005581 Предпосылки изобретения Пролиферация и дифференциация клеток многоклеточных организмов регулируются гормонами и
advertisement
005581 Предпосылки изобретения Пролиферация и дифференциация клеток многоклеточных организмов регулируются гормонами и полипептидными факторами роста. Эти диффундируемые молекулы позволяют клеткам общаться друг с другом и действовать совместно для образования клеток и органов и для репарации и регенерации поврежденной ткани. Примеры гормонов и факторов роста включают в себя стероидные гормоны (например, эстроген, тестостерон), паратиреоидный гормон, фолликулостимулирующий гормон, интерлейкины, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), эпидермальный фактор роста (EGF), гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), эритропоэтин (ЕРО) и кальцитонин. Гормоны и факторы роста влияют на клеточный метаболизм посредством связывания с белками. Белки могут быть интегральными белками мембран, которые связаны с путями передачи сигналов в клетке, такими как системы вторичных мессенджеров. Другие классы белков представляют собой растворимые молекулы. Особый интерес представляют собой цитокины, молекулы, которые усиливают пролиферацию и/или дифференциацию клеток. Примеры цитокинов включают в себя эритропоэтин (ЕРО), который стимулирует развитие эритроцитов; тромбопоэтин (ТРО), который стимулирует развитие клеток мегакариоцитарной линии дифференцировки; и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), который стимулирует развитие нейтрофилов. Эти цитокины применимы в восстановлении нормальных уровней клеток крови в пациентах, страдающих от анемии или получающих химиотерапию по поводу рака. Демонстрируемые in vivo активности этих цитокинов иллюстрируют огромный клинический потенциал других цитокинов, агонистов цитокинов и антагонистов цитокинов и потребность в них. Сущность изобретения Данное изобретение обращается к этой потребности путем обеспечения нового полипептида и относящихся к нему композиций и способов. В одном аспекте данное изобретение обеспечивает выделенный полинуклеотид, кодирующий содержащий четыре альфа-спирали цитокин млекопитающего, названный Zcyto10. Полипептид-предшественник цитокина Zcyto10 человека состоит из последовательности 176 аминокислот с начальным Met, показанной в SEQ ID NO:2 (нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO:1). Считается, что аминокислотные остатки 1-24 являются сигнальной последовательностью, а зрелый полипептид Zcyto10 представлен аминокислотной последовательностью, простирающейся от остатка 25, лейцина, по аминокислотный остаток 176, остаток глутаминовой кислоты, также определенной SEQ ID NO:12. Другой вариант данного изобретения (полипептидапредшественника цитокина Zcyto10 человека) определяется аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:4 (нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO:3). Полипептид SEQ ID NO:4 состоит из 151 аминокислотного остатка, где аминокислоты 1-24 включают в себя сигнальную последовательность, а последовательность зрелого полипептида цитокина Zcyto10 человека простирается от аминокислотного остатка 25, лейцина, по аминокислоту 151, глутаминовую кислоту, и также определяется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:13. Другой активный вариант простирается от аминокислотного остатка 33, цистеина, по аминокислотный остаток 176 последовательности SEQ ID NO:2. Этот вариант зрелого полипептида цитокина Zcyto10 человека имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:26. Полипептид-предшественник цитокина Zcyto10 мыши состоит из 176 аминокислотных остатков и определяется аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:19 (нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO:18). Мышиный Zcyto10 имеет сигнальную последовательность, простирающуюся от аминокислотного остатка 1, метионина, по аминокислотный остаток 24, глицин, последовательности SEQ ID NO:19. Таким образом зрелый пилипептид цитокина Zcyto10 мыши простирается от аминокислотного остатка 25, лейцина, по аминокислотный остаток 176, лейцин последовательности SEQ ID NO:19, также определяемый последовательностью SEQ ID NO:20. Считается, что другой активный вариант простирается от аминокислотного остатка 33, цистеина, по аминокислотный остаток 176 последовательности SEQ ID NO:19. Этот вариант зрелого полипептида цитокина Zcyto10 мыши определяется также последовательностью SEQ ID NO:25. В дополнительном варианте этот полипептид содержит дополнительно аффинную метку. Вариант полипептида-предшественника цитокина Zcyto10 мыши имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:34 (нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO:33). Этот вариант имеет длину 154 аминокислотных остатка и имеет сигнальную последовательность, простирающуюся от аминокислотного остатка 1, метионина, по аминокислотный остаток 24, глицин, последовательности SEQ ID NO:34. Таким образом, зрелая последовательность простирается от аминокислотного остатка 25, лейцина, по аминокислотный остаток 154, лейцин, последовательности SEQ ID NO:34. Зрелая последовательность определяется также последовательностью SEQ ID NO:35. Во втором аспекте данного изобретения обеспечен экспрессирующий вектор, содержащий (а) промотор транскрипции; (b) сегмент ДНК, кодирующий полипептид Zcyto10, и (с) терминатор транскрипции, причем эти промотор, сегмент ДНК и терминатор являются оперативно (функционально) связанными. -1- 005581 В третьем аспекте данного изобретения обеспечена культивируемая эукариотическая или прокариотическая клетка, в которую был введен экспрессирующий вектор, описанный выше, причем вышеупомянутая клетка экспрессирует полипептид белка, кодируемый этим сегментом ДНК. В следующем аспекте этого изобретения обеспечен химерный полипептид, состоящий по существу из первой части и второй части, соединенных пептидной связью. Первая часть этого химерного полипептида состоит по существу из (а) полипептида Zcyto10, показанного в SEQ ID NO:2, (b) аллельных вариантов SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:34 или SEQ ID NO:35; и (с) полипептидов белка, которые, по меньшей мере, на 90% идентичны (а) или (b). Вторая часть этого химерного полипептида состоит по существу из другого полипептида, такого как аффинная метка. В одном варианте эта аффинная метка представляет собой Fc-полипептид иммуноглобулина. Это изобретение обеспечивает также экспрессирующие векторы, кодирующие эти химерные полипептиды, и клетки-хозяева, трансфицированные для получения этих химерных полипептидов. В дополнительном аспекте данного изобретения обеспечено антитело, которое специфически связывается с полипептидом Zcyto10, описанным выше, и также антиидиотипическое антитело, которое нейтрализует антитело к полипептиду Zcyto10. В другом аспекте данного изобретения обеспечена фармацевтическая композиция, содержащая очищенный полипептид Zcyto10 в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Такие композиции могут быть применимы для модуляции пролиферации клеток, дифференцировки клеток или продуцирования цитокинов в предупреждении или лечении состояний, характеризующихся неправильными пролиферацией клеток, дифференцировкой клеток или продуцированием цитокинов, как обсуждается далее в данном описании. Более конкретно, полипептид Zcyto10 может быть использован в предупреждении или лечении аутоиммунных заболеваний посредством ингибирования клеточного иммунного ответа. Аутоиммунные заболевания, которые могут быть поддающимися лечению Zcyto10, включают в себя IDDM (инсулиннезависимый сахарный диабет), множественный склероз, ревматоидный артрит и т.п. Полипептиды Zcyto10 данного изобретения могут быть применимы также в ингибировании роста или пролиферации раковых клеток. Полипептиды Zcyto10 данного изобретения могут также стимулировать иммунную систему для лучшей борьбы с микробными или вирусными инфекциями. В частности, Zcyto10 может вводиться системно для увеличения продуцирования тромбоцитов индивидуумом. Кроме того, полипептиды Zcyto10 данного изобретения могут быть использованы в специфических для трахеи или в специфических трахеобронхиальных приложениях, таких как поддержание или заживление ран трахеобронхиального эпителия или лежащих ниже клеток, регуляция продуцирования слизи или клиренса мерцательным (реснитчатым) эпителием инородных веществ или остатков органических веществ из раны, или лечение астмы, бронхита или других заболеваний трахеальнобронхиального пути. Они могут также ускорять заживление ран и стимулировать регенерацию поврежденных тканей, что может быть, в частности, применимо в лечении периодонтального заболевания. Кроме того, полипептиды Zcyto10 могут быть использованы для лечения кожных болезней, таких как псориаз, экзема и, в общем, сухая кожа. Дополнительный вариант данного изобретения относится к пептиду или полипептиду, который имеет аминокислотную последовательность, описанную выше. Пептиды или полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность несущей эпитоп части полипептида Zcyto10 данного изобретения, включают в себя части таких полипептидов с, по меньшей мере, девятью, предпочтительно, по меньшей мере, 15 и более предпочтительно, по меньшей мере, 30-50 аминокислотами, хотя в данное изобретение включены также несущие эпитоп полипептиды любой длины вплоть до полной аминокислотной последовательности полипептида данного изобретения, описанной выше. Также заявлены любые из этих полипептидов, которые слиты с другим полипептидом или молекулой-носителем. Такие эпитопсодержащие варианты включают в себя, но не ограничиваются ими, последовательности SEQ ID NO:25-32. Антитела, продуцируемые с использованием этих несущих эпитоп частей Zcyto10, могут быть использованы в очистке Zcyto10 из среды для культуры клеток. Эти и другие аспекты данного изобретения станут очевидными из нижеследующего описания и прилагаемого рисунка. Подробное описание изобретения Содержание всех цитируемых здесь ссылок включено в качестве ссылок во всей полноте. Перед подробным изложением данного изобретения для понимания изобретения может быть полезным определение следующих ниже терминов. Термин "аффинная метка" применяется здесь для обозначения полипептидного сегмента, который может быть присоединен ко второму полипептиду для обеспечения очистки или обнаружения этого второго полипептида или обеспечения сайтов для присоединения этого второго полипептида к субстрату. В принципе, любой пептид или белок, для которого доступны антитело или другой агент специфического связывания, может быть использован в качестве аффинной метки. Аффинные метки включают в себя полигистидиновый участок, протеин A, Nilsson et al., EMBO J. 4:1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3 (1991), глутатион-S-трансферазу, Smith and Johnson, Gene 67:311 (1988), аффинную метку -2- 005581 Glu-Glu, Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4 (1985), вещество Р, FLAG™-пептид, Норр et al., Biotechnology 6:1204-10 (1988), стрептавидинсвязывающий пептид или другой антигенный эпитоп или связывающий домен. См., в общем. Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95-107 (1991). ДНК, кодирующие аффинные метки, доступны из коммерческих источников (например, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Термин "аллельный вариант" используется здесь для обозначения любой из двух или более альтернативных форм гена, занимающих один и тот же хромосомный локус. Аллельная вариация возникает природно посредством мутации и может приводить к фенотипическому полиморфизму внутри популяций. Мутации генов могут быть молчащими (без изменения в кодируемом полипептиде) или могут кодировать полипептиды, имеющие измененную аминокислотную последовательность. Термин аллельный вариант используется здесь также для обозначения белка, кодируемого аллельным вариантом гена. Термины "аминоконцевой" и "карбоксиконцевой" используются здесь для обозначения положений в полипептидах. Там, где это позволяет контекст, эти термины используются со ссылкой на конкретную последовательность или часть полипептида для обозначения близости или относительного положения. Например, определенная последовательность, расположенная карбокситерминально относительно цитируемой последовательности в полипептиде, расположена проксимально относительно карбоксиконца цитируемой последовательности, но необязательно при карбоксиконце полного полипептида. Термин "пара комплемент/антикомплемент" обозначает неидентичные части молекулы, которые образуют нековалентно связанную стабильную пару при подходящих условиях. Например, биотин и авидин (или стрептавидин) являются прототипами членов пары комплемент/антикомплемент. Другие примеры пар комплемент/антикомплемент включают в себя пары рецептор/лиганд, пары антитело/антиген (или гаптен или эпитоп), пары смысловой/антисмысловой полинуклеотид и т.