Есюнина Дарья Михайловна Особенности реакции расщепления
advertisement
На правах рукописи Есюнина Дарья Михайловна Особенности реакции расщепления РНК и регуляции активности у РНК-полимераз Deinococcus radiodurans, Thermus aquaticus и Thermus thermophilus 03.01.03 - молекулярная биология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» и в лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов отдела молекулярной генетики клетки Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной генетики Российской академии наук. Научный руководитель: доктор биологических наук Кульбачинский Андрей Владимирович Официальные оппоненты: Сергиев Петр Владимирович, доктор химических наук, Химический факультет Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова», профессор кафедры химии природных соединений. Шпаковский Георгий Вячеславович, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, руководитель лаборатории механизмов генной экспрессии. Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии имени В.А.Энгельгардта Российской академии наук. Защита состоится 19 декабря 2013 года в часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 12, МГУ, биологический факультет, ауд. ____. С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций). Автореферат разослан « » ноября Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук 2013 г. Крашенинников И.А. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы РНК-полимераза (РНКП) – высоко консервативный фермент, осуществляющий процесс транскрипции в клетках всех организмов. У бактерий транскрипция всех генов осуществляется единственной РНКП, которая является одной из основных моделей для изучения фундаментальных механизмов транскрипции, а также может служить перспективной мишенью для действия антибиотиков. Процесс транскрипции разделяют на три стадии: инициацию, элонгацию и терминацию, которые сопровождаются сложными структурными перестройками РНКП. Инициация транскрипции осуществляется холоферментом РНКП, состоящим из кор-фермента и σ-субъединицы, ответственной за узнавание промоторных элементов. Дальнейшие стадии транскрипции – элонгация и терминация – могут осуществляться в отсутствие σ-субъединицы кор-ферментом РНКП, состоящим, в свою очередь, из пяти субъединиц – α2ββ′ω. Нуклеиновые кислоты во время транскрипции располагаются в главном канале РНКП, сформированном β- и β′субъединицами. Активный центр фермента, также образованный β- и β′субъединицами, содержит два каталитических иона магния. В процессе синтеза РНК нуклеотиды поступают через вторичный канал РНКП, соединяющийся с главным в области активного центра. Вторичный канал является также местом связывания многих регуляторных факторов белковой природы, которые, проникая в него, достигают активного центра фермента и могут напрямую регулировать активность РНКП. На стадии элонгации РНКП может осуществлять не только синтез, но и эндонуклеолитическое расщепление РНК (далее для краткости «расщепление РНК»). Предполагается, что реакция расщепления РНК играет важную роль в исправлении ошибок транскрипции и в преодолении транскрипционных пауз, возникающих в ходе элонгации (Gordon et al., 2009; Sydow et al., 2009; Пупов и Кульбачинский, 2010). Было показано, что расщеплению РНК предшествует обратное смещение элонгационного комплекса (ЭК), при этом 3′-конец РНК выходит во вторичный канал РНКП. Следует сказать, что, хотя биохимические и структурные исследования последних лет позволили предположить детальный молекулярный механизм синтеза РНК бактериальной РНКП, про механизм расщепления РНК известно гораздо меньше. В последние годы активно ведутся работы по расшифровке пространственных структур РНКП и транскрипционных комплексов, что вместе с биохимическими данными обеспечивает понимание молекулярных механизмов работы РНКП на разных стадиях транскрипции. К настоящему времени наиболее полная структурная информация получена для РНКП термофильных бактерий рода Thermus (T. thermophilus и T. aquaticus) (Vassylyev et al., 2007). РНКП этих бактерий обладают рядом уникальных особенностей, связанных с адаптацией к высоким температурам, и при этом являются неродственными РНКП мезофильной бактерии Escherichia coli, которая очень хорошо изучена биохимическими методами. С этой точки зрения, большой интерес представляет исследование РНКП мезофильной бактерии Deinococcus radiodurans, которая филогенетически родственна бактериям рода Thermus. Существующие данные показывают, что РНКП T. aquaticus, T. thermophilus и D. radiodurans обладают гораздо большей скоростью расщепления РНК (в своих температурных оптимумах), чем РНКП E. coli, что делает 3 сравнительное исследование этих РНКП актуальным с точки зрения понимания механизмов реакции расщепления РНК и температурной адаптации катализа. В связи с консервативностью структуры активного центра РНКП у бактерий и эукариот, исследование механизмов действия различных факторов (белков, низкомолекулярных соединений, некодирующих нуклеиновых кислот и антибиотиков) на работу бактериальной РНКП позволяет понять общие принципы регуляции транскрипции. Важнейшей группой факторов являются регуляторные молекулы, способные непосредственно воздействовать на активный центр РНКП. К таким факторам относятся белки Gre, связывающиеся во вторичном канале РНКП и стимулирующие расщепление РНК (Borukhov et el., 1993). Еще одной группой факторов являются разнообразные белки бактериофагов, изменяющие активность хозяйской РНКП в процессе инфекции. Исследование механизма действия данных белков с привлечением современных данных о структуре РНКП (прежде всего, термофильных бактерий) может дать ценную информацию о различных способах регуляции активности РНКП. С этой точки зрения очень интересной моделью являются регуляторные белки бактериофагов, заражающих бактерии рода Thermus, в частности, открытый недавно белок gp39 бактериофага Р23-45, который взаимодействует с РНКП T. thermophilus (Berdygulova et al., 2011). Понимание молекулярного механизма транскрипции и основных принципов регуляции активности РНКП представляет не только фундаментальный интерес, но имеет и важное практическое значение, так как РНКП является перспективной мишенью для создания новых антибиотиков. Изучение факторов, играющих ключевую роль в регуляции активности РНКП, необходимо для разработки новых систем для высокоэффективной экспрессии целевых генов. Исследование взаимодействий регуляторных белков бактериофагов с РНКП может быть также использовано для разработки новых тест-систем для поиска и характеристики различных лигандов РНКП, в том числе, имеющих медицинское значение. Степень разработанности В то время как детальный механизм синтеза РНК достаточно хорошо изучен, механизм расщепления РНК остается не до конца ясным; в частности, непонятно, какие районы РНКП принимают участие в данной реакции. Кроме того, в настоящее время нет данных о роли определенных районов РНКП в межвидовых различиях в катализе реакции расщепления. Существуют противоречивые данные об участии одного из ключевых элементов активного центра – G-петли – в реакции расщепления РНК (Yuzenkova et al., 2010, Zhang et al., 2010). Механизм действия факторов, способствующих расщеплению РНК, – Gre-белков у прокариот и фактора TFIIS у эукариот – изучается с конца ХХ века, однако, многие детали взаимодействия данных белков с РНКП и их физиологическая роль у разных организмов понятны не до конца (Sosunova et al., 2003, Sigurdsson et al., 2010). Кроме того, в последнее время ведется поиск новых ингибиторов бактериальной РНКП, в том числе, на основе фаговых белков. В связи с этим, активно изучаются механизмы взаимодействия РНКП с регуляторами фаговой природы. Однако многообразие таких механизмов делает исследование каждого нового фагового регулятора хозяйской транскрипции уникальным. 