Методы выявления мутагенов окружающей среды

Методы выявления мутагенов
окружающей среды
 Генетическая (прежде всего - мутагенная)
активность факторов среды может быть
исследована на основе разнообразных
критериев у широкого круга объектов:
генные мутации у бактерий, дрожжей и
водорослей; хромосомные аберрации и
летальные мутации у животных и
растений.
 Наибольший интерес представляет генетическая
активность исследуемых агентов для человека.
 Так как прямое исследование их действия на
человека невозможно, приходится ограничиваться
результатами, получаемыми на модельных
объектах.
 Эти результаты в значительной степени
справедливы и для человека из-за биологической
универсальности свойств генетического
материала.
Перечень наиболее широко используемых тестобъектов для выявления мутагенов в
окружающей среде
Тест-объект
Регистрируемые изменения
Микроорганизмы
Salmonella typhimurium
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Генные мутации
Генные мутации, ДНК-повреждения
ДНК-повреждения
Грибы
Saccharomyces cerevisiae
Aspergillus nidulans
Neurospora crassa
Генные мутации
Анеуплоидия
Анеуплоидия
Растения
Tradescantia sp.
Vicia faba
Allium cera
Генные мутации, микроядра
СХО, Хромосомные аберрации
Хромосомные аберрации
Перечень наиболее широко используемых тестобъектов для выявления мутагенов в
окружающей среде
Тест-объект
Регистрируемые изменения
Насекомые
Drosophila melanogaster
Рекомбинации, генные мутации, хромосомные
аберрации, анеуплоидия
Клетки млекопитающих (in vitro)
Культуры клеток грызунов (хомяки,
крысы, мыши)
Крысиные гепатоциты
Клетки яичника или легких хомяка
Мышиная лимфома
Хромосомные аберрации, СХО, микроядра
ДНК-повреждения
Генные мутации
Генные мутации
Организм животных (in vivo)
Костный мозг in vivo
Лимфоциты in vivo
Гепатоциты крысы
ДНК-повреждения,
СХО, микроядра
ДНК-повреждения
хромосомные
аберрации,
Перечень наиболее широко используемых тестобъектов для выявления мутагенов в
окружающей среде
Тест-объект
Регистрируемые изменения
Клетки человека (in vitro)
Лимфоциты, Фибробласты
Эритроциты,
Эптелиальные клетки
ДНК-повреждения, хромосомные
аберрации, СХО, микроядра
Микроядра
Тест-системы для выявления
мутагенов
 Существует более 200 разных тест-систем для
определения мутагенного действия химических и
физических факторов.
 Химические вещества индуцируют мутации всех
трех типов: генные, хромосомные и геномные.
Универсального метода для обнаружения всех
типов мутаций не существует. В этой связи для
изучения мутагенности используют несколько
методов, позволяющих регистрировать индукцию
различных категорий мутаций.
Тест-системы для выявления
мутагенов
 Однако тестирование сотен или даже тысяч
химических соединений, поступающих в
окружающую среду, невозможно проводить
одновременно несколькими методами. К тому же
изучение мутагенности на млекопитающих
требует больших усилий, затрат и времени.
Применение таких методов оправдано только при
избирательном тестировании, т.е. при
установлении очередности.
Тест-системы для выявления
мутагенов
 Один из подходов к установлению этой
очередности заключается в ступенчатой
системе испытаний, которая основывается
на том, что фактически все генетически
опасные вещества можно выявить с
помощью простых или быстрых методов
скрининга (просеивания).
Тест-системы для выявления
мутагенов
 К скрининговым тест-системам относятся методы,
в которых в качестве индикатора мутагенности
используются микроорганизмы.
 Мутагены, обнаруженные при скрининге,
подвергают далее всестороннему исследованию
на тест-системах, позволяющих учитывать
индукцию генетических нарушений в клетках
млекопитающих in vitro и in vivo.