п. Если желательна последующая диссоциация пары комплемент/антикомплемент, эта пара комплемент/антикомплемент предпочтительно имеет аффинность связывания <109 М-1. Термин "комплементы полинуклеотидной молекулы" обозначает полинуклеотидную молекулу, имеющую последовательность комплементарных оснований и обратную ориентацию в сравнении со ссылочной последовательностью. Например, последовательность 5' ATGCACGGG 3' является комплементарной последовательности 5' CCCGTGCAT 3'. Термин "контиг" обозначает полинуклеотид, который имеет прилегающий отрезок последовательности, идентичной или комплементарной другому полинуклеотиду. Говорят, что прилегающие последовательности "перекрывают" конкретный отрезок полинуклеотидной последовательности либо целиком, либо вдоль частичного отрезка данного полинуклеотида. Например, характерными контигами к полинуклеотидой последовательности 5'-ATGGCTTAGCTT-3' являются 5'-TAGCTTgagtct-3' и 3'gtcgacTACCGA-5'. Термин "вырожденная нуклеотидная последовательность" обозначает последовательность нуклеотидов, которая включает в себя один или несколько вырожденных кодонов (в сравнении со ссылочной молекулой полинуклеотида, которая кодирует полипептид). Вырожденные кодоны содержат отличающиеся триплеты нуклеотидов, но кодируют тот же самый аминокислотный остаток (т.е. каждый из триплетов GAU и GAC кодирует Asp). Термин "экспрессирующий вектор" обозначает молекулу ДНК, линейную или кольцевую, которая содержит сегмент, кодирующий представляющий интерес полипептид, оперативно (функционально) связанную с дополнительными сегментами, которые обеспечивают его транскрипцию. Такие дополнительные сегменты включают в себя последовательности промотора и терминатора и могут также включать в себя одну или несколько точек инициации репликации ("ориджин репликации"), один или несколько селектируемых маркеров, энхансер, сигнал полиаденилирования и т.п. Экспрессирующие векторы обычно получают из плазмидной или вирусной ДНК или могут содержать элементы обеих. Термин "изолированный" ("выделенный") в применении к полинуклеотиду означает, что этот полинуклеотид был удален из его природной генетической среды и, следовательно, не содержит других посторонних или нежелательных кодирующих последовательностей и находится в форме, пригодной для применения в системах получения генетически сконструированных белков. Такие изолированные молекулы являются молекулами, которые выделены из их природного окружения, и включают в себя клоны кДНК и геномные клоны. Выделенные молекулы ДНК данного изобретения не содержат других генов, с которыми они обычно связаны, но могут включать в себя природно встречающиеся 5'- и 3'нетранслируемые районы, такие как промоторы и терминаторы. Идентификация ассоциированных районов будет очевидной для специалиста с обычной квалификацией в данной области. См., например, Dynan and Tijan, Nature 316:774-78 (1985). "Выделенный" полипептид или белок является полипептидом или белком, который обнаруживается в условиях, иных, чем его нативное окружение, например, отдельно от крови и ткани животного. В предпочтительной форме, выделенный полипептид является по существу не содержащим других полипептидов, в частности, других полипептидов животного происхождения. Предпочтительно получать эти полипептиды в высокоочищенной форме, т.е. с чистотой более 95%, более предпочтительно с чистотой более 99%. При использовании в этом контексте термин "выделенный" не исключает присутствия того же са-3- 005581 мого полипептида в альтернативных физических формах, таких как димеры, или альтернативно гликозилированных или дериватизованных формах. Термин "оперативно (функционально) связанный", в применении к сегментам ДНК, свидетельствует о том, что эти сегменты размещены таким образом, что они функционируют совместно для их предполагаемых целей, например, транскрипция инициируется в промоторе и протекает через кодирующий сегмент до терминатора. Термин "ортолог" обозначает полипептид или белок, полученный из одного вида, который является функциональной копией полипептида или белка из другого вида. Различия последовательности среди ортологов являются результатами видообразования. "Паралоги" являются отличающимися, но структурно родственными белками, производимыми организмом. Считается, что паралоги возникают посредством дупликации генов. Например, α-глобин, β-глобин и миоглобин являются паралогами друг друга. Термин "полинуклеотид" обозначает одно- или двухцепочечный полимер дезоксирибонуклеотидных или рибонуклеотидных оснований, считываемых от 5'-конца к 3'-концу. Полинуклеотиды включают в себя РНК и ДНК и могут быть изолированы из природных источников, синтезированы in vitro или получены из комбинации природных и синтетических молекул. Размеры полинуклеотидов выражаются в виде пар нуклеотидов (сокращаемых как "п.н."), нуклеотидов ("нт") или тысяч пар нуклеотидов ("т.п.н."). Если позволяет контекст, последние два термина могут описывать полинуклеотиды, которые являются одноцепочечными или двухцепочечными. При использовании этого термина для двухцепочечных молекул он используется для обозначения полной длины и, как будет понятно, является эквивалентом термина "пары нуклеотидов". Специалистам в данной области будет понятно, что две цепи двухцепочечного полинуклеотида могут слегка отличаться по длине и что их концы могут быть выступающими в результате ферментативного расщепления; следовательно не все нуклеотиды в двухцепочечной молекуле полинуклеотида могут быть спаренными. Такие неспаренные концы не будут обычно превышать длины 20 нт. "Полипептид" является полимером аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями, образованным природным путем или синтетически. Полипептиды, содержащие менее приблизительно 10 аминокислотных остатков, обычно называют "пептидами". Термин "промотор" применяется здесь в его признанном в данной области значении для обозначения части гена, содержащей последовательности ДНК, которые обеспечивают связывание РНКполимеразы и инициацию транскрипции. Промоторные последовательности обнаруживаются обычно, но не всегда, в 5'-некодирующих районах генов. "Белок" является макромолекулой, содержащей одну или несколько полипептидных цепей. Белок может содержать также непептидные компоненты, такие как углеводные группы. Углеводы и другие непептидные заместители могут быть присоединены к белку клеткой, в которой продуцируется этот белок, и будут меняться в зависимости от типа клетки. Белки определяются здесь на основе их аминокислотных каркасных структур; заместители, такие как углеводные группы, обычно не указываются, но они тем не менее могут присутствовать. Термин "рецептор" обозначает связанный с клеткой белок, который связывается с биоактивной молекулой (т.е. лигандом) и медиирует действие этого лиганда на клетку. Мембраносвязанные рецепторы характеризуются мультидоменной структурой, содержащей внеклеточный лигандсвязывающий домен и внутриклеточный эффекторный домен, который обычно участвует в трансдукции (передаче) сигнала. Связывание лиганда с рецептором приводит к конформационному изменению в рецепторе, которое вызывает взаимодействие между эффекторным доменом и другой молекулой (молекулами) в клетке. Это взаимодействие, в свою очередь, приводит к изменению в метаболизме клетки. Метаболические события, связанные с взаимодействиями лиганд-рецептор, включают в себя транскрипцию генов, фосфорилирование, дефосфорилирование, увеличения продуцирования циклического АМФ, мобилизацию клеточного кальция, мобилизацию мембранных липидов, клеточную адгезию, гидролиз инозитлипидов и гидролиз фосфолипидов. В общем, рецепторы могут быть мембраносвязанными, цитозольными или ядерными; мономерными (например, рецептор тиреоид стимулирующего гормона, бета-адренергический рецептор) или мультимерными (например, PDGF-рецептор, рецептор гормона роста, IL-3-рецептор, GMCSF-рецептор, G-CSF-рецептор, рецептор эритропоэтина и IL-6-рецептор). Термин "секреторная сигнальная последовательность" обозначает последовательность ДНК, которая кодирует полипептид ("секреторный полипептид"), который, как компонент большего полипептида, направляет этот больший полипептид через секреторный путь клетки, в которой он синтезируется. Этот больший полипептид обычно расщепляется с удалением секреторного пептида во время прохождения через этот секреторный путь. Термин "сплайсинговый вариант" используется здесь для обозначения альтернативных форм РНК, транскрибируемых из гена. Сплайсинговая вариация возникает в природе посредством использования альтернативных сайтов сплайсинга в транскрибируемой молекуле РНК или, менее часто, между отдельно транскрибируемыми молекулами РНК, и может приводить к нескольким мРНК, транскрибируемым из одного и того же гена. Сплайсинговые варианты могут кодировать полипептиды, имеющие измененную -4- 005581 последовательность аминокислот. Термин "сплайсинговый вариант" используется здесь также для обозначения белка, кодируемого сплайсинговым вариантом мРНК, транскрибируемым из гена. Молекулярные массы и длины полимеров, определенные непрецизионными аналитическими способами (например, гель-электрофорезом), должны пониматься как приблизительные величины. Когда такая величина выражается как "около" Х или "приблизительно" X, указанная величина Х должна пониматься как величина, определенная с точностью ±10%. Консервативные аминокислоты в спирали D Zcyto10 могут быть использованы в качестве инструмента для идентификации новых членов семейства. Спираль D является наиболее высококонсервативной, имеющей приблизительно 32%-ную идентичность со спиралью D IL-10. Например, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) может быть использована для амплификации последовательностей, кодирующих этот консервативный [домен, район или мотив из вышеуказанных] из РНК, полученных из множества источников ткани или клеточных линий. В частности, высоковырожденные праймеры, сконструированные из последовательностей Zcyto10, применимы для этой цели. В предпочтительных вариантах данного изобретения выделенные полинуклеотиды будут гибридизоваться с районами такого же размера SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:33 или комплементарной им последовательности в строгих условиях. В общих чертах, строгие условия выбирают таким образом, чтобы они были на около 5°С ниже термической точки плавления (Тm) для данной конкретной последовательности при определенных ионной силе и рН. Тm является температурой (при определенных ионной силе и рН), при которой 50% целевой последовательности гибридизуется с точно комплементарным зондом. Типичными строгими условиями являются условия, в которых концентрация соли равна около 0,02 М или менее при рН 7, а температура равна, по меньшей мере, около 60°С. Как отмечалось ранее, выделенные полинуклеотиды данного изобретения включают в себя ДНК и РНК. Способы выделения ДНК и РНК хорошо известны в данной области. Общая РНК может быть получена с использованием экстракции гуанидином-НСl с последующим выделением центрифугированием в градиенте CsCl [Chirgwin et al., Biochemistry 18:52-94 (1979)]. Поли(А)+ РНК получают из общей РНК с использованием способа Aviv and Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-1412 (1972). Комплементарную ДНК (кДНК) получают из поли(А)+ РНК при помощи известных способов. Затем полинуклеотиды, кодирующие полипептиды Zcyto10, идентифицируют и выделяют, например, с использованием гибридизации или ПЦР. Кроме того, полинуклеотиды данного изобретения могут быть синтезированы с использованием ДНК-синтезатора. В настоящее время предпочтительным способом является фосфорамидитный способ. Если химически синтезированная двухцепочечная ДНК необходима для такого применения, как синтез гена или фрагмента гена, то каждую комплементарную цепь получают отдельно. Получение коротких генов (60-80 п.н.) является технически простым и может быть выполнено синтезом комплементарных цепей и затем их отжигом. Однако, для получения более длинных генов (>300 п.н.) должны быть разработаны особые стратегии, поскольку эффективность связывания каждого цикла во время химического синтеза ДНК редко равна 100%. Для преодоления этой проблемы синтетические гены (двухцепочечные) собирают в модульной форме из одноцепочечных фрагментов, имеющих длину от 20 до 100 нуклеотидов. См., Glick, Bernard R. and Jack J. Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA, (ASM Press, Washington, D.C. 1994), Itakura, K. et al., Synthesis and use of synthetic oligonucleotides. Annu. Rev. Biochem. 53:323-356 (1984) и Climie, S. et al. Chemical synthesis of the thymidylate synthase gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:633-637 (1990). Специалистам в данной области будет понятно, что последовательности, описанные в SEQ ID NO: l, 2, 3 и 4, обозначают два аллеля человека, a SEQ ID NO:18, 19, 33 и 34 обозначают два аллеля мыши. Дополнительные аллельные варианты этих последовательностей могут быть клонированы зондированием библиотек кДНК или геномных библиотек из различных индивидуумов в соответствии со стандартными процедурами. Аллельные варианты последовательности ДНК, показанной в SEQ ID NO: 1, в том числе аллельные варианты, содержащие молчащие мутации, и аллельные варианты, в которых мутации приводят к изменениям в аминокислотной последовательности, находятся в объеме данного изобретения, как и белки, которые являются аллельными вариантами SEQ ID NO:2. кДНК, генерируемые из претерпевших альтернативный сплайсинг мРНК, которые сохраняют свойства полипептида Zcyto10, включены в объем данного изобретения, так же как и полипептиды, кодируемые такими кДНК и мРНК. Аллельные варианты и сплайсинговые варианты этих последовательностей могут быть клонированы зондированием библиотек кДНК или геномных библиотек из различных индивидуумов или тканей в соответствии со стандартными процедурами, известными в данной области. Далее данное изобретение обеспечивает копии белков и полинуклеотидов из других видов ("видовые ортологи"). Особый интерес представляют полипептиды Zcyto10 из других видов млекопитающих, в том числе мышиных, свиных, овечьих, бычьих псовых, кошачьих, лошадиных и приматов. Видовые ортологи белка Zcyto10 человека могут быть клонированы с использованием информации и композиций, обеспеченных данным изобретением, в сочетании с общепринятыми способами клонирования. Например, кДНК может быть клонирована с использованием мРНК, полученной из типа ткани или клеток, который экспрессирует этот белок. Подходящие источники мРНК могут быть идентифицированы зондиро-5- 005581 ванием Нозерн-блотов зондами, сконструированными из описанных здесь последовательностей. Затем может быть приготовлена библиотека из мРНК позитивной ткани или линии клеток. Затем кодирующая белок кДНК может быть выделена различными способами, такими как зондирование полной или частичной кДНК человека или мыши или одним или несколькими наборами вырожденных зондов, сконструированных на основе описанных последовательностей. Эта кДНК может быть также клонирована с использованием полимеразной цепной реакции, или ПЦР (Mullis, U.S. Patent No. 4 683 202), с применением праймеров, сконструированных из описанных здесь последовательностей. В дополнительном способе, эта библиотека кДНК может быть использована для трансформации или трансфекции клеток-хозяев, и экспрессия представляющей интерес кДНК может быть детектирована антителами к этому белку. Подобные способы могут быть применены также для выделения геномных клонов. В применении здесь и в формуле изобретения, формулировка "выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид, причем этот полинуклеотид определяется последовательностями SEQ ID NO:2, 4, 12, 13, 19, 20, 25, 26, 34 и 35", включает в себя все аллельные варианты и видовые ортологи этих полипептидов. Данное изобретение обеспечивает также выделенные полипептиды белка, которые по существу являются гомологичными полипептидам белка SEQ ID NO:2 и его видовым ортологам. Под термином "выделенные" имеют в виду белок или полипептид, который обнаруживается в условиях, иных, чем его нативное окружение, например, отдельно от крови и ткани животного. В предпочтительной форме выделенный белок является по существу не содержащим других полипептидов, в частности, других полипептидов животного происхождения. Предпочтительно, получать эти полипептиды в высокоочищенной форме, т.е. с чистотой более 95%, более предпочтительно с чистотой более 99%. Термин "по существу идентичный" используется здесь для обозначения полипептидов, имеющих 50%-ную, предпочтительно 60%-ную, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%-ную, идентичность с последовательностью, показанной в последовательностях SEQ ID NO:2, 4, 12, 13, 19, 20, 25, 26, 34 и 35, или их видовых ортологов. Такие полипептиды будут более предпочтительно, по меньшей мере, на 90% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 95% или более идентичны SEQ ID NO: 2 или ее видовым ортологам. Процентную идентичность последовательности определяют общепринятыми способами. См., например, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603-616 (1986) и Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919 (1992). Вкратце, две аминокислотные последовательности сопоставляют выстраиванием для оптимизации оценок сопоставления с использованием penalty 10 открывания гэпа и penalty 1 удлинения гэпа и счетной матрицы "blossom 62" Henikoff and Henikoff (ibid.), показанной в табл. 1 (аминокислоты представлены с использованием стандартных однобуквенных кодов). Затем процентную идентичность рассчитывают по формуле: Таблица 1 -6- 005581 Идентичность последовательности полинуклеотидных молекул определяют подобными способами с использованием отношения, описанного выше. Вариантные полипептиды Zcyto10 или, по существу, идентичные белки и полипептиды характеризуются тем, что они имеют одну или несколько аминокислотных замен, делеций или присоединений. Эти изменения предпочтительно являются изменениями минорного характера, то есть, являются заменами консервативных аминокислот (см. табл. 2) и другими заменами, которые не влияют значимо на укладку или активность белка или полипептида; небольшими делециями, обычно от одной до около 30 аминокислот; и небольшими амино- или карбоксилконцевыми удлинениями, такими как аминоконцевой остаток метионина, небольшой линкерный пептид до около 20-25 остатков, или небольшое удлинение, которое облегчает очистку (аффинная метка), такое как полигистидиновый участок, протеин A [Nilsson еt а1., EMBO J. 4:1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3 (1991)], глутатион-S-трансфераза [Smith and Johnson, Gene 67:31 (1988)], или другой антигенный эпитоп или связывающий домен. См., в общем. Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95-107 (1991). ДНК, кодирующие аффинные метки, доступны из коммерческих фирм-поставщиков (например, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Таблица 2. Замены консервативных аминокислот. Основные: аргинин лизин гистидин Кислые: глутаминовая кислота аспарагиновая кислота Полярные: глутамин аспарагин Гидрофобные: лейцин изолейцин валин Ароматические: фенилаланин триптофан тирозин Небольшие: глицин аланин серин треонин метионин Далее данное изобретение обеспечивает множество слитых (гибридных) полипептидов с другим полипептидом [и родственные мультимерные белки, содержащие один или несколько слитых (гибридных белков)]. Например, полипептид Zcyto10 может быть получен в виде гибридного белка с димеризующим белком, как описано в патентах США №№ 5 155 027 и 5 567 584. Предпочтительные димеризующие белки в этой связи включают в себя домены константной области иммуноглобулина. Гибридные белки иммуноглобулин-полипептид Zcyto10 могут экспрессироваться в генетически сконструированных клетках [для получения множества мультимерных аналогов Zcyto10]. Вспомогательные домены могут быть гибридизованы с полипептидами Zcyto10 для нацеливания их на специфические клетки, ткани или макромолекулы (например, коллаген). Например, полипептид или белок Zcyto10 может быть нацелен на заранее определенный тип клеток слиянием полипептида с лигандом, который специфически связывается с рецептором на поверхности клетки-мишени. Таким образом полипептиды и белки могут быть нацелены для терапевтических и диагностических целей. Полипептид Zcyto10 может быть слит с двумя или несколькими частями молекул, такими как аффинная метка для очистки и нацеливающий домен. Гибридные полипептиды могут также содержать один или несколько сайтов расщепления, в частности, между доменами. См., Tuan et al., Connective Tissue Research 34:1-9 (1996). Белки данного изобретения могут также содержать не встречающиеся в природе аминокислотные остатки. Не встречающиеся в природе аминокислоты включают в себя, без ограничений, транс-3метилпролин, 2,4-метанопролин, цис-4-гидроксипролин, транс-4-гидроксипролин, N-метилглицин, аллотреонин, метилтреонин, гидроксиэтилцистеин, гидроксиэтилгомоцистеин, нитроглутамин, гомоглутамин, пипеколиновую кислоту, тиазолидинкарбоновую кислоту, дегидропролин, 3- и 4-метилпролин, 3,3диметилпролин, трет-лейцин, норвалин, 2-азафенилаланин, 3-азафенилаланин, 4-азафенилаланин и 4фторфенилаланин. В данной области известны несколько способов для включения не встречающихся в природе аминокислотных остатков в белки. Например, может быть использована система in vitro, в которой нонсенсмутации подавляются при помощи химически аминоацилированных супрессорных тРНК. Способы синтеза аминокислот и аминоацилирования тРНК известны в данной области. Незаменимые аминокислоты в полипептидах данного изобретения могут быть идентифицированы в соответствии с процедурами, известными в данной области, такими как сайтнаправленный мутагенез или аланинсканирующий мутагенез [Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989); Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4498-4502 (1991)]. В последнем способе единственные мутации аланина вводят при каждом ос-7- 005581 татке в молекуле и полученные в результате мутантные молекулы тестируют на биологическую активность (например, на связывание лиганда и трансдукцию сигнала) для идентификации аминокислотных остатков, которые являются критическими для активности этой молекулы. Сайты взаимодействия лиганд-белок могут быть также определены анализом кристаллической структуры, определяемой такими способами, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография или фотоаффинное мечение. См., например, de Vos et al., Science 255:306-312 (1992); Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64 (1992). Идентичности незаменимых аминокислот могут быть также выведены из анализа гомологий с родственными белками. Многочисленные аминокислотные замены могут быть произведены и тестированы с использованием известных способов мутагенеза и скрининга, таких как описанные Reidhaar-Olson and Sauer, Science 241:53-57 (1988) или Bowie and Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156 (1989). Вкратце, эти авторы описывают способы одновременной рандомизации двух или более положений в полипептиде, отбор на функциональный полипептид и затем секвенирование мутагенизированных полипептидов для определения спектра допустимых замен в каждом положении. Другие способы, которые могут быть использованы, включают в себя способ фаговой индикации, например, Lowman et al., Biochem. 30:10832-10837 (1991); Ladner et al., U.S. Patent-No. 5 223 409; Huse, WIPO Publication WO 92/06204 и районнаправленный мутагенез, Derbyshire et al., Gene 46:145 (1986); Ner et al., DNA 7:127 (1988). Способы мутагенеза, описанные выше, могут комбинироваться с высокопроизводительными способами скрининга для обнаружения активности клонированных мутагенизированных белков в клеткаххозяевах. Предпочтительные тесты в этом отношении включают в себя тесты пролиферации клеток и основанные на биосенсоре тесты связывания лиганда, которые описаны ниже. Мутагенизированные молекулы ДНК, кодирующие активные белки или их части (например, лигандсвязывающие фрагменты), могут быть извлечены из клеток-хозяев и быстро секвенированы с использованием современного оборудования. Эти способы делают возможным быстрое определение важности индивидуальных аминокислотных остатков в представляющем интерес полипептиде и могут применяться к полипептидам неизвестной структуры. При помощи обсуждаемых выше способов специалист с обычной квалификацией в данной области может получить многочисленные полипептиды, которые являются, по существу, идентичными последовательностям SEQ ID NO:2, 4, 12, 13, 19, 20, 25, 26, 34 и 36 или их аллельным вариантам, и сохраняют свойства белка дикого типа. Как выражено и заявлено здесь, формулировка, "полипептид, определяемый последовательностью SEQ ID NO:2", включает в себя все аллельные варианты и видовые ортологи этого полипептида. Полипептиды белка данного изобретения, в том числе полноразмерные белки, фрагменты белка (например, лигандсвязывающие фрагменты) и слитые (гибридные) полипептиды, могут продуцироваться в генетически сконструированных клетках-хозяевах в соответствии с общепринятыми способами. Подходящими клетками-хозяевами являются те типы клеток, которые могут быть трансформированы или трансфицированы экзогенной ДНК и выращены в культуре, и они включают в себя бактерии, грибковые клетки и культивируемые высшие эукариотические клетки. Эукариотические клетки, в частности культивируемые клетки многоклеточных организмов, являются предпочтительными. Способы манипулирования клонированными молекулами ДНК и введения экзогенной ДНК в различные клетки-хозяева описаны в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2nd ed.) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) и Ausubel et al., ibid. Полинуклеотиды, обычно последовательность кДНК, данного изобретения кодируют вышеописанные полипептиды. Последовательность кДНК, которая кодирует полипептид данного изобретения, состоит из ряда кодонов, причем каждый аминокислотный остаток этого полипептида кодируется кодоном и каждый кодон состоит их трех нуклеотидов. Аминокислотные остатки кодируются их соответствующими кодонами следующим образом. Аланин (Аlа) кодируется GCA, GCC, GCG или GCT; Цистеин (Суs) кодируется TGC или TGT; Аспарагиновая кислота (Asp) кодируется GAC или GAT; Глутаминовая кислота (Glu) кодируется GAA или GAG; Фенилаланин (Phe) кодируется ТТС или ТТТ; Глицин (Gly) кодируется GGA, GGC, GGG или GGT; Гистидин (His) кодируется САС или CAT; Изолейцин (Ilе) кодируется АТА, АТС или АТТ; Лизин (Lys) кодируется ААА или AAG; Лейцин (Leu) кодируется ТТА, TTG, СТА, СТС, CTG или СТТ; Метионин (Met) кодируется ATG; Аспарагин (Asn) кодируется ААС или ААТ; Пролин (Pro) кодируется ССА, ССС, CCG или ССТ; Глутамин (Gln) кодируется САА или CAG; Аргинин (Аrg) кодируется AGA, AGG, CGA, CGC, CGG или CGT; -8- 005581 Серин (Ser) кодируется AGC, AGT, TCA, TCC, TCG или ТСТ; Треонин (Thr) кодируется АСА, АСС, ACG или ACT; Валин (Val) кодируется GTA, GTC, GTG или GTT; Триптофан (Тrр) кодируется TGG; и Тирозин (Тyr) кодируется ТАС или ТАТ. Должно быть понятно, что в соответствии с данным изобретением, когда заявляется кДНК, описанная выше, следует иметь в виду, что заявляется как смысловая цепь, антисмысловая цепь, так и ДНК в виде двухцепочечной ДНК, имеющая как смысловую, так и антисмысловую цепи, отожженные (гибридизованные) вместе посредством их соответствующих водородных связей. Также заявляется мессенджер-(информационная) РНК (мРНК), которая кодирует полипептиды данного изобретения, причем эта мРНК кодируется вышеупомянутой кДНК. Мессенджер-РНК (мРНК) будет кодировать полипептид с использованием кодонов, определенных выше, за исключением того, что каждый нуклеотид тимин (Т) заменен нуклеотидом урацилом (U). В общих чертах, последовательность ДНК, кодирующую полипептид Zcyto10, оперативно связывают с другими генетическими элементами, требующимися для ее экспрессии, обычно включающими в себя промотор и терминатор транскрипции, в экспрессирующем векторе. Этот вектор обычно будет содержать один или несколько селектируемых маркеров и одну или несколько точек инициации репликации, хотя специалистам в данной области будет понятно, что в некоторых системах селектируемые маркеры могут быть обеспечены на отдельных векторах, и репликация экзогенной ДНК может быть обеспечена интеграцией в геном клетки-хозяина. Выбор промоторов, терминаторов, селектируемых маркеров, векторов и других элементов является предметом рутинного конструирования в пределах обычной квалификации в данной области. Многие такие элементы описаны в литературе и являются доступными через коммерческих поставщиков. Для направления полипептида Zcyto10 в секреторный путь клетки-хозяина, в экспрессирующем векторе обеспечена секреторная сигнальная последовательность (также известная как лидерная последовательность, препропоследовательность или препоследовательность). Секреторная сигнальная последовательность может быть сигнальной последовательностью этого белка или может быть произведена из другого секретируемого белка (например, t-PA (тканевого активатора плазминогена)) или синтезирована de novo. Секреторная сигнальная последовательность соединена с последовательностью ДНК Zcyto10 в правильной рамке считывания. Секреторные сигнальные последовательности обычно расположены 5' (слева) от последовательности ДНК, кодирующей представляющий интерес полипептид, хотя некоторые сигнальные последовательности могут быть расположены в другом месте в представляющей интерес последовательности ДНК (см., например, Welch et al., U.S. Patent No. 5 037 743; Holland et al., U.S. Patent No. 5 143 830). Способы введения экзогенной ДНК в клетки-хозяева млекопитающих включают в себя опосредованную фосфатом кальция трансфекцию, Wigler et al., Cell 14:725 (1978); Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603 (1981); Graham and Van der Eb, Virology 52:456 (1973), электропорацию, Neumann et al., EMBO J. 1:841-845 (1982), опосредованную ДЭАЭ-декстраном трансфекцию, Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987) и опосредованную липосомами трансфекцию (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73 (1993); Ciccarone et al., Focus 15:80 (1993). Получение рекомбинантных полипептидов в культивируемых клетках млекопитающих описано, например, Levinson et al., U.S. Patent No. 4 713 339; Hagen et al., U.S. Patent No. 4 784 950; Palmiter et al., U.S. Patent No. 4 579 821; и Ringold, U.S. Patent No. 4 656 134. Подходящие культивируемые клетки млекопитающих включают в себя клеточные линии COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC No. CRL 10314), 293 (ATCC No. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:5972 (1977) и линии клеток яичника китайского хомячка (например, СНО-К1; ATCC No. CCL 61). Дополнительные подходящие клеточные линии известны в данной области и доступны из общественных депозитариев, таких как American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. В общем, предпочтительны сильные промоторы транскрипции, такие как промоторы из SV-40 или цитомегаловируса. См., например, U.S. Patent No. 4 956 288. Другие подходящие промоторы включают в себя промоторы из генов металлотионеина (U.S. Patent No. 4 579 821 и U.S. Patent No. 4 601 978) и основной поздний промотор аденовируса. Отбор с лекарственным средством обычно применяют для отбора на культивируемые клетки млекопитающих, в которые была встроена чужеродная ДНК. Такие клетки обычно называют "трансфектантами". Клетки, которые культивировались в присутствии селективного агента и способны передавать представляющий интерес ген их потомству, называют "стабильными трансфектантами". Предпочтительным селектируемым маркером является ген, кодирующий устойчивость к антибиотику неомицину. Отбор проводят в присутствии лекарственного средства типа неомицина, такого как G-418 или т.п. Системы отбора могут быть также использованы для увеличения уровня экспрессии представляющего интерес гена, способа, называемого "амплификацией". Амплификацию проводят культивированием трансфектантов в присутствии низкого уровня селективного агента и затем увеличением количества селективного агента для отбора клеток, которые продуцируют высокие уровни продуктов введенных генов. Предпоч-9- 005581 тительным амплифицируемым селектируемым маркером является дигидрофолатредуктаза, которая сообщает клеткам устойчивость к метотрексату. Другие гены устойчивости к лекарственным средствам (например, устойчивости к гигромицину, множественной устойчивости к лекарственным средствам, пуромицинацетилтрансферазе) также могут быть использованы. Альтернативные маркеры, которые вводят измененный фенотип, такие как зеленый флуоресцентный белок, или белки поверхности клеток, такие как CD4, CD8, МНС Класса I, щелочная фосфотаза плаценты, могут быть использованы для сортировки трансфицированных клеток от нетрансфицированных клеток такими способами, как FACS-сортинг (сортировка с использованием клеточного сортера с активацией флуоресценции) или способ разделения с магнитными гранулами. Другие высшие эукариотические клетки могут быть также использованы в качестве хозяев, в том числе клетки насекомых, клетки растений и клетки птиц. Трансформация клеток насекомых и получение в них чужеродных полипептидов описаны Guarino et al., U.S. Patent No. 5 162 222; Bang et al., U.S. Patent № 4 775 624 и WIPO publication WO 94/06463. Применение Agrobacterium rhizogenes в качестве вектора для экспрессии генов в клетках растений было рассмотрено в обзоре Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58 (1987). Клетки насекомых могут быть инфицированы рекомбинантным бакуловирусом, обычно произведенным из вируса ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV). См. King, L.A. and Possee, R.D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide (Chapman and Hall, London); O'Reilly, D.R. et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (University Press., New York, Oxford, 1994); и Richardson, C.D., Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, (Humana Press, Totowa, NJ, 1995). Второй способ получения рекомбинантного Zcyto10-бакуловируса использует систему на основе транспозона, описанную Luckow, V.A., et al., J. Virol. 67;4566-79, 1993. Эта система, которая использует векторы-переносчики, продается в виде набора Bac-to-Bac™ (Life Technologies, Rockville, MD). Эта система использует переносящий (трансдуцирующий) вектор, pFastBacl™ (Life Technologies), содержащий транспозон Тn7, для перемещения ДНК, кодирующей полипептид Zcyto10, в геном бакуловируса, сохраняемый в Е. coli в виде большой плазмиды, называемой "бакмидой". См. Hill-Perkins, M.S. and Possee, R.D., J. Gen. Virol., 71:971-6, (1990); Bonning, B.C. et al., J. Gen. Virol., 75:1551-6 (1994) и Chazenbalk, G.D. and Rapoport, В., J. Biol. Chem., 270:1543-9 (1995). Кроме того, переносящие векторы могут включать в себя в рамке считывания слияние с ДНК, кодирующей эпитопную метку на С- или Nконце экспрессируемого полипептида Zcyto10, например, эпитопную метку Glu-Glu, Grussenmeyer, Т. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7952-4 (1985). При помощи способа, известного в данной области, переносящий вектор, содержащий Zcyto10, трансформируют в Е. coli и подвергают скринингу на бакмиды, которые содержат прерванный ген LacZ, свидетельствующий о рекомбинантном бакуловирусе. Бакмидную ДНК, содержащую геном рекомбинантного бакуловируса, выделяют с использованием общепринятых способов и используют для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda, например, клеток Sf9. Затем получают рекомбинантный вирус, который экспрессирует Zcyto10. Исходные растворы рекомбинантного вируса готовят способами, обычно используемыми в данной области. Этот рекомбинантный вирус используют для инфицирования клеток-хозяев, обычно клеточной линии, полученной из совки травяной, Spodoptera frugiperda. См., в общем, Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C. (1994). Другой подходящей клеточной линией является клеточная линия High FiveO™ (Invitrogen), произведенная из Trichoplusia ni (U.S. Patent No. 5 300 435). Для выращивания и поддержания этих клеток используют коммерчески доступные бессывороточные среды. Подходящими средами являются Sf900 II™ (Life Technologies) или ESF 921™ (Expression Systems) для клеток SF9; и Ex-cellО405™ (JRH Biosciences, Lenexa, KS) или Express FiveO™ (Life Technologies) для клеток Т. ni. Клетки выращивают от плотности инокуляции приблизительно 2-5 х 105 клеток до плотности 1-2 х 106 клеток, после чего добавляют исходный раствор рекомбинантного вируса при множественности заражения (MOI) 0,1-10, более обычно около 3. Используемые процедуры в общем описаны в доступных лабораторных руководствах (King, L.A. and Possee, R.D., ibid.; O'Reilly, D.R. et al., ibid; Richardson, C.D., ibid.). Последующая очистка полипептида Zcyto10 из супернатанта может достигаться с использованием описанных здесь способов. Грибковые клетки, в том числе дрожжевые клетки, и, в частности, клетки рода Saccharomyces, могут быть также использованы в данном изобретении, например, для получения фрагментов белка или слитых (гибридных) полипептидов. Способы трансформации дрожжевых клеток экзогенной ДНК и получения из них рекомбинантных полипептидов описаны, например, Kawasaki, U.S. Patent No. 4 599 311; Kawasaki et al., U.S. Patent No. 4 931 373; Brake, U.S. Patent No. 4 870 008; Welch et al., U.S. Patent