4 Цели и задачи исследования Цели работы: 1. Выявить районы РНКП D. radiodurans, T. aquaticus и E. coli, участвующие в реакции расщепления РНК и определяющие межвидовые различия в данной реакции. 2. Исследовать механизм регуляции транскрипции РНКП Thermus thermophilus белком gp39 бактериофага Р23-45. Задачи: 1. Исследовать особенности реакции расщепления РНК РНКП D. radiodurans. 2. Методами сайт-направленного мутагенеза и транскрипции in vitro выявить участки активного центра РНКП, определяющие различия в скорости реакции расщепления РНК у РНКП E. coli и D. radiodurans. 3. Изучить влияние мутаций в активном центре РНКП T. aquaticus на расщепление РНК в реакциях по транскрипции in vitro и выявить связанные с температурной адаптацией различия в реакции расщепления между РНКП T. aquaticus и D. radiodurans. 4. Методами транскрипции in vitro исследовать влияние белка gp39 бактериофага Р23-45 на транскрипционные свойства РНКП T. thermophilus. Найти районы РНКП, ответственные за связывание белка gp39. Научная новизна В ходе работы при помощи анализа мозаичных вариантов РНКП, содержащих последовательности от разных бактерий, проведен поиск элементов фермента, участвующих в реакции расщепления РНК и ответственных за межвидовые различия в скоростях расщепления. В результате идентифицирован ключевой элемент активного центра РНКП (G-петля), обусловливающий различия в скоростях расщепления РНК между РНКП D. radiodurans и E. coli. Кроме того, при сравнении РНКП термофильных и мезофильных бактерий установлено, что на скорость расщепления РНК способны также влиять дополнительные элементы активного центра, контактирующие с G-петлей и ответственные за температурную адаптацию в реакции расщепления РНК. Изучено влияние Gre-факторов на реакцию расщепления РНК РНКП D. radiodurans и E. coli. В части работы, посвященной изучению механизмов регуляции транскрипции фаговым белком gp39, детально исследованы транскрипционные свойства РНКП T. thermophilus в присутствии белка gp39 и охарактеризован предполагаемый участок связывания белка gp39 с РНКП. В ходе выполнения работы также впервые исследованы механизмы действия белка gp39 на активность клеточной РНКП на стадиях инициации и терминации транскрипции. Теоретическая и практическая значимость работы Полученные в работе данные значительно расширяют имеющиеся представления о механизмах катализа в активном центре РНКП и о способах регуляции активности фермента на разных стадиях транскрипции. Результаты работы могут быть использованы для создания модельных систем для структурных исследований транскрипционных комплексов и разработки новых ингибиторов бактериальной РНКП. 5 Методы исследования В работе использованы следующие методы исследования: сайт-направленный мутагенез, выделение нативных и рекомбинантных белков, различные варианты методик транскрипции in vitro, методы быстрой ферментативной кинетики, исследование влияния мутаций на выживаемость клеток бактерий in vivo. 1. 2. 3. 4. Положения, выносимые на защиту G-петля в активном центре РНКП обусловливает межвидовые различия в реакции расщепления РНК между РНКП D. radiodurans и E. coli. F-петля определяет различия в реакции расщепления РНК между РНКП D. radiodurans и T. aquaticus. Скорость расщепления РНК в присутствии GreA-факторов у РНКП D. radiodurans и E. coli выравнивается. Белок gp39 бактериофага Р23-45 взаимодействует с доменом «заслонка» βсубъединицы РНКП T. thermophilus и ингибирует инициацию транскрипции, но при этом стимулирует элонгацию транскрипции и подавляет терминацию. Степень достоверности и апробация результатов Все результаты работы являются достоверными, эксперименты сделаны с необходимыми контролями и имеют повторности. Результаты работы были представлены на следующих семинарах, конференциях и симпозиумах: 16 и 17 международных пущинских школах-конференциях молодых ученых (Пущино, 2012, 2013 гг.); International conference of postgenomic technology for biomedicine (Novosibirsk, 2012); The 73rd Harden Conference Machines on genes II – the central dogma at the interface of biology, chemistry and physic (Oxford, UK, 2012); международной конференции FASEB «Mechanisms and regulation of prokaryotic transcription» (Vermont, 2013); V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011 г.); «X чтениях памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова» (Москва, 2011 г.). Публикации По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 3 – статьи в рецензируемых научных изданиях, 7 – материалы международных и российских конференций и симпозиумов. Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и страницах машинописного списка цитируемой литературы. Работа изложена на текста и содержит рисунков и таблиц. Библиография включает названия. 6 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Исследование особенностей реакции расщепления РНК РНКполимеразами D. radiodurans и E. coli Реакция расщепления РНК осуществляется в том же активном центре РНКП, что и синтез РНК, и происходит в ЭК, смещенных в обратном направлении относительно хода транскрипции (смещенных ЭК) и содержащих в активном центре внутреннюю часть РНК-транскрипта (рис. 1). Активный центр РНКП содержит два иона Mg2+, которые координируют субстраты реакции в процессе катализа (Sosunov et al., 2003). Первый ион Mg2+ (MgI) прочно связан с тремя остатками аспарагиновой кислоты абсолютно консервативного для всех РНКП мотива NADFDGD β′-субъединицы. Второй ион Mg2+ (MgII) связан с РНКП гораздо слабее и в процессе синтеза РНК дополнительно координируется фосфатными группами входящего нуклеотида. При расщеплении РНК эти группы отсутствуют, в связи с чем регуляция связывания иона MgII приобретает важное значение. В отсутствие дополнительных факторов расщепление происходит с достаточно низкой эффективностью. При этом в реакции расщепления задействован нуклеотид в +2 положении РНК в смещенном комплексе, который, в частности, способствует координации иона MgII (Zenkin et al., 2006, Sosunova et al., 2013). Было показано, что реакция расщепления РНК РНКП E. coli значительно стимулируется при повышении рН, за счет улучшения связывания MgII в активном центре РНКП (Sosunov et al., 2003). Кроме того, специализированные Gre-факторы (у E. coli GreA и GreB), стимулирующие реакцию расщепления РНК, также улучшают связывание иона MgII в активном центре РНКП (Laptenko et al., 2003; Sosunova et al., 2003). Однако, структура комплекса РНКП с Gre-факторами и детали взаимодействий Greфакторов с различными элементами активного центра РНКП остаются неясными. В настоящее время установлены основные элементы активного центра РНКП, участвующие в синтезе РНК. Связывание нуклеотида в активном центре, его присоединение к 3′-концу РНК и трансклокация фермента сопровождается последовательными конформационными перестройками G-петли и F-спирали, образованными β′-субъединицей (рис. 1). В частности, при связывании входящего нуклеотида происходит сворачивание развернутой G-петли в две α-спирали и «закрывание» нуклеотида в активном центре РНКП, что способствует быстрому и точному катализу (рис. 1А). Однако, роль данных элементов активного центра, а также других участков РНКП, в