Улучшение доставки комплексов плазмидной ДНК с

Оригинальные исследования
101
Улучшение доставки комплексов плазмидной ДНК
с поликатионом в клетки человека
в присутствии блоксополимеров этилени пропиленоксида
А.Д. Мартынова, В.Д. Шевченко, О.В. Бондарь, Т.И. Абдуллин
Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань
Improved delivery of plasmid DNA complexes with polycation into human cells in the presence
of block copolymers of ethylene oxide and propylene oxide
A.D. Martynova, V.D. Shevchenko, O.V. Bondar, T.I. Abdullin
Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan
Работа посвящена исследованию влияния новых блоксополимеров этилен- и пропиленоксида на доставку плазмидной ДНК и ее комплексов с катионными полимерами в
клетки человека. В качестве систем доставки протестированы трехфункциональные амфифильные блоксополимеры на основе глицерина (лапролы), полиэтиленимин (25
кДа) и коммерческий трансфекционный реагент TurboFect.
Установлено, что TurboFect образует более компактные и
положительно заряженные полиплексы с плазмидной ДНК
(pEGFP-N2) и обеспечивает большую экспрессию GFP в
клетках HEK 293, чем полиэтиленимин. Лапролы слабо
взаимодействуют с плазмидной ДНК и не улучшают ее
внутриклеточную доставку, однако существенно усиливают трансфекцию клеток комплексами ДНК с полиэтиленимином. Результаты показывают, что лапролы обладают
умеренной цитотоксичностью и представляют интерес для
доставки геннотерапевтических препаратов в клетки.
The work is aimed at the study of the effect of novel
block copolymers of ethylene oxide and propylene oxide
on the delivery of plasmid DNA and its complexes with
cationic polymers into human cells. Tri-functional amphiphilic
block copolymers on the basis of glycerol (LaprolsTM),
polyethyleneimine (25 kDa) and commercial transfection
reagent TurboFectTM were tested as delivery systems.
TurboFect was found to form more compact and positively
charged polyplexes with plasmid DNA (pEGFP-N2) and
provided higher expression of GFP in HEK 293 cells
compared to polyethyleneimine. Laprols weakly interacted
with plasmid DNA and did not improve its intracellular
delivery. However they markedly promoted cell transfection
by DNA-polyethyleneimine complexes. Results show that
Laprols exhibit mild cytotoxicity and produce the interest for
gene therapeutics delivery into cells.
Ключевые слова: плазмидная ДНК, полиплексы, полимерные носители, блоксополимеры этилен- и пропиленоксида, генная терапия.
Key words: plasmid DNA; polyplexes; polymeric carriers;
block copolymers of ethylene oxide and propylene oxide; gene
therapy.
Разработка эффективных систем доставки генетического материала является актуальной задачей
клеточной биологии и генной терапии. В настоящее
время в качестве геннотерапевтических векторов
тестируют различные вирусы, которые, несмотря на
эффективность трансформации клеток, обладают
высокой иммуно- или туморогенностью [1–3]. Значительно более безопасной системой являются препараты на основе плазмидной ДНК, отличающиеся
низкой себестоимостью, но, вместе с тем, характеризующиеся низкой эффективностью доставки терапевтических генов [4].
Для улучшения трансфекции клеток плазмидной
ДНК общепринятым подходом является ее связывание с катионными липидами и полимерами. Эти
вещества образуют компактные комплексы с нуклеиновыми кислотами, облегчая внутриклеточный перенос генов, их высвобождение из лизосом и защиту
от расщепления нуклеазами [5–7]. Фундаментальным недостатком катионных липидов/полимеров
является их высокая токсичность, обусловленная,
в частности, мембраноповреждающим действием.
Перспективным классом полимерных носителей генов являются амфифильные полимеры, такие как
блоксополимеры этилен- и пропиленоксида. К на-
стоящему времени подробно исследованы свойства
двухфункциональных блоксополимеров, известных
под торговой маркой Плуроники (Pluronics, BASF).
