Шалгинских Наталья Андреевна ВЛИЯНИЕ КАНЦЕРОГЕННЫХ И
advertisement
1 РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НИИ Канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ имени Н.Н.Блохина» РАМН На правах рукописи Шалгинских Наталья Андреевна ВЛИЯНИЕ КАНЦЕРОГЕННЫХ И ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ КСЕНОБИОТИКОВ НА ЭПИГЕНЕТИЧЕСКУЮ РЕГУЛЯЦИЮ ТРАНСКРИПЦИИ (14.01.12 - онкология) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: д.м.н. М.Г.Якубовская Москва 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ................................................................................................................4 ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................................... 7 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................................ 10 1.1. Механизмы эпигенетической регуляции экспрессии генов................................................. 10 1.1.1. Метилирование ДНК .......................................................................................................... 12 1.1.2. Модификации гистонов ...................................................................................................... 18 1.1.3. РНК – интерференция......................................................................................................... 23 1.1.4. Реализация эпигенетического молчания или взаимосвязь механизмов эпигенетической регуляции ...................................................................................................................................... 27 1.2. Химический канцерогенез..................................................................................................... 30 1.2.1. Генотоксические и эпигенетические канцерогены............................................................ 34 1.2.2. Влияние химических канцерогенов на эпигенетическую регуляцию экспрессии генов........................................................................................................................... 44 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ..................................................................................................... 53 2.1. Клеточные культуры.............................................................................................................. 53 2.2. Плазмидные векторы ............................................................................................................. 53 2.3. Получение вирусного стока, инфицирование и анализ GFP экспрессии. ........................... 54 2.4. Выделение субпопуляции клеток, содержащей эпигенетически инактивированный геном вируса саркомы птиц.................................................................................................................... 54 2.5. Трансфекция с использованием двухцепочечных олигонуклеотидных РНК-дуплексов (siRNA).......................................................................................................................................... 57 2.6. Определение белка методом Вестерн-блоттинг ................................................................... 58 2.7. Иммунопреципитация хроматина (ChIP).............................................................................. 59 2.8. Количественная ПЦР в реальном времени ........................................................................... 60 2.9. Анализ метилирования методом бисульфитного секвенирования ...................................... 61 2.10. Анализ метилирования методом ELISA ............................................................................. 62 2.11. Анализ метилирования методом метилчувствительной ПЦР............................................ 63 2.12. Статистическая обработка данных...................................................................................... 64 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................................................................................... 65 3.1. Характеристика модельной системы .................................................................................... 65 3 3.1.1. Влияние сайтов интеграции ретровирусного вектора на реактивирующее действие химических соединений. .............................................................................................................. 65 3.1.2. Определение гистоновых модификаций на промоторе и гене GFP.................................. 68 3.1.3. Анализ метилирования ДНК интегрированного провируса ............................................. 70 3.2. Реактивирующее действие химических соединений............................................................ 74 3.2.1. Реактивирующее действие эпигенетических препаратов. ................................................ 74 3.2.2. Тестирование химических соединений на модели HeLa-TI.............................................. 75 3.2.3. Влияние химических соединений на общий уровень гистоновых модификаций............ 80 3.2.4. Изменение общего уровня метилирования ........................................................................ 82 3.2.5. Влияние химических соединений на уровень метилирования ДНК клеток HeLa-TI при реактивации экспрессии GFP в результате обработки химическими соединениями. ............... 83 3.3. Изучение эпигенетических эффектов узкобороздочных лигандов...................................... 85 3.3.1. Анализ реактивирующего действия узкобороздочных лигандов ..................................... 85 3.3.2. Влияние УБЛ на гистоновые модификации в модельной системе HeLa-TI..................... 86 3.3.3. Влияние УБЛ на уровень метилирования ДНК клеток HeLa-TI....................................... 88 3.4. Взаимосвязь процессов модификации гистонов и ДНК метилирования ............................ 89 3.4.1. Совместное действие УБЛ и эпигенетических ингибиторов ............................................ 89 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ............................................................................................. 94 4.1. Особенности используемой модельной системы ................................................................ 94 4.1.1. Распределение гистоновых модификаций на интегрированном векторе ......................... 96 4.1.2. Метилирование ДНК интегрированного провируса ......................................................... 99 4.2. Реактивирующее действие канцерогенных и противоопухолевых ксенобиотиков .......... 102 4.3. Действие узкобороздочных лигандов ................................................................................. 111 4.4.Синергическое действие химических препаратов............................................................... 115 ЗАКЛЮЧЕНИЕ .......................................................................................................................... 119 ВЫВОДЫ.................................................................................................................................... 121 СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................... 123 4 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АДФ - аденозиндифосфат АП - апуриновый/апиримидиновый сайт ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота дцРНК - двухцепочечная РНК кшРНК - короткая шпилькообразная РНК мРНК - матричная РНК миРНК - малая интерферирующая РНК мкРНК - микро РНК НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат памиРНК - повтор-ассоциированная малая интерферирующая РНК ПАУ - полициклические ароматические углеводороды РНК - рибонуклеиновая кислота ASV - вирус саркомы птиц (avian sarcoma virus) ATM - Ataxia-Telangiectasia Mutated BER - эксцизионная репарация оснований (Base excision repair) BRCA1/2 - белки ассоциированные с раком молочной железы (breast cancer type 1/2 susceptibility proteins) BZ - хинуклидил-3-бензилат (chinuclidinylbenzilat) CBP/p300 - семейство Cbp/p300 ассоциированных ацетилтрансфераз (Cbp/p300 related acetyltransferase) CFZ - тетрапептид эпоксикетон CMV - цитомегаловирус (cytomegalovirus) CpdA - 2-(4-ацетоксифенил)-2-хлор-N-метилэтиламмоний хлорида CYP - Цитохром P450 (cytochrome P450) DAPI - 4',6-диамино-2-фенилиндол (diamino fenilindol) d-azaC - 5-аза-2'дезоксицитидин (5-aza-2'-deoxycytidine) DMBA - 7,12-диметилбенз (а) антрацен (dimethylanthracene) DMEM - Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DSB - двойной разрыв ДНК (double-strand break ) dsRNA - двухцепочечная РНК (double stranded RNA) 5 DMSO - диметил сульфоксид (dimethyl sulfoxide) DNMT - ДНК метилтрансферазы (DNA methyltransferases) EGCG - эпигаллокатехин галлат (epigallocatechin gallate) ELISA - иммуноферментный анализ (enzyme-linked immunosorbent assay) FA - флуоцинолона ацетонид (fluocinolone acetonide) FANC - анемия Фанкони (Fanconi anemia) GNAT - семейство Gcn5 ассоциированных ацетилтрансфераз (Gcn5 related acetyltransferase) GFP - зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein) GGNER - репарация неспаренных оснований на уровне полного генома (Global Genome NER) HAT - гистоновые ацетилтрансферазы (hystone acetyltransferases) HDAC - гистоновые деацетилазы (histone deacetylases) HMT - гистоновые метилтрансферазы (histome methyltransferases) HR - гомологичная рекомбинация (Homologous recombination) hTERT - human telomerase reverse transcriptase H3 - гистон H3 H4 - гистон H4 H2A - гистон H2A H2B - гистон H2B HIV1 - вирус иммунодефицита человека 1 (human immunodeficiency virus 1) KDM - гистоновые лизин деметилазы (lysine demethylase) LTR - длинные концевые повторы (long terminal repeat) MEM - Eagles Minimum Essential Medium MLV - вирус мышиной лейкемии (murine leukemia virus) MMR-IDL - репарация мисмэтчей вызванных при вставках либо делециях (insertiondeletion mismatches) MYST - семейство Myst ассоциированных ацетилтрансфераз (Myst related acetyltransferase) mRNA - матричная РНК (matrix RNA) miRNA - микро РНК (micro RNA) MBD1 - метил- связывающий белок (metyl -binding domain) 6 MBP - ДНК метил-CpG-связывающиq белок (metyl-CpG-binding protein) MMR - репарация мисмэтчей (DNA mismatch repair) NAD - никотинамидадениндинуклеотид (nicotinamide adenine dinucleotide) NER - репарация неспаренных оснований (nucleotide excision repair) NHEJ - репарация воссоединением негомологичных концов (Non-homologous end joining) PCNA - ядерный антиген пролиферации (Proliferating Cell Nuclear Antigen) PRC - репрессорный Поликомб комплекс (Polycomb Repressive Complex) RISC - РНК-индуцируемый комплекс пострансляционного молчания (RNAinduced silencing complex) RITS - РНК-индуцируемый комплекс трансляционного молчания (RNA-induced transcriptional silencing) SAHA - субероиланилид гироксамиковая кислота (suberoylanilide hydroxamic acid) shRNA - короткая шпилькообразная РНК (short hairpin RNA) siRNA - малая интерферирующая РНК (small interfering RNA) TCNER - транскрипционно-зависимая репарация неспаренных оснований (transcription-coupled NER) TSA - трихостатин А (trichostatin A) VPA - валпроиковая кислота (valproic acid) 5-azaC - 5 -азацитидин (5-azacytidine) 7 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы. Химические канцерогены являются одним из самых распространенных этиологических факторов онкологических заболеваний человека. Наряду с индукцией повреждений структуры ДНК, они могут влиять на процессы метилирования ДНК, модификации гистонов и РНК-интерференции, вызывая изменения эпигенетической регуляции экспрессии генов. Такие изменения, в свою очередь, приводят к нарушению механизмов регуляции большинства биологических процессов: клеточной дифференцировки, пролиферации, репарации ДНК и апоптоза, что в конечном итоге вызывает опухолевую трансформацию и способствует опухолевой прогрессии. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что помимо канцерогенных соединений эпигенетически активными являются также противоопухолевые препараты, относящиеся к алкилгалогенидам, алкенам, эпоксисоединениям. Они способны необратимо ингибировать метилтрансферазы, эпигенетически модулируя экспрессию генов. Имеются также отдельные данные о влиянии некоторых химиопрепаратов на состояние гистонов, что играет большую роль в репарации повреждений ДНК, обеспечивая эффективность комбинированной химиотерапии. Однако, несмотря на активное развитие исследований отдельных эпигенетических изменений в процессе канцерогенеза и при проведении химиотерапии, проблема оценки эффектов химических соединений на реактивацию эпигенетически репрессированных генов изучена недостаточно. Таким образом, изучение влияния канцерогенных и противоопухолевых ксенобиотиков на эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов является актуальной задачей современной молекулярной онкологии. Помимо более детального понимания молекулярных механизмов влияния ксенобиотиков на системы эпигенетической регуляции генов, данное исследование представляется целесообразным в плане определения новых стратегий создания химиотерапевтических препаратов, а также скрининга потенциально опасных вновь синтезированных химических соединений. Основные цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования является изучение влияния канцерогенных и противоопухолевых ксенобиотиков на процессы эпигенетической регуляции экспрессии генов. В соответствии с основной целью нашего исследования были поставлены следующие 8 задачи: 1. Оценить возможность использования модельной системы, представляющей собой субпопуляцию HeLa клеток, несущую ретровирусный вектор с эпигенетически репрессированным репортерным геном зеленого флуоресцентного белка GFP, для скрининга химических соединений на способность реактивировать экспрессию генов. 2. Провести скрининг химических канцерогенов и химиотерапевтических препаратов на способность реактивировать экспрессию генов на данной модельной системе. 3. Оценить эффекты канцерогенов и химиотерапевтических препаратов, вызвавших реактивацию экспрессии GFP, на метилирование ДНК. 4. Исследовать влияние канцерогенов и химиотерапевтических препаратов на модификации гистонов. 5. Изучить влияние соединений, оказавших реактивирующее действие на экспрессию GFP, на активность отдельных факторов эпигенетической регуляции экспрессии генов. Научная новизна. В данном исследовании впервые был предложен метод скрининга канцерогенных и противоопухолевых ксенобиотиков на модельной системе клеток человека, несущих эпигенетически репрессированный ретровирусный геном, содержащий флуоресцентный белок GFP. В результате скрининга был исследован эффект широкого ряда химических и эпигенетически противоопухолевых ксенобиотиков репрессированных генов, на исследовано реактивацию транскрипции их влияние на гистоновые модификации и метилирование ДНК. Впервые продемонстрированы эпигенетические эффекты противоопухолевых препаратов Bortezomib, MLN4924, Mimosine, Bleomycin. Также было показано, что реактивацию экспрессии генов способны вызывать соединения класса узкобороздочных лигандов, что является одним из первых экспериментальных свидетельств влияния соединений Hoechst 33342 и Hoechst 33258 на модификации гистонов и метилирование ДНК. Впервые был показан синергизм действия данных соединений в различных комбинациях с эпигенетическими препаратами (трихостатином-А (TSA) и 5азацитидином (5-azaC)). Научно-теоретическая и практическая значимость исследования. На основании результатов настоящего исследования было расширено понимание механизмов химического канцерогенеза, в частности, для Bleomycin, известного генотоксического агента, вызывающего двунитевые разрывы, выявлена способность к эпигенетической регуляции экспрессии генов. Также в работе был оптимизирован метод быстрого скрининга канцерогенных и противоопухолевых ксенобиотиков, позволяющий выявлять соединения, 9 вызывающие значимую реактивацию экспрессии эпигенетически репрессированных генов. Оценка влияния канцерогенных и противоопухолевых ксенобиотиков на эпигенетические механизмы регуляции генов может послужить руководством к выбору стратегий синтеза новых химиотерапевтических препаратов и разработки путей их внедрения в клинику. 10 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Механизмы эпигенетической регуляции экспрессии генов Регуляция транскрипции генов является одним из механизмов регуляции большинства биологических процессов: клеточной дифференцировки, пролиферации, апоптоза и многих других. В дифференцированных клетках взрослого организма соблюдается строгая регуляция экспрессии тканеспецифических генов, подавление генов участвующих в дифференцировке стволовых клеток, повторяющихся элементов генома (LINE, SINE элементов) и эндогенных ретровирусных последовательностей. Исследования последних лет показали, что в процессах канцерогенеза и прогрессии опухолей играют значительную роль не только генетические, но и эпигенетические изменения [Baylin, 2004; Б.П.Копнин, 2004; Pogribny and Beland, 2012]. Было показано, что в процессе образования и прогрессии опухолей нарушение экспрессии многих генов происходит за счетизменения их эпигенетической регуляции [Baylin, 2004]. В основе эпигенетической регуляции генов лежат два взаимосвязанных процесса: метилирование ДНК и химические модификации гистонов с распознающими и модифицирующими их ферментами. При этом метилирование промоторных областей генов ассоциировано с подавлением транскрипции, а метилирование кодирующих последовательностей генов – с ее активацией [Jones and Baylin, 2002; Baylin, 2005; Kisseljova and Kisseljov, 2005]. В процессе опухолеобразования может происходить как реактивация экспрессии ранее неактивных генов, так и подавление их транскрипции [Baylin, 2004]. К таким изменениям могут приводить естественные ошибки репликации ДНК в делящихся клетках, особенно в случае недостаточно эффективной работы систем репарации ДНК, а также внешние воздействия – химические канцерогены, ионизирующее и УФ облучение [Б.П.Копнин, 2004]. Для некоторых канцерогенов была выявлена способность одновременно с генотоксическим действием изменять уровень метилирования ДНК за счет модификаций ее оснований и ингибирования ферментов системы эпигенетической регуляции экспрессии генов [Cisneros and Branch, 2004; Anway, Cupp et al., 2005]. Также установлено, что метилированные сайты ДНК являются наиболее частой мишенью канцерогенных метаболитов и местом образовании аддуктов [Hu, Feng et al., 2003]. Данный механизм объясняется тем, что присутствие модифицированного цитозина приводит к локальному изменению структуры хроматина и делает данную область более доступной для модификаций [Белицкий, 2006]. 11 В репарации повреждений ДНК (разрывов, модификаций оснований, межнитевых сшивок), инициированных химическими канцерогенами, большую роль играет состояние гистонов. Например, изменение структуры N-концевого участка гистона Н4, нарушающее ацетилирование лизина, увеличивает количество химичеки индуцированных мутаций и хромосомных аберраций в период S-фазы клеточного цикла [Choy and Kron, 2002]. Таким образом, изменение гистонового кода ведет не только к нарушению процессов репарации, но и транскрипции, репликации и работы сверочных точек клеточного цикла. Также в последние годы все больший интерес привлекает изучение регуляции генов при помощи микроРНК, точечные мутации или нарушение регуляции которых в свою очередь приводит к изменению паттерна экспрессии генов. Процесс эпигенетического подавления транскрипции как в норме, так и в процессе воздействия канцерогенных ксенобиотиков можно разделить на нескольких стадий: инициацию эпигенетического молчания, его поддержание и реактивацию экспрессии генов. Для стадии инициации характерно метилирование ДНК и гистонов на заданном участке хроматина посредством привлечения модифицирующих эпигенетических факторов. Инициация эпигенетической репрессии транскрипции наблюдается при изменении профиля экспрессии генов во время дифференцировки клеток в период эмбрионального развития, а также при интеграции чужеродной (вирусной) ДНК в геном. На стадии поддержания эпигенетического молчания существующие модификации гистонов сохраняются. Если этап поддержания молчания прерывается, то происходит реактивация транскрипции гена. 12 1.1.1. Метилирование ДНК Наличие метилированных оснований в ДНК было обнаружено у различных организмов, включая прокариот, у которых наблюдается метилирование по основаниям цитозина и аденина, что является частью системы распознавания и защиты от чужеродной ДНК [Wilson and Murray, 1991]. У эукариот метилирование происходит только по основаниям цитозина и осуществляется при помощи ДНК-метилтрансфераз, которые переносят метильную группу с S-аденозил-L-метионина на цитозин в положении С-5. Образующийся при этом 5-метилцитозин (5-mC), находится преимущественно в CpG динуклеотидах, метилирование которых ассоциировано с конденсированным состоянием хроматина и отсутствием экспрессии генов [Bird and Wolffe, 1999; Гвоздев, 1999; Suzuki and Bird, 2008]. Для млекопитающих, помимо защиты генома от чужеродной вирусной ДНК и мобильных элементов генома, метилирование ДНК необходимо при дифференцировке клеток во время эмбриогенеза, геномного импринтинга и инактивации X-хромосомы [Bestor and Bourc'his, 2004; Razin and Kantor, 2005]. У человека метилированные CpG-динуклеотиды составляют 70-80% от общего их числа в геноме, их совокупность составляет ДНК-метилом. Однако распределение метилированных CрG-нуклеотидов по геному млекопитающих неравномерно: при наличии протяженных областей, содержащих небольшое количество метилированных CpG- динуклеотидов, встречаются короткие участки, с высоким содержанием GC-оснований, так называемые CpG островки [Bird, 1986; Bird, 2002]. CpG-островки часто входят в состав регуляторных областей генов. Многочисленные исследования подтверждают влияние метилирования ДНК в промоторных областях генов на их экспрессию: при наличии большого количества метилированных CpG-динуклеотидов часто наблюдается резкое снижение экспрессии ряда генов [Majumder, Kutay et al., 2006]. В норме паттерн метилирования устанавливается в эмбриогенезе в результате баланса процессов метилирования и деметилирования ДНК. В дифференцированных клетках паттерн метилирования поддерживается в относительно неизменном виде, но может существенно нарушаться при старении и при развитии некоторых заболеваниях, в том числе при возникновении злокачественных новообразований [Киселева Н.П., 2005; Lewandowska and Bartoszek, 2011]. Существенное снижение содержания 5-метил-цитозина по сравнению с соответствующими нормальными тканями было обнаружено во многих неоплазиях человека и животных. Наряду с общим снижением уровня метилирования ДНК, в опухолевых клетках 13 наблюдается избирательное локальное гиперметилирование цитозина в составе CpGдинуклеотидов, расположенных в 5' -регуляторных областях генов [N. E. Fomchenko, E. V. Voropayev 2004]. Таким образом, изменение паттерна метилирования ДНК приводит к нарушению нормальной регуляции транскрипции генов [Baylin, 2004; Baylin, 2005; Fraga and Esteller, 2007]. К настоящему времени различают несколько взаимосвязанных механизмов, посредством которых происходит подавление экспрессии генов в результате метилирования регуляторных участков в геноме [Klose and Bird, 2006] (Рисунок 1). Рисунок 1 Механизмы ДНК-опосредованной репрессии экспрессии генов. (А) Метилирование ДНК в области связывания транскрипционных факторов (TF) [Klose and Bird, 2006] (Б) Метил-CpGсвязывающие белки (MBP), распознающие метилированные участки ДНК и корепрессорные молекулы. (В) Взаимодействие ДНК метилтрансфераз (DNMT), гистоновых деацетилаз (HDAC) и метилтрансфераз (HMT) с образованием репрессорного комплекса в промоторной области. (Г) Метил-CpG-связывающие белки (MBP) и метилирование ДНК в кодирующей области. [Watt and Molloy, 1988] Метилирование цитозина может препятствовать взаимодействию некоторых транскрипционных факторов с ДНК, тем самым ингибируя активацию транскрипции (Рисунок 1А) [Watt and Molloy, 1988].С другой стороны, наличие метилирования в промоторной области генов, является сигналом для связывания с ними специфических белков, участвующих в установлении репрессирующего потенциала. В случае 14 взаимодействия с ДНК метил-CpG-связывающих белков (MBP) с привлечением транскрипционных корепрессоров происходит изменение структуры хроматина и подавление экспрессии генов (Рисунок 1Б) [Jones, Veenstra et al., 1998; Nan, Ng et al., 1998; Sarraf and Stancheva, 2004; Fatemi and Wade, 2006]. ДНК-метилтрансферазы (DNMT), помимо их ДНКметилирующей активности, входят в состав репрессорных белковых комплексов, включающих гистоновые деацетилазы (HDAC) и метилтрансферазы (HMT), что также снижает уровень транскрипции и изменяет структуру хроматина (Рисунок 1В) [Boyes and Bird, 1991; Hendrich and Bird, 1998]. Кроме того, было показано влияние этих белков на экспрессию метилированных участков гена, удаленных от сайта начала транскрипции [Hsieh, 1997; Lorincz, Dickerson et al., 2004]. Механизм такой репрессии до конца не изучен, однако наличие метилированных CpG-динуклеотидов в кодирующей области гена может препятствовать элонгации транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой, за счет образования репрессорных комплексов с участием MBP-белков или опосредованно за счет изменения структуры хроматина [Lorincz, Dickerson et al., 2004]. В таблице 1 приведены примеры генов, нарушение экспрессии которых обусловлено метилированием [Lewandowska and Bartoszek, 2011]. Степень метилирования одиночных CpG-динуклеотидов может значительно различаться в зависимости от типа клеток и тканей. В этом случае роль метилирования в регуляции экспрессии ограничивается теми генами, в регуляции которых участвуют факторы транскрипции, чувствительные к метилированию ДНК (Рисунок 1А) [Walsh and Bestor, 1999]. Однако метилирование одиночных CpG является важным механизмом в поддержании целостности генома за счет стабилизации структуры хромосом [Smith and Crocitto, 1999; Liang, Chan et al., 2002]. У эукариот среди ДНК-метилтрансфераз, регулирующих метилирование ДНК, выделяют два типа ферментов, различающихся по предпочитаемому субстрату [Bestor and Verdine, 1994]. De-novo метилтрансферазы, как правило, отвечают за метилирование ранее неметилированных CpG сайтов. После того, как определенная область ДНК подверглась метилированию, данная модификация поддерживается в ряду клеточных делений с помощью ферментов другого класса - поддерживающих ДНК метилтрансфераз, которые копируют уже существующее метилирование на дочернюю цепь во время репликации ДНК. 15 Таблица 1 - Гены, гиперметилированые при злокачественных новообразованиях Ген Функция кодируемого белка Регуляция клеточного цикла Трансдукция сигналов Rb APC p14ARF p15/CDKN 2B p16/CDKN 2A BRCA1 VHL Регуляция клеточного цикла Регуляция клеточного цикла Регуляция клеточного цикла Репарация ДНК hMLH1 Супрессор опухолевого роста Репарация мисметчей ER-a Рецептор эстрогенов Myf-3 Дифференцировка миобластов Клеточная адгезия E-cadherin Bcr-abl Регуляция деления и дифференцировки GSTP1 Детоксикация PTEN Регуляция роста и апоптоза DNMT1. Тип неоплазии Источник Ретинобластома [Jones and Baylin, 2002] [Baylin, 2005] Рак толстого кишечника и другие опухоли Рак толстого кишечника Лейкозы Различные опухоли Рак молочной железы и яичников Рак почки Рак молочной железы, желудка и эндометрия Рак молочной железы и другие гормонзависимые опухоли Рак молочной железы Опухоли различных органов Острый гранулоцитарный лейкоз Рак предстательной железы, почки, молочной железы, гепатоцеллюлярный рак печени Рак предстательной железы ДНК-метилтрансфераза DNMT1 [Herman, Jen et al., 1996] [Herman, Merlo et al., 1995] [Esteller, Silva et al., 2000] [Herman, Umar et al., 1998] [Issa, Ottaviano et al., 1994] [Hahnel, Harvey et al., 1996] [Yoshiura, Kanai et al., 1995] [Zion, Ben-Yehuda et al., 1994] [Esteller, 2003] [Dimitrijevic, 2005] [Smith and Crocitto, 1999; Liang, Chan et al., 2002] [Esteller, Silva et al., 2000] является поддерживающей метилтрансферазой и ассоциирована с локусами репликации во время S-фазы клеточного цикла [Leonhardt, Page et al., 1992]. Также ранее для DNMT1 было показано предпочтение к полуметилированной ДНК [Bestor and Ingram, 1983]. Однако значение DNMT1 в качестве только поддерживающей ДНК метилтрансферазы оспаривается, поскольку высокий уровень экспрессии данного белка был обнаружен в тканях с низким уровнем пролиферации клеток 16 (сердце, головной мозг) [Yen, Vertino et al., 1992; Robertson, Uzvolgyi et al., 1999; Jones and Liang, 2009]. Также были получены данные, свидетельствующие о возможном участии DNMT1 в процессах de-novo метилирования ДНК [Jair, Bachman et al., 2006]. Об альтернативных функциях данного белка свидетельствует также наличие в клетке его альтернативных транскрипционных изоформ [Robertson, Uzvolgyi et al. 1999]. DNMT3A и DNMT3B. К de-novo ДНК метилтрансферазам в настоящее время относят белки DNMT3A и DNMT3B. Об их участии в de-novo метилировании свидетельствует высокий уровень их активности в эмбриональных клетках и независимость их экспрессии от фаз клеточного цикла [Okano, Bell et al., 1999]. Однако во время S-фазы клеточного цикла были обнаружены локусы, содержащие DNMT3A и частично перекрывающиеся с локусами репликации [Bachman, Rountree et al., 2001]. По сравнению с экспрессией DNMT3A, распространенной в тканях повсеместно, уровень экспрессии DNMT3B значительно ниже. Основную роль DNMT3B играет в в сперматогенезе, так как в тканях яичка наблюдается наиболее высокий уровень экспрессии этого белка [Okano, Bell et al., 1999; Robertson, Uzvolgyi et al., 1999]. Также была показана ассоциация данных белков с транскрипционными факторами [Fuks, Burgers et al., 2001]. К настоящему времени известно три возможных механизма de-novo метилирования ДНК: (1) DNMT3 ферменты сами способны распознавать ДНК или хроматин за счет специфического PWWP-домена; (2) DNMT3A и DNMT3B могут привлекаться за счет белковых взаимодействий с транскрипционными репрессорами или другими факторами; (3) система РНК- интерференции может привлекать ферменты de-novo метилирования к специфическим последовательностям ДНК [Klose and Bird, 2006]. Тем не менее, механизмы образования нового профиля метилирования ДНК остаются изученными не до конца. Кроме того, для DNMT3A и DNMT3B было показано участие и в процессе поддержания метилирования ДНК [Liang, Chan et al., 2002; Chen, Ueda et al., 2003]. DNMT2. ДНК-метилтрансфераза DNMT2 была изначально отнесена к семейству ДНК-метилтрансфераз по гомологии ее каталитического домена с другими ДНКметилтрансферазами [Okano, Xie et al., 1998]. Однако ферментативная метилтрансферазная активность данного белка значительно ниже по сравнению другими ДНК- метилтрансферазами (DNMT1, DNMT3A и DNMT3B) [Jeltsch, Nellen et al., 2006]. Также позднее была продемонстрировано участие данного белка в метилировании РНК [Schaefer, Pollex et al.] 17 DNMT3L. ДНК-метилтрансфераза 3L (DNMT3L) не обладает метилтрансферазной активностью, но может стимулировать активность DNMT3A и DNMT3B [Suetake, Shinozaki et al., 2004]. Снижение уровня транскрипции при участии DNMT3L происходит за счет белок-белкового взаимодействия с другими ДНК-метилтрансферазами и образования репрессорного комплекса при участии гистоновых деацетилаз и метилтрансфераз [Aapola, Liiv et al., 2002; Deplus, Brenner et al., 2002]. Метилирование ДНК является стабильной и наследуемой модификацией, однако она может быть обратима под воздействием деметилирующих агентов - ингибиторов ДНКметилтрансфераз [Xiao, Ding et al., 2006]. В 2009 году было описано гидроксиметилирование цитозина как новая модификация ДНК, однако в настоящее время его роль остается слабо изученной. Эта модификация найдена в большинстве клеточных типов, включая нейроны и стволовые клетки [Stroud, Feng et al.; Лихтенштейн А.В. , 2001; Киселева Н.П., 2005; Kriaucionis and Heintz, 2009]. Было показано, что при процессинге метилцитозина in vitro и in vivo может образовываться гидроксиметилцитозин [Tahiliani, Koh et al., 2009]. таким образом данный аспект создает новое направление в области изучения регуляции экспрессии генов на уровне ДНК. Скрининг распределения гидроксиметилирования в геноме стволовых плюрипотентных клеток показал ассоциацию данной модификации с энхансерными и промоторными областями некоторых генов, а также с монометилированием H3K4 и ацетилированием H3K27 (модификациями, характерными для активно транскрибируемых промоторов и энхансерных областей) [Stroud, Feng et al.; Szulwach, Li et al.]. Структурное сходство 5-метилцитозина и гидроксиметилцитозина усложняет анализ функций данных модификаций в процессе исследований. Было показано, что наличие гидроксиметилцитозина может ингибировать связывание МВР-белков с ДНК и ингибировать функцию поддерживающей DNMT1 [Valinluck, Tsai et al., 2004; Valinluck and Sowers, 2007]. Список генов, эпигенетическая инактивация которых в опухолевых клетках происходит путем метилирования промоторов, постоянно растет [Залетаев Д.В., 2008]. Было установлено, что профиль метилированных генов представляет собой уникальную характеристику опухоли и может быть использован для классификации заболевания или определения стадии его развития. В настоящее время многие группы исследователей разрабатывают алгоритмы метилирования в качестве использования маркеров для некоторых генов диагностики, с высокой определения частотой групп риска возникновения рака, прогноза и мониторинга заболевания, а также проводят дизайн и 18 испытания противоопухолевых препаратов на основании ингибиторов метилирования [Jones and Baylin, 2002; Baylin, 2005; Kisseljova and Kisseljov, 2005; Киселева Н.П., 2005; Кирсанова О.В., 2009]. 1.1.2.Модификации гистонов У эукариот основание нуклеосомы составляют гистоновые белки. Тетраметр из гистонов Н3 и Н4 и двух гетеродимеров Н2А и Н2В образуют ядро нуклеосомы. У высших эукариот гистоновый белок Н1 осуществляет конденсацию хроматина и обеспечивает взаимодействие нуклеосом между собой [Francis, Kingston et al., 2004]. Степень конденсации хроматина регулирует доступность ДНК для транскрипционных факторов [Luger, Mader et al., 1997; Suto, Clarkson et al., 2000]. ДНК в составе эухроматина характеризуется наличием транскрипционной активности. Переход из эухроматина в гетерохроматин характерен для нетранскрибируемых областей в интерфазе и обеспечивает конденсацию хромосом непосредственно перед делением клетки. Пространственная структура отдельного гистона представляет собой глобулярное ядро, осуществляющее димеризацию, и неструктурированный N-концевой домен, определяющий стабильность нуклеосомы [Hayes, Clark et al., 1991]. Особенностью Nконцевых участков гистонов является их способность подвергаться большому числу модификаций: метилированию, ацетилированию, фосфорилированию, АДФ- рибозилированию, убиквитинированию, сумоилированию, деиминированию и изомеризации пролина. N-концевые участки гистонов могут быть одновременно модифицированы по нескольким аминокислотным остаткам [Barski, Cuddapah et al., 2007; Kouzarides, 2007]. Кроме того, некоторые аминокислоты (лизин и аргинин) могут находиться в состояниях моно-, ди- и триметилирования (моно- и диметилирования для аргинина). На рисунке 2 представлена схема образования нуклеосомы и возможных модификаций гистонов [Marks, Rifkind et al., 2001]. Такое разнообразие модификаций дает огромное количество потенциальных функциональных вариантов и позволяет предполагать наличие уникального гистонового кода, определяющего не только степень конденсации хроматина, но и уровень экспрессии генов [Jenuwein and Allis, 2001; Turner, 2002]. Изменение модификаций гистонов - очень динамичный процесс, что представляет дополнительную сложность в изучении роли модификаций гистонов в эпигенетической регуляции генов. 19 Рисунок 2 Структурная организация нуклеосомы и N-концевых участков гистонов. (А) Ядро нуклеосомы представляет собой октамер, состоящий из гетеродимеров гистоновых белков (H2A-H2B и H3-H4) и ДНК. (Б) N-концевые участки гистонов с возможными модификациями (А – ацетилирование, М – метилирование, С – карбоксилирование, Ub – убиквитинирование, Р – фосфорилирование). Учитывая большое количество модификаций, характерных для различных типов гистонов, принята следующая система обозначений: первым обозначается тип гистона (H3, H4, H2A/B), затем следует однобуквенное обозначение модифицированной аминокислоты (K – лизин, S – серин, Е – глутамин и т.