EcoRI

 Рестриктазы - группа бактериальных нуклеаз. Рестриктазы - это ферменты, обладающие
эндонуклеазной
активностью,
которые
специфически
гидролизуют
молекулы
двухцепочечных ДНК при наличии в них определенных последовательностей нуклеотидов сайтов рестрикции.

Название этих ферментов происходит от английского restriction (ограничения); они были
выявлены у определенных штаммом бактерий.

Крайне редко помимо эндонуклеазной активности рестриктаза обладает еще и метилазной
(Есо571),
производя
последовательности,
модификацию
(метилирование)
узнаваемой
рестриктазой;
определенных
такие
нуклеотидов
в
модифицированные
последовательности не подвержены ферментативной рестрикции.

Но обычно эти ферменты структурно независимы и работают в комплексе, образуя так
называемую RM-систему (систему рестрикции-модификации).

Одновременное наличие в клетке обеих ферментативных активностей защищает от
интеграции в геном чужеродной ДНК (например, вирусов или плазмид) и предотвращает
разрушение собственной ДНК.
 Известно около 2500 рестриктаз.

Название того или иного фермента составляется из первой буквы рода и двух первых букв
вида бактерии, из которой данная рестриктаза выделена, еще одна буква может обозначать
тип штамма. Если в определенном штамме клеток имеется несколько рестриктаз, то к
буквенному названию фермента добавляется числовое обозначение. Например - рестриктаза
HindIIII выделена из клеток Haemophilus influenzae с серотипом d и относится к III классу
RM-системы.
 Рестриктазы могут кодироваться не только геномной ДНК бактерии, но также плазмидами
и фагами, в связи с этим к названию фермента добавляется название внехромосомного
элемента (ЕсоRI).
Рестриктазы
Рестриктазы 4 типа
Рестриктазы 1 типа
Рестриктазы 2 типа
Рестриктазы 3 типа
Рестриктазы 1 типа
 Рестриктазы 1 типа представляют собой сложные мультимерные комплексы, построенные
из трех субъединиц с молекулярной массой до 300 кДа, которые обладают рестриктазной,
ДНК-метилазной и АТРазной активностями.

Рестриктазы типа I для проявления своей активности требуют присутствия ATP, Sаденозилметионина и ионов Mg2+.
 Расщепляют ДНК в произвольных местах на расстоянии от нескольких сот до нескольких
тысяч пар нуклеотидов от несимметричных сайтов узнавания.

При этом образуется сплошной спектр рестриктов, не детерминированных по размерам и
содержанию информации, поэтому данные рестриктазы в генной инженерии не
используют.

Примером таких рестриктаз может служить ЕсоК.
Рестриктазы 2 типа
 Рестриктазы II типа имеют широкое применение, поскольку рестриктазы и метилазы этого
класса действуют независимо

Сайты узнавания совпадают с сайтами расщепления или находятся рядом с ними на
определенном
расстоянии,
в
результате
чего
получаются
фрагменты
ДНК
воспроизводимого состава и длины.
 Более половины рестриктаз данного класса узнают нуклеотидные последовательности с
вращательной симметрией второго порядка (палиндромы).

По способу расщепления данные ферменты делятся на два подкласса:
 Представители первого осуществляют ступенчатый разрез комплементарных нитей ДНК,
в результате чего образуются фрагменты с выступающими (липкими) концами: либо 5'-
концами, либо 3'-концами, как в случае действия рестриктазы PstI.