В зависимости от физико-химических свойств
Плуроники способны оказывать различные биологические эффекты, в том числе, модулировать активность систем мембранного транспорта и усиливать
доставку лекарственных средств в резистентные
опухолевые клетки и клетки гематоэнцефалического
барьера [8, 9]. Показано, что Плуроник Р85 усиливает пролиферацию и остеогенную дифференцировку
мезенхимных стволовых клеток человека [10]. Зафиксировано повышение уровня экспрессии маркерных генов в клетках человека при трансформации
невирусными векторами [8, 9], аденовирусами [11]
и лентивирусами [12] в присутствии Плуроников.
Обнаружено, что Плуроники F127, L61 и P85 повышают уровень трансфекции при инъекции «голой»
плазмидной ДНК в скелетную мышцу [13, 14].
Настоящая работа посвящена исследованию возможности применения трехфункциональных блоксополимеров этилен- и пропиленоксида на основе
глицерина для доставки плазмидной ДНК в клетки
человека. Ранее установлено, что подобные полимеры более эффективны при усилении внутриклеточной
e-mail: oxanav.bondar@gmail.com
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VII, № 3, 2012
102
Оригинальные исследования
доставки низкомолекулярных лекарственных средств
и флуорофоров, чем Плуроники [15]. Нами охарактеризованы комплексы плазмидной ДНК с лапролами
и катионными полимерами, оценена цитотоксическая
активность лапролов и их влияние на эффективность
трансфекции клеток HEK 293.
но визуализировали в режиме дифференциальноинтерференционного контраста и путем окрашивания
ядер Hoechst 33342. Изображения клеток анализировали с помощью програм-много обеспечения IN
Cell Analyzer Workstation 3.7 и AxioVision (Carl Zeiss,
Германия).
Материал и методы
В работе использовали плазмидную ДНК pEGFPN2 (Clontech, США) с геном зеленого флуоресцентного белка (GFP), разветвленный полиэтиленимин
(ПЭИ) с молекулярной массой 25 кДа (Sigma-Aldrich,
США), трехфункциональные блоксополимеры этилен- и пропиленоксида на основе глицерина: лапрол
3603, лапрол 5003, лапрол 6003 (ОАО «Нижнекамскнефтехим»), трансфекционный агент TurboFectTM
(Fermentas, США), флуоресцентный краситель
Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, США).
Электрофоретическое разделение и анализ комплексов плазмидной ДНК с ПЭИ и лапролами проводили с использованием оборудования BioRad в
1% агарозном геле в ТАЕ-буфере. Для визуализации
ДНК окрашивали специфичным флуоресцентным
красителем (этидия бромидом).
Структуру комплексов плазмидной ДНК с полимерами исследовали методом динамического светорассеяния на анализаторе Zetasizer NanoZS (Malvern,
США). ДНК смешивали с ПЭИ или реагентом TurboFect
в конденсирующей концентрации в буфере. Смесь
инкубировали 10 мин. при комнатной температуре и
далее регистрировали гидродинамический диаметр
и дзета-потенциал образовавшихся комплексов.
Цитотоксичность комплексов плазмидной ДНК
с ПЭИ и блоксополимеров этилен- и пропиленоксида определяли с помощью MTT-теста. Для этого
клетки аденокарциномы легких (А549) и первичные
фибробласты кожи человека культивировали в среде
DMEM и α-MEM соответственно, содержащей 10%
сыворотки крови плода коровы, 2 мМ L-глутамин,
100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина
при 37°С в атмосфере 5% СО2. Клетки рассеивали
в 96-луночном планшете, добавляли блоксополимеры в различных концентрациях и культивировали
70 ч. После культивирования клетки обрабатывали
реагентом MTТ согласно протоколу производителя
(Sigma, США). Продукт восстановления МТТ жизнеспособными клетками – формазан – детектировали
на микропланшетном анализаторе Infinite M200 Pro
(Tecan, США) при 550 нм. Долю жизнеспособных
клеток рассчитывали относительно контроля (необработанные клетки).
