Document 2348554
advertisement
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Программируемая клеточная смерть (ПКС) является особой формой гибели клетки, инициированной внутриклеточной программой. Разные формы ПКС встречаются практически у всех эукариотических организмов, включая одноклеточные. Апоптоз является одним из трех основных типов клеточной смерти, встречаемых у животных. В сравнении с двумя другими основными типами клеточной смерти у животных – аутофагией и регулируемым некрозом – процессы апоптоза к настоящему времени исследованы лучше всего как с биохимической, так и с морфологической точек зрения. Классический апоптоз сопровождается характерными морфологическими признаками: округлением погибающей клетки, снижением клеточного объема, конденсацией хроматина, сегментацией ядра и очень небольшими ультраструктурными модификациями цитоплазматических органелл. Кроме того, наблюдается сморщивание плазматической мембраны, которая, однако, не теряет непроницаемости до финальных стадий процесса клеточной смерти, а также разделение погибающей клетки на части, известные как апоптотические тельца. В конце процесса такие апоптотические тельца поглащаются фагоцитами и деградируют внутри них с помощью лизосом. В отличие от животных у растений, как и у многих представителей других царств живых организмов, как минимум, по двум причинам по определению не может быть «классического» апоптоза: (i) из-за наличия плотной клеточной стенки, что делает невозможным образование апоптотических телец; (ii) из-за отсутствия у растений клеток, способных к фагоцитозу (van Doorn et al., 2011). Интенсивные исследования ПКС в течении последних 30-ти лет выявили большое разнообразие в типах развития клеточной смерти, встречающихся даже у одного и того же организма. Многие из них описаны морфологически, в то время как данные об их биохимических механизмах пока охарактеризованы очень не полно. Для того, чтобы унифицировать критерии для определения разных типов клеточной смерти у животных, был создан комитет по номенклатуре клеточной смерти, который периодически публикует и обновляет рекомендации по использованию терминов в данной области. При этом, по мере накопления новых данных о молекулярных механизмах развития процессов ПКС рекомендуется переходить от морфологических определений к биохимическим (Galluzzi et al., 2012). Аналогичная работа по классификации типов клеточной смерти проводится сообществом исследователей, изучающих ПКС в растениях (van Doorn et al., 2011). Каспазы являются идеальными эффекторами для обеспечения процессов ПКС по трем причинам. Во-первых, каспазы конститутивно экспрессируются в виде неактивного зимогена. Таким образом, некоторое их количество постоянно присутствует в клетке и после активации может выполнить свою функцию в достаточно сжатые сроки. Во-вторых, реакции протеолитического расщепления, катализируемые каспазами, являются необратимыми. В третьих, существенным преимуществом является определенная полиспецифичность каспаз, что обусловливает расщепление, с одной стороны, многих субстратов, а с другой – нерасщепление абсолютно всех белков. У представителей царства животных каспазы достаточно консервативны, однако их количество и типы могут сильно варьировать у разных организмов. 1 Несмотря на то, что феномен ПКС характерен для всех видов живых организмов, представители семейства каспаз встречаются только у представителей царства животных. После публикации полноразмерных геномов резушки (Arabidopsis thaliana L.) и риса (Oryza sativa L.) стало окончательно очевидно, что у растений (по крайней мере, у этих двух видов) нет генов каспаз, которые можно было бы идентифицировать с помощью простых инструментов поиска гомологичных генов. Тем не менее, накопление многочисленных данных о том, что в процессах развития ПКС у растений детектируется каспазо-подобная активность (Bonneau et al., 2008), стимулировало исследователей примененить специальные биоинформатические методы, которые позволили обнаружить у растений очень отдаленных родственников протеиназ, относящихся к семейству каспаз, – метакаспазы (Uren et al., 2000). Кроме того, к настоящему времени охарактеризовано еще несколько протеиназ, активность которых, как считается, необходима при развитии некоторых видов ПКС у растений. Такими протеиназами являются: вакуолярный процессирующий фермент (VPE), представитель субтилизин-подобного семейства протеиназ, названный фитаспазой, а также еще две сериновые протеиназы SAS-1 и SAS-2 (Chichkova et al., 2010; Coffeen and Wolpert 2004; Hatsugai et al., 2004). Несмотря на то, что у животных известно более тысячи природных субстратов каспаз (Crawford et al., 2013), у растений к настоящему времени охарактеризован единственный природный субстрат протеиназ, обеспечивающих развтите ПКС в растениях. Им является субстрат фитаспазы – белок VirD2, но его расщепленее фитаспазой скорее всего не связано с процессами развития ПКС (Chichkova et al., 2010). В условиях хронического стресса энодоплазматического ретикулума (ЭПР), индуцированного переполнением люмена ЭПР несвернутыми или неправильно свернутыми белками, часто развиваются процессы ПКС. В дополнение к функции, направленной на запуск механизмов, восстанавливающих гомеостаз ЭПР – процесса, названного ответом на несвернутый белок (ОНБ; unfolded protein response), способствующего выживанию клетки, – существуют сигнальные пути развития ОНБ, приводящие к развитию ПКС (Sano and Reed 2013). Вирусные патогены, продуцирующие большие количества вирус-специфических белков, значительная часть из которых является мембранными, используют различные стратегии для использования процессов ОНБ в целях обеспечения максимально продуктивной инфекции (Zhang and Wang 2012). Стресс ЭПР и развитие ОНБ являются базовыми реакциями, свойственными всем эукариотическим организмам. Недавно было показано, что инфекция, вызываемая X вирусом картофеля (XВК) у растений, а также вирус-специфический гидрофобный транспортный белок ТБГ3 XВК способны индуцировать стресс ЭПР, ОНБ и, в некоторых условиях, последующее развитие ПКС (Ye et al., 2011; 2013). Несмотря на активные исследования, проводимые в последние годы, механизмы, используемые вирусами для осуществления тонких настроек фундаментальных процессов развития ОНБ для обеспечения собственной продуктивной инфекции, до сих пор остаются, вомногом, не ясными (Zhang and Wang 2012). Цель работы. Настоящая работа была направлена на выявление новых молекулярных механизмов развития программируемой клеточной смерти при морфогенезе, стрессе и вирусной инфекции. 2 Задачи исследования. 1. Охарактеризовать функциональную роль метакаспазы растений mcII-Pa в процессах развития ПКС при морфогенезе и в условиях стресса. 2. Выявить и охарактеризовать природный субстрат метекаспазы растений mcII-Pa. Исследовать влияние протеолитического расщепления природного субстрата, инициируемого mcII-Pa, на его функциональные свойства. 3. Выявить гомологи субстрата, расщепляемого mcII-Pa, у животных. Исследовать возможность протеолитического расщепления такого гомолога в процессе развития апоптоза. 4. Исследовать внутриклеточную локализацию гидрофобных белков ТБГ3 и цистеин богатого белка вируса курчавости верхушек картофеля. Определить функциональную роль белка ТБГ3 в процессах транспорта вирусов растений. 5. Исследовать возможность индукции стресса ЭПР и последующего развития ПКС при экспрессии гидрофобных белков вирусов растений. 6. Исследовать особенности экспрессии гидрофобных белков вируса курчавости верхушек картофеля при развитии вирусной инфекции. Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые биохимически охарактеризована метакаспаза растений mcII-Pa. В результате проведенных работ показано, что в отличие от каспаз животных, представляющих из себя аспартат-специфичные цистеиновые протеиназы, mcII-Pa является аргинин/лизин-специфичной цистеиновой протеиназой. Также впервые показано, что протеолитическая активность mcII-Pa является необходимой у растений для развития ПКС при морфогенезе и ответе на стресс. Несмотря на особенную субстратную специфичность, функция mcII-Pa является аналогичной функциям каспаз: на начальных этапах ПКС mcII-Pa локализуется в цитоплазме, а при развитии ПКС она транслоцируется в ядро и инициирует его деградацию. В настоящей работе также впервые показано, что эволюционно-консервативный многофункциональный белок TSN является неизменным компонентом деградома как у растений, так и у животных. Выявлено, что у растений протеолитическое расщепление TSN в ходе развития ПКС осуществляется метакаспазой, в то время как у животных протеолитическое расщепление TSN в процессе развития апоптоза осуществляется каспазой-3, причем это протеолитическое расщепление TSN негативно влияет на его функциональную активность. Кроме того, в работе показано, что эволюционно-консервативный многофункциональный белок TSN является необходимым фактором выживаемости как у растительных, так и у животных клеток. При выполнении настоящей работы была создана модельная система для изучения транспорта вирусов растений, содержащих тройной блок генов (ТБГ). Показано, что продукт экспрессии ТБГ, мембранный белок ТБГ3 вируса курчавости верхушек картофеля (ВКВК; Potato mop-top virus; PMTV), индуцирует образование из мембран ЭПР телец-включений на клеточной периферии, образование которых необходимо для осуществления внутриклеточного и межклеточного транспорта РНК-связывающего белка ТБГ1. В тоже время, в настоящей работе продемонстрировано, что именно белок ТБГ3 индуцирует стресс ЭПР, следствием которого является ОНБ. Такой ответ, имеющий целью компенсировать функциональные повреждения ЭПР, вызывает клеточную смерть при условии длительного воздействия факторов, приводящих к стрессу ЭПР. При 3 выполнении данной работы выяснилось, что аналогичным потенциалом индуцировать стресс ЭПР обладает еще один мембранный, богатый цистеином белок, экспрессируемый ВКВК. Проведенные в настоящей работе исследования особенностей экспрессии мембранных белков ВКВК выявили молекулярные механизмы, с помощью которых вирусы снижают уровень экспрессии белков, способных индуцировать развитие ПКС. При исследовании интегральных мембранных белков был разработан новый оригинальный метод определения топологии таких белков в живых клетках. Апробация работы. Диссертация была апробирована на совместном семинаре отдела сигнальных путей клетки и отдела биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» 15 мая 2013 года. Материалы работы докладывались на всероссийских и международных конференциях: 7th Aschersleben Symposium ‘New Aspects of Resistance Research on Cultivated Plants’, (Ашерслебен, Германия, 1999 г.), IXth Conference on Virus Diseases of Gramineae in Europe, (Йорк, Великобритания, 2001 г.), III-ий Всероссийский биохимический съезд, (СанктПетербург, 2002 г.), VIIIth International Congress of Plant Pathology (Крайстчерч, Новая Зеландия, 2003 г.), 11th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions (Санкт-Петербург, 2003 г.), Conference “Cell Biology of Nitric Oxide and Cell Death in Plants” (Ялта, Украина, 2004 г.), XXII SPPS Congress (Умео, Швеция, 2005 г.), Научно-практическая конференция «Научное обеспечение и инновационное развитие картофелеводства» (Коренево, Моск. обл., 2008) Научнопрактическая конференция «Современные тенденции и перспективы инновационного развития картофелеводства» (Чебоксары, 2011 г.). Публикации. По результатам работы опубликовано 17 статей в рецензируемых научных изданиях. Основные результаты и теоретические обобщения опубликованы в ведущих журналах, входящих в список журналов, рекомендованных ВАК, и/или индексируемых базами данных Web of Science и Scopus (Биохимия, Current Drug Targets, Journal of General Virology, Molecular PlantMicrobe Interactions, Nature Cell Biology, Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America, The Plant Journal), а также в международных журналах (Beiträge zur Züchtungsforschung и NATO Science Series I: Life and Behavioural Sciences). Структура и объем работы. Диссертация содержит следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на _____ страницах, содержит _____ рисунков и _____ таблиц. Список литературы содержит ссылки на ______ литературных источников. 4 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Метакаспаза растений mcII-Pa является аргинин/лизин-специфичной цистеиновой протеиназой. Роль программируемой клеточной смерти (ПКС) сложно преувеличить в процессах развития многоклеточных эукариотических организмов, а также в их системах защиты, в том числе, от патогенов. У животных в большинстве процессов ПКС (в том числе, при апоптозе) участвуют представители семейства каспаз, которые относятся к цистеиновым протеиназам (Earnshaw et al., 1999). В растениях близких гомологов каспаз обнаружено не было. Удалось обнаружить только отдаленные гомологи, которые назвали метакаспазами (Uren et al., 2000). Метакаспазы были обнаружены у бактерий, представителей Archaea и практически у всех эукариот за исключение представителей Metazoa (Uren et al., 2000; Vercammen et al., 2007). Обнаружение метакаспаз в растениях активизировало исследования, в которых метакаспазы рассматривались в качестве аналогов каспаз у животных. Действительно, в некоторых случаях каспазная активность, измеряемая с помощью флуоресцентных субстратов каспаз, возрастает в условиях оверэкспрессии метакаспаз и снижается при снижении экспрессии метакаспаз (Suarez et al., 2004). Также следует отметить, что у растений имеется целый ряд представителей других семейств протеиназ, вносящех свой вклад в развитие некоторых видов ПКС у растений. Одной из таких протеиназ является вакуолярный процессирующий фермент (VPE). К настоящему времени известно, что VPE принимает участие в ПКС, возникающей в процессе развития гиперчувствительного ответа, индуцированного вирусом табачной мозаики в растениях табака, несущих ген N (Hatsugai et al., 2004). Еще одной протеиназой, вовлеченной в процессы развития ПКС у растений, неожиданно оказался представитель субтилизин-подобного семейства протеиназ, названный в соответствии с выявленной функцией и проявляемой активностью фитаспазой (Chichkova et al., 2010). Кроме того, опубликованы данные еще о двух возможных функциональных аналогах каспаз животных у растений (SAS-1 и SAS-2), оба из которых обладают высокой, похожей на каспазы субстрат специфичностью, но так же, как и фитаспаза, являются сериновыми протеиназами и относятся к семейству субтилаз (Coffeen and Wolpert 2004). Несмотря на то, что у животных известно более тысячи природных субстратов каспаз (Crawford et al., 2013), у растений охарактеризован единственный природный субстрат протеиназ, обеспечивающих развитие ПКС в растениях. Им является субстрат фитаспазы – белок VirD2 из патогенной бактерии растений Agrobacterium tumefaciens. VirD2 ответственен за доставку фрагмента бактериальной ДНК в ядро зараженной клетки. Его процессинг, осуществляемый фитаспазой, в результате которого VirD2 лишается С-концевого сигнала локализации в ядро, может являться проявлением систем активной защиты клетки растений от нежелательной трансформации (Chichkova et al., 2010). Однако данная активность фитаспазы не связана с процессами развития ПКС. К настоящему времени также охарактеризовано по одному субстрату метакаспаз у дрожжей и у мицелиальных грибов. Ими являются белки GAPDH и PARP, соответственно (Silva et al., 2011; Strobel and Osiewacz 2013). Интересно, что у животных их гомологи 5 являются субстратами каспаз, из чего, скорее всего, следует, что процессы развития ПКС по составу деградома имеют достаточно высокую степень консервативности. 