д), ее порядковый номер, отсчитывая от N-конца белка (K9) и далее обозначается тип модификации. [Grunstein, 1997; Wolffe and Hayes, 1999] Ацетилирование гистонов. Процессы ацетилирования и деацетилирования гистонов тесно взаимосвязаны и наиболее изучены к настоящему времени. Ацетилирование гистонов увеличивает доступность хроматина для транскрипционного аппарата, способствуя активации транскрипции [Grunstein, 1997; Wolffe and Hayes, 1999]. Степень ацетилирования гистонов определяется активностью двух типов ферментов – гистоновых ацетилтрансфераз (histone acetyltransferases, HAT) и гистоновых деацетилаз (histone deacetylases, HDAC). Гистоновые ацетилтрансферазы разделяют по их субстрат-распознающему мотиву на три основных семейства: GNAT, MYST и CBP/p300 [Sterner and Berger, 2000; Lee and Workman, 2007]. Функции этих белков зачастую перекрываются из-за низкой специфичности, 20 однако при взаимодействии с различными кофакторами специфичность данных ферментов значительно повышается. Так, комплекс гистонацетилтрансферазы MSL с кофакторами (семейства MYST) высокоспецифичен к ацетилированию H4K16, а потеря ацетилирования в данном положении приводит к дестабилизации нуклеосом и деконденсации хроматина [Shogren-Knaak, Ishii et al. 2006, Fraga, Ballestar et al. 2005]. Для некоторых представителей белков семейств GNAT и MYST ранее было продемонстрировано участие в системах репарации ДНК: для ацетилтрансфераз семейства GNAT в репарации неспаренных оснований (nucleotide excision repair (NER))[Brand, Moggs et al., 2001], а для белков MYST - в репарации двойных разрывов ДНК (double-strand break (DSB) repair) [Ikura, Ogryzko et al., 2000]. Помимо гистонов, ацетилтрансферазы способны ацетилировать и негистоновые субстраты. Одним из таких белков, активность которого регулируется ацетилтрансферазой CBP/p300, является опухолевый супрессор p53 [Gu and Roeder, 1997] и другие [Yang, 2004]. Деацетилирование гистонов приводит к компактизации хроматина, что характерно для нетранскрибируемых участков ДНК. Гистоновые деацетилазы, отвечающие за удаление ацетильной группы с N-концевых участков гистонов, представлены двумя семействами белков, обладающих деацетилазной активностью, но отличающихся по своей структуре и функциям. Семейство SIR2 включает NAD+ -зависимые деацетилазы, которые были выделены в отдельное семейство в связи с их сходством с белком дрожжей Sirtuin [de Ruijter, van Gennip et al., 2003]. Классические (NAD+ -независимые) гистоновые деацетилазы в свою очередь разделяют на 2 класса: представители I класса (HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8 и HDAC11) отличаются широким профилем экспрессии и преимущественно ядерной локализацией. Белки данного класса деацетилаз вовлечены в процессы реорганизации структуры хроматина и регуляции экспрессии генов [de Ruijter, van Gennip et al., 2003]. Гистоновые деацетилазы II класса (HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDA7, HDAC9 и HDAC10) обнаруживаются как в ядре, так и в цитоплазме, и в основном экспрессируются в дифференцирующихся клетках [de Ruijter, van Gennip et al., 2003]. Также, как и для гистоновых ацетилтрансфераз, для HDAC была показана их способность деацетилировать негистоновые белки: тубулин, опухолевый супрессор p53, транскрипционный фактор NF-κB и др. [Rothgiesser, Erener et al.; Gulick, Mellors et al., 1997; Luo, Su et al., 2000] Метилирование гистонов. В отличие от ферментов, регулирующих ацетилирование и деацетилирование гистонов, белки, катализирующие метилирование гистонов (гистоновые метилтрансферазы, HMT), обладают высокой специфичностью. Метилирование аминокислотных остатков в составе N-концевых участков гистонов может происходить по 21 одному или нескольким положениям в пределах одного гистона, где для лизина характерно моно-, ди- и триметилирование, а для аргинина - моно- и диметилирование. Для ди- и триметилирования лизина в составе гистона Н3 было показано симметричное и ассиметричное положения [van der Heijden, Dieker et al., 2005]. Таким образом, специфичность работы гистоновых метилтрансфераз обусловливается необходимостью в распознавании определенной аминокислоты. Для промоторной области активно транскрибируемых генов характерно наличие триметилированных аминогрупп в положениях H3K4me3, H3K36me3, H3K79me3 и H4R17me2, причем H3K4me3 и H3K36me3, расположенные за промоторной областью, также необходимы для транскрипции [Barski, Cuddapah et al., 2007; Guenther, Levine et al., 2007]. Триметилирование аминогрупп в положениях H3K9me3, H3K27me3 и H4K20me3 напротив ассоциировано с гетерохроматиновой областью и репрессией генов [Barski, Cuddapah et al., 2007; Guenther, Levine et al., 2007]. Метилирование в области H3K9 приводит к связыванию с гистонами белка HP1 (Histone protein 1), который необходим для поддержания конденсированного состояния хроматина [Bannister, Zegerman et al., 2001]. Функции моно- и диметилирования изучены не до конца, однако была показана колокализация монометилирования H3K9me1 и H4K20me1 в области сайта старта транскрипции и их распределение в кодирующей области активно транскрибируемых генов [Sims, Houston et al., 2006; Vakoc, Sachdeva et al., 2006]. Ранее считалось, что в отличие от ацелилирования, метилирование белков необратимо. После открытия лизин-специфической деметилазы (LSD1), распознающей монои диметилирование H3K4me1/2 и H3K9me1/2, а также белков, способных проявлять деметилазную активность в отношении триметилированных аминокислотных остатков [Yamane, Toumazou et al., 2006; Metzger and Schule, 2007], было продемонстрировано обратное. Например, белки KDM4, KDM5, KDM6 могут деметилировать триметилированные гистоны в положениях H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3 и H3K36me3, а для KDM1, KDM2 и KDM3 показана активность только в отношении моно- и диметилирования [Whetstine, Nottke et al., 2006; Mosammaparast and Shi, 2010]. Дальнейшее изучение гистоновых деметилаз привело к открытию негистоновых субстратов детеметилирования. Для LSD1 сначала была показана роль в регуляции активности р53 [Huang, Sengupta et al., 2007], а позднее его роль в деметилировании ДНК метилтрансферазы DNMT1 [Wang, Hevi et al., 2009]. Другие модификации гистонов. Как было упомянуто ранее, модификации гистонов не ограничиваются только ацетилированием и метилированием, а включают также: 22 фосфорилирование, убиквитинирование, сумоилирование, АДФ-рибозилирование, деиминирование и изомеризацию пролина. Функции их менее изучены, а роль в эпигенетической регуляции генов остается до конца не ясной. Для фосфорилирования гистона Н3 показана ассоциация с транскрипционно активными локусами генов белков теплового шока [Nowak and Corces, 2000]. Убиквитинирование характерно для разных изоформ гистона Н2: гистонов Н2А и Н2В. Убиквитинирование H2AK119ub производится ферментами комплекса Bmi/RING1 и приводит к транскрипционной репрессии генов белков комплекса Поликомб, таких как Ring1, Ring2, Bmi1 and HPH2 [Wang, Wang et al., 2004], тогда как Н2ВK20ub способствует ее активации [Zhu, Zheng et al., 2005]. Сумоилирование, как и убиквитинирование, происходит по остаткам лизина и ассоциировано с нетранскрибируемыми областями ДНК [Nathan, Ingvarsdottir et al., 2006]. Деаминирование заключается в отщеплении аминогруппы аргинина и превращении его в цитруллин, что предотвращает метилирование аргинина [Cuthbert, Daujat et al., 2004]. Процесс АДФрибозилирования способствует активации транскрипции в участках с поврежденной ДНК [Ju, Lunyak et al., 2006]. Изомеризация пролина необходима для узнавания метилирования или деметилирования Н3K36 [Chen, Zang et al., 2006]. В таблице 2 представлен краткий перечень модификаций гистонов и их функции. Таким образом, белки-модификаторы гистонов участвуют не только в регуляции транскрипции генов за счет изменения структуры хроматина, но также осуществляют взаимосвязь между гистонами и ДНК, а также принимают участие в процессах репарации. Поскольку изменение модификаций гистонов в норме происходит при различных биологических процессах, таких как пролиферация, дифференцировка клеток и др., дальнейшее изучение их функций является необходимым для понимания механизмов опухолевой прогрессии. 23 Таблица 2 - Модификации гистонов и их функции Модификации хроматина Основания гистонов Функции Ацетилирование К-ас Регуляция транскрипции, репарация и репликация ДНК, конденсация хроматина Метилирование K-me1, K-me2, K-me3 Регуляция транскрипции, репарация ДНК R-me1, R-me2a, R-me2s Регуляция транскрипции Фосфорилирование S-ph, T-ph Регуляция транскрипции, репарация ДНК, конденсация хроматина Убиквитинилирование K-ub Регуляция транскрипции, репарация ДНК Сумолирование K-su Регуляция транскрипции АДФ-рибозилирование E-ar Регуляция транскрипции Деиминирование R → Cit Регуляция транскрипции Изомеризация пролина P-cis → P-trans Регуляция транскрипции 1.1.3. РНК – интерференция Впервые механизм РНК-интерференции был обнаружен у растений как посттранскрипционное ингибирование экспрессии генов [Fire, Albertson et al., 1991; Fire, Xu et al., 1998]. При этом процессе происходит запуск деградации матричной РНК (мРНК/mRNA) посредством связывания с короткой гомологичной РНК длиной 21-28 пар нуклеотидов. На сегодняшний день этот механизм обнаружен у большинства эукариотических организмов [Tijsterman, Ketting et al., 2002; Ullu, Tschudi et al., 2004]. Первоначально считалось, что роль РНК-опосредованного снижения экспрессии генов заключается в предотвращении беспорядочной интеграции транспозонов и противовирусной защите [Waterhouse, Wang et al., 2001]. Позднее у растений и животных были обнаружены специфические гены, кодирующие РНК-транскрипты, которые образуют двуцепочечные 24 шпильки и процессируются с образованием коротких двухцепочечных РНК (дцРНК/dsRNA). Сейчас основную роль РНК-интерференции стала отводиться участию в регуляции экспрессии генов [Bartel, 2004]. К настоящему времени выделяют три типа эндогенных малых РНК, различающихся по своему происхождению и функциям: (1) малые интерферирующие РНК (миРНК/siRNA), (2) повтор-ассоциированные малые интерферирующие РНК (памиРНК/rasiRNA) и микроРНК (мкРНК/miRNA). Двухцепочечные продукты РНК-зависимой РНК-полимеразы (например, у вирусов) или продукты гибридизации перекрывающихся транскриптов (перекрывающиеся последовательности транспозонов) после процессинга дают начало миРНК и памиРНК, которые в свою очередь осуществляют деградацию мРНК за счет РНК-интерференции (siRNA) и участвуют в регуляции модификаций гистонов (rasiRNA) соответственно [Tijsterman, Ketting et al., 2002; Meister and Tuschl, 2004]. Одноцепочечные эндогенные РНКтранскрипты, являющиеся продуктами РНК полимеразы II и содержащие комплементарные инвертированные участки, образуют шпильки и процессируются в мкРНК [Ryan, Robles et al., 2010]. На рисунке 3 представлена схема образования мкРНК и модель посттрансляционной регуляции экспрессии генов [Ryan, Robles et al., 2010]. При синтезе РНК с гена, кодирующего мкРНК, РНК полимераза II образует транскрипт длиной 500-3000 нуклеотидов, так называемую, первичную мкРНК (pri-miRNA). Далее созревание малых РНК регулируется дцРНК-специфическими РНК эндонуклеазами III-го типа Drosha и Dicer, содержащими каталитический РНКазный и РНК-связывающий домены. В ядре первичная мкРНК процессируется посредством сложного белкового комплекса, содержащего эндонуклеазу Drosha, с образованием пре-мкРНК (pre-miRNA) - шпильки длиной 60-100 нуклеотидов [Lee, Jeon et al., 2002; Lee, Ahn et al., 2003]. 25 Рисунок 3 Схема образования мкРНК и модель посттрансляционной регуляции экспрессии гена. AA - поли А конец; m7G- 7-метилгуанозиновый кэп; ORF – открытая рамка считывания. Объяснения в тексте. [Yi, Qin et al., 2003; Bohnsack, Czaplinski et al., 2004; Lund, Guttinger et al., 2004]. Транспорт пре-мкРНК из ядра в цитоплазму происходит при участии ГТФазы Ran (RAN GTP) и белка экспортина (exportin-5, XPO5) [Yi, Qin et al., 2003; Bohnsack, Czaplinski et al., 2004; Lund, Guttinger et al., 2004]. В цитоплазме клетки с помощью эндонуклеазы Dicer происходит дальнейшее процессирование предшественника мкРНК, в результате чего образуется РНК-дуплекс длиной 20-25 пар нуклеотидов, несущий фосфатную группу на 5’конце и неспаренный выступающий 3’-конец [Bernstein, Caudy et al., 2001; Hutvagner, McLachlan et al., 2001; Lee, Nakahara et al., 2004]. После завершения процессинга мкРНКдуплексы связываются с РНК-стимулируемым комплексом RISC, где происходит диссоциация РНК-дуплекса [Hammond, Bernstein et al., 2000]. После диссоциации комплекс RISC остается связан с так называемой зрелой одноцепочечной мкРНК, гомологичной мРНК либо промоторной области ДНК, в то время как комплементарная или спутниковая РНК подвергается деградации [Griffiths-Jones, Grocock et al., 2006]. Какая молекула РНК останется в составе RISC комплекса, зависит от термодинамических характеристик, стабильности РНК 26 и последовательности 3’-области; однако иногда при схожих характеристиках обе РНК остаются в составе комплекса [O'Toole, Miller et al., 2006]. Таким образом, за счет мкРНК комплекс RISC, в состав которого также входит белок argonaute-2 (AGO2) осуществляет специфическую деградацию комплементарной мРНК гена-мишени, катализируя гидролиз мРНК в середине комплементарного участка [Martinez, Patkaniowska et al., 2002; Martinez and Tuschl, 2004]. Посттранскрипционная регуляция экспрессии гена за счет мкРНК также может происходить и из-за ингибирования процесса трансляции [Pillai, Bhattacharyya et al., 2007]. Регуляция экспрессии генов с помощью мкРНК может также происходить на уровне транскрипции в результате ее взаимодействия с ДНК, и на уровне трансляции в результате неполной комплементарности с мРНК [Boeger, Bushnell et al., 2005; Morris, 2005]. В составе комплекса RISC мкРНК, гомологичная промоторной области гена, остается связанной с нуклеосомой [Boeger, Bushnell et al., 2005; Morris, 2005]. При участии белков argonaute-1,2,3 и 4 (AGO1-4) и привлечении хроматин-модифицирующих комплексов, в состав которых входят HDAC1 и другие ферменты, происходит изменение модификаций хроматина в промоторной области гена-мишени и последующее снижение его экспрессии [Jeffery and Nakielny, 2004; Kim, Villeneuve et al., 2006; Weinberg, Villeneuve et al., 2006]. По данным биоинформатического анализа, около 30% всех генов подвергаются регуляции за счет различных мкРНК [Lim et al., 2005]. Таким образом, мутации в генах, кодирующих мкРНК и белки-регуляторы мкРНК-интерференции (Xpo5, Dicar1 и др), а также изменения последовательности в сайтах связывания генов-мишеней мкРНК являются непосредственным фактором риска развития различных онкологических заболеваний [Ryan, Robles et al., 2010]. Было показано, что область тринадцатой хромосомы, кодирующая ген мкРНК-16-1 (ингибирует экспрессию Cdk6, циклина Е1 и D1), часто делетирована у пациентов с хроническим лимфолейкозом [Calin and Croce, 2006]. К настоящему моменту были идентифицированы сотни предполагаемых генов-мишеней, регулируемых семейством мкРНК-34, большинство из которых отвечают за прохождение клеточного цикла и регуляцию апоптоза: CDK4/6, Циклин Е2, Е2F5, MET и Bcl-2 [Bommer, Gerin et al., 2007; Chang, Wentzel et al., 2007; Tazawa, Tsuchiya et al., 2007]. 27 1.1.4. Реализация эпигенетического молчания или взаимосвязь механизмов эпигенетической регуляции Реализация эпигенетического молчания осуществляется как путем одностороннего воздействия со стороны систем эпигенетической регуляции (метилирования ДНК, модификаций гистонов и посттрансляционной регуляции экспрессии гена за счет РНКинтерференции), так и путем тесного взаимодействия всех трех эпигенетических систем, рассмотренных выше. При этом нарушения в одной из систем могут привести к изменению механизмов регуляции двух других, и, таким образом, изменению профиля экспрессии генов. Схема взаимодействия между модификациями гистонов, метилированием ДНК и механизмами РНК-интерференции представлена на рисунке 4 [Egger, Liang et al., 2004]. Рисунок 4 Схема взаимодействия механизмов РНК-интерференции с модификациями гистонов и метилированием ДНК при реализации эпигенетического молчания. Изначально связь между модификациями гистонов и метилированием ДНК была показана у растений и грибов, где метилирование Н3К9 являлось необходимым условием для дальнейшего метилирования ДНК [Tamaru and Selker, 2001; Jackson, Lindroth et al., 2002]. Позднее удалось показать и обратную связь, когда метилирование ДНК способствовало метилированию гистонов Н3К9 [Soppe, Jasencakova et al., 2002; Tariq, Saze et al., 2003]. Взаимодействие систем модификаций гистонов с метилированием ДНК подтвердилось и для млекопитающих, что свидетельствует о консервативности процессов регуляции экспрессии. Также, как и для растений, модификация Н3К9, характерная для гетерохроматина, способна обеспечивать метилирование ДНК прицентромерных областей хромосом [Lehnertz, Ueda et al., 2003]. 28 Взаимодействие между различными модификациями гистонов и ДНК- метилированием осуществляется с помощью специфических белков, распознающих гистоновые модификации и метилированные CpG-островки напрямую или через белкипосредники. Данные, полученные многими группами исследователей, свидетельствуют о том, что ДНК-метилтрансферазы могут различать гистоновые модификации и взаимодействовать с ними. Так, была обнаружена четкая обратная корреляция между метилированием ДНК и хроматином с модификацией гистонов H3K4me3 в случае эмбриональных и соматических клеток [Meissner, Mikkelsen et al., 2008; Hodges, Smith et al., 2009]. Прямая корреляция между ДНК-метилированием и метилированием H3K36me3 распространяется на участки, преимущественно локализованные внутри экзонов, тогда как корреляция метилирования ДНК с H3K9me3 характерна для гетерохроматиновых областей. [Hodges, Smith et al., 2009]. В свою очередь, белки-регуляторы гистоновых модификаций могут влиять на метилирование ДНК. Для гетерохроматина показана ассоциация с модификацией H3K27me3, осуществляемой белковым репрессорным комплексом Поликомб, в состав которого входит специфическая гистоновая лизинметилтрансфераза (белок EZH2 ) [Reynolds, Sigaroudinia et al., 2006; Vire, Brenner et al., 2006]. Поскольку для EZH2 известна его ассоциация с de novo ДНК-метилтрансферазами, для модификации H3K27me3 также отводится роль в de novo метилировании ДНК [Vire, Brenner et al., 2006; Schlesinger, Straussman et al., 2007]. Было показано, что гены, неущие модификацию H3K27me3, являются основными мишенями для ДНК-метилтрансфераз, что ведет к метилированию ДНК de novo и аномальному и перманентному подавлению транскрипции генов-супрессоров в опухолевых клетках [Schlesinger, Straussman et al., 2007]. Для передачи существующих и вновь образованных паттернов модификаций гистонов также необходима взаимосвязь систем метилирования ДНК и модификаций гистонов. Белковый комплекс, в состав которого входят как ДНК метил-связывающий белок MBD1, так и гистоновая метилтрансфераза SETDB1, осуществляет передачу эпигенетических маркеров во время S-фазы клеточного цикла [Sarraf and Stancheva, 2004]. За счет привлечения DNMT1 во время репликации ДНК и одновременного взаимодействия с фактором сборки хроматина CAFp150, данный комплекс участвует в передаче репрессорных маркеров, таких как ДНК и H3K9 метилирование, тем самым осуществляя эпигенетического молчания [Sarraf and Stancheva, 2004]. поддержание и наследование 29 Участие мкРНК в процессе посттрансляционной эпигенетической регуляции генов за счет деградации их мРНК было рассмотрено выше. Однако деградация мРНК метилтрансфераз, ацетилаз, деацетилаз и других факторов эпигенетического молчания приводит в изменению профиля модификаций ДНК и хроматина [Filipowicz, Bhattacharyya et al., 2008]. На рисунке 5 приводятся примеры посттрансляционной регуляции ДНК метилтрансфераз и их взаимосвязь с патогенезом различных заболеваний [Denis, Ndlovu et al., 2011] Снижение количества Гиперэкспресси я снижает пролиферацию клеток холангиокарци номы и Гиперэкспреси и метилчувствате льных генов в CD4+Tклетках Гиперэкспресси я снижает пролиферацию клеток холангиокарци номы и ассоциирована с сайленсингом метилчувствми ельных генов опухолевых супрессоров Снижение количества белка DNMT3B Гиперэкспресси Не выявлено я ведет к оверэкспресии метилчувствате льных генов в CD4+Tклетках Снижение количества белка DNMT3B/3A Восстановление приводит к глобальноме гипометилирован ию (рак легких). Возможнп роль в развитии женских гонад [Braconi, Huang et al., 2010; Pan, Zhu et al., 2010] Увеличение стабильности mRNA DNMT3B siRNA против HuR снижает глобальное метилирование Sat2 и D4Z4 повторов в клетках колоректально й карциномы [Braconi, Huang et al., 2010; Huang, Wang et al., 2010] Рисунок 5 Посттрансляционная мкРНК-зависимая регуляция генов ДНК метилтрансфераз и последствия ее нарушения. Роль РНК-интерференции в эпигенетическом молчании также не ограничивается посттрансляционной регуляцией экспрессии генов. У дрожжей мутации в генах, участвующих в регуляции пути РНК-интерференции, приводят к нарушению формирования гетерохроматина и активации ранее молчащих репортерных локусов [Hall, Shankaranarayana et al., 2002; Volpe, Kidner et al., 2002]. Позднее был описан и сам РНК-индуцируемый комплекс транскрипционного молчания (RITS) дрожжей, состоящий из хроматин- и РНКассоциированных белков, катализирующих данный процесс [Verdel, Jia et al., 2004]. Наличие РНК-зависимой системы посттрансляционного молчания у млекопитающих и ее сходство с 30 дрожжами повлекло за собой дальнейшее изучение механизма РНК-зависимого формирования гетерохроматина [Morris, 2005; Janowski, Huffman et al., 2006; Kim, Villeneuve et al., 2006; Weinberg, Villeneuve et al., 2006]. На примере гена убиквитина C, а также вируса иммунодифицита человека 1 (HIV1), удалось показать возникновение транскрипционного молчания за счет взаимодействия мкРНК с промоторной областью [Hawkins, Santoso et al., 2009; Turner, De La Cruz et al., 2009]. В этом случае снижение экспрессии реализуется за счет привлечения белков de novo ДНК-метилтрансфераз (DNMT3A) и гистоновых деацетилаз (HDAC1) с последующим изменением структуры хроматина [Jeffery and Nakielny, 2004; Kim, Villeneuve et al., 2006; Weinberg, Villeneuve et al., 2006]. Обнаружение в стволовых клетках пивиРНК (piwiRNA), позволяет объяснить механизм de novo ДНК метилирования в процессе эмбрионального развития. ПивиРНК, длиной 26-31 нуклеотидов, были охарактеризованы и выделены в отдельный класс по их ассоциации с Piwi белками подсемейства Argonaute. Мышиные клеточные линии, дефектные по одному или двум белкам Piwi семейства (Mili или Miwi2), оказались дефектными по механизму de novo метилирования транспозонов. Кроме того, фенотип дефектных по пивиРНК мышей сходен с фенотипом мышей, дефектных по ДНК метилтрансферазе DNMT3L, являющейся компонентом комплекса de novo ДНК метилирования [Suetake, Shinozaki et al., 2004]. Такая ассоциация позволяет предположить способность комплексов с пивиРНК привлекать DNMT3A/DNMT3B к последовательностям транспозонов, однако молекулярный механизм такого типа взаимодействий остается недостаточно изученным. [Kuramochi-Miyagawa, Watanabe et al., 2008]. Таким образом, при наличии многоуровневого процесса регуляции транскрипции генов, достигается стабильное поддержание специфического паттерна метилирования ДНК и модификаций гистонов, а, следовательно, и эпигенетического молчания генов в клетках [Brenner and Fuks, 2007; Cedar and Bergman, 2009]. 1.2. Химический канцерогенез Изучение механизмов химического канцерогенеза является необходимым для понимания природы опухолей, этиологическим фактором возникновения которых являются химические агентов. Также изучение канцерогенной активности химических соединений является необходимым для поиска новых и эффективных методов лечения онкологических 31 заболеваний. При опухолевой трансформации клетки происходят необратимые изменения в регуляции клеточной дифференцировки, пролиферации, апоптоза и многих других. Основой для таких изменений служат повреждения в генетическом аппарате клетки [Jansen-Durr, 1996; Shackelford, Kaufmann et al., 1999; Tamakawa, Fleisig et al., 2010; Zheng, 2010] По определению ВОЗ в 1979 г, канцерогеном (физическим, химическим или вирусным) называют агент, способный вызывать или ускорять развитие новообразования независимо от механизма (или механизмов) его действия или степени специфичности эффекта. Химические канцерогены являются одним из самых распространенных этиологических факторов онкологических заболеваний человека. По данным ВОЗ, химические ксенобиотики вызывают до 75% случаев злокачественных новообразований человека. Химические канцерогены можно разделить по механизму их происхождения на природные и антропогенные, появление которых в окружающей среде связано с деятельностью человека. К наиболее повреждающим химическим агентам внешней среды относятся продукты сгорания табака (примерно 40%); канцерогены, входящие в состав пищи (25-30%) и соединения, используемые в различных сферах производства (около 10%). Химические канцерогены являются представителями различных классов химических веществ, как органического, так и неорганического происхождения. В таблице 3 приведены примеры химических канцерогенов. 32 Таблица 3 - Основные классы химических канцерогенов и их представители Органические соединения Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) Гетероциклические ароматические углеводороды Ароматические амины и амиды Нитрозосоединения Аминоазосоединения Афлатоксины Эндогенные канцерогены Наибольшей канцерогенной активностью среди них обладают 3,4-бензпирен, 20-метилхолантрен и диметилбензантрацен. Дибензакридин, дибензкарбазол и другие соединения. 2-нафтиламин, 2-аминофлюорен, бензидин и др Наиболее опасные среди них — диэтилнитрозамин, диметилнитрозамин, нитрозометилмочевина. Высокоэффективными канцерогенами среди них считаются 4-диметилами-ноазобензол и ортоаминоазотолуол. — продукты метаболизма (производные кумаринов) плесневых грибов Aspergillus flavus. Эти соединения образуются в организме в результате физико-химической модификации продуктов нормального обмена веществ. Полагают, что такими потенциально канцерогенными соединениями являются жёлчные кислоты, эстрогены, некоторые аминокислоты (тирозин, триптофан), липопероксидные соединения. Неорганические соединения Экзогенные канцерогены Хроматы, мышьяк и его соединения, кобальт, окись бериллия, асбест и ряд других. Прочие органические соединения с канцерогенной активностью включают: волокнистые и неволокнистые силикаты, эпоксиды, пластмассы, уретан, четырёххлористый углерод, хлорэтиламины и другие. Разные классы химических канцерогенов обладают различными механизмами повреждения генетического аппарата клетки. Еще в начале 40-х годов Дж. Робсоном и Ш. Ауэрбах было описано сильное мутагенное действие некоторых химических соединений, способных вызывать инициацию опухолевого процесса [Auerbach and Robson, 1946]. Так, на примере иприта, впервые был продемонстрирован генотоксический эффект, обусловленный возникновением ковалентных связей между канцерогеном и клеточными макромолекулами, прежде всего ДНК [Auerbach and Robson, 1946]. Так как процесс канцерогенеза принято 33 подразделять на несколько стадий: инициацию, промоцию и прогрессию, данные соединения позднее были отнесены к инициаторам канцерогенеза. На этапе инициации происходит взаимодействие канцерогена с локусами ДНК, кодирующими гены, контролирующие процессы дифференцировки и апоптоза клетки, или протоонкогенами. Однако возможны два варианта взаимодействия канцерогена с ДНК: генотоксический и эпигенетический. Генотоксический механизм заключается в возникновении соматической мутации, результатом которой является активация одного или нескольких протоонкогенов или встроенных в геном клетки вирусных онкогенов [Белицкий, 2006]. Эпигенетический механизм характеризуется индукцией неактивного ранее протоонкогена за счет снятия эпигенетического молчания. За процессом инициации следует этап промоции химического канцерогенеза. К промоторам канцерогенеза принято относить соединения, не обладающие мутагенной активностью, но способные приводить к прогрессии опухолей. В отличие от стадии инициации, которая является кратковременным и необратимым процессом, действие промоторов должно быть длительным. Также отличием промоторов канцерогенеза от его индукторов является прекращение развития опухоли при прекращении воздействия вещества. Таким образом, если процесс инициации связан с наследуемым изменением в генетическом аппарате клетки, то промоция реализуется в результате длительных и на определенных стадиях обратимых изменений в функционировании регуляторных систем, дающих преимущественный рост трансформированным клеткам [Белицкий, 2006]. Однако деление канцерогенов на промоторы и инициаторы канцерогенеза нужно признать условным. Оказалось, что большинство сильных канцерогенов обладают как инициирующими, так и промоторными свойствами. В свою очередь промоторы также способны проявлять канцерогенную активность, при их длительном применении в высоких дозах [Белицкий, 2006]. Деление на инициаторы и промоторы в определенной степени соответствует делению канцерогенов на генотоксические и негенотоксические. 34 1.2.1. Генотоксические и эпигенетические канцерогены Исследования механизмов действия и активации химических канцерогенов начались с работ А. и Б. Пульман, которые проанализировали корреляцию между канцерогенной активностью полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) и электронной конфигурацией их молекул [Pullman, 1945]. В дальнейшем исследование класса ароматических аминов – соединений, которые широко использовались в промышленности и быту, привело к открытию механизма активации некоторых канцерогенных соединений в организме. Так в работе Дж. Миллер и Э. Миллер был проведен анализ конечных продуктов метаболизма 4-диметиламинобензэна и других аминоазокрасителей в печени [Mueller and Miller, 1948; Mueller and Miller, 1950]. Благодаря этим и последующим работам, в которых анализировались продукты метаболических превращений канцерогенов других классов и, в первую очередь, канцерогенных полициклических углеводородов, было найдено их общее свойство, а именно, способность превращаться в электрофильные метаболиты. В настоящее время изучены различные пути активации химических канцерогенов. На основе этого различают канцерогены прямого действия, которые обладают первичной канцерогенной активностью и не требуют какого-либо видоизменения в организме и проканцерогены, нуждающиеся в метаболической активации. Так как большинство проканцерогенов гидрофобны, способ их выведения из организма сводится, в основном, к повышению их водорастворимости [McCoy, Rosenkranz et al., 1990]. В данном процессе принимает участие система цитохрома Р450 (CYP). Цитохром Р450 впервые был открыт Клингенбергом и представляет собой индуцируемый гемопротеин, который катализируют расщепление различных веществ с участием донора электрона НАДФН и молекулярного кислорода [Klingenberg, 1958]. По характеру катализируемых реакций цитохром Р450 был обозначен как оксидаза со смешанной функцией, поскольку в широкий круг катализируемых им процессов входят не только монооксигеназные, но и оксидазные реакции. Ферменты системы цитохрома Р450 локализованы в мембранах эндоплазматического ретикулума, в наружных мембранах митохондрий и ядерной оболочке [Szczesna-Skorupa and Kemper, 2008]. Одной из основных функций этой системы является удаление из клетки гидрофобных ксенобиотиков путем их окисления и превращения в более гидрофильные соединения.[Ingelman-Sundberg, 2005]. В организме цитохром Р450 существует в виде множества изоформ, обладающих различной, иногда перекрывающейся субстратной специфичностью. При этом один и тот же субстрат 35 может метаболизироваться несколькими изоформами с образованием одинаковых или разных производных [Danielson, 2002]. В зависимости от преобладания в клетке тех или иных изоформ изменяется спектр метаболизма проканцерогена и, в частности, соотношение продуктов активации и детоксикации. У представителей одного вида каждая изоформа CYP может быть представлена набором вариантов, отличающихся по своей активности. Таким генетическим полиморфизмом в значительной степени обусловлено существование межвидовых, внутривидовых, половых, тканевых и клеточных различий в чувствительности к канцерогенам [Ingelman-Sundberg, Sim et al., 2007; Wijnen, Op den Buijsch et al., 2007]. Многие ферменты семейства генов CYP1, CYP2, CYP3 и CYP4 принимают участие в метаболизме эйкозаноидов, обмене жирных кислот, лейкотриенов и др.[Panigrahy, Kaipainen et al., 2010]. Например, CYP1A2, гидроксилируя эстрогены, изменяет их активность, что существенно для промоции опухолей из гормонозависимых тканей [Long, Cai et al., 2007]. Некоторые изоформы, экспрессируемые генами семейств CYP2, CYP3 и CYP4, кроме ксенобиотиков метаболизируют желчные кислоты, тестостерон, холестерин и другие эндогенные субстраты, производные которых могут оказывать промоторный эффект. Реакции второго этапа метаболизма ксенобиотиков сводятся в основном к образованию гидрофильных конъюгатов, легко выводимых из организма, и обеспечиваются ферментами, находящимися, в цитоплазме [Guengerich, 1992]. В ходе этих реакций продукты метаболической активации гидрофобных проканцерогенов превращаются в комплексные соединения. Для большинства ксенобиотиков это путь детоксикации, а для некоторых проканцерогенов – необходимый промежуточный этап в дальнейших реакциях активации. Эпоксидгидролазы превращают эпоксиды в трансдигидродиолы, которые соединяются затем с глюкуроновой кислотой, глютатионом или сульфатом и экскретируются в виде нейтральных комплексов [Morisseau and Hammock, 2005]. Модификация бензена под действием эпоксидгидролаз приводит к активации молекулы и ее превращению в канцерогенный метаболит [Bauer, Faiola et al., 2003]. Бензол под действием эпоксидгидролаз превращается в орто- и парабензохиноны – метаболиты, вызывающие лейкоз [Gillis, Gavin et al., 2007]. Глутатион-S-трансферазы катализируют перенос глутатиона на электрофильные соединения (оксиарены, эпоксиды алкенов, ионы нитрония, ионы карбония и свободные радикалы). Это приводит к нейтрализации активных метаболитов бензола, афлатоксина, ПАУ и к активации хлористого метилена или дибромэтилена [Hishida, Terakura et al., 2005]. УДФ-глюкуронилтрансферазы также инактивируют многие электрофильные 36 соединения, но активируют производные гетероциклических аминов. В кишечнике комплексы расщепляются р-глюкуронидазой и в конечном итоге превращаются в высокореактивные электрофилы – N-ацетоксиариламины. Считается, что эти соединения играют существенную роль в возникновении рака толстого кишечника у человека [Fahmy and Fahmy, 1976]. Ацетилтрансферазы ацетилируют аминогруппы ариламинов и гидразинов, что является необходимым этапом их активации и (или) детоксикации, при этом 2-аминофлуорен активируется, а 2-нафтиламин и бензидин детоксицируются [Chung, Chang et al., 2000; Carreon, Ruder et al., 2006]. Полиморфизм ферментов NAT2 и NAT1 обеспечивает различие в активности данных белков в десятки раз. [Hein, Doll et al., 2000; Windmill, Gaedigk et al., 2000; Walker, Ginsberg et al., 2009]. Фенотип медленного ацетилирования также связан с мутациями гена NAT2, которые приводят либо к снижению активности фермента, либо к уменьшению его стабильности [Lin, Han et al., 1993] У людей с первым типом профессиональный рак мочевого пузыря, индуцируемый 2-нафтиламином и бензидином , развивается значительно реже [Carreon, Ruder et al., 2006; Walker, Ginsberg et al., 2009]. Сульфотрансферазы представлены в клетке множеством изоформ с различной активностью. В большинстве случаев образование сульфатов увеличивает водорастворимость и снижает фармакологическую и канцерогенную активности ксенобиотиков [Gamage, Barnett et al., 2006]. Обратный эффект наблюдается, когда образуются нестабильные сульфатные конъюгаты, которые, разрушаясь, образуют сильные электрофильные соединения. Сульфоконъюгация является необходимым этапом активации аминофлуоренов, ариламинов и некоторых других проканцерогенов [Jakoby, 1980]. Таким образом, прямые канцерогены и электрофильные метаболиты проканцерогенов взаимодействуя с нуклеофильными центрами повреждают многие клеточные структуры. Генотоксические канцерогены. Генотоксические канцерогены способны повреждать ДНК без дополнительной активации, обеспечивая при этом все три стадии канцерогенеза инициацию, промоцию и прогрессию. Основой их действия является прямое или непрямое повреждение генетического аппарата клетки, злокачественная трансформация. В клетке, результатом которого является ее подвергшейся воздействию химического канцерогена при значительных повреждениях ДНК происходит запуск апоптоза. Способ репарации ДНК напрямую зависит от типа повреждения ДНК, которое включает образования аддуктов, сшивок цепей, модификации оснований, индукции гидролиза N-гликозидных и фофодиэфирных связей, а также нарушения работы ферментов метаболизма ДНК. 37 На рисунке 6 приведены примеры повреждения ДНК различными классами химических соединений и пути их репарации. Процесс репарации ДНК начинается с обнаружения специфическими ферментами неканонической пары в дуплексе ДНК. Следует отметить, что системы репарации ДНК взаимозависимы, так как в ходе устранения модифицированных оснований и в процессе жизнедеятельности в клетке может происходить изменение типа повреждения ДНК. Рисунок 6 Различные типы повреждения ДНК и их репарация. Репарация апуриновых и апиримидиновых (АП) сайтов возникающих в результате действия активных форм кислорода и некоторых аддуктов ДНК может происходить как с помощью специальных ферментов инсертаз [O'Donovan, 1979], так и с помощью эксцизионной репарации нуклеотидов (Nucleotide excision repair (NER)). Эксцизионная репарация нуклеотидов (NER) представляет собой один из главных и эволюционно консервативных путей репарации в эукариотических клетках. Данный тип репарации включает около 30 различных белков, для некоторых из которых показана связь с различными заболеваниями, примером которых является пигментная ксеродерма и синдром Кокейна. Систему эксцизионной репарации подразделяют на эксцизионную репарацию 38 нуклеотидов (NER), эксцизионную репарацию оснований (Base excision repair (BER)), а также, если модифицированное основание не было удалено из ДНК, и при репликации возникла неканоническая пара нуклеотидов, включается механизм репарации мисмэтчей (DNA mismatch repair (MMR)). Эксцизионной репарации подвергаются не только так называемые АП-сайты, но и модифицированные основания, ДНК-аддукты и межнитевые сшивки, индуцируемые как химическими канцерогенами, так и ультрафиолетовым излучением. Также NER разделяют на два подпути, приводящие к восстановлению структуры ДНК, но отличающиеся набором ферментов, зависящих от их локализации [Hanawalt, 2002]. На уровне полного генома (Global Genome NER (GGNER)) повреждения ДНК распознаются сложным комплексом XPChHR23B, где ДНК открывается при помощи транскрипционного и репарирующего комплекса TFIIH, содержащего хеликазу и белки репарации XPD, XPB, XPA и RPA. Далее, поврежденный участок удаляется при участии эндонуклеаз XPG и ERCC1XPF, а заполнение «бреши» осуществляется ДНК полимеразами δ,ε или k при участии белков PCNA, RFC и RPA [Ogi, Limsirichaikul et al., 2010]. В транскрипционно-зависимом механизме репарации (transcription-coupled NER (TCNER)), блок транскрипции при помощи РНК полимеразы II на поврежденной ДНК требует участия дополнительных транскрипционнозависимых белков репарации CSB and CSA [Fousteri and Mullenders, 2008]. В результате атаки электрофильных соединений происходят разнообразные модификации оснований ДНК. В частности, наиболее распространенным результатом атаки алкилирующих агентов, является образование N7-метилгуанина, О6-метилгуанина и О4алкилтимина. Cпособом восстановления таких модифицированных оснований ДНК является их эксцизионная репарация (BER). Основным отличием данного типа репарации от рассмотренного выше (NER) является то, что он характерен для повреждений, не затрагивающих вторичную структуру ДНК. Цепь реакций репарации начинается с распознавании модифицированного основания различными гликозилазами, расщепляющими N-гликозидную связь этого основания с сахарофосфатным остовом молекулы ДНК с образованием апуринового/апиримидинового сайта. Различают монофункциональные и бифункциональные гликозилазы, последние, помимо своей гликозилазной активности, могут процессировать AП-сайт без участия АП-эндонуклеаз. При этом существуют гликозилазы, специфически распознающие присутствие в ДНК определенных модифицированных оснований: примером может служить белок OGG1, специфически распознающий оксигуанин. [Bjoras, Seeberg et al., 2002]. Также существуют специфические белки для оксиметилурацила, гипоксантина, 3-метиладенин, 5-метилурацила, 3-метиладенина, 7-метилгуанина и т.д. Для 39 многих гликозилаз к настоящему времени описан полиморфизм, связанный с заменой одного из нуклеотидов в кодирующей последовательности гена. Для ряда изоформ этих ферментов была установлена ассоциация с повышенным риском онкологических заболеваний [Karahalil, Bohr et al., 2012]. Разрыв гликозидной связи с образованием апуринового/апиримидинового сайта также катализируется соответствующими ферментами группы AП-эндонуклеаз типа II (апуриновых/апиримидиновых эндонуклеаз) [Kornberg, 1988; Myles and Sancar, 1989]. На основании специфического сайта распознавания различают 4 класса AП-эндонуклеаз: эндонуклеазы I и II классов расщепляют связь в молекуле ДНК с образованием 3’-OH и 5’фосфат концевых групп, в то время как эндонуклеазы классов III и IV оставляют 3’-фосфат и 5’-ОН концевые группы [Myles and Sancar, 1989]. При участии ДНК полимераз δ,ε или k происходит замена основания как и при NER. Восстановления целостности цепи, как и в случае однонитевых разрывов осуществляется ДНК полинуклеотидлигазами за счет прямого соединением концов путем восстановления разорванных фосфодиэфирных связей. Канцерогенный эффект алкилирующих агентов коррелирует с содержанием модифицированных оснований по N- и O-положениям. Тогда как N- метилирование распознается и удаляется в процессе эксцизионной репарации нуклеотидов, репарация О– метилирования чаще осуществляется с помощью специфических метилтрансфераз, которые могут захватывать метильные группы и благодаря этому восстанавливать исходную структуру ДНК. Репарация О6-метилгуанина происходит при участии фермента О6метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы (MGMT). При отсутствии репарации О6-метилгуанина и длительной его персистенции происходит транзиция GC ->AT, что приводит к мутагенному эффекту [Kondo, Takahashi et al., 2010]. У человека был выявлен полиморфизм по О6-метилтрансферазе и показана зависимость предрасположенности к различным онкологическим заболеваниям от типа данного белка [Huang, Ye et al., 2007; Doecke, Zhao et al., 2008]. Если модифицированное в результате атаки нуклеофильных соединений основание не было удалено из ДНК, и/или при репликации возникла неканоническая пара нуклеотидов, включается механизм репарации мисмэтчей (MMR). Механизм репарации мисмэтчей также отвечает за коррекцию мутаций, вызванных инсерцией или делецией (insertion-deletion mismatches (IDL)). Данный механизм репарации осуществляется при помощи ферментов, распознающих материнскую и дочернюю цепи ДНК во время репликации, а также нарушение вторичной структуры ДНК дуплекса при модификации оснований [Iyer, Pluciennik et al., 2006; Larrea, Lujan et al., 2010]. Процесс репарации запускается при связывании 40 белковых комплексов с мисметчем: комплекс MSH2-MSH6 связывается с единичными и с IDL-мисметчами или MSH2-MSH3 связывается с IDL –мисмэтчами, содержащими более 16 нуклеотидов на одной цепи [McCulloch, Gu et al., 2003]. Далее эти комплексы рекрутируют к местам с нарушенной структурой ДНК комплексы белков МLH1-PSM2, МLH1-PSM1, и МLH1-М LH3, которые, в свою очередь, привлекают нуклеазы, вырезающие аномальный фрагмент ДНК, а также факторы репликации (PCNA, ДНК-полимеразы), обеспечивающие застройку бреши и восстановление нормальной структуры ДНК. Однако механизм и специфичность работы данных комплексов остается не до конца изученной. Для некоторых белков данной системы репарации был показан полиморфизм. Известно, что риск развития различных новообразований значительно повышается при врожденных дефектах систем эксцизионной репарации ДНК. Так, врожденные гетерозиготные мутации по меньшей мере четырех из компонентов этой системы (MSH2, MLH1, MSH6 и PMS2) вызывают синдром Линча II, а нарушения функции генов MSH2, MLH1, MSH3, MSH6 и PMS2, приводящие к нестабильности микросателлитов и характерны для некоторых форм спорадических опухолей. Ряд производных канцерогенов дает массивные аддукты, ковалентно связывающиеся с ДНК, что приводит к сильным стерическим нарушениям структуры дуплекса и остановке транскрипции и репликации. При действии бифункциональных алкилирующих агентов между нитями ДНК могут образовываться сшивки. Репарация таких повреждений ДНК происходит двумя путями: с помощью гомологичной рекомбинации (homologous recombination, HR) или воссоединением негомологичных концов (non-homologous end joining, NHEJ). Межнитевые сшивки ДНК распознаются группой белков FANC (Fanconi anemia), взаимодействующими с белками BRCA1, BRCA2 (breast cancer type 1/2 susceptibility proteins) и белками, репарирующими повреждения путем гомологичной рекомбинации (Rad51 и др.)