Palmer, A. G. Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-tomillisecond motions in biological macromolecules / A. G. Palmer, C. D. Kroenke, J. P. Loria // Meth.Enzymology - 2001. - Vol. 339. - P. 204-238. 37. Luz, Z. Nuclear magnetic resonance study of the protolysis of trimethylammonium ion in aqueous solution - order of the reaction with respect to solvent / Z. Luz, S. Meiboom // J.Chem.Phys. - 1963. - Vol. 39. - P. 366-370. 38. Allerhand, A. Spin-echo NMR studies of chemical exchange .1. Some general aspects / A. Allerhand, H. S. Gutowsky // J.Chem.Phys. - 1964. - Vol. 41. - P. 2115-2126. 39. Zinn-Justin, S. Off-resonance rf fields in heteronuclear NMR: Application to the study of slow motions / S. Zinn-Justin, P. Berthault, M. Guenneugues, H. Desvaux // J.Biomol.NMR - 1997. - Vol. 10. - P. 363-372. 40. Mulder, F. A. A. An off-resonance rotating frame relaxation experiment for the investigation of macromolecular dynamics using adiabatic rotations / F. A. A. Mulder, R. A. de Graaf, R. Kaptein, R. Boelens // J.Magn.Reson. - 1998. - Vol. 131. P. 351-357. 41. Davis, D. G. Direct measurements of the dissociation-rate constant for inhibitorenzyme complexes via the T1ρ and T2 (CPMG) methods / D. G. Davis, M. E. Perlman, R. E. London // J.Magn.Reson. Ser. B - 1994. - Vol. 104. - P. 266-275. 231 42. Deverell, C. Studies of chemical exchange by nuclear magnetic relaxation in rotating frame / C. Deverell, R. E. Morgan, J. H. Strange // Mol.Phys. - 1970. - Vol. 18. - P. 553-559. 43. Kloiber, K. Differential multiple-quantum relaxation arising from cross-correlated time-modulation of isotropic chemical shifts / K. Kloiber, R. Konrat // J.Biomol.NMR - 2000. - Vol. 18. - P. 33-42. 44. Fruh, D. Cross-correlated chemical shift modulation: A signature of slow internal motions in proteins / D. Fruh, J. R. Tolman, G. Bodenhausen, C. Zwahlen // J.Am.Chem.Soc. - 2001. - Vol. 123. - P. 4810-4816. 45. Siminovitch, D. J. Solid-state NMR studies of proteins: the view from static H-2 NMR experiments / D. J. Siminovitch // Biochem.Cell Biol. - 1998. - Vol. 76. - P. 411-422. 46. Lindestrom-Lang, K. U. Protein structure and enzyme activity / K. U. LindestromLang, J. A. Schellman // In: The enzymes, Vol. 1/ Ed. P. O. Boyer, H. Lardy, K. Myrback - New York: Academic Press - 1959. - P. 443-510. 47. Cave, A. Conformational mobility within the structure of mascular parvalbumins. An NMR study of the aromatic resonances of phenylalanine residues / A. Cave, C. M. Dobson, J. Parello, R. J. P. Williams // FEBS Lett. - 1976. - Vol. 65. - P. 190-194. 48. Cayley, P. J. Nuclear magnetic resonance studies of the binding trimethoprim to dihydrafolate reductase / P. J. Cayley, J. P. Albrand, J. Feeney, G. C. K. Roberts, E. A. Piper, A. S. V. Burgen // Biochemistry - 1979. - Vol. 18. - P. 3886-3895. 49. Feeney, J. H-1 nuclear magnetic resonance study of the complexes of two diastereoisomers of folinic acid with dihydrofolate reductase / J. Feeney, B. Birdsall, J. P. Albrand, G. C. K. Roberts, A. S. V. Burgen, P. A. Charlton, D. W. Young // Biochemistry - 1981. - Vol. 20. - P. 1837-1842. 50. Allerhand, A. Carbon-13 Fourier transform nuclear magnetic resonance .3. Conformation and segmental motion of native and denatured ribonuclease-A in solution - application of natural-abundance carbon-13 partially relaxed Fourier transform nuclear magnetic resonance / A. Allerhand, D. Doddrell, U. Glushko, D. W. Cochran, E. Wenkert, P. J. Lawson, F. R. N. Gurd // J.Am.Chem.Soc. - 1971. - Vol. 93. - P. 544-546. 51. Wittebort, R. J. Aliphatic groups of sperm whale myoglobin: 13C NMR study / R. J. Wittebort, T. M. Rothgeb, A. Szabo, F. R. N. Gurd // Proc.Nat.Acad.Sci.USA - 1979. - Vol. 76. - P. 1059-1063. 52. Richarz, R. Carbon-13 nuclear magnetic relaxation studies of internal mobility of the polypeptide chain in basic pancreatic trypsin inhibitor and a selectively reduced analogue / R. Richarz, K. Nagayama, K. Wuthrich // Biochemistry - 1980. - Vol. 19. P. 5189-5196. 53. Canioni, P. Conformational dynamics of porcine pancreatic colipase A. A natural abundance carbon-13 nuclear magnetic resonance study / P. Canioni, M. Bernard, P. J. Cozzone // Biochim.Biophys.Acta - 1984. - Vol. 790. - P. 36-45. 232 54. Hughes, L. T. 13C NMR studies of the molecular dynamics of selectively 13C-enriched ribonuclease complexes / L. T. Hughes, J. S. Cohen, A. Szabo, C. H. Niu, S. Matsuura // Biochemistry - 1984. - Vol. 23. - P. 4390-4394. 55. Bax, A. Detection of insensitive nuclei / A. Bax, S. W. Sparks, D. A. Torchia // Meth.Enzymology - 1989. - Vol. 176. - P. 134-150. 56. Mayo, K. H. Peptide internal motions on nanosecond time scale derived from direct fitting of C-13 and N-15 NMR spectral density functions / K. H. Mayo, V. A. Daragan, D. Idiyatullin, I. Nesmelova // J.Magn.Reson. - 2000. - Vol. 146. - P. 188195. 57. Lee, A. L. Assessing potential bias in the determination of rotational correlation times of proteins by NMR relaxation / A. L. Lee, A. J. Wand // J.Biomol.NMR - 1999. Vol. 13. - P. 101-112. 58. Smith, L. J. NMR and protein dynamics / L. J. Smith, C. M. Dobson // Int.J.Quantum Chem. - 1996. - Vol. 59. - P. 315-332. 59. Palmer, A. G. NMR probes of molecular dynamics: Overview and comparison with other techniques / A. G. Palmer // Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struc. - 2001. - Vol. 30. - P. 129-155. 60. Daragan, V. A. Motional model analyses of protein and peptide dynamics using C-13 and N-15 NMR relaxation / V. A. Daragan, K. H. Mayo // Prog.Nucl.Magn.Reson.Spectros. - 1997. - Vol. 31. - P. 63-105. 61. Korzhnev, D. M. NMR studies of Brownian tumbling and internal motions in proteins / D. M. Korzhnev, M. Billeter, A. S. Arseniev, V. Y. Orekhov // Prog.Nucl.Magn.Reson.Spectros. - 2001. - Vol. 38. - P. 197-266. 62. Palmer, A. G. NMR characterization of the dynamics of biomacromolecules / A. G. Palmer // Chem.Rev. - 2004. - Vol. 104. - P. 3623-3640. 