На правах рукописи МУРСАЛИМОВ СЕРГЕЙ РАМИЛЬЕВИЧ
advertisement
На правах рукописи МУРСАЛИМОВ СЕРГЕЙ РАМИЛЬЕВИЧ ИССЛЕДОВАНИЕ ЦИТОМИКСИСА В МИКРОСПОРОГЕНЕЗЕ ТАБАКА (NICOTIANA TABACUM L.) РАЗНОГО УРОВНЯ ПЛОИДНОСТИ 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2012 Работа выполнена в лаборатории биоинженерии растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск. Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Дейнеко Елена Викторовна Официальные оппоненты: Высоцкая Людмила Васильевна доктор биологических наук, профессор, заместитель заведующего кафедры цитологии и генетики Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, г. Новосибирск Киселева Елена Владимировна кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории морфологии и функции клеточных структур Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск. Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск. Защита диссертации состоится _____________________ 2012 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 003.011.01 при ИЦиГ СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10. тел. (383)363-49-06, факс (383)333-12-78; e-mail: dissov@bionet.nsc.ru C диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН. Автореферат разослан «______» _____________ 2012 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Хлебодарова Т.М. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Межклеточные контакты являются важнейшим звеном в процессе роста и развития многоклеточного организма. Существует множество типов и разновидностей таких контактов, с помощью которых клетки взаимодействуют друг с другом. Ключевую роль во взаимодействии растительных клеток играют контакты, представляющие собой каналы, напрямую связывающие цитоплазму и мембраны соседних клеток в единый континуум. В тканях высших растений выделяют два типа таких каналов – плазмодесмы и цитомиктические каналы (ЦК). Плазмодесмы встречаются практически во всех типах растительных клеток, а образование ЦК, как правило, выявляется в микроспоцитах высших растений. В то время как плазмодесмы являются хорошо изученными структурами, формирование, функционирование и роль ЦК практически не исследована. Наиболее интересным феноменом, ассоциированным с ЦК, является перемещение по ним ядер из одной клетки в другую – цитомиксис (Шнайдер, 1975; HeslopHarrison, 1966; Saggoo et al., 2011). Интерес к цитомиксису объясняется уникальными клеточными механизмами этого процесса, а также его возможным вкладом в формирование полиплоидных и анеуплоидных гамет, поскольку чаще всего этот процесс наблюдается в микроспорогенезе. Несмотря на то, что цитомиксис открыт более ста лет назад (Arnoldy, 1900), на сегодняшний день в распоряжении исследователей имеется очень мало экспериментальных данных, характеризующих это явление. Остается неясным, какую роль играет цитомиксис в жизни растения, является ли он нормальным физиологическим процессом, или это – отклонение от нормы. Неизвестно, почему цитомиксис встречается чаще всего в клетках репродуктивной сферы, и одинаково ли протекает этот процесс в различных тканях одного растения и у различных видов. Спорным остается эволюционная значимость цитомиксиса. Цитомиксис многократно обнаруживался в микроспорогенезе полиплоидных форм растений. Однако неясно, каким образом связано появление этого процесса в микроспорогенезе с изменением уровня плоидности растения. Практически не изученными остаются цитологические механизмы этого процесса. Неизвестной также является судьба мигрирующего при цитомиксисе хроматина. В связи с этим актуальными задачами в изучении цитомиксиса на настоящий момент являются определение влияния уровня плоидности на проявление этого процесса, анализ ультраструктурных особенностей межклеточных каналов, ядра и хроматина при цитомиксисе, оценка влияния цитомиксиса на жизнеспособность клеток. Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является изучение особенностей цитомиксиса в микроспорогенезе растений табака разного уровня плоидности. Задачи исследования: 1. Проанализировать частоту цитомиксиса в микроспорогенезе растений табака разного уровня плоидности. 2. Изучить механизмы формирования цитомиктических каналов на различных стадиях микроспорогенеза. 3. Сравнить особенности формирования и функционирования цитомиктических каналов в микроспорогенезе диплоидных и тетраплоидных растений табака. 4. Изучить ультраструктурную организацию ядра и его компонентов при цитомиксисе. 