Тест Эймса
 Имея в своем распоряжении
разные мутантные штаммы
сальмонеллы, нуждающиеся в
гистидине, зная
молекулярную природу этих
мутационных изменений:
замены, вставки или
выпадения пар оснований в
ДНК, Б. Эймс (1973г.)
предложил изучать реверсии
гистидиновых мутантов, то
есть восстановление у них
способности синтезировать
гистидин, и, следовательно
расти на среде без гистидина
в результате воздействия
различных мутагенов.
Bruce Ames
UC Berkeley
Тест Эймса
 Тест относительно прост:
достаточно засеять среду без
гистидина мутантом
сальмонеллы, нуждающимся
в гистидине (который
естественно не растет на
такой среде), и нанести в
центр используемой для этого
чашки Петри испытуемое
химическое соединение.
Через 2-3 суток можно видеть
появление колоний мутантов
(в данном случае
ревертантов) вокруг пятна
нанесенного вещества, если
оно обладает генетической
активностью.
из http://www.personal.psu.edu
Тест Эймса
Колонии – ревертанты тестерного штамма
ТА 98 (сдвиг рамки считывания)
Колонии - ревертанты тестерного
штамма ТА 100 (замена пар оснований)
Метаболическая активация
 Для оценки мутагенной активности возможных непрямых
мутагенов в тестируемом образце в тестерную систему
вводят специальный активирующий компонент, содержащий
монооксигеназы.
 Активирующий компонент включает постмитохондриальный
супернатант гомогената печени крыс (фракция S-9) и
кофакторы, необходимые для нормального
функционирования микросомных систем окисления.
 фракцию S-9 получают из печени крыс, которым
предварительно вводят индукторы микросом. В качестве
индукторов применяют фенобарбитал, 3-метилхолантрен,
полихлорированные бифенилы или совол.
Характеристика основных тест-штаммов Salmonella
typhimurium, используемых в тесте Эймса
Штаммы
Мутации
Плазмида
pKM 101
Тип
мутаций
регистрируемых
ауксотрофность по
гистидину
rfa
uvrB
G-45
G-46
–
–
–
Замена оснований
TA 1950
G-46
–
+
–
–”–
TA 1534
D-3052
–
+
–
Сдвиг считывания
TA 1535
G-46
+
+
–
Замена оснований
TA 1536
C-207
+
+
–
Сдвиг считывания
TA 1537
C-3076
+
+
–
–”–
TA 1538
D-3052
+
+
–
–”–
TA 100
G-46
+
+
+
Замена оснований
TA 98
D-3552
+
+
+
Сдвиг считывания
 Тест Эймса является одним из основных
методов в скрининговых программах
различных стран, когда нужно
сравнительно быстро проанализировать
большое число соединений и отобрать
среди них те, которые потенциально
могут явиться мутагенами для человека.
 Такое широкое применение этого
метода связано с высокой корреляцией
между канцерогенной и мутагенной
активностями химических веществ.
Цитогенетические методы
 Используются в качестве одного из
основных компонентов в общепринятые
наборы тест-систем оценки мутагенности
радиационных и химических факторов
среды.
Цитогенетические методы
 В цитогенетических тестах анализируется весь
геном целиком непосредственно в микроскоп, что
имеет большое значение в случае химических
соединений, которые имеют специфические
участки действия на геном (горячие точки). Еще
одним преимуществом является то, что эти
методы выполняются сравнительно быстро и
относительно с небольшими затратами.
Методы учета хромосомных
аберраций
 Изменение числа и структуры хромосом в
соматических клетках и зародышевых клетках
могут возникать спонтанно или после воздействия
физическими и химическими агентами.
Нарушения хромосом, возникающие в
зародышевых клетках, приводят к разнообразной
врожденной патологии у человека. Эти
нарушения принято относить к мутациям, которые
могут быть разделены на геномные в случае
изменения числа хромосом и хромосомные – при
структурных нарушениях.
