Брошюра (0.71Мб)

ТКАНЕВОЕ ТИПИРОВАНИЕ
И ДИАГНОСТИКА МУТАЦИЙ
на генетических анализаторах
HLA-секвенирование • Фрагментный анализ MLPA
ГРУППА КОМПАНИЙ
«БИОХИММАК»
2012
Технология секвенирования ДНК
В последнее время секвенирование ДНК приобретает все большее применение не только в научных исследованиях, но и в клинической диагностике. Метод секвенирования представляет собой процесс установления первичной последовательности нуклеотидов в цепочке ДНК.
Наиболее широкое использование нашел способ секвенирования
ДНК по Сэнгеру. Для выполнения этого метода используются автоматические генетические анализаторы (секвенаторы), работающие по принципу капиллярного электрофореза нуклеиновых
кислот. Сущность метода заключается в том, что при постановке
реакции амплификации (секвенирующая ПЦР) помимо обычных
нуклеотидов используются дидезоксинуклеозидтрифосфаты
(ddNTP), меченные флуорохромными красителями. Такие ddNTP
называются еще «терминаторами», так как при включении их в
растущую цепь ДНК в процессе ПЦР они приводят к обрыву амплифицирующейся цепочки.
При прохождении фрагментов через датчик считывающего
устройства прибора луч лазера возбуждает флуоресценцию красителей, и детектор определяет, какой «терминатор» в настоящий
момент мигрирует через гель. Так как при капиллярном электрофорезе все фрагменты ДНК выстраиваются строго в соответствии
со своей длиной (молекулярной массой), то не сложно определить точную последовательность нуклеотидов в анализируемом
образце ДНК.
В результате постановки секвенирующей ПЦР в присутствии
ddNTP получается огромное количество фрагментов ДНК различной длины, каждый из которых заканчивается «терминатором» с
флуорохромной меткой, соответствующей определенному азотистому основанию одного из четырех нуклеотидов (аденину, гуанину, тимину или цитозину). После завершения секвенирующей
ПЦР образцы загружаются в секвенатор и производится их автоматический электрофорез в капиллярах прибора, заполненных
специальным полимером.
HLA-генотипирование методом секвенирования
Полиморфизм генов HLA-комплекса обусловлен существованием
в человеческой популяции огромного разнообразия аллельных
вариантов этих генов. Различные аллели отличается друг от друга
определенным количеством нуклеотидных замен в гене того или
иного локуса HLA. Во всех прочих генетических методах HLA-типирования для определения различных аллельных вариантов
генов комплекса гистосовместимости используют либо уникальные праймеры в реакции ПЦР, либо олигонуклеотидные зонды в
реакции гибридизации. Метод секвенирования ДНК позволяет
напрямую определить первичную последовательность типируемого гена того или иного локуса HLA.
Наборы SeCore
Для осуществления данной методики HLA-типирования компания
«БиоХимМак» предлагает наборы SeCore® HLA SBT Kits (Life Technologies) для определения HLA-генотипа по локусам A, B, Cw,
DRB1, DQB1 и DPB1. Наборы существуют в двух форматах: классический (на 25 и 500 тестов) и скрининговый экспресс-набор
(на 1536 тестов). Каждый набор состоит из двух компонентов: преПЦР и пост-ПЦР.
Принцип метода
Секвенирование генов HLA, в отличие от других методов HLAгенотипирования, позволяет проводить определение аллельных
вариантов путем прямого сравнения первичных последовательностей нуклеотидов в цепочке ДНК анализируемого образца с
консенсусной последовательностью нуклеотидов в соответствующем гене HLA в базе данных.
Преимущества метода
HLA-типирование методом секвенирования ДНК дает возможность проводить анализ на среднем и высоком разрешении с
использованием минимальных количеств ДНК (всего 2-5 мкл ДНК
с концентрацией 15-30 нг/мкл для типирования по одному
локусу).