63. Eisenmesser, E. Z. Enzyme dynamics during catalysis / E. Z. Eisenmesser, D. A. Bosco, M. Akke, D. Kern // Science - 2002. - Vol. 295. - P. 1520-1523. 64. Cole, R. Evidence for flexibility in the function of ribonuclease A / R. Cole, J. P. Loria // Biochemistry - 2002. - Vol. 41. - P. 6072-6081. 65. van Tilborg, P. J. A. Changes in dynamical behavior of the retinoid X receptor DNAbinding domain upon binding to a 14 base-pair DNA half site / P. J. A. van Tilborg, M. Czisch, F. A. A. Mulder, G. E. Folkers, A. M. J. J. Bonvin, M. Nair, R. Boelens, R. Kaptein // Biochemistry - 2000. - Vol. 39. - P. 8747-8757. 66. McIntosh, P. B. The influence of DNA binding on the backbone dynamics of the yeast cell-cycle protein Mbp1* / P. B. McIntosh, I. A. Taylor, T. A. Frenkiel, S. J. Smerdon, A. N. Lane // J.Biomol.NMR - 2000. - Vol. 16. - P. 183-196. 67. Kimmich, R. NMR: tomography, diffusometry, relaxometry / R. Kimmich Heidelberg: Springer, 1997. 68. Kimmich, R. Field-cycling NMR relaxometry / R. Kimmich, E. Anoardo // Prog.Nucl.Magn.Reson.Spectros. - 2004. - Vol. 44. - P. 257-320. 233 69. Blears, D. J. Proton wide-line nuclear magnetic resonance spectra of hydrated proteins / D. J. Blears, S. S. Danyluk // Biochim.Biophys.Acta - 1968. - Vol. 154. - P. 17-27. 70. Andrew, E. R. Proton magnetic relaxation in solid poly(L-alanine), poly(L-leucine), poly(L-valine), and polyglycine / E. R. Andrew, R. Gaspar, W. Vennart // Biopolymers - 1978. - Vol. 17. - P. 1913-1925. 71. Andrew, E. R. Proton magnetic relaxation and dynamics of solid poly-L-proline and polyglycine / E. R. Andrew, D. J. Bryant, E. M. Cashell, R. Gaspar, Q. A. Meng // Polymer - 1981. - Vol. 22. - P. 715-717. 72. Andrew, E. R. Proton relaxation studies of dynamics of proteins in the solid-state / E. R. Andrew, D. N. Bone, D. J. Bryant, E. M. Cashell, R. Gaspar, Q. A. Meng // Pure Appl.Chem. - 1982. - Vol. 54. - P. 585-594. 73. Gaspar, R. Dipolar relaxation and slow molecular motions in solid proteins / R. Gaspar, E. R. Andrew, D. J. Bryant, E. M. Cashell // Chem.Phys.Lett. - 1982. - Vol. 86. - P. 327-330. 74. Andrew, E. R. NMR of solid biopolymers / E. R. Andrew // Polymer - 1985. - Vol. 26. - P. 190-192. 75. Buszko, M. L. 1H NMR study of lithium lactate / M. L. Buszko, E. R. Andrew // Solid State Nucl.Magn.Reson. - 1992. - Vol. 1. - P. 115-119. 76. Andrew, E. R. Proton relaxation NMR study of polycrystalline progesterone / E. R. Andrew, K. Jurga, J. M. Radomski, E. C. Reynhardt // Solid State Nucl.Magn.Reson. - 1992. - Vol. 1. - P. 121-125. 77. Andrew, E. R. Molecular dynamics in polycrystalline testosterone studied by proton NMR / E. R. Andrew, J. M. Radomski // Solid State Nucl.Magn.Reson. - 1993. - Vol. 2. - P. 57-60. 78. Andrew, E. R. Proton NMR study of molecular motion in solid cortisone / E. R. Andrew, M. Kempka // Solid State Nucl.Magn.Reson. - 1993. - Vol. 2. - P. 261-264. 79. Andrew, E. R. Molecular motions in solid estradiol studied by nuclear magnetic resonance spectroscopy / E. R. Andrew, M. Kempka // Solid State Nucl.Magn.Reson. - 1995. - Vol. 4. - P. 249-253. 80. Andrew, E. R. Molecular motion in solid all-trans retinoic acid (vitamin A acid) by proton NMR / E. R. Andrew, B. Peplinska // Solid State Nucl.Magn.Reson. - 1998. Vol. 13. - P. 39-43. 81. Andrew, E. R. Molecular dynamics in solid L-adrenaline by proton NMR / E. R. Andrew, B. Peplinska, M. Kempka // Solid State Nucl.Magn.Reson. - 1998. - Vol. 10. - P. 117-121. 82. Andrew, E. R. Molecular dynamics in solid anhydrous beta-estradiol studied by H-1 NMR / E. R. Andrew, M. Kempka, J. M. Radomski, E. Szczesniak // Solid State Nucl.Magn.Reson. - 1999. - Vol. 14. - P. 91-94. 83. Andrew, E. R. Molecular dynamics in solid riboflavin as studied by H-1 NMR / E. R. Andrew, S. Glowinkowski // Solid State Nucl.Magn.Reson. - 2000. - Vol. 18. - P. 8996. 234 84. Fedotov, V. D. Nuclear magnetic relaxation and molecular motion in solid lysozyme / V. D. Fedotov, N. P. Obuchov, J. Spevacek, J. Straka // Makromol.Chem.Macromol.Symp. - 1990. - Vol. 34. - P. 249-261. 85. Задиханов, Р.А. 1H и 13С ядерная магнитная релаксация и молекулярное движение в твердых гомополипептидах. / Р.А. Задиханов, В.Д. Федотов, И. Спевачек, И Страка // Высокомол. Соед. Сер. А - 1992. - Т. 34. - С. 58-66. 86. Fedotov, V. D. H-1 and C-13 nuclear magnetic relaxation and local dynamics of lysozyme and synthetic polypeptides / V. D. Fedotov, N. P. Obuchov, R. A. Zadikhanov, J. Spevacek, J. Straka // Appl.Magn.Reson. - 1993. - Vol. 4. - P. 491511. 87. Krushelnitsky, A. G. Dynamic structure of proteins in solid state. H-1 and C-13 NMR relaxation study / A. G. Krushelnitsky, V. D. Fedotov, J. Spevacek, J. Straka // J.Biomol.Struct.Dyn. - 1996. - Vol. 14. - P. 211-224. 88. Yoshioka, S. Different molecular motions in lyophilized protein formulations as determined by laboratory and rotating frame spin-lattice relaxation times / S. Yoshioka, Y. Aso, S. Kojima // J.Pharm.Sci. - 2002. - Vol. 91. - P. 2203-2210. 89. Belskaya, A. V. Internal dynamics and hydration of solid proteins by H-1 NMR relaxation and FTIR spectroscopy / A. V. Belskaya, D. A. Fayzullin, V. D. Fedotov // Appl.Magn.Reson. - 2004. - Vol. 27. - P. 549-562. 90. Frauenfelder, H. Dynamics and function of proteins: The search for general concepts / H. Frauenfelder, B. McMahon // Proc.Nat.Acad.Sci.USA - 1998. - Vol. 95. - P. 47954797. 91. Nusser, W. Solid-state NMR study of protein/polypeptide backbone fluctuations interpreted by multiple trapping diffusion of dilating defects / W. Nusser, R. Kimmich, F. Winter // J.Phys.Chem. - 1988. - Vol. 92. - P. 6808-6814. 92. Kimmich, R. Interactions and fluctuations deduced from proton field-cycling relaxation spectroscopy of polypeptides, DNA, muscles and algae / R. Kimmich, F. Winter, W. Nusser, K. H. Spohn // J.Magn.Reson. - 1986. - Vol. 68. - P. 263-282. 93. Kennedy, S. D. Hydration effects on dynamics of polyglycine and sodium poly(Lglutamate) / S. D. Kennedy, R. G. Bryant // Biopolymers - 1990. - Vol. 30. - P. 691701. 