2.1.1. Метакаспаза ели норвежской mcII-Pa и каспазы обладают различной субстрат-специфичностью. Для проведения работы рекомбинантная метакаспаза ели норвежской mcIIPa (Suarez et al., 2004) была экспрессирована в бактериальных клетках. Оказалось, что выделяемый после экспрессии зимоген mcII-Pa аутокаталитически процессируется в 2-х сайтах: (i) после Arg-188, отделяя таким образом p20 каспазаподобную субединицу от линкера, специфичного для метакаспаз, тип II, и (ii) после Lys-269, разделяя линкер и p10 каспаза-подобную субъединицу (Рис. 1. А). Для исследования субстрат-специфичности метакаспазы mcII-Pa были поставлены тесты in vitro с использованием синтетических флуоресцентных пептидных субстратов (Рис. 1. Б). Несмотря на то, что рекомбинантная mcII-Pa была способна расщеплять субстраты и с Arg, и с Lys в позиции P1, активность метакаспазы при расщеплении субстратов, содержащих Arg, была в 25-50 раз выше, чем для Рис. 1. Метакаспаза ели норвежской mcII-Pa является аргинин/лизин-специфичной цистеиновой протеиназой. (А) Схематическое изображение метакаспазы ели норвежской mcII-Pa. Зимоген mcII-Pa состоит из p20 каспаза-подобной субъединицы, содержащей каталитический Cys-139, линкерного региона и p10 каспаза-подобной субъединицы. Аутокаталитический протеолиз рекомбинантной mcII-Pa расщепляет белок в двух местах: после Arg-188 и Lys-269. (Б) Исследование субстрат-специфичности рекомбинантной mcII-Pa с помощью пяти различных синтетических флуоресцентных субстратов, содержащих Arg, Lys или Asp в позиции P1. (В) Вестерн-блот, иллюстрирующий аутокаталитический протеолиз mcII-Pa и отсутствие аутокаталитического протеолиза у мутанта mcII-Pa C139A. Биохимические особенности mcII-Pa: влияние Ca2+ (Г), pH (Д), Zn2+ (Е) на активность mcII-Pa, а также определение действия различных ингибиторов протеиназ на активность фермента (Ж). Вертикальные отрезки на гистограммах – стандартная ошибка среднего, рассчитанная при анализе результатов трех независимых экспериментов. 6 субстратов, содержащих Lys (Рис. 1. Б). Интересно, что ни один из протестированных субстратов, обычно расщепляемых каспазами (Asp в позиции P1), не расщеплялся mcII-Pa (Рис. 1. Б), что подтверждает тот факт, что метакаспазы у растений имеют субстрат-специфичность отличную от каспаз (Vercammen et al., 2004; Watanabe et al., 2005). Несмотря на то, что активность каспаз, как правило, не зависит от концентрации ионов Ca2+ (Stennicke et al., 1997), в проведенных экспериментах выяснилось, что для аутоактивации метакаспазы mcII-Pa необходимо присутствие миллимолярных концентраций Ca2+ (оптимум при 50 мМ Ca2+; Рис. 1. Г). mcII-Pa, подобно каспазам животных, обладает наибольшей протеолитической активностью при нейтральных pH, но, в отличие, от каспаз более чувствительна к наличию ионов Zn2+ (Рис. 1. Д, Е). Протеолитическая активность метакаспазы mcII-Pa не может быть ингибирована с помощью специфических ингибиторов каспаз, но в тоже время активность mcII-Pa может быть ингибирована леупептином, Nα-тозил-L-лизин-cmk, а также специально синтезированным ингибитором для mcII-Pa – H-EGR-cmk (Рис. 1. Ж). Мутантный белок mcII-Pa C139A, содержащий в первичной структуре аминокислотный остаток Ala вместо каталитического Cys, свойственного всем представителям суперсемейства цистеиновых протеиназ, не обладал протеолитической активностью при расщеплении Boc-EGR-амидо-4-метилкумарина, который наиболее эффективно расщеплялся метакаспазой дикого типа. Таким образом, можно сделать вывод о том, что метакаспаза ели норвежской mcII-Pa является аргинин/лизинспецифичной цистеиновой протеиназой. 2.2. Протеолитическая активность необходима для развития ПКС. метакаспазы растений mcII-Pa 2.2.1. Протеолитическая активность mcII-Pa необходима для эмбриогенеза. У всех голосеменных суспензор эмбриона состоит из нескольких слоев терминально дифференцированных клеток. Клетки суспензора образуются за счет асимметричного деления клеток эмбриональной массы, которая является функциональным аналогом эмбриона покрытосеменных (Bozhkov et al., 2005; Singh, 1978). Клетки суспензора не проходят деление, т.к. в них сразу начинают развиваться процессы ПКС. В клетках, расположенных ближе к эмбриональной массе, только начинают развиваться процессы ПКС, в то время как в более отдаленных от эмбриональной массы клетках суспензора развиваетие ПКС происходит все сильнее и сильнее, образуя своего рода градиент из клеток, в которых прогрессируют различные стадии развития ПКС (Рис. 2.). В итоге базальные клетки суспензора представляют собой только остатки клеточной стенки (Bozhkov et al., 2005; Smertenko et al., 2003). Таким образом, эмбрион ели является уникальной модельной системой, в которой можно наблюдать сразу все стадии развития ПКС (Рис. 2.). Более того, учитывая положение отдельной взятой клетки в суспензоре, можно судить о стадии развития ПКС в этой клетке. Для исследования роли метакаспаз в регуляции ПКС при морфогенезе была использована модель соматического эмбриогенеза P. abies. Система соматического эмбриогенеза повторяет нормальное развитие зиготы. При этом с помощью 7 факторов роста при соматическом эмбриогенезе можно синхронизировать этапы развития эмбрионов, что удобно при проведении экспериментов (Goldberg et al., 1994; Filonova et al., 2000). Ранее было показано, что снижение экспрессии метакаспазы с помощью РНК-интерференции в процессе развития соматического эмбриогенеза ели норвежской приводит к увеличенной пролиферации эмбриональной массы, но в тоже время блокирует дифференцировку суспензора (Suarez et al., 2004). В настоящей работе степень развития ПКС оценивалась по количеству клеток с фрагментированной ядерной ДНК (Рис. 3. А). Полученные данные показывают, что степень развития ПКС в линии со сниженной экспрессией метакаспазы в 4 раза ниже, чем в линии дикого типа. В этой линии Argспецифичная протеолитическая активность также была значительно снижена Рис. 2. Развитие ПКС при эмбриогенезе ели норвежской (справа налево). От эмбриональной массы (ЭМ; стадия 0) до базального полюса суспензора располагаются клетки суспензора, находящиеся в разных стадиях развития ПКС (cтадии I-V) (по Bozhkov et al., 2005). 8 (Рис. 3. А), что, вероятно, указывает на возможное наличие других активированых Arg-специфичных протеаз в используемой модельной системе. Интересно, что аналогичное снижение количества TUNEL-позитивных клеток и снижение Argспецифичной протеолитической активности наблюдалось также и в ранее охарактеризованной линии (Filonova et al., 2000), в которой не происходит дифференцировка суспензора (Рис. 3. Б). Также интересно, что в данной линии не удавалось выявить продукты аутокаталитического расщепления метакаспазы с помощью вестерн-блота с использованием антител к mcII-Pа (Рис. 3. Б). Вероятно, эта линия обладает некоторым дефектом, связанным с активностью mcII-Pa. Обобщая полученные результаты, можно сделать вывод о том, что развитие ПКС в модельной системе соматического эмбриогенеза зависит от протеолитической активности метакаспазы mcII-Pa. Рис 3. Развитие ПКС зависит от активности метакаспазы mcII-Pa. (А) Исследование количества TUNEL-позитивных клеток, вестерн-блот с использованием анти-mcII-Pa антител и исследование «EGR-азной» активности при соматическом эмбриогенезе ели норвежской дикого типа и линии, в которой экспрессия гена mcII-Pa была снижена с помощью системы умолкания генов (сайленсинг mcII-Pa). (Б) Количество TUNELпозитивных клеток, вестерн блот с использованием анти-mcII-Pa антител и исследование «EGR-азной» активности при соматическом эмбриогенезе ели норвежской дикого типа и для ранее охарактеризованной линии (Filonova et al., 2000), в которой не происходит дифференцировка суспензора (неразвивающаяся линия). Вертикальные отрезки на гистограммах – стандартная ошибка среднего, рассчитанная при анализе результатов трех независимых экспериментов. 2.2.2. Метакаспаза mcII-Pa накапливается в ядрах отмирающих клеток. В экспериментах с соматическими эмбрионами ели норвежской наблюдалось изменение внутриклеточной локализация метакаспазы mcII-Pa в зависимости от степени развития ПКС. Для одновременного мониторинга степени фрагментации ДНК образцы кроме окраски с помощью антител к mcII-Pa также окрашивались DAPI и TUNEL, окрашивающими ядра и фрагментированную ДНК, соответственно. Метакаспаза mcII-Pa обнаруживалась во всех клетках эмбриона (Рис. 4. А). Однако в TUNEL-позитивных клетках суспензора прокрашивание с помощью антител к mcII-Pa выявляло значительно более высокий уровень сигнала по сравнению с уровнем детектируемого сигнала в клетках эмбриональной массы 9 (Рис. 4. А). Дальнейший анализ эмбрионов с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии приводил к идентификации двух различных типов иммунолокализации mcII-Pa, которые также коррелировали со степенью ядерной деградации в клетках суспензора (Рис. 4. Б). В клетках с фрагментированной ДНК, но все еще обладающих интактной ядерной оболочкой, mcII-Pa детектировалась на периферии ядра и в околоядерной цитоплазме, в то время как в клетках с деградированной ядерной оболочкой mcII-Pa детектировалась, в основном, внутри ядра (Рис. 4. Б). Для дальнейшей проверки феномена ядерной локализации метакаспазы mcII-Pa во время развития ПКС был использован метод иммуноэлектронной микроскопии с частицами коллоидного золота. В клетках эмбриональной массы, клетках суспензора, в которых только начинаются процессы ПКС, и в клетках из средней части суспензора частицы коллоидного золота обнаруживались как в цитоплазме, так и в ядре (клетки с более развитым процессом ПКС не анализировались, т.к. в этих клетках практически не остается цитоплазмы, а весь Рис 4. Метакаспаза mcII-Pa колокализуется с фрагментированной ДНК в клетках суспензора. (А) Флуоресцентная микроскопия целого эмбриона, окрашенного DAPI (синий канал), с помощью TUNEL (красный канал) и с помощью антител к mcII-Pa (зеленый канал). (Б) Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия эмбриональной массы (верхний ряд), морфологически интактных клеток суспензора (средний ряд) и клеток суспензора с деградированной ядерной оболочкой (нижний ряд). Масштабная линейка – 100 мкм (А) и 10 мкм (Б). клеточный объем заполнен вакуолями). При этом, количество золотых частиц относительно единицы анализируемой площади увеличивалось в клетках с более выраженными проявлениями ПКС. Более того, соотношение количества частиц коллоидного золота в ядре относительно количества частиц в цитоплазме увеличивалось по мере развития ПКС: от 0,6 в клетках эмбриональной массы, доходя до 1,7-2,0 в клетках из средней части суспензора (Рис 5.). В цитоплазме клеток суспензора, частицы были сосредоточены вокруг ядерной оболочки, тогда как практически все частицы золота в ядрах были связаны с электронно-плотными 10 участками хроматина (Рис 5.). В тоже время, частицы коллоидного золота не обнаруживались в аутофагических вакуолях, которые являются типичными органеллами аутофагической ПКС. Такой результат хорошо согласуется с наблюдениями о том, что для катализа метакаспазе mcII-Pa требуются условия с нейтральным или близким к нейтральным рН, в то время как содержимое вакуоли, как правило, имеет кислый pH. Таким образом, полученные данные по локализации метакаспазы mcII-Pa в развивающемся эмбрионе указывают на то, что в процессе развития ПКС метакаспаза mcII-Pa транслоцируется из цитоплазмы в ядро. Рис. 5. Метакаспаза mcII-Pa в процессе развития ПКС в клетках суспензора эмбриона ели норвежской транслоцируется из цитоплазмы в ядро. Репрезентативное изображение эмбриона ели норвежской (левая фотография, масштабная линейка – 100 мкм), использованного для иммуноэлектронной микроскопии с антителами к mcII-Pa (центральная панель фотографий). Верхний ряд центральной панели – иммуноэлектронная микроскопия эмбриональной массы. Нижний ряд центральной панели – суспензор. Масштабная линейка на микрофотографиях, иллюстрирующих ультраструктуру клеток – 5 мкм; на микрофотографиях, иллюстрирующих ультраструктуру ядра и цитоплазмы – 200 нм. Гистограмма (справа) – количество частиц коллоидного золота в ядре и цитоплазме клеток эмбриональной массы, начальной и средней частей суспензора. Вертикальные отрезки на гистограммах – стандартная ошибка среднего, рассчитанная при анализе результатов трех независимых экспериментов. n – ядро, v – вакуоль, звездочкой отмечена аутофагосома. 