Исследование трансфекции клеток комплексами
плазмидной ДНК с полимерами проводили на клетках линии HEK 293 (эмбриональные клетки почки
человека). Клетки культивировали в стандартных
условиях до достижения плотности около 70%.
В культуральную среду DMEM с сывороткой и без
сыворотки вносили комплексы ДНК с реагентом
TurboFect, согласно рекомендациям производителя,
а также смеси лапролов (100, 500 мкг/мл) с плазмидной ДНК с ее комплексами с ПЭИ в связывающих
концентрациях (10, 20 мкг/мл). Трансфицированные
клетки с флуоресценцией GFP визуализировали с
помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Axio Observer.A1 (Carl Zeiss, Германия) и
автоматизированного анализатора IN Cell Analyzer
2000 (GE Healthcare, США). Клетки дополнитель-
Результаты и обсуждение
В качестве модельной плазмидной ДНК (пДНК)
использовали плазмиду pEGFP-N2 с геном «усиленного» зеленого флуоресцентного белка (egfp).
Чистоту препарата контролировали с использованием спектрофотометрии и рестрикционного анализа. С использованием электрофореза в агарозном
геле и динамического рассеяния света исследовано
комплексообразование пДНК с синтетическими катионными полимерами – полиэтиленимином (ПЭИ)
с молекулярной массой 25кДа, а также коммерческим трансфиционным реагентом TurboFect. По
данным электрофореза, минимальная концентрация
ПЭИ, связывающая 10 мкг/мл пДНК в неподвижный
комплекс, составила 5 мкг/мл. В тех же условиях
рекомендованная производителем концентрация
TurboFect также полностью связывала пДНК. Исследуемые лапролы (3603, 5603, 6003) с различными
характеристиками не изменяли электрофоретическую подвижность пДНК в широком диапазоне концентраций, свидетельствуя о том, что эти полимеры
не образуют устойчивые комплексы с ДНК.
Метод динамического рассеяния света (фотонной корреляционной спектроскопии) применен для
характеристики структуры комплексов пДНК с полимерами. В табл. 1 приведены значения гидродинамического диаметра и дзета-потенциала пДНК
и ее комплексов с полимерами. Исходная пДНК
имеет гидродинамический диаметр 130 нм и дзетапотенциал -24 мВ. В присутствии лапрола размер
пДНК увеличивался незначительно, а отрицательный заряд понижался почти до -2 мВ. Подобные
изменения указывают на наличие определенных
взаимодействий между блоксополимерами этилени пропиленоксида с пДНК.
Образующиеся комплексы пДНК с ПЭИ в минимальной связывающей концентрации имели диаметр
около 169 нм и дзета-потенциал +17 мВ (табл. 1).
Таблица 1. Характеристика структуры
комплексов плазмидной ДНК с катионными
полимерами по данным динамического
рассеяния света
Гидродинамический
диаметр (нм)
PdI
Дзетапотенциал
(мВ)
пДНК
130±27
0,46
-24,1±2,0
пДНК + ПЭИ
(10 мкг/мл)
169±16
0,43
+17±9
пДНК + ПЭИ
(20 мкг/мл)
50±3
0,48
+18±12
пДНК +
TurboFect
62±16
0,29
+25±18
Комплексы
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VII, № 3, 2012
103
Оригинальные исследования
При увеличении концентрации ПЭИ в 2 раза заряд полиплексов достоверно не изменялся, а их
размер уменьшался почти в 3,4 раза (до 50 нм).