94. Swanson, S. D. The hydration response of poly(L-lysine) dynamics measured by 13CNMR spectroscopy / S. D. Swanson, R. G. Bryant // Biopolymers - 1991. - Vol. 31. P. 967-973. 95. Gregory, R. B. The influence of hydration on the conformation of lysozyme studied by solid-state 13C-NMR spectroscopy / R. B. Gregory, M. Gangoda, R. K. Gilpin, W. Su // Biopolymers - 1993. - Vol. 33. - P. 513-519. 96. Yoshioka, S. Determination of molecular mobility of lyophilized bovine serum albumin and gamma-globulin by solid-state H-1 NMR and relation to aggregationsusceptibility / S. Yoshioka, Y. Aso, S. Kojima // Pharmaceut.Res. - 1996. - Vol. 13. P. 926-930. 97. Gil, A. M. A C-13-NMR study on the conformational and dynamical properties of a cereal seed storage protein, C-hordein, and its model peptides / A. M. Gil, K. Masui, 235 A. Naito, A. S. Tatham, P. S. Belton, H. Saito // Biopolymers - 1997. - Vol. 41. - P. 289-300. 98. Partridge, J. Activity and mobility of subtilisin in low water organic media: hydration is more important than solvent dielectric / J. Partridge, P. R. Dennison, B. D. Moore, P. J. Halling // Biochim.Biophys.Acta - 1998. - Vol. 1386. - P. 79-89. 99. Separovic, F. A solid-state NMR study of protein hydration and stability / F. Separovic, Y. H. Lam, X. Ke, H. K. Chan // Pharmaceut.Res. - 1998. - Vol. 15. - P. 1816-1821. 100. Wang, P. X. An NMR study of structure and dynamics of hydrated poly (aspartic acid) sodium salt / P. X. Wang, I. Ando // J.Mol.Struct. - 1998. - Vol. 447. - P. 81-88. 101. Hediger, S. Solid-state NMR characterization of hydration effects on polymer mobility in onion cell-wall material / S. Hediger, L. Emsley, M. Fischer // Carbohyd.Res. - 1999. - Vol. 322. - P. 102-112. 102. Kishore, A. I. Solid-state NMR relaxation studies of Australian spider silks / A. I. Kishore, M. E. Herberstein, C. L. Craig, F. Separovic // Biopolymers - 2001. - Vol. 61. - P. 287-297. 103. Lam, Y. H. A solid-state NMR study of protein mobility in lyophilized protein-sugar powders / Y. H. Lam, R. Bustami, T. Phan, H. K. Chan, F. Separovic // J.Pharm.Sci. 2002. - Vol. 91. - P. 943-951. 104. Calucci, L. C-13 and H-1 solid state NMR investigation of hydration effects on gluten dynamics / L. Calucci, C. Forte, L. Galleschi, M. Geppi, S. Ghiringhelli // Int.J.Biol.Macromol. - 2003. - Vol. 32. - P. 179-189. 105. Calucci, L. Structure and dynamics of flour by solid state NMR: Effects of hydration and wheat aging / L. Calucci, L. Galleschi, M. Geppi, G. Mollica // Biomacromolecules - 2004. - Vol. 5. - P. 1536-1544. 106. Rupley, J. A. Protein hydration and function / J. A. Rupley, G. Careri // Advan.Prot.Chem. - 1991. - Vol. 41. - P. 37-172. 107. Shirley, W. M. Proton-nuclear spin relaxation and molecular dynamics in the lysozyme-water system / W. M. Shirley, R. G. Bryant // J.Am.Chem.Soc. - 1982. Vol. 104. - P. 2910-2918. 108. Lester, C. C. Water-proton nuclear magnetic relaxation in heterogeneous systems: hydrated lysozyme results / C. C. Lester, R. G. Bryant // Magn.Reson.Med. - 1991. Vol. 22. - P. 143-153. 109. Belton, P. S. NMR studies of protein hydration / P. S. Belton // Prog.Biophys.Mol.Biol. - 1994. - Vol. 61. - P. 61-79. 110. Renou, J. P. NMR study of collagen-water interactions / J. P. Renou, M. Bonnet, G. Bielicki, A. Rochdi, P. Gatellier // Biopolymers - 1994. - Vol. 34. - P. 1615-1626. 111. Bryant, R. G. The dynamics of water-protein interactions / R. G. Bryant // Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struc. - 1996. - Vol. 25. - P. 29-53. 112. Kennedy, S. D. Structural effects of hydration: studies of lysozyme by 13C solids NMR / S. D. Kennedy, R. G. Bryant // Biopolymers - 1990. - Vol. 29. - P. 1801-1806. 236 113. Gregory, R. B. The influence of hydration on the conformation of bovine serum albumin studied by solid-state 13C-NMR spectroscopy / R. B. Gregory, M. Gangoda, R. K. Gilpin, W. Su // Biopolymers - 1993. - Vol. 33. - P. 1871-1876. 114. Mack, J. W. Backbone motions in a crystalline protein from field-dependent H-2NMR relaxation and line-shape analysis / J. W. Mack, M. G. Usha, J. Long, R. G. Griffin, R. J. Wittebort // Biopolymers - 2000. - Vol. 53. - P. 9-18. 115. Tamura, A. Dynamics of the three methionyl side chains of Streptomyces subtilisin inhibitor. Deuterium NMR studies in solution and in the solid state / A. Tamura, M. Matsushita, A. Naito, S. Kojima, K. I. Miura, K. Akasaka // Protein Sci. - 1996. - Vol. 5. - P. 127-139. 116. Williams, J. C. Dynamics of the flexible loop of triosephosphate isomerase: the loop motion is not ligand gated / J. C. Williams, A. E. McDermott // Biochemistry - 1995. Vol. 34. - P. 8309-8319. 117. Rozovsky, S. The time scale of the catalytic loop motion in triosephosphate isomerase / S. Rozovsky, A. E. McDermott // J.Mol.Biol. - 2001. - Vol. 310. - P. 259-270. 118. Rozovsky, S. Solution-state NMR investigations of triosephosphate isomerase active site loop motion: Ligand release in relation to active site loop dynamics / S. Rozovsky, G. Jogl, L. Tong, A. E. McDermott // J.Mol.Biol. - 2001. - Vol. 310. - P. 271-280. 119. Desamero, R. Active site loop motion in triosephosphate isomerase: T-jump relaxation spectroscopy of thermal activation / R. Desamero, S. Rozovsky, N. Zhadin, A. McDermott, R. Callender // Biochemistry - 2003. - Vol. 42. - P. 2941-2951. 120. Shaw, W. J. A solid state NMR study of dynamics in a hydrated salivary peptide adsorbed to hydroxyapatite / W. J. Shaw, J. R. Long, A. A. Campbell, P. S. Stayton, G. P. Drobny // J.Am.Chem.Soc. - 2000. - Vol. 122. - P. 7118-7119. 121. Sarkar, S. K. Molecular dynamics of collagen side chains in hard and soft tissues. A multinuclear magnetic resonance study / S. K. Sarkar, Y. Hiyama, C. H. Niu, P. E. Young, J. T. Gerig, D. A. Torchia // Biochemistry - 1987. - Vol. 26. - P. 6793-6800. 