1 5. Оценить целостность геномной ДНК в микроспороцитах растений табака с высокой частотой цитомиксиса. Научная новизна и практическая ценность работы. Детальный анализ микроспорогенеза растений табака с разным уровнем плоидности позволил выявить многие ранее неизвестные закономерности межклеточной миграции ядер между микроспороцитами высших растений. При анализе частоты цитомиксиса в микроспорогенезе растений табака разного уровня плоидности показано, что частота цитомиксиса пропорционально возрастает у триплоидных и тетраплоидных растений, а у гаплоидных растений не отличается от диплоидных. При электронно-микроскопическом анализе впервые было установлено, что межклеточная миграция хроматина происходит в составе ядра, при этом ядерная оболочка и хроматин не получают видимых повреждений после цитомиксиса. Выявлены два механизма формирования ЦК между микроспороцитами табака – на основе плазмодесм и de novo. Впервые выявлено участие в формировании ЦК особого класса клеточных органелл – сферосомоподобных везикул. С помощью цитохимического анализа выявлено наличие в этих органеллах фермента каллазы. При ультраструктурном анализе микроспорогенеза линии SR1 впервые описаны ядерные мостики – структуры, формирующиеся при слиянии оболочек двух ядер, контактирующих через ЦК. Изучена динамика ядрышка при цитомиксисе, показано, что после перехода через ЦК ядрышко может фрагментироваться и попадать в разные микроядра. Впервые показано, что геномная ДНК, выделенная из микроспороцитов растений табака, характеризующихся высокой частотой цитомиксиса, не проявляет признаков деградации. Практическая ценность данной работы заключается в создании ультраструктурного атласа микроспорогенеза табака и составлении схемы постадийной реорганизации межклеточных каналов в микроспорогенезе двудольных растений. Результаты данной работы могут быть использованы в курсах лекций по клеточной биологии для студентов биологических факультетов. Положения диссертации, выносимые на защиту. 1. Частота цитомиксиса в микроспорогенезе табака возрастает у триплоидных и тетраплоидных растений. 2. Цитомиктические каналы в микроспорогенезе табака образуются на основе плазмодесм и de novo с помощью сферосомоподобных везикул, содержаших фермент каллазу. 3. При цитомиксисе мигрирующий хроматин не повреждается. Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на следующих конференциях и симпозиумах: XLVI и XLVII Международных научных студенческих конференциях (2008 и 2009, Новосибирск) (в 2009 году доклад удостоен диплома первой степени); "Хромосома-2009" (2009, Новосибирск); XII Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии (2009, Владивосток); IV Международная конференция молодых учёных "Биология: от молекулы до биосферы" (2009, Харьков, Украина) (диплом за лучший устный доклад); XXIII Российская конференция по электронной микроскопии (2010, Черноголовка); XVI всероссийский симпозиум "Cтруктура и функции клеточного ядра" (2010, СанктПетербург); I всероссийская молодежная научная конференция «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии» (2010, Томск); VII International 2 scientific conference for students and PhD students (2011, Львов, Украина) (доклад удостоен диплома второй степени); VII Международная конференция «Факторы экспериментальной эволюции организмов» (2011, Алушта, Украина) (доклад удостоен диплома за лучший устный доклад); 2-ая Международная школаконференция «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (2011, Звенигород); 11th Gatersleben Research Conference CHROMOSOME BIOLOGY, GENOME EVOLUTION AND SPECIATION (2012, Гатерслебен, Германия); The International PhD Student Conference on Experimental Plant Biology (2012, Брно, Чехия); Материал диссертационной работы был представлен в виде устных и стендовых докладов на отчетных сессиях ИЦиГ СО РАН в 2008, 2011 гг. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ, из них 4 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в список ВАК и 13 тезисов конференций. Структура и объем работы. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список публикаций по теме диссертации, список цитируемой литературы и приложение. Работа изложена на 130 страницах, содержит 18 рисунков и 5 таблиц. Список цитируемой литературы включает 255 источника. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Исходным материалом для работы послужили растения табака (Nicotiana tabacum L.) линии SR1 (2n=48) и мутантные трансгенные тетраплоидные растения линий Res79 и 16.70 (2n=96), полученные в результате сомаклональной изменчивости при культивировании in vitro и характеризующиеся высокой частотой цитомиксиса. (Сидорчук и др., 2007). На основе линии SR1 с помощью андрогенеза in vitro, колхицинирования и направленных скрещиваний были созданы нетрансгенные растения табака разного уровня плоидности (n, 3n, 4n). Для изучения микроспорогенеза анализируемых линий табака на световом уровне материал фиксировали в уксуснокислом спирте и анализировали на давленых