[Grompe and D'Andrea, 2001; Yoshida and Miki, 2004]. Основным компонентом данной ферментной системы является белок ATM (Ataxia-Telangiectasia Mutated), который способен приобретать киназную активность после связывания с концами разорванной ДНК и/или модифицированными белками хроматина, а также с белком BRCA1. Привлекая комплексы белков Rad50/Mre11/NBS1, он стимулирует процессирование концов ДНК, подготавливая их либо для гомологичной рекомбинации, либо для негомологичного воссоединения концов двух основных путей репарации двунитевых разрывов ДНК [Gatei, Jakob et al., 2011]. Белок RAD51 участвует в гомологичной рекомбинации и катализирует как поиск гомологов, так и обмен сестринских хроматид [Sung, 1994; Li and Heyer, 2008]. Данный способ репарации 41 приводит к полному восстановлению исходной последовательности, когда в процессе участвуют гомологи или сестринские хроматиды, за исключением небольших участков инициации рекомбинации, подвергшихся генной конверсии. Второй способ репарации двунитевых разрывов – негомологичное воссоединение концов (NHEJ) представляет собой способ сохранения жизнеспособности клетки путем создания новой комбинации генов. В случае NHEJ ДНК-лигаза, взаимодействуя с белком-кофактором XRCC4 осуществляет соединение негомологичных концов [Wilson, Grawunder et al., 1997]. Полиморфизм белков репарации достаточно широк. Таким образом, модифицированная ДНК подвергается репарации, а нерепарированные повреждения трансформируются в мутации и структурные повреждения хромосом. Аддукты ДНК и хромосомные повреждения в виде микроядер, обменов сестринских хроматид и хромосомных аберраций расцениваются как ранние маркеры канцерогенеза, тогда как мутации приводят к отдаленным последствиям, например, к активации проонкогенов либо подавлению их супрессоров, что проявляется на более поздних стадиях. Эпигенетические канцерогены. К негенотоксическим канцерогенам относятся соединения различной химической структуры и различного механизма действия: промоторы канцерогенеза, пестициды, гормоны, волокнистые материалы и прочие соединения. Главной отличительной чертой негенотоксических канцерогенов является их неспособность напрямую повреждать генетический аппарат клетки, т.е. ковалентно связываться с ДНК с образованием аддуктов и вызывать мутации. Кроме того, в отличие от мутагенных канцерогенов, эффекты негенотоксических агентов обратимы на ранних стадиях действия (в хронических экспериментах на животных). Необходимость сравнительно больших доз и длительного действия для достижения эффекта обьединяет негенотоскические канцерогены с промоторами канцерогенеза – соединениями, приводящими к прогрессии опухолей, но не проявляющими мутагенной активности. Негенотоксические или эпигенетические канцерогены обладают широким спектром механизмов действия, в том числе следует заметить, что в канцерогенном действии одного и того же соединения могут принимать участие несколько механизмов. Эффекты действия негенотаксических канцерогенов включают в основном промоцию спонтанной инициации, т.е. постоянно возникающих в организме мутаций. Также к их действию относятся различные механизмы ингибирования апоптоза, нарушение межклеточных щелевых контактов, цитотоксичность со стойким митогенным эффектом, образование комплекса канцерогенрецептор и оксидативный стресс. 42 Многие химические канцерогены обладают цитотоксическим эффектом, однако у некоторых, например, фурана и хлороформа, этот эффект настолько выражен, что позволяет говорить о причастности данного эффекта к механизмам канцерогенеза. Предполагается, что массовая гибель клеток ведет к активной пролиферации выживших, в том числе несущих мутации клеток, что в конечном итоге приводит к образованию опухоли. Положительная корреляция между развитием опухолей у животных и уровнем пролиферации подтверждает данную теорию [Slaga, 1989]. Также следует отметить, что выраженная пролиферация характерна для действия промоторов канцерогенеза. Различные химические соединения могут ингибировать либо стимулировать передачу митотического сигнала за счет влияния на активность ферментов. Так, окадаиковая кислота ингибирует функцию фосфотаз, инактивирующих белки сигнальных путей клетки. Трансигаргин нарушает в клетке обмен кальция, ионы которого являются участниками пролиферативного каскада. Таким образом, нарушение обмена кальция ведет к нерегулируемому росту и пролиферации даже в отсутствие исходного сигнала к делению. Для других химических агентов, напротив, характерен механизм ингибирования апоптоза. К таким соединениям относятся фенобарбитал и диоксины. Образование комплекса канцероген-рецептор наиболее характерно для гормоноподобных веществ, природных или стильбеновых эстрогенов. В их канцерогенном действии присутствуют два компонента. Промоторный компонент сводится к действию гормональной стимуляции, т.е.пролиферации клеток в органе-мишени. Другой компонент – генотоксический, осуществляется при образовании метаболитов гормоноподобных веществ. Примером может служить действие хинонов и семихенонов, образующихся при метаболизме диэтилстильбэстрола. Оксидативный стресс с образованием перекиси водорода и молекул активного кислорода приводит в конечном итоге к повреждению ДНК и образованию окисленных оснований. В процессе индукции образования активных форм кислорода могут быть задействованы различные группы химических соединений. Группа химических соединенийстимуляторов пероксисом приводит к образованию активных форм кислорода путем стимуляции изоформ цитохрома Р450 и окисления жирных кислот в пероксисомах, а также активации специфических рецепторов (peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR). К данной группе относятся некоторые пестициды, растворители (трихлорэтилен), гиполипидемические средства (клофибрат, гемифиброзил). Хлорированные бифинилы, диоксины и фенобарбитал являются стимуляторами изоформ цитохрома Р450. 43 Таким образом, генотоксический и негенотоксический механизмы постоянно взаимодействуют в процессе канцерогенеза, и один и тот же эффект может быть вызван посредством как генотоксического, так и негенотоксического механизма. Более того, гентоксические активностью. канцерогены также обладают и промоторной (негенотоксической) 44 1.2.2 Влияние химических канцерогенов на эпигенетическую регуляцию экспрессии генов Основные механизмы эпигенетической регуляции экспрессии генов были описаны выше. Считается, что в норме эпигенетические модификации (белков хроматина и/или ДНК), вызываемые прямо или опосредованно физиологическими лигандами, дают клетке больше информации, нежели генетический код. Обратимость эпигенетических изменений придает им большую динамичность, что позволяет оперативно активировать или инактивировать экспрессию генов в нужное время и в нужном месте. В то же время эти модификации могут наследоваться, как это происходит в эмбриогенезе при дифференцировке. Эпигенетические эффекты химических канцерогенов, промоторов канцерогенеза и антиканцерогенных препаратов приводят к изменениям процессов регуляции экспрессии генов на всех этапах передачи генетической информации (Рисунок 7). Это приводит к появлению нового паттерна экспрессируемых белков, который, в свою очередь, определяет последующие эффекты воздействующих ксенобиотиков. 45 Рисунок 7 Генотоксические и эпигенетические эффекты химических канцерогенов, промоторов канцерогенеза и антиканцерогенных препаратов. Следует отметить, что функционирование систем регуляции экспрессии генов определяется как экзогенными, так и различными эндогенными факторами, является тканеспецифичным, зависит от возраста и пола организма. Изменение метилирования ДНК под действием химических канцерогенов. Различные исследования эпигенетической регуляции свидетельствуют, что химические соединения могут изменять паттерны метилирования ДНК, приводя к наследуемым эпигенетическим эффектам [Cisneros and Branch, 2004; Anway, Cupp et al., 2005]. В результате перераспределения паттерна метилирования происходит усиление экспрессии не только целого ряда генов ферментов метаболизма ксенобиотиков, но и протоонкогенов [Hu, Feng et al., 2003]. Одной из основных характеристик паттерна метилирования ДНК опухолевой клетки является тотальное гипометилирование ДНК при одновременном гиперметилировании отдельных локусов и, в частности, CpG-островков. Данный паттерн 46 образуется при воздействии как генотоксических, так и негенотоксических канцерогенов, однако механизмы его становления специфичны для разных соединений. В последнее время появились данные о том, что характер метилирования ДНК при действии канцерогенов изменяется не случайным образом. Зондирование с помощью микрочипов профиля метилирования тысяч CpG-островков и промоторных областей генов в сочетании с транскрипционным профилем мРНК всего генома в гепатоцитах мышей, у которых фенобарбиталом индуцировали опухоли печени, показало, что при этом происходит избирательная CAR-зависимая активация гена Cyp2b10 в результате одновременного гипометилирования промотора и индукции его транскрипционной активности. [Lempiainen, Muller et al., 2011]. На примере действия фенобарбитала и WY-14,643 – негенотоксических канцерогенов, действие которых связано с активацией пероксисом, было показано снижение уровня глобального метилирования и изменение метилирования на локальных участках – промоторах различных генов. В итоге такого перераспределения паттерна метилирования происходит усиление экспрессии не только целого ряда генов метаболизма ксенобиотиков, но и протоонкогенов типа Ha-ras [Bachman, Phillips et al., 2006; Pogribny, Tryndyak et al., 2007]. Для многих ксенобиотиков гуанин является одним из предпочтительных оснований ДНК для модификаций [Swenberg, Richardson et al., 1985]. Также установлено, что метилированные сайты ДНК являются наиболее частой мишенью канцерогенных метаболитов и местом образовании аддуктов [Hu, Feng et al., 2003]. Данный механизм объясняется тем, что присутствие модифицированного цитозина приводит к локальному изменению структуры хроматина и делает данную область белее доступной для модификаций. Это подтверждается тем, что на первом этапе метаболиты канцерогенов могут «прековалентно» связываться с метилированым цитозином, изменяя стерическую конфигурацию комплекса и обеспечивая оптимальные условия для ковалентного связывания этих метаболитов с гуанином. Примером может служить действие химического канцерогена бенз(а)пирена. Подвергаясь метаболической трансформации с образованием диолэпоксида происходит его дальнейшее взаимодействие с гуанином в последовательности XGG, где Хлюбое основание. Присутствие в триплете метилированного цитозина обеспечивает предпочтительное связывание диолэпоксида с гуанином [Hu, Feng et al., 2003]. Подобное сродство к метилированному цитозину также было показано для циклобутанпиримидиновых димеров – основных мутагенов УФ-излучения, табакоспецифических канцерогенов, афлатоксина В1, акролеина и ацетальдегида [Yoon, Smith et al., 2001; Matter, Wang et al., 2004; 47 Guza, Kotandeniya et al., 2011]. Так как в норме метилирование чаще наблюдается в промоторных областях генов, модификация оснований в этих же областях приводит и к изменению регуляции гена. Иной механизм действия у неорганического мышьяка, который конкурирует за метильные группы S-аденозил-L-метионина с ДНК-метилтрансферазами, поскольку окислительное метилирование является основным механизмом его детоксикации в клетке. Добавление мышьяка в культуру клеток печени приводит к их злокачественной трансформации на фоне тотального гипометилирования ДНК и низкого уровня активности ДНК-метилтрансфераз, при одновременной их повышенной экспрессии. Эти изменения наследуются злокачественными клетками, поскольку сохраняются при их культивировании на среде без мышьяка [Zhao, Young et al., 1997]. Гиперметилирование промоторов и изменение структуры гистонов характерно и для действия канцерогенов, вызывающих профессиональные опухоли у человека – плутония, никеля и хрома, которые в дополнение к своим генотоксическим эффектам изменяют структуру хроматина. При этом экспрессия многих генов, в том числе и опухолевых супрессоров, снижается в десятки раз. В частности, это показано для CDKN2A (p16), RB, VHL, p15, BRCA1, RASSF1A, LKB1, MTHFR и CDH1 [Zheng and Shank, 1996; Esteller, 2002; Herman and Baylin, 2003; Belinsky, Klinge et al., 2004; Salnikow and Zhitkovich, 2008; Liu, Liu et al., 2009]. Эпигенетическое молчание генов репарации, таких как MLH1, MGMT , BRCA1, а также генов детоксикации канцерогенов типа GSTP1, повышает частоту мутаций. В частности, гиперметилирование промотора MLH1, продукт которого участвует в репарации неспаренных оснований, приводит к микросателлитной нестабильности, предрасполагающей к развитию многих видов опухолей. Гиперметилирование промотора MGMT - гена, кодирующего O6-метилгуанин-ДНК метилтрансферазу, которая удаляет мутагенные аддукты O6-метилгуанина, повышает частоту G - A транзиций в p53 и K-ras. [Jacinto and Esteller, 2007]. Эти эффекты характерны для действия многих канцерогенов, в том числе входящих в состав табачного дыма, компоненты которого вызывают гиперметилирование CpG сайтов [Denissenko, Chen et al., 1997; Smith, Denissenko et al., 2000; Yoon, Smith et al., 2001; Belinsky, 2005]. Также за счет конформационных изменений структуры ДНК вследствие образования ДНК-аддуктов происходит изменение структуры хроматина. Для ДНК-интеркаляторов была 48 показана индукция конденсации хроматина и, соответственно, снижение экспрессии некоторых генов [Sen and Crothers, 1986] Изменение модификаций хроматина при химическом канцерогенезе. Одним из механизмов возникновения наследуемых эпигенетических эффектов является изменение гистонового кода. Функции различных модификаций гистонов (метилирования, ацетилирования, фосфорилирования, убиквитинирования и т.д.) в эпигенетической регуляции были рассмотрены выше. Среди прочих функций структура хроматина определяет доступность поврежденных участков ДНК для ферментов систем репарации. Ацетилирование гистонов, фосфорилирование или метилирование их аминокислотных остатков, соответственно, несет информацию и о локализации повреждений ДНК. Химические канцерогены, в числе других эффектов, индуцируют двухцепочечные разрывы ДНК, которые наиболее часто приводят к возникновению мутаций и хромосомных аберраций. В репарации этих разрывов большую роль играет состояние гистонов, модификации которых могут приводить к генетическим изменениям. Например, изменение структуры N-концевого участка гистона Н4, нарушающее нормальное ацетилирование лизина, увеличивает количество химически индуцированных мутаций и хромосомных аберраций в период S-фазы клеточного цикла. Также данный эффект сопроваждается замедлением прохождения контрольных точек S-фазы и замедлением репарации ДНК [Choy and Kron, 2002]. Тот же процесс может происходить и в результате индуцированного канцерогенами изменения транскрипции гена путем связывания регуляторов чекпойнтов клеточного цикла с гистонами. Такой механизм показан для 53BP1 - белка, участвующего в распознавании двухцепочечных разрывов ДНК. Появление двухцепочечных разрывов изменяет структуру хроматина таким образом, что в участке разрыва появляется метиллизин 79 гистона Н3, который служит специфическим местом связывания 53BP1. Поскольку метилирование гистона H3K79 при повреждении ДНК происходит обязательно, считается, что оно необходимо для функции распознавания повреждений [Loizou, Murr et al., 2006; Murr, Vaissiere et al., 2007]. Очевидно, что всякого рода нарушения этого процесса затрудняют распознавание повреждений и повышают риск возникновения мутаций . Таким образом, изменение гистонового кода ведет не только к нарушениу процессов репарации, но и транскрипции, репликации и работы контрольных точек клеточного цикла. Они же создают условия возникновения и накопления мутаций, инициирующих необратимые процессы канцерогенеза и прогрессии опухоли. В этих случаях генетические изменения возникают как следствие первичных эпигенетических процессов [Murr, Vaissiere et al., 2007]. 49 Первичный характер таких изменений в генезе опухолей человека строго доказан пока для немногих опухолей, например, для спорадического рака толстого кишечника, проявляющегося при эпигенетическом выключении супрессоров RB1 и VHL или гена репарации мисмэтчей hMLH [Strahl and Allis, 2000; Feinberg, Ohlsson et al., 2006; Hake, Xiao et al., 2007; Jacinto and Esteller, 2007]. Влияние ксенобиотиков на микроРНК. В настоящий момент, когда изучение роли миРНК в химическом канцерогенезе находится на стадии накопления данных, есть сведения о том, что экспрессия некоторых из них может ингибироваться канцерогенными соединениями вместе с приобретением клеткой злокачественных свойств [Nakajima and Yokoi, 2011]. Так, при внесении мышьяка в виде NaAsO2 в культуру иммортализованных нормальных клеток бронхиального эпителия человека при нокдауне p53, приводила к ее злокачественной трансформации, сопровождавщейся не только эпителиально- мезенхимальным переходом, но и снижением концентрации мкРНК miR-200. Возобновление экспрессии miR-200b приводила к обратному эффекту, с восстановлением исходного фенотипа. Более того, экспрессия miR-200b в исходных нормальных клетках приводила к резистентности клеток к малигнизирующему действию NaAsO2 [Wang, Zhao et al., 2011]. Другим бронхиального экспрессию примером служит эпителия человека miR-506. обработка культуры диолэпоксидом псевдонормальных бенз(а)пирена, Ее восстановление ингибирует экспрессию клеток который N-Ras, снижает а также пролиферацию опухолевых клеток и рост опухоли, перевитой бестимусным мышам [Zhao, Liu et al., 2011]. Пролифераторы пероксисом активируют альфа-рецептор (PPARalpha) гепатоцитов, что приводит к ингибированию miR let-7C, которая, в свою очередь, является ингибитором онкогена c-myc. С-myc приводит к активации экспрессию онкогенного кластера mir-17-92 [Shah, Morimura et al., 2007]. На ранних стадиях индукции опухолей легких у крыс с помощью табакоспецифичного канцерогена 4-(метилнитрозамино)-1-(3пиридил)-1-бутанона отмечено снижение экспрессии miR-101, miR-126, miR-199 and miR-34, наблюдающееся также в опухолях легких человека. Подавление экспрессии miR-126 коррелировало с усилением экспрессии CYP2A3, превращающей данное вещество в его электрофильное производное [Kalscheuer, Zhang et al., 2008]. Таким образом, с одной стороны, миРНК могут влиять на все стадии канцерогенеза, в том числе и модифицируя важные сигнальные пути [Calin and Croce, 2007]. С другой, 50 электрофильные метаболиты канцерогенов могу вызывать мутации в кластерах генов, кодирующих миРНК - как в независимых транскрипционных единицах, так и в тех, которые находятся в интронах белок-кодирующих генов. В заключение следует отметить, что анализ влияния ксенобиотиков на процесс канцерогенеза через различные механизмы эпигенетической регуляции экспрессии генов сложен, так как эпигенетические характеристики клетки весьма динамичны, они являются тканеспецифичными, зависят от степени дифференцировки клетки, стадии клеточного цикла и т.д. Однако к настоящему моменту стала очевидной необходимость организации широкого тестирования ксенобиотиков на эпигенетическую канцерогенную активность. Данные о возможности существенного изменения паттерна экспрессируемых белков с помощью ксенобиотиков, запускающих эпигенетические механизмы как способствующие, так и препятствующие канцерогенезу, раскрывают новые возможности, как в плане профилактики онкологических заболеваний, так и для развития ранней диагностики, разработки новых методов химиотерапевтического лечения и мониторинга заболевания. В таблице 4 приведены наиболее интересные данные о влиянии канцерогенных соединений, промоторов канцерогенеза и антиканцерогенных препаратов на процессы эпигенетической регуляции. 51 Таблица 4 - Эпигенетические эффекты канцерогенных соединений, промоторов канцерогенеза и антиканцерогенных соединений Ксенобиотик Эпигенетический эффект Диолэпоксиды бенз(а)пирена изменение профиля мкРНК Циклофосфамид изменение экспрессии мкРНК-34 мкРНК-125b мкРНК-155 мыши (p53+/-) аберрантное метилирование; образцы тканей человека; клеточные линии модификации гистонов линии клеток мкРНК образцы тканей крыс [Rajendrasozhan, Yao et al., 2009; Chen, Fang et al., 2013] [Kalscheuer, Zhang et al., 2008] клеточные линии [Pogribny I.P., 2013] образцы тканей человека, клеточные линии [Pogribny I.P., 2013] образцы тканей человека, клеточные линии [Pogribny I.P., 2013] образцы тканей мыши, клеточные линии [Pogribny I.P., 2013] образцы тканей человека, клеточные линии [Pogribny I.P., 2013] Табакоспецифические канцерогены Афлатоксин B1 Диэтилстильбэстрол Тамоксифен Бутадиен (дивинилэритрен) Мышьяк аберрантное метилирование гипометилирование, аберрантное метилирование сниженение экспрессии мкРНК-9 гипометилирование, аберрантное метилирование изменение модификации гистонов гипометилирование ДНК, повторяющихся последовательностей модификация гистонов гипометилирование ДНК и гистонов, аберрантное метилирование Объект/модельная система псевдонормальные клетки бронхиального эпителия человека Ссылка [Rajendrasozhan, Yao et al., 2009; Chen, Fang et al., 2013] [Pogribny I.P., 2013] 52 Фенобарбитал Соединения хрома Никель Кадмий Меркурий модификация гистонов: гипометилирование аберрантное метилирование – гипометилирование генов ряда изоформ цитохрома P-450 абберантное метилирование ДНК модификации гистонов Бисфенол А абберантное метилирование ДНК Активаторы пероксисом (PPARalpha, WY-14, 643) аберрантное метилирование образцы тканей мыши, клеточные линии клеточные линии, образцы тканей человека, ткани животных (крысы, мыши) образцы тканей мыши, крысы [Martinez-Zamudio and Ha, 2011] [Rajendrasozhan, Yao et al., 2009] [Kundakovic, Gudsnuk et al., 2013] [Hu, Feng et al., 2003; Pogribny, Tryndyak et al., 2007] 53 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Клеточные культуры Клеточные линия эмбриональных куриных фибробластов DF-1 (East Lansing Line (ELL-0)) (CRL-12203) и клетки аденокарциномы человека HeLa (CCL-2) культивировали в Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) с добавлением эмбриональной бычьей сыворотки (fetal bovine serum, FBS) до 10%. Культуральная среда для клеточных линий содержала 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина, предоставляемые «Cell Culture Facility, Fox Chase Cancer Center» (США). Выделение субпопуляций клеток HeLa, содержащих эпигенетически инактивированный геном вируса саркомы птиц было описано ранее [Katz, Jack-Scott et al., 2007; Poleshko, Einarson et al., 2010; Shalginskikh, Poleshko et al., 2013]. 2.2. Плазмидные векторы Ретровирусные векторы на основе вируса саркомы птиц (ASV), экспрессирующий репортерный ген, кодирующий зеленый флюоресцентный белок (EGFP), находящийся под контролем вирусного LTR промотора (ASV-GFP), промотора цитомегаловируса человека (ASV-CMV-GFP) либо клеточного промотора EF1α (ASV- EF1α -GFP) были описаны ранее [Barsov and Hughes, 1996; Katz, Jack-Scott et al., 2007]. Данные вирусные конструкции также кодируют MLV (Murine leukemia virus) Env ген для инфицирования клеток млекопитающих. Схема данных ретровирусных векторов представлена ниже Рисунок 7 Ретровирусные векторы на основе вируса саркомы птиц. 54 Вирус ASV-GFP подгруппы А содержит ASV Env ген и способен инфицировать только куриные клетки. Трансфекция плазмидной ДНК в культуру клеток млекопитающих проводилась при помощи трансфекционного реагента LT1 (Mirus, США) согласно протоколу компанииизготовителя. 2.3. Получение вирусного стока, инфицирование и анализ GFP экспрессии В качестве вирус-продуцирующих клеток использовалась культура фибробластов куриного эмбриона DF-1. Для получения вирусного стока к трансфицированным соответствующим ретровирусным вектором и продуцирующим вирусные частицы DF-1 клеткам добавляли ростовую среду без сыворотки и инкубировали в течение ночи при +37°С и 5% содержании СО2. На следующий день собирали среду, содержащую ретровирусные частицы и пропускали через фильтр с Tuffryn мембраной 0,45 мкм (Pall Corporation, США). Полученный в результате вирусный сток использовали для инфицирования клеток. Клетки инфицировали в присутствии DEAE-dextran с конечной концентрацией 0,01г/ л в течение 6 часов, при разной концентрации вирусного стока. Эффективность инфекции оценивали спустя 48 часов после начала инфицирования по уровню экспрессии GFP (количеству зеленых клеток или среднему уровню флюоресценции) методом проточной цитофлуориметрии (FACS, Fluorescence-activated cell sorting). Измерение уровня экспрессии GFP проводилось на проточном цитофлуориметре Becton Dickinson FACScan (Becton Dickinson, США) и Guava Easy Cyte (Guava Technologies, США). Живые клетки снимались с культуральной плашки, разводились в минимальной среде OptiMEM (GIBCO, США), затем анализировались на проточном цитофлуориметре. Полученные данные обрабатывались при помощи программ FlowJo (Tree Star Inc, США) и CytoSoft (Guava Technologies, США). 2.4. Выделение субпопуляции клеток, содержащей эпигенетически инактивированный геном вируса саркомы птиц Для создания клеточной линии с инактивированным репортерным геном была использована стратегия многоступенчатой сортировки клеток. инфицированы вирусным стоком (ASV, несущим Клетки HeLa были репортерный ген зеленого флуоресцирующего белка (GFP)). Количество вируса используемого для инфицирования 55 клеточной популяции и дальнейшей сортировки выбиралось с тем условием, чтобы уровень клеток обладающих GFP-положительным фенотипом (далее GFP-положительных или (GFP(+)) после инфицирования не превышал 10-15%, с целью иметь не более одной копии интегрированного провируса на клетку. Определение количества GFP-положительных клеток проводилось через 48 часов после инфицирования при помощи методов проточной цитофлуориметрии. Для установления эпигенетического молчания инфицированные клетки пассировались в течении 2 недель, после чего были отсортированы клетки обладающие GFPотрицительным фенотипом (далее GFP-отрицательные или (GFP(-)). Полученная популяция содержала неинфицированные клетки и клетки с молчащим репортерным GFP геном. Также в качестве контроля было отобрана популяция клеток, содержащаа только GFPположительные клетки. Затем GFP-отрицательные клетки инкубировались с ингибитором гистоновых деацетилаз Трихостатином А (TSA) в течение 24 часов (0.5 мкМ), для реактивации молчащего гена GFP. Через 48 часов после начала обработки были отсортированы GFP-положительные клетки (Рисунок 9.). Полученная популяция была пассирована в течение 10 дней, в ходе которых в большей части клеток произошло восстановления эпигенетической репрессии ретровирусного вектора или репортерного GFP гена, с изменением фенотипа клеток на GFPотрицательный. Затем снова были отсортированы GFP-отрицательные клетки, для снижения остаточного свечения (остаточной активации GFP). Таким образом, в результате многоступенчатой стратегии сортировки клеток нами была получена стабильная клеточная линия, несущая интегрированный транскрипционномолчащий репортерный ген GFP в составе ретровирусного вектора. На рисунке 10 представлена схема сортировки на примере HeLa. Также были отсортированы отдельные клоны. 56 Рисунок 9 Культура клеток HeLa после инфицирования ретровирусом ASV-CMV-GFP. (А) клетки обработанные TSA. (Б) необработанная GFP(-) популяция клеток. Фотографии сделаны в обычном и ультрафиолетовом свете. Увеличение х50. Данная клеточная линия, в дальнейшем HeLa-TI, поддерживает свой GFP-негативный фенотип на протяжении многих пассажей, при этом, она способна приобретать GFPположительный фенотип после обработки ингибиторами гистоновых деацетилаз или других реактивирующих агентов. Данная стратегия была применена для создания субпопуляции HeLa клеток с репортерным GFP геном под контролем различных промоторов: hCMV (ТИ-C), нативного ретровирусного ASV LTR (ТИ-L), а так же клеточного промотора EF1α (ТИ-E). 57 Рисунок 10 Получение TSA-чувствительной клеточной популяции. ASV-CMV-GFP ретровирусный вектор на основе вируса саркомы птиц, экспрессирующий репортерный ген, кодирующий зеленый флюоресцентный белок, находящийся под контролем промотера цитомегаловируса человека. После инфицирования были отсортированы GFP-отрицательные клетки. Далее клетки инкубировались с Трихостатином А в течение 24 часов, для реактивации молчащего гена GFP. Через 48 часов после начала обработки были отсортированы GFP-положительные клетки. Полученная GFP-положительная популяция была пассирована в течение 10 дней, в ходе которых в большей части клеток произошло восстановления эпигенетической репрессии ретровирусного вектора или репортерного GFP гена. Затем, были снова отсортированы GFP-отрицательные клетки. 2.5. Трансфекция с использованием двухцепочечных олигонуклеотидных РНКдуплексов (siRNA) Трансфекция клеток проводилась согласно протоколу компании производителя (Dharmacon, США) с финальной концентрацией РНК 50 нМ. В качестве трансфекционного реагента для трансфекции миРНК (siRNA) в клеточную линию HeLa использовался реагент DharmaFECT1 (T-2001). Через 48 часов после начала эксперимента трансфекционная смесь 58 заменялась на стандартную ростовую среду. Измерение эффективности нокдауна методом РНК-интерференции на уровне мРНК и белка проводилось после 48 и 72 часов с момента начала трансфекции, соответственно. Оценка количества GFP-положительных клеток осуществлялась через 96 часов с момента начала трансфекции методом проточной цитофлуориметрии. (дополнительные 24 часа после нокдауна белкового продукта необходимы для оптимальной аккумуляции GFP белка). В работе использовали готовую смесь миРНК для нокдауна белков HDAC1 (M003493-02), HDAC2 (M-003495-00), HDAC3 (M-003496-00), HDAC4 (M-003497-02) фирмы Dharmacon, а также отдельные миРНК (Qiagen Corporation, США) для нокдауна белков DNMT1 (Hs_DNMT1_4/6/7/8), (Hs_DNMT3A_3/10/13/15), DNMT2 DNMT3B (Hs_DNMT2_1/2/4/5), (Hs_DNMT3B_3/5/6/7), и DNMT3A DNMT3L (Hs_DNMT3L_1/2/5/6). В качестве отрицательного контроля трансфекции использовали siRNA#1 (D-001210-01), не соответствующую какой-либо мРНК, или GAPDH (D-001140-01). 2.6. Определение белка методом Вестерн-блоттинг Выделение суммарного клеточного белка проводилось с использованием SDS буфера (2%SDS; 66мМ TrisHCl pH7,5; ингибиторы протеаз в таблетках (Roche Diagnostics, США) и ингибиторы фосфатаз 2мМ (NaF, Na3VO4)). Измерение концентрации суммарного белка проводилось согласно протоколу компании производителя BСA (bicinchoninic acid) анализа, в основе которого используется биуретовый метод определения белков (Thermo Scientific, США). Гель-электрофорез осуществлялся на NuPage Bis-Tris 10% и 4-12% гелях фирмы Invitrogen, США. В качестве маркера молекулярного веса использовался маркер SeeBlue Plus (Invitrogen, США). Трансфер белков из геля проводился на мембрану Immobilon-P 0.45 мкм (Millipore, США). Фиксация мембраны осуществлялась раствором 5% молока в буфере PBS, при комнатной температуре в течение часа. Инкубация с первичными и вторичными антителами проводилась также в течение часа, при комнатной температуре. В качестве вторичных антител были использованы антитела против иммуноглобилинов G кролика и иммуноглобилинов G мыши коньюгированные с пероксидазой (Chemicon, США), а так же хемилюминесцентный реагент SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific, США), согласно протоколу компании изготовителя. Антитела против Actin (A2668) были получены от фирмы Sigma-Aldrich, США. Антитела против GAPDH (MAB374) из Chemicon, США; против DNMT1 (H-300), DNMT3A 59 (H-295), и DNMT3B (H-230) из Santa Cruz Biotechnology, США. В работе также были использованы антитела фирмы Abcam против гистоновых деацетилаз HDAC1 (ab19845), HDAC2 (ab16032), HDAC3 (ab16047), HDAC4 (ab12172). В работе были использованы антитела фирмы Abcam к гистонам H3 (ab1791), H4 (ab10158), H3K9me3 (ab8898), H3K4me3 (ab8580), H4K20me3 (ab9053) и фирмы Millipore к ацетилированным гистонам H3 (07-677-I) и Н4(06-598). В работе использовались вторичные козьи антитела против IgG кролика (31462, Pierce, США) и мыши (ab47827, Abcam, США). 2.7. Иммунопреципитация хроматина (ChIP) Для приготовления клеточных лизатов хроматина использовался EZ-Magna ChIP и дальнейшей (Millipore, США) иммунопреципитации согласно протоколу производителя. Для приготовления клеточных лизатов, клетки фиксировались 37% формальдегидом при комнатной температуре в течение 10 минут для стабилизации белковых комплексов с ДНК, затем формальдегид инактивировали добавлением 10х раствора глицина. Инкубацию с глицином проводили 5 минут при комнатной температуре. Далее клетки отмывали холодным 1х раствором PBS и лизировали с Lysis Buffer (Millipore, США) на льду. Полученные лизаты центрифугировали при температуре 40С и 800хg в течение 5 минут, отбирали супернатант, а осадок лизировали с Nuclear Lisis Buffer (Millipore, США) на льду. Полученные ядерные лизаты подвергались ультразвуковой обработке на льду на приборе Q125 Sonicator (50 Ватт) фирмы Qsonica (США) для получения участков ДНК с белковыми комплексами длиной около 500 н.п. Отрезки ДНК около 500 н.п. получали при действии 70 импульсов (1с) мощностью 15 Ватт. Для получения отрезков ДНК нужной длины ранее подбирались условия ультразвуковой обработки и контроль полученных отрезков на агарозном геле после обработки комплексов ДНК-белок протеиназой К (620С, 4 часа). Приготовленные таким образом образцы инкубирвались с антителами против белковых факторов при температуре 40С 12 часов при покачивании. В качестве контроля использовали антитела против Polymerase II (положительный контроль) и иммуноглобулин G в качестве отрицательного контроля, данные реагенты также были предоставлены Millipore в составе EZ-Magna ChIP. Антитела против различных модификаций гистонов H3K9me3 (ab8898), H4K20me3 (ab9053) и против гистона H3 (Upstate, 06-599) были получены из фирмы Abcam, 60 США. Также использовались антитела против белков Daxx (M-112), DNMT1 (H-300), DNMT3A (H-295) и DNMT3B (H-230) (Santa Cruz Biotechnology, США). После инкубации с антителами белковые комплексы с ДНК инкубировались с магнитными частицами (40С, 1 час), ассоциированными с протеином G для выделения комплексов с антителами. Отмывка магнитных частиц с белковыми комплексами осуществлялась с помощью различных буферов в соcтаве набора реактивов EZ-Magna ChIP (40С, 5 мин) и магнита Magna Grip Rack (Millipore, США). После выделения белковых комплексов сДНК образцы обрабатывали протеиназой К (620С, 4 часа). Оценка результатов проводилась методом количественного ПЦР в реальном времени, используя следующие ДНК- праймеры: праймеры для контрольного участка промоторной области GAPDH (Fw TACTAGCGGTTTTACGGGCG; Rev TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA); область вирусного промотора LTR (Fw CCGATTGGTGGAAGTAAGGTG, Rev AAATACAATATCTCTGCAATGCGG); область вирусного промотора CMV (Fw ATGCCAAGTACGCCCCCTATTGAC; Rev AACCGCTATCCACGCCCATTGATG); область сайта старта транскрипции LTR (Fw CCATTTGACCATTCACCACATT; Rev GCTCGTAGTCGTCAGGGAATC); область сайта старта транскрипции CMV (Fw GTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGC; Rev CAGCTCGACCAGGATGGGCACCAC); область сайта связывания РНК-затравки для синтеза негативной цепи ДНК (Fw TTGATTCCCTGACGACTACGAGCAC; Rev GCCGACCACTATTCCCTAACTATC). 2.8. Количественная ПЦР в реальном времени Количественную реакцию проводили в присутствии красителя SYBR Green, (KAPA SYBR FAST qPCR, Kapabiosystems, США), согласно инструкции производителя. Суммарная клеточная РНК выделялась при помощи набора RNAqueous (Ambion, США). Суммарная клеточная ДНК выделялась при помощи набора DNeasy Blood&Tissue (Qiagen, США) Концентрация РНК и ДНК измерялась при помощи NanoVue Spectrophotometer (Fisher Scientific, США). Реакция обратной транскрипции (ОТ) в случае РНК проводилась при помощи рекомбинантной обратной транскриптазы Super Script III (Invitrogen, США) и олиго dT праймеров. 