обратном смещении РНКП и расщеплении РНК исследована гораздо меньше. Имеется только несколько работ, где была установлена роль некоторых аминокислотных остатков, а также 3′-конца РНК в реакции расщепления (Sosunov et al., 2003, Sosunova et al., 2013, Zenkin et al., 2006; Yuzenkova et al., 2010). Недавно была расшифрована пространственная структура смещенного ЭК РНКП II S. cerevisiae, в котором 3′-концевой нуклеотид РНК выходит во вторичный канал РНКП и контактирует с несколькими элементами активного центра, в том числе, с участком связывания каталитических ионов магния, G-петлей, F-спиралью и несколькими дополнительными участками РНКП (рис. 1 Б). В отличие от ЭК в процессе синтеза РНК, в котором G-петля находится в свернутой конформации и закрывает доступ в активный центр со стороны вторичного канала (рис. 1 А), в 7 А В Б Рисунок 1. Пространственная структура активного центра РНКП. (А) Пространственная структура активного центра РНКП Thermus thermophilus в элонгационном комплексе (по Vassylyev, 2007). (Б) Пространственная структура активного центра РНКП Saccharomyces cerevisiae в смещенном элонгационном комплексе (по Cheung, 2011). Входящий нуклеотид (А) и 3′-концевой нуклеотид РНК (Б) показаны черным цветом, матричная цепь ДНК оранжевым, цепь РНК – желтым цветом, каталитические иона магния отмечены пурпурным цветом. Кроме того, указаны некоторые элементы РНКП, которые взаимодействуют с РНК и могут влиять на ее расщепление – крышка и шип, граничащие с задней границей ДНК-дуплекса; F-спираль, G-петля и F-петля, принимающие участие в катализе присоединения нуклеотидов; а также аминокислоты, граничащие с 3′-концом РНК – Р567 и L783, показаны голубым и фиолетовыми цветами соответственно. В Gпетле показан остаток 1136, приближающийся к 3′-концевому нуклеотиду РНК в смещенном элонгационном комплексе. Зеленой стрелкой отмечено место вставки SI3 петли, характерной для некоторых РНКП, в том числе Е. соli. (В) Схема обратного смещения РНКП в составе элонгационного комплекса. РНКП показана розовым, активным центр – фиолетовым, РНК – красным и оранжевым цветами. В процессе обратного смещения 3'-конец РНК теряет контакты с активным центром и несколько нуклеотидов оказываются во вторичном канале фермента (показаны красным цветом). смещенном комплексе G-петля частично развернута и контактирует с F-петлей РНКП (рис. 1 Б). Можно предположить, что перечисленные районы активного центра могут играть важную роль в реакции расщепления РНК, в том числе в 8 случае бактериальной РНКП. Однако экспериментально роль большинства из этих районов в расщеплении не проверялась. Ранее в ЛМГМ были получены предварительные данные о том, что скорость расщепления РНК РНКП D. radiodurans значительно превосходит таковую у РНКП Е. соli (Пупов и соавт., 2008). Чтобы установить, насколько данные различия в скорости катализа характерны именно для реакции расщепления РНК, мы сравнили средние скорости элонгации транскрипции, а также скорости включения одного нуклеотида данными РНКП. Было установлено, что в обоих экспериментах скорость синтеза РНК РНКП D. radiodurans превосходит скорость синтеза РНК РНКП Е. соli не более чем в 2-3 раза. Таким образом, сравнительный анализ реакций расщепления РНК РНКП Е. соli и D. radiodurans, с привлечением имеющихся данных о трехмерной структуре элонгационного комплекса, открывает возможности для поиска структурных элементов активного центра РНКП, принимающих участие именно в расщеплении РНК, и поиска факторов, влияющих на скорость расщепления. Важно отметить, что данные РНКП имеют идентичную аминокислотную последовательность в участке связывания каталитических ионов Mg2+ (NADFDGD), поэтому различия в скорости расщепления РНК у этих ферментов должны определяться какими-то другими факторами и элементами структуры РНКП. В частности, данные различия могут определяться: различной эффективностью связывания каталитических ионов Mg2+ в активном центре; различиями в эффективности образования смещенного ЭК; особенностями контактов РНКП с РНК и ДНК в смещенном комплексе. 1.1. Измерение скоростей расщепления РНК РНКП Е. соli и D. radiodurans Известно, что в природных ЭК эффективность реакции расщепления РНК и длина отщепляемого фрагмента может быть различной, в зависимости от последовательности ДНК и РНК и дополнительных факторов. В данной работе для измерения точной скорости расщепления была использована специальная синтетическая матрица, состоящая из трех олигонуклеотидов: матричной цепи ДНК, нематричной цепи ДНК и РНК-затравки (рис. 2А). Как было показано ранее, ЭК, полученные с использованием синтетических олигонуклеотидов подобной структуры, не отличаются по своим свойствам от природных ЭК (Sosunov et al., 2005, Zenkin et al., 2006). РНК в составе матрицы, показанной на рис. 2А, подвергается расщеплению с достаточно большой скоростью (рис. 2Б), что позволяет использовать эту матрицу в качестве удобной модельной системы. При проведении эксперимента на первом этапе производили отжиг радиоактивно-меченой по 5′-концу 15 нт РНК-затравки на матричной ДНК-цепи, затем гибрид РНК-затравки и матричной цепи ДНК инкубировали в транскрипционном буфере, не содержащем ионов Mg2+, с кор-ферментом РНКП. На последнем этапе к полученному комплексу добавляли нематричную цепь ДНК. При добавлении к такому комплексу ионов Mg2+ РНКП способна расщеплять РНК с 3′конца, при этом образуется в основном 13 нт РНК-продукт, с отщеплением динуклеотидного 3′-концевого фрагмента (рис. 2Б). Это объясняется тем, что 3′концевой нуклеотид в +2 положении РНК в составе смещенного ЭК стимулирует гидролиз связи между +1 и -1 нуклеотидами за счет участия в координации иона MgII (Zenkin et al., 2006). 9 А Б В Рисунок 2. Исследование эндонуклеазной активности РНКП E. coli и D. radiodurans. (А) Схема матрицы, используемой для исследования расщепления РНК; отмечены основные компоненты, РНКП изображена в виде овала. РНК содержала радиоактивную метку в 5′-конце. Место расщепления РНК показано стрелкой. (Б) Электрофореграмма результата исследования эндонуклеазной активности РНКП E. coli. Расщепление в искусственном элонгационном комплексе запускали добавлением ионов Mg2+. Отобранные через разные промежутки времени аликвоты анализировали после разделения в ПААГ с помощью программного обеспечения ImageQuant и Grafit. Отмечены исходная 15 нт РНК и продукт реакции расщепления – 13 нт РНК. (В) Таблица со скоростями расщепления РНК РНКП Е. соli (Eco) и D. radiodurans (Dra) (приведены значения наблюдаемой константы скорости реакции kobs, измеренные при 37°С, 10 мМ MgCl2) и данными по эффективности связывания ионов магния (приведены значения Kd). Измерения скорости расщепления РНК проводили с использованием двух типов ЭК. Различия между ними заключались в наличии комплементарности между 3′концевым нуклеотидом РНК и матричной цепью ДНК. В случае элонгационного комплекса с неспаренным 3′-концом РНК (ЭК3′Н, рис. 2А) при сборке комплекса кор-фермент РНКП изначально оказывался смещен на один нуклеотид назад по матрице ДНК, в результате чего ЭК обладал высокой абсолютной скоростью расщепления РНК. Большинство экспериментов, описанных ниже, были проведены с использованием именно этого комплекса. Было установлено, что в ЭК такой структуры РНКП E. coli и D. radiodurans различаются по скорости расщепления РНК примерно в 20 раз (рис. 2В и 3В). Во втором случае, когда 3′-конец РНК был комплементарен матричной цепи ДНК (элонгационный комплекс со спаренным 3′концевым нуклеотидом РНК - ЭК3′С), скорость расщепления РНК для обеих РНКП была примерно в 40 раз ниже (рис. 3В). Однако, 20-ти кратные различия в скорости расщепления РНК между исследуемыми РНКП наблюдались вне зависимости от наличия комплементарности между 3′-концом РНК и матричной цепью ДНК. Одним из факторов, который может в значительной степени влиять на скорость расщепления, является эффективность связывания второго каталитического иона Mg2+ в активном центре РНКП в процессе расщепления (как было сказано выше, первый каталитический ион Mg2+ прочно связан с РНКП). Для выяснения возможной роли различий в связывании каталитических ионов в обнаруженных различиях в скоростях расщепления РНК у исследуемых РНКП были проведены измерения констант диссоциации (Kd) для связывания второго иона Mg2+ в 10 активном центре. С этой целью были измерены скорости расщепления РНК при различных концентрациях MgCl2 в диапазоне от 0,1 до 100 мМ и на основании зависимости скоростей реакции от концентрации магния были вычислены значения Kd (таблица на рис. 2В). Из полученных данных можно заключить, что РНКП D. radiodurans отличается от РНКП Е. соli по эффективности связывания ионов Mg2+, отраженной в значениях Kd, не более, чем в 2 раза, что может вносить лишь незначительный вклад в формирование различий в скоростях расщепления РНК между данными РНКП. Стоит отметить, что в данной работе при проведении большинства экспериментов по измерению скоростей расщепления РНК использовалась физиологическая концентрация MgCl2 10 мМ, которая примерно соответствует Kd для обеих исследуемых РНКП (такая же концентрация MgCl2 использовалась в большинстве опубликованных работ). Еще одним фактором, который мог бы являться причиной столь сильных различий между РНКП Е. соli и D. radiodurans в скорости расщепления РНК, могли бы стать различия в рН-оптимуме для работы фермента. рН реакционного буфера влияет на ионизацию аминокислотных остатков в активном центре РНКП и может изменять его способность координировать субстраты реакции в процессе расщепления. Как было показано ранее, реакция расщепления РНК РНКП E. coli значительно активируется при рН выше 8,5 (Orlova et al., 1995). Это позволяет предположить, что в случае РНКП D. radiodurans структура активного центра при физиологических значениях рН (значение рН 7,9, при котором было проведено большинство измерений скорости расщепления) могла бы соответствовать структуре активного центра РНКП E. coli при высоких значениях рН. Однако, проведенные эксперименты показали схожую рН-зависимость скоростей расщепления РНК для обеих исследуемых РНКП. Таким образом, РНКП Е. соli и D. radiodurans имеют сходные скорости синтеза РНК, но проявляют значительные различия в реакции расщепления РНК, которые не связаны с различиями в связывании каталитического иона MgII и рНзависимости реакции. Это позволяет искать районы РНКП, отвечающие за различия в скорости расщепления РНК и принимающие участие в катализе данной реакции. 1.2. Поиск районов, определяющих межвидовые различия в реакции расщепления РНК РНКП Е. соli и D. radiodurans Для поиска районов РНКП, принимающих участие в реакции расщепления РНК, был использован подход с получением мозаичных мутантов РНКП Е. соli с заменами отдельных участков РНКП на соответствующие последовательности D. radiodurans. Сравнение последовательностей РНКП Е. соli и D. radiodurans в районах, контактирующих с 3′-концом РНК в смещенном комплексе (по данным о трехмерной структуре комплекса РНКП II S. cerevisiae, рис. 1Б) выявило ряд аминокислотных замен, которые потенциально могут обусловливать различия в скорости расщепления РНК между РНКП Е. соli и D. radiodurans. Прежде всего, это замены в ключевых элементах активного центра, в том числе, в F-спирали (замена L783G) β′-субъединицы, районе β-1 β-субъединицы (замена P567А), G-петле и контактирующей с ней F-петле β′-субъединицы. Кроме того, были выявлены замены в участках lid (крышка) и rudder (шип) β′-субъединицы, которые контактируют с задней границей РНК-ДНК гибрида и также могли бы влиять на 11 А В Б Рисунок 3. G-петля – элемент РНКП, определяющий межвидовые различия в скорости расщепления РНК между РНКП Е. соli и D. radiodurans. (А) Выравнивание последовательностей G-петли и соседней α-спирали (курсивом, последние 9 аминокислот), подвергшихся замене. По краям выравниваний отмечены соответствующие номера аминокислот для данных РНКП. Зеленым цветом отмечены различающиеся аминокислотные остатки, присутствующие в данном положении у РНКП Е. соli, сиреневым – у РНКП D. radiodurans. Точкой показано место вставки SI3-петли, пунктир в данном месте обозначает отсутствие SI3-петли. Синим цветом отмечены границы делеций G-петли. (Б) Сравнение скоростей синтеза РНК мутантными РНКП. В эксперименте использовали матрицу, кодирующую транскрипт длиной 500 нт, скорость определяли по времени синтеза полноразмерной РНК. (В) Скорости реакции расщепления РНК для РНКП дикого типа и мутантных вариантов РНКП. Приведены абсолютные значения констант скорости (kobs, мин-1, выделены жирным шрифтом) и стандартные отклонения по 3 независимым измерениям и относительгные значения скорости по сравнению с РНКП Е. соli дикого типа. Измерения проводили при рН 7.9, 37°С, 10 мМ MgCl2. Во второй строке показаны схемы использованных матриц, черным цветом выделена матричная цепь ДНК, красным – РНК. эффективность расщепления за счет влияния на образование смещенного ЭК. Для изучения роли этих структурных различий в рамках данной работы были исследованы мутантные варианты РНКП Е. соli с точечными заменами L783G и P567А, а также с заменами элементов lid, rudder, F-спирали с F-петлей и G-петли на соответствующие элементы РНКП D. radiodurans. Измерения скоростей расщепления были проведены с использованием комплексов ЭК3′Н и ЭК3′С. Было обнаружено, что первые пять замен (L783G, 12 P567A, lid, rudder, F-спираль с F-петлей) не приводят к увеличению скорости расщепления РНК. В то же время, замена G-петли (РНКП «Есо-G-Dra») значительно ускоряет реакцию расщепления в обоих типах комплексов (в 7 и 13 раз в ЭК3′Н и ЭК3′С, соответственно) (рис. 3А и 3В). В результате, РНКП с заменой Gпетли оказывается всего в 1,5-3 раза медленнее в реакции расщепления, чем РНКП D. radiodurans. Стоит отметить, что в середине G-петли у РНКП Е. соli и родственных бактерий имеется вставка 188-аминокислотной SI3-петли, отсутствующая в РНКП других бактерий, в том числе в группе DeinococcusThermus. РНКП Есо-G-Dra также не содержала SI3 петли, поэтому в качестве контрольной РНКП был использован вариант РНКП Е. соli с делецией SI3-петли (Есо ∆SI3). Было показано, что само по себе удаление SI3-петли не приводит к заметным изменениям скорости катализа (рис. 3В). Для исследования роли отдельных аминокислотных остатков в наблюдаемом эффекте увеличения скорости расщепления РНК у РНКП Eco-G-Dra были получены точечные замены в G-петле РНКП Е. соli на соответствующие остатки D. radiodurans (I937T, G1136M, A1142I, D1143E, все РНКП не содержали SI3-петли). Было выяснено, что замена G1136M практически эквивалентна замене всей G-петли по степени ускорения реакции расщепления РНК (рис. 3В). Важно отметить, что скорости синтеза РНК для РНКП Есо ∆SI3, Eco-G-Dra, Есо G1136M практически совпадают с таковой для дикого типа РНКП Е. соli (рис. 3Б). Таким образом, замена G1136M в G-петле значительно ускоряет реакцию расщепления РНК, не влияя при этом на синтез РНК. Для проверки роли G-петли в катализе реакции расщепления РНК было исследовано влияние делеций