Области применения
•
•
•
•
2
трансплантология
онкогематология
создание регистров доноров костного мозга
популяционные научные исследования
Комплект пре-ПЦР реагентов включает в себя:
• смесь для постановки локус-специфической ПЦР (AmpMix)
• FastStartTM Taq DNA полимеразу
Комплект пост-ПЦР реагентов включает в себя:
• ExoSap-ITТМдля очистки продуктов ПЦР
• набор смесей для постановки секвенирующей ПЦР (SeqMix),
содержащих секвенирующие праймеры, нуклеотиды, BigDye
терминаторы и термостабильную секвеназу
• PPT буфер для преципитации ДНК
Группа компаний «БиоХимМак». 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова
Необходимое оборудование
Для постановки HLA-типирования с наборами SeCore® потребуется следующее оборудование:
• 96-луночный амплификатор (термоциклер) с нагреваемой крышкой
(например, VeritiTM Thermal Cycler, Applied Biosystems)
• автоматический генетический анализатор (секвенатор) (например,
ABI 3100, 3730 или 3500 Series Genetic Analyzer, Applied Biosystems)
• настольная центрифуга с адаптерами для 96-луночных планшетов
• оборудование для гелевого электрофореза ДНК
• ПЦР-бокс
Этапы выполнения методики
Процесс HLA-типирования методом секвенирования ДНК состоит из
следующих этапов:
• выделение геномной ДНК
• постановка локус-специфической ПЦР
• очистка продуктов ПЦР с использованием
ферментного реагента ExoSap-ITТМ
• постановка секвенирующей ПЦР
• очистка продуктов ПЦР
• проведение капиллярного электрофореза
(секвенирование)
• анализ полученных данных и интерпретация результатов
Вся процедура анализа, включая капиллярный электрофорез образцов на секвенаторе, занимает около 18 часов.
Программное обеспечение uTYPE®
Обработку полученных результатов секвенирования ДНК проводят с использованием программы интерпретации данных uTYPE®
HLA Analysis Software.
• программа имеет дружественный интерфейс, все окна главного
экрана легко изменяются в размере для максимального удобства пользователя
В данном программном продукте реализованы сложные алгоритмы обработки информации, которые с использованием интуитивного анализа позволяют облегчить интерпретацию данных
секвенирования и с легкостью получить окончательные результаты типирования.
Особенности программы uTYPE® HLA Analysis Software:
• программа регулярно (ежеквартально) обновляется в соответствии с актуальными базами международной системы IMGT/
HLA Database
• коды базы данных IMGT и национальной программы доноров
костного мозга (NMDP) встроены в программу и могут быть
просмотрены одновременно с данными секвенирования
• инструменты поиска, навигации и выравнивания аллельных
последовательностей удобно организованы и позволяют с легкостью проводить анализ
Информация для заказа
Кат.
номер
Наименование
продукта
Количество реакций
амплификации
Количество секвенирующих
реакций (области секвенирования)
Кол-во
тестов
5300025
SeCore® A Locus
Sequencing Kit
1 реакция
(Single Amplification System)
6 реакций
(экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev, экзон 4 – Fwd/Rev)
25
5310025
SeCore® B Locus
Sequencing Kit
2 реакции
(Group Specific Set)
6 реакций
(экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev, экзон 4 – Fwd/Rev)
25
5311025D
SeCore® B Locus
Sequencing Kit
1 реакция
(Single Amplification System)
6 реакций
(экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev, экзон 4 – Fwd/Rev)
25
5320025
SeCore® Cw Locus
Sequencing Kit
1 реакция
(Single Amplification System)
6 реакций
(экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev, экзон 4 – Fwd/Rev)
25
Наборы для секвенирования HLA класса I (25 тестов)
Тел.: (495) 647-2740, 932-9214, 939-2421, e-mail:info@biochemmack.ru, www.biochemmack.ru
3
Кат. номер
Наименование
продукта
Количество реакций
амплификации
Количество секвенирующих
реакций (области секвенирования)
Кол-во тестов
Наборы для секвенирования по HLA класса II (25 тестов)