No. 5 037 743 и Murray et al., U.S. Patent No. 4 845 075. Трансформированные клетки отбирают по фенотипу, определяемому селектируемым маркером, обычно по устойчивости к лекарственному средству или по способности расти в отсутствие определенного питательного вещества (например, лейцина). Предпочтительной векторной системой для применения в дрожжах является векторная система РОТ1, описанная Kawasaki et al. (U.S. Patent No. 4 931 373), которая позволяет отбирать трансформированные клетки по росту в содержащей глюкозу среде. Подходящие промоторы и терминаторы для применения в дрожжах включают в себя промоторы и терминаторы из генов гликолитических ферментов (см., например, Kawasaki, U.S. Patent No. 4 599 311; Kingsman et al., U.S. Patent No. 4 615 974 и Bitter, U.S. Patent No. 4 977 092) - 10 - 005581 и генов алкогольдегидрогеназы. См. также Патенты США №№ 4 990 446, 5 063 154, 5 139 936 и 4 661 454. Системы трансформации для других дрожжей, в том числе Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii и Candida maltosa, известны в данной области. См., например, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465 (1986) и Cregg, U.S. Patent No. 4 882 279. Клетки Aspergillus могут быть использованы в соответствии со способами McKnight et al., U.S. Patent No. 4 935 349. Способы трансформации Acremonium chrysogenum описаны Sumino et al., U.S. Patent No. 5 162 228. Способы трансформации Neurospora описаны Lambowitz, U.S. Patent No. 4 486 533. Применение Pichia methanolica в качестве хозяина для получения рекомбинантных белков описано в WIPO Publications WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 и WO 98/02565. Молекулы ДНК для применения в трансформации Р. methanolica обычно должны быть получены в виде двухцепочечных кольцевых плазмид, которые предпочтительно линеаризуют перед трансформацией. Для получения полипептида в Р. methanolica предпочтительно, чтобы промотор и терминатор в этой плазмиде был промотором гена Р. methanolica, такого как ген утилизации спирта Р. methanolica (AUG1 или AUG2). Другие применимые промоторы включают в себя промоторы генов дигидроксиацетонсинтазы (DHAS), формиатдегидрогеназы (FMD) и каталазы (CAT). Для облегчения интеграции этой ДНК в хромосому хозяина предпочтительно иметь весь экспрессионный сегмент плазмиды, фланкированный на обоих концах последовательностями ДНК хозяина. Предпочтительным селектируемым маркером для использования в Pichia methanolica является ген ADE2 Р. methanolica, который кодирует фосфорибозил-5-аминоимидазолкарбоксилазу (AIRC; ЕС 4. 1. 1. 21), который позволяет клеткам-хозяевам ade2 расти в отсутствии аденина. Для крупномасштабных промышленных процессов, где желательно минимизировать использование метанола, предпочтительно использовать клетки-хозяева, в которых делетированы оба гена утилизации метанола (AUG1 и AUG2). Для получения секретируемых белков предпочтительными являются клетки-хозяева, недостаточные по генам вакуолярной протеазы (РЕР4 и PRB1). Для облегчения введения плазмиды, содержащей ДНК, кодирующую представляющий интерес полипептид, в клетки Р. methanolica используют электропорацию. Предпочтительно трансформировать клетки Р. methanolica электропорацией с использованием экспоненциально затухающего, пульсирующего электрического поля, имеющего напряженность поля от 2,5 до 4,5 кВ/см, предпочтительно около 3,75 кВ/см, и постоянную времени (τ) от 1 до 40 мс, наиболее предпочтительно приблизительно 20 мс. Прокариотические клетки-хозяева, в том числе штаммы бактерий Escherichia coli, Bacillus и других родов, являются также применимыми клетками-хозяевами в данном изобретении. Способы трансформации этих хозяев и экспрессия чужеродных последовательностей ДНК, клонированных в них, являются хорошо известными в данной области (см., например, Sambrook et al., ibid.). При экспрессии полипептида Zcyto10 в бактериях, таких как Е. coli, полипептид может сохраняться в цитоплазме, обычно в виде нерастворимых гранул, или может быть направлен в периплазматическое пространство бактериальной последовательностью секреции. В первом случае, клетки лизируют и гранулы извлекают и денатурируют при помощи, например, гуанидинизотиоцианата или мочевины. Затем денатурированный полипептид может быть повторно уложен и димеризован разбавлением денатуранта, например, диализом против раствора мочевины и комбинации восстановленного и окисленного глутатиона с последующим диализом против забуференного солевого раствора. В последнем случае, полипептид может быть извлечен из периплазматического пространства в растворимой и функциональной форме разрушением клеток (например, обработкой ультразвуком или осмотическим шоком) для высвобождения содержимого периплазматического пространства и выделения белка, с исключением тем самым необходимости денатурации и повторной укладки. Трансформированные и трансфицированные клетки-хозяева культивируют в соответствии с общепринятыми процедурами в культуральной среде, содержащей питательные вещества и другие компоненты, необходимые для роста выбранных клеток-хозяев. Различные подходящие среды, в том числе среды с определенным составом среды и комплексные среды, известны в данной области и обычно они включают в себя источник углерода, источник азота, незаменимые аминокислоты, витамины и минеральные соединения. Среды могут также содержать такие компоненты, как факторы роста или сыворотка, если требуется. Среда для выращивания будет обычно производить отбор на клетки, содержащие экзогенно добавленную ДНК, посредством, например, отбора с использованием лекарственного средства или недостатка незаменимого питательного компонента, который дополняется селектируемым маркером, имеющимся на экспрессирующем векторе или котрансфицируемым в клетку-хозяин. Клетки Pichia methanolica культивируют в среде, содержащей адекватные источники углерода, азота и микроэлементов, при температуре около 25-35°С. Жидкие культуры обеспечиваются достаточной аэрацией общепринятыми средствами, такими как качание небольших колб или барботирование ферментеров. Предпочтительной культуральной средой для Р. methanolica является YEPD (2% D-глюкоза, 2% Bacto™ пептон (Difco Laboratories, Detroit, MI), 1% Bacto™ дрожжевой экстракт (Difco Laboratories), 0,004% аденин и 0,006% L-лейцин). - 11 - 005581 В одном аспекте данного изобретения новый белок продуцируется культивируемой клеткой и эту клетку используют для скрининга на рецептор или рецепторы для этого белка, в том числе природный рецептор, а также агонисты и антагонисты природного лиганда. Выделение белка Предпочтительно очистить полипептиды данного изобретения до >80% чистоты, более предпочтительно до >90% чистоты, даже еще более предпочтительно до >95% чистоты и особенно предпочтительным является фармацевтически чистое состояние, которое является более чем на 99,9%, чистым в отношении примесных макромолекул, в частности других белков и нуклеиновых кислот, и не содержащим инфекционных и пирогенных агентов. Предпочтительно очищенный полипептид, по существу, не содержит других полипептидов, в частности других полипептидов животного происхождения. Экспрессируемые рекомбинантные полипептиды (или химерные полипептиды) могут быть очищены с использованием фракционирования и/или общепринятых способов и сред очистки. Для фракционирования проб могут быть использованы осаждение сульфатом аммония и кислотная или хаотропная экстракция. Примеры стадий очистки могут включать в себя хроматографию на гидроксиапатите, гельфильтрационную хроматографию, жидкостную экспресс-хроматографию белков (FPLC) и высокоэффективную жидкостную хроматографию с обращенной фазой. Подходящие анионообменные среды включают в себя производные декстрана, агарозу, целлюлозу, полиакриламид, специальные диоксиды кремния и т.п. Предпочтительными являются производные PEI, DEAE, QAE и Q, причем особенно предпочтительной является DEAE Fast-Flow Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). Примеры хроматографических сред включают в себя среды, дериватизованные фенильной, бутильной или октильной группами, такие как Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), OctylSepharose (Pharmacia) и т.п.; или полиакриловые смолы, такие как Amberchrom CG 71 (Toso Haas) и т.п. Подходящие твердые носители включают в себя стеклянные бусины, смолы на основе диоксида кремния, целлюлозные смолы, агарозные гранулы, сшитые агарозные гранулы, полистироловые гранулы, сшитые полиакриламидные смолы и т.п., которые являются нерастворимыми в условиях, в которых они должны использоваться. Эти носители могут быть модифицированы реакционноспособными группами, позволяющими присоединение белков посредством аминогрупп, карбоксильных групп, сульфгидрильных групп, гидроксильных групп и/или углеводных частей молекул. Примеры химических способов связывания включают в себя активацию цианогенбромидом, активацию N-гидроксисукцинимидом, активацию эпоксидом, активацию сульфгидрильными группами, активацию гидразидом и карбоксил- и аминопроизводными для способов сочетания с использованием карбодиимида. Эти и другие твердые среды являются хорошо известными и широко используемыми в данной области и доступными из коммерческих источников. Способы связывания рецепторных полипептидов со средами-носителями хорошо известны в данной области. Выбор конкретного способа является рутинным и определяется отчасти свойствами выбранного носителя. См., например, Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988). Полипептиды данного изобретения могут быть выделены путем использования их свойств. Например, адсорбционная хроматография с иммобилизованным металлом (IMAC) может быть использована для очистки богатых гистидином белков. Вкратце, гель сначала загружают ионами двухвалентного металла с образованием хелата [Е. Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1-7 (1985)]. Богатые гистидином белки будут адсорбироваться на этом матриксе с различными аффинностями в зависимости от используемого иона металла и будут элюироваться конкурентной элюцией, понижением рН или применением сильных хелатообразователей. Другие способы очистки включают в себя очистку гликозилированных белков аффинной хроматографией с иммобилизованным лектином и ионообменной хроматографией (Methods in Enzymol., Vol. 182:529-39, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, (ed.), (Acad. Press, San Diego, 1990). Альтернативно, слитый (гибридный) белок представляющего интерес полипептида и аффинной метки (например, полигистидина, мальтозусвязывающего белка, домена иммуноглобулина) может быть сконструирован для облегчения очистки. Применения Полипептид данного изобретения имеет структурные характеристики цитокина в виде четырехспирального пучка. Белок обычно характеризуется как цитокин вследствие его растворимости и способности действовать через рецепторы клеточной поверхности для сигнализации и модуляции пролиферации клеток. Цитокины делятся на несколько классов третичной структурной укладки, в том числе богатые цитеином димеры (например, инсулин, PDGF), бета-складки в виде трилистника (например, FGF, IL-1) и все-альфа четырехспиральные пучки. Последние характеризуются четырьмя спиралями, помеченными как А, В, С и D, в уникальной топологии вверх-вверх-вниз-вниз, где две поднятые петли связывают спирали А и В и спирали С и D. См., например, Manavalan et al., Journal of Protein Chemistry 11(3): 321-31, (1992). Цитокины со структурой четырехспирального пучка иногда дополнительно подразделяются на короткоцепочечные (например, IL-4, IL-2, GM-CSF) и длинноцепочечные (например, ТРО, гормон роста, лептин, IL-10), где последние обычно обнаруживают более длинные спирали А и D и поднятые петли. Далее мы будем использовать термин "цитокин" как синоним "цитокина с четырехспиральным пучком". Спираль A Zcyto10 включает в себя последовательность от аминокислотного остатка 35, изолейцина, по - 12 - 005581 аминокислотный остаток 49, изолейцин, также определяемую последовательностью SEQ ID NO:14; спираль В включает в себя последовательность от аминокислоты 91, лейцина, по аминокислотный остаток 105, треонин, также определяемую последовательностью SEQ ID NO:15; спираль С включает в себя последовательность от аминокислотного остатка 112, лейцина, по аминокислотный остаток 126, цистеин, также определяемую последовательностью SEQ ID NO:16; спираль D включает в себя последовательность от аминокислотного остатка 158, валина, по аминокислотный остаток 172, метионин, также определяемую последовательностью SEQ ID NO: 17. Zcyto10 человека имеет внутримолекулярную дисульфидную