Ферменты второго подкласса (например, SmaI) расщепляют совпадающие связи, в
результате чего образуются фрагменты с ровными (тупыми) концами.
Тупой-конец
Липкий 5`-конец
Липкий 3`-конец
Рестриктазы 3 типа
Рестриктазы 4 типа
 Рестриктазы III класса (например, EcoRI Pl) действуют в одном
комплексе
с
метилазами
и
узнают
несимметричные
последовательности нуклеотидов, при этом расщепление происходит
на определенном расстоянии от сайта узнавания.
 RM-система
представлена
(комплекс
пока
рестриктазы
уникальным
и
метилазы)
ферментом
Eco571
IV
в
класса
одной
полипептидной цепочке которого и эндонуклеазная, и метилазная
активность.
A. Связывание РНК-полимеразы
и начало транскрипции в
направлении 5-3.
B. Включение нуклеотидов в
РНК со скоростью 40
нукл\сек, одновременно к
иРНК прикрепляются
рибосомы.
C. Группы рибосом следуют за
полимеразой. С 5`-конца
начинается деградация ДНК.
D. По мере движения рибосом
иРНК деградирует, но с
меньшей скоростью, чем идёт
процесс трансляции.
E. После окончания
транскрипции иРНК
освобождается, но процессы
деградации и трансляции
продолжаются.
Транскрипция
инициируется
при
образовании
стабильного
комплекса
между
холоферментом и специфической последовательностью, называемой промотором и
располагающейся в начале всех транскрипционных единиц.
1. Поиск промотора
2. Образование закрытого промоторного комплекса
3. Образование открытого комплекса
4. Отсоединение σ – фактора и присоединение
фактора элонгации
5. Терминация синтеза. РНК- полимераза достигает
зоны терминатора
6. Высвобождение готовойго РНУ0транскрипьа в
виде копии матричной ДНК.
Интрон это участок ДНК, который является частью гена, но не содержит информации о
последовательности аминокислот.
Интроны были обнаружены в генах кодирующих белки геномов органелл и ядер низших и
высших эукариот, прокариот и вирусов.
Последовательность
нуклеотидов
соответствующая
интрону,
удаляется
из
транскрибированной с него РНК в процессе сплайсинга до того, как произойдёт считывание
белка (трансляция).
 Интроны характерны для всех типов эукариотической РНК, но также найдены в
рибосомальной РНК (рРНК) и транспортной РНК (тРНК) прокариот).
ТИПЫ ИНТРОНОВ
Интроны генов ядерных мРНК
Твинтрон
Интроны в генах тРНК
Особый тип интронов: группа 3
Особый тип интронов: группа 2
Особый тип интронов: группа 1

У генов, кодирующих разные тРНК, внутренние и фланговые участки интронов заметно
различаются.

Нет никакой канонической последовательности, которая могла бы узнаваться ферментами
сплайсинга для растений, амфибий и млекопитающих.

Все интроны содержат последовательность, комплементарную антикодону тРНК.

Это приводит к формированию альтернативной конформации антикодоновой петли, при которой её
длина увеличивается за счёт спаривания оснований антикодона с интроном.

В основе сплайсинга тРНК лежит узнавание вторичной структуры тРНК, а не нуклеотидной
последовательности интрона.
 Особый тип интронов: группа 1 находятся:
а) в ядерных генах рРНК некоторых низших эукариот (Netrahymena thermophile, Physarum polycephalum)
б) в генах рРНК митохондрий, хлоропластов, дрожжей и грибов
в) в некоторых митохондриальных генах мРНК дрожжей и грибов
г) в генах тРНК хлоропластов высших растений.
 Размеры интронов первой группы варьируют от от 400 п. н. у интрона про-рРНК Tetrahymena до
нескольких тысяч п. н у митохондриальных мРНК.
 Интроны 1 группы сами катализируют свой сплайсинг, причём вся информация, необходимая для
сплайсинга, содержится во множестве относительно коротких внутренних последовательностей
внутри
интрона,
которые
обеспечивают
укладку
молекулы
с
образованием
пространственной структуры.
 Автокаталитический сплайсинг был открыт у транскриптов генов рРНК T. thermophile.
характерной
Аутосплайсинг 26 S рРНК у тетрахимены
в процессе образования рибозима .
1.
Гуанозин атакует 5`- конец интрона,
в результате чего происходит
разрыв межнуклеотидной связи и
высвобождение 5`- конца интрона;
2.
Гидроксильная группа 3`-конца
экзона 1 атакует фосфодиэфирную
связь на 3`- конце интрона.
3.
Замыкание фосфодиэфирной связи
между ОН-группой 3`-конца
экзона 1 и 5`- фосфатной группой
экзона 2
4.
В результате двухэтапного
аутокаталитического расщепления
19 нуклеотидов из состава интрона
образуется рибозим, обладающий
каталитическими свойствами.
Многие интроны группы I кодируют эндонуклеазы, обеспечивающие им мобильность.
Известно уже несколько семейств таких эндонуклеаз, но у всех у них рядом с активным центром
располагается аминокислотный мотив LAGLIDADG. Примером интрона группы I, кодирующим
эндонуклезу, является интрон td фага Т4, который режет последовательность – мишень,
расположенную на 24 пн выше сайта внедрения интрона .