G-петли в РНКП Е. соli и D. radiodurans (рис. 3А). В случае обеих РНКП скорость реакции расщепления значительно снижается, подтверждая важную роль G-петли в данной реакции (рис. 3В). Кроме того, были обнаружены два интересных эффекта. Во-первых, делеция G-петли приводит к уравниванию скоростей расщепления РНК между РНКП Е. соli и D. radiodurans в обоих типах ЭК (рис. 3В). Это еще раз подтверждает ключевую роль G-петли в формировании межвидовых различий в расщеплении РНК между данными РНКП. Во-вторых, делеции G-петли приводят к резкому уменьшению разницы в скоростях расщепления РНК в ЭК3′С и ЭК3′Н: в случае ферментов дикого типа она составляет 40 раз, а в случае РНКП с делециями G-петли 2 и 5 раз для РНКП D. radiodurans и Е. соli, соответственно. Более слабое влияние делеций G-петли на расщепление РНК в ЭК с комплементарным 3′-концом РНК может объясняться тем, что в этом случае лимитирующей стадией реакции является обратное смещение ЭК, которое предшествует расщеплению и не зависит от G-петли. Полученные результаты являются очень интересными в свете опубликованных ранее данных. В некоторых работах с использованием делеций в G-петле было показано, что G-петля не принимает участия в реакции расщепления РНК (Zhang et al., 2010), а в некоторых утверждалось обратное (Yuzenkova et al., 2010). Наши данные однозначно показывают, что G-петля играет важную роль в расщеплении РНК и способна определять межвидовые различия в данной реакции. Ранее было показано, что в расщеплении РНК РНКП T. aquaticus важную роль играет остаток гистидина 936 (нумерация Е. соli) в G-петле (Yuzenkova et al., 2010), отмеченный на рисунке 3А, однако, данный остаток абсолютно консервативен у всех исследуемых РНКП. В то же время, полученные данные показывают, что замены 13 неконсервативных остатков в G-петле также могут значительно влиять на расщепление РНК. В частности, в случае РНКП Е. соli и D. radiodurans различия в основном определяются заменой остатка в положении 1136. Можно предположить, что данная замена изменяет структуру G-петли или влияет на ее конформационные перестройки в процессе реакции. Кроме того, по существующим моделям (рис. 1Б) нельзя исключить, что данный остаток в случае РНКП D. radiodurans (и родственных ей РНКП T. aquaticus и T. thermophilus) может напрямую контактировать с отщепляемым фрагментом РНК, стимулируя реакцию. 1.3. Изучение влияния факторов GreA на реакцию расщепления РНК РНКполимеразами Е. соli и D. radiodurans и их мутантными вариантами Активность РНКП на разных стадиях транскрипции регулируется большим числом регуляторных факторов различной природы. Одной из наиболее интересных групп факторов являются факторы, которые способны непосредственно воздействовать на активный центр РНКП и изменять его каталитические свойства (рис. 4А). К таким белкам, осуществляющим регуляцию транскрипции у бактерий, относятся белки Gre, Gfh, DksA. Белки Gre – это небольшие белки (около 20 кДа), состоящие из двух доменов – глобулярного С-концевого и вытянутого N-концевого, представленного структурой из двух переплетенных α-спиралей (рис. 4Б). Согласно существующей модели действия Gre-белков, С-концевой домен фактора связывается с поверхностью РНКП в области вторичного канала, а N-концевой домен помещается внутрь вторичного канала таким образом, что консервативные остатки аспарагиновой и глутаминовой кислоты на его дистальном конце (рис. 4Б) могут взаимодействовать с активным центром РНКП, принимая участие в координировании второго каталитического иона MgII, и, таким образом, ускоряя реакцию расщепления РНК (см. схему на рис. 4А) (Sosunova et al., 2003). В геноме Е. соli закодированы два белка Gre: GreА и GreВ. GreА несколько слабее взаимодействует с РНКП и способствует отщеплению более коротких фрагментов с 3′-конца РНК, чем GreВ (Borukhov et al., 1993). В геноме большинства других бактерий, в частности, D. radiodurans, закодирован только один GreA-фактор. Важной задачей данной работы было сравнение влияния Gre-факторов на реакцию расщепления РНК РНКП Е. соli и D. radiodurans, так как данные факторы значительно стимулируют реакцию расщепления как in vitro, так и in vivo, в клетках бактерий. Оказалось, что GreA-фактор Е. соli не действует на РНКП D. radiodurans, и наоборот, поэтому дальнейшие исследования проводились с использованием соответствующих для каждой РНКП Gre-белков. Было обнаружено, что в присутствии GreA-белков РНКП Е. соli и D. radiodurans расщепляют РНК с одинаково высокой скоростью (рис. 4В). Наблюдаемая константа скорости (kobs) реакции расщепления РНК в присутствии GreA-белков составила порядка 15 с-1. Таким образом, GreA Е. соli ускоряет расщепление РНК намного сильнее (примерно в 2000 раз), чем GreA D. radiodurans (примерно в 100 раз). Это позволяет предположить, что для эффективной транскрипции необходим некоторый оптимальный уровень скорости расщепления, который в присутствии Gre-факторов оказывается одинаковым даже у РНКП филогенетически неродственных бактерий. В недавних работах было показано, что Gre-катализируемое расщепление РНК в случае РНКП Thermus aquaticus проходит без участия G-петли. В случае же РНКП 14 А Б В Г Рисунок 4. Расщепление РНК в присутствии Gre факторов. (А) Схема взаимодействия Greфактора с РНКП (из Opalka et al., 2006). РНКП обозначена оттенками серого цвета, ДНК - зеленым цветом (матричная цепь темно-зеленым, нематричная – светло-зеленым), РНК - красным цветом. В виде двух оранжевых цилиндров обозначен N-концевой домен Gre-фактора, находящийся во вторичном канале и координирующий ионы магния в активном центре РНКП. Оранжевыми кружками со стрелкой показан путь выхода отщепляемого 3′-конца РНК через вторичный канал РНКП. (Б) Структура GreВ фактора Е. соli (по Vassylyeva et al., 2007). Зеленым цветом показан Сконцевой глобулярный домен, оранжевым – N-концевой фибриллярный, на конце которого выделены консервативные остатки глутаминовой кислоты (показан фиолетовым цветом) и аспарагиновой кислоты (показан красным цветом). (В) Кинетика расщепления РНК РНКП Е. соli и D. radiodurans в присутствии соответствующих GreA-факторов в элонгационном комплексе с неспаренным 3′-концом РНК. Измерения проводили при рН 7.9, 30°С, 10 мМ MgCl2, 5 мкМ GreA на приборе для измерения быстрой кинетики. (Г) Электрофореграмма результатов эндонуклеолитической реакции РНКП Е. соli с делецией G-петли в присутствии Gre-факторов. 15 Е. соli наличие G-петли и входящей в ее состав SI3-петли считалось обязательным для катализируемого Gre-факторами расщепления РНК (Roghanian et. al., 2010; Zhang et al., 2010); однако, в данной работе проверялся только фактор GreВ. Поэтому было решено исследовать влияние обоих Gre-белков Е. соli на РНКП с делециями и заменами в районе G-петли. Было обнаружено, что даже при делеции всей G-петли, а также при делеции SI3-петли (РНКП Eco ∆SI3) и при замене Gпетли (РНКП Eco-G-Dra), GreA-фактор Е. соli способен стимулировать реакцию расщепления РНК (хотя и в меньшей степени, чем в случае РНКП дикого типа), в отличие от фактора GreВ (рис. 4Г). Таким образом, структурно похожие Gre факторы Е. соli по-разному взаимодействуют с РНКП, и для действия GreA не требуется наличия G-петли. 