61 ПЦР в реальном времени проводилась на инструменте Eppendorf Realplex2 Mastercycler (Eppendorf, США). Праймеры были сконструированы с использованием программы Primer Express version 1.5 (Applied Biosystems, США). Реакция ПЦР проводилась в следующих условиях: денатурацию ДНК проводили в течении 15 минут при 95оС, затем следовало 40 циклов (15 сек 95оС, 60 сек 60оС). Для количественного определения изменения уровня экспрессии был использован метод определения по пороговому циклу (2 -ΔΔCT, где CT - пороговый цикл). Нормализация образцов проводилась по отношению к количеству мРНК гена GAPDH. Для каждого образца было подсчитано среднее значение и стандартное отклонение. В работе использовали следующие праймеры: GAPDH (Fw CACCAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTA; Rev CCTTGACGGTGCCATGGAATT TGC); LTRp (Fw CCGATTGGTGGAAGTAAGGTG; Rev AAATACAATATCTCTGCAATGCGG) 2.9. Анализ метилирования методом бисульфитного секвенирования Профиль метилирования отдельных областей интегрированного в клетку провируса оценивали методом бисульфитного секвенирования. Кратко: суммарную геномную ДНК выделяли из инфицированных клеток, содержащих интегрированный ретровирусный геном, используя DNeasy (Qiagen, США). Реакцию бисульфитной обработки проводили с использованием EZ DNA Methylation Gold (Zymo Research, CШA) согласно протоколу производителя, при условиях, приводящих к полной конверсии цитозина в урацил (98ºС – 10минут; 53 ºС- 4 часа). Таким образом модифицированную ДНК использовали для дальнейшей ПЦР используя GoTag Flexi DNA polymerase (Promega, США), с праймерами к выбранной области. Последовательность праймеров подбирали таким образом, что она не содержала СG пар и соответствовала полностью конвертированной в процессе бисульфитной обработки ДНК. Ниже приведены последовательности праймеров, использованных в работе и условия ПЦР. Для области LTR промотора использовали: Fw GTAATATGTTTTATAAGGAGAGAAAAAG; Rev AAAACCTTCTACTTCATACAAATACTC; 94oC- 3 мин, 30 циклов (94oC-30с, 54oC -40с, 70oC -30с), 72oC -3 мин. 62 Для области CMV ATTAGTTTATAGTTTATATATGGAG; промотора использовали: Rev1 CCATTAATATACTACCAAAACC Fw1 и Fw2 o GTTTGGTATTATGTTTAGTATATG; Rev2 CCAACTCTACTTATATAAACCTCCC; 94 C- 3 мин, 30 cycles (94oC-30с, 55/56oC - 40с, 70oC -30с), 72oC -3 мин. Для области GFP гена: Fw1 GTAAGTTGATTTTGAAGTTTATTTGTATTA; CAACTTATACCCCAAAATATTACC и Rev1 Fw2 TGGGGTATAAGTTGGAGTATAATTATAATAG; Rev2 AACTCCAACAAAACCATATAATC; 94oC- 3 мин, 30 cycles (94oC-30с, 55/57oC - 40с, 70oC 30с), 72oC -3 мин. Для областей ENV гена: Fw1 GAGTGGGATTTTTTAGATTAGGAAT; Rev1 AAACCACAAACAACTTTAAAACATC и Fw2 ATTTTTTGGATTTTGTATTTTTAAT; Rev2 CAATAACTATCTTTCCTACCTTACTC; 94oC- 3 мин, 30 cycles (94oC-30с, 56/55oC - 40с, 70oC -30с), 72oC -3 мин. Продукты амплификации были вырезаны из геля и почищены с использованием Zymoclean Gel DNA Recovery (Zymo Research, CШA). Клонирование в pGEM-T Easy вектор проводили с использованием pGEM-T Easy Vector System (Promega, США) и компетентных клеток Z-Competenе E. Coli Cells - Strain Zymo 5α согласно протоколу производителя. Для каждой области было проанализировано секвенированием 10-20 клонов. Профиль метилирования для каждой области был получен путем сравнения сиквенсов ДНК после бисульфитной обработки с немодифицированной ДНК. 2.10. Анализ метилирования методом ELISA Общий уровень метилирования ДНК в клетках оценивали методом иммуноферментного анализа ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) с использованием белковых метил-связывающих доменов и антител к метилированной ДНК. Кратко: согласно протоколу производителя MethylFlash Methylated DNA Quantification (Epigentek, США) для оптимального определения метилирования использоавали 0,1мкг ДНК. Положительный (метилированная ДНК) и отрицательный (неметилированная ДНК) использовались согласно протоколу и входили в состав предоставляемых реагентов. В лунки 96-луночного планшета для проведения иммуноанализа сорбировали антиген (0,1мкг ДНК) в лунку в 100 мкл связывающего буфера (PBS). Инкубация проводилась в течение 30 минут при комнатной 63 температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка несвязавшихся молекул антигена (ДНК) и блокирования мест неспецифического связывания осуществлялась фосфатно-солевым буфером содержащим 0.1% Tween-20 (PBSТ). Далее проводилась инкубация со специфическими антителами к метилированной ДНК в течение 60 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка несвязавшихся молекул антител проводилась 3 раза с использованием отмывочного буфера. Добавление антивидовых антител, конъюгированных с ферментной меткой проводилась в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Пероксидаза хрена катализирует реакцию окисления субстрата перекисью водорода. В качестве субстрата пероксидазы хрена используется о-фенилендиамин (ОФД). В результате прохождения реакции образуется окрашенный продукт окисления ОФД. Перед измерением оптической плотности проводилась остановка цветной реакции с помощью 0.5 М Н2SО4. Оптическая плотность раствора окрашенного продукта измеряется при λ=450нм с использованием планшетного спектрофотометра. Относительный уровень метилирование ДНК оценивали по формуле: 5 mC% ( sampleOD ME3OD) / S x100% , где S – количество ДНК (нг); P – ( ME4OD ME3OD) X 2 * / P положительный контроль (нг); 2* - фактор нормализации положительного контроля к 100% (положительный контроль содержит 50% 5-mC); ME3OD – оптическая плотность отрицательного контроля; ME4OD - оптическая плотность положительного контроля; 2.11. Анализ метилирования методом метилчувствительной ПЦР Суммарную геномную ДНК выделяли из клеток, содержащих интегрированный ретровирусный геном, и обработанных химическими соединениями (DNeasy (Qiagen, США)). Далее проводилась рестрикция с участием метилчувствительного фермента HpaII в течении 12 часов при 37 оС. Для рестрикции было использовано 0,5 мкг ДНК и 10 тыс. Ед. Фермента на 50 мкл суммарной реакции. Подбор метилчувствительной рестриктазы осуществлялся с условием присутствия сайта рестрикции в последовательности LTR и его одновременном отсутствии на промоторе гена GAPDH, праймеры к которому использовались в качестве внутреннего контроля. Реакция ПЦР в реальном времени проводилась в следующих условиях: денатурацию ДНК проводили в течении 15 минут при 95оС, затем следовало 40 циклов (15 сек 95оС, 60 сек 64 60оС). Для количественного определения изменения уровня экспрессии был использован метод определения по пороговому циклу (2-ΔΔCT, где CT - пороговый цикл). Нормализация образцов проводилась по отношению к GAPDH. Для каждого образца было подсчитано среднее значение и стандартное отклонение. В работе использовали следующие праймеры: GAPDH (Fw CACCAGGGCTGCTTTTAACTCTGGTA; Rev CCTTGACGGTGCCATGGAATT TGC); LTRp (Fw CCGATTGGTGGAAGTAAGGTG; Rev AAATACAATATCTCTGCAATGCGG) 2.12.Статистическая обработка данных Оценка статистической значимости результатов проводилась с использованием критерия Стьюдента. Подсчет статистического параметра - Z'-фактора, характеризующего степень чувствительности системы скрининга и ее воспроизводимости производился по формуле: Z'1 (3 П 3 О ) , где σП и σО, стандартные отклонения а, µП и µО – средние значения ( П О ) положительных и отрицательных контролей [Bestor and Bourc'his, 2004; Zhang, Fatima et al., 2005]. Для подсчета использовались данные трех независимых экспериментов. На 96луночный планшет наносили 10 образцов с TSA и DMSO в качестве положительного и отрицательного контроля. отдельно, затем Z’-фактор вычислялся для каждого 96-луночного планшета вычислялось среднее значение трех экспериментов, которое и использовалось для оценки качества созданной системы скрининга. Созданная система скрининга считается хорошей, если значение Z'-фактора лежит в интервале от 0.5 до 1, где 0.5 минимально допустимое значение для скрининга. В случаях когда значение фактора опускается ниже 0.5, возможно перекрывание положительных и отрицательных результатов. 65 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. Характеристика модельной системы 3.1.1. Влияние сайтов интеграции ретровирусного вектора на реактивирующее действие химических соединений Эпигенетическая репрессия транскрипции генов часто наблюдается при использовании терапевтических или репортерных генов на основе ретровирусных векторов. При эффективной трансдукции репортерного гена его экспрессия со временем снижается вплоть до полного подавления [Pannell, Osborne et al. 2000, Aapola, Liiv et al. 2002, Swindle and Klug 2002, Ellis and Yao 2005]. В большинстве случаев эпигенетические механизмы регуляции экспрессии ретровирусных генов направлены на подавление транскрипции, что связано с защитным механизмом против внедрения в геном чужеродной ДНК, однако эпигенетические процессы, участвующие в контроле ретровирусного молчания, в значительной степени перекрываются с механизмами, регулирующими экспрессию генов во время эмбрионального развития и клеточной дифференцировки [Svoboda, Hejnar et al. 2000; Jaenisch and Bird 2003]. Поскольку для простых ретровирусов экспрессия полностью осуществляется с помощью эпигенетических механизмов ферментов регуляции и факторов транскрипции клетки-хозяина, на модельных изучение системах с использованием ретровирусных векторов получило широкое распространение. Клеточная линия HeLa-TI представляет собой модель эпигенетической репрессии, маркером которого является интегрированный в геном ретровирусный вектор, содержащий репортерный ген GFP. Учитывая, что эпигенетические механизмы регуляции интегрированных ретровирусных генов схожи с механизмами экспрессии клеточных генов, линия клеток HeLa-TI является удобной и адекватной моделью для исследования механизмов эпигенетической инактивации транскрипции. Для создания клеточной линии с молчащим репортерным геном клеточная линия HeLa была инфицирована вектором на основе вируса саркомы птиц (ASV), несущим репортерный ген зеленого флуоресцирующего белка (GFP) [Poleshko et al, 2010]. После инфицирования были отсортированы GFP-отрицательные клетки. Полученная популяция содержала неинфицированные клетки и клетки с молчащим репортерным GFP геном. Затем клетки инкубировались с 0.5 мМ Трихостатином А (TSA) в течение 24 часов, для реактивации молчащего гена GFP. Через 48 часов после начала обработки были 66 отсортированы GFP-положительные клетки. Полученная популяция была пассирована в течение 10 дней, в ходе которых в большей части клеток произошло восстановления эпигенетической репрессии ретровирусного вектора или репортерного GFP гена. Затем снова были отсортированы GFP-отрицательные клетки. Таким образом, после описанных этапов сортировки была получена субпопуляция клеток HeLa, названная «Трихостатин А Индуцируемая» [Poleshko, Einarson et al., 2010], несущая интегрированный транскрипционно-молчащий репортерный ген GFP. Основным признаком подавления транскрипции гена в модельной системе клеток HeLa-TI является сохранение GFP-отрицательного фенотипа клеток, в то время как реактивация сопровождается накоплением флуоресцентного белка GFP в клетках. Анализ изменения экспрессии GFP проводится как с помощью проточной цитофлуориметрии, так и флуоресцентной микроскопии. Поскольку линия HeLa-TI представляет собой популяцию клеток, содержащих различные сайты интеграции провируса, на первом этапе нам необходимо было проанализировать влияние локализации гена GFP на степень реактивации. Для этого, методом разведений были отобраны отдельные клоны HeLa-TI клеток, содержащие единый для каждого отдельного клона сайт интеграции провируса. Далее был проведен сравнительный анализ экспрессии гена GFP в родительской популяции HeLa-TI клеток и в отдельных клонах. На рисунке 11 представлено сравнение степени реактивации гена GFP в родительской популяции HeLa-TI и в отдельных клонах после обработки химическими ингибиторами эпигенетических факторов. В случае ингибирования гистоновых деацетилаз (Рисунок 11А) клетки инкубировались в течение 24 часов при различных концентрациях TSA. Средний уровень флуоресценции GFP оценивался спустя 24 часа при помощи метода проточной цитофлуориметрии. Реактивация экспрессии гена GFP после добавления трихостатина-А (TSA) свидетельствует о прерывании эпигенетического молчания. На рисунке 11А представлена зависимость реактивации экспрессии репортерного гена GFP от концентрации добавленного TSA. Концентрация TSA была подобрана с учетом максимального эффекта реактивирующего агента при наименьшей его токсичности, и в дальнейшем TSA использовался в качестве положительного контроля для оценки степени реактивации, обусловленной работой гистоновых деацетилаз. Для проведения данного эксперимента было случайно отобрано 20 клонов. Результаты представлены для клонов, HeLa-TI-1 и HeLa-TI-2, продемонстрировавших наибольшие различия в уровне реактивации по сравнению с 67 родительской популяцией клеток. При концентрации TSA 0,5мкМ доля GFP-положительных клеток для клона HeLa-TI-1 составила более 50% от общего количества клеток, в то время как для клона HeLa-TI-2 реактивация составила около 20%. В родительской популяции HeLa-TI клеток степень реактивации оказалась усредненной - 32% GFP-положительных клеток, что позволило в дальнейшем пренебречь влиянием сайтов интеграции провируса на степень реактивации. Кроме того, была подобрана оптимальная концентрация TSA с учетом максимального эффекта при минимальной токсичности реактивирующего агента и в дальнейшем TSA использовался в качестве положительного контроля для оценки степени реактивации, обусловленной работой гистоновых деацетилаз. Рисунок 11 Реактивируюшее действие трихостатина-А (TSA) и 5-азацитидина (5-azaC). (А) Процент GFP-положительных клеток для линии HeLa-TI и клонов HeLa-TI-1 и HeLa-TI-2 после обработки трихостатином-А. Данные проточной цитофлуориметрии через 48 часов после начала эксперимента. (Б) Процент GFP-положительных клеток для линии HeLa-TI и клонов HeLa-TI-1 и HeLa-TI-2 после обработки 5-азацитидином. Данные проточной цитофлуориметрии через 72 часа после начала эксперимента. Линии погрешности отражают значения стандартного отклонения. 68 Для ингибирования ДНК-метилтрансфераз мы использовали типичный представитель ингибиторов клеточных метилтрансфераз 5-азацитидин (5-azaC). Вещество является нуклеотидным аналогом и обладает цитотоксическим, бактериостатическим и мутагенным эффектами и способно реактивировать экспрессию генов, напрямую изменяя статус их метилирования, и опосредованно, изменяя структуру хроматина, что обеспечивает доступность промоторной области гена для транскрипционных факторов. Инкубация клеток с 5-azaC проводилась в течение 24 часов, средний уровень флюоресценции оценивали спустя следующие 48 часов с помощью метода проточной цитофлуориметрии. На рисунке 11Б показана зависимость реактивации экспрессии репортерного гена GFP от количества добавленного 5-азацитидина. Как и в случае обработки клеток TSA наблюдалась реактивация экспрессии GFP, с разницей для отдельных клонов и популяции клеток. 3.1.2. Определение гистоновых модификаций в области промотора и гене GFP Для характеристики системы и дальнейшего детального изучения влияния химических веществ на эпигенетические механизмы регуляции транскрипции нами были проанализированы маркеры сайленсинга гена GFP и промоторных областей ретровирусного вектора. При помощи нокдауна генов методом РНК-интерференции нам удалось выявить отдельные белки, участвующие в эпигенетической регуляции транскрипции. О вовлечении конкретного белка в процесс эпигенетического молчания судили по реактивации транскрипции гена GFP в ответ на деградацию матричной РНК этого гена при введении в клетки специфических миРНК. При оценке уровня реактивации гена GFP после нокдауна белков, ответственных за изменение уровня ацетилирования (HDAC1) или метилирования гистонов (KMT1E и KMT5C функционируют как гистоновые метилазы для H3K9me3 и H4K20me3 модификаций соответственно), была показана роль данных белков и привносимых ими модификаций на уровень эпигенетической репрессии (Рисунок 12А). Во всех экспериментах с миРНК для исключения “off target” эффекта в качестве отрицательного контроля использовалась неспецифическая миРНК. 69 Рисунок 12 Участие гистоновых модификаций в области промотора и гене GFP в регуляции транскрипции. (А) Анализ уровня реактивации гена GFP (представлен в % GFP-положительных клеток) после нокдауна гистоновой деацетилазы-1 (HDAC1) и гистоновых метилтрансфераз (KMT1E и KMT5C). (Б) Анализ модификаций гистонов на промоторах генов GFP и GAPDH методом иммунопреципитации хроматина. Результаты ПЦР в реальном времени с праймерами, специфичными к следующим областям: промоторным областям генов GAPDH (GAPDHp) и GFP (GFPp), а также к области, содержащей сайт старта транскрипции гена GFP (GFPtss). Линии погрешности отражают значения стандартного отклонения. (В) Данные проточной цитофлуориметрии отражающие степень реактивации гена GFP в клетках HeLa-TI и соответствующие им результаты вестерн блота после нокдауна белков HDAC1, HDAC2 и HDAC3 с использованием миРНК. Инкубация мембран с антителами против GAPDH служит в качестве внутреннего контроля загрузки. (Г) Схема распределения модификаций гистонов и участие, привносящих их белков для различных ретровирусных систем. 70 Для оценки эффективности РНК-интерференции снижение уровня экспрессии интересующего гена определяли методом Вестерн-блоттинга (Рисунок 12В). Результаты профилей реактивации после нокдауна гистоновых деацетилаз (HDAC1, HDAC2 и HDAC3) и специфическая деградация каждой их них (Рисунок 12В) свидетельствовали об эффективности и специфичности ингибирования. Кроме того, было показано, что HDAC1 вовлечен в регуляцию транскрипции гена GFP для данной системы. Анализ гистоновых модификаций в области промотора и сайта старта транскрипции гена GFP проводился с использованием метода иммунопреципитации хроматина с антителами, распознающими следующие модификации гистонов: H3K9me3 и H4K40me, характерными для эпигенетически молчащих генов, а также H3ac и H4ac, являющееся маркером активной транскрипции. В качестве отрицательного контроля реакции иммунопреципитации хроматина использовались контрольные IgG, не распознающие гистоны и их модификации, в качестве положительного контроля - антитела против ДНКполимеразы II (PolII) и праймеры к промоторной области транскрипционно-активного гена GAPDH. Результаты ПЦР в реальном времени представлены на панели Б рисунка 12. Также нами были изучены гистоновые модификации в области LTR промотора и проведен сравнительный анализ этих модификаций в HeLa-TI клетках с гистоновыми модификациями LTR промотора в HeLa-TI-L клетках, несущих идентичный эпигенетически молчащий ген GFP в составе того же ретровирусного вектора, но при отсутствии внутреннего CMV промотора. Последнее исследование позволило нам исключить влияние самого CMV промотора на механизмы эпигенетического молчания, связанные с изменением гистоновых модификаций. Участие белковых факторов и распределение модификаций гистонов в системе клеток HeLa-TI схематично представлено на панели Г рисунка 12. Эти результаты свидетельствуют о том, что экспрессия гена GFP подвергается регуляции со стороны эпигенетических факторов, ответственных за изменение уровня ацетилирования (HDAC1) и метилирования гистонов (KMT1E и KMT5C), однако сами модификации распределены по всей длине интегрированного ретровирусного вектора равномерно. 3.1.3. Анализ метилирования ДНК интегрированного провируса Для изучения локального действия метилирования ДНК на экспрессию гена, нами было исследовано распределение метилирования ДНК интегрированного провируса на модели клеток HeLa-TI. Методом бисульфитного секвенирования с праймерами к 71 ретровирусным промоторам LTR и CMV, а также к гену GFP было проведено сравнение уровня метилирования ДНК в культуре клеток. В сравнении с линией клеток HeLa-TI, содержащей эпигенетически инактивированный провирус с геном GFP и обладающей GFPотрицательным фенотипом, был проанализирован уровень метилирования ДНК в популяции клеток HeLa-GFP(+), инфицированных тем же ретровирусом, но активно экспрессирующих GFP. Клетки, обладающие GFP-положительным фенотипом, использовавшиеся для сравнения с популяцией HeLa-TI, были получены в результате сортировки методом проточной цитофлуориметрии. На рисунке 13 A схематично представлено распределение СpG пар внутри LTR промотора с указанием праймеров для ПЦР. Для изучения уровня метилирования в культуре клеток HeLa-TI, а также в популяции GFP-положительных клеток HeLa было проанализировано по 10-20 отдельных клонов для каждого участка (каждая линия на схеме представляет собой отдельный клон). По результатам бисульфитного секвенирования уровень метилирования LTR в GFP-положительных клетках оказался значительно ниже по сравнению с HeLa-TI. Данные проточной цитофлуориметрии отражают уровень экспрессии GFP в исследуемых популяциях клеток. Для HeLa-TI популяции доля GFP-положительных клеток составила 1,5%, тогда как в популяции клеток HeLa, экспрессирующих GFP – около 90%. Однако при сравнении уровня метилирования ДНК для фрагмента GFP гена (Рисунок 13Б) такой значительной разницы в метилировании ДНК обнаружено не было. В клетках как с отрицательным (HeLa-TI), так и положительным GFP фенотипом процент метилирования составил 22% и 23% соответственно. При анализе профиля метилирования ДНК внутреннего промотора (CMV), под контролем которого находится непосредственно ген GFP, оказалось, что уровень метилированных СpG не превышает 2% (Рисунок 13Д). На рисунке 13В представлены профили экспрессии GFP в клетках HeLa-TI, а также в клетках HeLa, несущих транскрипционно активный провирус с различными GFP-фенотипами – GFP-отрицательный (HeLa-TI) и GFP-положительный - с процентным указанием уровня метилирования в области LTR. Таким образом, данные проточной цитофлуориметрии в совокупности с результатми анализа метилирования ДНК показали, что участие метилирования ДНК в регуляции экспрессии GFP опосредовано лишь метилированием ДНК в участках LTR. Далее мы исследовали роль de novo метилтрансфераз и поддерживающих ДНК метилтрансфераз в поддержании эпигенетического молчания в нашей модельной системе. Для этого нами было использовано ингибирование экспрессии генов методом РНКинтерференции. Анализ уровня реактивации экспрессии GFP после введения в клетки 72 специфических миРНК показал участие двух ДНК метилтрансфераз (DNMT3A и DNMT3B) в поддержании эпигенетической репрессии в модельной системе HeLa-TI (Рисунок 13Г). Как и для гистоновых метилтрансфераз, эффективность нокдауна подтверждалась методом Вестерн-блоттинга (данные не представлены). Для определения ДНК метилтрансфераз в области промотора и сайта старта транскрипции гена GFP, как и в случае анализа модификаций гистонов, использовался метод иммунопреципитации хроматина с антителами, распознающими ДНК метилтрансферазы (DNMT1, DNMT3A и DNMT3B). Результаты ПЦР в реальном времени не представлены. На панели Д рисунка 13 схематично показано присутствие белковых факторов, в соответствии с полученными экспериментальными данными. Роль различных ДНК-метилтрансфераз в поддержании эпигенетического молчания была показана при анализе уровня реактивации экспрессии GFP после ингибирования экспрессии каждого из белков методом РНКинтерференции (Рисунок 13Д). Мы также провели сравнительный анализ распределения метилированных CpG оснований исследуемых областей ДНК в культуре клеток HeLa-TI с клетками HeLa-TI-L, несущими идентичный эпигенетически молчащий ген GFP в составе того же ретровирусного вектора, но без внутреннего CMV промотора (Рисунок 13Д). Полученные результаты наглядно демонстрируют, что внутренний CMV промотор не только не подвергается метилированию, но и препятствует метилированию ДНК соседних областей (области гена env и гена GFP) в культурах клеток HeLa-TI и HeLa-TI-L. Помимо этого, при анализе локализации ДНК-метилтрансфераз в культурах клеток HeLa-TI и HeLa-TI-L выяснилось, что белок DNMT3A локализован в области CMV промотора, а DNMT3B - в области LTR. Полученные данные полностью подтвердились при анализе уровня реактивации экспрессии GFP после ингибирования экспрессии генов методом РНКинтерференции. Так, реактивация экспрессии GFP после нокдауна DNMT3B наблюдалась в обоих случаях для культуры HeLa-TI клеток, и только в случае нокдауна DNMT3A для клеток HeLa-TI. Несмотря на низкий уровень реактивации экспрессии GFP после нокдауна белка DNMT1 в обоих клеточных линиях, нам удалось показать, что он локализован в области LTR. Таким образом, из совокупности данных по метилированию можно заключить о непосредственном участии ДНК метилтрансфераз и влиянию метилирования LTR на экспрессию GFP в данной модельной системе. 73 Рисунок 13 Влияние локального метилирования ДНК провируса на экспрессию GFP. (А) Метилирование LTR интегрированного провируса. Схема распределения СpG пар внутри LTR промотора с указанием праймеров для ПЦР. Метилированные CpG пары обозначены в виде черных кружков, неметилированные – в виде белых. Процент метилирования получен в результате проведения бисульфитного секвенирования. Справа показаны профили, полученные методом проточной цитофлуориметрии с указанием процента GFP-положительных клеток. (Б) Метилирование гена GFP. Схема распределения СpG пар внутри гена GFP с указанием праймеров для ПЦР. Процент метилирования получен в результате проведения бисульфитного секвенирования. Профиль метилирования для каждой области был получен путем сравнения сиквенсов ДНК после бисульфитной обработки с немодифицированной областью. (В) Профили экспрессии GFP для инфицированных и сортированных HeLa-TI и GFP(+) клеток. (Г) Результат реактивации экспрессии гена GFP (% GFP-положительных клеток) после нокдауна белков (методом РНК интерференции) относящихся к ДНК метилтрансферазам. [Svoboda, Hejnar et al., 2000] Схема распределения белковых факторов на ДНК в соответствии с полученными экспериментальными данными в культурах клеток HeLa-TI. 74 3.2. Реактивирующее действие химических соединений 3.2.1 Реактивирующее действие эпигенетических препаратов Для исследования чувствительности модельной системы к химическим соединениям с эпигенетическими эффектами был проведен эксперимент с использованием ингибиторов гистоновых деацетилаз и ингибиторов метилирования ДНК. Каждого из соединений исследовали в двух концентрациях (1 и 5 мкМ) и при различных условиях инкубации: одни образцы подвергались обработке в течение 24 часов и анализировались через следующие 24 часа методом проточной цитофлуориметрии (FACS) (48 часов после начала эксперимента), а другие – через 48 часов (72 часа после начала эксперимента). Было показано, что все вещества проявляли способность реактивировать экспрессию GFP. Наилучшие результаты были получены при анализе доли светящихся клеток через 48 часов после начала опыта, тогда как при втором варианте постановки эксперимента эффективность реактивации снижалась. В таблице 5 представлено краткое описание использованных соединений и данные FACS через 48 часов после начала эксперимента. Таблица 5 - Список химических соединений, реактивационную способность и результаты № Название препарата представленных Описание препарата в тесте Реактивация в % GFP + стандартное отклонение Концетрация 1 TSA (Trichostatin A) 2 SAHA (Vorinostat) 3 VPA 4 Depsipeptide 5 Pomiferin 6 BIX01294 7 MS275 (Entinostat) 8 d-azaC (Vidaza) Ингибитор гистоновых деацетилаз I-го и II-го классов Субероланилидгидроксамовая кислота. Ингибитор гистоновых деацетилаз I-го и II-го классов Вальпроевая кислота. Ингибитор гистоновых деацетилаз Бициклический пептид, изолированный из Chromobacterium violaceum. Ингибитор гистоновых деацетилаз Флаваноид, изолированный из Maclura pomifera. Ингибитор гистоновых деацетилаз Производное диазепинхиназолинамина. Ингибитор гистоновых мелиттрансфераз Специфический ингибитор гистоновой деацетилазы 1 5-аза-2’дезоксицитидин, химический аналог цитидина. Ингибитор ДНК 1мкМ 33,7 + 1,3 5мкМ 34,1 + 1,7 8,3 + 0,9 19,4 + 0,9 9,9 + 1,1 18,8 + 1,1 13,1 + 0,5 21,4 + 0,9 11,3+ 0,5 28,1 + 1,3 8,1 + 0,5 11,2 + 1,1 9,9 + 1,4 15,9 + 1,6 19,2 + 0,4 24,1 + 1,1 на 75 9 5-azaC 10 DZNep 11 RG108 12 13 DMSO HeLa-TI без обработки метилтрансфераз. 5-азацитидин, химический аналог цитидина. Ингибитор ДНК метилтрансфераз. 3-диазенпланоцин А. Ингибитор H3K27me3 и H4K20me3 триметилирования N-фталил-L-триптофан. Ингибитор ДНК метилтрансфераз Диметил сульфоксид. Растворитель 23,1 + 0,5 26,9 + 0,9 12,4 + 0,9 14,4 + 0,7 13,4 + 0,7 14,9 + 0,7 8,3+ 0,9 3,5+ 0,9 7,9+ 0,6 5,5 + 0,6 В целом, этот эксперимент подтвердил возможность использования данной модельной системы для тестирования химических соединений на HeLa-TI популяции с целью оценки их влияния на механизмы, регулирующие процесс эпигенетической репрессии. 3.2.2 Тестирование химических соединений на модели HeLa-TI На этом этапе работы был проведен скрининг химических соединений различных химических групп и классов на их способность реактивировать экспрессию GFP в модельной системе HeLa-TI. Список отобранных соединений, их химические формулы и краткое описание действия представлены в таблице 6. Как и в предыдущей серии экспериментов для тестирования были использованы две концентрации веществ (1 и 5 мкМ), цитофлуориметрические измерения проводились спустя 48 часов после начала эксперимента. Таблица 6 - Список химических соединений, раективационную способность и результаты № Название препарата представленных Описание препарата в тесте Реактивация в % GFP + стандартное отклонение Концетрация 1 Hoechst 33342* Производное бисбензимидазола, (2′-(4-этоксифенил)-5-(4-метил-1пиперазинил)-2,5′-бисбензимидазол тригидрохлорид). Показано взаимодействие с ДНК по малой бороздке и специфичность для нуклеотидной АТ – пары; ингибитор топоизомеразы I. на 1мкМ 15,1 + 1,5 5мкМ 34,6 + 0,9 76 2 Hoechst 33258* 3 DAPI* 4 Netropsin (Congocidine, Sinanomycin) 5 Diminazenе (Azidin, Berenil, Ganasag, Pirocide) 6 Pentamidine 7 Cisplatin (Сisplatinum) 8 DMBA 9 Aranose 10 Cyclophosphamide (Сарколизин, Мелфалан) 11 Bleomycin 12 TSA (Trichostatin A) 13 5-azaC 14 FA 15 CpdA 16 MLN4924 Производное бисбензимидазола, (2′-(4-гидроксифенил)-5-(4-метил1-пиперазинил)-2,5′-бисбензимидазол тригидрохлорид гидрат). Показано взаимодействие с ДНК по малой бороздке и специфичность для нуклеотидной АТ – пары. 4',6-диамино-2-фенилиндол. Показано взаимодействие с ДНК по малой бороздке и специфичность для нуклеотидной АТ – пары. Нетропсиндигидрохлорид гидрат. Антибиотик из Streptomyces netropsis. Взаимодействие с ДНК по малой бороздке, показана специфичность для нуклеотидной АТ – пары. 4,4'-(1-триазен–1,3–дийил)бисбензенекарбоксимидамид).Взаимо действие с ДНК по малой бороздке. Производное бисбензамидина. Взаимодействие с ДНК по малой бороздке, показана специфичность для нуклеотидной АТ –пары. Цис-диаминодихлорплатина. ДНКсвязывающий агент, участие в образовании сшивок 7,12-диметилбенз (а) антрацен. Образование ДНК- аддуктов Арабинопиранозилметил нитрозомочевина. Алкилирующее соединение 3-(4-(ди(2-хлорэтил)амино)фенил) -2-аминопропановой кислоты гидрохлорид. Образование ДНКаддуктов и сшивок. Антибиотик из Streptomyces verticillus.Индукция двуцепосчечных разрывов ДНК, ингибирование включения тимидина. Ингибитор гистоновых деацетилаз I-го и II-го классов 5-азацитидин, химический аналог цитидина. Ингибитор ДНК метилтрансфераз. Флуоцинолона ацетонид, противовоспалительное средство, глюкокортикостероид 2-(4-ацетоксифенил)-2-хлор-Nметилэтиламмоний хлорида. Нестероидный аналог глюкокортикоидов. Сульфоновая кислота. Ингибитор 7,5 + 0,6 16,6 + 0,6 19,8 + 0,6 34,8 + 1,2 14,3 + 0,7 19,6 + 1,2 10,3 + 0,4 21,9 + 0,9 8,8 + 0,5 16,8 + 0,5 5,1 + 0,9 6,4 + 0,6 4,7 + 0,8 4,9 + 0,6 5,9 + 0,3 6,4 + 0,7 0.9 + 0,5 Т 1,3 + 0,9Т 18,8 + 0,5 35,3 + 0,5 33,7 + 1,3 34,1 + 1,7 23,1 + 0,5 26,9 + 0,9 12,7 + 0,8 22,3 + 1,1 8,2 + 1,9 8,2 + 1,1 13,9 + 0,6 32,2 + 2,2 77 убиквитинирования, связывается с E1- E3-лигазой Хинуклидил-3-бензилат, холиноблокатор Тетрапептид эпоксикетон, ингибитор активности протеасомы 20S Ингибитор активности протеасомы 26S. 17 BZ 18 CFZ (Kyprolis) 19 Bortezomib (Velcade) 20 MG132 Ингибитор протеасомы 26S. 21 Camptothecin (CPT, Topotecan, Irinotecan.) 22 Etoposide (Etopophos, VP-16) Sobuzoxane (Buprenorphine, Buprenex, Subutex, Butrans) Staurosporine (AM2282) 23 24 25 EGCG 26 Catechin 27 Mimosine (Leucenol) 28 Suramin A 29 30 31 32 Lopinavir Arsenic trioxide (ATO, Roxarsone, Neosalvarsan) Bisphenol A (BPA) Chloroquine (CQ) 33 Piperlongumine (PPL) 34 Pazopanib 9,1 + 0,4 9,8 + 0,6 12,7 + 0,6 11,7 + 0,9 20,9 + 1,2 28,2 + 0,7 активности 22,9 + 1,5 71,7 + 1,7 Алкалоид из Camptotheca acuminata. ингибитор топоизомеразы I. Этопозид фосфат, алкалоид. Ингибитор топоизомеразы II. 34,1 + 2,4 23,6 + 0,7 10,2 + 0,7 22,6 + 1,1 Полусентетический антагонист рецепторов опиоид, опиоидных 5,4 + 0,6 11,4 + 1,1 Алкалоид из Streptomyces staurosporeus. Ингибитор действия протеин киназ. 6,1 + 0,6 9,3 + 1,1 Эпигаллокатехин галлат, полифенол, флаваноид из зеленого чая. Ингибитор ДНК метилтрансфераз и теломераз. Фенол, флаваноид из Mimosa catechu. Ингибитор гистидин декарбоксилаз β-3-гидрокси-4 пуридин аминокислота из Mimosa pudica. Аналог тирозина,ингибитор репликации ДНК Полисульфонированная нафтилмочевина. Ингибитор топоизомераз, клеточного транспорта фолиевой кислоты и синтеза стероидных гормонов Ингибитор протеаз. Триоксид мышьяка, цитостатик, индуктор оксидативного стресса. 12,3 + 1,2 11,5 + 0,4 12,5 + 1,1 15,1 + 0,4 13,2 + 1,1 13,8 + 0,6 16,6 + 0,6 15,8 + 0,5 12,8 + 1,1 25,2 + 1,1 13,5 + 1,1 73,8 + 3,5 Гормоноподобный эффект 4-аминохинолин. Применчется при лечении малярии. Натуральный компонент из Piper longum. Индуктор оксидативного стресса Ингибитор рецепторов тирозин VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PDGFR-a/β. 15,2 + 0,9 8,3 + 1,1 21,1 + 1,8 8,1 + 0,5 9,8 + 1,1 19,5 + 1,2 8,8 + 0,5 7,8 + 0,6 78 35 DMSO 36 HeLa-TI без обработки Диметил Растворитель сульфоксид. (*- соединения, обладающие собственной флуоресценцией, при данных концентрациях (см.объяснения в тексте). Т 8,3 + 0,9 7,9 + 0,6 3,5 + 0,9 5,5 + 0,6 – цитотоксическое действие препарата Для соединений, обладающих собственной флуоресценцией (в таблице 6 помечены «*»), использовался дополнительный контроль на популяции клеток HeLa, не несущих интегрированный провирус с геном GFP. Для Cyclophosphamide был отмечен эффект снижения сигнала ниже контрольного, что можно объяснить высоким цитотоксическим эффектом для клеток HeLa-TI при данных концентрациях. При снижении же концентрации данного соединения до не токсического уровня (ниже 0,2мкМ) реактивирующего действия не наблюдалось. Результаты скрининга наглядно представлены на рисунке 14. Рисунок 14 Скрининг химических соединений. Результаты скрининга представлены как процент GFP-положительных клеток, при двух концентрациях для каждого соединения. Каждый образец протестирован в трех независимых экспериментах, данные представлены в виде среднего значения трех независимых экспериментов (Линии погрешности отражают значения стандартного отклонения). Знаком (*) отмечены статистически значимые результаты при значении р<0,001. При проведении эксперимента эффект определялся как «положительный», если средняя величина GFP-положительных клеток превышала 12% для одной из двух концентраций химического соединения c достоверностью p<0,001 (Рисунок 14). Для 79 определения чувствительности и воспроизводимости системы скрининга также было проведено определение статистического параметра, характеризующего системы скрининга с высокой пропускной способностью – Z'-фактора [Pannell, Osborne et al., 2000; Swindle and Klug, 2002; Ellis and Yao, 2005]. Z'-фактор, измеренный для созданной системы скрининга, был равен 0.7, что указывает на высокую чувствительность и воспроизводимость данной системы и подтверждает перспективность её использования для скрининга химических веществ с целью оценки их влияния на механизмы эпигенетической регуляции экспрессии генов в клетках. При анализе результатов эксперимента было отмечено, что оба контрольных препарата TSA и 5-azaC реактивировали экспресиию GFP до 35 и 27% соответственно. Для группы генотоксических соединений эффект варьировал, однако следует отметить, что все тестируемые узкобороздочные лиганды (вещества с 1 по 6 в таблице 6) также обладали реактивирующим эффектом. Наибольшей реактивирующей способностью обладает Hoechst 42 и DAPI (34 и 35 %), меньший эффект наблюдался при применении Netropsin и Deminazenе (20 и 22% соответственно) и по 17 % для Pentamidine и Hoechst 33258. Препарат Cisplatin, участвующий в образовании сшивок; 7,12-диметилбенз(а)антрацен (DMBA), приводящий к образованию аддуктов ДНК; алкилирующее соединение- арабинопиранозилметил нитрозомочевина (Aranose) и Cyclophosphamide (образование ДНК- аддуктов и сшивок) не оказали реактивирующего действия. Bleomycin, индуцирующий образование двуцепосчечных разрывов ДНК, привел к реактивации транскрипции GFP до 35 %. Среди соединений с различными механизмами действия положительный результат на реактивацию в скрининге оказали соединения: FA, MLN, Bortezomib, MG132, Camptothecin Etoposide, EGCG, Catechin, Mimosine, Suramin A, Lopinavir, Arsenic trioxide, Bisphenol A и Piperlongumine. Таким образом, помимо вышеперечисленных соединений, данные, полученные в ходе скрининга, указывают на потенциальную способность генотоксических соединений, относящихся к группе узкобороздочных лигандов, в дополнение к их известным свойствам, влиять на эпигенетическую регуляцию экспрессии генов. 80 3.2.3. Влияние химических соединений на общий уровень гистоновых модификаций Далее мы исследовали влияние химических соединений на общий уровень гистоновых модификаций. Для этого нами были отобраны соединения, продемонстрировавшие положительный эффект на реактивацию экспрессии гена GFP в клетках HeLa-TI на предыдущем этапе работы. В эту группу попали: все узкобороздочные лиганды, генотоксических препарат Bleomycin, ингибиторы топоизомераз Camptothecin и Etoposide, ингибитор активности протеасомы 26S – MG132, индуктор оксидативного стресса триоксид мышьяка, ингибитор убиквитинирования MLN, глюкокортикостероид флуоцинолона ацетонид, а также гормональный канцероген Бисфенол А. В качестве положительного контроля были использованы TSA и 5-azaC. Измерение уровня модификаций гистонов проводили методом Вестерн-блоттинга. Клетки HeLa-TI инкубировались с химическими соединениями в концентрации 5мкМ (для TSA - 1 мкМ) в течение 24 часов. На рисунке 15 представлен анализ изменений гистоновых модификаций. На рисунке 15А показано изменение триметилирования лизинов гистонов H3 и H4 в положениях 9 (H3K9me3) и 20 (H4K20me3) соответсвенно. Эти модификации характерны для нетранскрибируемых генов. Ожидаемое снижение уровня этих модификаций после обработки клеток по сравнению с интактными клетками HeLa-TI наблюдалось для модификации H4K20me3 практически во всех образцах. Исключение составили 5-azaC, Hoechst 42 и Camptothecin, а наибольшие изменения наблюдались при обработке клеток соединениями TSA и MG132. Снижение уровня метилирования H3K9me3 (модификации, характерной для нетранскрибируемых генов) было наиболее выражено в образцах клеток, обработанных Camptothecin и MG132, тогда как для остальных количество данной модификации оставалось на уровне интактного контроля. На рисунке 15Б представлены результаты анализа изменений гистоновых модификаций, характерных для активно транскрибируемых генов. Эпигенетическими маркерами транскрипции являются триметилирование лизина гистона H3 в положении 4 (H3K4me3), а также ацетилирование гистонов H3 и Н4 (acH3/acH4) в промоторных областях генов. Мы показали, что обработка HeLa-TI клеток TSA, Hoechst 42, DAPI, Camptothecin, Etoposide и MG132 приводит к увеличению уровня триметилирования лизинов в положении 4 гистонов H3 (H3K4me3). При этом уровень ацетилирования гистона Н4 остается без существенных изменений, за исключением образца клеток, обработанных TSA. Уровень 81 ацетилирования гистона Н3, напротив, увеличился во всех образцах. При этом наибольшее значение было зарегистрировано для TSA, а наименьшее - для Bleomycin. В качестве внутреннего контроля и контроля нанесения были использованы антитела к гистонам H3 и Н4. Рисунок 15 Изменение общего уровня модификаций гистонов. (A) Анализ гистоновых модификаций, характерных для нетранскрибируемых генов: H3K9me3 и H4K20me3; (Б) Анализ гистоновых модификаций, характерных для активно транскрибируемых генов: H3K4me3 и acH3/H4. 82 3.2.4. Изменение общего уровня метилирования Одним из важных показателей эпигенетической активности химических соединений является изменение уровня метилирования ДНК. Общий уровень метилирования ДНК в клетке оценивали методом иммуноферментного анализа ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) с использованием белковых ДНК-метил-связывающих доменов и антител, специфически распознающих метилированную ДНК. Полученные данные свидетельствуют (Рисунок 16) о незначительном изменении общего уровня метилирования ДНК в клетках HeLa-TI после обработки большинством исследуемых соединениями. Статистически достоверные результаты (p<0,01) были получены для клеток, обработанных 5-azaC, веществом глюкокортикостероидного происхождения FA (флуоцинолона ацетонид), ингибитором 26S-протеасомы MG132 и индуктором оксидативного стресса ATO (триоксид мышьяка). Рисунок 16 Изменение общего уровня метилирования ДНК. Данные ELISA (* - уровень метилирования статистически значимо отличен от контроля, р<0,01). 