122. Kikuchi, J. Structure and dynamics of photosynthetic membrane-bound proteins in Rhodobacter Sphaeroides, studied with solid-state NMR spectroscopy / J. Kikuchi, M. P. Williamson, K. Shimada, T. Asakura // Photosynth.Res. - 2000. - Vol. 63. - P. 259267. 123. Cole, H. B. R. An NMR study of the backbone dynamics of staphylococcal nuclease in the crystalline state / H. B. R. Cole, D. A. Torchia // Chem.Phys. - 1991. - Vol. 158. - P. 271-281. 124. Krushelnitsky, A. Superslow backbone protein dynamics as studied by 1D solid-state MAS exchange NMR spectroscopy / A. Krushelnitsky, D. Reichert, G. Hempel, V. Fedotov, H. Schneider, L. Yagodina, A. Schulga // J.Magn.Reson. - 1999. - Vol. 138. - P. 244-255. 125. Hong, M. Determination of multiple phi-torsion angles in proteins by selective and extensive C-13 labeling and two-dimensional solid-state NMR / M. Hong // J.Magn.Reson. - 1999. - Vol. 139. - P. 389-401. 237 126. Hong, M. Selective and extensive C-13 labeling of a membrane protein for solid-state NMR investigations / M. Hong, K. Jakes // J.Biomol.NMR - 1999. - Vol. 14. - P. 7174. 127. deAzevedo, E. R. Determination of slow motions in extensively isotopically labeled proteins by magic-angle-spinning C-13-detected N-15 exchange NMR / E. R. deAzevedo, S. B. Kennedy, M. Hong // Chem.Phys.Lett. - 2000. - Vol. 321. - P. 4348. 128. Kennedy, S. B. Dynamic structure of a protein hydrogel: A solid-state NMR study / S. B. Kennedy, E. R. deAzevedo, W. A. Petka, T. P. Russell, D. A. Tirrell, M. Hong // Macromolecules - 2001. - Vol. 34. - P. 8675-8685. 129. Huster, D. Solid-state NMR investigation of the dynamics of the soluble and membrane-bound colicin Ia channel-forming domain / D. Huster, L. S. Xiao, M. Hong // Biochemistry - 2001. - Vol. 40. - P. 7662-7674. 130. Weliky, D. P. Determination of peptide conformations by two-dimensional magic angle spinning NMR exchange spectroscopy with rotor synchronization / D. P. Weliky, R. Tycko // J.Am.Chem.Soc. - 1996. - Vol. 118. - P. 8487-8488. 131. Saalwachter, K. Relaxation-induced dipolar exchange with recoupling - An MAS NMR method for determining heteronuclear distances without irradiating the second spin / K. Saalwachter, K. Schmidt-Rohr // J.Magn.Reson. - 2000. - Vol. 145. - P. 161172. 132. Buffy, J. J. Immobilization and aggregation of the antimicrobial peptide protegrin-1 in lipid bilayers investigated by solid-state NMR / J. J. Buffy, A. J. Waring, R. I. Lehrer, M. Hong // Biochemistry - 2003. - Vol. 42. - P. 13725-13734. 133. Reichert, D. A solid-state NMR study of the fast and slow dynamics of collagen fibrils at varying hydration levels / D. Reichert, O. Pascui, E. R. deAzevedo, T. J. Bonagamba, K. Arnold, D. Huster // Magn.Reson.Chem. - 2004. - Vol. 42. - P. 276284. 134. Bonagamba, T. J. Slow ester side-group flips in glassy poly(alkyl methacrylate)s characterized by centerband-only detection of exchange nuclear magnetic resonance / T. J. Bonagamba, F. Becker-Guedes, E. R. deAzevedo, K. Schmidt-Rohr // J.Polym.Sci.B - Polym.Phys. - 2001. - Vol. 39. - P. 2444-2453. 135. Miyoshi, T. Helical jump motions in isotactic poly(4-methyl-1-pentene) crystallites revealed by 1D MAS exchange NMR spectroscopy / T. Miyoshi, O. Pascui, D. Reichert // Macromolecules - 2002. - Vol. 35. - P. 7178-7181. 136. Pascui, O. Identification of slow dynamic processes in poly(n-hexyl methacrylate) by solid-state 1D-MAS exchange NMR / O. Pascui, M. Beiner, D. Reichert // Macromolecules - 2003. - Vol. 36. - P. 3992-4003. 137. deAzevedo, E. R. Conformational dynamics of phenylene rings in poly(p-phenylene vinylene) as revealed by C-13 magic-angle-spinning exchange nuclear magnetic resonance experiments / E. R. deAzevedo, R. W. A. Franco, A. Marletta, R. M. Faria, T. J. Bonagamba // J.Chem.Phys. - 2003. - Vol. 119. - P. 2923-2934. 138. Woessner, D. E. Nuclear spin relaxation in ellipsoids undergoing rotational Brownian motion / D. E. Woessner // J.Chem.Phys. - 1962. - Vol. 37. - P. 647-654. 238 139. South, G. P. Dielectric dispersion and dipole moment of myoglobin in water / G. P. South, E. H. Grant // Proc.R.Soc.London Ser. A - 1972. - Vol. 328. - P. 371-387. 140. Halle, B. Protein hydration from water oxygen-17 magnetic relaxation / B. Halle, T. Andersson, S. Forsen, B. Lindman // J.Am.Chem.Soc. - 1981. - Vol. 103. - P. 500508. 141. Kimmich, R. Fluctuations, exchange processes, and water diffusion in aqueous protein systems: a study of BSA by diverse NMR techniques / R. Kimmich, T. Gneiting, K. Kotitschke, G. Schnur // Biophys.J. - 1990. - Vol. 58. - P. 1183-1197. 142. Sinha, N. Electrostatics in protein binding and function / N. Sinha, S. J. Smith-Gill // Curr.Protein Pept.Sci. - 2002. - Vol. 3. - P. 601-614. 143. Sheinerman, F. B. Electrostatic aspects of protein-protein interactions / F. B. Sheinerman, R. Norel, B. Honig // Curr.Opin.Struct.Biol. - 2000. - Vol. 10. - P. 153159. 144. Elcock, A. H. Computer simulation of protein-protein interactions / A. H. Elcock, D. Sept, J. A. McCammon // J.Phys.Chem.B - 2001. - Vol. 105. - P. 1504-1518. 145. Nee, T. W. Theory of dielectric relaxation in polar liquids / T. W. Nee, R. Zwanzig // J.Chem.Phys. - 1970. - Vol. 52. - P. 6353-6363. 146. Berne, B. J. A self-consistent theory of rotational diffusion / B. J. Berne // J.Chem.Phys. - 1975. - Vol. 62. - P. 1154-1160. 147. Brito, P. Influence of dielectric friction on molecular reorientations / P. Brito, P. Bordewijk // Mol.Phys. - 1980. - Vol. 39. - P. 217-226. 148. Madden, P. Dielectric friction and molecular reorientation / P. Madden, D. Kivelson // J.Phys.Chem. - 1982. - Vol. 86. - P. 4244-4256. 149. Sophianopoulos, A. J. Physical studies of muramidase (lysozyme). 2. pH dependent dimerization / A. J. Sophianopoulos, K. E. Vanholde // J.Biol.Chem. - 1964. - Vol. 239. - P. 2516-2524. 150. Fedotov, V. D. NMR and dielectric spectroscopy investigation of protein dynamic structure / V. D. Fedotov, Y. D. Feldman, A. G. Krushelnitsky, I. V. Ermolina // J.Mol.Struct. - 1990. - Vol. 219. - P. 293-298. 