SeCore® DRB1 Locus
Sequencing Kit
1 реакция
(Single Amplification System)
3 реакции
(экзон 2 – Fwd/Rev, кодон 86 – Rev)
25
SeCore® DRB1, DRB3, 4
& 5 Locus Sequencing Kit
11 реакций
(Group Specific Set)
3 реакции
(экзон 2 – Fwd/Rev,кодон 86 – Rev)
25
5341025D
SeCore® DQB1 Locus
Sequencing Kit
2 реакции
(экзон 2, экзон 3)
4 реакции
(экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev)
25
5351025
SeCore® DPB1 Locus
Sequencing Kit CE
2 реакции
(экзон 2,
экзоны 3 и 4)
8 реакций
(экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev,
экзон 4 – Fwd/Rev, кодон 8 – Fwd,
кодон 85 – Rev)
25
5330025
5331025
Наборы для секвенирования HLA класса I (500 тестов)
22000D
SeCore® A Locus
Sequencing Kit CE
1 реакция
(Single Amplification System)
6 реакций
(экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev,
экзон 4 – Fwd/Rev)
500
22110D
SeCore® B Locus
Sequencing Kit
2 реакции
(Group Specific Set)
6 реакций
(экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev,
экзон 4 – Fwd/Rev)
500
22200D
SeCore® Locus
Sequencing Kit
1 реакция
(Single Amplification System)
6 реакций
(экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev,
экзон 4 – Fwd/Rev)
500
Наборы для секвенирования по HLA класса II (500 тестов)
22300D
SeCore® DRB1 Locus
Sequencing Kit
1 реакция
(Single Amplification System)
3 реакции
(экзон 2 – Fwd/Rev, кодон 86 – Rev)
500
22410D
SeCore® DQB1 Locus
Sequencing Kit
2 реакции
(экзон 2, экзон 3)
4 реакции
(экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev)
500
22510D
SeCore® DPB1 Locus
Sequencing Kit
2 реакции
(экзон 2, экзоны 3 и 4)
8 реакций
(экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev,
экзон 4 – Fwd/Rev, кодон 8 – Fwd,
кодон 85 – Rev)
500
Скрининговые эксресс-наборы
A11310
SeCore® Express A
Locus (CE)
1 реакция
(Single Amplification System)
4 реакции
(экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev)
1536
A11311
SeCore® Express B
Locus (CE)
1 реакция
(Single Amplification System)
4 реакции
(экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev)
1536
A11312
SeCore® Express Cw
Locus (CE)
1 реакция
(Single Amplification System)
4 реакции
(экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev)
1536
A11313
SeCore® Express DRB1
Locus (CE)
1 реакция
(Single Amplification System)
3 реакции
(экзон 2 – Fwd/Rev, кодон 86 – Rev)
1536
A11528
SeCore® Express DQB1
Locus (CE)
1 реакция
(Single Amplification System)
4 реакции
(экзон 2 – Fwd/Rev, экзон 3 – Fwd/Rev)
1536
Наборы для разрешения неоднозначностей (GSSP)
A11256ZXX
SeCore® GSSP Kit ZXX
-
1 реакция
25
Программное обеспечение
4
539991
Программа для интерпретации результатов uTYPE® HLA Analysis Software
53999100
Обновление библиотеки uTYPE® HLA Allele Library Updates
Группа компаний «БиоХимМак». 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова
Фрагментный анализ MLPA
MLPA-анализ является методом выбора для одновременного
определения ряда мутаций связанных с тем или иным генетическим заболеванием. Технология MLPA представляет собой мультиплексную лигазно-зависимую амплификацию зондов (от англ.
Multiplex ligation-dependent probe amplification – MLPA). Данный
метод представляет собой разновидность мультиплексной ПЦР,
в результате которой амплифицируются несколько различных мишеней только c одной праймерной пары.
Принцип метода
Каждый зонд состоит из двух олигонуклеотидов, которые узнают
сходные участки ДНК. Один из олигонуклеотидов зонда содержит
участок, узнаваемый прямым праймером, второй – обратным.
После того как оба олигонуклеотида зонда гибридизуются с комплементарными им участками на молекуле ДНК, происходит их
лигирование в полноразмерный зонд. Преимущество разделения
зонда на две составные части заключается в том, что амплифицируется только лигированный полноразмерный зонд, а отдельные
олигонуклеотиды при этом не будут амплифицироваться.