83 3.2.5. Влияние химических соединений на уровень метилирования ДНК клеток HeLa-TI при реактивации экспрессии GFP в результате обработки химическими соединениями Поскольку изменение общего уровня метилирования ДНК после обработки клеток оказалось незначительным, дополнительно мы решили исследовать изменение уровня метилирования промоторной области GFP на модельной системе HeLa-TI. В нашей системе метилирование области LTR оказывает непосредственное влияние на экспрессию GFP. Методом метилчувствительной ПЦР с модификациями нами было показано влияние некоторых из исследуемых химических агентов на уровень метилирования LTR в области сайта старта транскрипции. На рисунке 17А приведена схема LTR c локализацией сайта рестрикции метилчувствительного фермента HpaII и праймерами для ПЦР в реальном времени. Статистически значимое (р<0,01) снижение уровня метилирования ДНК LTR в области сайта старта транскрипции было обнаружено при обработке клеток HeLa-TI следующими соединениями: 5-azaC, Hoechst58, Camptothecyn, FA, MG132, ATO и BPA. Следует отметить, что после обработки с Hoechst42 изменений уровня метилирования LTR не наблюдалось, в то время как обработка клеток Hoechst58 приводила к снижению уровня метилирования. 84 Рисунок 17 Изменение уровня метилирования в области LTR. (А) Схема LTR с расположением сайта рестрикции для метилчувствительного фермента HpaII и праймерами для ПЦР. CpG пары обозначены в виде кружков. (Б) Результаты ПЦР реального времени. Нормализация результатов проводилась по отношению к внутреннему контролю – количеству GAPDH. 85 3.3. Изучение эпигенетических эффектов узкобороздочных лигандов 3.3.1. Анализ реактивирующего действия узкобороздочных лигандов В данной серии экспериментов особое внимание было уделено тестированию соединений, связывающихся с макромолекулой ДНК по малой бороздке. Эти соединения обладают высокой аффинностью к ДНК благодаря их способности образовывать водородные и ван-дер-ваальсовые связи по узкой борозде биополимера. Некоторые из этих соединений широко применяются для окрашивания ДНК в молекулярно-биологических исследованиях. Кроме того, изучается возможность их применения для лечения вирусных инфекций и химиотерапии опухолей. Ранее была показано, что эти соединения могут изменять функционирование топоизомеразы I вследствие стабилизации комплекса ДНК с этим ферментом [Khan and Pilch 2007; Takagi, Dexheimer et al. 2007]. Также известно, что классические УБЛ Hoechs33342 и Hoechst33258 обладают рекомбиногенной активностью, механизм которой изучен не до конца. Однако к настоящему моменту времени эпигенетические механизмы действия этих соединений изучены не были. Анализ реактивационной активности Hoechst был проведен с помощью проточной цитофлуориметрии через 48 часов после начала эксперимента, при этом клетки инкубировались с химическими веществами в течение первых 24 часов. Поскольку Hoechst33342 обладает флуоресценцией в голубом спектре видимого света, в качестве контроля фонового уровня флуоресценции мы использовали культуру клеток HeLa (не несущую интегрированный провирус). Как показано на рисунках 18А и 18Б обработка Hoechst33342, как и TSA, оказывала дозозависимый эффект как на долю GFPположительных клеток, так и на средний уровень свечения. На рисунке 18В представлены изображения клеток HeLa-TI после обработки контрольными реактивирующими агентами – TSA и 5-azaC, а также узкобороздочными лигандами Hoechst 33342, Hoechst 33358 и DAPI. Несмотря на то, что степень реактивации у использованных узкобороздочных лигандов оказалась различна, ее уровень оказался сравнимым с ингибиторами эпигенетических факторов (TSA и 5-azaC), что свидетельствует о том, что УБЛ способны реактивировать эпигенетически инактивирванный ген GFP. 86 Рисунок 18 Реактивирующее действие узкобороздочных лигандов. (А) Доля GFP-положительных клеток после обработки клеток HeLa-TI TSA, Hoechst33342 (Hoechst42) и популяции клеток HeLa, не содержащих интегрированный провирус (Hoechst42/HeLa). (Б) Средний уровень флюоресценции (СУФ) для тех же образцов клеток HeLa-TI, обработаных TSA (TSA) или Hoechst33342 (Hoechst42), и популяции клеток HeLa, не содержащей интегрированный провирус (Hoechst42/HeLa). (В) Клетки HeLa-TI после обработки TSA, 5-azaC, Hoechst 33342 (Hoechst42), Hoechst33358 (Hoechst58) и 5мкМ DAPI. Под каждым флуоресцентным изображением представлена доля GFP-положительных клеток в образцах. Клетки были обработаны соединениями в течение 24 часов, данные проточной цитофлуориметрии и изображения получены через 48 часов после начала эксперимента. Увеличение х50. 3.3.2. Влияние УБЛ на гистоновые модификации в модельной системе HeLa-TI Известно, что в процессе реактивации отдельно взятого гена (в нашем случае GFP) изменение модификаций гистонов происходит в первую очередь в его промоторной области. Раннее нами было изучено распределение гистоновых модификаций на уровне ретровирусного вектора, интегрированного в геном клеток HeLa-TI и показано наличие маркеров сайленсинга в области сайта старта транскрипции GFP. В этой части работы мы изучили изменения эпигенетических маркеров в результате реактивации после обработки клеток УБЛ. В качестве контрольных реактивирующих агентов использовались TSA и 5azaC. 87 Анализ изменений гистоновых модификаций на промоторе проводили методом иммунопреципитации хроматина со специфическими антителами, распознающими модификации гистонов H4K40me3 и H3ac. IgG, не распознающие гистоны и их модификации были использованы в качестве отрицательного контроля. Результаты ПЦР в реальном времени представлены на рисунке 19: изменение уровня метилирования H4K40me3 (Рисунок.19А) и ацетилирования Н3ас (Рисунок 19Б) обнаруживалось уже через 8 часов после начала инкубации с соединениями. Снижение уровня метилирования H4K40me3 и повышение уровня ацетилирования H3ac на промоторе GFP, указывает на то, что исследуемые агенты оказывают действие на эпигенетическую регуляцию транскрипции за счет изменения модификаций гистонов. Эти изменения наблюдались для всех использованных в эксперименте соединений. Рисунок 19 Анализ изменений гистоновых модификаций на промоторе GFP после обработки клеток УБЛ. (А) Результаты ПЦР в реальном времени для модификации H4K40me3. (Б) Результаты ПЦР в реальном времени для модификации Н3ас. Нормализация результатов проводилась по отношению к уровню загрузки для иммунопреципитации, внутреннему контролю – количеству GAPDH и необработанным HeLa-TI. На рисунке представлены средние значения трех экспериментов. Линии погрешности отражают значения стандартного отклонения. 88 3.3.3. Влияние УБЛ на уровень метилирования ДНК клеток HeLa-TI Исследование метилчувствительной метилирования ПЦР с ДНК модификациями промоторной показало, что области методом изменение уровня метилирования происходит при действии Hoechst58, но не с Hoechst42. Для подтверждения полученных результатов, нами был проведен анализ метилирования всей области LTR методом бисульфитного секвенирования в образцах HeLa-TI, обработанных Hoechst42, Hoechst 58 и контрольными препаратами. (Рисунок 20). Всего было проанализировано по 1020 отдельных клонов для каждого участка. Параллельно методом проточной цитофлуориметрии проводился анализ профилей флуоресценции. Рисунок 20 Изменение метилирования в области LTR при действии Hoechst. Доля метилирования получена в результате проведения бисульфитного секвенирования. Справа показаны профили, полученные методом проточной цитофлуориметрии с указанием доли GFP-положительных клеток. Метилированные CpG пары обозначены в виде черных кружков, неметилированные – в виде белых. По снижению уровня метилирования для образца с 5-azaC (36%) и отсутствию изменений для TSA (79%), можно судить о достаточной чувствительности метода. Мы показали, что при действии Hoechst42 изменений уровня метилирования LTR не наблюдалось, что согласовалось с данными, полученными методом метилчувствительной ПЦР. Обработка клеток Hoechst58 приводила к снижению уровня метилирования до 56%. 89 3.4. Взаимосвязь процессов модификации гистонов и ДНК метилирования 3.4.1 Совместное действие УБЛ и эпигенетических ингибиторов Как известно, реализация эпигенетического молчания может осуществляться как путем одностороннего воздействия со стороны систем эпигенетической регуляции (за счет изменения посттрансляционных модификаций гистонов, либо за счет изменения метилирования ДНК в промоторной области гена), так и путем тесного взаимодействия этих двух систем. Мы показали, что в нашей экспериментальной модели регуляторную роль играют как репрессорные модификации гистонов, так и метилирование ДНК на LTR промоторе. При высоком уровне данных модификаций экспрессия репортерного гена GFP подавляется, в то время как при снижении их уровня происходит реактивация экспрессии GFP. Для исследования взаимодействия вышеописанных систем регулирования эпигенетических процессов мы изучили взаимное влияние ингибитора гистоновых деацетилаз TSA и ингибитора ДНК- метилтрансфераз 5-аzaC на модели HeLa-TI. В этом эксперименте клетки обрабатывались каждым из ингибиторов отдельно, последовательно и одновременно. Клетки обрабатывались в течение 24 часов для каждого из соединений: 24 часа при отдельной и совместной обработке и 24+24 часа при последовательном добавлении агентов. Уровень реактивации экспрессии GFP оценивали в разные промежутки времени после добавления ингибиторов: через 24, 48 и 72 часа. Данные проточной цитофлуориметрии представлены на рисунке 21А. 90 Рисунок 21 Cинергическое действие эпигенетических ингибиторов. (А) Уровень реактивации (выражен в доле GFP–положительных клеток) после обработки эпигенетическими ингибиторами TSA и 5-аzaC. Представлены данные проточной цитофлуориметрии для 24, 48 и 72 часов после начала эксперимента. TSA - обработка клеток трихостатином А (0,5мкМ); 5-azaC - обработка клеток 5азацитидином (2,5мкМ); TSA+5-azaC – одновременная обработка клеток; TSA->5-azaC и 5-azaC>TSA – последовательные обработки клеток (Б) Уровень реактивации (выражен в доле GFP– положительных клеток) при обработке эпигенетическими ингибиторами и узкобороздочными лигандами (Hoechst42 и Hoechst58). Данные проточной цитофлуориметрии через 48 часов после начала эксперимента. (+) – совместная обработка; (->) – последовательная обработка. Концентрации соединений: TSA – 0,5мкМ; 5-azaC – 2,5мкМ; Hoechst 42 и Hoechst 58 – 2,5мкМ (*- отмечены образцы, с увеличением реактивирующего действия относительно каждого соединения). 91 При изучении взаимного действия гистоновых деацетилаз TSA и ингибитора ДНКметилтрансфераз 5-аzaC на модели HeLa-TI мы показали, что увеличение экспрессии GFP наблюдалось только при последовательной обработке 5-аzaC и TSA, но не наоборот. При этом максимальный эффект как при отдельной, так и совместной обработке веществ регистрировался через 48 часов после начала эксперимента. Далее на модельной системе HeLa-TI мы изучили совместное действие УБЛ Hoechst42, Hoechst58 и эпигенетических ингибиторов (Рисунок 21А). Мы обнаружили неаддитивное усиление реактивации при одновременной обработке клеток Hoechst42+TSA и Hoechst42+5-аzaC. Уровень реактивации экспрессии GFP при действии TSA в данном эксперименте составил 25%, 5-аzaC -17%, а при одновременном добавлении Hoechst 42 – 76% и 44% соответственно. Кроме того, усиление реактивирующего действия наблюдалось для образцов с последовательной обработкой TSA-> Hoechst 42 (58%), 5-аzaC-> Hoechst 42 (42%) и Hoechst 42-> TSA (54%). При этом совместная обработка с Hoechst 58 увеличивала реактивирующее действие эпигенетических ингибиторов лишь незначительно. Эпигенетические ингибиторы ацетилирования гистонов – TSA и метилирования ДНК – 5-аzaС обладают широким спектром действия по отношению к ферментам, ответственным за наличие данных модификаций. При совместном применении этих веществ ингибирование действия эпигенетических факторов также неспецифично. Ранее на системе клеток HeLa-TI нами был проведен анализ белковых факторов, участвующих в поддержании эпигенетического молчания. При помощи нокдауна генов с использованием методов РНКинтерференции, нам удалось выявить отдельные белки, участвующие в эпигенетической регуляции транскрипции. При исследовании отдельных эпигенетичеких факторов, участвующих в процессе реактивации при совместном действии соединений, мы использовали метод нокдауна отдельных белков при помощи миРНК. Для снижения токсического эффекта концентрация миРНК дуплексов для трансфекции была снижена до 25нМ. Через 72 часа после начала трансфекции были добавлены химические соединения: TSA - 0,5мкМ; 5-azaC - 2,5мкМ; Hoechst 42 и Hoechst 58 по 2,5мкМ. Уровень реактивации экспрессии GFP анализировали с помощью проточной цитофлуориметрии через 120 часов после начала эксперимента. Результаты эксперимента представлены на рисунке 22. При использовании химических веществ в указанных концентрациях без нокдауна какого-либо клеточного фактора реактивация GFP составила: 17% для TSA , 14% для 5-azaC, 14% для Hoechst 42 и 12% для Hoechst 58. При ингибировании экспрессии гистоновой деацетилазы 92 HDAC1, уровень экспрессии GFP составил 45%, при обработке этих клеток TSA либо Hoechst42 уровень реактивации составил 63 и 64% соответственно. При добавлении Hoechst 58 уровень реактивации повышался до 56%. Как было показано ранее, нокдаун генов HDAC2, HDAC3 и HDAC4 не приводил к реактивации экспрессии GFP в нашей модельной системе. Уровень флуоресценции при их ингибировании составил менее 10%; при обработке химическими агентами реактивация на фоне нокдауна наблюдалась на уровне действия каждого химического вещества, т.е. не более 17% для TSA , 14% для 5-azaC, 14% для Hoechst 42 и 12% для Hoechst 58. Нокдаун ДНК метилтрансферазы DNMT1 приводил к реактивации экспрессии GFP до 24%. На фоне ингибирования данного фактора при помощи РНК-интерференции обработка клеток TSA и Hoechst42 увеличивала реактивацию до 46 % для обоих веществ, применение же 5-azaC и Hoechst58 не приводило к дальнейшему увеличению экспрессии GFP. ДНК метилтрансфераза DNMT3A также является одним из факторов, регулирующих эпигенетическую репрессию в модельной системе HeLa-TI, его нокдаун приводит к значительной реактивации транскрипции GFP, сравнимой с нокдауном HDAC1(36%). Однако применение химических соединений, как эпигенетических ингибиторов (TSA, 5azaC), так и узкобороздочных лигандов Hoechst не приводило к дальнейшему усилению реактивирующего действия. Нокдаун ДНК метилтрансферазы DNMT3B, относящейся к de novo метилтрансферазам, как и DNMT3A, приводил к реактивации экспрессии до 17%. При обработке клеток химическими веществами усиление транскрипции наблюдалось только в присутствии Hoechst 42. В этом случае уровень реактивации составил 39%. Эпигенетический фактор DNMT3L не обладает метилтрансферазной активностью, но может стимулировать активность DNMT3A и DNMT3B. Нокдаун этого гена не приводил к значительной реактивации транскрипции (10%). Обработка таких клеток TSA не вызывала увеличение экспрессии GFP, тогда как 5-azaC и оба Hoechst незначительно увеличивали уровень реактивации. Максимальный эффект наблюдался для Hoechst 42 и составил 25%. 93 Рисунок 22 Синергическое действие химических соединений. Результат реактивации экспрессии гена GFP (выражен в доле GFP–положительных клеток) после нокдауна генов (методом РНК интерференции) гистоновых деацетилазам (HDAC1, HDAC2, HDAC3 и HDAC4) и ДНК метилтрансфераз (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B и DNMT3L). Контроль - стандартная миРНК, не соответствующая ни одной мРНК. NT- клетки без обработки, химические соединения: TSA -0,5мкМ; 5-azaC - 2,5мкМ; Hoechst 42 и Hoechst 58 по 2,5мкМ. Результаты проточной цитофлуориметрии через 120 часов после начала эксперимента. (*) отмечены образцы, с увеличением реактивирующего действия относительно каждого соединения. 94 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 4.1. Особенности используемой модельной системы Одной из перспективных модельных систем для для изучения механизмов эпигенетической регуляции экспрессии клеточных генов являются клеточные культуры с интрегрированной в геном вирусной последовательностью, содержащей репортерный ген. Эпигенетические механизмы инактивации ретровирусных генов идентичны механизмам эпигенетической регуляции экспрессии генов [Katz, Jack-Scott et al., 2007] [Jaenisch and Bird, 2003]. При изучении инфицированных клеток HeLa, содержащих интегрированный геном вируса саркомы птиц, было обнаружено, что репортерные гены в составе ретровирусного вектора представляют собой потенциальный объект для эпигенетической репрессии [Swindle and Klug, 2002; Ellis and Yao, 2005]. Основываясь на этом ранее был разработан метод получения клеток с интегрированным геномом вируса саркомы птиц, содержащим эпигенетически инактивированный репортерный ген зеленого флуоресцентного белка (GFP), экспрессия которого служила в качестве маркера эпигенетической регуляции. В настоящей работе нами была использована одна из таких клеточных линий, HeLa-TI, в качестве удобной модели для изучения влияния экзогенных ксенобиотиков на эпигенетическую регуляцию транскрипции генов. Эпигенетические процессы, участвующие в контроле транскрипции ретровирусов, в значительной степени перекрываются с механизмами, регулирующими экспрессию клеточных генов, однако на степень эпигенетического молчания ретровирусов могут влиять еще и дополнительные инфицированной клетки, факторы, такие как: текущая стадия дифференцировки локализация сайта интеграции на хромосоме, структура ретровирусного вектора, уровень экспрессии различных клеточных факторов, а так же наличие особых ретровирусных последовательностей, узнаваемых клеточными репрессорными комплексами [Pannell and Ellis, 2001][Svoboda, Hejnar et al., 2000; Hejnar, Hajkova et al., 2001; Lorincz, Schubeler et al., 2001; Mizutani, Ito et al., 2002; Yao, Sukonnik et al., 2004]. На рисунке 23 представлены возможные пути регулирования транскрипции специфичные для ретровирусных генов. 95 Рисунок 23 Модели эпигенетической репрессии ретровирусных генов. А. На частоту возникновения транскрипционной репрессии влияет наличие и уровень экспрессии как клеточных так и вирусных белков регуляторов. Б. Стадия клеточного цикла и дифференцировки инфицированной клетки влияет на возникновение эпигенетической репрессии за счет экспрессии различных клеточных транскрипционных факторов. В. «Позиционный эффект» предполагает влияние локализации сайта интеграции: состояние хроматина в районе интегрированной ДНК, ориентацию интегрированной ДНК по отношению к клеточной ДНК и транскрипционную активность соседних генов. Г. Наличие особых ретровирусных последовательностей, узнаваемых клеточными белками регуляторами, а также способность ретровирусных LTR и cis-элементов привлекать репрессорные транскрипционные факторы. К настоящему времени достаточно хорошо изучены роль метилирования ДНК и модификаций гистонов в эпигенетическом молчании ретровирусов [Mitchell, Beitzel et al., 2004; Narezkina, Taganov et al., 2004; Bushman, Lewinski et al., 2005]. Основным же вирусоспецифическим механизмом обеспечения эпигенетического молчания является «позиционный эффект», который определяется положением интегрированного провируса в хромосоме. Считается, что гетерохроматин или эухроматин в области сайта интеграции, отвечают за транскрипционно-молчащие или потенциально активные регионы, соответственно. Таким образом, помимо гистоновых ацетилтрансфераз, гистоновых деацетилаз, метилтрансфераз и белковых комплексов, принимающих участие в перестройке хроматина, на уровень экспрессии вирусных генов влияют: транскрипционная активность соседних генов, ориентация интегрированной ДНК по отношению к клеточной ДНК, а так же способность ретровирусных LTR и cis-элементов транскрипционные факторы [Katz, Jack-Scott et al., 2007]. привлекать репрессорные 96 Ранее на модели клеток HeLa-TI был проведен анализ влияния сайтов интеграции на реактивирующее действие различных клеточных и вирусоспецифических белков. Было показано, что для некоторых из них «позиционный эффект» оказывает значительное влияние на реактивацию гена GFP [Greger, Katz et al., 2005; Ouaissi, Cabral et al., 2007]. Для исключения этого влияния на реактивирующее действие химических соединений нами был проведен эксперимент с использованием родительской популяции клеток HeLa-TI и отдельных клонов HeLa-TI-1 и HeLa-TI-2, содержащих только один интегрированный провирус с разными положениями интеграции. Для проведения данного эксперимента из 20 полученных ранее клонов, были отобраны клоны (HeLa-TI-1 и HeLa-TI-2), дающие наибольшие различия в реактивации по сравнению с родительской популяцией клеток. При обработке химическими ингибиторами эпигенетического действия (TSA для ингибирования гистоновых деацетилаз и 5-azaC для ДНК-метилтрансфераз) нам удалось подтвердить, что наблюдаемая реактивация экспрессии гена GFP после добавления TSA для родительской популяции клеток представляет собой усредненный уровень реактивации по сравнению с отдельными клонами. При обработке клеток TSA (0,5мкМ), доля GFPположительных клеток для клона HeLa-TI-1 составила более 50% от общего количества клеток, в то время как для клона HeLa-TI-2 - около 20%. В родительской популяции клеток HeLa-TI уровень реактивации оказался около 30 % (Рисунок 11 А). Для 5-azaC реактивация в популяции клеток была ниже среднего уровня, однако не ниже реактивации в клоне HeLaTI-2, обладающим низкой чувствительностью к реактивирующим стимулам (Рисунок 11 Б). При обработке клеток 5-azaC (5мкМ) доля GFP-положительных клеток для клона HeLa-TI-1 составила 33% от общего количества клеток, для клона HeLa-TI-2 - 15% и 18% в родительской популяции HeLa-TI клеток. Таким образом, полученные результаты позволили в дальнейшем пренебречь влиянием сайтов интеграции провируса на степень реактивации. На рисунке 11 также представлена зависимость реактивации экспрессии репортерного гена GFP от экспозиции клеток к ряду соединений. 4.1.1. Распределение гистоновых модификаций в интегрированном векторе Реактивация транскрипции гена GFP после применения TSA свидетельствует о прерывании эпигенетического молчания в модельной системе, обусловленном модификациями гистонов, в частности ацетилированием. В тоже время ацетилирование гистонов осуществляется посредством двух ферментативных систем, представленных 97 семейством гистоновых ацетилтрансфераз (HAT), переносящих ацетильную группу на лизиновые аминокислотные остатки и семейством деацетилаз (HDAC), удаляющих данную модификацию. Наличие ацетилированных лизиновых остатков на N-концах гистонов характеризует транскрипционно-активные участки хроматина. Деацетилазы же удаляют эти модификации и представляют собой репрессоры транскрипции. Как правило, гистоновые ацетилтрансферазы и деацетилазы входят в состав больших коактиваторных и корепрессорных белковых комплексов [Katz, Jack-Scott et al., 2007; Poleshko, Palagin et al., 2008]. Ввиду того, что TSA имеет широкий спектр ингибирования гистоновых деацетилаз Iго и II-го класса, а литературные данные свидетельствуют о непосредственном участии гистоновой деацетилазы 1 (HDAC1) в поддержании эпигенетического молчания, для специфического нокдауна гена HDAC1 нами были использованы методы, основанные на РНК-интерференции, [Barski, Cuddapah et al., 2007; Guenther, Levine et al., 2007]. За счет деградации матричной РНК белка после взаимодействия со специфической миРНК, происходила реактивация транскрипции гена GFP до 60%, что свидетельствовало о вовлечении данного фактора в процесс эпигенетического подавления транскрипции (Рисунок 12А). Для подтверждения специфичности нокдауна посредством миРНК относительно белков одного семейства со схожей молекулярной структурой и специфичности вовлечения белка в процесс поддержания эпигенетического молчания, были проанализированы другие представители семейства гистоновых деацетилаз I-го класса (HDAC2 и HDAC3). В то время как нокдаун генов HDAC2 и HDAC3 не приводит к сколько либо значимой реактивации по сравнению с HDAC1, эффективность деградации белков была продемонстрирована для всех трех гистоновых деацетилаз (результаты Вестерн блоттинга, рисунок 12В). Также во всех экспериментах с использованием миРНК в качестве отрицательного контроля для исключения “off target” эффекта использовалась неспецифическая миРНК [Bannister, Zegerman et al., 2001]. Другими представителями эпигенетических репрессоров транскрипции являются гистоновые метилтрансферазы. Триметилирование аминогрупп в положениях H3K9me3, и H4K20me3 ассоциировано с гетерохроматиновой областью и репрессией генов [Grunstein, 1997; Wolffe and Hayes, 1999]. Также метилирование в области H3K9 приводит к связыванию с гистонами белка HP1 (Histone protein 1), который необходим для поддержания конденсированного состояния хроматина и обеспечивает взаимосвязь с метилтрансферазами [Barski, Cuddapah et al., 2007; Guenther, Levine et al., 2007]. Белковые факторы KMT1E и 98 KMT5C функционируют как гистоновые метилазы для H3K9me3 и H4K20me3 модификаций соответственно. При помощи РНК-интерференции нам удалось показать их роль в поддержании эпигенетической репрессии для GFP гена. Уровень реактивации экспрессии при нокдауне этих генов составил 35 и 45% соответственно. Для более детального изучения влияния химических соединений на эпигенетические механизмы регуляции транскрипции нами были проанализированы маркеры сайленсинга гена GFP и промоторных областей ретровирусного вектора. Анализ гистоновых модификаций в области промотора и сайта старта транскрипции гена GFP проводился с использованием метода иммунопреципитации хроматина с антителами, распознающими различные модификации гистонов. Используя данную методику нам удалось подтвердить наличие гистоновых модификаций в области промотора и сайта старта транскрипции гена GFP, что явно коррелирует с участием белковых факторов, ответственных за их образование в поддержании эпигенетического молчания. Так, ацетилирование гистонов Н3 и Н4 (маркеры активной транскрипции) было обнаружено в области промотора активно транскрибируемого гена GAPDH, что коррелирует с локализацией фермента PolII, обеспечивающего сам процесс транскрипции (Рисунок 12Б). При изучении областей GFP количество гистоновых модификаций было значительно снижено (ацетилирование Н3 и Н4), а фермент PolII отсутствовал. Полученные нами данные полностью согласуются с результатами изучения модификаций гистонов. Так было показано, что ацетилирование увеличивает доступность хроматина для транскрипционного аппарата, вследствие чего играет важную роль для активации транскрипции, тогда как деацетилирование гистонов приводит к гетерохроматинизации [Majumder, Kutay et al., 2006]. Анализ метилирования H3K9me3 и H4K40me, маркеров эпигенетически молчащих генов, отражал обратную корреляцию в соответствии с транскрипцией, т.е. их присутствие на ДНК гена GFP, но не GAPDH, что также согласуется с литературными данными об участии данных модификаций в эпигенетической репрессии генов [Klose and Bird, 2006]. Еще одной особенностью используемой модельной системы является наличие не только внутреннего промотора, но и вирусных LTR. Чтобы охарактеризовать интегрированный вектор, мы проанализировали распределение гистоновых модификаций и в области LTR промотора. Дополнительно был проведен сравнительный анализ этих модификаций в HeLa-TI клетках с клетками HeLa-TI-L, несущих идентичный эпигенетически молчащий ген GFP в составе того же ретровирусного вектора, но при отсутствии внутреннего CMV промотора (Рисунок 12Г). Данный анализ позволил нам 99 исключить влияние самого CMV промотора на механизмы эпигенетического молчания, связанные с изменением гистоновых модификаций, т к обе модельные системы обладали одинаковым равномерным распределением гистоновых модификаций по всей длине интегрированного ретровирусного вектора. Таким образом, нами было показано, что эпигенетическая репрессия GFP в составе интегрированного ретровирусного вектора обеспечивается за счет модификаций гистонов (H3K9me3 и H4K40me), и осуществляющих эти модификации белков (HDAC1, KMT1E и KMT5C), ответственных за из привнесение. 4.1.2. Метилирование ДНК интегрированного провируса Метилирование ДНК является наиболее изученной эпигенетической модификацией, ассоциированной с транскрипционной репрессией генов [Baylin 2004; Baylin 2005; Fraga and Esteller 2007]. Многочисленные исследования подтверждают влияние метилирования ДНК в промоторных областях генов на их экспрессию: при наличии большого количества метилированных CpG пар часто наблюдается снижение экспрессии гена вплоть до полного ее исчезновения [Brooks, Harkins et al., 2004; Katz, Jack-Scott et al., 2007; Blazkova, Trejbalova et al., 2009]. Различные механизмы, посредством которых происходит подавление экспрессии генов в результате метилирования регуляторных участков представлены на рисунке 1 [Senigl, Plachy et al., 2008]. Для изучения влияния метилирования ДНК на экспрессию гена GFP, мы исследовали метилирование в промоторной области CMV, под непосредственным влиянием которой происходит транскрипция GFP. Методом бисульфитного секвенирования было установлено, что уровень метилированных СpG CMV промотора не превышает 2% (Рисунок 13Д). Анализ литературных данных подтвердил, что в зависимости от модельной системы промотор СMV не всегда подвергается метилированию [Svoboda, Hejnar et al., 2000]. Одним из предполагаемых механизмов такой защиты от метилирования является наличие множественных сайтов связывания транскрипционных факторов, которые и препятствуют действию ДНК-метилтрансфераз [Fuks, Burgers et al., 2001]. Нами также было исследовано распределение метилирования ДНК внутри интегрированного провируса в области ретровирусных генов pol и env (Рисунок 13Д). Интересно, что при сравнении популяций клеток с внутренним неметилированным CMV и при его отсутствии изменяется и метилирование соседних регионов: при наличии CMV метилирование области гена env, 100 находящейся в непосредственной близости от промотора снижается с 68 до 37%, что наглядно демонстрирует, что внутренний CMV промотор не только не подвергается метилированию, но и препятствует метилированию ДНК соседних областей. Как было отмечено выше, особенностью ретровирусных модельных систем является наличие не только внутреннего промотора, но и вирусных LTR. Нами был проведен анализ метилирования последовательности LTR при действии 5-azaC. Методом бисульфитного секвенирования GFP было проведено сравнение уровня метилирования в культуре клеток HeLa-TI, содержащей эпигенетически инактивированный GFP ген и обладающей GFPотрицательным фенотипом, с уровнем метилирования ДНК в популяции HeLa-GFP(+) клеток, активно экспрессирующих GFP (Рисунок 13А). Было показано, что доля клеток, активно экспрессирующих GFP коррелирует с уровнем метилирования LTR: в популяции клеток HeLa-TI при 1,5% зеленых клеток, уровень метилирования LTR составил 78%, тогда как при метилировании в 27% уровень экспрессии GFP возрастал практически до 90% от общей популяции клеток (HeLa-GFP(+)). При сравнении уровня метилирования ДНК для фрагмента гена GFP (Рисунок 13Б) такой значительной разницы в метилировании ДНК обнаружено не было. В клетках как с отрицательным (HeLa-TI), так и положительным GFPфенотипом уровень метилирования составил 22% и 23 % соответственно. На рисунке 13В также представлено изменение профилей экспрессии GFP в процессе сортировки клеток, обладающих GFP- отрицательным фенотипом. Таким образом, полученные нами данные проточной цитофлуориметрии в совокупности с данными анализа метилирования ДНК указывают, что участие метилирования ДНК в регуляции экспрессии GFP опосредовано метилированием в участках LTR. Отсутствие метилирования в нашей модельной системе в области внутреннего CMV промотора и прерывание эпигенетического подавления транскрипции после применения 5-azaC также свидетельствуют о влиянии LTR. Это хорошо согласуется с литературными данными о том, что метилирование LTR является часто является мишенью для эпигенетического подавления транскрипции ретровирусных генов [Jeltsch, Nellen et al., 2006]. Далее был проведен нокдаун белков, участвующих как в поддержании уровня метилирования, так и обеспечивающих данную модификацию de novo. Было показано участие двух de novo ДНК метилтрансфераз (DNMT3A и DNMT3B) в поддержании эпигенетической репрессии (Рисунок 13Г). Для определения ДНК метилтрансфераз в области промотора и сайта старта транскрипции гена GFP, как и в случае анализа модификаций гистонов, использовался метод иммунопреципитации хроматина. На рисунке 101 13Д схематично показано распределение белков на ДНК в соответствии с полученными экспериментальными данными в культурах клеток HeLa-TI. При анализе локализации ДНКметилтрансфераз выяснилось, что белок DNMT3A ассоциирован с областью CMV промотора, что подтверждается данными реактивации экспрессии GFP после нокдауна в клетках HeLa-TI, но не HeLa-TI-L. Белок DNMT3B локализован в области LTR, и его нокдаун в обоих культурах приводил к реактивации GFP экспрессии. Несмотря на низкий уровень реактивации экспрессии GFP после нокдауна белка DNMT1 в обеих клеточных линиях, нам удалось показать его локализацию в области LTR. Полученные данные полностью соотносятся с литературными, так как для de novo метилтрансфераз также было показано их непосредственное участие в регуляции транскрипции посредством ассоциации данных белков с транскрипционными факторами [Suetake, Shinozaki et al., 2004]. Нам не удалось показать участие DNMT2 в регуляции экспрессии, однако известно, что ферментативная метилтрансферазная активность данного белка значительно ниже по сравнению другими ДНК-метилтрансферазами [Karpf, Peterson et al., 1999; Liang, Gonzales et al., 2002]. DNMT3L не обладает метилтрансферазной активностью, но может стимулировать активность других ферментов, в частности DNMT3A и DNMT3B [Christman, 2002]. При ее нокдауне также не наблюдалось значительной реактивации GFP. Таким образом, из совокупности данных по метилированию можно судить о непосредственном участии метилтрансфераз и метилирования LTR в регуляции экспрессии GFP. В целом наши исследования по описанию механизмов эпигенетической репрессии в модельной системе показали перспективность ее использования для исследования влияния ксенобиотиков на эпигенетическое ингибирование экспрессии генов, обусловленное как метилированием ДНК, так и модификацией гистонов. 102 4.2 Реактивирующее действие канцерогенных и противоопухолевых ксенобиотиков Изучение механизмов канцерогенеза является необходимым как для понимания этиологии и патогенеза опухолей, так и для поиска новых и эффективных методов лечения онкологических заболеваний. Химические соединения обладают широким спектром повреждающего действия как генотоксического, так и эпигенетического характера. Многие противоопухолевые препараты также обладают и генотоксическими, и эпигенетическими эффектами. В настоящее время к противоопухолевым химиопрепаратам относят различные группы соединений. Алкилирующие цитостатики вызывают нарушение структуры ДНК в клетках опухолей, что приводит к нарушению пролиферации. Антиметаболиты азотистых оснований вызывают гибель опухолевых клеток за счет встраивания в ДНК. Препараты алкалоидов растений воздействуют на цикл деления опухолевых клеток. К этой группе цитостатиков относят препараты тиса, алкалоиды подофиллотоксина и камптотекины. Ферментные препараты могут нарушать процессы роста и дифференцировки. Антибиотики влияют на процессы транскрипции ДНК и синтеза РНК в клетках опухоли. Ингибиторы рецепторов эпидермального и сосудистого эндотелиального фактора роста опухолей вызывают блокаду соответствующих сигнальных путей. Торможение роста опухоли с помощью гормонов, антигормонов или веществ, регулирующих их выработку, также относят к химиотерапии опухолей. В настоящей работе была проведена оценка действия химических соединений на эпигенетическую регуляцию экспрессии генов, что представляет особый интерес, так как при большом разнообразии противоопухолевых химиопрепаратов актуальной проблемой остается повышение их эффективности и уменьшение побочных эффектов. В последнее время такие соединения как трихостатин-А (TSA), субероиланилид гидроксамовая кислота (SAHA), подавляющие действия всех классов гистоновых деацетилаз, а также вальпроевая кислота (VPA), и трапоксин (Trapoxin), являющиеся ингибиторами HDAC I-го и II-го класса также получили широкое применение в противоопухолевой терапии [Butler, Zhou et al. 2002; Mukhopadhyay, Weisberg et al. 2006; Kijima, Yoshida et al. 1993; Dowdell, Pesnicak et al. 2009; Marks, Rifkind et al. 2001; Marks 2010]. 103 Среди ингибиторов ДНК метилтрансфераз наиболее известны 5-азацитидин (5-azaC) и 5-аза-2'дезоксицитидин (d-azaC). Для реактивации транскрипции ретровирусов в культурах клеток применяются оба ингибитора, так как исследования доказали их высокую эффективность. Данные препараты участвовали в клинических испытаниях, но из-за высокой токсической активности не используются для лечения пациентов [Kubicek, O'Sullivan et al., 2007] Тем не менее d-azaC до сих пор применяется для лечения миелодиспластических синдромов и случаев с эпигенетическим подавлением экспрессии критических регуляторных генов [Bartova, Pachernik et al., 2005; Gialitakis, Kretsovali et al., 2006]. Поиск новых менее токсичных специфических ингибиторов ДНК метилтрансфераз является весьма актуальным до сих пор. Таким образом, понимание молекулярных механизмов влияния химических соединений на системы эпигенетической регуляции генов и, соответственно, причин возникновения нарушений данной регуляции является актуальной задачей современной молекулярной онкологии. В представленной работе на модельной системе эпигенетической репрессии – популяции клеток HeLa-TI, нами были исследованы различные химические соединения для обнаружения их реактивирующего действия. Так как в данной модели присутствуют оба компонента эпигенетической репрессии: система ферментов, ответственных за изменение гистоновых модификаций и метилирование ДНК, при проведении скрининга были выявлены соединения с потенциальным влиянием как на метилирование так и на гистоновые модификации. Список химических соединений, проанализированных в тесте на их реактивирующую способность приведен в таблицах 5 и 6. Анализ данных, полученных в ходе скрининга, была ориентирован на отбор химических веществ, вызывающих значимую реактивацию эпигенетически инактивированных генов. Эффект определялся как «положительный», если средняя величина GFP-положительных клеток превышала 15% для одной из двух концентраций химического препарата c достоверностью более p<0,001 (Рисунок 14). Препараты, обладающие известной эпигенетической активностью. Для тестирования разработанной нами эукариотической модельной системы эпигенетической реактивации генов на возможность ее использования в скрининге химических препаратов, обладающих эпигенетическими эффектами, было изучено действие соединений с известной выраженной эпигенетической активностью. Положительный результат реактивации гена GFP был получен практически для всех соединений. 