2.2.3. Протеолитически активная метакаспаза mcII-Pa индуцирует деградацию ядра. Основываясь на полученных данных о том, что метакаспаза mcII-Pa необходима при индукции процессов ПКС in vivo, а также о том, что метакаспаза mcII-Pa накапливается в ядрах погибающих клеток (см. выше), было решено проверить влияние метакаспазы mcII-Pa на сохранение интактности ядра in vitro. Для этого была разработана специальная бесклеточная система. При этом использовались клеточные ядра, выделенные из линии, в которой не происходит дифференцировка суспензора (Filonova et al., 2000). Инкубация таких ядер с клеточными экстрактами, приготовленными из эмбриональных клеток линии 11 дикого типа не приводила к увеличению количества ядер с фрагментированной ДНК (Рис. 6. А). Однако добавление активной рекомбинантной метакаспазы значительно увеличивало количество TUNEL-позитивных ядер, в то время как присутствие в реакционной смеси ингибитора метакаспазы H-EGR-cmk значительно снижало эффект, индуцированный метакаспазой mcII-Pa (Рис. 6. А). В тоже время, как и предполагалось, количество ядер, содержащих фрагментированную ДНК, не увеличивалось по сравнению с контролем при добавлении в реакционную смесь неактивного мутанта mcII-Pa C139A (Рис. 6. А). В ходе экспериментов в бесклеточной системе также было выявлено, что фрагментация ДНК сопровождается характерными для ПКС изменениями в морфологии ядер. Такие изменения морфологии обычно происходят в три стадии: (i) ядро становится дольчатым, (ii) происходит конденсация хроматина, (iii) происходит полная ядерная деградация (Filonova et al., 2000). Для визуализиции этих стадий использовался краситель DAPI (Рис. 6. Б). При наличии активной Рис. 6. Метакаспаза mcII-Pa индуцирует деградацию ядер в бесклеточной системе. В всех экспериментах использовались ядра, выделены из линии, в которой не происходит дифференцировка суспензора. (А) Количество ядер, содержащих фрагментированную ДНК, при их инкубации с клеточным экстрактом из линии дикого типа, с рекомбинантной mcII-Pa в присутствии или отсутствии ингибитора H-EGR-cmk, а также с мутантом mcIIPa C139A. (Б) Репрезентативные примеры нормального изолированного клеточного ядра и ядер проходящих три стадии деградации: дольчатое ядро, ядро с конденсированным хроматином и деградированное ядро при двойной окраске с помощью DAPI и TUNEL. (В) Количество ядер проходящих три стадии деградации при их инкубации с клеточным экстрактом линии дикого типа, с рекомбинантной mcII-Pa в присутствии или отсутствии ингибитора H-EGR-cmk, а также с мутантом mcII-Pa C139A. Вертикальные отрезки на 12 гистограммах - стандартная ошибка среднего, рассчитанная при анализе результатов трех независимых экспериментов. метакаспазы mcII-Pa в бесклеточной системе, как выяснилось, в разы увеличивается количество ядер, проходящих каждую из трех стадий деградации по сравнением с контролями (Рис. 6. В). Этот эффект значительно снижался при добавлении ингибитора метакаспазы H-EGR-cmk (Рис. 6. В). Использование в бесклеточной системе неактивного мутанта mcII-Pa C139A, как и ожидалось, не приводило к увеличению количества деградирующих ядер и не отличалось по этому параметру от контрольных экспериментов (Рис. 6. В). 2.3. Белок TSN является консервативным компонентом деградома растений и животных. 2.3.1. Белок PaTSN расщепляется метакаспазой mcII-Pa in vitro. Для поиска возможных природных субстратов метакаспазы mcII-Pa использовалась база данных белков, кодируемых геномом Arabidopsis thaliana L. Алгоритм поиска включал в себя определение наличия в аминокислотных последовательностях кандидатов сайтов протеолиза mcII-Pa. Одним из найденных с помощью такого поиска потенциальных кандидатов оказался многофункциональный белок TSN (Tudor staphylococcal nuclease; tudor-sn; SND1; p100). Белок TSN является высококонсервативным белком, который экспрессируют самые разнообразные живые организмы, включая бактерии, протистов, грибы, растения и животных. Для проверки гипотезы о том, что TSN может являться природным субстратом метакаспазы mcII-Pa, была клонирована кДНК TSN из ели норвежской и получен рекомбинантный белок (PaTSN). В ходе проведенного протеолиза белка PaTSN с помощью метакаспазы mcII-Pa in vitro выяснилось, что mcII-Pa способна гидролизовать PaTSN. При этом при полном расщеплении белка PaTSN образуется пять фрагментов (Рис. 7.). Ингибитор метакаспазы H-EGR-cmk, как и ожидалось, блокировал процесс протеолиза PaTSN метакаспазой. Гидролиз PaTSN также не катализировался с помощью мутанта метакаспазы mcII-Pa C139A (Рис. 7. А). Определение аминокислотных последовательностей N-терминальных областей фрагментов PaTSN с помощью белкового сиквенирования позволило определить точные положения четырех сайтов расщепления. Как выяснилось, все определенные сайты содержат Arg или Lys в позиции P1 (Рис. 7. Б). 2.3.2. Белок PaTSN является субстратом mcII-Pa при развитии ПКС в ходе эмбриогенеза. Для исследования процесса расщепления PaTSN метакаспазой mcII-Pa in vivo была использована модельная система развития ПКС в ходе эмбригенеза ели норвежской. Перед началом эксперимента дополнительно была охарактеризована активность метакаспазы mcII-Pa при прохождении эмбрионом основных четырех стадий развития: стадии недифференцированных эмбриональных клеток, стадии раннего эмбриона, стадии позднего эмбриона и стадии зрелого эмбриона (Рис. 8. А, 13 Б). Наивысшая активность метакаспазы mcII-Pa детектировалась на стадии раннего эмбриона, состоящего из эмбриональной массы и отмирающего суспензора. Рис. 7. Белок PaTSN расщепляется метакаспазой mcII-Pa in vitro. (А) Электрофореграмма, иллюстрирующая результат инкубирования PaTSN с рекомбинантной mcII-Pa, с рекомбинантной mcII-Pa в присутствии ингибитора метакаспазы H-EGR-cmk или в присутствии каталитически неактивного мутанта метакаспазы mcII-Pa С139A. Молекулярные массы полученных фрагментов PaTSN рассчитывались исходя из результатов пептидного сиквенирования. Справа схематически представлены полноразмерный PaTSN и его фрагменты, образуемые в процессе протеолитического расщепления, катализируемого метакаспазой mcII-Pa (Б) Схематическое изображение доменной структуры PaTSN и отображение четырех сайтов протеолиза (стрелки). Наименьшая активность метакаспазы mcII-Pa детектировалась в зрелых эмбрионах, которые уже практически не содержат отмирающих клеток (Рис. 8. Б). Протеолиз нативного PaTSN, определяемый in vivo с помощью поликлональных антител к PaTSN, полностью коррелировал с детектируемой активностью метакаспазы mcII-Pa (Рис. 8. Б). В наибольшей степени протеолиз белка PaTSN наблюдался в ранних эмбрионах, в то время как в зрелых эмбрионах продукты протеолиза PaTSN не выявлялись (Рис. 8. Б). В серии экспериментов с развивающимися эмбрионами детектируемые фрагменты PaTSN соответствовали по молекулярным массам фрагментам PaTSN, полученным при расщеплении белка с помощью метакаспазы mcII-Pa in vitro (Рис. 7. А; Рис. 8. Б). Таким образом, 14 можно сделать вывод о том, что метакаспаза mcII-Pa протеолитически расщепляет PaTSN, распознавая одни и те же сайты как in vivo, так и in vitro. Далее проводился анализ активности метакаспазы mcII-Pa и анализ продуктов расщепления PaTSN в хирургически разделенных эмбриональных массах и суспензорах. Проведенные эксперименты показали, что активность метакаспазы в отмирающих суспензорах в 10 раз выше, чем в живых клетках эмбриональной массы (Рис. 8. В). Соответственно, и продукты расщепления PaTSN детектировались только в суспензорах, в то время как в эмбриональной массе Рис. 8. Белок PaTSN является субстратом mcII-Pa при развитии ПКС в ходе эмбриогенеза. (А) Схематическое изображение типичного синхронизированного развития соматического эмбриона Picea abies L. Пролиферация эмбриональных клеток запускается факторами роста (ауксин и цитокинин; GF). Дальнейшее развитие раннего эмбриона индуцируется отсутствием в среде факторов роста. Ранние эмбрионы состоят из живой эмбриональной массы и отмирающего суспензора. Поздний эмбриогенез и окончательное созревание зрелого эмбриона происходит в присутствии абсцизовой кислоты (ABA). В процессе позднего эмбриогенеза суспензор окончательно отмирает. (Б-Г) Расщепление эндогенного PaTSN (вестерн-блоты с использованием поликлональных антител к mcII-Pa) коррелирует с активностью mcII-Pa (гистограммы). Активность метакаспазы измерялась с помощью AMC-конъюгированного FESR-пептида. (Б) Образцы отбирались через 7 дней после начала инкубирования культуры с факторами роста (эмбриональные клетки), через 7 дней после окончания инкубирования с факторами роста (ранние эмбрионы), еще через 7 дней (поздние эмбрионы) и через 35 дней (зрелые эмбрионы) после начала инкубирования с абсцизовой кислотой. (В) Анализ образцов после хирургического разделения эмбриональной массы (ЭM) и суспензора раннего эмбриона. (Г) Анализ образцов дикого типа и двух линий, в которых экспрессия mcII-Pa была снижена с помощью РНК-интерференции (РНКи mcII-Pa 1 и РНКи mcII-Pa 2). Вертикальные отрезки на гистограммах – стандартная ошибка среднего, рассчитанная при анализе результатов трех независимых экспериментов. 15 обнаруживался только полноразмерный PaTSN (Рис. 8. В). Расщепление PaTSN в линиях, в которых экспрессия метакаспазы mcII-Pa была снижена с помощью РНКинтерференции, происходило менее эффективно, чем в линии дикого типа, и коррелировало со детектируемой протеолитической активностью mcII-Pa (Рис. 8. Г). Таким образом, можно сделать вывод о том, что PaTSN расщепляется in vivo метакаспазой mcII-Pa, а также о том, что PaTSN является компонентом деградома при развитии ПКС, происходящей во время эмбриогенеза. 2.3.3. Белок PaTSN является субстратом mcII-Pa при развитии ПКС, индуцированной стрессом. Для проверки того, является ли PaTSN частью деградома ПКС, индуцированной стрессом, эмбриональные клетки ели норвежской обрабатывались перекисью водорода в присутствии факторов роста, блокирующих формирование эмбриона и развитие ПКС, связанной с эмбриогенезом. В таком эксперименте активность метакаспазы увеличивалась в течении 12 часов после начала эксперимента, а потом плавно снижалась, параллельно с развитием ПКС (Рис. 9.). Увеличению активности mcII-Pa сопутствовало увеличение степени расщепления эндогенного PaTSN. При этом, детектируемые фрагменты оказались аналогичными по молекулярной массе фрагментам, выявленным при расщеплении PaTSN in vitro, а также фрагментам наблюдаемым при расщеплении PaTSN в процессе развития ПКС при эмбриогенезе. Таким образом, можно заключить, что PaTSN является частью деградома как в случае ПКС, развивающейся в процессах морфогенеза, так и в случае ПКС, индуцированной стрессом. Рис. 9. Белок PaTSN является субстратом mcII-Pa при развитии ПКС, индуцированной стрессом. Активность метакаспазы mcII-Pa (гистограмма) и уровень расщепления PaTSN (вестерн-блот) в процессе развития ПКС, индуцированной стрессом. Факторы роста, ингибирующие развитие ПКС, связанной с эмбриогенезом, и перекись водорода добавлялись в точке 0. Далее образцы отбирали и анализировали через 0, 6, 12, 24 и 48 часов после начала эксперимента. Активность метакаспазы измерялась с помощью AMC-конъюгированного FESR-пептида. Вертикальные отрезки на гистограммах – стандартная ошибка среднего, рассчитанная при анализе результатов трех независимых экспериментов. 16 2.3.4. Белок человека HsTSN расщепляется каспазой-3 in vitro. При анализе аминокислотной последовательности TSN человека (HsTSN) была выявлена последовательность DAVD 790, которая является известным сайтом, распознаваемым и расщепляемым ферментами, относящимися к семейству каспаз. В первичной структуре белка HsTSN последовательность DAVD располагается между последовательностью домена TUDOR и последовательностью пятого домена стафилококковой нуклеазы SN5 (Рис. 10. А). При проведении реакции in vitro выяснилось, что рекомбинантный HsTSN расщепляется каспазой-3 на два фрагмента c молекулярными массами примерно 90 и 10 кДа (Рис. 10. Б). Определение N-терминальных аминокислотных последовательностей изолированных белковых фрагментов с помощью белкового секвенирования подтвердило, что HsTSN процессировался каспазой-3 в месте расположения DAVD 790 мотива. Рис. 10. Белок HsTSN расщепляется каспазой-3 in vitro. (А) Схематическое изображение доменной структуры HsTSN. Мотив DAVD, распознающийся каспазой-3, располагается между доменами TUDOR и SN5. (Б) Расщепление HsTSN in vitro. HsTSN инкубировался отдельно (Буфер), в присутствии каспазы-3, или в присутствии каспазы-3 и ингибитора каспазы-3 DEVD-CHO. Белки разделялись с помощью ПААГ и окрашивались кумасси. Молекулярные массы были рассчитаны на основе данных, полученных с помощью N-терминального белкового сиквенирования. 2.3.5. Белок HsTSN расщепляется при развитии ПКС, индуцированной различными агентами, в культурах клеток человека. При индукции апоптоза в культуре клеток карциномы человека HCT116 с помощью флуороурацила (5FU) детектировалось увеличение активности каспазы-3 17 (Рис. 11. А). В тоже время наблюдалось увеличение количества расщепленного эндогенного HsTSN, что было выявлено путем детекции с помощью поликлональных антител к HsTSN двух фрагментов, которые были аналогичны по молекулярной массе фрагментам, наблюдаемым при расщеплении рекомбинантного HsTSN в экспериментах in vitro (Рис. 11. А, Рис. 10. Б). Такой эффект оказался неспецифичным по отношению к конкретной клеточной линии или к определенному индуктору апоптоза, т.к. он воспроизводился в модельной системе, в которой использовалась культура клеток HeLa, а индуктором апоптоза являлся камптотецин (CPT; Рис. 11. Б). Однако в модельной системе с индуцированным апоптозом в клетках HeLa продукты протеолиза не детектировались при эксперессии мутантного HsTSN D790E, или в случае, когда экспрессировался белок HsTSN дикого типа, но клетки были дополнительно Рис. 11. Белок HsTSN расщепляется при развитии ПКС, индуцированной различными агентами, в культурах клеток человека. (А) Воздействие флуороурацила (5FU; 50 мкг/мл) на культуру клеток карциномы человека HCT116 приводит к активации активности каспазы-3 (гистограмма) и индуцирует фрагментацию эндогенного HsTSN (вестерн-блот с использованием поликлональных антител к TSN). (Б) zVAD-fmk (15 мкМ) блокирует фрагментацию HsTSN. Вестерн-блот белковых экстрактов из культуры клеток HeLa и из этой же культуры, обработанной камптотецином (CPT; 5 мкМ), с использованием анти-TSN поликлональных антител. (В) Мутация Asp 790 ингибирует расщепление HsTSN. Вестерн-блот с использованием анти-FLAG антител экстрактов из культуры клеток HeLa, трансфецированных эксперессионным вектором, не содержащим экспрессируемого гена, содержащим ген HsTSN, слитым с FLAG, или содержащим ген мутантного белка HsTSN D790E, слитым с FLAG. В слитных белках FLAG находился на N-конце. Вертикальные отрезки на гистограммах – стандартная ошибка среднего, рассчитанная при анализе результатов трех независимых экспериментов. 