препаратах, окрашенных уксуснокислым кармином (Sigma, USA). Сравнение частот цитомиксиса в микроспорогенезе отдельных растений табака и растений разного уровня плоидности (3 растения для каждого уровня) проводили с помощью двухфакторного дисперсионного анализа для качественных признаков (Лакин, 1973; Васильева, 2007). Для ультраструктурного анализа использовали пыльники растений линии Res79 и SR1. Материал фиксировали в 2,5% глутаральдегиде (Serva, Germany) с постфиксацией в 1% растворе тетраокиси осмия (Азурит, Россия), с последующей заливкой в эпоксидную смолу «Аралдит» (Fluka, Switzerland). Ультратонкие срезы толщиной около 80 нм получали на ультрамикротоме Ultracut UCT (Leica, Швейцария), после чего проводили двойное окрашивание цитратом свинца и уранил ацетататом (Serva, Germany). Окрашенные срезы исследовали с помощью просвечивающих электронных микроскопов JEM 100S (Jeol, Япония) и Libra120 (Carl Zeiss, Германия) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Микроскопирование образцов проводили на базе Центра коллективного пользования микроскопического анализа биологических объектов Сибирского Отделения Российской академии наук. 3 Цитохимическую локализацию активности каллазы (3-β-D-glucan glucanohydrolase, EC 3.2.1.39) проводили с использованием модифицированной методики для выявления активности целлюлазы (Bal, 1974). Пыльники растений линий 16.70 и SR1 фиксировали в смеси 1% глутаральдегида и 4% параформальдегида (Sigma, USA) (Karnovsky, 1965) при 0о С. Затем материал отмывали и инкубировали с 1% ламинарином (Sigma, United Kingdom) и затем в растворе Бенедикта (Fluka, Denmark). Далее материал постфиксировали в 1% OsO4, после чего заливали в эпоксидную смолу «Аралдит». Ультрамикротомирование, контрастирование и исследование срезов проводили по методике, описанной выше. Геномную ДНК выделяли из пыльников растений линии SR1 и 16.70, с помощью СТАВ (Rogers, Bendich, 1985; с модификациями). Электрофоретическое разделение ДНК проводили в 2% агарозный геле. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние уровня плоидности растения на частоту цитомиксиса в микроспорогенезе табака В результате анализа микроспорогенеза полиплоидной серии табака выявлены различия в частоте цитомиксиса у растений разного уровня плоидности. Показано, что частота цитомиксиса достоверно различается в микроспорогенезе диплоидных, триплоидных и тетраплоидных растений, а частота цитомиксиса в микроспорогенезе гаплоидов не отличается от диплоидов (Таблица 1). Соотношение частот цитомиксиса в микроспорогенезе полиплоидной серии можно представить следующим образом: n=2n<3n<4n. Полученные данные ставят под сомнение распространенный в литературе постулат о том, что причиной повышения уровня цитомиксиса в микроспорогенезе является исключительно несбалансированность генома (Haroun, 1995; Peng et al., 2003). Наиболее несбалансированными растениями в нашем эксперименте являются полностью стерильные гаплоиды и триплоиды, однако частота цитомиксиса у гаплоидов не отличается от нормы (диплоидов), а у триплоидов значительно меньше, чем у тетраплоидов. Эти данные позволяют сделать вывод, что в случае табака, определяющим фактором, влияющим на частоту цитомиксиса, является количество хроматина, то есть чем выше уровень плоидности, тем чаще среди микроспороцитов отмечаются случаи межклеточной миграции ядер. При уменьшении количества хроматина (в случае гаплоидов) частота цитомиксиса не меняется. Таблица 1. Частота цитомиксиса в микроспорогенезе растений табака с разным уровнем плоидности. 2n Проанализировано клеток Клеток с цитомиксисом Число % ± SХср 24 57430 498 0,87 ± 0,03 48 46611 438 0,94 ± 0,03 72 23648 5826 24,63 ± 0,27 96 49958 21228 42,49 ± 0,21 4 2. Ультраструктурные особенности цитомиксиса в микроспорогенезе табака Данные ультраструктурного анализа микроспорогенеза изучаемых линий табака показали, что появление ЦК и миграция по ним ядер характерна как для диплоидных, так и для тетраплоидных растений, и в целом цитологическая картина этих процессов сходна у растений разных линий. На Рисунке 1 представлен цитомиксис на ультраструктурном уровне в микроспороцитах табака в профазе I мейоза. Именно на этой стадии мейоза выявляется максимальная частота миграции ядер между микроспороцитами. На Рисунке 1 A представлены две соседние клетки, соединенные ЦК друг с другом, а также с прилегающими клетками (указано стрелками). Заметно, что по этим каналам происходит межклеточная миграция ядер. В процессе ядерной миграции выявляется определенная направленность, ядра всех клеток пересекают клеточную стенку только в одном направлении, в данном случае не наблюдается движения ядер навстречу друг другу. Таким образом, образуется подобие цепочки из