Методы учета хромосомных
аберраций
 Исследования последних лет
свидетельствуют о том, что накопление
хромосомных мутаций в соматических
клетках является одним из факторов,
индуцирующих развитие клонов
злокачественных клеток, а также процессы
старения.
Методы учета хромосомных
аберраций
 Анализ хромосом соматических клеток
методически хорошо разработан. Аномалии
хромосом в экспериментальных условиях можно
индуцировать различными агентами в клеточных
культурах и в соматических клетках лабораторных
животных in vivo. В последнем случае обычно в
качестве модели используют клетки костного
мозга (мыши, крысы).
Методы учета хромосомных
аберраций
 Костный мозг млекопитающих является наиболее
широко используемой моделью для исследования
мутагенной активности химических соединений in
vivo. Это связано, во-первых, с тем, что клетки
костного мозга имеют высокую пролиферативную
активность и, во-вторых, простотой приготовления
препаратов. Морфология хромосом большинства
видов лабораторных животных хорошо изучена.
 Тестирование обычно проводят на мышах,
анализируют и учитывают как число метафаз с
аберрациями, так и общее число структурных
нарушений хромосом.
 Метод учета хромосомных аберраций в
клетках костного мозга млекопитающих
является составной частью практически всех
комплексов методов оценки мутагенных
свойств у химических веществ, принятых почти
во всех странах мира проводящих такую
оценку.
Метод учета хромосомных
аберраций у человека
 Культура лейкоцитов человека широко
используется для изучения
радиационного и химического
мутагенеза у человека.
 К достоинствам культуры лимфоцитов
человека относятся доступность
материала, синхронность клеточной
популяции, низкий уровень спонтанного
мутирования, отработанность техники
культивирования и изученность
морфологии хромосом.
Этапы получения препаратов метафазных хромосом человека






культивирование лимфоцитов
крови на искусственных
питательных средах;
стимуляция митозов
фитогемагглютинином (ФГА);
добавление алкалоида колхицина
(разрушает нити веретена
деления) для остановки митоза на
стадии метафазы;
обработка клеток
гипотоническим раствором,
вследствие чего хромосомы
"рассыпаются" и лежат
свободно; последующая фиксация
и приготовление препаратов;
окрашивание хромосом;
изучение хромосом под
микроскопом
Аберрации хроматидного типа
Одиночные фрагменты (указаны стрелками)
Аберрации хроматидного типа
Одиночные фрагменты (указаны стрелками)
Аберрации хроматидного типа
Внутрихромосомный межплечевой хроматидо-изохроматидныий неполный обмен (слева).
Межхромосомный хроматидо-хроматидный полный асимметричный обмен (справа).
Аберрации хромосомного типа
 Происхождение
парных (а) и
изохроматидных (б)
фрагментов; отличие
парных фрагментов
(в) от изохроматидных
пробелов (г).
Аберрации хромосомного типа
Парные фрагменты (указаны стрелками)
Аберрации хромосомного типа
Ацентрические кольца (пунктирная стрелка)
и три свободных парных фрагмента
(сплошные стрелки).
Удвоенные ацентрическве кольца
(указаны стрелками).
Аберрации хромосомного типа
 Происхождение
кольцевой хромосомы
(а); сопоставление
гомологичных
хромосом (б).
Аберрации хромосомного типа
дицентрическая хромосома без парных
фрагментов
дицентрическая хромосома без парных
фрагментов
Аберрации хромосомного типа
Дицентрическая кольцевая хромосома
с тремя ацентрическими фрагментами
Трицентрическая хромосома
Аберрации хромосомного типа
Дицентрическая хромосома, реципрокная
транслокация между хромосомами В и С и
инверсия в хромосоме 1
дицентрическая хромосома; инверсия в
хромосоме 2
Аберрации хромосомного типа
 Происхождение
реципрокной
транслокации с
участием двух
хромосом (а);
сопоставление
перекомбинированных хромосом с
гомологами (б).