связь между Суs33 и Cys126. Предсказывается, что другие четыре цистеина, Cys80, Cys132, Cys81 и Cys134 образуют две внутримолекулярные дисульфидные связи в расположении Cys80-Cys132 и Cys81-Cys134. Предсказывается, что остатки, которые являются критическими для структурной стабильности Zcyto10, включают в себя Суs33, Cys126, Cys80, Cys132, Cys81 и Cys134. Ожидается, что мутация любого одного из этих остатков в любой другой остаток инактивирует функцию Zcyto10. Структурная стабильность Zcyto10 зависит также от поддержания скрытой гидрофобной поверхности на четырех альфа-спиралях. Предсказывается, что остатки Ile42, Phe46, Ile49, Leu91, Val94, Phe95, Tyr98, Leu112, Phe116, Ile119, Leu123, Val158, Leu162, Leu165, Leu168, Leu169 и Met172 скрыты в центральной части этого белка и, если они изменяются, заменяемым аминокислотным остатком должна быть гидрофобная аминокислота. Ожидается, что остатки, участвующие в связывании Zcyto10 с рецептором клеточной поверхности, включают в себя Asp57, на поднятой петле между спиралями А и В, и Lys160 и Glu164, заряженные остатки, которые, как предполагается, открыты на поверхности спирали D. На поверхности этого белка, на зонах петли АВ и спирали D, находится гидрофобный поверхностный "пластырь", содержащий остатки Ile62, Leu71, Ile167 и Тrр171. Эти остатки могут взаимодействовать с гидрофобным поверхностным "пластырем" на рецепторе клеточной поверхности. Полипептид Zcyto10 данного изобретения имеет приблизительно 28%-ную идентичность относительно интерлейкина-10 (IL-10). Мышиный полипептид Zcyto10 имеет приблизительно 24%-ную идентичность относительно IL-10 человека и приблизительно 27%-ную идентичность относительно мышиного IL-10. Полипептид Zcyto10 человека имеет приблизительно 76%-ную идентичность относительно мышиного полипептидa Zcyto10. Спираль А мышиного Zcyto10 включает в себя последовательность от аминокислотного остатка 35, изолейцина, по аминокислотный остаток 49, аргинин, последовательности SEQ ID NO:19, также определяемую последовательностью SEQ ID NO:21. Спираль В мышиного Zcyto10 включает в себя последовательность от аминокислотного остатка 91, лейцина, по аминокислотный остаток 105, треонин, последовательности SEQ ID NO:19, также определяемую последовательностью SEQ ID NO:22. Спираль С мышиного Zcyto10 включает в себя последовательность от аминокислотного остатка 112, лейцина, по аминокислотный остаток 126, цистеин, последовательности SEQ ID NO:19, также определяемую последовательностью SEQ ID NO:23. Спираль D мышиного Zcyto10 включает в себя последовательность от аминокислотного остатка 158, валина, по аминокислотный остаток 172, метионин, последовательности SEQ ID NO:19, также определяемую последовательностью SEQ ID NO:24. IL-10 представляет собой цитокин, который ингибирует продуцирование других цитокинов, индуцирует пролиферацию и дифференцировку активированных В-лимфоцитов, ингибирует репликацию ВИЧ и проявляет антагонистические эффекты на гамма-интерфероне. IL-10 существует, по-видимому, в виде димера, образованного двумя альфа-спиральными полипептидными участками, связанными посредством вращения 180°. См., например, Zdanov et al., Structure: 3(6): 591-601 (1996). Сообщалось, что IL-10 является продуктом активированных Т-клеток Th2, В-клеток, кератиноцитов и моноцитов/макрофагов Th2, который способен модулировать Т-клеточный ответ Тhl. Такая модуляция может сопровождаться ингибированием синтеза цитокинов Т-клетками Тhl. См., например, Hus et al., Int. Immunoe. 4: 563 (1992) и D'Andrea et al., J. Exp. Med. 178: 1042 (1992). Сообщалось, что IL-10 ингибирует синтез цитокинов природными клетками-убийцами и моноцитами/макрофагами. См., например, Hus et al., цитированную выше, и Florentinо et al., J. Immunol. 146: 3444 (1991). Кроме того, было обнаружено, что IL-10 обладает защитным действием в отношении инсулинзависимого сахарного диабета. При анализе тканевого распределения мРНК, соответствующей этой новой ДНК, наблюдали единственный транскрипт при приблизительно 1,2 т.п.н. С использованием Clontech Multiple Tissue Northerns, этот транскрипт человека обнаруживали в трахее, плаценте, яичке, коже, слюнных железах, предстательной железе, щитовидной железе, причем более низкая экспрессия наблюдалась в желудке и поджелудочной железе. Zcyto10 экспрессировался в следующих тканях мышей: почке, скелетной мышце, слюнных железах, печени и коже. Тканеспецифичность экспрессии Zcyto10 предполагает, что Zcyto10 может быть фактором роста и/или поддержания в трахее и слюнных железах, желудке, поджелудочной железе и мышце и может быть важным в локальных иммунных ответах. Кроме того, местоположение гена Zcyto10 на хромосоме lq32.2 свидетельствует о том, что Zcyto10 является фактором роста/дифференцировки или является важным в регуляции иммунного ответа в виде IL-10. - 13 - 005581 Данное изобретение обеспечивает также реагенты, которые найдут применение в диагностических приложениях. Зонд, содержащий ДНК или РНК Zcyto10 или их подпоследовательность, может быть использован для определения, присутствует ли ген Zcyto10 на хромосоме 1 и не произошла ли мутация. Данное изобретение обеспечивает также реагенты значительной терапевтической ценности. Полипептид Zcyto10 (природно встречающийся или рекомбинантный), его фрагменты, антитела и антиидиотипические антитела к ним, вместе с соединениями, идентифицированными как имеющие связывающую аффинность в отношении полипептида Zcyto10, могли бы быть применимыми в лечении состояний, связанных с аномальными физиологией или развитием, в том числе аномальной пролиферацией, например, раковых состояний или дегенеративных состояний или измененного иммунитета. Антитела к полипептиду Zcyto10 могут быть очищены и затем введены пациенту. Эти реагенты могут комбинироваться для терапевтического применения с дополнительными активными или инертными ингредиентами, например, в фармацевтически приемлемых носителях или разбавителях, вместе с физиологически безвредными стабилизаторами и наполнителями. Эти комбинации могут быть стерильно отфильтрованы и помещены в дозированные формы, например, лиофилизацией в дозированных флаконах или хранением в стабилизированных водных препаратах. Данное изобретение предполагает также применение антител, их связывающих фрагментов или одноцепочечных антител этих антител, в том числе форм, которые не являются комплементсвязывающими. Количества реагентов, необходимые для эффективной терапии, будет зависеть от многочисленных различных факторов, в том числе от способов введения, сайта-мишени, физиологического состояния пациента и других вводимых лекарственных средств. Таким образом, терапевтические дозы должны титроваться для оптимизации безопасности и эффективности. В типичном случае, дозы, используемые in vitro, могут обеспечить полезное указание для количеств, применимых для введения in vivo этих реагентов. Испытание на животных эффективных доз для лечения конкретных нарушений обеспечит дополнительно предполагаемое указание относительно определения дозы для человека. Способы введения включают в себя пероральное, внутривенное, внутрибрюшинное, внутримышечное или чрескожное введение или введение в легкое или трахею в форме спрея посредством распылителя или пульверизатора. Фармацевтически приемлемые носители включают в себя воду, солевой раствор, буферы, среди прочих. Могли бы ожидаться обычно диапазоны доз от 1 до 1000 мкг на килограмм веса тела в день. Однако эти дозы могут быть более высокими или более низкими, как это может быть определено врачом с обычной квалификацией в данной области. В отношении полного обсуждения приготовлений лекарственных средств и диапазонов доз см. Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Ed., (Mack Publishing Company, Easton, Penn., 1996) и Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 9th Ed. (Pergamon Press 1996). Терапевтическое лечение на основе нуклеиновых кислот Если млекопитающее имеет мутированный ген Zcyto10 или не имеет этого гена, то ген Zcyto10 может быть введен в клетки этого млекопитающего. В одном варианте ген, кодирующий полипептид Zcyto10, вводят in vivo в вирусном векторе. Такие векторы включают в себя аттенуированный или дефектный ДНК-вирус, такой как (но не ограничиваемый ими) вирус простого герпеса (HSV), папилломавирус, вирус Эпстейна-Барр (EBV), аденовирус, аденоассоциированный вирус (AAV) и т.п. Предпочтительными являются дефектные вирусы, которые полностью или почти полностью лишены вирусных генов. Дефектный вирус является неинфекционным после введения в клетку. Применение дефектных вирусных векторов позволяет вводить их в клетки в специфическом локализованном участке без опасения, что этот вектор может инфицировать другие клетки. Примеры конкретных векторов включают в себя, но не ограничиваются ими, вектор дефектного вируса герпеса 1 (HSV1) [Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci., 2:320-330 (1991)], аттенуированный аденовирусный вектор, такой как вектор, описанный StratfordPerricaudet et al., J. Clin. Invest., 90:625-630 (1992), и дефектный аденоассоциированный вирусный вектор [Samulski et al., J. Virol., 61:3096-3101 (1987); Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828 (1989)]. В другом варианте этот ген может быть введен в ретровирусном векторе, например, как описано в Anderson et al., U.S. Patent No. 5 399 346; Mann et al., Cell, 33:153 (1983); Temin et al., U.S. Patent No. 4 650 764; Temin et al., U.S. Patent No. 4 980 289; Markowitz et al., J. Virol., 62:1120 (1988); Temin et al., U.S. Patent No. 5 124 263; International Patent Publication No. WO 95/07358, published March 16, 1995 Dougherty et al.; и Blood, 82:845 (1993). Альтернативно этот вектор может быть введен липофекцией in vivo с использованием липосом. Синтетические катионные липиды могут быть использованы для приготовления липосом для трансфекции in vivo гена, кодирующего маркер [Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417 (1987); см. Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8027-8031 (1988)]. Применение липофекции для введения экзогенных генов в специфические органы in vivo имеет определенные практические преимущества. Молекулярное нацеливание липосом на специфические клетки представляет собой одну область преимущества. Ясно, что направление трансфекции к конкретным типам клеток могло бы быть особенно выгодным в ткани с клеточной гетерогенностью, такой как поджелудочная железа, печень, почка и мозг. Липиды могут быть химически связаны с другими молекулами для нацеливания. Нацеленные пептиды, например, гормоны или нейротрансмиттеры, и белки, такие как антитела, или непептидные молекулы, могли бы быть связаны с липосомами химически. Эти липосомы могут также вводиться в форме спрея в легкое или трахею с использованием пульверизатора или распылителя. - 14 - 005581 Можно извлекать эти клетки из тела и вводить этот вектор в виде депротеинизированной ДНКплазмиды и затем повторно имплантировать трансформированные клетки в тело. Депротеинизированный ДНК-вектор для генной терапии может быть введен в желательные клетки-хозяева способами, известными в данной области, например, трансфекцией, электропорацией, микроинъекцией, трансдукцией, клеточным слиянием, ДЭАЭ-декстрановым методом, осаждением фосфатом кальция, с применением генной пушки или с применением транспортера (переносчика) ДНК-вектора [см., например, Wu et al., J. Biol. Chem., 267:963-967 (1992); Wu et al., J. Biol. Chem., 263:14621-14624 (1988)]. Полипептиды Zcyto10 могут быть также использованы для получения антител, которые специфически связываются с полипептидами Zcyto10. Затем эти антитела могут быть использованы для получения антиидиотипических антител. В применении здесь, термин "антитела" включает в себя поликлональные антитела, моноклональные антитела, их антигенсвязывающие фрагменты, такие как F(ab')2- и Fabфрагменты, и т.