клеток, связанных мигрирующими ядрами. На представленном рисунке хорошо видно, что хроматин во всех четырех микроспороцитах находится на одной стадии компактизации, и каких-либо отклонений, связанных с десинхронизацией микроспороцитов, не наблюдается, также не отмечается каких либо патологических изменений в структуре клеток. На Рисунке 1 A показано, что перемещение каждого ядра из одной клетки в другую происходит одновременно по нескольким близкорасположенным каналам. При переходе через ЦК, ядерная оболочка вытягивается, образуя выросты, внутри которых можно наблюдать хроматин. Вытягивание ядерной оболочки по направлению движения ядра, вероятно, вызывается цитоскелетными структурами клетки, которые, предположительно, и обеспечивают движение ядер при цитомиксисе. Можно предположить, что после того как в реципиентную клетку переходит ядерная оболочка, она увлекает за собой хроматин, прикрепленный к ее внутренней поверхности (Рисунок 1 A). На Рисунке 1 Б при большем увеличении представлено ядро, переходящее по ЦК в другую клетку. Видно, что ядерная оболочка сохраняет свою целостность до и после перехода через ЦК (указано стрелками). Следует отметить, что до подхода к ЦК хроматин обладает характерной для стадии пахитены структурой (Рисунок 1 Б), однако при приближении к каналу, внутри него и на выходе из канала хроматин выглядит как однородная темноокрашенная масса (Рисунок 1 Б). Несмотря на это, через некоторое время исходная структура хроматина восстанавливается, и какихлибо видимых изменений в ней не обнаруживается (Рисунки 1 A, В, Г). 5 Рисунок 1. Цитомиксис и его последствия в микроспороцитах табака линий SR1 (A) и Res79 (Б-Г) на стадии пахитены A – цитомиксис в микроспороцитах табака с последовательным однонаправленным перемещением ядер из клетки в клетку справа налево, стрелками указаны ЦК, часть каналов не попала в плоскость среза Б – миграция ядра через ЦК, стрелками указана непрерывность ядерной оболочки, миграция ядра в данном случае происходит в направлении снизу вверх В – микроядра, образовавшиеся в результате цитомиксиса, обозначены звездочками. В исходной клетке выявляется фрагмент ядра, оставшийся после миграции ядра в другую клетку, указан стрелкой Г – микроядро, образовавшееся в результате цитомиксиса. В структуре хромосом выявляется синаптонемный комплекс, указан стрелкой, на вставке представлен синаптонемный комплекс (увеличено) КС – клеточная стенка; Хр – хроматин, масштабная линейка A = 5 µм; Б = 1 µм, В = 2 µм; Г = 1 µм, вставка 500 нм По нашим наблюдениям цитомиксис, как правило, приводит к образованию микроядер из мигрирующего ядра. На Рисунке 1 В представлено образование более чем 10 микроядер с хроматином в результате цитомиксиса, при этом в исходной клетке виден остаток мигрирующего ядра (указано стрелкой). Следует обратить внимание на то, что во всех микроядрах, образовавшихся в результате цитомиксиса, и во фрагменте ядра, который остался в исходной клетке, структура хроматина выглядит одинаково (Рисунок 1 В). Более того, в микроядрах, образовавшихся в результате цитомиксиса, четко выявляется такая нативная структура хромосом как синаптонемный комплекс (Рисунок 1 Г, указано стрелками), что свидетельствует о сохранении нормальной организации хромосом после перехода через ЦК. В пользу идеи о том, что хроматин не повреждается при цитомиксисе, говорит тот факт, что по нашим наблюдениям целостность ядерной оболочки при цитомиксисе не нарушается и 6 хроматин, во время миграции по ЦК, а также в реципиентной клетке, постоянно окружен ядерной оболочкой (Рисунок 1 Б). На Рисунке 2 представлена более сложная картина цитомиксиса между тремя микроспороцитами, обозначенными номерами 1–3, ядра этих клеток соответственно обозначены как Я1, Я2 и Я3. Между клетками выявляются пять ЦК (указаны стрелками), три из которых участвуют в миграции ядер. Ядро Я2 из клетки №2 переходит в клетку №1 одновременно по двум ЦК. Наиболее интересным моментом представленной картины цитомиксиса является образование прямого контакта между ядрами Я1 и Я2 (указано белой стрелкой и увеличено на вставке). Подобное взаимодействие ядер соседних клеток при цитомиксисе описано впервые. Контакт между ядрами Я1 и Я2 обеспечивается посредством «ядерного мостика», который образовался, вероятно, в результате слияния ядерных оболочек двух контактирующих ядер после миграция Я2 через ЦК. При контакте между двумя ядрами произошло формирование ограниченного ядерной оболочкой канала, напрямую связывающего ядра двух клеток – «ядерного мостика» диаметром около 250 нм (Рисунок 2). Формирование данных структур при цитомиксисе выявлено нами в единичных случаях в линии SR1. Вполне возможно, что такие структуры могли быть образованы между микроспороцитами