104 В список эпигенетически активных соединений также вошли некоторые ингибиторы гистоновых деацетилаз. Так как TSA применялся ранее, он был использован в качестве положительного контроля на реактивацию, опосредованную изменением гистоновых модификаций. Его применение привело к экспрессии GFP в 35% клеток (Рисунок 14). Следующим шагом в изучении влияния химических препаратов на эпигенетическую регуляцию генов было проанализировано их влияние на общий уровень гистоновых модификаций (Рисунок 15). После обработки TSA наблюдалось снижение метилирования в положении H4K20me3, модификации характерной для нетранскрибируемых генов (Рисунок 15). После обработки TSA происходило увеличение модификации H3K4me3, отвечающей за активацию транскрипции на промоторе (Рисунок 19). Анализ изменений гистоновых модификаций на промоторе подтвердил результаты Вестерн-Блоттинга, что свидетельствует о непосредственном влиянии TSA на модификации гистонов на общеклеточном уровне и в промоторной области реактивированных генов. В качестве контроля TSA использовался и в экспериментах по изучению метилирования. Как и ожидалось, реактивурующее действие TSA не приводило к изменению метилирования ДНК как на уровне генома (Рисунок 16), так и в области LTR (Рисунки 17 Б и 20). Таким образом, результаты наших экспериментов хорошо согласуются с данными опубликованных исследований о том, что TSA не меняет уровень метилирования ДНК, но влияет на гистоновые модификации в промоторе эпигенетически инактивированного гена, и при этом приводит к увеличению общего уровня ацтелирования в клетках [Budde, Zhang et al., 2013]. В качестве других представителей ингибиторов гистоновых деацетилаз широкого спектра действия использовались cубероланилидгидроксамовая кислота (SAHA или Vorinostat), вальпроевая кислота (VPA), Depsipeptide (бициклический пептид, изолированный из Chromobacterium violaceu) и флаваноид, изолированный из Maclura pomifera - Pomiferin. Использование данных соединений привело к реактивации GFP до 19, 19, 21 и 28% соответственно, что несколько ниже по сравнению с TSA (35%) (табл. 5). Некоторые из этих препаратов уже получили применение в клинике. Препарат cубероланилидгидроксамовой кислоты, Vorinostat или Zolinza, применяется в химиотерапии в качестве цитотоксического и антинеопластического средства при Т-клеточных лимфомах (CTCL), при которых часто наблюдается повышенная экспрессия гистоновых деацетилаз [Feng and Kenney, 2006; Glister, Satchell et al., 2012; Zhao, Chen et al., 2012]. Изучение вальпроевой кислоты или VPA показало, что она способна изменять не только общий уровень ацетилирования гистонов, но и H3K9ac, важной модификации гистонов для регуляции генов в стволовых клетках [Svasti, 105 Srisomsap et al., 2005]. В настоящее время VPA в клинике применяется при эпилепсии и легочной гипертензии, также было показано, что данное соединение также может применяться для улучшения результатов химиотерапии при лечении EBV (Epstein–Barr virus) - ассоциированных опухолей [Glasspool, Teodoridis et al., 2006; Sharma, Lee et al., 2010]. В настоящее время препарат Depsipeptide проходит клинические испытания для лечения Тклеточных лимфом (CTCL). Известно, что препарат имеет метаболический путь активации и отличается по молекулярной структуре от уже известных ингибиторов гистоновых деацетилаз, так как является непосредственно синтетическим пептидом. Для Pomiferin, помимо ингибирования гистоновых деацетилаз, были показаны антиоксидативное и цитотоксическое действие по отношению к клеткам холангиокарциномы [Belinsky, Grimes et al., 2011]. Специфический ингибитор гистоновой деацетилазы 1 MS275 или Entinostat реактивировал до 16% клеток. Ранее нами уже была исследована роль HDAC1 в поддержании эпигенетической репрессии при помощи РНК-интерференции. Химический ингибитор HDAC1 Entinostat может применяться не только при заболеваниях с повышенной экспрессией данного белка, но и для снижения резистентности к лекарственным препаратам, обусловленной эпигенетическими факторами [Miranda, Cortez et al., 2009]. При совместном применении с ингибиторами метилирования ДНК была показана эффективность данного соединения на модели клеток рака легкого [Zhou, Bi et al., 2011]. Соединение DZNep или 3-диазенпланоцин А, являющийся ингибитором H3K27me3 и H4K20me3 триметилирования, в скрининге реактивировал экспрессию в 15% клеток. Ингибируя метилирование гистонов в клетках, данное соединение приводит к реактивации генов, механизм инактивации которых не включает метилирование ДНК [Karpf, Peterson et al., 1999; Liang, Gonzales et al., 2002]. Известно, что DZNep может применяться при лечении острого миелоидного лейкоза (AML), а его механизм реактивации генов включает увеличение образования активных форм кислорода [Christman, 2002; Steensma, Baer et al., 2009]. К соединениям метилирования ДНК эпигенетического в скрининге действия относятся: с известным 5-азацитидин ингибированием (5-azaC) и 5-аза-2’- дезоксицитидин (d-azaC). Оба соединения являются химическими аналогами цитидина и приводят к необратимому ингибированию ДНК-метилтрансфераз. Для реактивации транскрипции генов в культурах клеток применяются оба ингибитора, т. к. исследования доказали их высокую эффективность. В течение последних 20 лет данные препараты 106 участвовали в клинических испытаниях, но из-за высокой токсической активности не используются для лечения пациентов [Brueckner, Garcia Boy et al., 2005]. Однако в последнее время снова возрос интерес к применению децитабина (Decitabine, 5-aza-2'-deoxycytidine) для лечения миелодиспластических синдромов в случаях с эпигенетическим ингибированиием критических регуляторных генов [Kaminskas, Farrell et al., 2005]. При обработке этими соединеним происходила реактивация экспрессии GFP в 27% и 25% клеток. Применение соединения RG108 (N-фталил-L-триптофан) привело к реактивации экспрессии GFP в 15 % клеток. Известно, что его реактивирующая способность ниже по сравнению с 5-azaC. Однако, в отличие от 5azaC механизм его действия на метилтрасферазы не включает ковалентное связывеие с ДНК, что делает его более перспективным для применения. Кроме того, RG108 не влияет на метилирования саттелитных последовательностей центромерных областей и обладает низкой токсичностью [Krawczyk, Keane et al., 2013]. В настоящее время данный препарат проходит клинические испытания. В нашей системе 5-azaC использовали в качестве контрольного ингибитора метилирования как общего уровня метилирования в клетке (Рисунок 16), так и в метилирования в областях LTR (Рисунки 17Б и 20). Как видно из результатов эксперимента с гистоновыми модификациями, 5-azaC не влияет на изменение гистоновых модификаций на общем уровне (Рисунок 15), но может приводить к увеличению Н3ас и снижению H4K20me3 непосредственно в области промотора GFP (Рисунок 19). Однако нельзя исключить, что данные изменения произошли в результате реактивации транскрипции и эффект является вторичным. В настоящее время d-azaC (или Vidaza) применяется для лечения острого миелоидного лейкоза и миелодиспластических синдромов [Johnson, He et al., 1995]. Для препарата BIX01294 (производное диазепинхиназолинамина) эффект был минимальным, однако данный препарат является селективным ингибитором гистоновой мелиттрансферазы G9a, ответственной за образование модификации H3K9me2, в то время как в нашей системе была показана роль KMT1E в образовании H3K9me3, что может объяснить данный отрицательный результат [Piacentini, Donadelli et al., 2006]. В заключение нужно отметить, что хотя многие из вышеперечисленных соединений получили практическое применение, точный механизм действия для многих из них до сих пор не изучен до конца. Таким образом, для всех соединений с выраженной эпигенетической активностью (Таблица 5) был получен положительный результат реактивации гена GFP, что является подтверждением возможности использования данной модели эпигенетической репрессии для 107 поиска новых химических соединений, обладающих потенциальным эпигенетическим действием. Группа генотоксических соединений. В последнее время в онкологии особое внимание уделяется эпигенетическим механизмам воздействия на фенотип клетки. Причина этого заключается в появлении большого количества данных о роли эпигенетической составляющей в процессе злокачественной трансформации клетки. Более того, необратимые генетические изменения часто вторичны и являются следствием предшествующих эпигенетических процессов. В связи с этим во всем мире резко возрос объем исследований в области эпигенетических механизмов канцерогенеза и возможностей обратного воздействия на этот процесс с помощью ксенобиотиков. Такие противоопухолевые препараты как цисплатин, доксорубицин, митоксантрон, митомицин С и циклофосфамид способны связываться с ДНК. Митомицин С ковалентно связывается с N2- атомом гуанина, а также образует сшивки между комплементарными цепями ДНК. В тоже время митомицин С является наиболее изученным препаратом, для которого эпигенетический эффект показан на молекулярном уровне. Так, наличие метилированного цитозина увеличивает количество сшивок при действии митомицина С, что в конечном итоге приводит к изменению структуры хроматина в данной области и снижению экспрессии ряда генов [Parker, Cutts et al., 2001]. Известный цитостатик доксорубицин ковалентно связывается с N2- атомом гуанина в составе CG пар оснований, что также может влиять на экспрессию генов, если образование аддуктов происходит в промоторной области [Parker, Buley et al., 2004]. Митоксантрон также приводит к образованию аддуктов с гуанином и способен ингибировать транскрипцию генов [Galea and Murray, 2002]. Формирование аддуктов происходит в последовательности CCGG, что объясняется изменением структуры ДНК при наличии метилированых сайтов. При таком взаимодействии, наоборот, происходит раскрывание структуры хроматина, что делает ДНК более доступной для различных белковрегуляторов транскрипции и молекул митоксантрона. [Davies, Hardman et al., 2000]. При скрининге генотоксические соединения оказывали различное влияние на реактивацию гена GFP (соединения с 1 по 11, табл. 6). Цисплатин, ДМБА, араноза и циклофосфамид не оказали реактивирующего действия. 108 Из литературных данных известно, что цисплатин формирует межнитевые сшивки GG и внутринитевые G-С, что приводит к конформационному изменению ДНК и делает ее более доступной для дальнейших взаимодействий [Barton, Robaire et al., 2005]. При этом повышается уровень повреждения ДНК и нарушается структура нуклеосомы, однако эпигенетическог эффекта при этом выявлено не было [Rummel, Trosko et al., 1999]. Bleomycin, антибиотик из Streptomyces verticillus, индуцирующий как образование двуцепосчечных разрывов ДНК, так и ингибирование включения тимидина привел к реактивации транскрипции GFP до 35 %. Было исследовано действие данного соединения на на гистоновые модификации и метилирование ДНК, где не было выявлено значительных изменений (Рисунки15, 16 и 17Б). Все тестируемые узкобороздочные лиганды (соединения с 1 по 6 в таблице 6) обладали реактивирующим эффектом. Данные, полученные в ходе скрининга, указывают на потенциальную способность УБЛ влиять на эпигенетическую регуляцию экспрессии генов. Действие некоторых УБЛ было изучено более подробно. Обсуждение данных препаратов приводится в следующей главе. Соединения с различными механизмами действия. К соединениям с различным механизмом действия в нашем исследовании были отнесены соединения, обладающие гормоноподобным еффектом. Флуоцинолона ацетонид (FA) является глюкокортикостероидом с выраженным противовоспалительным эффектом. Уровень реактивации для данного соединения составил 22% (доля клеток с реактивацией GFP). Обработка FA приводила к снижению уровня репрессорной модификации гистонов H4K20me3 в клетках и к увеличению общего уровня ацетилирования (Рисунок 15). Также было выявлено, что это соединение оказывает эффект на интегральный уровень метилирования ДНК в клетке (Рисунок 16) и в промоторе (Рисунок 17Б). Биологическое действие глюкокортикоидов осуществляется посредством активации глюкокортикоидного рецептора (GR), который экспрессируется практически во всех типах клеток и представляет собой транскрипционный фактор. Предположительным механизмом реактивирующего действия данного соединения может являться активации транскрипционных факторов через глюкокортикоидный рецептор. Обработка клеток соединением Bisphenol A (BPA) (химическая структура сходна с эстрадиолом) приводила к увеличению доли клеток с GFP-позитивным фенотипом. Влияние этого препарата на модификации гистонов сравнимо с действием FA (Рисунок 15). Однако 109 снижение уровня метилирования ДНК наблюдалось только на промоторе LTR, но не в клетках в целом (Рисунки 17Б и 16 соответственно). Данное соединение в настоящее время применяется для производства резиновых изделий, найдено в металлических банках, пластиковых контейнерах и т.д. Также было показано, что BPA стимулирует рост опухолей при андроген-независимом раке предстательной железы [Guo and Peng, 2013]. Сульфоновая кислота (MLN4924) является низкомолекулярным ингибитором убиквитинирования, связывающимся с E1- E3-лигазой. В скрининге препарат привел к реактивации транскрипции GFP в 32% клеток. Как известно, убиквитинирование белков контролирует деятельность многих ферментов, как в норме, так и при развитии различных патологий. Было показано, что применение данного соединения стимулирует в клетках аутофагию и апоптоз [Field-Smith, Morgan et al., 2006]. В нашем исследовании препарат не оказал действие на метилирование ДНК (Рисунки 16 и 17Б), но при этом наблюдалось изменение ацетилирования гистонов Н3 и Н4 и снижение репрессорной модификации H4K20me3 на общем клеточном уровне (Рисунок 15), что может служить предположительным механизмом действия данного соединения. Bortezomib и MG132 являются протеосомальными ингибиторами. Оба соединения ингибируют активность протеасомы за счет связывания 26S субьединицы, таким образом предотвращая расщепление ряда клеточных белков. В скрининге уровень реактивации для этих агентов составил: 28% для Bortezomib и 71% для MG132. Так как MG132 показал большую реактивационную способность, препарат был выбран для дальнейшего изучении гистоновых модификаций и метилирования ДНК. Действие MG132 на ацетилирование гистонов оказалось ниже по сравнению с другими реактивирующими агентами, а анализ гистоновых модификаций, характерных для активно транскрибируемых генов (H3K4me3 и acH3/H4) продемонтрировал снижениепосле их уровня в клетке после обработки MG132 (Рисунок 15). Также для MG132 было показано и его действие на метилирвание ДНК на общем уровне (Рисунок 16) и значительное снижение метилирования на LTR промоторе (Рисунок 17Б). Таким образом, ингибиторование протеасом оказывает эффект на эпигенетическую регуляцию экспрессии генов. Однако данный эффект может быть вторичным и быть связанным с предотвращением деградации белков эпигенетической регуляции. Ингибирование протеасом является перспективным направлением для клинического применения, так как для данной группы соединений было показано их избирательное цитотоксическое действие на опухолевые клетки [Khan and Pilch, 2007; Takagi, Dexheimer et al., 110 2007]. Препарат Bortezomib (Velcade) в настоящее время уже применяется для лечения различных видов миелом [Dancey and Eisenhauer, 1996; Weintraub, Revel-Vilk et al., 2007]. Camptothecin (CPT, Topotecan, Irinotecan), алкалоид из Camptotheca acuminata, ингибиторует действие топоизомеразы I вследствие стабилизации комплекса ДНК с этим ферментом [Mathews, Chendamarai et al., 2011]. Топоизомеразы относятся к классу ферментов-изомераз, топологическую влияющих напряженность на топологию цепи ДНК, ДНК. Топоизомераза связанные со I разрешает спирализацией — деспирализацией, внося разрыв, который позволяет спирали ДНК вращаться. После релаксации топоизомераза соединяет разорванные концы. Другим представителем ингибиторов топоизомераз является Etoposide (Etopophos, VP-16) - алкалоид ингибирующий действие топоизомеразы II. Топоизомераза II катализирует и обеспечивают расплетание ДНК путем создания разрывов в обоих цепях ДНК. Обраотка клеток ингибиторами топоизомеразы I и II (Camptothecin и Etoposide) привел к реактивации экспрессии GFP в 34% и 23% клеток соответственно. Ингибиторы топоизомераз рассматривают в качестве противоопухолевых препаратов достаточно давно, в настоящее время в клинике применяются аналоги данных препаратов [Raj, Ide et al., 2011; Jarvius, Fryknas et al., 2013]. Однако их действие на эпигенетические механизмы изучено не достаточно. Для Camptothecin было показано действие на гистоновые модификации только за счет снижения уровня H3K9me3 (Рисунок 15), при этом значительного изменения других модификаций не наблюдалось. Для Etoposide было выявлено снижение H4K20me3 и незначительное увеличение ацетилирования гистона Н3 (Рисунок 15). При анализе данных метилирования ДНК неожиданным результатом оказалось снижение локального метилирования при действии Camptothecin, в то время как Etoposide схожего действия не оказывал (Рисунок 17Б). Suramin A, полисульфонированная нафтилмочевина является ингибитором топоизомераз, клеточного транспорта фолиевой кислоты и синтеза стероидных гормонов. Наряду с обширным механизмом действия реактивировал экспресиию гена GFP до 17%. Повышенный уровень реактивных форм кислорода, таких как пероксиды и свободные радикалы, приводит к повреждающему действию ДНК. Триоксид мышьяка, Arsenic trioxide (ATO, Roxarsone, Neosalvarsan) является индуктором оксидативного стресса. Данное соединение применяется в качестве цитостатика при лечении острого промиелоцитарного лейкоза [Lecumberri, Dupertuis et al., 2013] [Vittorio, Cirillo et al., 2012]. Известно, что цитостатическое действие Arsenic trioxide обусловлено различными механизмами, однако ранее эффект данного препарата на эпигенетическую регуляцию не изучался. При его 111 применении в скриниге наблюдался эффект реактивации экспрессии GFP в 74% клеток. Нами был продемонстрирован эффект на гистоновые модификации. Было выявлено незначительное увеличение ацетилирования гистона Н3 и снижение H4K20me3 (Рисунок 15). Более выраженным эффектом данного препарата было снижение интегрального уровня метилирования ДНК в промоторе LTR и в геноме обработанных клеток (Рисунки 17Б и 16). Piperlongumine (PPL), выделенный из растения Piper longum, является индуктором оксиативного стресса. Действие данного препарата до конца не изучено, наряду с индукцией оксидативного стресса было показано его ингибирующее действие на протеасомы [Loewe and Urbanietz, 1974]. Результат реактивации экспрессии GFP был значительно ниже (20%) по сравнению с Arsenic trioxide (70%). Препарат EGCG (эпигаллокатехин галлат, полифенол, флаваноид из зеленого чая) являющийся одновременно ингибитором ДНК метилтрансфераз и теломераз, в скрининге привел к низкой реактивации гена GFP (11%), по сравнению с другими соединениями. В настоящее время это соединение рассматривается как адьювант при химиотерапии [Baraldi, Bovero et al., 2004]. Catechin (фенол, флаваноид из Mimosa catechu), ингибитор гистидин декарбоксилаз, реактивировал экспрессию GFP до 15%, рассматривается в качестве препарата для лечения аденокарценомы поджелудочной железы [Baraldi, Bovero et al., 2004]. Таким образом, исследовав ряд лекарственных препаратов и канцерогенных соединений с последующим изучением действия некоторых из них на модификации гистонов и метилирование ДНК, нам удалось показать возможность применения данной экспериментальной модели эпигенетической репрессии для поиска препаратов, оказывающих потенциальное эпигенетическое действие. 4.3. Действие узкобороздочных лигандов Как было описано ранее, данные полученные в ходе скрининга указывают на потенциальную способность препаратов, относящихся к группе узкобороздочных лигандов, в дополнение к их известным свойствам, влиять на эпигенетическую регуляцию экспрессии генов. Все тестируемые узкобороздочные лиганды (соединения с 1 по 6 в таблице 6) обладали реактивирующим эффектом, действие соединений этой группы на системы эпигенетической регуляции эукариот ранее не изучали. 112 В список узкобороздочных лигандов были включены производные бисбензимидазола - Hoechst 33342 и Hoechst 33258, производные бисбензамидина Pentamidine и Deminazenе, а также Netropsin и DAPI (4',6-диамино-2-фенилиндол). Бисбензимидазолы Hoechst 33258 и Hoechst 33342, синтезированные в 1974 г. [Pommier and Marchand, 2005] широко применяются для окрашивания ДНК в молекулярнобиологических исследованиях. Кроме того, изучается возможность их применения для лечения вирусных инфекций и химиотерапии опухолей [Khan and Pilch, 2007; Khan, Shah et al., 2012]. Эти соединения обладают высокой аффинностью к ДНК благодаря их способности образовывать водородные и ван-дер-ваальсовые связи по узкой борозде ДНК [Cherepanova, Zhuze et al., 2010]. Было показано, что эти флуорохромы при связывании с ДНК изменяют температуру ее плавления, особенно, в участках, богатых АТ. Хотя эти соединения не обладают способностью ковалентно связываться с ДНК, их присутствие в узкой бороздке приводит к изменению активности ряда ферментов, в частности, топоизомеразы I [EgbeNwiyi, Igbokwe et al., 2003; Grant, Sun et al., 2006; Grant, Baron et al., 2009] хеликазы, TATAсвязывающие белки, репликативный белок А и других [Grant, Sun et al., 2006]. Препараты Pentamidine, Deminazenе и Netropsin могут применятся в качестве антибиотиков при лечении бактериальной пневмонии, малярии и других инфекционных заболеваний [Wu, Apontes et al., 2007]. В литературе также встречается упоминание об их способности усиливать транскрипцию ряда генов. Было показано, что Pentamidine усиливает экспрессию белка фратаксина на эукариотической системе [Ferguson and Denny, 1995]. Netropsin может усиливать действие промотора NOS2 за счет взаимодействия с его транскрипционными факторами [Chen, Yu et al., 1993]. Hoechst и DAPI нашли свое широкое применение в лабораторных исследованиях для окраски ядер для флуоресцентной микроскопии за счет их связывания с ДНК и наличия собственной флуоресценции. При использовании данных препаратов в работе с HeLa-TI популяцией клеток, было установлено, что при обработке клеток данными соединениями происходит реактивация транскрипции эпигенетически инактивированного гена GFP. На рисунке 18А представлены результаты обработки клеток разлиными концентрациями Hoechst 33342 (Hoechst 42). Для контроля собственной флуоресценции Hoechst 42 в тех же концентрациях обрабатывались нормальные клетки HeLa. Hoechst 42 реактивирует экспрессию GFP при более высоких концентрациях по сравнению с TSA, а его реактивирующее действие зависит от концентрации вещества и сравнимо с действием TSA. Данный эффект наблюдался и при измерении среднего уровня флуоресценции клеток (Рисунок 18Б). На панели В рисунка 18 также представлены 113 фотоснимки клеток HeLa-TI после обработки контрольными реактивирующими агентами – TSA и 5-azaC, а также узкобороздочными лигандами Heochst 33342, Heochst 33358 и DAPI. Несмотря на то, что степень реактивации у использованных узкобороздочных лигандов оказалась различна, ее уровень оказался сравнимым с ингибиторами эпигенетических факторов (TSA и 5-azaC). Наибольшей реактивирующей способностью обладали Hoechst 42 и DAPI (34 и 35 %), меньший эффект наблюдался при применении Netropsin и Deminazenе (20 и 22% соответственно) и 17 % для Pentamidine и Hoechst 33258. Особенностью Hoechst 33258 и Hoechst 33342 является то, что эти узкобороздочные лиганды связывается преимущественно с АТ-богатыми участками ДНК [Komashko and Farnham, 2010]. Важно, что соединения Hoechst42 и Hoеchst58 обладают очень схожей молекулярной структурой и отличаются одним радикалом, но при этом обладают различной реактивационной активностью. Оба препарата обладают значительным рекомбиногенным действием, поскольку ингибируют активность топоизомеразы I. При ингибировании топоизомеразы I могут возникать одноцепочечные разрывы, что, в свою очередь, является предпосылкой соматической рекомбинации [Meng, Dai et al., 2008]. Химическая структура Hoechst представлена на рисунке 24. Рисунок 24 Химическая структура Hoechst33342/ Hoechst33258. Hoechst33342 - 2′-(4этоксифенил)-5-(4-метил-1-пиперазинил)-2,5′-бис-бензимидазол тригидрохлорид. Hoechst33258 - 2′(4-гидроксифенил)-5-(4-метил-1-пиперазинил)-2,5′-бис-бензимидазол тригидрохлорид. Исходя из полученных данных мы выбрали оба препарата для дальнейших исследований их действия на эпигенетическую регуляцию. Эксперимент по измерению уровня модификаций гистонов в популяции клеток HeLaTI, характерных для нетранскрибируемых генов (H3K9me3 и H4K20me), не показал значительного снижения метилирования для обоих соединений. Однако для обоих соединений наблюдалось увеличение уровня ацетилирования гистонов acH3/H4, что характерно для реактивации экспрессии генов. Также для Hoechst33342, но не Hoechst33258 114 наблюдалось увеличение модификации H3K4me3, активирующей модификации, расположенной в промоторной области активно транскрибируемых генов (Рисунок 15). Для анализа гистоновых модификаций на промоторе GFP в результате реактивации нами были использованы Hoechst33342, Hoechst33258, DAPI, а также TSA c 5-azaC в качестве контрольных препаратов. В то время как нам не удалось показать значительного изменения модификации H4K20me для Hoechst33342, Hoechst33258, DAPI и 5-azaC, в области промотора гена GFP наблюдалось снижение данной модификации для всех препаратов, включая 5-azaC (Рисунок 19А). В промоторной области возрастало и количество ацетилирования гистона Н3, что тоже наблюдалось для всех препаратов (максимально – для TSA) (Рисунок 19Б). Из литературных данных известно, что 5-azaC не влияет на глобальное изменение модификаций гистонов, и чего можно сделать вывод, что изменение модификаций на промоторе при обработке 5-azaC происходит вторично за счет реактивации гена GFP вследстсвие снижения метилирвания. Ранее было показано, что 5-azaC может влиять на организацию хроматина за счет ингибирования de-novo ДНК метилтрансфераз [Watson, McKim et al., 2004]. Так как для Hoechst и TSA изменение модификаций гистонов происходило не только на промоторной области, но и интегрально, то можно предположить первичный эффект влияния препаратов Hoechst на регуляцию экспрессии генов за счет изменения модификации гистонов. При анализе общего уровня метилирования для группы узкобороздочных лигандов, включая Hoechst, значительных изменений отмечено не было (Рисунок 16). Напротив, при обработке клеток 5-azaC было отмечено снижение метилирования, что полностью соответствует литературным данным [Baqir and Smith, 2006; Piacentini, Donadelli et al., 2006; Senigl, Plachy et al., 2008]. В качестве отрицательного контроля выступал TSA, при применении которого изменений в глобальном метилировании ДНК зарегистрировано не было [Zhang, Fatima et al., 2005]. Некоторые препараты, не влияющие на интегральный уровень метилирования ДНК способны метилировать область промотора LTR. Примером такого соединения служит Camptothecin (Рисунки 16 и 17Б), что согласуются с результатами других исследователей [Lopez de Silanes, Gorospe et al., 2009]. При анализе метилирования промоторной области в результате обработки Hoechst, нами было показано, что наряду с 5-azaC, Hoechst33258 снижает метилирование в области LTR. При этом обработка Hoechst33342 к значительным изменениям метилирования не приводила (Рисунок 17Б). Для подтверждения полученных данных мы сравнили метилирование LTR после обработки Hoechst методом бисульфитного 115 секвенирования. Параллельно проводился анализ профилей флуоресценции, указывающих на уровень реактивации экспрессии GFP. (Рисунок 20). После обработки с Hoechst42 изменений уровня метилирования LTR не наблюдалось, в то время как обработка клеток Hoechst58 приводила к снижению уровня метилирования, что соответствует данным, полученным методом метилчувствительной ПЦР. Таким образом, при использовании Hoechst33342 и Hoechst33258, нам удалось охарактеризовать их действие на эпигенетические механизмы регуляции транскрипции. Обладая сходной молекулярной структурой, данные соединения по разному влияют на реактивацию транскрипции гена GFP. При одновременном воздействии на систему регуляции модификаций гистонов, только один препарат - Hoechst33258 оказывает деметилирующее действие на промоторную область LTR, однако реактивирующая способность его при тех же концентрациях ниже по сравнению с Hoechst33342. 4.4.Синергическое действие УБЛ и ингибиторов эпигенетической репрессии транскрипции Монохимиотерапия предполагает лечение одним препаратом, к которому наиболее чувствительна опухоль. Однако для предотвращения развития устойчивости рака к противоопухолевому препаратов. Обычно лечению предпочтение полихимиотерапия отдается заключается использованию в комбинации одновременном или последовательном применении нескольких препаратов, которые в комбинации имеют наилучший эффект. Также совместное применение двух и более препаратов позволяет снизить применяемые дозы. При взаимодействии лекарственных средств или химических препаратов может происходить изменение эффекта одного или нескольких лекарственных средств при их одновременном или последовательном применении. При этом их действие может как усиливаться, так и уменьшаться. В том случае, когда эффект комбинируемых препаратов превышает эффект каждого из них, говорят о синергизме. Если же в результате комбинированного применения лекарственных средств их эффект ослабевает или полностью устраняется, говорят об антагонизме лекарственных препаратов. В настоящее время выделяют четыре вида синергизма. Сенситизация или сенситизирующее действие веществ вид синергизма, при котором одно из вхoдящих в комбинацию лекарственных средств 116 усиливает действие другого. Такой вид взаимодействия можно выразить условной формулой 0 + 1 // 1,5. Аддитивное действие наблюдается, когда эффект комбинируемых препаратов больше, чем эффект каждого из них, но меньше их математической суммы (1 + 1 // 1,75). Суммация эффекта наблюдается при равенстве математической сумме эффектов каждого из них: 1+1//2. Потенцирующее действие обеспечивается, когда эффект применения веществ в комбинации выше математической суммы эффекта каждого из них (1 + 1 // 3). Механизмы эпигенетического молчания, описанные выше, предполагают совместное участие и модификаций хроматина, и ДНК метилирования. Многочисленные исследования выявили большую частоту реактивации молчащих генов после обработки культур клеток одновременно ингибиторами гистоновых деацетилаз и ДНК метилтрансфераз [Fabbri, Garzon et al., 2007; Garzon, Liu et al., 2009; Takada, Berezikov et al., 2009]. Так как эпигенетическая репрессия гена GFP в нашей системе обеспечивается наличием метилирования и гистоновых модификаций мы исследовали действие совместного применения эпигенетических препаратов и узкобороздочных лигандов. Изначально мы проверили действие совместного применения ингибитора гистоновых деацетилаз TSA и ингибитора ДНК- метилтрансфераз 5-azaC. В эксперименте клетки обрабатывались каждым ингибитором отдельно, последовательно и одновременно. При анализе данных нам удалось выявить потенцирующее действие 5-azaC с последующей обработкой TSA. Эффект реактивации составил 17% для 5-azaC, 30% для TSA и 52% - при их последовательном применении (Рисунок 21А данные для 48 часов). Данный эксперимент позволил нам сделать вывод об упорядоченности процессов деметилирования ДНК и ацетилирования гистонов при поддержании эпигенетического молчания, причем процесс деметилирования ДНК с последующим ацетилированием гистонов способствует реактивации транскрипции гена GFP и прерыванию эпигенетического молчания. Из литературных данных известно, что данный эффект также может наблюдаться и при реактивации клеточных генов [Zhao, Rank et al., 2009]. Применяя данную схему обработки (отдельно, последовательно и одновременно) в следующий эксперимент мы включили препараты Hoechst. Было показано, что статистически значимое увеличение экспрессии GFP наблюдалось для следующих образцов: при одновременной обработке препаратами Hoechst 33342 и TSA (19% + 25% // 76%) и Hoechst 33342 и 5-azaC (19% + 17% // 44%) наблюдалось потенцирующее действие (Рисунок 21). При одновременном применении Hoechst 33342 и Hoechst 33258 эффект их действия суммировался (19% + 16% // 35%). Нами был выявлен потенцирующий эффект и при 117 последовательных обработках: TSA-> Hoechst 33342 (25% + 19% // 58%); 5-аzaC -> Hoechst 33342 (17% + 19% // 42%) и при обработке Hoechst 33342 -> TSA (19% + 25% // 54%). При этом обработка Hoechst 33342 -> 5-azaC не давала подобного эффекта. Интересно отметить, что максимальный потенцирующий эффект наблюдался при совместном применении Hoechst 33342 и TSA, реактивация экспрессии в данном случае достигала 76%. Таким образом, данный эксперимент позволил нам выявить синергическое действие Hoechst 33342, но не Hoechst 33258 с эпигенетическими препаратами. Для дальнейшего изучения синергического действие Hoechst и повышения избирательности эффекта данных препаратов нами была предпринята попытка определения таргетных белков, участвующих в синергическом действии, т.е. эпигенетичеких факторов, часто гиперэкспрессированных в опухолевых клетках. Путем ингибирования белков методом РНК-интерференции, мы исследованли эффект Hoechst на реактивацию экспрессии гена GFP при нокдауне одного из белков эпигенетической регуляции. При данном подходе обработка химическими препаратами может служить предпосылкой для синергического действия химического вещества и данного белка. Для проведения эксперимента мы отобрали миРНК для ингибирования гистоновых деацетилаз (HDAC1, HDAC2, HDAC3 и HDAC4), при этом известно, что в нашей модельной системе участие в поддержании эпигенетического молчания принимает только HDAC1, и ДНК метилтрансфераз (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B и DNMT3L). Следует отметить, что данные ферменты могут взаимодействовать между собой и эффект их совместного действия нельзя исключать. Так на рисунке 25 показаны возможные взаимодействия вышеперечисленных эпигенетических факторов, определение которых проводилось на основе экспериментальных данных. 118 Рисунок 25 Взаимодействие эпигенетических факторов: гистоновых деацетилаз и ДНК метилтрансфераз. Определение взаимодействий основано на экспериментальных данных, при помощи базы данных string-db.org. Применение TSA на фоне ингибирования HDAC1 и DNMT1, усиливало эффект соединения, однако взаимодействие происходило по типу суммирования эффектов: TSA HDAC1 (17% + 45% // 63%), TSA - DNMT1 (17% + 24% // 41%) (Рисунок 22). Hoechst 33342 оказал аналогичный эффект на фоне ингибирования HDAC1 и DNMT1: Hoechst 33342 HDAC1 (14% + 45% // 64%) и Hoechst 33342 - DNMT1 (14% + 24% // 39%). Также нами было показано, что для Hoechst 33342 наблюдается эффект суммирования и при ингибировании DNMT3B и DNMT3L: Hoechst 33342 - DNMT3B (14% + 17% // 39%) и Hoechst 33342 DNMT3L (14% + 12% // 26%). В данном эксперименте действие Hoechst 33258 также отличалось от действия Hoechst 33342. Для Hoechst 33258 было показано только суммирования эффекта на фоне ингибирования HDAC1 (12% + 45% // 57%). Полученные данные указывают на возможность взаимодействия химических канцерогенных веществ с эпигенетическими факторами. Также следует отметить, что белковые факторы могут взаимодействовать между собой и нельзя исключать эффект их совокупного действия наряду с химическими канцерогенами. Тем не менее, синергический эффект подобного рода важно учитывать в комбинированной терапии с целью повышения эффективности препарата, снижения применяемой дозы, и достижения синергического противоопухолевого эффекта. 119 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В последнее время в онкологии особое внимание уделяется эпигенетическим механизмам воздействия на фенотип клетки. Причина этого заключается в появлении большого количества данных о роли эпигенетической составляющей в процессе злокачественной трансформации клетки. Более того, необратимые генетические изменения часто вторичны и являются следствием предшествующих эпигенетических процессов. В связи с этим во всем мире резко возрос объем исследований в области эпигенетических механизмов канцерогенеза и возможностей обратного воздействия на этот процесс с помощью ксенобиотиков. В данном исследовании впервые был предложен метод скрининга канцерогенных и противоопухолевых ксенобиотиков на модельной системе клеток человека, несущих эпигенетически репрессированный ретровирусный геном, содержащий флуоресцентный белок GFP. В результате скрининга был исследован эффект широкого ряда химических и противоопухолевых ксенобиотиков на реактивацию транскрипции эпигенетически репрессированных генов, исследовано их влияние на гистоновые модификации и метилирование ДНК. Впервые продемонстрированы эпигенетические эффекты противоопухолевых препаратов Bortezomib, MLN4924, Mimosine, Bleomycin. Также было показано, что реактивацию экспрессии генов способны вызывать соединения класса узкобороздочных лигандов, что является одним из первых экспериментальных свидетельств влияния соединений Hoechst 33342 и Hoechst 33258 на модификации гистонов и метилирование ДНК. Впервые был показан синергизм действия данных соединений в различных комбинациях с эпигенетическими препаратами (трихостатином-А (TSA) и 5азацитидином (5-azaC)). В представленном исследовании более детально было охарактеризовано действие узкобороздочных лигандов Hoechst 33342 и Hoechst 33258 на гистоновые модификации и на ДНК метилирование. Мы впервые продемонстрировали эффект Hoechst 33258 на ингибирование метилирования в промоторной области инактивированного гена. Более того, экспериментальная оценка эпигенетического действия Hoechst подтвердила, что, обладая сходной молекулярной структурой, данные соединения по-разному влияют на реактивацию транскрипции гена GFP. При одновременном воздействии на систему регуляции модификаций гистонов, только Hoechst33258 оказывает деметилирующее 120 действие на промоторную область LTR. Однако реактивирующая способность его при тех же концентрациях ниже по сравнению с Hoechst33342. Важным результатом представленной работы стала оценка совместного действия Hoechst 33342 и Hoechst 33258 с эпигенетичекими препаратами TSA и 5-azaC. Нами было показано синергическое действие данных соединений при различных комбинациях, при этом потенцирующим действием на эпигенетичекие препараты оказывал только Hoechst 33342. В представленной работе также было продемонстрировано действие Hoechst 33342 и Hoechst 33258 при нокдауне ряда эпигенетичеких регуляторов. Так, при нокдауне HDAC1, DNMT, DNMT3B и DNMT3L действие Hoechst 33342 оказывало синергических эффект на реактивацию экспрессии. Подобное дествие Hoechst 33258 наблюдалось только при ингибировании HDAC1. Полученные данные указывают на возможность взаимодействия химических канцерогенных веществ с эпигенетическими факторами. Синергический эффект подобного рода важно учитывать в комбинированной терапии с целью повышения эффективности препарата, снижения применяемой дозы, и достижения синергического противоопухолевого эффекта. Понимание молекулярных механизмов влияния генотоксических соединений на системы эпигенетической регуляции экспрессии генов и, соответственно, причин возникновения нарушений данной регуляции является актуальной задачей современной молекулярной онкологии. При воздействии комбинаций химиопрепаратов либо комплексных канцерогенных смесей их интегральный эффект часто не являются прямым суммированием эффектов отдельных компонентов. Изучение эффектов химических соединений, влияющих на эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов, расширит наши представления о молекулярных механизмах действия химических канцерогенов, а кроме того, позволит разработать новые стратегии при дизайне и испытаниях противоопухолевых препаратов. 