Каждый полноразмерный зонд имеет уникальную длину, так что
полученные ампликоны можно разделить и идентифицировать
путем капиллярного электрофореза. Поскольку прямой праймер,
используемый в амплификации зонда, мечен флуоресцентной
меткой, каждый ампликон генерирует флуоресцентный сигнал,
который может быть детектирован на генетическом анализаторе
(секвенаторе). Сравнивая значения сигналов, полученных для исследуемого образца, с данными, полученными для референсных
образцов, можно определить относительное количество каждого
ампликона. При этом сила флуоресцентного сигнала будет тем
выше, чем больше количество копий целевых участков ДНК.
Особенностью метода является то, что в результате постановки
ПЦР амплифицируется не участок анализируемой ДНК, а олигонуклеотидный зонд. Так как данный метод представляет собой
мультиплексную реакцию, то в одной реакции одновременно может участвовать до 50 различных зондов. При этом все зонды амплифицируются с одной праймерной пары, что значительно
увеличивает воспроизводимость реакции.
Преимущества метода
Данный метод анализа является высокоточным и позволяет детектировать различия в целевом участке ДНК всего в один нуклеотид. Для постановки анализа необходимо примерно 30 нг
геномной ДНК (около 3000 клеток или 0,5 мл амниотической
жидкости). Возможно использование материала с частично деградированной ДНК.
Метод MLPA-анализа используется для определения:
• изменения числа копий гена
• статуса метилирования импринтированных и промоторных
участков ДНК
• относительного количества мРНК
• известных точечных мутаций и SNP
Области применения
• пренатальная и постнатальная диагностика
• диагностика наследственных нейрогенетических и умственных
заболеваний
• диагностика наследственных форм рака
• характеристика опухолей
• фармакогенетика
• определение статуса метилирования
Схема протокола
5
1. Денатурация и гибридизация
5
Последовательность,
комплементарная ПЦР-праймеру X
Комплементарная последовательность
5’
Последовательность,
комплементарная
ПЦР-праймеру Y
Вставка
5’
5’
3’
5’
3’
5’
2. Лигирование
3. ПЦР
X
5’
Y
3’
Лигаза
X
5’
ДНК А
Y
X
Y
X
5’
3’
5’
3’
Лигаза
Y
5’
Каждый ампликон имеет уникальную длину 130-480 nо
3’
ДНК Б
5’
4. Разделение ампликонов капиллярным электрофорезом
Тел.: (495) 647-2740, 932-9214, 939-2421, e-mail:info@biochemmack.ru, www.biochemmack.ru
5
Наборы SALSA® MLPA®
Компания «БиоХимМак» предлагает наборы для проведения
MLPA-анализа SALSA® MLPA® (MRC-Holland). Доступны наборы
для постановки 25, 50 и 100 тестов.
Каждый набор включает в себя:
• Salsa MLPA буфер
• Salsa лигаза
• Лигазный буфер А
• Лигазный буфер B
• Salsa ПЦР primer Mix
• Salsa полимераза
• Смесь зондов
Необходимое оборудование
Для осуществления MLPA-анализа потребуется 96-луночный амплификатор с прогреваемой крышкой (например, VeritiTM Thermal Cycler, Applied Biosystems) и генетический анализатор
(секвенатор) (например, 3100, 3730 или 3500 Series Genetic Analyzer, Applied Biosystems).
Этапы выполнения методики
MLPA-анализ включает следующие этапы:
• выделение геномной ДНК
• денатурация ДНК
• гибридизация зондов на целевых участках ДНК
• лигирование зондов
6
• амплификация (ПЦР)
• капиллярный электрофорез
• анализ результатов
НЕСООТВЕТСВИЕ
ПОЛНОЕ СООТВЕТСВИЕ
Несоответствие в области лигирования
зонда –> нет лигирования, нет продукта
амплификации
Лигирование двух олигонуклеотидов
зонда –> амплификация, продукт
амплификации
Процедура выполнения MLPA-анализа занимает около 24 часов,
включая все ручные процедуры и капиллярный электрофорез
образцов.