и других исследуемых линий табака, однако их малый размер, специфика образования, а также случайное прохождение срезов при ультрамикротомировании, могли препятствовать их обнаружению. Необходимо отметить, что на протяжении всего «ядерного мостика» не наблюдается участков, в которых целостность ядерной оболочки была бы нарушена (Рисунок 2, вставка). Внутри «ядерного мостика» обнаруживается хроматин, который, возможно, перемещается из одного ядра в другое. Так как ядро Я2 перемещается в клетку №1, можно предположить, что если хроматин движется внутри «ядерного мостика», то это движение осуществляется из ядра Я2 в ядро Я1. Следует обратить внимание на то, что образование прямых контактов между ядрами разных клеток через ЦК, наблюдалось в редких случаях и выводы, сделанные на основании этих данных, являются предварительными. Однако они позволяют сделать некоторые интересные предположения, например о хроматине, который участвует в этом процессе. Движение хроматина по «ядерному мостику» между двумя клетками можно рассматривать как его перемещение внутри одного ядра, поскольку хроматин находится в замкнутом пространстве, ограниченном ядерной оболочкой, и, не покидая его, оказывается в другом ядре (Рисунок 2). Можно предположить, что хроматин, участвующий в этом процессе, не подвержен действию каких-либо повреждающих факторов, и, следовательно, его миграция может иметь определенные генетические последствия. Следует подчеркнуть, что в момент образования «ядерных мостиков» в клетках не наблюдается пикнотизации хроматина, вакуолизации цитоплазмы или других признаков клеточной патологии. Наблюдаемые нами случаи межклеточной миграции ядер позволяют заключить, что в микроспороцитах табака при цитомиксисе мигрирующее ядро чаще всего разделяется на микроядра после перехода в другую клетку (Рисунки 1 В, Г). Однако в случае, когда при цитомиксисе происходит контакт двух ядер, это может привести к образованию «ядерных мостиков» (Рисунок 2). 7 Рисунок 2. Цитомиксис с образованием «ядерного мостика» на стадии пахитены в микроспороцитах табака линии SR1. ЦК обозначены черными стрелками, «ядерный мостик» – белой стрелкой, микроядра – белыми звездочками, фрагмент ядра Я3, перешедший в клетку №2, обозначен черной звездочкой. 1–3 – номера клеток; Я1–Я3 – номера ядер, соответствующие номерам клеток; на вставке «ядерный мостик», увеличено. Показано что на протяжении «ядерного мостика» ядерная оболочка непрерывна (стрелки). КС – клеточная стенка, Хр – хроматин, масштабная линейка 2 µм; вставка 500 нм Перемещение хроматина из одного микроспороцита в другой через «ядерные мостики», либо в виде микроядер, предполагает переход части генетического материала между клетками, участвующими в цитомиксисе. На основании проведенных нами ультраструктурных исследований микроспорогенеза двух линий табака, можно сделать вывод, что структура хроматина после перехода через цитомиктические каналы не изменяется. Это позволяет рассматривать цитомиксис не как патологию, а как естественный клеточный процесс. Сохранность структуры хроматина после перехода в другую клетку свидетельствует в пользу идеи об образовании анеуплоидных и полиплоидных гамет в результате цитомиксиса. Однако для однозначных выводов этих данных недостаточно, поскольку перенос неповрежденного хроматина в другую клетку не гарантирует его включение в ядро в виде дополнительных хромосом, так как он впоследствии может быть и элиминирован. Даже перемещение хроматина в другое ядро по «ядерному мостику» не гарантирует того, что позднее этот хроматин не будет исключен из состава ядра. 3. Формирование цитомиктических каналов между микроспороцитами табака Формирование ЦК каналов между микроспороцитами табака начинается на самых ранних стадиях мейотического деления в лептотене-зиготене. В этот момент пектино-целлюлозная клеточная стенка микроспороцитов пронизана одиночными 8 плазмодесмами и среди них появляются первичные ЦК. На основании проведенного морфометрического анализа установлено, что ширина плазмодесм в микроспороцитах табака на стадиях лептотена-зиготена варьировала от 30,97 до 87,55 нм, а ЦК на стадиях лептотена-диплотена – от 43,71 до 620,77 нм. Сравнение средних значений убедительно доказывает, что ширина ЦК более чем в 4 раза превышает ширину плазмодесм. При этом минимальные значения размеров ЦК практически перекрываются с областью значений размеров плазмодесм. Полученные данные дают основание выдвинуть предположение о том, что с началом микроспорогенеза отдельные плазмодесмы могут быть преобразованы в ЦК. Между микроспороцитами табака на стадии лептотены наблюдается дискретное существование двух типов каналов – плазмодесм с десмотрубочкой и ЦК, равных им по размеру, но без внутренней