18 обработаны ингибитором каспаз zVAD-флуорометилкетоном (zVAD-fmk; Рис. 11. Б, В). Данные об отсутствии протеолиза мутантного HsTSN D790E говорят в пользу того, что HsTSN дикого типа действительно процессируется в сайте DAVD 790, в то время как данные об отсутствии протеолитического расщепления в присутсвии каспазного ингибитора zVAD-fmk указывают на то, что при индукции апоптоза белок HsTSN дейстивтельно гидролизуется при участии протеолитической активности каспаз. Таким образом, можно заключить, что в проведенных экспериментах был впервые выявлен новый компонентом деградома ПКС в клетках человека, которым оказался белок HsTSN. 2.3.6. Белок HsTSN необходим для поддержания выживаемости клеток. Физиологическое значение HsTSN в процессах выживания и апоптоза клеток исследовалось с помощью культур клеток человека, трансфецированных экспрессионным вектором, содержащим ген мутантного нерасщепляемого HsTSN D790E. Экспрессия HsTSN D790E в стандартных условиях приводила к усилению пролиферации клеток в культуре опухолевых клеток (HeLa) и в эмбриональной культуре клеток (HEK293) по сравнению с контрольными культурами или культурами, трансфецированными экспрессионным вектором, содержащим HsTSN дикого типа (Рис. 12. А, Б; P < 0.05). Индукция апоптоза с помощью CPT показала, что клетки линии HeLa, экспрессирующие мутантный HsTSN D790E, выживают значительно лучше, чем контрольные (Рис. 12. В). После получения данных о том, что нерасщепляемый HsTSN D790E стимулирует пролиферацию клеток и защищает клетки от апоптоза, была разработана система с использованием коротких интерферирующих РНК (siRNA; киРНК) к HsTSN. Такие киРНК были использованы для снижения уровня экспрессии эндогенного HsTSN в клетках HeLa. Клетки со сниженным уровнем экспрессии HsTSN оказались гораздо более чувствительны к индукции апоптоза с помощью CPT. Апоптоз в этих клетках сопровождался резким увеличением активности каспазы-3 (в 7,9±2,9 раз), что приводило к увеличению детектируемых количеств расщепленного PARP и ламина-А (в 3,7±0,5 раз и 6,7±2,9 раз, соответственно) (Рис. 12. Г). Более того, снижение уровня экспрессии белка HsTSN приводило к индукции апоптоза даже без наличия CPT. Детекция маркеров апоптоза, таких как процессировання каспаза-3, фрагментированный PARP и фрагментированный ламин-А, показала их резкое увеличение в 7,7±1,9, 6,1±1,3 и 11±1,9 раз, соответственно (Рис. 12. Г). Таким образом, исходя из полученных данных можно сделать вывод о том, что экспрессия белка HsTSN является необходимым условием, обеспечивающим выживаемость по крайней мере некоторых клеток человека. 2.3.7. Белок PaTSN необходим для поддержания выживаемости клеток развивающегося эмбриона ели. Обработка ранних эмбрионов ели норвежской pdTp (3’, 5’-дезокситимидин бисфосфат, ингибитор нуклеазной активности SN; Scadden, 2005) приводила к увеличению количества клеток в эмбриональных массах, содержащих 19 Рис. 12. Экспрессия белка HsTSN необходма для поддержания выживаемости клеток. (А, Б) Экспрессия мутантного белка HsTSN D790E увеличивает пролиферацию клеток. (А) Количество клеток линии HeLa, трансфецированных указанными конструкциями. Только клетки, трансфецированные HsTSN D790E, пролиферировали лучше, чем контрольные (P<0,05). Для полуколичественного определения экзогенного HsTSN в образцах использовался вестерн блот с анти-Flag антителами. Для нормирования нанесения экспериментальных образцов использовалось полуколичественное определение G3PDH. (Б) Рост клеток линии HEK293 после трансфекции экспрессионными векторами содержащими ген белка HsTSN или его мутанта HsTSN D790E. Вестерн блот с анти-FLAG антителами иллюстрирует количество экзогенного HsTSN в образцах. Определение 20 Рис. 13. Нуклеазная активность белка PaTSN необходима для обеспечения выживаемости клеток эмбриональной массы в развивающихся эмбрионах ели норвежской. Культивирование ранних эмбрионов на стадии отмены факторов роста проводилось в присутствии специфического ингибитора стафилококковой нуклеазы pdTp (500 мкмМ) или в присутствии неактивного аналога dTp (500 мкМ). Через четыре дня после начала культивирования проводился анализ клеток на наличие фрагментированной ДНК с помощью TUNEL. (А) Пример эмбриональной массы, содержащей TUNELпозитивные клетки. Масштабная линейка – 50 мкм. (Б) Частота встречаемости TUNELпозитивных клеток в эмбриональных массах. Эмбриональная масса считалась TUNELпозитивной при наличии, как минимум, двух TUNEL-позитивных ядер. Вертикальные отрезки на гистограммах – стандартная ошибка среднего, рассчитанная при анализе результатов трех независимых экспериментов. фрагментированную ДНК (Рис. 13.). Из этого эксперимента можно сделать вывод о том, что функциональный PaTSN, обладающий свойственной ему нуклеазной активностью, является необходимым при обеспечении выживаемости клеток в эмбриональной массе развивающегося эмбриона ели норвежской. 2.3.8. Протеолиз TSN эффекторными протеиназами ПКС снижает нуклеазную активность белка. Как было показано, в первую очередь, для животных, TSN является мультифункциональным белком. Белок TSN способен активировать транскрипцию, Рис. 12. (продолжение подписи) G3PDH проводилось для нормирования при нанесении других образцов. (В) Экспрессия мутантного белка HsTSN D790E ослабляет развитие процессов апоптоза. Гистограмма отражает данные о выживании клеток линии HeLa, трансфецированных указанными конструкциями, через 24 часа после индукции апоптоза с помощью CPT (5 мкМ). (Г) Снижение экспрессии HsTSN с помощью киРНК активирует процессы апоптоза. Вестерн-блоты с использованием антител к TSN, каспазе-3, PARP и ламину-А. Определение G3PDH проводилось для нормирования образцов при нанесении. Вертикальные отрезки на гистограммах – стандартная ошибка среднего, рассчитанная при анализе результатов трех независимых экспериментов. 21 белок является активатором сплайсинга, а также, являясь компонентом РНКиндуцируемого комплекса сайленсинга (RISC) и стрессорных гранул, белок TSN посредством нуклеазной активности участвует в деградации инозин-содержащих дуплексов РНК, включая микроРНК предшественники, отредактированные белками из семейства аденозиновых деаминаз ADAR (Caudy et al., 2003; GarcíaLópez et al., 2013; Scadden, 2007; Välineva et al., 2005; Yang et al., 2002; 2007). Для проверки того, влияет ли фрагментация TSN на функциональные свойства белка был проведен опыт, направленный на определение нуклеазной активности белка TSN, а также его фрагментов, полученных после протеолитического расщепления белка HsTSN с помощью каспазы-3, или белка PaTSN с помощью метакаспазы mcII-Pa. В качестве субстрата была использована одноцепочечная РНК (оцРНК) (Рис. 14.). При проведении этого эксперимента было также выявлено, что рибонуклеазная активность HsTSN и PaTSN может быть ингибирована pdTp (3’, 5’дезокситимидин бисфосфат), который является известным ингибитором стафилококковой нуклеазы (SN), но не зависит от присутствия в реакционной смеси dTp (3’-дезокситимидин монофосфат) (Caudy et al., 2003; Scadden, 2005; Рис. 14.). Расщепление белка HsTSN с помощью каспазы-3 снижало нуклеазную активность полученных фрагентов примерно на 50% (Рис. 14. А). Расщепление белка PaTSN метакаспазой mcII-Pa приводило к снижению активности полученных фрагментов PaTSN из ели норвежской на 90% (Рис. 14. Б). Более сильное снижение нуклеазной активности фрагментов, полученных при протеолизе белка TSN ели, может объясняться тем, что PaTSN расщепляется метакаспазой mcII-Pa в четырех местах (см. раздел 2.3.2.). При этом, один из сайтов расщепления находится внутри второго домена стафилококковой нуклеазы SN2 (Рис. 7.). В отличие от белка PaTSN, протеолиз HsTSN с помощью каспазы-3 происходит только в одном Рис. 14. Протеолиз TSN эффекторными протеиназами ПКС снижает нуклеазную активность белка. Рекомбинантный HsTSN (А) или рекомбинантный PaTSN (Б) инкубировался в буфере, содержащем указанные компоненты, после чего добавлялся субстрат (оцРНК). Нуклеазная эктивность измерялась флуориметрически (гистограммы) или с помощью электорофореза (нижние фотографии). Вертикальные отрезки на гистограммах – стандартная ошибка среднего, рассчитанная при анализе результатов трех независимых экспериментов. 22 месте и не затрагивает ни один из доменов, гомологичных доменам стафилококковых нуклеаз, содержащихся в последовательности белка HsTSN (см. раздел 2.3.4. и Рис. 10.). 2.4. Отдельные молекулярные пути развития ПКС являются неизменными у представителей различных царств живых организмов. В современной литературе широко обсуждаются эволюционные аспекты появления механизмов развития ПКС. Например, широко обсуждается возможность того, что многие прототипы белков-участников процессов клеточной смерти изначально выполняли функции, связанные с развитием и дифференцировкой организмов, и только позже приобрели функцию эффекторов клеточной смерти (Dick and Megeney 2013). Кроме того, уже давно разные исследователи указывали на то, что существует не так много типов ПКС, и, более того, что основные типы клеточной смерти имеют очень много общих морфологических и биохимических черт, несмотря на то, что они при этом могут быть присущи различным живым организмам. Появление методик, позволяющих массово определять субстраты эффекторных протеиназ клеточной смерти привело к появлению обширной информации о белках, подвергающихся протеолизу во время развития ПКС. Такая информация пока получена только для представителей царства животных (для человека, мыши, Drosophila и C. elegans) и требует дальнейшей биоинформационной обработки, но, тем не менее, уже сейчас можно сделать вывод о том, что наборы субстратов эффекторных протеиназ ПКС очень консервативны (Crawford et al., 2012). Очень показательно, что у мыши и у человека большинство субстратов каспаз совпадают, а также то, что в этих субстратах сайты протеолиза в большей степени одинаковы (Crawford et al., 2012). Однако при сравнении более эволюционно отдаленных организмов прослеживается, с одной стороны, четкая тенденция к снижению количества субстратов-ортологов, в то время как, с другой стороны, возрастает число альтернативных сайтов расщепления в оставшихся субстратах-ортологах (Crawford et al., 2012). Естественно, что чем эволюционно дальше отстоят друг от друга сравниваемые организмы, тем больше увеличивается количество уникальных белков-субстратов у каждого. Однако некоторые такие белки, участвующие в каком-либо функциональных процессе у одного организма, тем не менее, можно сравнить с негомологичными участники аналогичного функционального процесса другого организма, в том случае, если они также являются мишенями каспаз. Т.е. в этом случае мишенями протеолитических ферментов ПКС является не конкретный белок, а определенный процесс, на который можно воздействовать, протеолитически расщепляя различных его участников (Crawford et al., 2012). Тем более интересно, что в нашей работе был охарактеризован эффекторный фермент ПКС у растений. Оказалось, что этот фермент – метакаспаза mcII-Pa – обладает активностью отличной от активностей каспаз животных. Как выяснилось, вместо неизменного практически для всех за редким исключением каспаз Asp в позиции P1 субстрата для метакаспазы предпочтительным в данной позиции является Arg или Lys (см. выше). Тем более интересным оказывается тот факт, что первый охарактеризованный природный субстрат метакаспазы mcII-Pa – белок PaTSN – имеет относительно близкого гомолога у животных, включая человека, и 23 этот гомолог – белок HsTSN – является субстратом каспаз во время развития апоптоза (см. выше). Несмотря на различие в субстрат-специфичности каспаза-3 и метакаспаза mcII-Pa расщепляют HsTSN и PaTSN, соответственно, что в обоих случаях приводит к снижению ферментативной активности белка-субстрата. На данный момент PaTSN является единственным охарактеризованным природным субстратом метакаспаз, а также каких-либо других эффекторных протеиназ, обеспечивающих развитие ПКС у растений, расщепление которого происходит во время развития ПКС. Совсем недавно появились сообщения о том, что охарактеризованы один субстрат метакаспазы дрожжей и один субстрат метакаспазы мицелиальных грибов, расщепление которых происходит во время развития ПКС у этих организмов (Silva et al., 2011; Strobel and Osiewacz 2013). Примечательно, что и в этих двух случаях у субстратов были обнаружены близкие гомологи у млекопитающих, которые во время развития апоптоза являются мишенями каспаз. Таким образом, исходя из имеющихся данных, можно заключить, что процессы ПКС являются очень консервативными и многие элементы клеточной гибели остаются неизменными даже у представителей разных царств живых организмов. 2.5. Белок ТБГ3 направляет внутриклеточный и межклеточный транспорт вирусов, содержащих ТБГ. Наличие у растительных клеток плотной клеточной стенки приводит к тому, что фитовирусы вынуждены использовать особенную стратегию для распространения инфекции по организму растения. В отличие от вирусов животных и бактериофагов, которые лизируют клетки и таким образом оказываются во внешней среде или в межклеточном пространстве, или же у которых вирусные частицы отпочковываются от внешней мембраны клетки и, таким образом, оказываются снаружи, фитовирусы используют специальные механизмы, с помощью которых вирусный геном способен передаваться от клетки к соседней через каналы, соединяющие клетки растений – плазмодесмы (ПД). Для осуществления такого межклеточного транспорта фитовирусы экспрессируют специальные транспортные белки, функцией которых является осуществление перемещение вирусного генома от места репликации к ПД и через ПД в соседнюю клетку. У вируса табачной мозаики (ВТМ) транспортную функцию выполняет один 30К белок. В отличии от ВТМ и других представителей рода Tobamovirus значительное количество альфа-подобных вирусов растений, относящихся к различным семействам, кодируют в своем геноме консервативный модуль – тройной блок генов (ТБГ), ответственный за транспортную функцию. ТБГ состоит из трех перекрывающихся генов, кодирующих белки ТБГ1, ТБГ2 и ТБГ3. ТБГ у разных вирусов можно отнести к четырем различным группам: гордеи-подобные, потекс-подобные, бени-подобные и ТБГ вируса зеленой пятнистости гибискуса (ВЗПГ; Solovyev et al., 2012). Белок ТБГ2 является наиболее консервативным белком среди белков ТБГ и обладает наивысшей степенью гомологии при сравнении двух белков ТБГ2, относящихся к различным группам ТБГ. Исключение составляет белок ТБГ2 ВЗПГ, у которого центральный сегмент только отдаленно напоминает центральную последовательность ТБГ2, характерную для представителей других трех групп. Белки ТБГ1 у потекс24 подобных вирусов содержат домен, относящийся к суперсемейству хеликаз 1. Белки ТБГ1 у гордеи-подобных вирусов в дополнение к хеликазному домену имеют дополнительный N-терминальный домен, содержащий, как правило, хотя бы один участок, содержащий несколько положительно заряженных аминокислотных остатков. Бени-подобные белки ТБГ1 также состоят из хеликазного домена и дополнительного N-терминального домена. В тоже время первичная структура хеликазного домена белка ТБГ1 ВЗПГ наиболее блика к аминокислотной последовательности хеликазного домена репликаз у представителей рода Benyvirus, и имеет наименьшее сходство с первичной структурой других белков ТБГ1 (Solovyev et al., 2012). Гордеи-подобные и бениподобные ТБГ3, а также белок ТБГ3 ВЗПГ имеют в своей структуре по два гидрофобных сегмента, однако, являясь гомологами внутри каждой из трех групп, представители ТБГ3 из разных групп при сравнении между собой не оказываются гомологами. Потекс-подобные белки ТБГ3 содержат всего один гидрофобный сегмент. Также следует отметить, что потекс-подобный ТБГ недостаточен для осуществления транспортной функции. Для обеспечения полноценного вирусного транспорта также требуется участие белка оболочки (БО; Chapman et al., 1992). На основании данных о неполной первичной структуре белков ТБГ вируса мозаики Nicotiana velutina, в которой отсутствует часть данных для белка ТБГ3 (Randles and Rohde, 1990), можно утверждать, что в природе существует более, чем четыре класса ТБГ, а также то, что эволюция ТБГ происходила с помощью сложных и многоступенчатых процессов. 