151. Nesmelova, I. V. Self-diffusion and self-association of lysozyme molecules in solution / I. V. Nesmelova, V. D. Fedotov // Biochim.Biophys.Acta - 1998. - Vol. 1383. - P. 311-316. 152. Jardetzky, O. NMR studies of macromolecular dynamics / O. Jardetzky // Account.Chem.Res. - 1981. - Vol. 14. - P. 291-298. 153. Kakalis, L. T. The dynamics of water in protein solutions: The field dispersion of deuterium NMR longitudinal relaxation / L. T. Kakalis, T. F. Kumosinski // Biophys.Chem. - 1992. - Vol. 43. - P. 39-49. 154. Bertini, I. NMR spectroscopic detection of protein protons and longitudinal relaxation rates between 0.01and 50 MHz / I. Bertini, Y. K. Gupta, C. Luchinat, G. Parigi, C. Schorb, H. Schwalbe // Angew.Chem.Int.Ed. - 2005. - Vol. 44. - P. 2223-2225. 239 155. Gough, S. R. Models for dielectric relaxation of biopolymers: myoglobin in aqueous solution, a five dispersion fit / S. R. Gough // J.Solut.Chem. - 1983. - Vol. 12. - P. 729-739. 156. Gottschalk, M. Self-association of lysozyme as seen by magnetic relaxation dispersion / M. Gottschalk, B. Halle // J.Phys.Chem.B - 2003. - Vol. 107. - P. 79147922. 157. Gottschalk, M. Protein self-association in solution: The bovine pancreatic trypsin inhibitor decamer / M. Gottschalk, K. Venu, B. Halle // Biophys.J. - 2003. - Vol. 84. P. 3941-3958. 158. Carlsson, F. Monte Carlo simulations of lysozyme self-association in aqueous solution / F. Carlsson, M. Malmsten, P. Linse // J.Phys.Chem.B - 2001. - Vol. 105. P. 12189-12195. 159. Крушельницкий, А.Г. Влияние электростатических межмолекулярных взаимодействий на броуновское вращение белков в растворе. / А. Г. Крушельницкий, В. Д. Федотов // Мол. Биол. - 1992. - Т. 26. - С. 424-431. 160. Ermolina, I. V. Investigation of molecular motions and interprotein interactions in solutions by NMR and TDDS / I. V. Ermolina, A. G. Krushelnitsky, I. N. Ivoylov, Y. D. Feldman, V. D. Fedotov // Appl.Magn.Reson. - 1993. - Vol. 5. - P. 265-283. 161. Krushelnitsky, A. G. Overall and internal protein dynamics in solution studied by the nonselective proton relaxation / A. G. Krushelnitsky, V. D. Fedotov // J.Biomol.Struct.Dyn. - 1993. - Vol. 11. - P. 121-141. 162. Файзуллин, Д. А. Исследование динамических свойств биназы в растворе методами водородного обмена и 1Н релаксации / Д. А. Файзуллин, Е. А. Ступишина, А. Г. Крушельницкий, В. Д. Федотов // Мол. Биол. - 1995. - Т. 29. С. 563-573. 163. Крушельницкий, А. Г. Исследование динамики триптофан-репрессора в растворе методом неселективной протонной релаксации / А. Г. Крушельницкий // Мол. Биол. - 1996. - Т. 30. - С. 631-636. 164. Крушельницкий, А. Г. Исследование броуновской динамики бычьего сывороточного альбумина методом протонной релаксации / А. Г. Крушельницкий, Е. В. Юдина, В. Д. Федотов // Мол. Биол. - 1997. - Т. 31. - С. 293-299. 165. Ermakova, E. Brownian dynamics simulation of electrostatically interacting proteins / E. Ermakova, A. G. Krushelnitsky, V. D. Fedotov // Mol.Phys. - 2002. - Vol. 100. - P. 2849-2855. 166. Gallier, J. 1H- and 2H-NMR study of bovine serum albumin solutions / J. Gallier, P. Rivet, J. de Certaines // Biochim.Biophys.Acta - 1987. - Vol. 915. - P. 1-18. 167. Fuoss, R. M. Electrical Properties of Solids. VIII. Dipole Moments in Polyvinyl Chloride-Diphenyl Systems / R. M. Fuoss, J. G. Kirkwood // J.Am.Chem.Soc. - 1941. - Vol. 63. - P. 385-394. 168. Beckmann, P. A. Spectral densities and nuclear spin relaxation in solids / P. A. Beckmann // Phys.Rep. - 1988. - Vol. 171. - P. 85-128. 240 169. Абатуров, Л. В. Тепловые движения белка: мелкомасштабные флуктуации и конформационные подсостояния / Л. В. Абатуров // Мол. Биол. - 1983. - Т. 17. С. 683-704. 170. Halle, B. Flexibility and packing in proteins / B. Halle // Proc.Nat.Acad.Sci.USA 2002. - Vol. 99. - P. 1274-1279. 171. Lee, B. The interpretation of protein structures: estimation of static accessibility / B. Lee, F. M. Richards // J.Mol.Biol. - 1971. - Vol. 55. - P. 379-400. 172. Fushman, D. Surface fractality of proteins from theory and NMR data / D. Fushman // J.Biomol.Struct.Dyn. - 1990. - Vol. 7. - P. 1333-1344. 173. Brilliantov, N. V. Role of electrical interactions in the rotational motion of a charged solute molecule in a polar solvent / N. V. Brilliantov, N. G. Vostrikova, O. P. Revokatov // J.Phys.Chem.B - 1998. - Vol. 102. - P. 6299-6302. 174. Brilliantov, N. V. Influence of dielectric friction and near-surface increase of viscosity on rotational Brownian motion of charged biopolymers in solutions / N. V. Brilliantov, N. G. Vostrikova, V. P. Denisov, Y. M. Petrusievich, O. P. Revokatov // Biophys.Chem. - 1993. - Vol. 46. - P. 227-236. 175. Czaplicki, J. Segmental differences in the stability of the trp-repressor peptide backbone / J. Czaplicki, C. Arrowsmith, O. Jardetzky // J.Biomol.NMR - 1991. - Vol. 1. - P. 349-361. 176. Feldman, Y. Time domain dielectric spectroscopy: An advanced measuring system / Y. Feldman, A. Andrianov, E. Polygalov, I. Ermolina, G. Romanychev, Y. Zuev, B. Milgotin // Rev.Sci.Instr. - 1996. - Vol. 67. - P. 3208-3216. 177. Barlow, D. J. The distribution of charged groups in proteins / D. J. Barlow, J. M. Thornton // Biopolymers - 1986. - Vol. 25. - P. 1717-1733. 178. Spassov, V. Z. Electrostatic interactions in proteins. A theoretical analysis of lysozyme ionization / V. Z. Spassov, A. D. Karshikov, B. P. Atanasov // Biochim.Biophys.Acta - 1989. - Vol. 999. - P. 1-6. 179. Cornell, C. N. Spin-label studies on the sulfhydryl environment in bovine plasma albumin. 2. The neutral transition and the A isomer / C. N. Cornell, L. J. Kaplan // Biochemistry - 1978. - Vol. 17. - P. 1755-1758. 180. Koenig, S. H. Nuclear magnetic relaxation dispersion in protein solutions .I. Apotransferrin / S. H. Koenig, W. S. Schillinger // J.Biol.Chem. - 1969. - Vol. 244. P. 3282-3289. 181. Журавлев, А. К. 1Н- и 2Н-ЯМР релаксация в растворах сывороточного альбумина / А. К. Журавлев, М. Г. Гангардт // Мол. Биол. - 1987. - Т. 21. - С. 434-441. 