структуры. При этом не наблюдается случаев постепенного формирования ЦК, то есть не было обнаружено ЦК, частично пересекающих клеточную стенку. ЦК формируются очень быстро, полностью сходные по размерам и положению с плазмодесмами, что позволяет сделать нам вывод о формировании ЦК на основе единичных плазмодесм при разрушении внутренней структуры последних. Несмотря на малые размеры ЦК, образованных на основе плазмодесм, по ним происходит цитомиктичная миграция клеточных органелл, в первую очередь пластид. По всей видимости, в дальнейшем ЦК, образованные на основе плазмодесм, увеличиваются в размерах, и по ним становится возможной миграция ядер. ЦК, образованные на основе плазмодесм в начале мейотического деления, в микроспорогенезе табака существуют непродолжительное время, поскольку интенсивно откладывающийся слой каллозы закрывает образованные ЦК и оставшиеся плазмодесмы. Несмотря на то, что к стадии пахитены первичные ЦК полностью закрываются каллозой, для многих видов неоднократно наблюдалась межклеточная миграция ядер в ходе всего микроспорогенеза, вплоть до стадии тетрад (Sheidai, Bagheri-Shabestarei, 2007; Song, Li, 2009). Это предполагает существование ЦК между микроспороцитами после стадии пахитены и, соответственно, наличие механизма вторичного образования ЦК с локальным разрушением каллозной стенки. Данные, полученные при ультраструктурном анализе подтвердили присутствие ЦК между микроспороцитами табака после стадии пахитены по крайней мере, до стадии метафазы I. Таким образом, установлено, что ЦК между микроспороцитами табака существуют после окончания профазы I, несмотря на то, что первичные ЦК, образовавшиеся в начале мейоза, закрываются каллозой. Указанные факты подтверждают гипотезу о существовании механизма вторичного формирования ЦК. Кандидатами на участие во вторичном образовании ЦК являются сферосомоподобные везикулы – электронно-плотные тела, которые появляются в микроспороцитах после формирования каллозной стенки. На стадии пахитены сферосомоподобные везикулы имеют округлую или овальную формы и обнаруживаются в контакте с каллозной стенкой, реже они выявляются свободно лежащими в цитоплазме или вблизи ядра. Высокая осмиофильность этих органелл, визуально очень сходных со сферосомами (Yatsu, Jacks, 1972), свидетельствует об их липидном содержимом. 9 Сходные с электронноплотными телами сферосомоподобные вакуоли были выявлены ранее в стеблевых апексах березы (Betula pubescens) (Rinne et al., 2001). Авторами установлено, что сферосомоподобные вакуоли играют важную роль в восстановлении симпластической связи между клетками после периода покоя, поскольку выявленный в их составе фермент каллаза способен разрушать каллозные пробки, закрывающие плазмодесмы (Rinne et al., 2001). На момент появления сферосомоподобных везикул в микроспороцитах табака каллозная стенка уже хорошо развита, и в зонах контакта этих органелл и клеточной стенки можно наблюдать появление характерных участков лизиса каллозы. Зоны лизиса каллозы вблизи расположения сферосомоподобных везикул предполагают ферментативную активность этих органелл. Для доказательства вовлеченности сферосомоподобных везикул в образование ЦК, а также для того чтобы установить, каким образом происходит вторичное формирование ЦК необходимо было локализовать места активности каллазы – фермента гидролизующего каллозу, поскольку на данном этапе каллоза является единственным компонентом клеточной стенки микроспороцитов табака. Для решения данной задачи был выбран модифицированный метод цитохимической локализации активности ферментов, разрушающих полисахариды (Bal, 1974). После проведения соответствующих процедур окрашивания, в микроспороспороцитах табака линий SR1 и 16.70 реакционные продукты (РП) активности каллазы обнаруживались в виде мелких электронноплотных кристаллов (Рисунок 3). Реакционные продукты (РП) активности каллазы были выявлены в сферосомоподобных везикулах (Рисунок 3 А), внутри клеточной стенки (Рисунок 3 Ж) и не обнаруживались в АГ и ЭПР. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что содержимое сферосомоподобных везикул обладает ферментативной активностью и эти органеллы могут разрушать каллозную стенку, формируя новые ЦК, участвуя в реорганизации клеточной стенки микроспороцитов. Присутствие фермента каллазы в сферосомоподобных везикулах и их роль в формировании ЦК между микроспороцитами выявлены нами впервые. На основании полученных результатов мы предполагаем следующий способ выделения каллазы сферосомоподобными везикулами при формировании ЦК. Первоначально сферосомоподобная везикула контактирует с вакуолью, заполненной каллозой, и проникает внутрь нее (Рисунок 3 А). Затем, каллозная вакуоль, содержащая внутри себя сферосомоподобную