Интроны группы II распространены менее широко, чем интроны группы I. Они обнаружены:
А) в двух митохондриальных генах дрожжей, кодирующих одну из субъединиц цитохромоксидаазы
и цитохром.

Интроны данной группы не содержат канонических последовательностей, характерных для
интронов группы 1, но они также имеют специфическую вторичную структуру, образующуюся благодаря
внутримолекулярному спариванию оснований.

Интроны II группы также подвергаются аутосплайсингу in vitro, но в этом случае реакция
инициируется не экзогенным гуанозином, а остатком, входящим в состав самого интрона.

Интроны II группы, высвобожденные в результате сплайсинга, представляют собой лассоподобные
структуры, в которых 5`- концевой фосфат РНК интрона соединён фосфодиэфироной связью
гидроксильной группой внутреннего нуклеотида.
с 2`-

Самые изученные мобильные интроны группы II кодируют по одному единственному белку.

Открытая рамка считывания находится за пределами каталитического ядра интрона и даёт белок с
активностями обратной транскриптазы, матуразы, эндонуклеазы.

Также в этом белке имеется ДНК-связывающий мотив. Обратная транскриптаза синтезирует ДНК-
копию интрона на матрице РНК и эта копия ведёт себя подобно копиям ретропозонов. Внося надрезы по
обеим цепям ДНК, эндонуклеаза готовит сайт-мишень к внедрению интрона.
 Интроны генов ядерных мРНК находятся в ядерных генах кодирующих белки.
 Их размер варьирует от 100 п. н. до 10 т. п. н. и более.
 Наиболее характерной отличительной чертой всех интронов данной группы является наличие
специфических последовательностей вблизи их 5`- и 3`-концов.
 Нуклеотидные последовательности в местах соединения экзонов и интронов весьма консервативны и
практически одинаковы во всех генах ядерных мРНК
 Интроны принимают участие в увеличении разнообразия
продуктов экспрессии генов за счёт
альтернативного сплайсинга (MironovA.A. etall, 1999; ClarkF.,ThanaraiT. A., 2002).
 Некоторые интроны содержат энхансеры и способны активно регулировать экспрессию генов, которым
они принадлежат (RenX.-Y. Etall., 2006; DasD. Etall., 2007; ChungB. Y.W. etall., 2006).
 Интроны влияют на экспрессию генов через увеличение времени, необходимого для транскрипции гена.
В работе группы учёных показано, что существует обратная зависимость, между длиной интронов и
временем транскрипции генов, содержащих данные интроны (SwinburneI.A., 2008).
 В ряде работ было показано, что прерывание кодирующей последовательности гена вставкой интрона
приводит к усилению экспрессии гена.
 В интронах были обнаружены последовательности, кодирующие новый класс микроРНК. Данный класс
микроРНК получил название Id-miRNA. С функционированием данных молекул связаны процессы генной
интерференции (Lin SL., 2008).