121 ВЫВОДЫ 1. Клеточная линия HeLa-TI с интегрированным ретровирусным вектором, содержащим репортерный зеленый флуоресцентный белок GFP под промотором СMV, является адекватной модельной системой для тестирования химических соединений на способность реактивировать эпигенетически репрессированные гены. 2. Ксенобиотики с известными эпигенетическими эффектами реактивируют репрессированные гены в клетках HeLa-TI посредством модификаций гистонов и метилирования LTR промотора, в частности, за счет специфически локализованных гистоновых ацетилаз HDAC1 и метилтрансфераз KMT1E/KMT5C а также ДНКметилтрансфераз DNMT1/3A/3B. 3. Скрининг 43 ксенобиотиков выявил реактивирующее действие на эпигенетическую регуляцию экспрессии генов 21 соединения. Для 14 соединений, обладающих сильным реактивирующим действием, охарактеризовано их влияние на гистоновые модификации и метилирование ДНК. 4. Впервые противоопухолевых Подтверждена продемонстрированы препаратов способность эпигенетические Bortezomib, MLN4924, Lopinavir реактивировать эффекты Mimosine, Bleomycin. эпигенетически репрессированные гены. 5. Впервые продемонстрировано влияние узкобороздочных лигандов Hoechst 33342, Hoechst 33258, DAPI, Diminazene, Pentamidine, Netropsin на эпигенетическую регуляцию транскрипции, связанное как с процессами метилирования и ацетилирования гистонов, так и метилирования ДНК. 6. Эффекты Hoechst33258 и Hoechst 33342, различающихся лишь заместителями в пара-положении фенильного кольца, характеризуются разной направленностью действия: Hoechst33258 оказывает реактивирующее действие за счет изменения ацетилирования гистонов и снижения метилирования ДНК, а Hoechst 33342 - за счет изменения ацетилирования гистонов и 122 модификации H3K4me3, но не влияет на метилирование ДНК. 7. Процессы деметилирования ДНК и ацетилирования гистонов оказывают взаимное влияние друг на друга: наибольшая степень реактивации транскрипции гена GFP наблюдается при проведении деметилирования ДНК на 1 этапе с последующим ацетилированием гистонов. 8. Hoechst33342 оказывает потенцирующее действие на реактивацию транскрипции гена GFP эпигенетическими ингибиторами ацетилирования гистонов и метилирования ДНК, в то время как для Hoechst 33258 подобного эффекта не наблюдается. 123 СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Копнин, Б.П. Молекулярные механизмы канцерогенеза / Б.П. Копнин // В: Энциклопедия клинической онкологии. Под ред. Давыдова М.И. М.: РЛС-Пресс, с. 34–53.- 2004. - №. - P. Белицкий, Г.А. Химический канцерогенез / Г.А. Белицкий // Проблемы клинической медицины. - 2006. - № 1. - С. 10-15.- 2006. - №. - P. Гвоздев, В.А. Регуляция активности генов, обусловленная химической модификацией (метилированием) ДНК / В.А. Гвоздев // Соросовский образовательный журнал.- 1999. - V. 10, №. - P. 11-17. Залетаев, Д.В. Эпигенетическая регуляция экспрессии генов в процессах канцерогенеза / Д.В. Залетаев, М.В. Немцова, В.В. Стрельников, О.В. Бабенко, Е.М. Пальцева, В.В. Землякова, Е.Б Кузнецова, Т.В. Кекеева, Д.С. Михайленко, И.К. Манохина // Молекулярная медицина.- 2008. - № 4. - P. 46-51. Кирсанова, О.В. Ингибирование С5-цитозин-ДНК-метилтрансфераз / О.В. Кирсанова, Е.С. Громова // Биохимия.- 2009. - V. 74, № 11. - P. 1175-1186. Киселева, Н.П. Деметилирование ДНК и канцерогенез (обзор) / Н.П. Киселева, Ф. Л. Киселев // Биохимия.- 2005. - V. 70, № 7. - P. 900-911. Лихтенштейн, А.В. Метилирование ДНК и канцерогенез / А.В. Лихтенштейн , Н.П. Киселева // Биохимия.- 2001. - V. 66, № 3. - P. 293 – 317. Aapola, U. Imprinting regulator DNMT3L is a transcriptional repressor associated with histone deacetylase activity / U. Aapola, I. Liiv, P. Peterson // Nucleic Acids Res.- 2002. V. 30, № 16. - P. 3602-3608. Anway, M.D. Epigenetic transgenerational actions of endocrine disruptors and male fertility / M. D. Anway, A. S. Cupp, M. UzumcuM., K. Skinner // Science.- 2005. - V. 308, № 5727. - P. 1466-1469. Auerbach, C.J. Action of mustard gas on the bone marrow / C.J. Auerbach, M. Robson // Nature.- 1946. - V. 158, № 4024. - P. 878. Auerbach, C.J. Chemical production of mutations / C.J. Auerbach, M. Robson // Nature.1946. - V. 157, №. - P. 302. Bachman, A.N. Phenobarbital induces progressive patterns of GC-rich and gene-specific altered DNA methylation in the liver of tumor-prone B6C3F1 mice / A.N. Bachman, J.M. Phillips, J. I. Goodman // Toxicol Sci.- 2006. - V. 91, № 2. - P. 393-405. Bachman, K.E. Dnmt3a and Dnmt3b are transcriptional repressors that exhibit unique localization properties to heterochromatin / K.E. Bachman, M.R. Rountree, S.B. Baylin // J Biol Chem.- 2001. - V. 276, № 34. - P. 32282-32287. Bannister, A.J. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain / A.J. Bannister, P. Zegerman, J.F. Partridge, E.A. Miska, J.O. Thomas, R.C. Allshire, T. Kouzarides // Nature.- 2001. - V. 410, № 6824. - P. 120-124. Baqir, S.L. Inhibitors of histone deacetylases and DNA methyltransferases alter imprinted gene regulation in embryonic stem cells / S.L. Baqir, C. Smith // Cloning Stem Cells.- 2006. - V. 8, № 3. - P. 200-213. Baraldi, P.G. DNA minor groove binders as potential antitumor and antimicrobial agents / P.G. Baraldi, A. Bovero, F. Fruttarolo, D. Preti, M.A. Tabrizi, M.G. Pavani, R. Romagnoli // Med Res Rev.- 2004. - V. 24, № 4. - P. 475-528. 124 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. Barski, A. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome / A. Barski, S. Cuddapah, K. Cui, T. Y. Roh, D. E. Schones, Z. Wang, G. Wei, I. ChepelevK. Zhao // Cell.- 2007. - V. 129, № 4. - P. 823-837. Barsov, E. Gene transfer into mammalian cells by a Rous sarcoma virus-based retroviral vector with the host range of the amphotropic murine leukemia virus / E. Barsov, V.S. H. Hughes // J. Virol.- 1996. - V. 70, № 6. - P. 3922-3929. Bartel, D.P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function / D.P. Bartel, // Cell.- 2004. - V. 116, № 2. - P. 281-297. Barton, T.S. Epigenetic programming in the preimplantation rat embryo is disrupted by chronic paternal cyclophosphamide exposure / T.S. Barton, B. Robaire, B.F. Hales // Proc Natl Acad Sci U S A.- 2005. - V. 102, № 22. - P. 7865-7870. Bartova, E. Nuclear levels and patterns of histone H3 modification and HP1 proteins after inhibition of histone deacetylases / E. Bartova, J. Pachernik, A. Harnicarova, A. Kovarik, M. Kovarikova, J. Hofmanova, M. Skalnikova, M. Kozubek, S. Kozubek // J Cell Sci.- 2005. V. 118, № Pt 21. - P. 5035-5046. Bauer, A.K. Male mice deficient in microsomal epoxide hydrolase are not susceptible to benzene-induced toxicity / A.K. Bauer, B. Faiola, D.J. Abernethy, R. Marchan, L.J. Pluta,V.A. Wong, F.J. Gonzalez, B.E. Butterworth, S.J. Borghoff, J.I. EverittL. Recio // Toxicol Sci.- 2003. - V. 72, № 2. - P. 201-209. Baylin, S.B. Reversal of gene silencing as a therapeutic target for cancer--roles for DNA methylation and its interdigitation with chromatin / S.B.Baylin // Novartis Found Symp.2004. - V. 259, №. - P. 226-233; discussion 234-227, 285-228. Baylin, S.B. DNA methylation and gene silencing in cancer / S.B. Baylin // Nat Clin Pract Oncol.- 2005. - V. 2 Suppl 1, №. - P. S4-11. Belinsky, S.A. Plutonium targets the p16 gene for inactivation by promoter hypermethylation in human lung adenocarcinoma / S.A. Belinsky, D.M. Klinge, K.C. Liechty, T.H. March, T. Kang, F.D. Gilliland, N. Sotnic, G. Adamova, G. Rusinova, V. Telnov // Carcinogenesis.- 2004. - V. 25, № 6. - P. 1063-1067. Belinsky, S.A. Silencing of genes by promoter hypermethylation: key event in rodent and human lung cancer / S.A. Belinsky // Carcinogenesis.- 2005. - V. 26, № 9. - P. 1481-1487. Belinsky, S.A. Combination therapy with vidaza and entinostat suppresses tumor growth and reprograms the epigenome in an orthotopic lung cancer model / S.A. Belinsky, M.J. Grimes, M.A. Picchi, H.D. Mitchell, C.A. Stidley, Y. Tesfaigzi, M.M. Channell, Y. Liu, R.A. Casero, Jr., S.B. Baylin, M.D. Reed, C.S. Tellez, T.H. March // Cancer Res.- 2011. - V. 71, № 2. - P. 454-462. Bernstein, E., Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference / E. Bernstein, A.A. Caudy, S.M. Hammond, G.J. Hannon // Nature.- 2001. - V. 409, № 6818. - P. 363-366. Bestor, T.H. Two DNA methyltransferases from murine erythroleukemia cells: purification, sequence specificity, and mode of interaction with DNA / T.H. Bestor, V.M. Ingram // Proc Natl Acad Sci U S A.- 1983. - V. 80, № 18. - P. 5559-5563. Bestor, T.H. DNA methyltransferases / T.H. Bestor, G.L. Verdine // Curr Opin Cell Biol.1994. - V. 6, № 3. - P. 380-389. Bestor, T.H. Transposon silencing and imprint establishment in mammalian germ cells / T.H. Bestor, D. Bourc'his // Cold Spring Harb Symp Quant Biol.- 2004. - V. 69, №. - P. 381-387. Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory / A. Bird // Genes Dev.- 2002. V. 16, № 1. - P. 6-21. 125 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. Bird, A.P. CpG-rich islands and the function of DNA methylation / A.P. Bird // Nature.1986. - V. 321, № 6067. - P. 209-213. Bird, A.P. Methylation-induced repression--belts, braces, and chromatin / A.P. Bird, A.P. Wolffe // Cell.- 1999. - V. 99, № 5. - P. 451-454. Bjoras, M. Reciprocal "flipping" underlies substrate recognition and catalytic activation by the human 8-oxo-guanine DNA glycosylase / M. Bjoras, E. Seeberg, L.Luna, L.H. Pearl, T.E. Barrett // J Mol Biol.- 2002. - V. 317, № 2. - P. 171-177. Blazkova, J. CpG methylation controls reactivation of HIV from latency / J. Blazkova, K. Trejbalova, F. Gondois-Rey, P. Halfon, P. Philibert, A. Guiguen, E. Verdin, D. Olive, C. Van Lint, J. HejnarI. Hirsch // PLoS Pathog.- 2009. - V. 5, № 8. - P. e1000554. Boeger, H. Structural basis of eukaryotic gene transcription / H.Boeger, D.A. Bushnell, R. Davis, J. Griesenbeck, Y. Lorch, J.S. Strattan, K.D. Westover, R.D. Kornberg // FEBS Lett.2005. - V. 579, № 4. - P. 899-903. Bohnsack, M.T. Exportin 5 is a RanGTP-dependent dsRNA-binding protein that mediates nuclear export of pre-miRNAs / M.T. Bohnsack, K. Czaplinski, D. Gorlich // RNA.- 2004. V. 10, № 2. - P. 185-191. Bommer, G.T. p53-mediated activation of miRNA34 candidate tumor-suppressor genes / G.T. Bommer, I. Gerin, Y. Feng, A.J. Kaczorowski, R. Kuick, R.E. Love, Y. Zhai, T J. Giordano, Z.S. Qin, B.B. Moore, O.A. MacDougald, K.R. ChoE, R. Fearon // Curr Biol.2007. - V. 17, № 15. - P. 1298-1307. Boyes, J.A. DNA methylation inhibits transcription indirectly via a methyl-CpG binding protein / J.A. Boyes // Cell.- 1991. - V. 64, № 6. - P. 1123-1134. Braconi, C. MicroRNA-dependent regulation of DNA methyltransferase-1 and tumor suppressor gene expression by interleukin-6 in human malignant cholangiocytes / C. Braconi, N. Huang, T. Patel // Hepatology.- 2010. - V. 51, № 3. - P. 881-890. Brand, M. UV-damaged DNA-binding protein in the TFTC complex links DNA damage recognition to nucleosome acetylation / M. Brand, J.G. Moggs, M. Oulad-Abdelghani, F. Lejeune, F.J. Dilworth, J. Stevenin, G. Almouzni, L. Tora // EMBO J.- 2001. - V. 20, № 12. - P. 3187-3196. Brenner, C. A methylation rendezvous: reader meets writers / C. Brenner, F. Fuks // Dev Cell.- 2007. - V. 12, № 6. - P. 843-844. Brooks, A.R. Transcriptional silencing is associated with extensive methylation of the CMV promoter following adenoviral gene delivery to muscle / A.R. Brooks, R.N. Harkins, P. Wang, H.S. Qian, P. LiuG, M. Rubanyi // J Gene Med.- 2004. - V. 6, № 4. - P. 395-404. Brueckner, B. Epigenetic reactivation of tumor suppressor genes by a novel small-molecule inhibitor of human DNA methyltransferases / B. Brueckner, R. Garcia Boy, P. Siedlecki, T. Musch, H.C. Kliem, P. Zielenkiewicz, S. Suhai, M. Wiessler, F. Lyko // Cancer Res.- 2005. - V. 65, № 14. - P. 6305-6311. Budde, L.E. A phase I study of pulse high-dose vorinostat (V) plus rituximab (R), ifosphamide, carboplatin, and etoposide (ICE) in patients with relapsed lymphoma / L.E. Budde, M.M. Zhang, A.R. Shustov, J.M. Pagel, T.A. Gooley, G.R. Oliveira, T.L. Chen, N.L. Knudsen, J.E. Roden, B.E. Kammerer, S.L. Frayo, T.A. Warr, T.E. Boyd, O.W. Press, A.K. Gopal // Br J Haematol.- 2013. - V. 161, № 2. - P. 183-191. Bushman, F. Genome-wide analysis of retroviral DNA integration / F. Bushman, M. Lewinski, A. Ciuffi, S. Barr, J. Leipzig, S. Hannenhalli, C. Hoffmann // Nat Rev Microbiol.2005. - V. 3, № 11. - P. 848-858. Calin, G.A. Genomics of chronic lymphocytic leukemia microRNAs as new players with clinical significance / G.A.Calin, C.M. Croce // Semin Oncol.- 2006. - V. 33, № 2. - P. 167173. 126 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64. Calin, G.A. Chromosomal rearrangements and microRNAs: a new cancer link with clinical implications / G.A. Calin, C.M. Croce // J Clin Invest.- 2007. - V. 117, № 8. - P. 2059-2066. Carreon, T. NAT2 slow acetylation and bladder cancer in workers exposed to benzidine / T. Carreon, A.M. Ruder, P.A. Schulte, R.B. Hayes, N. Rothman, M. Waters, D.J. Grant, R. Boissy, D.A. Bell, F.F. Kadlubar, G.P. Hemstreet, S. YinG, K. LeMasters // Int J Cancer.2006. - V. 118, № 1. - P. 161-168. Cedar, H.Y. Linking DNA methylation and histone modification: patterns and paradigms / H.Y. Cedar, Bergman // Nat Rev Genet.- 2009. - V. 10, № 5. - P. 295-304. Chang, T.C. Transactivation of miR-34a by p53 broadly influences gene expression and promotes apoptosis / T.C. Chang, E.A. Wentzel, O.A. Kent, K. Ramachandran, M. Mullendore, K.H. Lee, G. Feldmann, M. Yamakuchi, M. Ferlito, C.J. Lowenstein, D.E. Arking, M.A. Beer, A. Maitra, J. T. Mendell // Mol Cell.- 2007. - V. 26, № 5. - P. 745-752. Chen, A.Y. DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors / A.Y Chen, C. Yu, B. Gatto, L.F. Liu // Proc Natl Acad Sci U S A.- 1993. - V. 90, № 17. - P. 8131-8135. Chen, D. Cigarette smoke component acrolein modulates chromatin assembly by inhibiting histone acetylation / D. Chen, L. Fang, H. Li, M.S. Tang, C. Jin // J Biol Chem.- 2013. - V. 288, № 30. - P. 21678-21687. Chen, T. Establishment and maintenance of genomic methylation patterns in mouse embryonic stem cells by Dnmt3a and Dnmt3b / T. Chen, Y. Ueda, J.E. Dodge, Z. Wang, E. Li // Mol Cell Biol.- 2003. - V. 23, № 16. - P. 5594-5605. Chen, Z. Structural insights into histone demethylation by JMJD2 family members / Z. Chen, J. Zang, J. Whetstine, X. Hong, F. Davrazou, T.G. Kutateladze, M. Simpson, Q. Mao, C.H. Pan, S. Dai, J. Hagman, K. Hansen, Y. ShiG, Zhang // Cell.- 2006. - V. 125, № 4. - P. 691-702. Cherepanova, N.A. Inhibition of murine DNA methyltransferase Dnmt3a by DNA duplexes containing pyrimidine-2(1H)-one / N.A. Cherepanova, A.L. Zhuze, E.S. Gromova // Biochemistry (Mosc).- 2010. - V. 75, № 9. - P. 1115-1125. Choy, J.S. NuA4 subunit Yng2 function in intra-S-phase DNA damage response / J.S. Choy, S.J. Kron // Mol Cell Biol.- 2002. - V. 22, № 23. - P. 8215-8225. Christman, J.K. 5-Azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy / J.K. Christman // Oncogene.- 2002. - V. 21, № 35. - P. 5483-5495. Chung, J.G. Inhibition of N-acetyltransferase activity and DNA-2-aminofluorene adducts by glycyrrhizic acid in human colon tumour cells / J.G. Chung, H.L. Chang, W.C. Lin, H.H. Wang, C.C. Yeh, C.F. HungY, C. Li // Food Chem Toxicol.- 2000. - V. 38, № 2-3. - P. 163172. Cisneros, F.J.. Transplacental exposure to the DNA demethylating agent, 5-AZA-CdR, affects the sexual behavior of CD-1 male mice / F.J.Cisneros, S. Branch // Neurotoxicology.- 2004. - V. 25, № 3. - P. 411-417. Cuthbert, G.L. Histone deimination antagonizes arginine methylation / G.L. Cuthbert, S. Daujat, A.W. Snowden, H. Erdjument-Bromage, T. Hagiwara, M. Yamada, R. Schneider, P.D. Gregory, P. Tempst, A.J. Bannister, T. Kouzarides // Cell.- 2004. - V. 118, № 5. - P. 545-553. Cutts, S.M. Sequence specificity of adriamycin-DNA adducts in human tumor cells / S.M. Cutts, L.P. Swift, A. Rephaeli, A. Nudelman, D.R. Phillips // Mol Cancer Ther.- 2003. - V. 2, № 7. - P. 661-670. Dancey, J.E. Current perspectives on camptothecins in cancer treatment / J.E. Dancey, A. Eisenhauer // Br J Cancer.- 1996. - V. 74, № 3. - P. 327-338. 127 65. 66. 67. 68. 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81. Danielson, P.B. The cytochrome P450 superfamily: biochemistry, evolution and drug metabolism in humans / P.B. Danielson // Curr Drug Metab.- 2002. - V. 3, № 6. - P. 561597. Davies, N.P. The effect of chromatin structure on cisplatin damage in intact human cells / N. P. Davies, L. C. Hardman, V. Murray // Nucleic Acids Res.- 2000. - V. 28, № 15. - P. 29542958. de Ruijter, A.J. Histone deacetylases (HDACs): characterization of the classical HDAC family / A. J. de Ruijter, A.H. van Gennip, H.N. Caron, S. Kemp, A.B. van Kuilenburg // Biochem J.- 2003. - V. 370, № Pt 3. - P. 737-749. Denis, H. Regulation of mammalian DNA methyltransferases: a route to new mechanisms / H. Denis, M.N. Ndlovu, F.Fuks // EMBO Rep.- 2011. - V. 12, № 7. - P. 647-656. Denissenko, M.F. Cytosine methylation determines hot spots of DNA damage in the human P53 gene / M.F. Denissenko, J.X. Chen, M.S. TangG, P. Pfeifer // Proc Natl Acad Sci U S A.- 1997. - V. 94, № 8. - P. 3893-3898. Deplus, R. Dnmt3L is a transcriptional repressor that recruits histone deacetylase / R. Deplus, C. Brenner, W.A. Burgers, P. Putmans, T. Kouzarides, Y. de Launoit, F. Fuks // Nucleic Acids Res.- 2002. - V. 30, № 17. - P. 3831-3838. Dimitrijevic, B. Cancer epigenome: A review / B. Dimitrijevic // Arch Oncol - 2005. - V. 13(3-4):108-14, №. - P. Doecke, J. Polymorphisms in MGMT and DNA repair genes and the risk of esophageal adenocarcinoma / J. Doecke, Z.Z. Zhao, N. Pandeya, S. Sadeghi, M. Stark, A.C. Green, N. K. Hayward, P. M. Webb, D. C. Whiteman // Int J Cancer.- 2008. - V. 123, № 1. - P. 174180. Egbe-Nwiyi, T.N. The pathogenicity of diminazene aceturate-resistant Trypanosoma brucei in rats after treatment with the drug / T.N.Egbe-Nwiyi, I.O. Igbokwe, P.A. Onyeyili // J Comp Pathol.- 2003. - V. 128, № 2-3. - P. 188-191. Egger, G. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy / G. Egger, G. Liang, A. Aparicio, P.A. Jones // Nature.- 2004. - V. 429, № 6990. - P. 457-463. Ellis, J.. Retrovirus silencing and vector design: relevance to normal and cancer stem cells? / J. Ellis, S. Yao // Curr Gene Ther.- 2005. - V. 5, № 4. - P. 367-373. Esteller, M. Promoter hypermethylation and BRCA1 inactivation in sporadic breast and ovarian tumors / M. Esteller, J.M. Silva, G. Dominguez, F. Bonilla, X. Matias-Guiu, E. Lerma, E. Bussaglia, J. Prat, I.C. Harkes, E.A. Repasky, E. Gabrielson, M. Schutte, S.B. Baylin, J.G. Herman // J Natl Cancer Inst.- 2000. - V. 92, № 7. - P. 564-569. Esteller, M. CpG island hypermethylation and tumor suppressor genes: a booming present, a brighter future / M. Esteller // Oncogene.- 2002. - V. 21, № 35. - P. 5427-5440. Esteller, M. Relevance of DNA methylation in the management of cancer / M. Esteller // Lancet Oncol.- 2003. - V. 4, № 6. - P. 351-358. Fabbri, M. MicroRNA-29 family reverts aberrant methylation in lung cancer by targeting DNA methyltransferases 3A and 3B / M. Fabbri, R. Garzon, A. Cimmino, Z. Liu, N. Zanesi, E. Callegari, S. Liu, H. Alder, S. Costinean, C. Fernandez-Cymering, S. Volinia, G. Guler, C.D. Morrison, K.K. Chan, G. Marcucci, G.A. Calin, K. Huebner, C.M. Croce // Proc Natl Acad Sci U S A.- 2007. - V. 104, № 40. - P. 15805-15810. Fahmy, O.G. Mutagenicity of N-alpha-acetoxyethyl-N-ethylnitrosamine and N,Ndiethylnitrosamine in relation to the mechanisms of metabolic activation of dialkylnitrosamines / O.G. Fahmy, M.J. Fahmy // Cancer Res.- 1976. - V. 36, № 12. - P. 5404-5412. Fatemi, M.P. MBD family proteins: reading the epigenetic code / M.P. Fatemi, A. Wade // J Cell Sci.- 2006. - V. 119, № Pt 15. - P. 3033-3037. 128 82. 83. 84. 85. 86. 87. 88. 89. 90. 91. 92. 93. 94. 95. 96. 97. Feinberg, A.P. The epigenetic progenitor origin of human cancer / A.P. Feinberg, R. Ohlsson, S. Henikoff // Nat Rev Genet.- 2006. - V. 7, № 1. - P. 21-33. Feng, W.H. Valproic acid enhances the efficacy of chemotherapy in EBV-positive tumors by increasing lytic viral gene expression / W.H. Feng, S.C. Kenney // Cancer Res.- 2006. V. 66, № 17. - P. 8762-8769. Ferguson, L.R. Microbial mutagenic effects of the DNA minor groove binder pibenzimol (Hoechst 33258) and a series of mustard analogues / L.R. Ferguson, W.A. Denny // Mutat Res.- 1995. - V. 329, № 1. - P. 19-27. Field-Smith, A. Bortezomib (Velcadetrade mark) in the Treatment of Multiple Myeloma / A. Field-Smith, G.J. Morgan, F.E. Davies // Ther Clin Risk Manag.- 2006. - V. 2, № 3. - P. 271-279. Filipowicz, W. Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight? / W. Filipowicz, S.N. Bhattacharyya, N. Sonenberg // Nat Rev Genet.2008. - V. 9, № 2. - P. 102-114. Fire, A. Production of antisense RNA leads to effective and specific inhibition of gene expression in C. elegans muscle / A. Fire, D. Albertson, S.W. Harrison, D.G. Moerman // Development.- 1991. - V. 113, № 2. - P. 503-514. Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans / A. Fire, S. Xu, M.K. Montgomery, S.A. Kostas, S.E. Driver, C.C. Mello // Nature.1998. - V. 391, № 6669. - P. 806-811. Fousteri, M.L. Transcription-coupled nucleotide excision repair in mammalian cells: molecular mechanisms and biological effects / M.L. Fousteri, H. Mullenders // Cell Res.2008. - V. 18, № 1. - P. 73-84. Fraga, M. Epigenetics and aging: the targets and the marks / M. Fraga, F.M. Esteller // Trends Genet.- 2007. - V. 23, № 8. - P. 413-418. Francis, N.J. Chromatin compaction by a polycomb group protein complex / N.J. Francis, R.E. Kingston, C.L. Woodcock // Science.- 2004. - V. 306, № 5701. - P. 1574-1577. Fuks, F. Dnmt3a binds deacetylases and is recruited by a sequence-specific repressor to silence transcription / F. Fuks, W.A. Burgers, N. Godin, M. Kasai, T. Kouzarides // EMBO J.- 2001. - V. 20, № 10. - P. 2536-2544. Galea, A. The interaction of cisplatin and analogues with DNA in reconstituted chromatin / A. Galea, M.V. Murray // Biochim Biophys Acta.- 2002. - V. 1579, № 2-3. - P. 142-152. Gamage, N. Human sulfotransferases and their role in chemical metabolism / N. Gamage, A. Barnett, N. Hempel, R G. Duggleby, K.F. Windmill, J.L. Martin, M.E. McManus // Toxicol Sci.- 2006. - V. 90, № 1. - P. 5-22. Garzon, R. MicroRNA-29b induces global DNA hypomethylation and tumor suppressor gene reexpression in acute myeloid leukemia by targeting directly DNMT3A and 3B and indirectly DNMT1 / R. Garzon, S. Liu, M. Fabbri, Z. Liu, C.E. Heaphy, E. Callegari, S. Schwind, J. Pang, J. Yu, N. Muthusamy, V. Havelange, S. Volinia, W. Blum, L.J. Rush, D. Perrotti, M. Andreeff, C.D. Bloomfield, J.C. Byrd, K. Chan, L.C. Wu, C.M. Croce, G. Marcucci // Blood.- 2009. - V. 113, № 25. - P. 6411-6418. Gatei, M. ATM protein-dependent phosphorylation of Rad50 protein regulates DNA repair and cell cycle control / M. Gatei, B. Jakob, P. Chen, A.W. Kijas, O.J. Becherel, N. Gueven, G. Birrell, J.H. Lee, T.T. Paull, Y. Lerenthal, S. Fazry, G. Taucher-Scholz, R. Kalb, D. Schindler, R. Waltes, T. DorkM, F. Lavin // J Biol Chem.- 2011. - V. 286, № 36. - P. 31542-31556. Gialitakis, M. Coordinated changes of histone modifications and HDAC mobilization regulate the induction of MHC class II genes by Trichostatin A / M. Gialitakis, A. 129 98. 99. 100. 101. 102. 103. 104. 105. 106. 107. 108. 109. 110. 111. 112. 113. Kretsovali, C. Spilianakis, L. Kravariti, J. Mages, R. Hoffmann, A. K. Hatzopoulos, J. Papamatheakis // Nucleic Acids Res.- 2006. - V. 34, № 3. - P. 765-772. Gillis, B. Identification of human cell responses to benzene and benzene metabolites / B. Gillis, I.M. Gavin, Z. Arbieva, S.T. King, S. Jayaraman, B. S. Prabhakar // Genomics.2007. - V. 90, № 3. - P. 324-333. Glasspool, R.M. Epigenetics as a mechanism driving polygenic clinical drug resistance / R.M. Glasspool, J. M. TeodoridisR, Brown // Br J Cancer.- 2006. - V. 94, № 8. - P. 10871092. Glister, C. The anti-epileptic drug valproic acid (VPA) inhibits steroidogenesis in bovine theca and granulosa cells in vitro / C. Glister, L. Satchell, A.E. Michael, A.B. Bicknell, P.G. Knight // PLoS One.- 2012. - V. 7, № 11. - P. e49553. Grant, L. Rational selection of small molecules that increase transcription through the GAA repeats found in Friedreich's ataxia / L. Grant, J. Sun, H. Xu, S. H. Subramony, J. B. Chaires, M.D. Hebert // FEBS Lett.- 2006. - V. 580, № 22. - P. 5399-5405. Grant, M.A. Netropsin improves survival from endotoxaemia by disrupting HMGA1 binding to the NOS2 promoter / M.A. Grant, R.M. Baron, A.A. Macias, M.D. Layne, M.A. Perrella, A.C. Rigby // Biochem J.- 2009. - V. 418, № 1. - P. 103-112. Greger, J.G. The cellular protein daxx interacts with avian sarcoma virus integrase and viral DNA to repress viral transcription / J.G. Greger, R.A. Katz, A.M. Ishov, G.G. Maul, A.M. Skalka // J Virol.- 2005. - V. 79, № 8. - P. 4610-4618. Griffiths-Jones, S. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature / S. Griffiths-Jones, R.J. Grocock, S. van Dongen, A. Bateman, A J. Enright // Nucleic Acids Res.- 2006. - V. 34, № Database issue. - P. D140-144. Grompe, M.A.. Fanconi anemia and DNA repair / M.A. Grompe, D'Andrea // Hum Mol Genet.- 2001. - V. 10, № 20. - P. 2253-2259. Grunstein, M. Histone acetylation in chromatin structure and transcription / M. Grunstein, // Nature.- 1997. - V. 389, № 6649. - P. 349-352 Gu, W.R. Activation of p53 sequence-specific DNA binding by acetylation of the p53 Cterminal domain / W.R. Gu, G. Roeder // Cell.- 1997. - V. 90, № 4. - P. 595-606. Guengerich, F.P. Metabolic activation of carcinogens / F.P. Guengerich // Pharmacol Ther.1992. - V. 54, № 1. - P. 17-61. Guenther, M.G. A chromatin landmark and transcription initiation at most promoters in human cells / M.G. Guenther, S.S. Levine, L.A. Boyer, R. Jaenisch, R.A. Young // Cell.2007. - V. 130, № 1. - P. 77-88. Gulick, R. Treatment with indinavir, zidovudine, and lamivudine in adults with human immunodeficiency virus infection and prior antiretroviral therapy / R. Gulick, J.W. Mellors, D. Havlir, J.J. Eron, C. Gonzalez, D. McMahon, D.D. Richman, F.T. Valentine, L. Jonas, A. Meibohm, E.A. Emini, J.A. Chodakewitz // N Engl J Med.- 1997. - V. 337, № 11. - P. 734739. Guo, N.Z. MG132, a proteasome inhibitor, induces apoptosis in tumor cells / N.Z. Guo, Peng // Asia Pac J Clin Oncol.- 2013. - V. 9, № 1. - P. 6-11. Guza, R. Influence of C-5 substituted cytosine and related nucleoside analogs on the formation of benzo[a]pyrene diol epoxide-dG adducts at CG base pairs of DNA / R. Guza, D. Kotandeniya, K. Murphy, T. Dissanayake, C. Lin, G.M. Giambasu, R.R. Lad, F. Wojciechowski, S. Amin, S.J. Sturla, R.H. Hudson, D.M. York, R. Jankowiak, R. Jones, N.Y. Tretyakova // Nucleic Acids Res.- 2011. - V. 39, № 9. - P. 3988-4006. Hahnel, R. Hypermethylation of the myogenic gene Myf-3 in human breast carcinomas / R.Hahnel, J. Harvey, P. Kay // Anticancer Res.- 1996. - V. 16, № 4A. - P. 2111-2115. 130 114. 115. 116. 117. 118. 119. 120. 121. 122. 123. 124. 125. 126. 127. 128. 129. Hake, S.B. Linking the epigenetic 'language' of covalent histone modifications to cancer / S.B. Hake, A. Xiao, C.D. Allis // Br J Cancer.- 2007. - V. 96 Suppl, №. - P. R31-39. Hall, I.M. Establishment and maintenance of a heterochromatin domain / I.M. Hall, G.D. Shankaranarayana, K. Noma, N. Ayoub, A. Cohen, S.I. Grewal // Science.- 2002. - V. 297, № 5590. - P. 2232-2237. Hammond, S.M. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells / S.M Hammond, E. Bernstein, D. Beach, G.J. Hannon // Nature.- 2000. V. 404, № 6775. - P. 293-296. Hanawalt, P.C. Subpathways of nucleotide excision repair and their regulation / P.C. Hanawalt // Oncogene.- 2002. - V. 21, № 58. - P. 8949-8956. Hawkins, P.G. Promoter targeted small RNAs induce long-term transcriptional gene silencing in human cells / P.G. Hawkins, S. Santoso, C. Adams, V. Anest, K.V. Morris // Nucleic Acids Res.- 2009. - V. 37, № 9. - P. 2984-2995. Hayes, J.J. Histone contributions to the structure of DNA in the nucleosome / J.J. Hayes, D.J. Clark, A.P. Wolffe // Proc Natl Acad Sci U S A.- 1991. - V. 88, № 15. - P. 6829-6833. Hein, D.W. Molecular genetics and epidemiology of the NAT1 and NAT2 acetylation polymorphisms / D.W. ein, M.A. Doll, A.J. Fretland, M.A. Leff, S.J. Webb, G.H. Xiao, U.S. Devanaboyina, N.A. Nangju, Y. Feng // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.- 2000. - V. 9, № 1. - P. 29-42. Hejnar, J. CpG island protects Rous sarcoma virus-derived vectors integrated into nonpermissive cells from DNA methylation and transcriptional suppression / J. Hejnar, P. Hajkova, J. Plachy, D. Elleder, V. Stepanets, J. Svoboda // Proc Natl Acad Sci U S A.- 2001. - V. 98, № 2. - P. 565-569. Hendrich, B. Identification and characterization of a family of mammalian methyl-CpG binding proteins / B. Hendrich, A. Bird // Mol Cell Biol.- 1998. - V. 18, № 11. - P. 65386547. Herman, J.G. Inactivation of the CDKN2/p16/MTS1 gene is frequently associated with aberrant DNA methylation in all common human cancers / J.G. Herman, A. Merlo, L. Mao, R.G. Lapidus, J.P. Issa, N.E. Davidson, D. Sidransky, S.B. Baylin // Cancer Res.- 1995. - V. 55, № 20. - P. 4525-4530. Herman, J.G. Hypermethylation-associated inactivation indicates a tumor suppressor role for p15INK4B / J.G. Herman, J. Jen, A. Merlo, S.B. Baylin // Cancer Res.- 1996. - V. 56, № 4. - P. 722-727. Herman, J.G. Incidence and functional consequences of hMLH1 promoter hypermethylation in colorectal carcinoma / J.G. Herman, A. Umar, K. Polyak, J.R. Graff, N. Ahuja, J.P. Issa, S. Markowitz, J.K. Willson, S.R. Hamilton, K.W. Kinzler, M.F. Kane, R.D. Kolodner, B. Vogelstein, T.A. Kunkel, S.B. Baylin // Proc Natl Acad Sci U S A.- 1998. - V. 95, № 12. P. 6870-6875. Herman, J.G. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation / J.G. Herman, S.B. Baylin // N Engl J Med.- 2003. - V. 349, № 21. - P. 2042-2054. Hezroni, H., Pluripotency-related, valproic acid (VPA)-induced genome-wide histone H3 lysine 9 (H3K9) acetylation patterns in embryonic stem cells / H. Hezroni, B.S. Sailaja, E. Meshorer // J Biol Chem.- 2011. - V. 286, № 41. - P. 35977-35988. Hishida, A. GSTT1 and GSTM1 deletions, NQO1 C609T polymorphism and risk of chronic myelogenous leukemia in Japanese / A. Hishida, S. Terakura, N. Emi, K. Yamamoto, M. Murata, K. Nishio, Y. Sekido, T. Niwa, N. Hamajima, T. Naoe // Asian Pac J Cancer Prev.2005. - V. 6, № 3. - P. 251-255. Hodges, E. High definition profiling of mammalian DNA methylation by array capture and single molecule bisulfite sequencing / E. Hodges, A.D. Smith, J. Kendall, Z. Xuan, K. Ravi, 131 130. 131. 132. 133. 134. 135. 136. 137. 138. 139. 140. 141. 142. 143. 144. 145. M. Rooks, M.Q. Zhang, K. Ye, A. Bhattacharjee, L. Brizuela, W.R. McCombie, M. Wigler, G.J. Hannon, J.B. Hicks // Genome Res.- 2009. - V. 19, № 9. - P. 1593-1605. Hsieh, C.L. Stability of patch methylation and its impact in regions of transcriptional initiation and elongation / C.L. Hsieh // Mol Cell Biol.- 1997. - V. 17, № 10. - P. 58975904. Hu, W. Preferential carcinogen-DNA adduct formation at codons 12 and 14 in the human Kras gene and their possible mechanisms / W. Hu, Z. Feng, M.S. Tang // Biochemistry.- 2003. - V. 42, № 33. - P. 10012-10023. Huang, J. p53 is regulated by the lysine demethylase LSD1 / J. Huang, R. Sengupta, A.B. Espejo, M.G. Lee, J.A. Dorsey, M. Richter, S. Opravil, R. Shiekhattar, M.T. Bedford, T. Jenuwein, S.L. Berger // Nature.- 2007. - V. 449, № 7158. - P. 105-108. Huang, J. Amino acid substitution polymorphisms of the DNA repair gene MGMT and the susceptibility to cervical carcinoma / J. Huang, F. Ye, H. Chen, W. Lu, X. Xie // Carcinogenesis.- 2007. - V. 28, № 6. - P. 1314-1322. Huang, J. Down-regulated microRNA-152 induces aberrant DNA methylation in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma by targeting DNA methyltransferase 1 / J. Huang, Y. Wang, Y. Guo, S. Sun // Hepatology.- 2010. - V. 52, № 1. - P. 60-70. Hutvagner, G. A cellular function for the RNA-interference enzyme Dicer in the maturation of the let-7 small temporal RNA / G. Hutvagner, J. McLachlan, A.E. Pasquinelli, E. Balint, T. Tuschl, P.D. Zamore // Science.- 2001. - V. 293, № 5531. - P. 834-838. Ikura, T. Involvement of the TIP60 histone acetylase complex in DNA repair and apoptosis / T. Ikura, V.V. Ogryzko, M. Grigoriev, R. Groisman, J. Wang, M. Horikoshi, R. Scully, J. Qin, Y. Nakatani // Cell.- 2000. - V. 102, № 4. - P. 463-473. Ingelman-Sundberg, M. The human genome project and novel aspects of cytochrome P450 research / M. Ingelman-Sundberg // Toxicol Appl Pharmacol.- 2005. - V. 207, № 2 Suppl. P. 52-56. Ingelman-Sundberg, M. Influence of cytochrome P450 polymorphisms on drug therapies: pharmacogenetic, pharmacoepigenetic and clinical aspects / M. Ingelman-Sundberg, S. C. Sim, A. Gomez, C. Rodriguez-Antona // Pharmacol Ther.- 2007. - V. 116, № 3. - P. 496526. Issa, J.P. Methylation of the oestrogen receptor CpG island links ageing and neoplasia in human colon / J.P. Issa, Y. L. Ottaviano, P. Celano, S.R. Hamilton, N.E. Davidson, S.B. Baylin // Nat Genet.- 1994. - V. 7, № 4. - P. 536-540. Iyer, R.R. DNA mismatch repair: functions and mechanisms / R.R. Iyer, A. Pluciennik, V. Burdett, P.L. Modrich // Chem Rev.- 2006. - V. 106, № 2. - P. 302-323. Jacinto, F.V. Mutator pathways unleashed by epigenetic silencing in human cancer / F.V. Jacinto, M. Esteller // Mutagenesis.- 2007. - V. 22, № 4. - P. 247-253. Jackson, J.P. Control of CpNpG DNA methylation by the KRYPTONITE histone H3 methyltransferase / J.P. Jackson, A.M. Lindroth, X. CaoS, E. Jacobsen // Nature.- 2002. - V. 416, № 6880. - P. 556-560. Jaenisch, R. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals / R. Jaenisch, A. Bird // Nat Genet.- 2003. - V. 33 Suppl, №. - P. 245-254. Jair, K.W. De novo CpG island methylation in human cancer cells / K.W. Jair, K.E. Bachman, H. Suzuki, A. H. Ting, I. Rhee, R.W. Yen, S.B. Baylin, K.E. Schuebel // Cancer Res.- 2006. - V. 66, № 2. - P. 682-692. Jakoby, W.B. In Enzymatic Basis of Detoxification Vol. 2, pp. 199–228. / W.B. Jakoby, Sekura, R.D., Lyon, E.S., Marcus, C.J., and Wang, J.-L. // 1980. - №. - P. 132 146. 147. 148. 149. 150. 151. 152. 153. 154. 155. 156. 157. 158. 159. 160. 161. Janowski, B. A. Involvement of AGO1 and AGO2 in mammalian transcriptional silencing / B. A. Janowski, K. E. Huffman, J. C. Schwartz, R. Ram, R. Nordsell, D. S. Shames, J. D. Minna, D. R. Corey // Nat Struct Mol Biol.- 2006. - V. 13, № 9. - P. 787-792. Jansen-Durr, P. Viral oncogenesis and cell cycle control / P. Jansen-Durr // Virus Res.1996. - V. 42, № 1-2. - P. 187-191. Jarvius, M. Piperlongumine induces inhibition of the ubiquitin-proteasome system in cancer cells / M. Jarvius, M. Fryknas, P. D'Arcy, C. Sun, L. Rickardson, J. Gullbo, C. Haglund, P. Nygren, S. Linde, R. Larsson // Biochem Biophys Res Commun.- 2013. - V. 431, № 2. - P. 117-123. Jeffery, L. Components of the DNA methylation system of chromatin control are RNAbinding proteins / L. Jeffery, S. Nakielny // J Biol Chem.- 2004. - V. 279, № 47. - P. 4947949487. Jeltsch, A. Two substrates are better than one: dual specificities for Dnmt2 methyltransferases / A. Jeltsch, W. Nellen, F. Lyko // Trends Biochem Sci.- 2006. - V. 31, № 6. - P. 306-308. Jenuwein, T.C. Translating the histone code / T.C. Jenuwein, D. Allis // Science.- 2001. - V. 293, № 5532. - P. 1074-1080. Johnson, W.S. Selective recognition of the m5CpG dinucleotide sequence in DNA by mitomycin C for alkylation and cross-linking / W.S. Johnson, Q.Y. He, M. Tomasz // Bioorg Med Chem.- 1995. - V. 3, № 6. - P. 851-860. Jones, P.A. The fundamental role of epigenetic events in cancer / P.A. Jones, S.B. Baylin // Nat Rev Genet.- 2002. - V. 3, № 6. - P. 415-428. Jones, P.A. Rethinking how DNA methylation patterns are maintained / P.A. Jones, G. Liang // Nat Rev Genet.- 2009. - V. 10, № 11. - P. 805-811. Jones, P.L. Methylated DNA and MeCP2 recruit histone deacetylase to repress transcription / P.L. Jones, G.J. Veenstra, P.A. Wade, D. Vermaak, S U. Kass, N. Landsberger, J. Strouboulis, A.P. Wolffe // Nat Genet.- 1998. - V. 19, № 2. - P. 187-191. Ju, B.G. A topoisomerase IIbeta-mediated dsDNA break required for regulated transcription / B.G. Ju, V.V. Lunyak, V. Perissi, I. Garcia-Bassets, D.W. Rose, C.K. Glass, M.G. Rosenfeld // Science.- 2006. - V. 312, № 5781. - P. 1798-1802. Kalscheuer, S. Differential expression of microRNAs in early-stage neoplastic transformation in the lungs of F344 rats chronically treated with the tobacco carcinogen 4(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone / S. Kalscheuer, X. Zhang, Y. Zeng, P. Upadhyaya // Carcinogenesis.- 2008. - V. 29, № 12. - P. 2394-2399. Kaminskas, E. FDA drug approval summary: azacitidine (5-azacytidine, Vidaza) for injectable suspension / E. Kaminskas, A.T. Farrell, Y.C. Wang, R. Sridhara, R. Pazdur // Oncologist.- 2005. - V. 10, № 3. - P. 176-182. Karahalil, B. Impact of DNA polymorphisms in key DNA base excision repair proteins on cancer risk / B. Karahalil, V.A. Bohr, D.M. Wilson, 3rd // Hum Exp Toxicol.- 2012. - V. 31, № 10. - P. 981-1005. Karpf, A.R. Inhibition of DNA methyltransferase stimulates the expression of signal transducer and activator of transcription 1, 2, and 3 genes in colon tumor cells / A.R. Karpf, P.W. Peterson, J.T. Rawlins, B.K. Dalley, Q. Yang, H. Albertsen, D.A. Jones // Proc Natl Acad Sci U S A.- 1999. - V. 96, № 24. - P. 14007-14012. Katz, R.A. High-frequency epigenetic repression and silencing of retroviruses can be antagonized by histone deacetylase inhibitors and transcriptional activators, but uniform reactivation in cell clones is restricted by additional mechanisms / R.A. Katz, E. Jack-Scott, A. Narezkina, I. Palagin, P. Boimel, J. Kulkosky, E. Nicolas, J.G. Greger, A.M. Skalka // J. Virol.- 2007. - V. 81, № 6. - P. 2592-2604. 133 162. 163. 164. 165. 166. 167. 168. 169. 170. 171. 172. 173. 174. 175. 176. 177. 178. Katz, R.A. High-frequency epigenetic repression and silencing of retroviruses can be antagonized by histone deacetylase inhibitors and transcriptional activators, but uniform reactivation in cell clones is restricted by additional mechanisms / R.A. Katz, E. Jack-Scott, A. Narezkina, I. Palagin, P. Boimel, J. Kulkosky, E. Nicolas, J.G. Greger, A.M. Skalka // J Virol.- 2007. - V. 81, № 6. - P. 2592-2604. Khan, G.S. Chemistry of DNA minor groove binding agents / G.S. Khan, A. Shah, R. Zia ur D. Barker // J Photochem Photobiol B.- 2012. - V. 115, №. - P. 105-118. Khan, Q.A. Topoisomerase I-mediated DNA cleavage induced by the minor groove-directed binding of bibenzimidazoles to a distal site / Q.A. Khan, D.S. Pilch // J Mol Biol.- 2007. - V. 365, № 3. - P. 561-569. Kim, D.H. Argonaute-1 directs siRNA-mediated transcriptional gene silencing in human cells / D.H. Kim, L.M. Villeneuve, K.V. Morris, J.J. Rossi // Nat Struct Mol Biol.- 2006. V. 13, № 9. - P. 793-797. Kisseljova, N.P. DNA demethylation and carcinogenesis / N.P. Kisseljova, F.L. Kisseljov // Biochemistry (Mosc).- 2005. - V. 70, № 7. - P. 743-752. Klingenberg, M. Pigments of rat liver microsomes / M. Klingenberg // Arch Biochem Biophys.- 1958. - V. 75, № 2. - P. 376-386. Klose, R.J. Genomic DNA methylation: the mark and its mediators / R.J. Klose, A.P. Bird // Trends Biochem Sci.- 2006. - V. 31, № 2. - P. 89-97. Komashko, V.M.. 5-azacytidine treatment reorganizes genomic histone modification patterns / V.M. Komashko, P.J. Farnham // Epigenetics.- 2010. - V. 5, № 3. - P. Kondo, N. DNA damage induced by alkylating agents and repair pathways / N. Kondo, A. Takahashi, K. OnoT. Ohnishi // J Nucleic Acids.- 2010. - V. 2010, №. - P. 543531. Kornberg, A. DNA replication / A. Kornberg // J Biol Chem.- 1988. - V. 263, № 1. - P. 1-4. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function / T. Kouzarides // Cell.- 2007. V. 128, № 4. - P. 693-705. Krawczyk, J. 5-Azacytidine for the treatment of myelodysplastic syndromes / J. Krawczyk, N. Keane, C.L. Freeman, R. Swords, M. O'Dwyer, F.J. Giles // Expert Opin Pharmacother.2013. - V. 14, № 9. - P. 1255-1268. Kriaucionis, S.N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain / S.N. Kriaucionis, Heintz // Science.- 2009. - V. 324, № 5929. - P. 929-930. Kubicek, S. Reversal of H3K9me2 by a small-molecule inhibitor for the G9a histone methyltransferase / S. Kubicek, R.J. O'Sullivan, E.M. August, E.R. Hickey, Q. Zhang, M.L. Teodoro, S. Rea, K. Mechtler, J.A. Kowalski, C.A. Homon, T.A. Kelly, T. Jenuwein // Mol Cell.