везикулу, транспортируется к клеточной стенке (Рисунок 3 Б, В). При контакте с плазматической мембраной, содержимое каллозной вакуоли высвобождается за границу клетки по принципу экзоцитоза, в результате чего переносимая ею каллоза и сферосомоподобная везикула оказывается включенной в состав клеточной стенки (Рисунок 3 Г, Д). Стоит отметить, что во время транспортировки сферосомоподобных везикул и их включения в клеточную стенку РП активности каллазы не обнаруживаются, что свидетельствует об отсутствии ферментативной активности этих органелл на этом этапе. По всей видимости, после того, как сферосомоподобная везикула проникает внутрь клеточной стенки, она разрушается под действием неизвестного фактора, взрывообразно выделяя свое содержимое в окружающее пространство (Рисунок 3 Е). Высвобождаемая каллаза, локально растворяет клеточную стенку (Рисунок 3 10 Ж), образуя при этом широкие межклеточные каналы, что, как мы полагаем, и делает возможным существование ЦК после образования каллозной стенки. Рисунок 3. Сферосомоподобные везикулы в микроспорогенезе табака на стадиях пахитены-метафазы I после цитохимической локализации активности каллазы, линия SR1 (Г, Е), линия 16.70 (А-В, Д, Ж) А – сферосомоподобная везикула проникает в вакуоль с каллозой, РП активности каллазы (черные стрелки) выявляются в зоне контакта органелл (увеличено на вставке) Б, В – транспорт сферосомоподобных везикул (указаны стрелками) внутри вакуоли с каллозой Г – слияние вакуолей с каллозой (вакуоли обозначены звездочками) с клеточной стенкой, стрелкой обозначена сферосомоподобная везикула Д – сферосомоподобная везикула (указана стрелкой) заключенная внутри клеточной стенки Е – взрывообразное выделение каллазы при разрушении сферосомоподобной везикулы, стрелками указаны фрагменты органеллы Ж – РП активности каллазы внутри клеточной стенки, участок распространения РП по размерам соответствует ЦК КС – клеточная стенка, РП – реакционные продукты, масштабная линейка А = 250 нм и 100 нм на вставе; Б, В, Е = 250 нм; Г = 1 µм; Д, Ж = 500 нм Суммируя результаты наших исследований и данные литературы, общую схему формирования ЦК в микроспорогенезе высших растений можно представить следующим образом – первичные ЦК формируются в профазе I мейоза, на стадии лептотены-зиготены, когда клеточная стенка представлена срединной пластинкой и тонким слоем целлюлозы. При этом формирование первичных ЦК в микроспороцитах может происходить с помощью гидролитических ферментов, выделяемых ЭПР и АГ (Wang et al., 1998; Yu et al., 2004), на основе единичных плазмодесм (Рисунок 4 Б, ЦК №1), при слиянии нескольких плазмодесм (Рисунок 4 Б, ЦК №3) или de novo без связи с плазмодесмами (Рисунок 4 Б, ЦК №2). 11 После образования первичных ЦК по ним происходит миграция мелких клеточных органелл, в первую очередь пластид. ЦК постепенно увеличиваются, и по ним начинают переходить ядра, с образованием микроядер или «ядерных мостиков» (Рисунок 4 Б, В). Далее со стадии пахитены пектино-целлюлозная клеточная стенка заменяется на каллозную (Рисунок 4 Г), которая окружает микроспороциты вплоть до стадии тетрад. В связи с перестройкой клеточной стенки начинается вторичное формирование ЦК. Во вторичном формировании ЦК после развития каллозной стенки активное участие принимают сферосомоподбные везикулы, способные выделять каллазу. Приблизительно после стадии метафазы I микроспороциты начинают отделяться друг от друга и постепенно изолироваться, хотя ЦК между микроспороцитами продолжают существовать. Вероятно, в случае табака, существование ЦК в течение всего первого мейотического деления необходимо для нормального микроспорогенеза. Возможно, что процессы первичного и вторичного формирования ЦК у разных видов растений могут значительно отличаться от той картины, которая описана нами для табака. Рисунок 4. Схема формирования и функционирования цитомиктических каналов в микроспорогенезе (ядра мигрируют через ЦК слева направо) А – микроспороциты при вступлении в мейоз, клетки окружены первичной клеточной стенкой и соединены плазмодесмами Б, В – микроспороциты на стадии зиготены-пахитены, ЦК образуются на месте единичных плазмодесм (1) и слиянии нескольких (3), а также de novo (2), по каналам происходит миграция ядра, в реципиентной клетке в результате цитомиксиса образуются микроядра (обозначены звездочками), в некоторых случаях «ядерные мостики» (ЯМ) Г – микроспороциты на стадии поздней пахитены, первичная клеточная стенка заменяется каллозной, первичные ЦК закрываются, вторичные ЦК формируются с помощью сферосомоподобных везикул Я – ядро, ЭПР – эндоплазматичекий ретикулум, Пд – плазмодесма, СП – срединная пластинка, Ц – целлюлоза, ПМ – плазматическая мембрана, К – каллоза 12 3. Состояние