2.5.1. Белок ТБГ1 ПЛВМ обладает сиквенс-неспецифичной РНК-связывающей активностью. Вирусный межклеточный транспорт обычно предполагает образование рибонуклеопротеида, содержащего геномную нуклеиновую кислоту и транспортные белки. Исследуя гордеи-подобный ТБГ полулатентного вируса мятлика (ПЛВМ), с помощью проведенных экспериментов было выявлено, что белок ТБГ1 ПЛВМ способен связывать РНК (Рис. 15.). Кроме геномной РНК ВТМ, как было показано с помощью опытов, направленных на выявление РНКсвязывающих свойств белка (Рис. 15.), ТБГ1 ПЛВМ также оказался способным связывать геномную РНК ПЛВМ, геномную РНК вируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ), а также химерный участок генома X вируса картофеля (XВК), содержащий слитный в одной рамке трансляции ген ТБГ1 XВК и ген зеленого флуоресцентного белка (GFP). Таким образом, в проведенных экспериментах последовательность РНК не влияла на РНК-связывающие свойства ТБГ1 ПЛВМ (данные не приводятся). Из этого можно сделать вывод о том, что РНКсвязывающая активность ТБГ1 ПЛВМ не является сиквенс-специфичной. Интересно также, что, как было показано, сиквенс-неспецифичной РНКсвязывающей активностью обладает также белок ТБГ2 вируса мозаики бамбука (ВМБ) (Hsu et al., 2009). Таким образом, как минимум, два компонента ТБГ могут обладать РНК связывающей активностью. 25 Рис. 15. Белок ТБГ1 ПЛВМ обладает сиквенс-неспецифичной РНК-связывающей активностью. Атомно-силовая микроскопия (А) препарата РНК ВТМ, (Б) препарата белка ТБГ1 ПЛВМ и (В) комплексов, образуемых РНК ВТМ и белком ТБГ1 ПЛВМ. Стрелки указывают на нити, выступающие из шарообразных комплексов. Масштабная линейка (А, Б) – 100 нм, (В) – 50 нм. (Г) Анализ РНК-связывающих свойств белка ТБГ1 ПЛВМ с помощью нозерн-вестерн блота. Очищенный рекомбинантный белок ТБГ1 разделялся электрофоретически и переносился на нитроцеллюлозную мембрану. Связанный с мембраной белок денатурировли в буфере, содержащем 6М мочевину и 0,1% Tween, после чего ренатурировали в буфере, содержащем 20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 0,2 г/л БСА, 0,2 г/л фикола и 0,2 г/л поливинпиролидона, после чего мембрану инкубировали с РНК ВТМ, содержащей радиоактивный 32P. Окраска белка на мембране производилась с помощью Ponceau S. 2.5.2. Белок ТБГ1 с помощью белков ТБГ2 и ТБГ3 транслоцируется к клеточной периферии, проникает в ПД и, модифицируя их, транспортируется в соседние клетки. Для проведения следующей серии экспериментов была проведена попытка возможности создания из минимального количества компонентов модельной системы, обеспечивающей межклеточный транспорт, индуцируемый ТБГ. Для визуализации использовался слитный белок, содержащий аминокислотные последовательности GFP и белка ТБГ1 вируса курчавости верхушек картофеля (ВКВК), ТБГ которого, также как и ТБГ ПЛВМ, относится к классу гордеиподобных ТБГ. Слитный ген, содержащий в своей последовательности слитные открытые рамки трансляции GFP и ТБГ1, был клонирован в экспрессионный вектор под контроль 35S промотора вируса мозаики цветной капусты. Временная экспрессия в эпидермальных клетках листьев Nicotiana benthamiana проводилась с помощью трансфекции клеток путем их бомбардировки частицами вольфрама, на которые предварительно сорбировалась ДНК экспрессионных генетических конструкций. Визуализация с помощью флуоресцентной микроскопии показала, что внутриклеточная локализация слитного белка GFP-ТБГ1 не отличается от локализации свободного GFP (Рис. 16. А, Б). Слитный белок GFP-ТБГ1, как и свободный GFP, локализовался диффузно в цитоплазме и в несколько большем количестве внутри ядра трансфецированных клеток (Рис. 16. А, Б). В результате кобомбардмента экспрессионного вектора, содержащего ген GFP-ТБГ1 совместно с экспрессионными векторами, содержащими гены ТБГ2 ВКВК или ТБГ3 ВКВК было выявлено, что коэкспрессия GFP-ТБГ1 с еще одним белком, кодируемым 26 ТБГ, никак не влияет на внутриклеточную локализацию GFP-ТБГ1 (Рис. 16. В и данные не приводятся). В тоже время, коэкспрессия GFP-ТБГ1 с ТБГ2 и ТБГ3 выявила резкое изменение во внутриклеточной локализации GFP-ТБГ1. В условиях такой коэкспрессии с двумя другими белками ТБГ GFP-ТБГ1 стал локализоваться в тельцах включений, расположенных на клеточной периферии, а также в ярких точечных структурах внутри клеточной стенки (Рис. 16. Г, Д). Такие точечные структуры неоднократно наблюдались другими авторами при экспрессии слитных с GFP белков, локализующихся в ПД (Escobar et al. 2003, Oparka and Roberts, 2001). Более того, при использовании более высокой интенсивности лазерного излучения для возбуждения флуорофора GFP выяснилось, что GFP-ТБГ1 при коэкспрессии с ТБГ2 и ТБГ3 транспортируется в соседние клетки (Рис. 16. Е). Интересно, что немодифицированные ПД способны пропускать белки с молекулярной массой не более 50 кДа (Oparka et al., 1999). Молекулярная масса GFP-ТБГ1 составляет примерно 78 кДа. Таким образом, можно сделать вывод о том, что белки ТБГ ВКВК совместно способны модифицировать ПД, повышая их пропускную способность. Примечательно также, что локализация GFP-ТБГ1 в клетках, соседних с трансфецированной, повторяло локализацию GFP-ТБГ1 при его экспрессии отдельно от белков ТБГ2 и ТБГ3 или же при его коэкспрессии только с одним из этих белков (Рис. 16. А, Е), что позволяет сделать вывод о том, что белок ТБГ2 и/или белок ТБГ3 не способны транспортироваться в соседнюю клетку. Для проверки функциональной активности GFP-ТБГ1 была модифицирована полная инфекционная копия ВКВК, в которой ген ТБГ1 был замещен геном GFPТБГ1. Транскриптами, полученными с помощью модифицированной полной инфекционной копии ВКВК, содержащей ген GFP-ТБГ1, были инокулированы растения N. benthamamiana. Через три дня после инокуляции с помощью флуоресцентной микроскопии можно было наблюдать локусы инфекции (Рис. 16. З), которые значительно разрастались к 5 дню после инокуляции (Рис. 16. И). Таким образом, можно сделать вывод о том, что наличие дополнительного участка, содержащего последовательность GFP, в структуре ТБГ1 ВКВК не затрагивает его функции транспортного белка. Обобщая полученные данные, можно сделать вывод о том, что РНКсвязывающий белок ТБГ1 с помощью белков ТБГ2 и ТБГ3 транслоцируется к клеточной периферии, проникает в ПД и, модифицируя их, транспортируется в соседние клетки. 2.5.3. Гетерологичные белки ТБГ2 и ТБГ3 частично транслоцируют белок ТБГ1 из ядра и цитоплазмы в тельца включений, расположенных на клеточной периферии, но не в ПД. При коэкспрессии белка GFP-ТБГ1 ВКВК с гетерологичными белками ТБГ2 и ТБГ3 гордеи-подобного ТБГ ПЛВМ или потекс-подобного ТБГ XВК выяснилось, что GFP-ТБГ1 только частично транслоцируется из ядра и цитоплазмы в тельца включений, расположенных на клеточной периферии, но не детектируется в ПД (Рис. 17.). Замена белков ТБГ2 или ТБГ3 обратно на соответствующий белок 27 Рис. 16. Белок GFP-ТБГ1 с помощью белков ТБГ2 и ТБГ3 транслоцируется к клеточной периферии, проникает в ПД и, модифицируя их, транспортируется в соседние клетки. (А) Локализация GFP в эпидермальной клетке N. benthamiana, визуализированная с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. (Б, Ж) Локализация GFP-ТБГ1 ВКВК в эпидермальной клетке N. benthamiana. (Б) Вынесенный участок – один оптический срез, проходящий через середину ядра клетки. Флуоресцентная микроскопия клеток, коэкспрессирующих белки GFP-ТБГ1 и ТБГ3 (В) GFP-ТБГ1, ТБГ2 и ТБГ3 (Г, Д, Е). (Е, Ж) Для визуализации флуоресценции в этих случаях использовалась высокая интенсивность лазерного излучения (примерно в 10 раз выше, чем для обычной визуализации внутриклеточной локализации белков, слитных с GFP). (З, И) Визуализация с помощью флуоресцентоной микроскопии локусов инфекции ВКВК, экспрессирующего GFP-ТБГ1. Масштабные линейки (Е, Ж) – 20 мкм, (З, И) – 100 мкм, остальные – 10 мкм. ВКВК в экспериментах по коэкспрессии ничего не изменяла и не приводила к полной транслокации GFP-ТБГ1 в тельца включений, расположенных на клеточной периферии, а также в ПД (Рис. 17.) в отличие от системы, в которой все три белка ТБГ принадлежали ВКВК (см. п. 2.5.2.). Также ни в одном из описанных случаев не удалось обнаружить транспорт белка GFP-ТБГ1 в соседние клетки, направляемый белками ТБГ2 и ТБГ3. Таким образом, можно заключить, что для транспорта белка ТБГ1 в ПД и в соседние клетки требуются специфичные взаимодействия между всеми тремя белками ТБГ. Поэтому транспорт белка ТБГ1 не осуществляться даже в том случае, если один из белков (ТБГ2 или ТБГ3) не принадлежит к ТБГ, к которому относится белок ТБГ1. 2.5.4. Белок ТБГ3 способен сиквенс-неспецифично транслоцировать ТБГ2 в тельца включений на клеточной периферии. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия эпидермальных клеток N. benthamiana, экспрессирующих слитный с GFP белок ТБГ2 ВКВК и белок 28 Рис. 17. Гетерологичные ТБГ2 и ТБГ3 частично транслоцируют GFP-ТБГ1 из ядра и цитоплазмы в тельца включений, расположенные на клеточной периферии, но не в ПД и не в соседние клетки. Микрофотографии результатов конфокальной лазерной сканирующей микроскопии эпидермальных клеток N. benthamiana, коэкспрессирующих указанные белки. Масштабная линейка – 10 мкм. ТБГ2 XВК, показала, что белки ТБГ2 локализуются в структурах, морфология которых позволяет сделать заключение о том, что белки ассоциированы с мембранами эндоплазматического ретикулума (ЭПР; Рис. 18. А, Д). В тоже время, конфокальная лазерная сканирующая микроскопия эпидермальных клеток N. benthamiana, экспрессирующих слитный с dsRed белок ТБГ3 ПЛВМ, выявила, что dsRed-ТБГ3 ПЛВМ, в отличие от белка ТБГ2, локализуется на клеточной периферии в тельцах включений (Рис. 18. Б). Более того, с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии клеток, коэкспрессирующих dsRed-ТБГ3 ПЛВМ и GFP-ТБГ2 ПЛВМ, были получены данные о том, что оба белка (ТБГ2 и ТБГ3) при коэкспрессии детектировались в тельцах включений на клеточной периферии. При этом детектируемые флуоресцентные сигналы были полностью колокализованы (Рис. 18. Б-Г). Флуоресцентная микроскопия клеток, коэкспрессирующих GFP-ТБГ2 и ТБГ3 XВК, также как GFP-ТБГ2 и ТБГ3 ВКВК позволила детектировать GFP-ТБГ2 также в тельцах включений на клеточной периферии (Рис. 18. Е для XВК и 18. Ж для ВКВК). Таким образом, можно заключить, что при экспрессии в клетках табака белок ТБГ2 ассоциирован с мембранами кортикального ЭПР, в то время как белок ТБГ3 локализуется в тельцах включений на клеточной периферии. Коэкспрессия этих белков приводит к транслокации белка ТБГ2 в структуры на периферии клеток. Тот факт, что ТБГ3 ПЛВМ оказался способен транслоцировать ТБГ2 ВКВК (Рис. 18. З), а также некоторые другие белки вирусов растений, не содержащих ТБГ (например, 6К мембранный белок вируса желтухи свеклы (ВЖС) и предполагаемый транспортный белок вируса некротической желтухи фасоли), в тельца включений (Рис. 18. З и данные не приводятся), указывает на то, что транслокация других белков с помощью белка ТБГ3 происходит сиквенс-неспецифично. 2.5.5. Периферические тельца включений, образование которых индуцируется ТБГ3, являются производными ЭПР. Для выявления природы структур, образуемых экспрессией в эпидермальных клетках N. benthamiana белка ТБГ3, слитный белок dsRed-ТБГ3 ПЛВМ был коэкспрессирован с GFP, локализующимся в ЭПР (GFP-ER; GFP, слитый с 29 Рис 18. Белок ТБГ3 способен транслоцировать белок ТБГ2 в тельца включений на клеточной периферии. (А) Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия эпидермальной клетки N. benthamiana, экспрессирующей слитный белок GFP-ТБГ2 ВКВК. (Б-Г) Визуализация коэкспресии слитного белка dsRed-ТБГ3 ПЛВМ (Б) и слитного белка GFP-ТБГ2 ПЛВМ (В). (Г) наложение (Б) и (В). (Д) Микрофотография клетки, экспрессирующей слитный белок GFP-ТБГ2 XВК. (Е) Флуоресцентная микроскопия клетки, экспрессирующей слитный белок GFP-ТБГ2 XВК и белок ТБГ3 XВК. (Ж) Визуализация коэкспресии слитного белка GFP-ТБГ2 ВКВК и белка ТБГ3 ВКВК. (З) Визуализация коэкспресии слитного белка GFP-ТБГ2 ВКВК и белка ТБГ3 ПЛВМ. Масштабная линейка – 10 мкм. лидерной последовательностью хитиназы из Arabidopsis thaliana, направляющей белок в полость ЭПР, и С-концевым сигналом задержки в ЭПР; Boevink et al., 1998), а GFP-ТБГ3 XВК совместно с ТБГ3 XВК были коэкспрессированы с YFP, локализующимся в ЭПР (YFP-ER). Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия выявила, что приферические тельца включений, образуемые белком ТБГ3, колокализуются со структурами ЭПР (Рис. 19.). При этом, в клетках, экспрессирующих только GFP-ER, какие-либо специфические новые образования на периферии клеток не детектировались (Рис. 19.). Таким образом, можно заключить, что тельца включений, образование которых индуцирует белок ТБГ3 на периферии трансфецированной клетки, являются структурами, произошедшими от ЭПР. Коэкспрессия белков ТБГ ВКВК GFP-ТБГ1, ТБГ2 и ТБГ3 совместно с YFPER показала, что периферические тельца включений, в которые при коэкспрессии с белками ТБГ2 и ТБГ3 транслоцируется слитный белок GFP-ТБГ1, также являются структурами, произошедшими от ЭПР. Таким образом, можно заключить, что в процессе вирусного транспорта, обеспечиваемого белками гордеи-подобного или потекс-подобного ТБГ, белок 30 Рис. 19. Периферические тельца включений, образование которых индуцируется белком ТБГ3, являются производными ЭПР. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия эпидермальных клеток N. benthamiana, экспрессирующих GFP-ER (верхняя микрофотография), коэкспрессирующих слитный белок dsRed-ТБГ3 ПЛВМ и белок GFPER (второй ряд сверху; микрофотографии слева направо: детекция dsRed-ТБГ3, GFP-ER, наложение зеленого и красного каналов), коэкспрессирующих белки GFP-ТБГ3 XВК, ТБГ3 XВК и YFP-ER (третий ряд сверху; микрофотографии слева направо: детекция GFPТБГ3, YFP-ER и наложение двух микрофотографий) и коэкспрессирующих белки GFPТБГ1 ВКВК, ТБГ2 ВКВК, ТБГ3 ВКВК и YFP-ER (нижний ряд; микрофотографии слева направо: детекция GFP-ТБГ1, YFP-ER и наложение двух микрофотографий). Масштабная линейка – 10 мкм. ТБГ3 индуцирует образование новых структур на клеточной периферии из мембран ЭПР и сиквенс-неспецифично транслоцирует в них белок ТБГ2. Транслокация в эти структуры гордеи-подобного белка ТБГ1 уже является сиквенсспецифичным процессом, требующим участия белка ТБГ2. Оказавшись на клеточной периферии, гордеи-подобный белок ТБГ1 транслоцируется в ПД, увеличивает их пропускную способность и транспортируется в соседнюю клетку. В отличии от гордеи-подобных ТБГ, у потекс-подобных ТБГ транспорт вирусного генома от места репликации к ПД и в соседнюю клетку происходит не в виде РНП, образуемого белком ТБГ1 и вирусной геномной РНК, а в виде РНП, образованного белком ТБГ1, белком оболочки и геномной РНК (Verchot-Lubicz et al., 2010). Тем 31 не менее, можно заключить, что основной движущей силой, обеспечивающей внутриклеточный и межклеточный транспорт, является белок ТБГ3. 2.6. Мембранные белки ТБГ3 и цистеин богатый белок ВКВК вызывают стресс ЭПР, приводящий к ПКС. 2.6.1. Гордеи-подобный белок ТБГ3 индуцирует стресс ЭПР. Дальнейшие микроскопические исследования влияния экспрессии ТБГ3 на ЭПР в эпидермальных клетках N. benthamiana выявили, что экспрессия белка ТБГ3 может приводить к дезинтеграции ЭПР. Такая дезинтеграция ЭПР проявляется в везикуляции мембран ЭПР, приводящей к потере мембранами ЭПР характерной для них морфологии, и может быть легко визуализирована с помощью микроскопии (Рис. 20. А, Б). Накопление в ЭПР существенных количеств несвернутых или неверно свернутых белковых молекул, избытка мембранных белков, а также другие причины вызывают стресс ЭПР (Xu et al., 2005), следствием которого является так называемый «ответ на несвернутый белок» (ОНБ), имеющий целью компенсировать функциональные повреждения ЭПР, но вызывающий, при условии длительного воздействия факторов, приводящих к стрессу ЭПР, клеточную смерть (Xu et al., 2005; Zhang et al., 2006). В клетках растений, также как и в клетках всех эукариотических организмов развитие ОНБ связано с повышением уровня ряда белков ЭПР, участвующих в сворачивании полипептидных цепей, таких как белок BiP, протеиндисуфидизомераза, кальретикулин и кальмодулин (Oh et al., 2003, Urade, 2009). Недавно было показано, что потекс-подобный белок ТБГ3, кодируемый ХВК, вызывает стресс ЭПР в условиях высокого уровня накопления данного белка в клетках растений (Ye et al., 2013). Было обнаружено, что белок ТБГ3 активирует транскрипционный фактор bZIP60, необходимый для индукции экспрессии целого ряда белков ЭПР, обеспечивающих процессы развития ОНБ, а также белка SKP1, являющегося компонентом Е3-убиквитин-лигазного комплекса (Ye et al., 2011; 2012; 2013). Развитие процессов ОНБ в ответ на стресс ЭПР, индуцированный белком ТБГ3, приводит к клеточной смерти, сопровождающейся повышением уровня активных форм кислорода и фрагментацией ДНК (Ye et al., 2013), однако молекулярный механизм индукции клеточной смерти в результате стресса ЭПР и развития реакций ОНБ остается неизвестным (Tabas and Ron, 2011). Для выяснения молекулярных механизмов развития ПКС при экспрессии гордеи-подобного белка ТБГ3 мы использовали митохондриально-адресованный антиоксидант SkQ1 (10-(6’-пластохинонил)децилтрифенилфосфоний), который эффективно подавлял развитие ПКС у растений, индуцированную через каскад митоген-активируемых киназ. В этом случае использовалась модельная система индукции ПКС при развитии гиперчувствительного ответа растений табака, содержащих ген N, в ответ на экспрессию элиситора гиперчувствительного ответа, кодируемого ВТМ (данные не приводятся). Подавление ПКС в такой экспериментальной системе с помощью Bcl-xL указывает на то, что супрессия развития ПКС происходит на уровне митохондрий (данные не приводятся). В тоже время, как выяснилось, 32 использование SkQ1 никак не влияло на развитие стресса ЭПР, вызываемого гордеи-подобным ТБГ3 ПЛВМ (Рис. 20. Б, В). Такой результат хорошо согласуется с данными, полученными для потекс-подобного белка ТБГ3 XВК. В экспериментах Ye и соавторов (2013) Bcl-xL не был способен супрессировать ПКС, индуцируемую ТБГ3 XВК. Можно заключить, что несмотря на существенные различия в структуре и потекс-подобный, и гордеи-подобный белки ТБГ3 индуцируют стресс ЭПР, приводящий к развитию ПКС, которое не затрагивает сигнальные каскады, проходящие с участием митохондрий. Рис. 20. Гордеи-подобный белок ТБГ3 индуцирует стресс ЭПР. (А) Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия эпидермальной клетки N. benthamiana, экспрессирующей белок GFP-ER. (Б) Микрофотография эпидермальной клетки N. benthamiana, коэкспрессирующей GFP-ER и ТБГ3 ПЛВМ. (В) Микрофотография эпидермальной клетки N. benthamiana, коэкспрессирующей GFP-ER и ТБГ3 ПЛВМ в условиях инкубировании с SkQ1. Масштабная линейка – 20 мкм. 2.6.2. Цистеин богатый белок ВКВК индуцирует развитие стресса ЭПР и развитие ПКС. При исследовании внутриклеточной локализации еще одного мембранного 8 кДа цистеин-богатого белка (ЦББ), кодируемого ВКВК, выяснилось, что он также способен индуцировать дезинтеграцию структур ЭПР (Рис. 21.). Поэтому неудивительно, что результатом экспрессии ЦББ с помощью гетерологичного экспрессионного вектора в растениях N. benthamiana явилась полная некротизация верхушек растения (Рис. 21.). Таким образом, ВКВК кодирует как минимум два мембранных белка, способных индуцировать стресс ЭПР, приводящий к развитию ПКС. 33 Рис. 21. Цистеин богатый мембранный белок (ЦББ) ВКВК индуцирует развитие стресса ЭПР и развитие ПКС. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия эпидермальной клетки N. benthamiana, коэкспрессирующей слитный белок GFP-ЦББ и YFP-ER (верхний ряд микрофотографий; зеленый канал – визуализация GFP-ЦББ; красный канал – визуализация YFP-ER; правая микрофотография – наложение зеленого и красного каналов). Масштабная линейка – 20 мкм. (Нижний ряд) N. benthamiana, инфицированная XВК, экспрессирующим ЦБГ ВКВК через 10 дней после заражения (слева). N. benthamiana, инфицированная XВК. 2.7. Вирусы растений используют специальные механизмы для снижения уровня экспрессии вирус-специфических белков, которые могут вызывать развитие ПКС. Очевидно, что вирусу невыгодно экспрессировать белок, который индуцирует ПКС. Поэтому логично предположить, что в случае с белками ТБГ3 и ЦББ, вирусу выгодно, чтобы их экспрессия была на минимальном уровне. Действительно, на протяжении многих лет осуществлялись безрезультатные попытки детектировать белок ТБГ3 при вирусной инфекции, и только недавно появилось сообщение о том, что ТБГ3 ПЛВМ детектируется в малых количествах во время вирусной инфекции (Shemyakina et al., 2011). В наших экспериментах ЦББ детектировался, хотя его детекция также была затруднена низким уровнем экспрессии белка (данные не приводятся). 34 Анализ генома ВКВК (Рис. 22. А) показывает, что для экспрессии всех белков, кодируемых открытыми рамками трансляции, вирусу необходимо дополнительно продуцировать субгеномные РНК (сгРНК) для экспрессии следующих белков: 13К ТБГ2, 21К ТБГ3 и 8К ЦББ, в то время как продукты RT 206K и RT 91K экспрессируются за счет проскока рибосомой соответствующих терминальных кодонов. Нозерн-блот тотальной РНК, выделенной из зараженного растения, с использованием пробы к консервативной 3’-терминальной области, присутствующей во всех трех геномных РНК ВКВК, позволил детектировать только одного потенциального кандидата для сгРНК, который по своему размеру может соответствовать сгРНК для экспрессии ТБГ2 (Рис. 22. Б). Однако следует учитывать то, что более низкомолекулярные РНК при электрофорезе могут хуже концентрироваться, чем высокомолекулярные фрагменты, что снижает чувствительность метода. Для проведения анализа другим методом, а также для картирования 5’-концевых областей сгРНК, был использован метод удлинения праймера при проведении реакции обратной транскрипции. В этом эксперименте в качестве матрицы также использовалась тотальная РНК, выделенная из зараженных растений. Для постановки реакции олигонуклеотиды EXT-ТБГ2, EXTТБГ3 и EXT-ЦББ подбирались таким образом, чтобы они были комплементарными к участкам последовательности РНК3 ВКВК, расположенным с 3’-конца от инициаторных кодонов генов ТБГ2, ТБГ3 и ЦББ. Реакции обратной транскрипции, проведенные с олигонуклеотидами EXT-ТБГ2 и EXT-ЦББ выявили места обрыва полимеразной реакции (Рис. 22. В, Г), в то время как реакция, проведенная с олигонуклеотидом EXT-ТБГ3 на интересуемом участке, не выявила наличие обрыва цепи (данные не приводятся). Два или три следующих друг за другом обрыва реакции удлинения праймера при обратной транскрипции указывают на то, что такие РНК содержат КЭП (White and Mackie 1990). Таким образом, можно заключить, что для экспрессии ТБГ2 и ЦББ ВКВК синтезирует специальные сгРНК, в то время как ТБГ3 транслируется с использованием сгРНК для ТБГ2. Такое возможно за счет проскока рибосомой в ходе сканирования AUG-кодона ТБГ2 и альтернативной инициации трансляции с помощью инициаторного кодона ТБГ3. Примечательно, что между инициаторными кодонами ТБГ2 и ТБГ3 нет никаких других AUG-кодонов. Такие данные хорошо согласуются с данными, полученными для потексподобного ТБГ: как было показано, белки ТБГ2 и ТБГ3 XВК транслируются с использованием одной бицистронной сгРНК в качестве матрицы (Morozov et al., 1991; Verchot et al., 1998). Для проверки аналогичной возможности экспрессии ТБГ3 у гордеи-подобного ТБГ была проведен эксперимент, включавший в себя коэкспрессию слитного белка GFP-ТБГ1 и белков ТБГ2 и ТБГ3 ВКВК, для которого был сконструирован специальный экспрессионный вектор, содержащий перекрывающиеся гены белков ТБГ2 и ТБГ3 и повторяющий соответсвующий участок генома ВКВК. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия выявила, что в этом эксперименте слитный белок GFP-ТБГ1 полностью транслоцировался в периферические тельца включений и в ПД (Рис. 22. Д). Слитный белок GFP-ТБГ1 также транспортировался в соседние клетки (данные не приводятся). Из этих данных можно сделать вывод о том, что белок ТБГ3 способен транслироваться с бицистронной матрицы in vivo, т.к. для обеспечения полной транслокации белка ТБГ1 в перефирические структуры экспрессии одного ТБГ2 недостаточно (см. п. 2.5.2.). Более того, из данного эксперимента следует, что даже 35 Рис. 22. ВКВК использует специальные механизмы для снижения уровня экспрессии мембранных белков, которые приводят к развитию стресса ЭПР и могут вызывать индукцию процессов ПКС. (А) Схематическое изображение генома ВКВК. (Б) Нозернблот с использованием радиоактивного зонда к 3’-терминальной консервативной области РНК1, 2 и 3 ВКВК. Левая дорожка – электрофоретическое разделение тотальной РНК, выделенной из здоровых растений. Правая дорожка – электрофоретическое разделение тотальной РНК, выделенной из растений, зараженных ВКВК. (В и Г) Продукты реакций обратной транскрипции, проведенной с помощью олигонуклеотидов EXT-ТБГ2 (В) и EXT-ЦББ (Г), используя тотальный экстракт РНК, выделенной из растений, зараженных ВКВК (правые дорожки). Реакция секвенирования по Сэнгеру (дорожки G, A, T, C) с 36 небольшого количества белка ТБГ3 достаточно для обеспечения внутриклеточного и межклеточного транспорта белка ТБГ1. Примечательно, что при анализе нуклеотидных последовательностей различных изолятов ВКВК было обнаружено, что многие из них в своей последовательности не содержат инициаторный кодон у гена, кодирующего ЦББ, который заменен на триплет GUG (Рис. 22. Е). Также известно, что у представителей рода Allexvirus ген белка ТБГ3 не содержит инициаторного AUG кодона. Известно, что инициация трансляции с использованием неканонических инициаторных возможна, но ее эффективность, как минимум, на порядок ниже, чем трансляции, инициируемой с помощью канонического AUG-кодона (Ivanov et al., 2011). Таким образом можно заключить, что вирусы растений используют специальные механизмы для снижения уровня экспрессии мембранных белков, которые приводят к развитию стресса ЭПР и могут вызывать развитие процессов ПКС. К настоящему времени накопилось много данных о развитии стресса ЭПР в клетках млекопитающих, индуцированного вирусными инфекциями (Jordan et al., 2002; Baltzis et al., 2004; Netherton et al., 2004; Sun et al., 2004; Tardif et al., 2005). В процессе продуктивной вирусной инфекции синтезируется значительное количество вирус-специфических белков, среди которых может быть также большое количество мембранных белков, что определяется клеточными сенсорами стресса ЭПР, как переполнение люмена ЭПР несвернутыми или неправильно свернутыми белками (Kim et al., 2008). В результате, в инфицированных клетках активированные сенсоры стресса ЭПР индуцируют развитие процессов ОНБ, целью которых является восстановление гомеостаза ЭПР. У животных к настоящему времени охарактеризовано три основных сигнальных каскада развития ОНБ, которые инициируются сенсорами стресса ЭПР PERK, IRE1 и ATF6 (Zhang and Wang 2012). Для восстановления гомеостаза ЭПР процессы развития ОНБ включают в себя механизмы супрессии трансляции, в результате чего в ЭПР перестают поступать новые белки, требующие осуществления фолдинга. С другой стороны, инициируются сигнальные пути приводящие к активации ЭПРассоциированной деградации белков. И, наконец, инициируются процессы, увеличивающие уровень экспрессии генов шаперонов ЭПР, что, в свою очередь, должно приводить к усилению молекулярного аппарата ЭПР, осуществляющего фолдинг, и увеличению его «пропускной способности» (Zhang and Wang 2012). Однако в случае, при котором стресс ЭПР приобретает хронический характер, клетка индуцирует запуск механизмов, осуществляющих развитие процессов ПКС (Sano and Reed 2013). Рис. 22. (продолжение подписи) помощью олигонуклеотидов EXT-ТБГ2 (В) и EXT-ЦББ (Г), проведенная с использованием полноразмерной ДНК копии РНК3 ВКВК в качестве матрицы. (Д) Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия эпидермальной клетки N. benthamiana, коэкспрессирующей слитный белок GFP-ТБГ1 и белки ТБГ2 и ТБГ3. Для коэкспрессии белков ТБГ2 и ТБГ3 в данном эксперименте использовалась бицистронная экспрессионная конструкция, содержащая перекрывающиеся гены белков ТБГ2 и ТБГ3 и повторяющая соответствующий участок геномной РНК3 ВКВК. Масштабная линейка – 10 мкм. (Е) Выравнивание аминокислотных последовательностей ЦББ разных изолятов ВКВК. Подчеркнут гидрофобный сегмент. 