2. Исследование особенностей реакции расщепления РНК РНКполимеразой T. aquaticus по сравнению с РНК-полимеразой D. radiodurans Проведенные эксперименты позволили выявить причины различий в скоростях расщепления РНК между далеко отстоящими друг от друга по филогенетическому родству бактериями D. radiodurans и Е. соli. В то же время, у родственных бактерий родов Deinicoccus и Thermus, для которых характерна повышенная скорость расщепления РНК, также имеются различия в каталитических свойствах, которые в данном случае связаны не с различающимся механизмом реакции, а с различной температурной адаптацией данных бактерий. T. aquaticus и T. thermophilus являются термофильными бактериями, и температурные оптимумы их РНКП составляют 5570°С. В то же время, D. radiodurans является мезофильным микроорганизмом с температурным оптимумом работы РНКП около 30°С. Мы показали, что при достаточно низких температурах (в частности, 20°С) РНКП D. radiodurans осуществляет катализ расщепления РНК на порядок быстрее, чем РНКП T. aquaticus, в то время как при повышении температуры данные различия исчезают (рис. 5Б). Еще более сильные различия между данными РНКП, связанные с температурной адаптацией, были обнаружены ранее при исследовании реакции синтеза РНК (Miropolskaya et al., 2009). Вероятно, подобная «холодочувствительность» катализа термофильным ферментом объясняется повышенной жесткостью его структуры, связанной с адаптацией к высоким температурам (Miropolskaya et al., 2009). Стоит отметить, что РНКП D. radiodurans и T. aquaticus имеют сходную структуру G-петли и, как было показано, замена Gпетли в РНКП T. aquaticus на соответствующую последовательность РНКП D. radiodurans не приводит к увеличению скорости катализа (Miropolskaya et al., 2009). В то же время, замены в расположенной рядом F-петле (рис. 1А, рис. 5А) приводят к увеличению скорости синтеза РНК РНКП T. aquaticus при низких температурах. Таким образом, F-петля отвечает за температурную адаптацию в реакции синтеза РНК, вероятно, способствуя сворачиванию G-петли при присоединении нуклеотидов (Miropolskaya et. al., 2009). Для изучения влияния F-петли на расщепление РНК в данной работе было исследовано влияние замены F-петли в РНКП T. aquaticus на F-петлю D. radiodurans (в сумме 8 аминокислотных замен). Было обнаружено, что РНКП TaqF-Dra при низких температурах не отличается по скорости расщепления РНК от РНКП D. radiodurans дикого типа (рис. 5Б). Важная роль F-петли в расщеплении РНК была подтверждена при исследовании расщепления РНК у РНКП T. aquaticus с 16 А Б Рисунок 5. F-петля β′-субъединицы РНКП определяет межвидовые различия в скорости расщепления РНК между РНКП T. aquaticus и D. radiodurans. (А) Выравнивание аминокислотных последовательностей F-петли T. aquaticus и D. radiodurans, обозначены номера пограничных аминокислотных остатков, цветом выделены различающиеся аминокислотные остатки. Синим отмечено место делеции F-петли в РНКП T. aquaticus. (Б) Скорости реакции расщепления РНК для РНК-полимераз T. aquaticus и D. radiodurans и гибридного варианта РНКП T. aquaticus с F-петлей D. radiodurans. Приведены абсолютные значения констант скорости (kobs, мин-1) с указанием стандартных отклонений по 3 независимым измерениям при двух температурах. Измерения проводили при рН 7.9, 10 мМ MgCl2. делецией F-петли. Было показано, что данная делеция замедляет расщепление РНК в 25 раз при 40°С относительно фермента T. aquaticus дикого типа. При этом делеция G-петли (границы соответствуют представленным на рисунке 3А) замедляет расщепление РНК в 2000 раз при относительно фермента дикого типа, а совместная делеция F-петли и G-петли – в 1500 раз. Таким образом, F-петля влияет на скорость расщепления РНК только в присутствии G-петли. На основе этих данных можно предположить, что механизм действия F-петли в данном случае также обусловлен влиянием на конформационные перестройки G-петли в ходе катализа (согласно структурным данным, F-петля способна непосредственно контактировать с G-петлей, см. рис. 1). Таким образом, F-петля является ключевым элементом температурной адаптации у РНКП близкородственных видов T. aquaticus и D. radiodurans не только в реакции синтеза, но и в расщеплении РНК. 3. Механизмы регуляции транскрипции РНК-полимеразы T. thermophilus белком gp39 бактериофага Р23-45 Работа РНКП регулируется большим количеством факторов различной природы. Помимо клеточных регуляторных белков модулировать активность РНКП могут также и белки фагов, изменяя профиль транскрипции генов зараженной клетки. Примерами хорошо изученных фаговых белков, влияющих на активность бактериальной РНКП, могут служить белки N и Q фага λ (Santangelo and Artsimovitch, 2011), анти-сигма фактор AsiA фага Т4 (Orsini et al., 1993), белок Gp2 фага Т7 (Nechaev et al., 2003) и многие другие. Недавно был идентифицирован 17 белок gp39 бактериофага Р23-45 T. thermophilus, способный связываться с хозяйской РНКП зараженных клеток (Minakhin et al, 2008; Berdygulova et al., 2011). Как было показано, gp39 является продуктом среднего гена и мог бы регулировать транскрипцию как с хозяйских промоторов, так и с фаговых промоторов разных временных классов. Предварительные эксперименты показали, что белок gp39 может влиять на эффективность инициации и терминации, осуществляемых РНКП T. thermophilus. Данное обстоятельство крайне интересно в свете того, что большинство изученных белков-регуляторов транскрипции действуют главным образом только на одну из стадий транскрипции (инициацию, элонгацию или терминацию). Кроме того, данный белок является первым известным фаговым регулятором активности РНКП термофильной бактерии T. thermophilus, для которой известна структура элонгационного комплекса, что может быть использовано для структурного анализа механизма его действия. 3.1. Анализ механизма подавления инициации транскрипции белком gp39 фага P23-45 Исследование механизма влияния белка gp39 на инициацию транскрипции включало в себя определение эффективности действия данного белка на разных классах промоторов, а также поиск места связывания белка gp39. При исследовании инициации транскрипции проводили эксперименты по абортивному синтезу РНК, в которых к промоторному комплексу РНКП добавляли ограниченный набор субстратов, вследствие чего происходил многораундовый синтез только коротких РНК-продуктов. Исследования были проведены с использованием модельных промоторов Т7А1 (содержит -10 и -35 элементы) и galP1 (содержит -10 и TG элементы) (рис. 6А). Субстратами являлись динуклеотидный РНК-праймер СрА, соответствующий -1 и +1 положениям промотора относительно старта транскрипции на обоих промоторах, и радиоактивно-меченый нуклеотид UTP, соответствующий +2 положению промотора. В результате синтезировался радиоактивно-меченый тринуклеотид СрАрU (рис. 6А и Б). Проведенный анализ абортивной транскрипции с разных промоторов показал, что белок gp39 полностью подавляет транскрипцию на промоторах, содержащих 35 элемент (-10/-35 класс, промотор Т7А1). В то же время, на промоторы с удлиненной -10 областью с дополнительным TG-элементом gp39 практически не действует (промотор galP1). Результаты по титрованию белка gp39 на обоих типах промоторов приведены на рисунке 6Б. Это согласуется с данными о том, что gp39 намного слабее влияет на транскрипцию со средних и поздних промоторов фага P23-45, которые в большинстве принадлежат к классу с удлиненным -10 элементом (Berdygulova et al., 2011). Следующей задачей было выявление сайта связывания gp39 с молекулой РНКП. Было обнаружено, что gp39 подавляет абортивную транскрипцию у РНКП родственных бактерий T. thermophilus, T. aquaticus и D. radiodurans, но не влияет на РНКП Е. соli. Проведенные нашими коллегами предварительные эксперименты с использованием набора делеционных вариантов РНКП T. thermophilus