ядерной ДНК в микроспороцитах растений табака с высокой и низкой частотой цитомиксиса Чтобы оценить жизнеспособность клеток после цитомиксиса в первую очередь необходимо определить присутствие в них деградирующей ДНК. Электрофоретическое разделение в агарозном геле является одним из наиболее простых методов оценки состояния целостности геномной ДНК. Если интактная ДНК практически не мигрирует в геле, то деградирующая ДНК расходится в геле, формируя некротический «шмер» или «апоптозную лестницу» (Zhivotovsky, Orrenius, 2001; Fan, Xing, 2004). Для оценки целостности ДНК в микроспороцитах после цитомиксиса, геномную ДНК выделяли из пыльников растений с низкой и высокой частотой цитомиксиса и визуализировали путем электрофоретического разделения в агарозном геле. Пыльники согласно их размеру отбирали на стадиях, когда в микроспороцитах заканчивается массовый цитомиксис и, в случае если мигрирующая при цитомиксисе ДНК деградирует, при анализе должны появляться характерные признаки этой деградации. При выделении ДНК из целого пыльника в результаты анализа может вносить погрешность присутствие в выделенном материале геномной ДНК вегетативных клеток пыльника. Однако в контрольном образце ДНК, выделенной из пыльников растений низкоцитомиктичной линии SR1, мы наблюдаем отсутствие деградирующей или поврежденной ДНК (Рисунок 5), поэтому присутствием ДНК вегетативных клеток пыльника в данном случае можно пренебречь. Рисунок 5. Электрофоретическое разделение геномной ДНК, выделенной из пыльников высокоцитомиктичных и контрольных растений табака в 2% агарозном геле М – молекулярный маркер 1 – ДНК с «апоптозной лестницей» (стрелками указана характерная для апоптоза фрагментация ДНК) 2 – геномная ДНК, выделенная из пыльников растений линии SR1 3 – геномная ДНК, выделенная из пыльников растений линии 16.70 4 – ДНК, выделенная из листьев растения линии SR1 Если ДНК микроспороцитов высокоцитомиктичных растений подвергается деградации после цитомиксиса, то при электрофоретическом анализе в геле, помимо высокомолекулярной фракции неповрежденной геномной ДНК, 13 выделенной из вегетативных клеток пыльника и микроспороцитов, не вовлеченных в цитомиксис, должна выявляться и низкомолекулярная фракция деградирующей ДНК. На основании результатов анализа геномной ДНК, выделенной из пыльников линии 16.70, в которых почти половина клеток участвует в цитомиксисе, установлено, что вся выделенная ДНК представлена в геле в виде высокомолекулярной фракции и в ней отсутствуют признаки деградации (Рисунок 5). ВЫВОДЫ 1. Выявлено пропорциональное увеличение частоты цитомиксиса в микроспорогенезе у триплоидных и тетраплоидных растений табака по сравнению с диплоидными растениями. 2. Установлено, что гаплоидные и диплоидные растения табака не различаются между собой по частоте цитомиксиса в микроспорогенезе. 3. Цитомиктические каналы в микроспорогенезе табака могут быть образованы двумя путями: на основе плазмодесм и de novo при участии сферосомоподобных везикул. Эти пути формирования каналов разделены во времени и сменяют друг друга в ходе первой мейотической профазы. 4. Выявлено присутствие фермента каллазы в сферосомоподобных везикулах, выделение которого происходит при выходе сферосомоподобных везикул из клетки. 5. Не выявлено отличий в механизмах формирования и функционирования цитомиктических каналов в тетраплоидных и диплоидных растениях табака. 6. Установлено, что после перехода ядра через цитомиктический канал в другую клетку происходит разделение ядра на микроядра, в редких случаях при миграции ядра наблюдается формирование «ядерных мостиков». 7. Ядерная оболочка и хроматин мигрирующих ядер сохраняют целостность внутри цитомиктического канала. Хроматин после выхода из цитомиктического канала не проявляет видимых признаков повреждения. 8. Показано отсутствие признаков деградации геномной ДНК выделенной из пыльников растений табака с высокой частотой цитомиксиса. СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Мурсалимов С.Р., Байбородин С.И., Сидорчук Ю.В., Шумный В.К., Дейнеко Е.В. Особенности формирования цитомиктических каналов в материнских клетках пыльцы Nicotiana tabacum L. // Цитология и генетика. 2010. - Т. 44. № 1. - С. 19-24. 2. Mursalimov S.R., Deineko E.V. An ultrastructural study of cytomixis in tobacco pollen mother cells // Protoplasma. - 2011. V. 248. № 4. - P. 717-724. 3. Mursalimov S.R., Deineko E.V. An ultrastructural study of microsporogenesis in tobacco line SR1 // Biologia. - 2012. - V. 67. № 2. - P. 369376. 4. Mursalimov S., Sidorchuk Yu., Deineko E. The role of spherosome-like vesicles in formation of cytomictic channels between tobacco microsporocytes // Biologia Plantarum. - 2012. - DOI: 10.1007/s10535-012-0276-y. 14