37 Многие вирусы млекопитающих эволюционировали таким образом, чтобы приспособить сигнальные пути ОНБ хозяина для обеспечения максимально эффективной репликации и транскрипции вирусного генома, трансляции и обеспечения фолдинга вирус-специфических продуктов, а также для повышения вероятности выживания вируса в инфицированной клетке. С одной стороны, активный синтез вирус-специфических продуктов часто приводит к стрессу ЭПР и активирует сенсоры стресса ЭПР, что приводит к развитию ОНБ со всеми, в том числе и негативными для вируса эффектами. С другой стороны, восстановление функций ЭПР часто является необходимым условием для обеспечения нормальной репликации вируса, а также для обеспечения фолдинга вирус-специфических продуктов (He, 2006; Zhang and Wang 2012). Естественно, ингибирование синтеза белка, к которому приводит сигнальный каскад, инициированнный одним из сенсоров стресса ЭПР PERK, также негативно влияет на синтез, в том числе, и вирус-специфических продуктов, что является нежелательным при развитии продуктивной вирусной инфекции. И, наконец, возможное развитие ПКС также является нежелательным процессом для продукции вируса. Поэтому вирусы животных приобрели специальные механизмы, которые способны манипулировать молекулярными механизмами развития ОНБ с целью обеспечения максимально комфортных условий для вирусной репродукции (Zhang and Wang 2012). У растений, как и у всех эукариотических организмов, в ответ на переполнение люмена ЭПР несвернутыми или неправильно свернутыми белками, также может развиваться стресс ЭПР, индуцирующий сигнальные каскады ОНБ, целью которых является восстановление гомеостаза ЭПР. Интенсивные исследования, проведенные в последние десятилетие, позволили выявить у растений, как минимум, два сигнальных пути развития ОНБ. IRE1-зависимый путь развития ОНБ у растений по особенностям молекулярных механизмов во многом аналогичен соответствующему сигнальному каскаду у животных, в то время как bZIP17 и bZIP28-зависимый путь развития ОНБ у растений напоминает ATF6зависимый сигнальный каскад у животных (Iwata and Koizumi, 2012). К настоящему времени практически ничего не известно о пересечении молекулярных путей развития инфекционных процессов, вызываемых фитовирусами c молекулярными путями развития процессов ОНБ, вызванного стрессом ЭПР, у растений. Тем не менее, недавно было продемонстрировано, что потекс-подобный белок ТБГ3, кодируемый ХВК, в условиях оверэкспрессии вызывает стресс ЭПР (Ye et al., 2013). Более того, как было показано, в таких условиях белок ТБГ3 XВК активирует транскрипционный фактор bZIP60, необходимый для индукции экспрессии целого ряда белков ЭПР, обеспечивающих процессы развития ОНБ, а также белок SKP1, который является компонентом Е3убиквитин-лигазного комплекса (Ye et al., 2011; 2012; 2013). Кроме того, ответом на стресс ЭПР, индуцированный оверэкспрессией белка ТБГ3, является развитие процессов ПКС (Ye et al., 2013). В наших экспериментах было показано, что стресс ЭПР может быть также индуцирован функциональным гомологом белка ТБГ3 XВК – белком ТБГ3 ПЛВМ. Кроме того, стресс ЭПР индуцируется экспрессией мембранного ЦББ ВКВК и, более того, оверэкспрессия ЦББ ВКВК приводит к развитию ПКС (см. пп. 2.6.1. и 2.6.2.). Однако все известные примеры индукции стресса ЭПР и развивающихся вследствие этого феномена процессов наблюдались у растений только в искусcтвенных экспериментальных системах, в которых была значительно 38 увеличена экспрессия индукторов стресса ЭПР по сравнению с уровнями экспрессии таких белков-индукторов стресса ЭПР, характерными для вирусной инфекции (Ye et al., 2013 и см. выше). Полученные данные о том, что при вирусной инфекции специальные вирус-специфичные молекулярные механизмы регуляции экспрессии белков ТБГ3 и ЦББ направлены на значительное снижение уровня экспрессии этих двух вирус-специфических продуктов, позволяют сделать вывод о том, что в случае с этими мембранными белками фитовирусы используют специальную стратегию снижения их уровня экспресии, которая позволяет миновать процессы развития стресса ЭПР и последующего развития ПКС, т.е. процессов, которые являются нежелательными для эффективной вирусной репродукции. 2.8. Разработка метода определения топологии мембранных белков in vivo. Более чем 30% от общего числа белков эукариот являются трансмембранными белками (Wallin and von Heijne, 1998). Исследователи, изучающие такие мембранные белки, обычно сталкиваются с тем, что нет данных об их пространственной структуре. Стандартные методы, такие как кристаллография, достаточно трудоемки в случаях, когда предметом исследования является мембранный белок. По сравнению с растворимыми белками технические трудности с трансмембранными белками обычно возникают на всех этапах получения данных о пространственной структуре таких белков: при экспрессии, рефолдинге и кристаллизации. Кроме того, разрешенная структура обычно не несет информации о том, в какой компартмент транслоцированы растворимые части трансмембранного белка. Для предсказания топологии мембранных белков на основе их первичной структуры существуют алгоритмы и соответствующие программы. Однако они не всегда способны обеспечить получение достоверного результата (van Geest and Lolkema, 2000). В ходе исследований мембранных белков вирусов растений нами был разработан новый метод определения топологии мембранных белков, разработанный на основе феномена бимолекулярной флуоресцентной комплементации (БиФК; Ghosh et al., 2000; Hu et al., 2002). БиФК основана на том, что две части флуоресцентного белка, коэкспрессированные в одной клетке, взаимодействовать, образовывая при этом правильную способны пространственную структуру флуоресцентного белка, что приводит к созреванию хромофора и, соответственно, к возможности поглощать излучение определенной длины волны и испускать флуоресценцию. Сразу после открытия феномена БиФК на его основе был предложен метод определения белок-белковых взаимодействий (Hu et al., 2002). В наших экспериментах при коэкспрессии YN и YC (фрагменты YFP: YN cодержал 1-154 аминокислотные остатки последовательности полноразмерного YFP, в то время как YC – 155-239 аминокислотные остатки) после бомбардмента или агроинфильтрации N. benthamiana с помощью флуоресцентной микроскопии детектировались флуоресцентные клетки (Рис. 23. Б, Д), из чего можно сделать вывод о том, что при коэкспрессии фрагменты YFP способны взаимодействовать и образовывать структуру YFP. При коэкспрессии YN-ER и YC-ER (соответствующие фрагмены YFP, слитые с лидерной последовательностью, 39 направляющей их в полость ЭПР, и С-концевым сигналом задержки в ЭПР HDEL) в обеих экспрессионных системах с помощью флуоресцентной микроскопии также детектировались флуоресцирующие клетки (Рис. 23. В, Е). При этом можно было наблюдать структуры, по морфологии характерные для структур ЭПР. При коэкспрессии YN и YC-ER также в обеих экспрессионных системах наблюдались флуоресцирующие клетки (Рис. 23. Г и Ж). При этом флуоресценция наблюдалась в ядре и цитоплазме, что позволяет предположить, что из-за неправильной транслокации в полость ЭПР часть YC-ER остается в цитоплазме и образует комплекс с YN. При анализе коэкспрессии YN-ER и YC образцы не отличались от контроля (трансфекция экспрессионным вектором, не содержащим какого-либо гена) и обнаружить флуоресцирующих клеток не удалось (Рис. 23. З, И и данные не приводятся). Белковые экстракты из листьев, временно экспрессирующих все четыре варианта в присутствии или отсутствии супрессора сайленсинга HcPro, который использовался для повышения уровня экспресии, анализировались флуориметрически и вестерн-блотом, используя поликлональные антитела к YFP (Рис. 23. К, Л). Как и следовало ожидать, при флуориметрическом анализе наибольший сигнал детекировался в образцах, полученных из листьев, экспрессирующих YN-ER и YC-ER, а также YN и YC. Детектируемый флуоресцентный сигнал в образцах, полученных из листьев, экспрессирующих YN и YC-ER, был существенно ниже, в то время как флуоресцентный сигнал в образцах, полученных из листьев, экспрессирующих YN-ER и YC практически не отличался от базовой линии, соответствовавшей уровню аутофлуоресценции контроля (Рис. 23. К). Вестерн-блот образцов с использованием поликлональной сыворотки к YFP выявил, что YN и YC, экспрессированные по отдельности, не детектируются, что, вероятно, происходит из-за их быстрой деградации в цитоплазме (Рис. 23. Л). В отличие от YN и YC YN-ER и YC-ER при раздельной экспрессии детектировались, что предполагает их способность накапливаться в полости ЭПР (Рис. 23. Л). Примечательно, что в образцах из листьев, коэкспрессирующих YN и YC, а также YN-ER и YC-ER, несмотря на классическую процедуру денатурации, предшествующую электрофорезу, детектировалась зона, соответствующая полноразмерному YFP или YFP, слитному с двойным повтором последовательности локализации в ЭПР, что позволяет сделать вывод о высокой стабильности YFP, образованного из двух фрагментов. Таким образом, пара белков YN-ER и YC накапливаются в ЭПР и цитоплазме, соответственно, и из-за локализации в разных клеточных компартментах не могут взаимодействовать друг с другом и образовывать YFP. Согласно предсказанию, сделанному с помощью биоинформатического пакета программного обеспечения TMHMM (Krogh et al., 2001), белок ТБГ2 содержит два трансмембранных сегмента, а его N- и C-терминальные части транслоцированы в цитоплазму, в то время как петля, соединяющая гидрофобные участки, ориентирована в полость ЭПР (Рис. 24. А). Для проверки правильности этого предсказания in vivo, была сконструирована серия экспрессионных векторов, в которых ген белка ТБГ2 ВКВК был слит в одной рамке трансляции с YN или YC в трех вариантах: последовательности, кодирующие фрагменты YFP YN и YC встраивались таким образом, чтобы транслируемый белок содержал один из фрагментов YFP на N-конце, C-конце или внутри петли, соединяющей трансмембранные сегменты белка ТБГ2 (Рис. 24. Б). Полученные 40 Рис. 23. YN-ER и YC накапливаются в ЭПР и цитоплазме, соответственно, и из-за локализации в разных клеточных компартментах не могут взаимодействовать. (А) Схематическое изображение использованных экспрессионных векторов. (Б-Г) Временная коэкспрессия белков YN и YC (Б), YN-ER и YC-ER (В), а также YN и YC-ER (Г) в эпидермальных клетках N. benthamiana после бомбардмента соответствующими экспрессионными векторами, визуализированная с помощью флуоресцентной микроскопии. (Д-И) Флуоресцентная микроскопия листьев N. benthamiana, экспрессирующих белки YN и YC (Д), YN-ER и YC-ER (Е), YN и YC-ER (Ж), YN-ER и YC (З), или листа, трансфецированного вектором не несущим какого-либо гена. (К) Флуориметрический анализ белковых экстрактов из листьев, коэкспрессирующих указанные белки. (Л) Вестерн-блот образцов, полученных из листьев, экспрессирующих указанные белки. Масштабная линейка – 20 мкм. Вертикальные отрезки на гистограмме – стандартная ошибка среднего, рассчитанная при анализе результатов трех независимых экспериментов. генноинженерные конструкции использовались для кобомбардмента совместно с соответствующими экспрессионными векторами, кодирующими 41 Рис. 24. Разработка метода определения топологии интегральных мембранных белков in vivo. (А) Результат предсказания топологии белка ТБГ2с помощью алгоритмов TMHMM (Krogh et al., 2001). (Б) Схематическое изображение экспрессионных кассет, использованных для кобомбардмента и агроинфильтрации с YN-ER и YC (Рис. 23. А). Микрофотографии, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии эпидермальных клеток N. benthaniana, экспрессирующих белки YN-TBG2 и YC (В), TG<YC>Bp2 и YN-ER (Г), а также TBG2-YN и YC (Д). Микрофотографии, полученные с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии клеток, экспрессирующих белки YN-TBG2 и YC (Е), TG<YC>Bp2 и YN-ER (Ж), а также TBG2-YN и YC (З). (И) Флуориметрический анализ белковых экстрактов из листьев N. benthamiana, коэкспрессирующих указанные белки. (К) Схематическое изображение ориентации белка ТБГ2 в мембране ЭПР in vivo, как следует из проведенных экспериментов. (Л). Схематическое изображение ориентации 6K ВЖС в мембране ЭПР в соответствии с данными литературы (Peremyslov et al., 2004). (М) Схематическое изображение экспрессионных векторов, использованных для агроинфильтрации листьев N. benthaniana совместно с YN-ER или YC (Рис. 23. А). Флуориметрический анализ белковых экстрактов из листьев N. benthamiana, коэкспрессирующих указанные белки. Масштабные линейки (В-Д) – 20 мкм, (Е-З) – 5 мкм. Вертикальные отрезки на гистограмме – стандартная ошибка среднего, рассчитанная при анализе результатов трех независимых экспериментов. комплементирующие фрагменты YFP – YN-ER или YC. Флуоресцентная микроскопия позволила выявить наличие флуоресцирующих клеток после кобомбардмента YN-TGB2 и YC, TG<YC>Bp2 и YN-ER, а также TBG2-YN и YC 42 (Рис. 24. В-Д). Конфокальная микроскопия таких клеток показала, что флуоресценция локализовалась в структурах, морфологически характерных для структур ЭПР (Рис. 