п., в том числе генетически сконструированные антитела. Антитела определяются как специфически связывающие, если они связываются с полипептидом Zcyto10 с Ка, большей или равной 107/М. Аффинность моноклональных антител может быть легко определена специалистом с обычной квалификацией в данной области (см., например, Scatchard, ibid.). Способы получения поликлональных и моноклональных антител хорошо известны в данной области (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Second Edition) (Cold Spring Harbor, NY, 1989) и Hurrell, J.G.R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982), которые включены здесь в качестве ссылки). Как должно быть очевидно для специалиста с обычной квалификацией в данной области, поликлональные антитела могут быть получены из различных теплокровных животных, таких как лошади, коровы, козы, овцы, собаки, куры, кролики, мыши и крысы. Иммуногенность полипептида Zcyto10 может быть увеличена использованием адъюванта, такого как полный или неполный адъювант Фрейнда. Различные тесты, известные специалистам в данной области, могут быть использованы для обнаружения антител, которые специфически связываются с полипептидами Zcyto10. Примеры тестов описаны подробно в Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Eds.), (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Характерные примеры таких тестов включают в себя: конкурентный иммуноэлектрофорез, радиоиммуноанализы, радиоиммунопреципитации, твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), дот-блот-анализы, анализы ингибирования или конкурентного связывания и сэндвич-анализы. Антитела к Zcyto10 могут быть использованы для мечения клеток, которые экспрессируют этот белок, для аффинной очистки, в диагностических тестах для определения уровней растворимых полипептидов белка в кровотоке и в качестве антагонистов для ингибирования связывания лиганда и трансдукции сигнала in vitro и in vivo. В другом аспекте данного изобретения обеспечена фармацевтическая композиция, содержащая очищенный полипептид Zcyto10 в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Такие композиции могут быть применимы для модуляции пролиферации клеток, дифференцировки клеток или продуцирования цитокинов в предупреждении или лечении состояний, характеризующихся неправильной пролиферацией клеток, дифференцировкой клеток или продуцированием цитокинов, как обсуждается здесь далее. Кроме того, полипептиды Zcyto10 данного изобретения могут быть использованы в специфических для трахеи или в специфических трахеобронхиальных приложениях, таких как поддержание или заживление ран трахеоброхиального эпителия или лежащих ниже клеток, регуляция продуцирования слизи или клиренса мерцательным (реснитчатым) эпителием инородных веществ или остатков органических веществ из раны, или лечение астмы, бронхита или других заболеваний трахеальнобронхиального пути. Ожидается, что полипептид Zcyto10 мог бы вводиться в диапазоне доз между дозами, используемыми для конструкции Zcyto10-Fc, и дозами в 100-раз более высокими, в зависимости от стабильности полипептида Zcyto10. Терапевтические дозы Zcyto10 могли бы быть в диапазоне доз от 5 до 5000 мкг/кг/день. Полипептид Zcyto10 данного изобретения экспрессируется на высоком уровне в слюнных железах и трахее и был обнаружен в слюне при помощи Вестерн-блот-анализа. Слюнные железы синтезируют и секретируют ряд белков, обладающих разнообразными функциями. Такие белки облегчают смазывание полости рта (например, муцины и богатые пролином белки), реминерализацию (например, статерин и богатые ионным пролином белки) и переваривание пищи (например, амилаза, липаза и протеазы) и обеспечивают способность поддержания антимикробной целостности (например, богатые пролином белки, лизозим, гистатины и лактопероксидаза) и целостности слизистой оболочки (например, муцины). Кроме того, известно, что слюна является богатым источником факторов роста, синтезируемых слюнными железами. Например, известно, что слюна содержит эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста нервов (NGF), трансформирующий фактор роста-альфа (TGF-α), трансформирующий фактор роста-бета (TGF-β), инсулин, инсулин-подобные факторы роста I и II (IGF-I и IGF-II) и фактор роста фибробластов (FGF). См., например, Zelles et al., J. Dental. Res. 74(12): 1826-32, 1995. Считается, что синтез факторов роста слюнными железами является необходимым для здоровья полости рта и желудочно-кишечного тракта. - 15 - 005581 Таким образом, полипептиды Zcyto10, их агонисты или антагонисты могут быть терапевтически применимы в регенерации желудочно-кишечного тракта или полости рта. Для подтверждения наличия этой способности у полипептидов Zcyto10, такие полипептиды Zcyto10, их агонисты или антагонисты оценивают в отношении их способности разрушать крахмал в соответствии с процедурами, известными в данной области. Полипептиды Zcyto10, их агонисты или антагонисты могут быть применимы в лечении астмы и других заболеваний трахеобронхиального тракта, таких как бронхит и т.п., посредством вмешательства в перекрестную регуляцию Тh1 и Th2 лимфоцитов, регуляцию роста, дифференцировки и продуцирования цитокинов других воспалительных клеточных медиаторов, таких как эозинофилы, мастоциты, базофилы, нейтрофилы и макрофаги. Полипептиды Zcyto10, их агонисты или антагонисты могут также модулировать мышечный тонус в трахеобронхиальном тракте. Полипептиды Zcyto10 могут быть также использованы для лечения ряда кожных состояний либо системно, либо локально путем помещения мази или крема, например, экземы, псориаза или состояний сухой кожи вообще или в связи с уходом за кожей. Полипептид Zcyto10 может быть непосредственно инъецирован в мышцу для лечения мышечной атрофии у пожилых людей, больных или прикованных к постели людей. Картирование с использованием облученных гибридов (клеток) представляет собой генетический способ с применением соматических клеток, разработанный для конструирования последовательных генетических карт высокого разрешения хромосом млекопитающих [Сох et al., Science 250:245-250 (1990)]. Частичное или полное знание последовательности гена позволяет сконструировать ПЦРпраймеры, пригодные для применения с хромосомными панелями картирования облученных гибридов. Коммерчески доступные панели (наборы) картирования облученных гибридов, которые включают в себя весь геном человека, такие как Stanford G3 RH Panel и GeneBridge 4 RH Panel (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL), являются доступными. Эти панели позволяют выполнять быстрые, основанные на ПЦР, определения местоположения в хромосоме и порядка расположения генов, меченых определенной последовательностью сайтов (STS) и других неполиморфных и полиморфных маркеров в представляющем интерес районе хромосомы. Это включает в себя установление прямо пропорциональных физических расстояний между вновь открытыми представляющими интерес генами и картированными ранее маркерами. Точное знание положения гена может быть применимо в целом ряде способов, в том числе: 1) в определении, является ли последовательность частью существующего контига, и получении дополнительных окружающих генетических последовательностей в различных формах, таких как YAC-, ВАСили кДНК-клоны, 2) в обеспечении возможного гена-кандидата для наследственного заболевания, который обнаруживает сцепление с тем же самым хромосомным районом, и 3) для перекрестно-ссылочных модельных организмов, таких как мышь, которые могут быть ценными в содействии определению функции, которую может иметь конкретный ген. Эти результаты показывают, что ген Zcyto10 картируется в районе 889.26 cR_3000 от верхней части группы сцепления хромосомы 1 человека на карте облученных гибридов WICGR. Проксимальным и дистальным каркасными маркерами были D1S504 и WI-9641 (D1S2427), соответственно. Использование маркеров окружения помещает ген Zcyto10 в район lq32.2 на интегрированной карте LDB хромосомы 1 (The Genetic Location Database, University of Southhampton, WWW server: http://cedar.genetics.soton.ac.uk/ public_html/). Многочисленные гены были картированы в районе lq32.2 хромосомы 1. В частности, было обнаружено, что мутации в этом районе приводят к синдрому van der Woude, связанному с врожденным пороком (мальформацией) нижней губы, который иногда связан с расщелиной нёба. Таким образом, ген Zcyto10, который экспрессируется в слюнных железах, может быть использован в генной терапии этого синдрома. Если млекопитающее имеет мутированный ген Zcyto10 или не имеет этого гена, ген Zcyto10 может быть введен в клетки этого млекопитающего. Другой аспект данного изобретения включает в себя композиции антисмысловых полинуклеотидов, которые являются комплементарными сегменту полинуклеотида, представленного в SEQ ID NO: l, 3, 18 и 33. Такие синтетические антисмысловые олигонуклеотиды конструируются для связывания с мРНК, кодирующей полипептиды Zcyto10, и ингибирования трансляции таких мРНК. Такие антисмысловые олигонуклеотиды применимы для ингибирования экспрессии кодирующих полипептид Zcyto10 генов в культуре клеток или в субъекте. Данное изобретение обеспечивает также реагенты, которые найдут применение в диагностических применениях. Например, ген Zcyto10, зонд, содержащий ДНК или РНК Zcyto10 или ее подпоследовательность, может быть использован для определения, присутствует ли ген Zcyto10 на хромосоме 1 или произошла мутация. Детектируемые хромосомные абберации в локусе гена Zcyto10 включают в себя, но не ограничиваются ими, анеуплоидию, изменения копийности гена, инсерции, делеции, изменения сайтов рестрикции и реаранжировки. Такие аберрации могут быть обнаружены с использованием полинуклеотидов данного изобретения при помощи молекулярно-генетических способов, таких как анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RELP), анализ коротких тандемных концевых повторов (STR) с использованием ПЦР-способов, и других способов анализа генетического сцепления, известных в данной области [Sambrook et al., ibid.; Ausubel, et al., ibid.; Marian, A.J., Chest, 108:255-265, (1995)]. - 16 - 005581 Специалистам в данной области будет понятно, что последовательности, описанные в SEQ ID NO: 2, 4, 12, 13, 19, 20, 25, 26, 34 и 35, представляют отдельные аллели генов и полипептидов Zcyto10 человека и мыши и что ожидается возможность аллельной вариации и альтернативного сплайсинга. Аллельные варианты могут быть клонированы зондированием библиотек кДНК или геномных библиотек в соответствии со стандартными процедурами. Аллельные варианты последовательности ДНК, показанной в последовательностях SEQ ID NO: l, 3, 18 и 33, в том числе аллельные варианты, содержащие молчащие мутации, и аллельные варианты, в которых мутации приводят к изменениям аминокислотной последовательности, находятся в сфере действия данного изобретения. Последовательность Zcyto10 имеет 7 мотивов нестабильности транскрипции в 3'-нетранслируемом районе в положениях 706, 813, 855 и 906 SEQ ID NO:1. Обработка клеток, экспрессирующих Zcyto10, циклогексимидом может ослаблять эту нестабильность транскрипции. См. Shaw, G. et al., Cell 46: 659667 (1986). Кроме того, АТ-богатый 3'-нетранслируемый район может быть генетически изменен или удален для дополнительного усиления стабильности транскрипции. Применение Zcyto10 для ускорения заживления ран Результаты примера 4 показывают, что Zcyto10 играет роль в заживлении ран. Таким образом, Zcyto10 может наноситься на рану или ожог для усиления заживления раны. Zcyto10 может вводиться системно в дозе от 1 до 100 мкг на килограмм веса индивидуума. Zcyto10 может также наноситься на рану в виде мази, которая содержит от 1 нг до 1 мг Zcyto10 на грамм мази. См. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., (Mack Publishing Company, Easton, Penn., 1996). Zcyto10 должен помещаться на очищенную рану ежедневно до заживления раны. Применение Zcyto10 для увеличения числа тромбоцитов Как можно видеть из приведенного ниже примера 7, авторы обнаружили, что Zcyto10 может быть использован для увеличения числа тромбоцитов. Это особенно важно для раковых пациентов, которые испытывают тромбоцитопению вследствие химиотерапии или лучевой терапии. Zcyto10 может быть введен терапевтически в фармацевтически приемлемом носителе. Далее данное изобретение будет иллюстрироваться при помощи нижеследующих неограничительных примеров. Пример 1. Клонирование Zcyto10. Полноразмерная последовательность zcyto10x1 (более длинная форма) и zcyto 10x2 (более короткая форма) была выяснена с использованием 3'-RACE® и секвенирования двух полученных фрагментов (SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:11) и затем искусственного сплайсинга вместе при помощи компьютера estпоследовательности, показанной в SEQ ID NO:5, с перекрывающейся последовательностью из двух 3'RACE-фрагментов. Олигонуклеотид (олиго) zc15907 (SEQ ID NO:6) был сконструирован к участку, расположенному непосредственно слева (5') от предположительного метионина для zcyto10. Далее справа (по ходу транскрипции) конструировали другой олиго, zc15906 (SEQ ID NO:7), к участку непосредственно слева от сайта отщепления сигнальной последовательности. Эти олигонуклеотиды использовали в реакциях 3'RACE на марафон-кДНК трахеи человека. Zc15907 использовали в первичной 3'-RACE-реакции и zc15906 использовали во внутригенной 3'-RACE-реакции. Марафон-кДНК (MARATHON-кДНК) готовили с использованием набора Marathon cDNA Amplification kit (Clontech, Palo Alto, CA) в соответствии с инструкциями изготовителя с использованием в качестве исходного материала мРНК трахеи человека, приобретенную из Clontech. ПЦР-реакции проводили в соответствии с инструкциями изготовителя в наборе Marathon cDNA Amplification kit с некоторой модификацией в параметрах термоцикла. Эти параметры термоцикла были следующими: 94°С 1 мин 30 с 1х 94°С 15 с 68°С 1 мин 30х 72°С 7 мин 1х Параметры термоцикла, используемые во внутригенной ПЦР-реакции, были следующими: 94°С 1 мин 30 с 1х, 94°С 15 с 68°С 1 мин 20 с 30х, 72°С 7 мин 1х. Полученные продукты подвергали электрофорезу на 1,2% агарозном геле (агароза Gibco) и наблюдали две основных полосы, приблизительно на расстоянии 80 т.