Комплексы пДНК с TurboFect имели размер около
62 нм и дзета-потенциал +25 мВ. Результаты показывают, что комплексы пДНК с TurboFect обладают
более положительным зарядом и большей однородностью (меньшим индексом полидисперсности, PdI),
чем комплексы с ПЭИ; с увеличением концентрации
поликатиона (ПЭИ) размер полиплексов уменьшается, по-видимому, вследствие конденсации молекул
ДНК.
Представляло интерес оценить эффективность
трансфекции клеток комплексами пДНК с исследуемыми полимерами и выяснить как структура
комплексов влияет на этот процесс. Вначале нами
исследована цитотоксичность полимеров на клетках легочной аденокарциномы (А549) и первичных
фибробластах кожи человека с использованием
МТТ-теста.
Установлено, что ПЭИ не проявляет цитотоксичности в связывающих ДНК концентрациях (данные
не показаны). Цитотоксичность исследуемых лапролов уменьшалась с повышением гидрофильнолипофильного баланса и молекулярной массы (в ряду
лапрол 3603, лапрол 5003, лапрол 6003). Лапрол
6003 обладал наименьшей среди других лапролов
цитотоксичностью: его концентрация, ингибирующая рост человеческих фибробластов, составляет
135 мкг/мл (табл. 2).
Таблица 2. Цитотоксичные концентрации
лапролов (мкг/мл), вызывающие гибель
50% клеток при культивировании
Полимер
Клетки
А549
Фибробласты кожи
человека
Лапрол 3603
2,7±0,1
6,0±1,2
Лапрол 5003
11,7±3,7
18,7±3,4
Лапрол 6003
30,5±10,9
135,4±23,6
однородности и стабильности, которые выше в случае использования коммерческого трансфекционного реагента.
Установлено, что добавление лапролов к комплексам пДНК с ПЭИ приводило к существенному
увеличению числа экспрессирующих GFP клеток
(рис.). В частности, в присутствии лапролов 5003 и
6003 количество GFP-позитивных клеток в культуре
повышалось до 9,4 и 5,8 %, соответственно. Исследованию внутриклеточного транспорта комплексов
пДНК с полимерами и механизма влияния неионогенных лапролов на усиление трансфекции будет посвящена другая работа. Ранее мы установили, что
полифункциональные лапролы обратимо повреждают клеточные мембраны и способны усиливать доставку низкомолекулярных веществ в резистентные
опухолевые клетки [15]. Можно предположить, что
усиление трансфекции клеток полиплексами в присутствии лапролов связано с облегчением переноса
пДНК через плазматическую мембрану, а также последующего высвобождения ДНК из лизосом.
GFP
Hoechst 33342
DIC
1
2
3
Для анализа трансфекции использовали культуру эмбриональных клеток почки человека HEK 293.
Установлено, что в условиях эксперимента для комплексов pEGFP-N2 с реагентом TurboFect экспрессия GFP наблюдалась почти в 40% клеток. В среде
DMEM без сыворотки эффективность трансфекции
была выше, чем при использовании среды с сывороткой, однако при этом наблюдалось уменьшение
количества жизнеспособных клеток в культуре.
В присутствии лапролов трансфекция клеток «голой»
пДНК не наблюдалась.
На рисунке представлены микрофотографии клеток HEK 293, обработанных комплексами пДНК с
ПЭИ и лапролами. Выяснено, что в связывающей концентрации (10 мкг/мл) ПЭИ характеризуется достаточно низкой эффективностью трансфекции (1,3%
клеток с флуоресценцией GFP). Как показано выше
(см. табл. 1), полиплексы на основе ПЭИ характеризуются большим размером и меньшим зарядом,
чем комплексы с TurboFect. Можно предположить,
что эффективность доставки полиплексов в клетки
зависит от величины их положительного заряда,
Клетки HEK 293, обработанные комплексами
плазмидной ДНК pEGFP-N2 с полиэтиленимином:
1 – без лапролов;
2 – в присутствии лапрола 6003;
3 – в присутствии лапрола 5003;
GFP – флуоресценция в трансфицированных
клетках GFP;
Hoechst 33342 – флуоресценция ядер клеток;
DIC – дифференциально-интерференционный контраст.