Аберрации хромосомного типа
 Происхождение
перицентрической
инверсии (а);
сопоставление
«инвертированной»
хромосомы с
гомологом (б).
Результаты картографирования цитогенетических
эффектов у населения Кемеровской области
Мутации геномного типа (анеуплоидии,
полиплоидии)
Тетраплоидный лимфоцит с парным ацентрическим фрагментом (указан
стрелкой)
Мультиаберрантные клетки
(rogue cells)
 Впервые были
обнаружены у
южноамериканских
индейцев (Bloom A.D.
et al. Chromosome
aberrations among the
Yanomama Indians //
Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 1968).
 Анализировали 4875
метафаз из ЛПК,
нашли 21 метафазу с
МА (0,43%).
Гипотезы о причинах появления
мультиаберрантных клеток
 Воздействие вирусной инфекции (вирус
полиомы человека).
 воздействие бактериальных эндонуклеаз
рестрикции.
 Воздействие радиации (при внутреннем
облучении источниками плотноионизирующего излучения).
Мультиаберрантные клетки у жителей
Кемеровской области
№
Населенный пункт
Год
Возраст
(лет)
Пол
Число
изученных
клеток
Доля аберрантных
метафаз, %*
Нарушения в rogue cells
1
Таштагол
1992
муж
14
100
9,0
dic – 2, R – 2, t -1, double minutes – 6
2
Таштагол
2005
жен
17
500
2,8
tetra -1, tric – 1, dic – 5, R – 1, t – 2, double
minutes – 16
3
Таштагол
2005
жен
15
500
4,8
dic – 2, R – 4, t – 1, fra – 7, double minutes – 7
4
Таштагол
2005
муж
15
500
4,2
tric – 1, dic – 3, double minutes – 8
5
Таштагол
2005
муж
15
200
4,5
dic – 3, R – 2, double minutes – 14
6
Таштагол
2005
муж
14
200
3,0
dic – 3, R – 3, fra – 1, double minutes – 6
7
Таштагол
2005
жен
12
400
7,5
dic – 3, fra – 6, double minutes – 4
8
Таштагол
2008
жен
10
200
4,0
dic – 2, R – 1, fra – 1, double minutes - 3
9
Таштагол
2008
жен
9
200
7,0
dic – 3, R – 1, double minutes - 4
10
Новокузнецк
1986
муж
47
100
3,0
dic – 7, double minutes - 9
11
Кемерово
1992
муж
14
100
0
dic – 1, t – 1, fra – 2
12
Кемерово
1994
муж
14
100
4,0
tric – 1, t – 2, fra – 4
13
Кемерово
1998
муж
42
100
14,0
dic – 3, double minutes – свыше 30
Сестринские хроматидные обмены
(CХО)
 Феномен обмена участками между сестринскими
хроматидами одной хромосомы привлек
внимание исследователей мутагенных факторов
окружающей среды своей высокой
чувствительностью. Так, изучение уровней
индукции СХО и хромосомных аберраций при
действии 5 мутагенными агентами на лимфоциты
человека in vitro и на клетки костного мозга
мышей in vivo показало, что эффективность
индукции СХО in vitro в 300-30 раз превышает
эффективность образования аберраций
хромосом.
Сестринские хроматидные обмены
(CХО)
 Принцип метода
обнаружения СХО
заключается в воздействии
на клетки таким образом,
чтобы две сестринские
хроматиды отличались
друг от друга. Достигается
это введением в растущую
культуру клеток 5бромдезоксиуридина (БДУ)
с последующей окраской
препаратов.
Сестринские хроматидные обмены
(CХО)
 БДУ присутствуют в среде
в течение двух клеточных
циклов. Хроматиды,
включившие БДУ в обе
субъединицы, выглядят на
окрашенных препаратах
более светлыми, чем
хроматиды, включившие
его в одну субъединицу
или не включившие
вообще.