182. Hallenga, K. Protein rotational relaxation as studied by solvent 1H and 2H magnetic relaxation / K. Hallenga, S. H. Koenig // Biochemistry - 1976. - Vol. 15. - P. 42554264. 183. Grosch, L. NMR relaxation investigation of water mobility in aqueous bovine serum albumin solutions / L. Grosch, F. Noack // Biochim.Biophys.Acta - 1976. - Vol. 453. P. 218-232. 241 184. Schauer, G. Deuteron field-cycling relaxation spectroscopy and translational water diffusion in protein hydration shells / G. Schauer, R. Kimmich, W. Nusser // Biophys.J. - 1988. - Vol. 53. - P. 397-404. 185. Koenig, S. H. A unified view of relaxation in protein solutions and tissue, including hydration and magnetization transfer / S. H. Koenig, R. D. Brown, R. Ugolini // Magn.Reson.Med. - 1993. - Vol. 29. - P. 77-83. 186. Denisov, V. P. Protein hydration dynamics in aqueous solution: a comparison of bovine pancreatic trypsin inhibitor and ubiquitin by oxygen-17 spin relaxation dispersion / V. P. Denisov, B. Halle // J.Mol.Biol. - 1995. - Vol. 245. - P. 682-697. 187. Denisov, V. P. Hydrogen exchange and protein hydration: the deuteron spin relaxation dispersions of bovine pancreatic trypsin inhibitor and ubiquitin / V. P. Denisov, B. Halle // J.Mol.Biol. - 1995. - Vol. 245. - P. 698-709. 188. Venu, K. Water H-1 magnetic relaxation dispersion in protein solutions. A quantitative assessment of internal hydration, proton exchange, and cross-relaxation / K. Venu, V. P. Denisov, B. Halle // J.Am.Chem.Soc. - 1997. - Vol. 119. - P. 31223134. 189. Denisov, V. P. Protein hydration dynamics in aqueous solution / V. P. Denisov, B. Halle // Faraday Discuss. - 1996. - Vol. 103. - P. 227-244. 190. Gottschalk, M. Microsecond exchange of internal water molecules in bacteriorhodopsin / M. Gottschalk, N. A. Dencher, B. Halle // J.Mol.Biol. - 2001. Vol. 311. - P. 605-621. 191. Feldman, Y. D. Time domain dielectric spectroscopy - a new effective tool for physical chemistry investigation / Y. D. Feldman, Y. F. Zuev, E. A. Polygalov, V. D. Fedotov // Colloid Polym.Sci. - 1992. - Vol. 270. - P. 768-780. 192. Валитов В. М. Автоматический временной диэлектрический спектрометр / В. М. Валитов, И.В.Ермолина, Ю.Ф.Зуев, Ю.Д.Фельдман // Жур. Физ. Хим. - 1987. - Т. 61. - С. 564-569. 193. Ermolina, I. Investigation of molecular motion and interprotein interactions in solution by TDDS: a comparison with NMR data / I. Ermolina, V. Fedotov, Y. Feldman, I. Ivoylov // J.Non-Cryst.Solids - 1994. - Vol. 172. - P. 1103-1108. 194. Ermolina, I. V. Dielectric relaxation, molecular motion and interprotein interactions in myoglobin solution / I. V. Ermolina, I. N. Ivoylov, V. D. Fedotov // J.Biomol.Struct.Dyn. - 1997. - Vol. 15. - P. 381-392. 195. Ermolina, I. V. Structure and dynamic behavior of protein molecules in solution / I. V. Ermolina, V. D. Fedotov, Y. D. Feldman // Physica A - 1998. - Vol. 249. - P. 347352. 196. Bodo, G. The crystal structure of myoglobin. 5. A low-resolution three-dimensional fourier synthesis of sperm-whale myoglobin crystals / G. Bodo, H. M. Dintzis, J. C. Kendrew, H. W. Wyckoff // Proc.R.Soc.London Ser.A - Math. - 1959. - Vol. 253. - P. 70-102. 197. Dachwitz, E. On the dielectric relaxation of aqueous myoglobin solutions / E. Dachwitz, F. Parak, M. Stockhausen // Ber.Bunsen-Ges.Phys.Chem.Chem. - 1989. Vol. 93. - P. 1454-1458. 242 198. Fedotov, V. D. On the rotational diffusion of globular proteins in aqueous solutions / V. D. Fedotov, Y. D. Feldman, I. D. Yudin // Stud.Biophys. - 1985. - Vol. 107. - P. 83-90. 199. Halle, B. Biomolecular hydration: From water dynamics to hydrodynamics / B. Halle, M. Davidovic // Proc.Nat.Acad.Sci.USA - 2003. - Vol. 100. - P. 12135-12140. 200. Mukherjee, A. Rotational friction on globular proteins combining dielectric and hydrodynamic effects / A. Mukherjee, B. Bagchi // Chem.Phys.Lett. - 2005. - Vol. 404. - P. 409-413. 201. Chandrasekhar, S. Stochastic, statistical and hydromagnetic problems in physics and astronomy / S. Chandrasekhar - Chicago: University of Chicago Press, 1989. 202. Ermak, D. L. Brownian dynamics with hydrodynamic interactions / D. L. Ermak, J. A. McCammon // J.Chem.Phys. - 1978. - Vol. 69. - P. 1352-1360. 203. Несмелова, И. В. Самодиффузия молекул миоглобина и воды в растворах / И. В. Несмелова, В. Д. Федотов // Высокомол. Соед. - 1997. - Т. 39. - С. 521-526. 204. Allen, M. P. Computer simulation of liquids / M. P. Allen, D. J. Tildesley - Oxford: Clarendon, 1987. 205. Бриллиантов, Н. В. Вращательное броуновское движение полярных макромолекул в растворах / Н. В. Бриллиантов, А. И. Квяткевич, Ю. М. Петрусевич, О. П. Ревокатов // Докл. АН СССР - 1989. - Т. 304. - С. 340-344. 206. Akasaka, K. Spin-spin and spin-lattice contributions to the rotating frame relaxation of C-13 in L-alanine / K. Akasaka, S. Ganapathy, C. A. McDowell, A. Naito // J.Chem.Phys. - 1983. - Vol. 78. - P. 3567-3572. 207. Tekely, P. Attenuation of spin-spin effects in C-13 T1rho NMR experiments by multipulse proton homonuclear decouling / P. Tekely, D. Canet, J. J. Delpuech, J. Virlet // Magn.Reson.Chem. - 1990. - Vol. 28. - P. S10-S14. 208. Федотов, В. Д. Ядерная релаксация в ВСК и динамика спин-системы в твердых аморфных полимерах / В.Д. Федотов, В.М. Чернов // Высокомол. Соед. Сер. А 1977. - Т. 19. - С. 1501-1506. 209. Krushelnitsky, A. Expanding the frequency range of the solid-state T1ρ experiment for heteronuclear dipolar relaxation / A. Krushelnitsky, R. Kurbanov, D. Reicher, G. Hempel, H. Schneider, V. Fedotov // Solid State Nucl.Magn.Reson. - 2002. - Vol. 22. - P. 423-438. 210. Jones, G. P. Spin-lattice relaxation in rotating frame - weak-collision case / G. P. Jones // Phys.Rev. - 1966. - Vol. 148. - P. 332-335. 211. Torchia, D. A. Measurement of proton-enhanced 13C T1 values by a method which suppresses artifacts / D. A. Torchia // J.Magn.Reson. - 1978. - Vol. 30. - P. 613-616. 212. Krushelnitsky, A. Response of lysozyme internal dynamics to hydration probed by C13 and H-1 solid-state NMR relaxation / A. Krushelnitsky, D. Reichert // Appl.Magn.Reson. - 2004. - Vol. 27. - P. 501-518. 