Флуоресцентная микроскопия
Благодарности
Работа софинансировалась в рамках выполнения
ФЦП Министерства образования и науки Российской Федерации (соглашения № 14.А18.21.0113 и
№ 14.А18.21.1236) и ФЦП «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и
дальнейшую перспективу» (проект по созданию Научнообразовательного центра фармацевтики Казанского
(Приволжского) федерального университета).
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VII, № 3, 2012
104
Оригинальные исследования
ЛИТЕРАТУРА:
1. Kay M.A., Glorioso J.C., Naldini L. Viral vectors for gene therapy:
the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics.
Nature Medicine 2001; 7(I): 33–40.
2. Thomas M., Klibanov A.M. Non-viral gene therapy: polycationmediated DNA delivery. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003; 62:
27–34.
3. Tiera M.J., Shi Q., Winnik F.M. et al. Polycation-based gene
therapy: current knowledge and new perspectives. Current Gene
Therapy 2011; 11(IV): 288–306.
4. Patil S.D., Rhodes D.G., Burgess D.J. DNA-based therapeutics
and DNA delivery systems: a comprehensive review. AAPS 2005;
7(1): 61–77.
5. Petersen H., Kunath K., Martin A.L. et al. Star-shaped
poly(ethylene glycol)-blockpolyethylenimine copolymers enhance
DNA condensation of low molecular weight polyethylenimines.
Biomacromolecules 2002; 3(V): 926–36.
6. Lemkine G.F., Demeneix B.A. Polyethylenimines for in vivo gene
delivery. Curr. Opin. Mol. Ther. 2001; 3: 178–82.
7. Boussif O., Lezoualc’h F., Zanta M.A. et al. A versatile vector
for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo:
polyethylenimine. PNAS USA 1995; 92(XVI): 7297–301.
8. Batrakova E.V., Kabanov A.V. Pluronic block copolymers:
evolution of drug delivery concept from inert nanocarriers to biological
response modifiers. Control Release 2008; 130: 98–106.
9. Astafieva I., Maksimova I., Lukanidin E. et al. Enhancement of
the polycation-mediated DNA uptake and cell transfection with Pluronic
P85 block copolymer. FEBS letters 1996; 389(III): 278–80.
10. Блатт Н.Л., Ялвач М.Э., Шафигуллина А.К. и др. Влияние Плуроника Р85 на пролиферацию и остеогенную дифференцировку мезенхимных стволовых клеток человека in vitro.
Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия 2010; 5(III):
66–70.
11. Feldman L.J., Pastore C.J., Aubailly N. et al. Improved efficiency
of arterial gene transfer by use of poloxamer 407 as a vehicle for
adenoviral vectors. Gene Ther. 1997; 4(III): 189–98.
12. Dishart K.L., Denby L., George S.J. et al. Third-generation
lentivirus vectors efficiently transduce and phenotypically modify
vascular cells: implications for gene therapy. J. Mol. Cell. Cardiol.
2003; 35(VII): 739–48.
13. Lemieux P., Guerin N., Paradis G. et al. A combination of
poloxamers increases gene expression of plasmid DNA in skeletal
muscle. Gene Therapy 2000; 7: 986–91.
14. Yang Z., Zhu J., Sriadibhatla S. et al. Promoter- and strainselective enhancement of gene expression in a mouse skeletal muscle
by a polymer excipient Pluronic P85. Control. Release. 2005; 108:
496–512.
15. Штырлин Ю.Г., Абдуллин Т.И., Бондарь О.В. и др. Трехфункциональные блоксополимеры этиленоксида и пропиленоксида для
доставки активных веществ в живые клетки. Заявка на патент РФ
№2012119390. 2012 Май 11.
Поступила 24.09.2012
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VII, № 3, 2012