- 2007. - V. 25, № 3. - P. 473-481. Kundakovic, M. Sex-specific epigenetic disruption and behavioral changes following lowdose in utero bisphenol A exposure / M. Kundakovic, K. Gudsnuk, B. Franks, J. Madrid, R. L. Miller, F.P. Perera, F.A. Champagne // Proc Natl Acad Sci U S A.- 2013. - V. 110, № 24. - P. 9956-9961. Kuramochi-Miyagawa, S. DNA methylation of retrotransposon genes is regulated by Piwi family members MILI and MIWI2 in murine fetal testes / S. Kuramochi-Miyagawa, T. Watanabe, K. Gotoh, Y. Totoki, A. Toyoda, M. Ikawa, N. Asada, K. Kojima, Y. Yamaguchi, T.W. Ijiri, K. Hata, E. Li, Y. Matsuda, T. Kimura, M. Okabe, Y. Sakaki, H. Sasaki, T. Nakano // Genes Dev.- 2008. - V. 22, № 7. - P. 908-917. Larrea, A.A. SnapShot: DNA mismatch repair / A.A. Larrea, S.A. Lujan, T.A. Kunkel // Cell.- 2010. - V. 141, № 4. - P. 730 e731. 134 179. 180. 181. 182. 183. 184. 185. 186. 187. 188. 189. 190. 191. 192. 193. 194. Lecumberri, E. Green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate (EGCG) as adjuvant in cancer therapy / E. Lecumberri, Y.M. Dupertuis, R. Miralbell, C. Pichard // Clin Nutr.2013. - №. - P. Lee, K.K.. Histone acetyltransferase complexes: one size doesn't fit all / K.K. Lee, J.L. Workman // Nat Rev Mol Cell Biol.- 2007. - V. 8, № 4. - P. 284-295. Lee, Y. MicroRNA maturation: stepwise processing and subcellular localization / Y. Lee, K. Jeon, J. T. Lee, S. Kim, V.N. Kim // EMBO J.- 2002. - V. 21, № 17. - P. 4663-4670. Lee, Y. The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing / Y.Lee, C. Ahn, J. Han, H. Choi, J. Kim, J. Yim, J. Lee, P. Provost, O. Radmark, S. Kim, V.N. Kim // Nature.2003. - V. 425, № 6956. - P. 415-419. Lee, Y.S. Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways / Y.S. Lee, K. Nakahara, J.W. Pham, K. Kim, Z. He, E.J. Sontheimer, R.W. Carthew // Cell.- 2004. - V. 117, № 1. - P. 69-81. Lehnertz, B. Suv39h-mediated histone H3 lysine 9 methylation directs DNA methylation to major satellite repeats at pericentric heterochromatin / B. Lehnertz, Y. Ueda, A.A. Derijck, U. Braunschweig, L. Perez-Burgos, S. Kubicek, T. Chen, E. Li, T. Jenuwein, A.H. Peters // Curr Biol.- 2003. - V. 13, № 14. - P. 1192-1200. Lempiainen, H. Phenobarbital mediates an epigenetic switch at the constitutive androstane receptor (CAR) target gene Cyp2b10 in the liver of B6C3F1 mice / H. Lempiainen, A. Muller, S. Brasa, S.S. Teo, T.C. Roloff, L. Morawiec, N. Zamurovic, A. Vicart, E. Funhoff, P. Couttet, D. Schubeler, O. Grenet, J. Marlowe, J. Moggs, R. Terranova // PLoS One.2011. - V. 6, № 3. - P. e18216. Leonhardt, H.A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei / H.A. Leonhardt, A.W. Page, H.U. Weier, T.H. Bestor // Cell.- 1992. - V. 71, № 5. - P. 865-873. Lewandowska, J.A. DNA methylation in cancer development, diagnosis and therapy-multiple opportunities for genotoxic agents to act as methylome disruptors or remediators / J.A. Lewandowska, Bartoszek // Mutagenesis.- 2011. - V. 26, № 4. - P. 475-487. Li, X.W. Homologous recombination in DNA repair and DNA damage tolerance / X.W. Li, D. Heyer // Cell Res.- 2008. - V. 18, № 1. - P. 99-113. Liang, G. Cooperativity between DNA methyltransferases in the maintenance methylation of repetitive elements / G. Liang, M.F. Chan, Y. Tomigahara, Y.C. Tsai, F.A. Gonzales, E. Li, P.W. Laird, P.A. Jones // Mol Cell Biol.- 2002. - V. 22, № 2. - P. 480-491. Liang, G. Analysis of gene induction in human fibroblasts and bladder cancer cells exposed to the methylation inhibitor 5-aza-2'-deoxycytidine / G. Liang, F.A. Gonzales, P.A. Jones, T. F. Orntoft, T. Thykjaer // Cancer Res.- 2002. - V. 62, № 4. - P. 961-966. Lin, H. J. Slow acetylator mutations in the human polymorphic N-acetyltransferase gene in 786 Asians, blacks, Hispanics, and whites: application to metabolic epidemiology / H.J.Lin, C.Y. Han, B.K. Lin, S. Hardy // Am J Hum Genet.- 1993. - V. 52, № 4. - P. 827-834. Liu, W.B. Dynamic changes in DNA methylation during multistep rat lung carcinogenesis induced by 3-methylcholanthrene and diethylnitrosamine / W.B. Liu, J.Y. Liu, L. Ao, Z. Y. Zhou, Y.H. Zhou, Z.H. Cui, H. Yang, J. Cao // Toxicol Lett.- 2009. - V. 189, № 1. - P. 5-13. Loewe, H.J. [Basic-substituted 2,6-bisbenzimidazole derivates, a novel class of substances with chemotherapeutic activity] / H.J. Loewe, Urbanietz // Arzneimittelforschung.- 1974. V. 24, № 12. - P. 1927-1933. Loizou, J.I. Epigenetic information in chromatin: the code of entry for DNA repair / J.I. Loizou, R. Murr, M.G. Finkbeiner, C. Sawan, Z.Q. Wang, Z. Herceg // Cell Cycle.- 2006. V. 5, № 7. - P. 696-701. 135 195. 196. 197. 198. 199. 200. 201. 202. 203. 204. 205. 206. 207. 208. 209. 210. 211. Long, J.R. Genetic polymorphisms in estrogen-metabolizing genes and breast cancer survival / J.R. Long, Q. Cai, X.O. Shu, H. Cai, Y.T. Gao, W. Zheng // Pharmacogenet Genomics.- 2007. - V. 17, № 5. - P. 331-338. Lopez de Silanes, I. The RNA-binding protein HuR regulates DNA methylation through stabilization of DNMT3b mRNA / I. Lopez de Silanes, M. Gorospe, H. Taniguchi, K. Abdelmohsen, S. Srikantan, M. Alaminos, M. Berdasco, R.G. Urdinguio, M.F. Fraga, F.V. Jacinto, M. Esteller // Nucleic Acids Res.- 2009. - V. 37, № 8. - P. 2658-2671. Lorincz, M.C.,D. SchubelerM. Groudine. Methylation-mediated proviral silencing is associated with MeCP2 recruitment and localized histone H3 deacetylation / Lorincz, M.C., D. Schubeler, M. Groudine // Mol Cell Biol.- 2001. - V. 21, № 23. - P. 7913-7922. Lorincz, M.C. Intragenic DNA methylation alters chromatin structure and elongation efficiency in mammalian cells / M.C. Lorincz, D.R. Dickerson, M. Schmitt, M. Groudine // Nat Struct Mol Biol.- 2004. - V. 11, № 11. - P. 1068-1075. Luger, K. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution / K. Luger, A.W. Mader, R.K. Richmond, D.F. Sargent, T.J. Richmond // Nature.- 1997. - V. 389, № 6648. - P. 251-260. Lund, E. Nuclear export of microRNA precursors / E. Lund, S. Guttinger, A. Calado, J.E. Dahlberg, U. Kutay // Science.- 2004. - V. 303, № 5654. - P. 95-98. Luo, J. Deacetylation of p53 modulates its effect on cell growth and apoptosis / J. Luo, F. Su, D. Chen, A. Shiloh, W. Gu // Nature.- 2000. - V. 408, № 6810. - P. 377-381. Darii M.V. Dimeric bisbenzimidazoles: Cytotoxicity and effects on DNA methylation in normal and cancer human cells / M.V. Darii, A.R. Rakhimova,V.N. Tashlitsky, S.V. Kostyuk, N.N. Veiko, A.A. Ivanov, A.L. Zhuze, E.S. Gromova // Molecular Biology.- 2013. - №. - P. Majumder, S. Epigenetic regulation of metallothionein-i gene expression: differential regulation of methylated and unmethylated promoters by DNA methyltransferases and methyl CpG binding proteins / S. Majumder, H. Kutay, J. Datta, D. Summers, S.T. Jacob, K. Ghoshal // J Cell Biochem.- 2006. - V. 97, № 6. - P. 1300-1316. Marks, P. Histone deacetylases and cancer: causes and therapies / P. Marks, R.A. Rifkind, V.M. Richon, R. Breslow, T. Miller, W.K. Kelly // Nat Rev Cancer.- 2001. - V. 1, № 3. - P. 194-202. Martinez-Zamudio, R.H. Environmental epigenetics in metal exposure / R.H. MartinezZamudio, C. Ha // Epigenetics.- 2011. - V. 6, № 7. - P. 820-827. Martinez, J. Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi / J. Martinez, A. Patkaniowska, H. Urlaub, R. Luhrmann, T. Tuschl // Cell.- 2002. - V. 110, № 5. - P. 563-574. Martinez, J.T. Tuschl. RISC is a 5' phosphomonoester-producing RNA endonuclease / Martinez, J.T. Tuschl // Genes Dev.- 2004. - V. 18, № 9. - P. 975-980. Mathews, V. Treatment of acute promyelocytic leukemia with single-agent arsenic trioxide / V. Mathews, E. Chendamarai, B. George, A. Viswabandya, A. Srivastava // Mediterr J Hematol Infect Dis.- 2011. - V. 3, № 1. - P. e2011056. Matter, B. Formation of diastereomeric benzo[a]pyrene diol epoxide-guanine adducts in p53 gene-derived DNA sequences / B. Matter, G. Wang, R. Jones, N. Tretyakova // Chem Res Toxicol.- 2004. - V. 17, № 6. - P. 731-741. McCoy, G.D. Non-mutagenic carcinogens are primarily hydrophobic / G.D. McCoy, H.S. Rosenkranz, G. Klopman // Carcinogenesis.- 1990. - V. 11, № 7. - P. 1111-1117. McCulloch, S.D. Bi-directional processing of DNA loops by mismatch repair-dependent and -independent pathways in human cells / S.D. McCulloch, L. GuG, M. Li // J Biol Chem.2003. - V. 278, № 6. - P. 3891-3896. 136 212. 213. 214. 215. 216. 217. 218. 219. 220. 221. 222. 223. 224. 225. 226. 227. 228. Meissner, A. Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells / A. Meissner, T.S. Mikkelsen, H. Gu, M. Wernig, J. Hanna, A. Sivachenko, X. Zhang, B.E. Bernstein, C. Nusbaum, D.B. Jaffe, A. Gnirke, R. Jaenisch, E.S. Lander // Nature.- 2008. V. 454, № 7205. - P. 766-770. Meister, G. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA / G. Meister, T. Tuschl // Nature.- 2004. - V. 431, № 7006. - P. 343-349. Meng, C.F. [Effects of 5-Aza-2'-deoxycytidine and trichostatin A on DNA methylation and expression of hMLH1 in ovarian cancer cell line COC1/DDP] / C.F. Meng, D.Q. Dai, K.J. Guo // Ai Zheng.- 2008. - V. 27, № 12. - P. 1251-1255. Metzger, E. The expanding world of histone lysine demethylases / E. Metzger, R. Schule // Nat Struct Mol Biol.- 2007. - V. 14, № 4. - P. 252-254. Miranda, T.B. DZNep is a global histone methylation inhibitor that reactivates developmental genes not silenced by DNA methylation / T.B. Miranda, C.C. Cortez, C.B. Yoo, G. Liang, M. Abe, T.K. Kelly, V.E. Marquez, P.A. Jones // Mol Cancer Ther.- 2009. V. 8, № 6. - P. 1579-1588. Mitchell, R.S. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences / R.S. Mitchell, B.F. Beitzel, A.R. Schroder, P. Shinn, H. Chen, C.C. Berry, J.R. Ecker, F.D. Bushman // PLoS Biol.- 2004. - V. 2, № 8. - P. E234. Mizutani, T. Maintenance of integrated proviral gene expression requires Brm, a catalytic subunit of SWI/SNF complex / T. Mizutani, T. Ito, M. Nishina, N. Yamamichi, A. Watanabe, H. Iba // J Biol Chem.- 2002. - V. 277, № 18. - P. 15859-15864. Morisseau, C.B. Epoxide hydrolases: mechanisms, inhibitor designs, and biological roles / C.B. Morisseau, D. Hammock // Annu Rev Pharmacol Toxicol.- 2005. - V. 45, №. - P. 311333. Morris, K.V. siRNA-mediated transcriptional gene silencing: the potential mechanism and a possible role in the histone code / K.V. Morris // Cell Mol Life Sci.- 2005. - V. 62, № 24. P. 3057-3066. Mosammaparast, N. Reversal of histone methylation: biochemical and molecular mechanisms of histone demethylases / N. Mosammaparast, Y. Shi // Annu Rev Biochem.2010. - V. 79, №. - P. 155-179. Mueller, G.C. The metabolism of 4-dimethylaminoazobenzene by rat liver homogenates / G.C. Mueller, J. A. Miller // J Biol Chem.- 1948. - V. 176, № 2. - P. 535-544. Mueller, G.C. The metabolism of 4-dimethylaminoazobenzene and related carcinogenic aminoazo dyes by rat liver homogenates / G.C. Mueller, J.A. Miller // Acta Unio Int Contra Cancrum.- 1950. - V. 7, № 1. - P. 134-136. Murr, R. Orchestration of chromatin-based processes: mind the TRRAP / R. Murr, T. Vaissiere, C. Sawan, V. Shukla, Z. Herceg // Oncogene.- 2007. - V. 26, № 37. - P. 53585372. Myles, G.. DNA repair / G. Myles, M.A. Sancar // Chem Res Toxicol.- 1989. - V. 2, № 4. P. 197-226. Nakajima, M. MicroRNAs from biology to future pharmacotherapy: regulation of cytochrome P450s and nuclear receptors / M. Nakajima, T. Yokoi // Pharmacol Ther.- 2011. - V. 131, № 3. - P. 330-337. Nan, X. Transcriptional repression by the methyl-CpG-binding protein MeCP2 involves a histone deacetylase complex / X. Nan, H.H. Ng, C.A. Johnson, C.D. Laherty, B.M. Turner, R.N. Eisenman, A. Bird // Nature.- 1998. - V. 393, № 6683. - P. 386-389. Narezkina, A. Genome-wide analyses of avian sarcoma virus integration sites / A. Narezkina, K.D. Taganov, S. Litwin, R. Stoyanova, J. Hayashi, C. Seeger, A.M. Skalka, R.A. Katz // J Virol.- 2004. - V. 78, № 21. - P. 11656-11663. 137 229. 230. 231. 232. 233. 234. 235. 236. 237. 238. 239. 240. 241. 242. 243. Nathan, D. Histone sumoylation is a negative regulator in Saccharomyces cerevisiae and shows dynamic interplay with positive-acting histone modifications / D. Nathan, K. Ingvarsdottir, D.E. Sterner, G.R. Bylebyl, M. Dokmanovic, J.A. Dorsey, K.A. Whelan, M. Krsmanovic, W.S. Lane, P.B. Meluh, E.S. Johnson, S.L. Berger // Genes Dev.- 2006. - V. 20, № 8. - P. 966-976. Nowak, S.J. Phosphorylation of histone H3 correlates with transcriptionally active loci / S.J. Nowak, V. G. Corces // Genes Dev.- 2000. - V. 14, № 23. - P. 3003-3013. O'Donovan, G. Purine insertase: a new enzyme / G. O'Donovan // Nature.- 1979. - V. 278, № 5700. - P. 121. O'Toole, A.S. Comprehensive thermodynamic analysis of 3' double-nucleotide overhangs neighboring Watson-Crick terminal base pairs / A.S. O'Toole, S. Miller, N. Haines, M.C. Zink, M.J. Serra // Nucleic Acids Res.- 2006. - V. 34, № 11. - P. 3338-3344. Ogi, T. Three DNA polymerases, recruited by different mechanisms, carry out NER repair synthesis in human cells / T. Ogi, S. Limsirichaikul, R.M. Overmeer, M. Volker, K. Takenaka, R. Cloney, Y. Nakazawa, A. Niimi, Y. Miki, N.G. Jaspers, L.H. Mullenders, S. Yamashita, M.I. Fousteri, A.R. Lehmann // Mol Cell.- 2010. - V. 37, № 5. - P. 714-727. Okano, M. Cloning and characterization of a family of novel mammalian DNA (cytosine-5) methyltransferases / M. Okano, S. XieE. Li // Nat Genet.- 1998. - V. 19, № 3. - P. 219-220. Okano, M. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development / M. Okano, D.W. Bell, D.A. Haber, E. Li // Cell.- 1999. - V. 99, № 3. - P. 247-257. Ouaissi, M. Histone deacetylase (HDAC) encoding gene expression in pancreatic cancer cell lines and cell sensitivity to HDAC inhibitors / M. Ouaissi, S. Cabral, J. Tavares, A. Cordeiro da Silva, F. Mathieu-Daude, E. Mas, J. Bernard, B. Sastre, D. Lombardo, A. Ouaissi // Cancer Biol Ther.- 2007. - V. 7, № 4. - P. Pan, W. MicroRNA-21 and microRNA-148a contribute to DNA hypomethylation in lupus CD4+ T cells by directly and indirectly targeting DNA methyltransferase 1 / W. Pan, S. Zhu, M. Yuan, H. Cui, L. Wang, X. Luo, J. Li, H. Zhou, Y. Tang, N. Shen // J Immunol.2010. - V. 184, № 12. - P. 6773-6781. Panigrahy, D. Cytochrome P450-derived eicosanoids: the neglected pathway in cancer / D. Panigrahy, A. Kaipainen, E.R. Greene, S. Huang // Cancer Metastasis Rev.- 2010. - V. 29, № 4. - P. 723-735. Pannell, D. Retrovirus vector silencing is de novo methylase independent and marked by a repressive histone code / D. Pannell, C.S. Osborne, S. Yao, T. Sukonnik, P. Pasceri, A. Karaiskakis, M. Okano, E. Li, H.D. Lipshitz, J. Ellis // EMBO J.- 2000. - V. 19, № 21. - P. 5884-5894. Pannell, D. Silencing of gene expression: implications for design of retrovirus vectors / D. Pannell, J. Ellis // Rev Med Virol.- 2001. - V. 11, № 4. - P. 205-217. Parker, B.S. Cytosine methylation enhances mitoxantrone-DNA adduct formation at CpG dinucleotides / B.S. Parker, S.M. Cutts, D.R. Phillips // J Biol Chem.- 2001. - V. 276, № 19. - P. 15953-15960. Parker, B.S. A molecular understanding of mitoxantrone-DNA adduct formation: effect of cytosine methylation and flanking sequences / B.S. Parker, T. Buley, B.J. Evison, S.M. Cutts, G.M. Neumann, M.N. Iskander, D.R. Phillips // J Biol Chem.- 2004. - V. 279, № 18. - P. 18814-18823. Patra, S.K. Demethylation of (Cytosine-5-C-methyl) DNA and regulation of transcription in the epigenetic pathways of cancer development / S.K. Patra, A. Patra, F. Rizzi, T.C. Ghosh, S. Bettuzzi // Cancer Metastasis Rev.- 2008. - V. 27, № 2. - P. 315-334. 138 244. 245. 246. 247. 248. 249. 250. 251. 252. 253. 254. 255. 256. 257. 258. 259. Piacentini, P. Trichostatin A enhances the response of chemotherapeutic agents in inhibiting pancreatic cancer cell proliferation / P. Piacentini, M. Donadelli, Costanzo, P.S. Moore, M. Palmieri, A. Scarpa // Virchows Arch.- 2006. - V. 448, № 6. - P. 797-804. Pillai, R.S. Repression of protein synthesis by miRNAs: how many mechanisms? / R.S. Pillai, S.N. Bhattacharyya, W. Filipowicz // Trends Cell Biol.- 2007. - V. 17, № 3. - P. 118126. Pogribny I.P. Epigenetic alterations in oncogenesis. Preface / I.P. Pogribny, R.I., Karpf // Adv Exp Med Biol.- 2013. - V. 754, №. - P. v-vii. Pogribny, I.P. Epigenetic effects of the continuous exposure to peroxisome proliferator WY14,643 in mouse liver are dependent upon peroxisome proliferator activated receptor alpha / I.P. Pogribny, V.P. Tryndyak, C.G. Woods, S.E. Witt, I. Rusyn // Mutat Res.- 2007. - V. 625, № 1-2. - P. 62-71. Pogribny, I.P. DNA methylome alterations in chemical carcinogenesis / I.P. Pogribny, F.A. Beland // Cancer Lett.- 2012. - №. - P. Poleshko, A. Identification of cellular proteins that maintain retroviral epigenetic silencing: evidence for an antiviral response / A. Poleshko, I. Palagin, R. Zhang, P. Boimel, C. Castagna, P.D. Adams, A.M. Skalka, R.A. Katz // J Virol.- 2008. - V. 82, № 5. - P. 23132323. Poleshko, A. Identification of a functional network of human epigenetic silencing factors / A. Poleshko, M.B. Einarson, N. Shalginskikh, R. Zhang, P.D. Adams, A.M. Skalka, R.A. Katz // J Biol Chem.- 2010. - V. 285, № 1. - P. 422-433. Pommier, Y. Interfacial inhibitors of protein-nucleic acid interactions / Y. Pommier, C. Marchand // Curr Med Chem Anticancer Agents.- 2005. - V. 5, № 4. - P. 421-429. Pullman, A. [Not available] / A.Pullman // C R Seances Soc Biol Fil.- 1945. - V. 139, №. P. 1056-1058. Raj, L. Selective killing of cancer cells by a small molecule targeting the stress response to ROS / L. Raj, T. Ide, A.U. Gurkar, M. Foley, M. Schenone, X. Li, N.J. Tolliday, T.R. Golub, S A. Carr, A.F. Shamji, A.M. Stern, A. Mandinova, S.L. Schreiber, S.W. Lee // Nature.- 2011. - V. 475, № 7355. - P. 231-234. Rajendrasozhan, S. Current perspectives on role of chromatin modifications and deacetylases in lung inflammation in COPD / S. Rajendrasozhan, H. YaoI. Rahman // COPD.- 2009. - V. 6, № 4. - P. 291-297. Razin, A. DNA methylation in epigenetic control of gene expression / A. Razin, B. Kantor // Prog Mol Subcell Biol.- 2005. - V. 38, №. - P. 151-167. Reynolds, P.A. Tumor suppressor p16INK4A regulates polycomb-mediated DNA hypermethylation in human mammary epithelial cells / P.A. Reynolds, M. Sigaroudinia, G. Zardo, M.B. Wilson, G.M. Benton, C.J. Miller, C. Hong, J. Fridlyand, J.F. Costello, T.D. Tlsty // J Biol Chem.- 2006. - V. 281, № 34. - P. 24790-24802. Robertson, K.D. The human DNA methyltransferases (DNMTs) 1, 3a and 3b: coordinate mRNA expression in normal tissues and overexpression in tumors / K D. Robertson, E. Uzvolgyi, G. Liang, C. Talmadge, J. Sumegi, F.A. Gonzales, P.A. Jones // Nucleic Acids Res.- 1999. - V. 27, № 11. - P. 2291-2298. Rothgiesser, K.M. SIRT2 regulates NF-kappaB dependent gene expression through deacetylation of p65 Lys310 / K.M. Rothgiesser, S. Erener, S. Waibel, B. Luscher, M.O. Hottiger // J Cell Sci.- - V. 123, № Pt 24. - P. 4251-4258. Rummel, A.M. Polycyclic aromatic hydrocarbons with bay-like regions inhibited gap junctional intercellular communication and stimulated MAPK activity / A.M.Rummel, J.E. Trosko, M.R. Wilson, B.L. Upham // Toxicol Sci.- 1999. - V. 49, № 2. - P. 232-240. 139 260. 261. 262. 263. 264. 265. 266. 267. 268. 269. 270. 271. 272. 273. 274. 275. Ruthenburg, A.J. Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic mark / A.J. Ruthenburg, C.D. Allis, J. Wysocka // Mol Cell.- 2007. - V. 25, № 1. - P. 15-30. Ryan, B.M. Genetic variation in microRNA networks: the implications for cancer research / B.M. Ryan, A.I. Robles, C.C. Harris // Nat Rev Cancer.- 2010. - V. 10, № 6. - P. 389-402. Salnikow, K. Genetic and epigenetic mechanisms in metal carcinogenesis and cocarcinogenesis: nickel, arsenic, and chromium / K. Salnikow, A. Zhitkovich // Chem Res Toxicol.- 2008. - V. 21, № 1. - P. 28-44. Sarraf, S. Methyl-CpG binding protein MBD1 couples histone H3 methylation at lysine 9 by SETDB1 to DNA replication and chromatin assembly / S. Sarraf, A.I. Stancheva // Mol Cell.- 2004. - V. 15, № 4. - P. 595-605. Schaefer, M. RNA methylation by Dnmt2 protects transfer RNAs against stress-induced cleavage / M. Schaefer, T. Pollex, K. Hanna, F. Tuorto, M. Meusburger, M. Helm, F. Lyko // Genes Dev. - V. 24, № 15. - P. 1590-1595. Schlesinger, Y. Polycomb-mediated methylation on Lys27 of histone H3 pre-marks genes for de novo methylation in cancer / Y. Schlesinger, R. Straussman, I. Keshet, S. Farkash, M. Hecht, J. Zimmerman, E. Eden, Z. Yakhini, E. Ben-Shushan, B.E. Reubinoff, Y. Bergman, I. SimonH. Cedar // Nat Genet.- 2007. - V. 39, № 2. - P. 232-236. Sen, D.D. Influence of DNA-binding drugs on chromatin condensation / D.D. Sen, M. Crothers // Biochemistry.- 1986. - V. 25, № 7. - P. 1503-1509. Senigl, F. The core element of a CpG island protects avian sarcoma and leukosis virusderived vectors from transcriptional silencing / F. Senigl, J. Plachy, J. Hejnar // J Virol.2008. - V. 82, № 16. - P. 7818-7827. Shackelford, R.E. Cell cycle control, checkpoint mechanisms, and genotoxic stress / R.E. Shackelford, W.K. Kaufmann, R.S. Paules // Environ Health Perspect.- 1999. - V. 107 Suppl 1, №. - P. 5-24. Shah, Y.M. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha regulates a microRNAmediated signaling cascade responsible for hepatocellular proliferation / Y.M. Shah, K. Morimura, Q. Yang, T. Tanabe, M. Takagi, F.J. Gonzalez // Mol Cell Biol.- 2007. - V. 27, № 12. - P. 4238-4247. Shalginskikh, N. Retroviral DNA methylation and epigenetic repression are mediated by the antiviral host protein Daxx / N. Shalginskikh, A. Poleshko, A.M. Skalka, R.A. Katz // J Virol.- 2013. - V. 87, № 4. - P. 2137-2150. Sharma, S.V. A chromatin-mediated reversible drug-tolerant state in cancer cell subpopulations / S.V. Sharma, D.Y. Lee, B. Li, M.P. Quinlan, F. Takahashi, S. Maheswaran, U. McDermott, N. Azizian, L. Zou, M.A. Fischbach, K.K. Wong, K. Brandstetter, B. Wittner, S. Ramaswamy, M. Classon, J. Settleman // Cell.- 2010. - V. 141, № 1. - P. 69-80. Sims, J.K. A trans-tail histone code defined by monomethylated H4 Lys-20 and H3 Lys-9 demarcates distinct regions of silent chromatin / J.K. Sims, S.I. Houston, T. Magazinnik, J.C. Rice // J Biol Chem.- 2006. - V. 281, № 18. - P. 12760-12766. Slaga, T.J. Cellular and molecular mechanisms involved in multistage skin carcinogenesis / T.J. Slaga // Carcinog Compr Surv.- 1989. - V. 11, №. - P. 1-18. Smith, L.E. Targeting of lung cancer mutational hotspots by polycyclic aromatic hydrocarbons / L.E. Smith, M.F. Denissenko, W.P. Bennett, H. Li, S. Amin, M. Tang, G.P. Pfeifer // J Natl Cancer Inst.- 2000. - V. 92, № 10. - P. 803-811. Smith, S. DNA methylation in eukaryotic chromosome stability revisited: DNA methyltransferase in the management of DNA conformation space / S. Smith, S.L. Crocitto // Mol Carcinog.- 1999. - V. 26, № 1. - P. 1-9. 140 276. 277. 278. 279. 280. 281. 282. 283. 284. 285. 286. 287. 288. 289. 290. 291. Soppe, W.J. DNA methylation controls histone H3 lysine 9 methylation and heterochromatin assembly in Arabidopsis / W.J. Soppe, Z. Jasencakova, A. Houben, T. Kakutani, A. Meister, M.S. Huang, S.E. Jacobsen, I. Schubert, P.F. Fransz // EMBO J.2002. - V. 21, № 23. - P. 6549-6559. Steensma, D.P. Multicenter study of decitabine administered daily for 5 days every 4 weeks to adults with myelodysplastic syndromes: the alternative dosing for outpatient treatment (ADOPT) trial / D.P.Ste ensma, M.R. Baer, J.L. Slack, R. Buckstein, L.A. Godley, G. Garcia-Manero, M. Albitar, J.S. Larsen, S. Arora, M.T. Cullen, H. Kantarjian // J Clin Oncol.- 2009. - V. 27, № 23. - P. 3842-3848. Sterner, D.E. Acetylation of histones and transcription-related factors / D.E. Sterner, S.L. Berger // Microbiol Mol Biol Rev.- 2000. - V. 64, № 2. - P. 435-459. Strahl, B.D. The language of covalent histone modifications / B.D. Strahl, C.D. Allis // Nature.- 2000. - V. 403, № 6765. - P. 41-45. Stroud, H. 5-Hydroxymethylcytosine is associated with enhancers and gene bodies in human embryonic stem cells / H. Stroud, S. Feng, S. Morey Kinney, S. Pradhan, S.E. Jacobsen // Genome Biol.- - V. 12, № 6. - P. R54. Suetake, I. DNMT3L stimulates the DNA methylation activity of Dnmt3a and Dnmt3b through a direct interaction / I. Suetake, F. Shinozaki, J. Miyagawa, H. Takeshima, S. Tajima // J Biol Chem.- 2004. - V. 279, № 26. - P. 27816-27823. Sung, P. Catalysis of ATP-dependent homologous DNA pairing and strand exchange by yeast RAD51 protein / P. Sung // Science.- 1994. - V. 265, № 5176. - P. 1241-1243. Suto, R.K. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z / R.K. Suto, M.J. Clarkson, D.J. Tremethick, K. Luger // Nat Struct Biol.- 2000. - V. 7, № 12. - P. 1121-1124. Suzuki, M. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics / M. Suzuki, M.A. Bird // Nat Rev Genet.- 2008. - V. 9, № 6. - P. 465-476. Svasti, J. Proteomic profiling of cholangiocarcinoma cell line treated with pomiferin from Derris malaccensis / J. Svasti, C. Srisomsap, P. Subhasitanont, S. Keeratichamroen, D. Chokchaichamnankit, L. Ngiwsara, N. Chimnoi, S. Pisutjaroenpong, S. Techasakul, S.T. Chen // Proteomics.- 2005. - V. 5, № 17. - P. 4504-4509. Svoboda, J. Retroviruses in foreign species and the problem of provirus silencing / J. Svoboda, J. Hejnar, J. Geryk, D. Elleder, Z. Vernerova // Gene.- 2000. - V. 261, № 1. - P. 181-188. Swenberg, J.A. Relationships between DNA adduct formation and carcinogenesis / J.A. Swenberg, F.C. Richardson, J.A. Boucheron, M.C. Dyroff // Environ Health Perspect.1985. - V. 62, №. - P. 177-183. Swindle, C.S. Mechanisms that regulate silencing of gene expression from retroviral vectors / C.S. Swindle, C.A. Klug // J Hematother Stem Cell Res.- 2002. - V. 11, № 3. - P. 449-456. Szczesna-Skorupa, E. Influence of protein-protein interactions on the cellular localization of cytochrome P450 / E. Szczesna-Skorupa, B. Kemper // Expert Opin Drug Metab Toxicol.2008. - V. 4, № 2. - P. 123-136. Szulwach, K.E. Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells / K.E. Szulwach, X. Li, Y. Li, C. X. Song, J.W. Han, S. Kim, S. Namburi, K. Hermetz, J.J. Kim, M.K. Rudd, Y.S. Yoon, B. Ren, C. He, P. Jin // PLoS Genet.- - V. 7, № 6. - P. e1002154. Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1 / M. Tahiliani, K.P. Koh, Y. Shen, W.A. Pastor, H. Bandukwala, Y. Brudno, S. Agarwal, L.M. Iyer, D.R. Liu, L. Aravind, A. Rao // Science.2009. - V. 324, № 5929. - P. 930-935. 141 292. 293. 294. 295. 296. 297. 298. 299. 300. 301. 302. 303. 304. 305. 306. 307. Takada, S. Potential role of miR-29b in modulation of Dnmt3a and Dnmt3b expression in primordial germ cells of female mouse embryos / S. Takada, E. Berezikov, Y.L. Choi, Y. Yamashita, H. Mano // RNA.- 2009. - V. 15, № 8. - P. 1507-1514. Takagi, K. Novel E-ring camptothecin keto analogues (S38809 and S39625) are stable, potent, and selective topoisomerase I inhibitors without being substrates of drug efflux transporters / K. Takagi, T.S. Dexheimer, C. Redon, O. Sordet, K. Agama, G. Lavielle, A. Pierre, S.E. Bates, Y. Pommier // Mol Cancer Ther.- 2007. - V. 6, № 12 Pt 1. - P. 32293238. Tamakawa, R.A. Telomerase inhibition potentiates the effects of genotoxic agents in breast and colorectal cancer cells in a cell cycle-specific manner / R.A. Tamakawa, H.B. Fleisig, J.M. Wong // Cancer Res.- 2010. - V. 70, № 21. - P. 8684-8694. Tamaru, H.E. A histone H3 methyltransferase controls DNA methylation in Neurospora crassa / H.E. Tamaru, U. Selker // Nature.- 2001. - V. 414, № 6861. - P. 277-283. Tariq, M. Erasure of CpG methylation in Arabidopsis alters patterns of histone H3 methylation in heterochromatin / M. Tariq, H. Saze, A.V. Probst, J. Lichota, Y. Habu, J. Paszkowski // Proc Natl Acad Sci U S A.- 2003. - V. 100, № 15. - P. 8823-8827. Tazawa, H. Tumor-suppressive miR-34a induces senescence-like growth arrest through modulation of the E2F pathway in human colon cancer cells / H. Tazawa, N. Tsuchiya, M. Izumiya, H. Nakagama // Proc Natl Acad Sci U S A.- 2007. - V. 104, № 39. - P. 1547215477. Tijsterman, M. The genetics of RNA silencing / M. Tijsterman, R.F. Ketting, R.H. Plasterk // Annu Rev Genet.- 2002. - V. 36, №. - P. 489-519. Turner, A.M. Mobilization-competent Lentiviral Vector-mediated Sustained Transcriptional Modulation of HIV-1 Expression / A.M. Turner, J. De La Cruz, K.V. Morris // Mol Ther.2009. - V. 17, № 2. - P. 360-368. Turner, B.M. Cellular memory and the histone code / B.M. Turner // Cell.- 2002. - V. 111, № 3. - P. 285-291. Ullu, E. RNA interference in protozoan parasites / E. Ullu, C. Tschudi, T. Chakraborty // Cell Microbiol.- 2004. - V. 6, № 6. - P. 509-519. Vakoc, C.R. Profile of histone lysine methylation across transcribed mammalian chromatin / C.R.Vakoc, M.M. Sachdeva, H. Wang, G.A. Blobel // Mol Cell Biol.- 2006. - V. 26, № 24. - P. 9185-9195. Valinluck, V. Oxidative damage to methyl-CpG sequences inhibits the binding of the methyl-CpG binding domain (MBD) of methyl-CpG binding protein 2 (MeCP2) / V. Valinluck, H.H. Tsai, D.K. Rogstad, A. Burdzy, A. Bird, L.C. Sowers // Nucleic Acids Res.2004. - V. 32, № 14. - P. 4100-4108. Valinluck, V. Endogenous cytosine damage products alter the site selectivity of human DNA maintenance methyltransferase DNMT1 / V. Valinluck, L.C. Sowers // Cancer Res.2007. - V. 67, № 3. - P. 946-950. van der Heijden, G.W. Asymmetry in histone H3 variants and lysine methylation between paternal and maternal chromatin of the early mouse zygote / G.W. van der Heijden, J.W. Dieker, A.A. Derijck, S. Muller, J.H. Berden, D.D. Braat, J. van der Vlag, P. de Boer // Mech Dev.- 2005. - V. 122, № 9. - P. 1008-1022. Verdel, A. RNAi-mediated targeting of heterochromatin by the RITS complex / A.Verdel, S. Jia, S. Gerber, T. Sugiyama, S. Gygi, S. I. Grewal, D. Moazed // Science.- 2004. - V. 303, № 5658. - P. 672-676. Vire, E. The Polycomb group protein EZH2 directly controls DNA methylation / E.Vire, C. Brenner, R. Deplus, L. Blanchon, M. Fraga, C. Didelot, L. Morey, A. Van Eynde, D. 142 308. 309. 310. 311. 312. 313. 314. 315. 316. 317. 318. 319. 320. 321. 322. Bernard, J.M. Vanderwinden, M. Bollen, M. Esteller, L. Di Croce, Y. de Launoit, F. Fuks // Nature.- 2006. - V. 439, № 7078. - P. 871-874. Vittorio, O. Dextran-catechin conjugate: a potential treatment against the pancreatic ductal adenocarcinoma / O.Vittorio, G. Cirillo, F. Iemma, G. Di Turi, E. Jacchetti, M. Curcio, S. Barbuti, N. Funel, O.I. Parisi, F. Puoci, N. Picci // Pharm Res.- 2012. - V. 29, № 9. - P. 2601-2614. Volpe, T.A. Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi / T.A.Volpe, C. Kidner, I.M. Hall, G. Teng, S.I. Grewal, R.A. Martienssen // Science.- 2002. - V. 297, № 5588. - P. 1833-1837. Walker, K. Genetic polymorphism in N-Acetyltransferase (NAT): Population distribution of NAT1 and NAT2 activity / K. Walker, G. Ginsberg, D. Hattis, D.O. Johns, K.Z. Guyton, B. Sonawane // J Toxicol Environ Health B Crit Rev.- 2009. - V. 12, № 5-6. - P. 440-472. Walsh, C.P. Cytosine methylation and mammalian development / C.P. Walsh, T.H. Bestor // Genes Dev.- 1999. - V. 13, № 1. - P. 26-34. Wang, H. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing / H. Wang, L. Wang, H. Erdjument-Bromage, M. Vidal, P. Tempst, R.S. Jones, Y. Zhang // Nature.- 2004. - V. 431, № 7010. - P. 873-878. Wang, J. The lysine demethylase LSD1 (KDM1) is required for maintenance of global DNA methylation / J. Wang, S. Hevi, J.K. Kurash, H. Lei, F. Gay, J. Bajko, H. Su, W. Sun, H. Chang, G. Xu, F. Gaudet, E. Li, T. Chen // Nat Genet.- 2009. - V. 41, № 1. - P. 125-129. Wang, Z. Reversal and prevention of arsenic-induced human bronchial epithelial cell malignant transformation by microRNA-200b / Z. Wang, Y. Zhao, E. Smith, G.J. Goodall, P.A. Drew, T. Brabletz, C. Yang // Toxicol Sci.- 2011. - V. 121, № 1. - P. 110-122. Waterhouse, P.M. Gene silencing as an adaptive defence against viruses / P.M. Waterhouse, M.B. Wang, T. Lough // Nature.- 2001. - V. 411, № 6839. - P. 834-842. Watson, R.E. The value of DNA methylation analysis in basic, initial toxicity assessments / R.E. Watson, J.M. McKim, G.L. Cockerell, J.I. Goodman // Toxicol Sci.- 2004. - V. 79, № 1. - P. 178-188. Watt, F.P.. Cytosine methylation prevents binding to DNA of a HeLa cell transcription factor required for optimal expression of the adenovirus major late promoter / F.P. Watt, L. Molloy // Genes Dev.- 1988. - V. 2, № 9. - P. 1136-1143. Weinberg, M.S. The antisense strand of small interfering RNAs directs histone methylation and transcriptional gene silencing in human cells / M.S. Weinberg, L.M. Villeneuve, A. Ehsani, M. Amarzguioui, L. Aagaard, Z.X. Chen, A.D. Riggs, J.J. Rossi, K.V. Morris // RNA.- 2006. - V. 12, № 2. - P. 256-262. Weintraub, M. Secondary acute myeloid leukemia after etoposide therapy for retinoblastoma / M. Weintraub, S. Revel-Vilk, M. Charit, M. Aker, J. Pe'er // J Pediatr Hematol Oncol.2007. - V. 29, № 9. - P. 646-648. Wetherill, Y.B. Bisphenol A facilitates bypass of androgen ablation therapy in prostate cancer / Y.B. Wetherill, J.K. Hess-Wilson, C.E. Comstock, S.A. Shah, C.R. Buncher, L. Sallans, P.A. Limbach, S. Schwemberger, G.F. Babcock, K.E. Knudsen // Mol Cancer Ther.- 2006. - V. 5, № 12. - P. 3181-3190. Whetstine, J.R. Reversal of histone lysine trimethylation by the JMJD2 family of histone demethylases / J.R. Whetstine, A. Nottke, F. Lan, M. Huarte, S. Smolikov, Z. Chen, E. Spooner, E. Li,G. Zhang ,M. Colaiacovo, Y. Shi // Cell.- 2006. - V. 125, № 3. - P. 467-481. Wijnen, P.A. Review article: The prevalence and clinical relevance of cytochrome P450 polymorphisms / P.A.Wijnen, R.A. Op den Buijsch, M. Drent, P. M. Kuijpers, C. Neef, A. Bast, O. Bekers, G.H. Koek // Aliment Pharmacol Ther.- 2007. - V. 26 Suppl 2, №. - P. 211219. 143 323. 324. 325. 326. 327. 328. 329. 330. 331. 332. 333. 334. 335. 336. 337. 338. Wilson, G.G. Restriction and modification systems / G.G. Wilson, N.E. Murray // Annu Rev Genet.- 1991. - V. 25, №. - P. 585-627. Wilson, T.E. Yeast DNA ligase IV mediates non-homologous DNA end joining / T.E. Wilson, U. Grawunder, M.R. Lieber // Nature.- 1997. - V. 388, № 6641. - P. 495-498. Windmill, K.F. Localization of N-acetyltransferases NAT1 and NAT2 in human tissues / K.F. Windmill, A. Gaedigk, P.M. Hall, H. Samaratunga, D.M. Grant, M.E. McManus // Toxicol Sci.- 2000. - V. 54, № 1. - P. 19-29. Wolffe, A.P. Chromatin disruption and modification / A.P. Wolffe, J.J. Hayes // Nucleic Acids Res.- 1999. - V. 27, № 3. - P. 711-720. Wu, J. Molecular mechanism of upregulation of survivin transcription by the AT-rich DNAbinding ligand, Hoechst33342: evidence for survivin involvement in drug resistance / J. Wu, P. Apontes, L. Song, P. Liang, L. Yang, F. Li // Nucleic Acids Res.- 2007. - V. 35, № 7. - P. 2390-2402. Xiao, R. [Effects of 5-azaC on methylation pattern of the perforin promoter of the perforin gene in normal human T cells] / R. Xiao, Y. Ding, Q.J. Lu, Y.P. Li, Y.J. Li, X.J. Yang, Y.W. Su, Y.S. Liang, G.Y. Zhang, H.Q. Wen // Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban.2006. - V. 31, № 6. - P. 843-847. Yamane, K. JHDM2A, a JmjC-containing H3K9 demethylase, facilitates transcription activation by androgen receptor / K. Yamane, C. Toumazou, Y. Tsukada, H. ErdjumentBromage, P. Tempst, J. Wong, Y. Zhang // Cell.- 2006. - V. 125, № 3. - P. 483-495. Yang, X.J. The diverse superfamily of lysine acetyltransferases and their roles in leukemia and other diseases / X.J. Yang // Nucleic Acids Res.- 2004. - V. 32, № 3. - P. 959-976. Yao, S. Retrovirus silencing, variegation, extinction, and memory are controlled by a dynamic interplay of multiple epigenetic modifications / S. Yao, T. Sukonnik, T. Kea, R.R. Bharadwaj, P. Pasceri, J. Ellis // Mol Ther.- 2004. - V. 10, № 1. - P. 27-36. Yen, R.W. Isolation and characterization of the cDNA encoding human DNA methyltransferase / R.W. Yen, P.M. Vertino, B.D. Nelkin, J.J. Yu, W. el-Deiry, A. Cumaraswamy, G.G. Lennon, B.J. Trask, P. Celano, S.B. Baylin // Nucleic Acids Res.1992. - V. 20, № 9. - P. 2287-2291. Yi, R. Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs / R. Yi, Y. Qin, I.G. Macara, B.R. Cullen // Genes Dev.- 2003. - V. 17, № 24. - P. 3011-3016. Yoon, J.H. Methylated CpG dinucleotides are the preferential targets for G-to-T transversion mutations induced by benzo[a]pyrene diol epoxide in mammalian cells: similarities with the p53 mutation spectrum in smoking-associated lung cancers / J.H. Yoon, L.E. Smith, Z. Feng, M. Tang, C.S. Lee, G.P. Pfeifer // Cancer Res.- 2001. - V. 61, № 19. - P. 7110-7117. Yoshida, K. Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage / K.Yoshida, Y. Miki // Cancer Sci.- 2004. - V. 95, № 11. - P. 866-871. Yoshiura, K. Silencing of the E-cadherin invasion-suppressor gene by CpG methylation in human carcinomas / K. Yoshiura, Y. Kanai, A. Ochiai, Y. Shimoyama, T. Sugimura, S. Hirohashi // Proc Natl Acad Sci U S A.- 1995. - V. 92, № 16. - P. 7416-7419. Zhang, Y. Coordinated changes in DNA methylation and histone modifications regulate silencing/derepression of luteinizing hormone receptor gene transcription / Y. Zhang, N. Fatima, M. L. Dufau // Mol Cell Biol.- 2005. - V. 25, № 18. - P. 7929-7939. Zhao, C.Q. Association of arsenic-induced malignant transformation with DNA hypomethylation and aberrant gene expression / C.Q. Zhao, M.R. Young, B.A. Diwan, T.P. Coogan, M.P. Waalkes // Proc Natl Acad Sci U S A.- 1997. - V. 94, № 20. - P. 1090710912. 144 339. 340. 341. 342. 343. 344. 345. 346. 347. Zhao, L. Histone deacetylation inhibition in pulmonary hypertension: therapeutic potential of valproic acid and suberoylanilide hydroxamic acid / L. Zhao, C.N. Chen, N. Hajji, E. Oliver, E. Cotroneo, J. Wharton, D. Wang, M. Li, T.A. McKinsey, K.R. Stenmark, M.R. Wilkins // Circulation.- 2012. - V. 126, № 4. - P. 455-467. Zhao, Q. PRMT5-mediated methylation of histone H4R3 recruits DNMT3A, coupling histone and DNA methylation in gene silencing / Q. Zhao, G. Rank, Y.T. Tan, H. Li, R.L. Moritz, R.J. Simpson, L. Cerruti, D.J. Curtis, D.J. Patel, C.D. Allis, J.M. Cunningham, S.M. Jane // Nat Struct Mol Biol.- 2009. - V. 16, № 3. - P. 304-311. Zhao, Y. The role of miR-506 in transformed 16HBE cells induced by anti-benzo[a]pyrenetrans-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide / Y. Zhao, H. Liu, Y. Li, J. Wu, A.R. Greenlee, C. Yang, Y. Jiang // Toxicol Lett.- 2011. - V. 205, № 3. - P. 320-326. Zhao, Y. Targeting Cullin-RING ligases by MLN4924 induces autophagy via modulating the HIF1-REDD1-TSC1-mTORC1-DEPTOR axis / Y. Zhao, X. Xiong, L. Jia, Y. Sun // Cell Death Dis.- 2012. - V. 3, №. - P. e386. Zheng, H.R. Changes in methyl-sensitive restriction sites of liver DNA from hamsters chronically exposed to hydrazine sulfate / H.R. Zheng, C. Shank // Carcinogenesis.- 1996. V. 17, № 12. - P. 2711-2717. Zheng, Z.M. Viral oncogenes, noncoding RNAs, and RNA splicing in human tumor viruses / Z.M. Zheng // Int J Biol Sci.- 2010. - V. 6, № 7. - P. 730-755. Zhou, J. The histone methyltransferase inhibitor, DZNep, up-regulates TXNIP, increases ROS production, and targets leukemia cells in AML / J. Zhou, C. Bi, L.L. Cheong, S. Mahara, S.C. Liu, K.G. Tay, T.L. Koh, Q.Yu, W.J. Chng // Blood.- 2011. - V. 118, № 10. P. 2830-2839. Zhu, B. Monoubiquitination of human histone H2B: the factors involved and their roles in HOX gene regulation / B. Zhu, Y. Zheng, A.D. Pham, S.S. Mandal, H. Erdjument-Bromage, P. Tempst, D. Reinberg // Mol Cell.- 2005. - V. 20, № 4. - P. 601-611. Zion, M. Progressive de novo DNA methylation at the bcr-abl locus in the course of chronic myelogenous leukemia / M. Zion, D. Ben-Yehuda, A. Avraham, O. Cohen, M. Wetzler, D. Melloul, Y. Ben-Neriah // Proc Natl Acad Sci U S A.- 1994. - V. 91, № 22. - P. 1072210726.