213. Yamaguchi, M. Side-chain dynamics in poly(gamma-benzyl L-glutamate) as studied by high-resolution solid-state C-13 nuclear magnetic relaxation in rotating frame / M. Yamaguchi, A. Tsutsumi // Polymer Journal - 1993. - Vol. 25. - P. 131-139. 243 214. Goldman, M. Spin temperature and nuclear magnetic resonance in solids / M. Goldman - Oxford: Clarendon Press, 1970. 215. Иванов, Ю. Н. Термодинамическая теория сужения линий ЯМР спектров в твердых телах. / Ю.Н. Иванов, Б.Н. Провоторов, Э.Б. Фельдман // Жур. Эксп. Теор. Физ. - 1978. - Т. 75. - С. 1847-1861. 216. Ацаркин, В. А. Влияние медленных молекулярных движений на ядерную магнитную релаксацию в условиях "магического угла" / В.А. Ацаркин, Т.Н. Хазанович // Жур. Эксп. Теор. Физ. - 1984. - Т. 87. - С. 279-288. 217. Мефед, А. Е. Ядерная магнитная релаксация в дважды вращающейся системе координат как метод исследования медленных молекулярных движений / A.E. Мефед, В.А. Ацаркин, М.Е. Жаботинский // Жур. Эксп. Теор. Физ. - 1986. - Т. 91. - С. 671-676. 218. Krushelnitsky, A. G. Study of slow molecular motions in alpha-crystallin by proton magnetic spin-lattice relaxation in the doubly rotating frame / A. G. Krushelnitsky, A. E. Mefed, A. A. Kharitonov, V. D. Fedotov // Appl.Magn.Reson. - 2001. - Vol. 20. P. 207-229. 219. Reichert, D. Dynamic carbon-13 MAS NMR: Application to benzene ring flips in polyaryl ethers / D. Reichert, G. Hempel, H. Zimmermann, H. Schneider, Z. Luz // Solid State Nucl.Magn.Reson. - 2000. - Vol. 18. - P. 17-36. 220. Suwelack, D. Slow molecular motion detected in the NMR-spectra of rotating solids / D. Suwelack, W. P. Rothwell, J. S. Waugh // J.Chem.Phys. - 1980. - Vol. 73. - P. 2559-2569. 221. Hughes, C. E. Magic-angle-spinning solid-state NMR applied to polypeptides and proteins / C. E. Hughes, M. Baldus // Annu.Rep.NMR Spectros. - 2005. - Vol. 55. - P. 121-158. 222. Cole, H. B. R. Comparison of the solution and crystal structures of staphylococcal nuclease with 13C and 15N chemical shift used as structural fingerprints / H. B. R. Cole, S. W. Sparks, D. A. Torchia // Proc.Nat.Acad.Sci.USA - 1988. - Vol. 85. - P. 6362-6365. 223. McDermott, A. E. Partial NMR assignments for uniformly (C-13, N-15)-enriched BPTI in the solid state / A. McDermott, T. Polenova, A. Bockmann, K. W. Zilm, E. K. Paulsen, R. W. Martin, G. T. Montelione // J.Biomol.NMR - 2000. - Vol. 16. - P. 209-219. 224. Bockmann, A. Solid state NMR sequential resonance assignments and conformational analysis of the 2 x 10.4 kDa dimeric form of the Bacillus subtilis protein Crh / A. Bockmann, A. Lange, A. Galinier, S. Luca, N. Giraud, M. Juy, H. Heise, R. Montserret, F. Penin, M. Baldus // J.Biomol.NMR - 2003. - Vol. 27. - P. 323-339. 225. Krushelnitsky, A. Solid-state NMR and protein dynamics / A. Krushelnitsky, D. Reichert // Prog.Nucl.Magn.Reson.Spectros. - 2005. - Vol. 47. - P. 1-25. 226. McIntosh, L. P. Assignment of the backbone 1H and 15N NMR resonances of bacteriophage T4 lysozyme / L. P. McIntosh, A. J. Wand, D. F. Lowry, A. G. Redfield, F. W. Dahlquist // Biochemistry - 1990. - Vol. 29. - P. 6341-6362. 244 227. Golbik, R. Folding of barstar C40A/C82A/P27A and catalysis of the peptidyl-prolyl cis/trans isomerization by human cytosolic cyclophilin (Cyp18) / R. Golbik, G. Fischer, A. R. Fersht // Protein Sci. - 1999. - Vol. 8. - P. 1505-1514. 228. Grutter, M. G. Goose lysozyme structure: an evolutionary link between hen and bacteriophage lysozymes? / M. G. Grutter, L. H. Weaver, B. W. Matthews // Nature 1983. - Vol. 303. - P. 828-831. 229. Raghunathan, V. Crystallization and molecular packing analysis of barstar crystals / V. Raghunathan, S. Khurana, V. Gupta, R. Khurana, J. B. Udgaonkar, D. M. Salunke // J.Mol.Biol. - 1994. - Vol. 243. - P. 533-536. 230. Matthews, B. W. Crystallographic data for lysozyme from bacteriophage T4 / B. W. Matthews, F. W. Dahlquist, A. Y. Maynard // J.Mol.Biol. - 1973. - Vol. 78. - P. 575576. 231. Kam, Z. Crystallization of proteins / Z. Kam, H. B. Shore, G. Feher // J.Mol.Biol. 1978. - Vol. 123. - P. 539-555. 232. Martin, R. W. Preparation of protein nanocrystals and their characterization by solid state NMR / R. W. Martin, K. W. Zilm // J.Magn.Reson. - 2003. - Vol. 165. - P. 162174. 233. Pauli, J. Sample optimization and identification of signal patterns of amino acid side chains in 2D RFDR spectra of the alpha-spectrin SH3 domain / J. Pauli, B. van Rossum, H. Forster, H. J. M. de Groot, H. Oschkinat // J.Magn.Reson. - 2000. - Vol. 143. - P. 411-416. 234. Perry, A. Solid-state C-13 NMR reveals effects of temperature and hydration on elastin / A. Perry, M. P. Stypa, B. K. Tenn, K. K. Kumashiro // Biophys.J. - 2002. Vol. 82. - P. 1086-1095. 235. Krushelnitsky, A. G. Simultaneous processing of solid-state NMR relaxation and 1DMAS exchange data: the backbone dynamics of free vs. binase-bound barstar / A. G. Krushelnitsky, G. Hempel, D. Reichert // Biochim.Biophys.Acta - 2003. - Vol. 1650. - P. 117-127. 236. Blout, E. R. Reversible configurational changes in poly-L-lysine hydrochloride induced by water / E. R. Blout, H. Lenormant // Nature - 1957. - Vol. 179. - P. 960963. 237. Krushelnitsky, A. Hydration dependence of backbone and side chain polylysine dynamics: A C-13 solid-state NMR and IR spectroscopy study / A. Krushelnitsky, D. Faizullin, D. Reichert // Biopolymers - 2004. - Vol. 73. - P. 1-15. 238. Krushelnitsky, A. Complex H-1 C-13-NMR relaxation and computer simulation study of side-chain dynamics in solid polylysine / A. Krushelnitsky, D. Reichert // Biopolymers - 2005. - Vol. 78. - P. 129-139. 239. Wang, T. Z. Temperature dependence of anisotropic protein backbone dynamics / T. Z. Wang, S. Cai, E. R. P. Zuiderweg // J.Am.Chem.Soc. - 2003. - Vol. 125. - P. 86398643. 240. Chang, S. L. Temperature dependence of protein backbone motion from carbonyl C13 and amide N-15 NMR relaxation / S. L. Chang, N. Tjandra // J.Magn.Reson. 