позволили предположить, что gp39 взаимодействует с районом flap (заслонка) β-субъединицы. Однако делеции важных участков РНКП могут изменять структуру и других районов. В связи с этим, для подтверждения и точного картирования места связывания белка gp39 в ходе данной работы были получены РНКП Е. соli с 18 А Б Г В Рисунок 6. Влияние белка gp39 на РНКП T. thermophilus на стадии инициации транскрипции. (А) Последовательность промоторов, использованных в работе. Отмечены основные промоторные элементы, старт транскрипции обозначен сиреневым цветом. Показаны субстраты реакции – РНКпраймер СрА и U, звездочка отмечает наличие радиоактивной метки. (Б) Эффективность подавления инициации транскрипции РНКП T. thermophilus повышающимися концентрациями белка gp39 на разных промоторах при 55°С. (В) Влияние порядка добавления белка gp39 на эффективность подавления инициации транскрипции различными РНКП. Реакция проводилась на промоторе Т7А1 при 55°С (РНКП T. thermophilus) и 37°С (РНКП Е. соli и мозаичные РНКП). Порядок добавления компонентов обозначен треугольными стрелками (стрелка от gp39 к промотору обозначает, что gp39 добавлялся перед промотором, и наоборот). (Г) Модель ЭК РНКП T. thermophilus с обозначением места связывания белка gp39. Flap-элемент показан темно-зеленым цветом. Место связывания белка gp39 отмечено красным кругом. РНК в составе ЭК показана красным цветом. β-субъединица светло-сиреневая, β'-субъединица – светло-зеленая. заменой всего элемента flap на соответствующую последовательность РНКП T. thermophilus (Eco-flap-Tth), а также мутантные РНКП с более короткими делециями и аминокислотными заменами (делецией SI2 петли и заменой аминокислот 723-740 в β-субъединице РНКП Е. соli на соответствующую последовательность РНКП T. thermophilus, нумерация для T. thermophilus). На рисунке 6В приведены данные по влиянию белка gp39 на абортивный синтез, осуществляемый разными РНКП. Было показано, что gp39 полностью подавляет инициацию транскрипции РНКП Eco-flapTth (рис. 6В). Изучение роли отдельных аминокислотных остатков в домене flap показало, что замена D725W (нумерация T. thermophilus) делает гибридную РНКП Eco-flap-Tth полностью устойчивой к действию gp39, не влияя при этом на активность РНКП. Таким образом, домен flap является основной функциональной 19 мишенью для действия белка gp39, а остаток D725, вероятно, непосредственно входит в участок связывания белка gp39. Для изучения механизма действия белка gp39 на инициацию транскрипции были проведены эксперименты с разным порядком добавления компонентов при образовании промоторного комплекса. Было обнаружено, что в случае РНКП T. thermophilus ингибирование инициации транскрипции происходит одинаково хорошо независимо от того, добавляется ли gp39 до или после промотора (рис. 6В). Однако, в случае РНКП Eco-flap-Tth ингибирование происходит только если gp39 добавляется в реакционную смесь до промотора. Это позволяет предположить, что gp39 препятствует связыванию РНКП с промотором, но не действует на уже сформированные промоторные комплексы. Различия в действии gp39 на активность разных РНКП, по-видимому, объясняются тем, что промоторные комплексы РНКП Eco-flap-Tth, как и РНКП Е. соli дикого типа, гораздо стабильнее промоторных комплексов T. thermophilus, которые быстро диссоциируют и находятся в равновесии со свободной ДНК и РНКП. В результате в случае РНКП T. thermophilus gp39 успевает подействовать, даже если добавлен после промоторной ДНК. Таким образом, gp39 ингибирует образование промоторного комплекса РНКП на промоторах, содержащих -35 элемент, взаимодействуя с доменом flap βсубъединицы РНКП. Данный домен РНКП в промоторном комплексе взаимодействует с районом 4 σ-субъединицы, который непосредственно узнает -35 промоторный элемент (Kuznedelov et al, 2002). Таким образом, белок gp39, вероятно, может нарушать взаимодействия РНКП c -35 элементом, изменяя конформацию домена flap и района 4 σ-субъединицы и/или нарушая взаимодействия домена flap и района 4 σ-субъединицы. 3.2. Механизм действия белка gp39 на стадиях элонгации и терминации транскрипции В ЭК домен flap β-субъединицы формирует наряду с другими консервативными доменами РНКП канал выхода РНК и принимает участие в регуляции элонгации и в терминации транскрипции. В связи с этим, на следующей стадии работы было исследовано действие белка gp39 на синтез РНК на стадии элонгации транскрипции, а также на терминацию транскрипции РНКП T. thermophilus. В тесте по измерению средней скорости синтеза РНК было показано, что белок gp39 существенно ускоряет элонгацию транскрипции РНКП T. thermophilus (рис. 7А). В то же время, измерения скоростей катализа с использованием искусственных ЭК различной структуры показали, что gp39 не влияет непосредственно на скорость включения нуклеотидов в активном центре, а также на скорость расщепления РНК. Таким образом, можно предположить, что ускорение элонгации объясняется влиянием белка gp39 на прохождение транскрипционных пауз. Действительно, анализ кинетики образования пауз в процессе элонгации показывает, что продолжительность пауз существенно снижается в присутствии gp39 (положение некоторых пауз на исследуемой матрице отмечено на рис. 7А звездочками). Следующей задачей работы было исследование действия белка gp39 на терминацию транскрипции. Процессы терминации у бактерий подразделяются на два класса: фактор-независимую и фактор-зависимую терминацию. Факторнезависимая терминация происходит в специальных местах матрицы в результате образования РНК вторичной структуры в виде G-C богатой шпильки, за которой 20 А Б Рисунок 7. Влияние белка gp39 на элонгацию и терминацию транскрипции. (А) Влияние белка gp39 на скорость элонгации РНКП T. thermophilus. Стрелками обозначены стартовый 26 нт РНКпродукт, синтезируемый в отсутствие СТР и gp39, и полноразмерный РНК-продукт. После получения ЭК, остановленного в +26 положении, пробы инкубировали 2 минуты с белком gp39 (или в его отсутствие), после чего дальнейший синтез запускали добавлением всех 4 нуклеотидов. Положение некоторых транскрипционных пауз, исчезающих в присутствии gp39, отмечено звездочками. (Б) Терминация РНКП T. thermophilus в присутствии повышающейся концентрации белка gp39 на tR2-терминаторе (структура терминатора приведена справа) фага λ в зависимости от наличия NusA. Схема используемой матрицы приведена сверху, отмечены ее основные элементы; синтез РНК осуществляли в 2 этапа – сначала в отсутствие U получали элонгационный комплекс, остановленный в +20-положении, к которому добавляли различные сочетания транскрипционных факторов, после чего запускали синтез полноразмерных продуктов добавлением всех 4 нуклеотидов. На электрофореграмме хорошо видно 2 полосы (нижняя соответствует остановке транскрипции в месте терминатора, верхняя – полноразмерному транскрипту, который синтезируется в результате антитерминации), соотношение между которыми изменяется с повышением концентрации белка gp39 вне зависимости от наличия фактора NusA. следует U-богатая последовательность (рис. 7Б). Фактор-зависимая терминация требует участия специальных терминационных факторов, таких как Rho или Mfd, и гораздо меньше зависит от специфической нуклеотидной последовательности матрицы. Оказалось, что белок gp39 подавляет терминацию РНКП T. thermophilus на различных фактор-независимых терминаторах (как клеточных, так и фаговых) и, таким образом, является антитерминатором транскрипции. В эксперименте, 21 приведенном на рис. 7Б, видно, что действие gp39 