24. Е-З). При анализе результатов кобомбардмента YС-TGB2 и YN-ER, TG<YN>Bp2 и YC, а также TGB2-YC и YN-ER с помощью флуоресцентной микроскопии, выявить флуоресцирующие клетки не удавалось (данные не приводятся). Флуориметрический анализ белковых экстрактов из листьев N. benthamiana, коэкспрессирующих все шесть возможных вариантов подтвердил данные экспериментов с кобомбардментом: флуоресцентный сигнал наблюдался только в образцах из листьев, коэкспрессирующих YN-TGB2 и YC, TG<YC>Bp2 и YN-ER, а также TGB2-YN и YC (Рис. 24. И). Таким образом, можно сделать вывод о том, что белок ТБГ2 располагается в мембране ЭПР клеток таким образом, что его N- и C-концевые участки ориентированы в цитоплазму, в то время как внутренняя петля, соединяющая трансмембранные сегменты, транслоцирована в люмен ЭПР (Рис. 24. К). Для проверки применимости разработанного метода была протестирована возможность его применения к белку 6К вируса желтухи свеклы (ВЖС), для которого ранее было показано, что он принадлежит к типу III трансмембранных белков (Peremyslov et al., 2004; Рис. 24. Л). Для коэкспрессии с YN-ER и YC была также сконструирована серия экспрессионных векторов, содержащих гены слитных белков YN-6K, YC-6K, 6K-YN и 6K-YC (Рис. 24. М). Флуориметрический анализ белковых экстрактов из листьев N. benthamiana, коэкспрессирующих четыре возможных варианта выявил, что сигнал детектировался в только образцах из листьев, коэкспрессирующих YC-6K и YN-ER, а также 6K-YN и YC (Рис. 24. Н). Таким образом, можно сделать вывод о том, что 6K ВЖС N-концевым участком ориентирован в полость ЭПР, в то время как C-концевой участок транслоцирован в цитоплазму. Такие данные хорошо согласуются с литературными данными о том, что 6K ВЖС относится к типу III интегральных мембранных белков (Peremyslov et al., 2004). Таким образом, можно обобщить, что успешно разработан и апробирован новый метод на основе БиФК, который применим для определения топологии интегральных мембранных белков in vivo. 43 ВЫВОДЫ 1. Протеолитическая активность метакаспазы растений mcII-Pa необходима для развития программируемой клеточной смерти при морфогенезе и в условиях стресса. 2. На начальных этапах программируемой клеточной смерти mcII-Pa локализуется в цитоплазме, в то время как при развитии программируемой клеточной смерти mcII-Pa транслоцируется в ядро и инициирует его деградацию. 3. Эволюционно-консервативный многофункциональный белок TSN является необходимым фактором выживаемости клеток у растений и у животных. Протеолитическое расщепление TSN негативно влияет на функциональную активность белка. 4. У растений протеолитическое расщепление TSN осуществляет аргинин/лизин-специфичная метакаспаза. У животных протеолитическое расщепление TSN осуществляет аспартат-специфичная каспаза-3. 5. Вирусный белок ТБГ3 обеспечивает внутриклеточный транспорт белков ТБГ1 и ТБГ2 в периферические мембранные структуры, являющиеся производными кортикального эндоплазматического ретикулума. Образование таких структур необходимо для транспорта белка ТБГ1 в плазмодесмы и в соседние клетки. 6. Вирусные интегральные мембранные белки ТБГ3 и цистеин богатый белок вируса курчавости верхушек картофеля индуцируют стресс эндоплазматического ретикулума, приводящий к развитию программируемой клеточной смерти. 7. Вирусы растений используют специальные молекулярные механизмы для снижения уровня экспрессии интегральных мембранных белков, вызывающих развитие программированной клеточной смерти. 8. С помощью специально разработанного нового метода определена топология некоторых вирусных интегральных мембранных белков in vivo. 44 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК и/или индексируемых в базах данных Web of Science и Scopus. 1. Kalinina, N.O., Rakitina, D.A., Yelina, N.E., Zamyatnin, A.A. Jr., Stroganova, T.A., Klinov, D.V., Prokhorov, V.V., Ustinova, S.V., Chernov, B.K., Schiemann, J., Solovyev, A.G., Morozov, S.Yu. RNA-binding properties of the 63 kDa protein encoded by the triple gene block of poa semilatent hordeivirus. // Journal of General Virology. – 2001. – Т. 82. – №. 10. – С. 2569-2578. 2. Zamyatnin, A.A. Jr., Solovyev, A.G., Sablina, A.A., Agranovsky, A.A., Katul, L., Vetten, H.J., Schiemann, J., Hinkkanen, A.E., Lehto, K., Morozov, S.Yu. Dual-colour imaging of membrane protein targeting directed by Poa semilatent virus movement protein TGBp3 in plant and mammalian cells. // Journal of General Virology. – 2002. – Т. 83. – №. 3. – С. 651-662. 3. Gorshkova, E.N., Erokhina, T.N., Stroganova, T.A., Yelina, N.E., Zamyatnin, A.A. Jr., Kalinina, N.O., Schiemann, J., Solovyev, A.G., Morozov, S.Yu. Immunodetection and fluorescent microscopy of transgenically expressed hordeivirus TGBp3 movement protein reveals its association with endoplasmic reticulum elements in close proximity to plasmodesmata. // Journal of General Virology. – 2003. – Т. 84. – №. 4. – С. 985-994. 4. Savenkov, E.I., Germundsson, A., Zamyatnin, A.A. Jr., Sandgren, M., Valkonen, J.P.T. Potato mop-top virus: the coat protein-encoding RNA and the gene for cysteinerich protein are dispensable for systemic virus movement in Nicotiana benthamiana. // Journal of General Virology. – 2003. – Т. 84. – №. 4. – С. 1001-1005. 5. Zamyatnin, A.A. Jr., Solovyev, A.G., Savenkov, E.I., Germundsson, A., Sandgren, M., Valkonen, J.P.T., Morozov, S.Yu. Transient coexpression of individual genes encoded by the triple gene block of Potato mop-top virus reveals requirements for TGBp1 trafficking. // Molecular Plant-Microbe Interactions. – 2004. – Т. 17. – №. 8. – С. 921-930. 6. Schepetilnikov, M.V., Manske, U., Solovyev, A.G., Zamyatnin, A.A. Jr., Schiemann, J., Morozov, S.Yu. The hydrophobic segment of Potato virus X TGBp3 is a major determinant of the protein intracellular trafficking. // Journal of General Virology. – 2005. – Т. 86. – №. 8. – С. 2379-2391. 7. Lukhovitskaya, N.I., Yelina, N.E., Zamyatnin, A.A. Jr., Schepetilnikov, M.V., Solovyev, A.G., Sandgren, M., Morozov, S.Yu., Valkonen, J.P.T., Savenkov, E.I. Expression, localization and effects on virulence of the cysteine-rich 8 kDa protein of Potato mop-top virus. // Journal of General Virology. – 2005. – Т. 86. – №. 10. – С. 2879-2889. 8. Bozhkov, P.V., Suarez, M.F., Filonova, L.H., Daniel, G., Zamyatnin, A.A. Jr., Rodriguez-Nieto, S., Zhivotovsky, B., Smertenko, A. Cysteine protease mcll-Pa executes programmed cell death during plant embryogenesis // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. – 2005. – Т. 102. – №. 40. – С. 14463-14468. 9. Zamyatnin, A.A. Jr., Solovyev, A.G., Bozhkov, P.V., Valkonen, J.P.T., Morozov, S.Yu., Savenkov, E.I. Assessment of the integral membrane protein topology in living cells. // The Plant Journal. – 2006. – Т. 46. – №. 1. – С. 145-154. 10. Антоненко Ю.Н., Аветисян А.В., Бакеева Л.Е., Черняк Б.В., Чертков В.А., Домнина Л.В., Иванова О.Ю., Изюмов Д.С., Хайлова Л.С., Клишин С.С., 45 Коршунова Г.А., Лямзаев К.Г., Мунтян М.С., Непряхина O.K., Пашковская А.А., Плетюшкина О.Ю., Пустовидко А.В., Рогинский В.А., Рокицкая Т.И., Рууге Э.К., Сапрунова В.Б., Северина И.И., Симонян Р.А., Скулачев И.В., Скулачев М. В., Сумбатян Н.В., Свиряева И.В., Ташлицкий В.Н., Васильев Ю.М., Высоких М.Ю., Ягужинский Л.С., Замятнин А.А. (мл.), Скулачев В.П. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения 1. Катионные производные пластохинона: синтез и исследование in vitro. // Биохимия. – 2008. – Т.73. – № 12. – C. 1589-1606. 11. Sundstrom, J.F., Vaculova, A., Smertenko, A.P., Savenkov, E.I., Golovko, A., Minina, E., Tiwari, B.S., Rodriguez-Nieto, S., Zamyatnin, A.A. Jr., Valineva, T., Saarikettu, J., Frilander, M.J., Suarez, M.F., Zavialov, A., Stahl, U., Hussey, P.J., Silvennoinen, O., Sundberg, E., Zhivotovsky, B., Bozhkov, P.V. Tudor staphylococcal nuclease is an evolutionarily conserved component of the programmed cell death degradome. // Nature Cell Biology. – 2009. – Т. 11. – №. 11. – С. 1347-1354. 12. Замятнин А.А. (мл.), Лямзаев К.Г., Зиновкин Р.А. A→I-редактирование РНК: вклад в многообразие транскриптома и развитие организмов. // Биохимия, – 2010. – Т. 75. – № 11. – С. 1489-1498. 13. Skulachev, M.V., Antonenko, Yu.N., Anisimov, V.N., Chernyak, B.V., Cherepanov, D.A., Chistyakov, V.A., Egorov, M.V., Kolosova, N.G., Korshunova, G.A., Lyamzaev, K.G., Plotnikov, E.Yu., Roginsky, V.A., Savchenko, A.Yu., Severina, I.I., Severin, F.F., Shkurat, T.P., Tashlitsky, V.N., Shidlovsky, K.M., Vyssokikh, M.Yu., Zamyatnin, A.A. Jr., Zorov, D.B., Skulachev, V.P. Mitochondrial-targeted plastoquinone derivatives. Effect on senescence and acute age-related pathologies. // Current Drug Targets. – 2011. – Т. 12. – №. 6. – С. 800-826. 14. Богданов А.А., Зиновкин Р.А., Замятнин А.А. (мл.). Редактирование РНК: нарушая догму. // Биохимия, – 2011. – Т. 76. – № 8. – С. 1061-1063. 15. Соловьева А.Д., Фролова О.Ю., Соловьев А.Г., Морозов С.Ю., Замятнин А.А. (мл.). Влияние митохондриально-адресованного антиоксиданта SkQ1 на программируемую клеточную смерть, индуцированную вирусными белками в растениях табака. // Биохимия. – 2013. – Т. 78. – № 9. – С. 1284-1292. Статьи в других международных научных изданиях 16. Solovyev, A.G., Stroganova, T.A., Zamyatnin, A.A. Jr., Schiemann, J., Morozov, S.Yu. Functional interaction of triple gene block movement proteins: cooperative subcellular sorting of poa semilatent virus membrane proteins. // Beiträge zur Züchtungsforschung. – 2000. – Т. 6. – №. 3. – С. 106-110. 17. Zamyatnin, A.A. Jr., Yelina, N.E., Lukhovitskaya, N.I., Solovyev, A.G., Germundsson, A., Sandgren, M., Morozov, S.Yu., Valkonen, J.P.T., Savenkov, E.I. High-Scale Analysis of Pathogenicity Determinants of Potato mop-top virus. // NATO Science Series, I: Life and Behavioural Sciences. – 2006. – Т. 371. – С. 320-324. Избранные тезисы устных и стендовых докладов 18. Erokhina, T.N., Strogonova, T.A., Zamyatnin A.A. Jr., Yelina, N.E., Solovyev, A.G., Schiemann, J., Morozov, S.Yu. Monoclonal antibodies againist Poa smilatent virus movement protein: in vivo detection and subcellular localization of the triple gene blockenoded betaC protein. // Programme and Abstracts of IXth Conference on Virus Diseases of Gramineae in Europe, York, UK. – 21-23 May 2001. 46 19. Замятнин А.А. (мл.), Савенков Е.И. Валконен Я., Соловьев А.Г., Морозов С.Ю. Внутриклеточный транспорт белков тройного блока генов вируса курчавости верхушек картофеля. // Тезисы научных докладов III-го съезда биохимического общества, СПб., – 26 июня – 1 июля 2002 года. – С. 76-77. 20. Соловьев А.Г., Замятнин А.А. (мл.), Морозов С.Ю. Внутриклеточный транспорт мембранных белков, кодируемых вирусами растений. // Тезисы научных докладов III-го съезда биохимического общества, СПб., – 26 июня – 1 июля 2002 года. – С. 113. 21. Zamyatnin, A.A. Jr., Solovyev, A.G., Savenkov, E.I., Morozov, S.Yu., Valkonen, J.P.T. Intracellular trafficking of the proteins encoded by the triple gene block of Potato mop-top virus. // Offered papers of VIIIth International Congress of Plant Pathology, Christchurch, New Zealand. – 2-7 February 2003. 22. Zamyatnin, A.A. Jr., Yelina, N.E., Savenkov, E.I., Solovyev, A.G., Germundsson, A., Sandgren, M., Morozov, S.Yu., Valkonen, J.P.T., Studies on Potato mop-top virus 8-kDa protein. // Volume of Abstracts of 11th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions, St. Petersburg, Russia. – 18-27 July 2003. – P183. 23. Solovyev, A.G., Schepetilnikov, M.V., Zamyatnin, A.A. Jr., Schiemann, J., Morozov, S.Yu. Membrane trafficking of triple gene block-encoded virus movement proteins. // Volume of Abstracts of 11th International Congress on Molecular PlantMicrobe Interactions, St. Petersburg, Russia. – 18-27 July 2003. – P190. 24. Kalashnikova, S.V., Klinov, D.V., Prokhorov, V.V., Demin, V.V., Kalinina, N.O., Rakitina, D.A., Yelina, N.E., Zamyatnin, A.A. Jr., Stroganova, T.A., Chernov, B.K., Schiemann, J., Solovyev, A.G., Morozov, S.Yu. Atomic-Force Microscopy of RNAprotein complexes. // Proceedings of Scanning Probe Microscopy-2003, – Nizhny Novgorod, Russia. – 2-5 March 2003. – P. 268. 25. Zamyatnin, A.A. Jr., Yelina, N.E., Lukhovitskaya, N.I., Solovyev, A.G., Germundsson, A., Sandgren, M., Morozov, S.Yu., Valkonen, J.P.T., Savenkov, E.I. High-Scale Analysis of Pathogenicity Determinants of Potato mop-top virus. // BMC Plant Biology. – 2005. – Т. 5. – №. Suppl 1. – С. S39. 26. Zamyatnin, A.A. Jr., Solovyev, A.G., Bozhkov, P.V., Valkonen, J.P.T., Morozov, S.Yu., Savenkov, E.I. Assessment of the integral membrane protein topology in living plant cells. // Abstract Book of XXII SPPS Congress, Umeå. Sweden. – 16-19 June 2005. 27. Кравченко Д.В., Усков А.И., Замятнин А.А. мл. Оптимизация процесса получения оздоровленных микрорастений картофеля из меристематических эксплантов с использованием препарата SkQ1. // Материалы научно-практической конференции и координационного совещания «Научное обеспечение и инновационное развитие картофелеводства», РАСХН, ВНИИКХ М., – 2008. – Т.1. – C. 330-337. 28. Долгих Ю.И., Степанова А.Ю., Чичкова Н.В., Соловьев А.Г., Замятнин А.А. мл., Вартапетян А.Б., Морозов С.Ю. Инновационное исследование влияния соединения SkQ1 на регенирацию каллусов и программируемое отмирание тканей у картофеля и других сельскохозяйственных растений. // Материалы научнопрактической конференции и координационного совещания «Научное обеспечение и инновационное развитие картофелеводства», РАСХН, ВНИИКХ М., – 2008. – Т. 1. – С. 338-348. 47 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АФК – активные формы кислорода БиФК – бимолекулярная флуоресцентная комплементация БО – белок оболочки ВЗПГ – вирус зеленой пятнистости гибискуса ВМБ – вирус мозаики бамбука ВТМ – вирус табачной мозаики ВЖС – вирус желтухи свеклы ВШМЯ – вирус штриховатой мозаики ячменя киРНК – короткие интерферирующие РНК ОНБ – ответ на несвернутый белок оцРНК – одноцепочечная РНК ПААГ – полиакриламидный гель ПД – плазмодесма ПКС – программируемая клеточная смерть ПЛВМ – полулатентный вирус мятлика сгРНК – субгеномная РНК ТБГ – тройной блок генов ЭПР - эндоплазматический ретикулум XВК – X вирус картофеля dsRed – красный флуоресцентный белок dTp – 3’-дезокситимидин фосфат GFP – зеленый флуоресцентный белок pdTp – 3’, 5’-дезокситимидин бисфосфат SN – стафилококковая нуклеаза YFP – желтый флуоресцентный белок 48