Группа компаний «БиоХимМак». 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова
Информация для заказа
Кат. номер
Наименование набора
Заболевания
Пренатальная и постнатальная диагностика
P095
SALSA MLPA P095 Aneuploidy
Анеуплоидии (синдром Дауна, синдром Эдвардса, синдром Патау)
P055
SALSA MLPA P055 PAH
Фенилкетонурия
ME029
SALSA MLPA ME029 FMR1/AFF2
Синдром ломкой Х-хромосомы
P021
SALSA MLPA P021 SMA
Спинальная мышечная атрофия
P036
SALSA MLPA P036 Human Telomere
Широкий субтеломерный скрининг
P250
SALSA MLPA P250 DiGeorge
Синдром Ди Джорджи
Наследственные формы рака
P190
SALSA MLPA P190 CHEK2
Предрасположенность к раку молочной железы
P002
SALSA MLPA P002 BRCA1
Рак молочной железы (наследственная форма)
P378
SALSA MLPA P378 MUTYH
Рак толстой кишки, рак желудка (наследственные формы)
P251
SALSA MLPA P251 NB mix 1
Нейробластома
P315
SALSA MLPA P315 EGFR
Солидные опухоли
P003
SALSA MLPA P003 MLH1/MSH2
Наследственный неполипозный рак толстой кишки
E024
SALSA MLPA ME024 9p21 CDKN2A/2B region
Меланомы кожи
Онкогематология
P327
SALSA MLPA P327 iAMP21
Острый лимфоидный (лимфопластический) лейкоз, iAMP21
P037
SALSA MLPA P037 CLL-1
Хронический лимфолейкоз
Генетические заболевания
P091
SALSA MLPA P091 CFTR
Муковисцидоз
P050
SALSA MLPA P050 CAH
Адреногенитальный синдром
P034
SALSA MLPA P034 DMD
Мышечная дистрофия Дюшена
P170
SALSA MLPA P170 APP
Болезнь Альцгеймера
P051
SALSA MLPA P051 Parkinson
Болезнь Паркинсона
P041
SALSA MLPA P041 ATM-1
Атаксия-телеангиэктазия (синдром Луи-Бара)
P343
SALSA MLPA P343 Autism-1
Аутизм
Для получения полного перечня наборов обращайтесь в офис компании «БиоХимМак» по электронной почте pcr@biochemmack.ru,
либо на сайт производителя наборов MRC-Holland (www.mrc-holland.com)
Тел.: (495) 647-2740, 932-9214, 939-2421, e-mail:info@biochemmack.ru, www.biochemmack.ru
7
Термоциклер Veriti®
(Applied Biosystems)
Генетические анализаторы 3500 и 3500xL
Genetic Analyzer (Applied Biosystems)
• Выпускается в четырех форматах: 96-луночный (0,2 или 0,1
мл), 384-луночный и 60-луночный (0,5 мл)
• Шесть независимых температурных блоков, содержащих по
16 ячеек каждый, позволяют выполнять одновременно до 6
различных протоколов
• Возможность работы в скоростном или стандартном режимах. Скоростной режим предоставляет возможность сократить время амплификации
• Термоциклер Veriti имеет цветной сенсорный экран с диагональю 6,5 дюймов, который очень удобен в эксплуатации
• В приборе имеется USB-порт для переноса данных и загрузки
обновлений. Это позволяет хранить на флеш-памяти неограниченное число протоколов
• 8-капиллярная система 3500 и 24-капиллярная система
3500xL
• Усовершенствованная система терморегуляции для улучшенного контроля
температуры при анализе фрагментов ДНК, требующем высокой точности
• Твердотельный лазер с одной длиной волны 505 нм и длительным сроком службы, работает от стандартной сети и не
требует охлаждения
• Встроенная мощная система сбора данных и ПО для первичного анализа, позволяющие оценивать качество данных в реальном времени
• Усовершенствованная технология для мультиплексного анализа фрагментов ДНК с использованием до 6 красителей
Официальный дистрибьютор в России
ЗАО «БиоХимМак»
119991 Москва, Ленинские горы, МГУ им. Ломоносова
Тел.: (495) 647-2740, 939-2421, факс (495) 939-0997
E-mail: prc@biochemmack.ru
www.biochemmack.ru
биохиммак.рф