проявляется уже при достаточно низких концентрациях белка, сопоставимых с концентрацией РНКП в наших экспериментах (0,1 мкМ), а при высоких концентрациях gp39 терминация практически полностью подавляется и происходит синтез полноразмерной РНК. Регуляция экспрессии генов с помощью антитерминации – достаточно распространенный процесс, который обнаружен как у бактерий, так и у бактериофагов. Классическими антитерминаторными белками являются белки N и Q фага λ, а также фактор RfaH E. coli. Следует сказать, что белки N и Q, как и белок gp39, взаимодействуют с доменом flap РНКП. Антитерминационный эффект этих белков усиливается в присутствии клеточного транскрипционного фактора NusA, который сам по себе усиливает терминацию на многих клеточных терминаторах (Santangelo and Artsimovitch, 2011). Так как белок NusA связывается в районе элемента flap, было исследовано наличие кооперативного действия данного фактора с белком gp39. На рис. 7Б приведен результат такого эксперимента, где видно, что белок NusA T. thermophilus усиливает терминацию транскрипции в отсутствие белка gp39. В то же время, gp39 способен подавлять терминацию со сравнимой эффективностью независимо от присутствия NusA. Таким образом, белок gp39 является новым высокоэффективным антитерминатором транскрипции, действие которого не требует участия дополнительных клеточных факторов. Вероятно, антитерминационная активность gp39 объясняется его способностью подавлять паузы транскрипции. В процессе терминации происходит временная остановка РНКП на U-богатой последовательности терминатора, что позволяет сформироваться терминаторной шпильке в составе РНК. В присутствии gp39 эффективность формирования паузы уменьшается, что стимулирует сквозное прочитывание терминатора и синтез полноразмерного продукта. Кроме того, возможным механизмом действия gp39 может являться изменение контактов между flap-доменом и терминационной РНКшпилькой, что может нарушать последующие конформационные изменения, необходимые для успешной терминации. В целом, полученные результаты показывают, что белок gp39, кодируемый фагом P23-45, регулирует все стадии транскрипции – инициацию, элонгацию и терминацию транскрипции и связывается с flap-доменом β субъединицы РНКП, причем участок его связывания располагается в ранее не охарактеризованном месте этого домена (рис. 6Г). Идентифицированный сайт связывания белка gp39 позволяет объяснить, как он может влиять на все стадии транскрипции. Домен flap связывает район 4 σ-субъединицы, участвующий в узнавании промоторов, а также формирует канал выхода РНК и непосредственно может влиять на эффективность пауз и терминации транскрипции. Стоит отметить, что с доменом flap также взаимодействуют многие другие клеточные и фаговые регуляторные белки, что делает этот домен одним из основных регуляторных участков РНКП. Таким образом, gp39 является уникальным фаговым белком, влияющим на все стадии транскрипции, осуществляемой хозяйской РНКП. Взаимодействие gp39 с РНКП бактерий рода Thermus делает его привлекательным кандидатом для кокристаллизации с данной РНКП с целью изучения механизмов регуляции транскрипции. 22 ВЫВОДЫ 1. РНК-полимераза D. radiodurans обладает большей скоростью расщепления РНК, чем РНК-полимераза E. coli, но незначительно отличается от нее по скорости синтеза РНК. Наблюдаемые различия в скоростях расщепления не связаны с различиями в связывании каталитических ионов магния и рНзависимости реакции у данных РНК-полимераз. 2. G-петля в активном центре РНК-полимеразы играет важную роль в реакции расщепления РНК РНК-полимеразами E. coli и D. radiodurans. Межвидовые различия в скоростях расщепления РНК между данными РНК-полимеразами в основном определяются заменой единичного аминокислотного остатка в Gпетле (в положении 1136 по нумерации E. coli). 3. GreА-факторы стимулируют расщепление РНК РНК-полимеразами E. coli и D. radiodurans до одинакового уровня и являются специфичными по отношению к своим РНК-полимеразам. 4. F-петля играет важную роль в реакции расщепления РНК с участием G-петли и определяет различия в скоростях расщепления РНК РНК-полимеразами D. radiodurans и T. aquaticus. 5. Белок gp39 фага Р23-45 связывается с flap-доменом β-субъединицы РНКполимеразы T. thermophilus и подавляет инициацию транскрипции на промоторах, содержащих -35 элемент, препятствуя формированию открытого промоторного комплекса. 6. Белок gp39 фага Р23-45 ускоряет элонгацию транскрипции за счет подавления пауз в процессе синтеза РНК и снижает эффективность терминации. 23 СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ Статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ: 1. Zhilina E., Esyunina D., Brodolin K., Kulbachinskiy A. Structural transitions in the transcription elongation complexes of bacterial RNA polymerase during sigma-dependent pausing. // Nucleic Acids Research. 2012. V. 40. Р. 3078-3091. 2. Berdygulova Z.*, Esyunina D.*, Miropolskaya N., Mukhamedyarov D., Kuznedelov K., Nickels B.E., Severinov K., Kulbachinskiy A., Minakhin L. A novel phage-encoded transcription antiterminator acts by suppressing bacterial RNA polymerase pausing. // Nucleic Acids Research. 2012. V. 40. Р. 4052-4063. * - совместное первое авторство. 3. Pupov D.*, Esyunina D.*, Feklistov A., Kulbachinskiy A. Single-strand promoter traps for bacterial RNA polymerase. // Biochemical Journal. 2013. V. 452. Р. 241-248. * совместное первое авторство. Тезисы всероссийских и международных конференций: 1. Esyunina D., Kulbachinskiy A. The trigger loop in the RNA polymerasse active center determines species-specific differences in the RNA cleavage reaction. // FASEB conference Mechanism and Regulation of Prokaryotic Transcription. Saxton River (VT, USA). 2013. Р. A19. 2. Есюнина Д. М., Кульбачинский А. В. G-петля в активном центре бактериальной РНК-полимеразы определяет межвидовые различия в реакции расщепления РНК.// 17 международная пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века». Пущино (Россия). 2013.С. 194. 3. Есюнина Д. М., Пупов Д.В., Кульбачинский А. В. Необычные свойства РНКполимеразы Deinococcus radiodurans. // 16 международная пущинская школаконференция молодых ученых «Биология – наука XXI века». Пущино (Россия). 2012. С. 105. 4. Esyunina D.M., Miropolskaya N.A., Minakhin L.S., Kulbachinskiy A.V. Gp39, a novel phage-encoded inhibitor of bacterial RNA polymerase. // International conference of postgenomic technology for biomedicine. Novosibirsk (Russia). 2012. Р. 85. 5. Esyunina D., Miropolskaya N., Bass I., Klimasauskas S., Kulbachinskiy A. Interplay between the trigger loop and the f loop in the RNA polymerase active center during nucleotide addition and RNA cleavage. // The 73rd Harden Conference Machines on genes II – the central dogma at the interface of biology, chemistry and physic. Oxford (England, UK). 2012. Р. 39. 6. Есюнина Д.М., Кульбачинский А. В. Получение и функциональная характеристика рекомбинантной РНК-полимеразы Deinococcus radiodurans. // V Российский симпозиум «Белки и пептиды». Петрозаводск (Россия). 2011. С. 300. 7. Есюнина Д. М., Миропольская Н. А., Минахин Л. С., Кульбачинский А. В. Новый фактор антитерминации транскрипции, действующий на РНК-полимеразу термофильных бактерий. // X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова. Москва (Россия). 2011. С. 24. 24 Подписано в печать 01.11.2013 г. Печать трафаретная Усл.п.л. – 1,5 Заказ № 3972 Тираж: 90 экз. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.avtoreferat.ru