2005. - Vol. 174. - P. 43-53. 245 241. Чиргадзе, Ю. Н. Роль воды в подвижности пептидных структур. Изучение конформационных переходов полипептидов и олигопептидов при гидратации / Ю.Н. Чиргадзе, A.M. Овсепян // Биофизика - 1972. - Т. 17. - С. 569-574. 242. Fedotov, V. D. Structure and dynamics of bulk polymers by NMR methods / V. D. Fedotov, H. Schneider - Berlin: Springer, 1989. 243. Слуцкер, А. И. Определение энергии активации сложных релаксационных процессов / А. И. Слуцкер, Ю. И. Поликарпов, К. В. Васильева // Физ. Тв. Тела 2002. - Т. 44. - С. 1529-1535. 244. Слуцкер, А. И. К определению энергии активации релаксационных переходов в полимерах методом дифференциальной сканирующей калориметрии / А. И. Слуцкер, Ю. И. Поликарпов, К. В. Васильева // Жур. Тех. Физики - 2002. - Т. 72. - С. 86-91. 245. Абатуров, Л. В. Вода как стабилизатор и пластификатор структуры глобулярных белков / Л.В. Абатуров, Д.А. Файзуллин, Н.Г. Носова // Докл. АН СССР - 1997. - Т. 355. - С. 1-4. 246. Wittebort, R. J. Rotational motions of side-chains of poly-L-lysine / R. J. Wittebort, A. Szabo, F. R. N. Gurd // J.Am.Chem.Soc. - 1980. - Vol. 102. - P. 5723-5728. 247. Bordi, F. High-frequency dielectric study of side-chain dynamics in poly(lysine) aqueous solutions / F. Bordi, C. Cametti, G. Paradossi // Biopolymers - 2000. - Vol. 53. - P. 129-134. 248. The fluctuating enzyme / Ed. G. R. Welch - New York: Wiley, 1986. 249. Alberti, E. Study of wheat high molecular weight 1Dx5 subunit by C-13 and H-1 solid-state NMR. II. Roles of nonrepetitive terminal domains and length of repetitive domain / E. Alberti, S. M. Gilbert, A. S. Tatham, P. R. Shewry, A. Naito, K. Okuda, H. Saito, A. M. Gil // Biopolymers - 2002. - Vol. 65. - P. 158-168. 250. Kalnin, N. N. Quantitative IR spectrophotometry of peptide compounds in water (H2O) solutions. III. Estimation of the protein secondary structure. / N. N. Kalnin, I. A. Baikalov, S. Y. Venyaminov // Biopolymers - 1990. - Vol. 30. - P. 1273-1280. 251. Forte, C. Dynamics of an amorphous polymer by an improved NMR approach based on the simultaneous analysis of H-1 and C-13 relaxation times / C. Forte, M. Geppi, M. Malvaldi, V. Mattoli // J.Phys.Chem.B - 2004. - Vol. 108. - P. 10832-10837. 252. Metropolis, N. Equation of state calculations by fast computing machines / N. Metropolis, A. W. Rosenbluth, M. N. Rosenbluth, A. H. Teller, E. Teller // J.Chem.Phys. - 1953. - Vol. 21. - P. 1087-1092. 253. Wei, Y. F. Solid-state C-13 NMR chemical shift anisotropy tensors of polypeptides / Y. F. Wei, D. K. Lee, A. Ramamoorthy // J.Am.Chem.Soc. - 2001. - Vol. 123. - P. 6118-6126. 254. Hartley, R. W. Barnase and barstar - two small proteins to fold and fit together / R. W. Hartley // Trends Biochem.Sci. - 1989. - Vol. 14. - P. 450-454. 255. Schreiber, G. Interaction of barnase with Its polypeptide inhibitor barstar studied by protein engineering / G. Schreiber, A. R. Fersht // Biochemistry - 1993. - Vol. 32. - P. 5145-5150. 246 256. Jones, D. N. M. Identification of the barstar binding-site of barnase by NMRspectroscopy and hydrogen-deuterium exchange / D. N. M. Jones, M. Bycroft, M. J. Lubienski, A. R. Fersht // FEBS Lett. - 1993. - Vol. 331. - P. 165-172. 257. Lubienski, M. J. 3-dimensional solution structure and C-13 assignments of barstar using nuclear-magnetic-resonance spectroscopy / M. J. Lubienski, M. Bycroft, S. M. V. Freund, A. R. Fersht // Biochemistry - 1994. - Vol. 33. - P. 8866-8877. 258. Olender, Z. Carbon-13 chemical-shift correlation, spin diffusion and self diffusion in isotopically enriched tropolone / Z. Olender, D. Reichert, A. Muller, H. Zimmermann, R. Poupko, Z. Luz // J.Magn.Resonance Ser A - 1996. - Vol. 120. - P. 31-45. 259. Herzfeld, J. Sideband intensities in NMR-spectra of samples spinning at the magic angle / J. Herzfeld, A. E. Berger // J.Chem.Phys. - 1980. - Vol. 73. - P. 6021-6030. 260. Reichert, D. Slow-down of C-13 spin diffusion in organic solids by fast MAS: A CODEX NMR study / D. Reichert, T. J. Bonagamba, K. Schmidt-Rohr // J.Magn.Reson. - 2001. - Vol. 151. - P. 129-135. 261. Oas, T. G. The carbonyl C-13 chemical-shift tensors of 5 peptides determined from N-15 dipole-coupled chemical-shift powder patterns / T. G. Oas, C. J. Hartzell, T. J. Mcmahon, G. P. Drobny, F. W. Dahlquist // J.Am.Chem.Soc. - 1987. - Vol. 109. - P. 5956-5962. 262. Idiyatullin, D. A simple method to measure (CH2)-C-13 heteronuclear dipolar crosscorrelation spectral densities / D. Idiyatullin, V. A. Daragan, K. H. Mayo // J.Magn.Reson. - 2004. - Vol. 171. - P. 4-9. 263. Wong, K. B. NMR N-15 relaxation and structural studies reveal slow conformational exchange in Barstar C40/82A / K. B. Wong, A. R. Fersht, S. M. V. Freund // J.Mol.Biol. - 1997. - Vol. 268. - P. 494-511. 264. van Rossum, B. J. Assignment of amide proton signals by combined evaluation of HN, NN and HNCA MAS-NMR correlation spectra / B. J. van Rossum, F. Castellani, J. Pauli, K. Rehbein, J. Hollander, H. J. M. de Groot, H. Oschkinat // J.Biomol.NMR 2003. - Vol. 25. - P. 217-223. 265. Reichert, D. MAS NMR studies of carbon-13 spin exchange in durene / D. Reichert, G. Hempel, R. Poupko, Z. Luz, Z. Olejniczak, P. Tekely // Solid State Nucl.Magn.Reson. - 1998. - Vol. 13. - P. 137-148. 266. Semertzidis, M. Structure of N-(tert-butoxycarbonyl)glycine / M. Semertzidis, J. Matsoukas, V. Nastopoulos, J. Hondrelis, S. Voliotis, I. Leban // Acta Cryst.C - 1989. - Vol. 45. - P. 1474-1475. 267. Giraud, N. Site-specific backbone dynamics from a crystalline protein by solid-state NMR spectroscopy / N. Giraud, A. Bockmann, A. Lesage, F. Penin, M. Blackledge, L. Emsley // J.Am.Chem.Soc. - 2004. - Vol. 126. - P. 11422-11423. 268. Paulson, E. K. Sensitive high resolution inverse detection NMR spectroscopy of proteins in the solid state / E. K. Paulson, C. R. Morcombe, V. Gaponenko, B. Dancheck, R. A. Byrd, K. W. Zilm // J.Am.Chem.Soc. - 2003. - Vol. 125. - P. 1583115836. 247