н. друг от друга. Эти полосы вырезали и очищали на геле с использованием смолы (Qiagen) в соответствии с инструкциями изготовителя. Затем эти фрагменты подвергали секвенированию, что позволяло выяснить полноразмерную последовательность zcyto10. Пример 2. Нозерн-блот-анализ. Множественные блоты тканей человека I, II, III и мастер-дот-блот РНК человека (Clontech) зондировали для определения тканевого распределения zcyto10. 45-мерный антисмысловой олигонуклеотид, SEQ ID NO:9, конструировали с использованием est-последовательности (5 п.н. 100-145 SEQ ID NO:5). 15 пм SEQ ID NO: 9 метили на конце 32Р с использованием полинуклеотидкиназы Т4 (Gibco-BRL). Реакция мечения содержала 2 мкл 5х реакционного буфера для киназы прямой реакции (Gibco-BRL), 1 мкл киназы Т4, 15 пм SEQ ID NO: 9, 1 мкл 6000 Ки/ммоль 32Р-гамма-АТФ (Amersham) и воду до 10 мкл. - 17 - 005581 Реакцию инкубировали 30 минут при 37°С. Невключенную радиоактивность удаляли при помощи колонки для очистки NucTrap Probe Purification Column (Stratagene). Нозерн-блоты множественных тканей и мастер-блот РНК человека предгибридизовали при 50°С 3 ч в 10 мл раствора ExpressHyb (Clontech), содержащего 1 мг ДНК спермы лосося и 0,3 мг ДНК cot1 человека (Gibco-BRL), причем обе ДНК кипятили 3 мин, затем охлаждали на льду 2 мин и добавляли к ExpressHyb. Гибридизацию проводили в течение ночи при 50°С. Начальные условия промывки были следующими: 2Х SSC, 0,1% ДСН при комнатной температуре в течение 40 мин с несколькими сменами промывного раствора, затем 0,1X SSC, 0,1% ДСН при 64°С (Тm-10) в течение 30 мин. Затем фильтры экспонировали на пленке в течение двух дней. Экспрессия zcyto10 на нозерн-блотах выявила полосу приблизительно 1,2 т.п.н. в трахее, слабую полосу 1,5 т.п.н. в желудке и более слабые полосы обоих размеров в поджелудочной железе. Дот-блоты показали присутствие zcyto10 в трахее, слюнных железах, плаценте, яичке, коже, предстательной железе, надпочечниках и щитовидной железе. В мышах zcyto10 был обнаружен в почке, скелетной мышце, слюнных железах, печени и коже. Пример 3. Хромосомное соотнесение и определение места Zcyto10 в хромосоме. Zcyto10 картировали в хромосоме 1 с использованием коммерчески доступной версии панели облученных гибридов "Stanford G3 Radiation Hybrid Panel" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). "Stanford G3 4 Radiation Hybrid Panel" содержит пригодные для ПЦР ДНК из каждого из 83 облученных гибридных клонов полного генома человека плюс две контрольные ДНК (донор RM и реципиент A3). Общественно-доступный WWW-сервер (http://shgc-www.stanford.edu) позволяет определить хромосомное местоположение маркеров. Для картирования Zcyto10 с использованием "Stanford G3 Radiation Hybrid Panel", реакции по 20 мкл устанавливали в пригодном для ПЦР 96-луночном микротитрационном планшете (Stratagene, La Jolla, СА) и использовали термоциклер "RoboCycler Gradient 96" (Stratagene). Каждая из этих 85 ПЦРреакций состояла из 2 мкл 10Х буфера для KlenTaq ПЦР-реакции (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), 1,6 мкл смеси dNTP (2,5 мМ каждый, PERKIN-ELMER, Foster City, CA), 1 мкл смыслового праймера SEQ ID NO: 6, 5' АТТ ССТ AGC ТСС TGT GGT CTC CAG 3', 1 мкл антисмыслового праймера SEQ ID NO: 8, 5' ТСС САА АТТ GAG TGT CTT CAG Т 3', 2 мкл "RediLoad" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL), 0,4 мкл 50Х смеси Advantage KlenTaq Polymerase Mix (Clontech Laboratories, Inc.), 25 нг ДНК из индивидуального гибридного клона или контроля и х мкл ddH2O для общего объема 20 мкл. На реакции наслаивали равное количество минерального масла и их герметизировали. Условия ПЦРциклера были следующими: 1 начальный цикл 5-минутной денатурации при 95°С, 35 циклов 1-минутной денатурации при 95°С, 1-минутный отжиг при 66°С и 1,5-минутное удлинение при 72°С, с последующим конечным 1 циклом удлинения в течение 7 мин при 72°С. Продукты реакции разделяли электрофорезом на 2% агарозном геле (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Результаты показали сцепление Zcyto10 с каркасным маркером SHGC-36215 с баллом LOD >10 и на расстоянии 14,67 cR_10000 от этого маркера. Применение маркеров окружения помещает Zcyto10 в район lq32.2 на интегрированной карте LDB хромосомы 1 (The Genetic Location Database, University of Southhampton, WWW server: http://cedar.genetics.soton.ac.uk/ public_html/). Пример 4. Использование Zcyto10 для усиления заживления ран. В данном исследовании использовали нормальных взрослых самок мышей Balb/c. Во время этого исследования их содержали в установках для ухода за животными с 12-часовым циклом свет-темнота и им давали воду и корм для лабораторных животных ad libitum. Co дня хирургического вмешательства их содержали в индивидуальных клетках. В день хирургии животных анестезировали кетамином (Vetalar, Aveco Inc., Ft. Dodge, IA) 104 мг/кг плюс ксилазином (Rompun, Mobey Corp., Shawnee, KS) 7 мг/кг в стерильном (фильтрованном через 0,2 µфильтр) забуференном фосфатом солевом растворе (ЗФР) посредством внутрибрюшинной инъекции. Волосы на их спинках выщипывали и проводили депиляцию кожи при помощи NAIR® (Carter-Wallace, New York, NY), затем промывали водой. 100% гель aloe vera наносили для противодействия щелочному ожогу от обработки NAIR®, затем животных помещали на нагревательные подушки с циркулирующей водой и выдерживали на них, пока кожа и окружающая шерсть не становились сухими. Затем животных анестезировали метофаном (Pittman Moore, Mundelein, NJ) и депилированную спинку вытирали 70% этанолом. Четыре иссечения (резекции), каждое 0,5 кв. см, делали через кожу и panniculus carnosum (слой скелетных мышц в поверхностной фасции) над паравертебральным участком на уровне грудных-поясничных позвонков. Раны и окружающую их депилированную кожу покрывали клейкой полупроницаемой окклюзионной повязкой, BIOCLUSIVE® (Johnson & Johnson, Arlington, TX). Срезанный край иссечения регистрировали через BIOCLUSIVE® на ацетатную прозрачность для более поздней оценки закрывания. Контрольную кожу и поврежденную кожу в разных временных точках (7, 15 и 24 ч) обрабатывали с использованием набора Qiagen RNeasy Midi kit. Вкратце, кожу (контрольный и пораженный участки) взвешивали и гомогенизировали в подходящем объеме лизисного буфера (RLT). Лизаты откручивали для удаления остатков тканей (дебриса) и к лизатам добавляли равный объем 70% этанола; хорошо смешивали и наносили на колонку. Пробы откручивали пять минут и промывали один раз 3,8 мл буфера RW1, - 18 - 005581 затем два раза RPE (по 2,5 мл каждый раз). Общую РНК элюировали водой, не содержащей РНКазы. Уровень экспрессии проб кожи измеряли с использованием ПЦР реального времени (Perkin Elmer ABI Prism 7700 Sequence Detector). Этот эксперимент был спланирован с не-эталонным контролем, набором стандартных и кожных проб. Для стандартной кривой использовали общую РНК почки мыши. В этом эксперименте использовали три набора общей РНК кожи (25 нг): 7 ч (контрольная и поврежденная); 15 ч (контрольная и поврежденная); 24 ч (контрольная и поврежденная). Каждую пробу использовали в трех повторностях с использованием одностадийной ОТ-ПЦР на детекторе последовательностей 7700. В этом эксперименте использовали приготовленные в лаборатории прямой праймер SEQ ID NO:36, обратный праймер SEQ ID NO:37 и зонд TaqMan Perkin Elmer (ZG-7-FAM). Условия одностадийной ОТ-ПЦР были следующими: (стадия ОТ) 48°С в течение 30 мин, (40 циклов ПЦР-стадии) 95°С в течение 10 мин, 95°С в течение 15 с, 60°С в течение 1 мин. Уровни экспрессии Zcyto10 в пробах контрольной кожи при 7 и 15 ч были сравнимыми и составляли 2,46 и 2,61 нг/мл, соответственно. При 24 ч уровень экспрессии Zcyto10 в пробах из контрольной кожи был равен нулю. Уровень экспрессии Zcyto10 в пробах из поврежденной кожи при 7 ч был 5,17 нг/мл (увеличение более чем в 2 раза по сравнению с уровнем контрольной пробы). Уровень экспрессии Zcyto10 в пробах из поврежденной кожи при 15 ч был 14,45 нг/мл (увеличение в 5,5 раз по сравнению с уровнем контрольной пробы). Уровень экспрессии Zcyto10 в пробах из поврежденной кожи при 24 ч был 5,89 нг/мл. Повторный эксперимент, включавший в себя также отрицательный контроль (дрожжевую тРНК), дал сходную тенденцию, что позволило предполагать, что амплификация была реальной и специфической для мыши. Эти результаты предполагают, что Zcyto10 играет роль в репарации поранений, так как уровень экспрессии Zcyto10 в пробах из имеющей поранения ткани был более высоким в сравнении с уровнем экспрессии Zcyto10 контрольной пробы и он увеличивался и снижался со временем. Таким образом, Zcyto10 может наноситься на раны для усиления заживления ран. Пример 5. Трансгенные мыши. Получали трансгенных мышей, которые экспрессировали Zcyto10 под контролем промотора альбумина или металлотионина. При рождении некоторые из этих мышей имели блестящий вид и имели ограниченное движение. Кожа этих мышей была тугой и морщинистой, некоторые имели также подобные усам волосы на нижней губе. Зоны ноздрей и рта, конечности и хвост были опухшими. Одна трансгенная мышь, для которой использовали промотор альбумина, выжила до дня 3 и сильно отставала в росте. Не было развития ушей и было снижено развитие пальцев стоп. Всех животных умерщвляли, когда они агонизировали в дни 1, 2 или 3. Брали пробы хвоста и печени и их фиксировали in situ в 10% нейтральном формалине, заливали в парафин и делали срезы при 3 мкм и окрашивали их Н&Е. Все мыши этого фенотипа были трансгенными и имели экспрессию Zcyto10 от низкой до высокой. Не наблюдали значимых изменений в большинстве тканей, за исключением кожи. Кожа экспрессирующих Zcyto10 мышат, в частности, тех мышей, которые имели высокий уровень экспрессии Zcyto10, имела тенденцию быть более толстой, чем кожа мышат, не экспрессирующих Zcyto10. Зернистый слой (stratum granulosum) в этих мышатах, по-видимому, является уменьшенным по толщине в сравнении с не экспрессирующими Zcyto10 мышатами, тогда как слой stratum spinosum был более толстым из-за увеличения слоев клеток и/или увеличенного диаметра клеток. Кроме этих изменений в эпидермисе, дерма (собственно кожа) одной мыши, имеющей среднюю экспрессию Zcyto10, была фокально умеренно расширена мукоидным материалом. Пример 6. Очистка Zcyto10 из клеточной культуральной среды. Zcyto10, продуцируемый клетками СНО, выделяли из клеточной культуральной среды при помощи двухстадийного способа, включающего в себя катионообменную хроматографию и гельфильтрационную хроматографию. А. Стадия катионообменной хроматографии. Используемые материалы: колонка: 2,2 см (диаметр (D)) х 6 см (высота (Н)) (AMICON), упакованная катионообменной смолой SP-650M, которая является ионообменной смолой TOYOPEARL, имеющей ковалентно связанные сульфопропильные (SP) группы. Собирали 15 л культуральной среды от клеток почки детеныша хомяка (ВНК), которые были трансфицированы плазмидой, содержащей Zcyto10. pH этой среды доводили до pH 5 2н. НСl. Вышеописанную упакованную колонку уравновешивали 50 мМ ацетатом натрия, NaAc, pH 5,0. Эту культуральную среду наносили на колонку при скорости 20 объемов колонки (сv)/ч при приблизительно 8 мл/мин. По завершении нанесения колонку промывали 10 cv (объемами колонки) 50 мМ NaAc, pH 5,0. Затем материал, находящийся в колонке, элюировали 20 cv (объемами колонки) градиента NaCl в 50 мМ NaAc, pH 5,0. Градиент NaCl был в диапазоне от 0 до 0,5 М NaCl. Это концентрировало материал в культуральной среде с 15 л до 170 мл. Полученные собранные 170 мл дополнительно концентрировали до приблизительно 5 мл при помощи центрифужного концентратора с отсечением 5 тысяч (Millipore, Inc. Bedford, MA). В. Стадия гель-фильтрационной (S-100) хроматографии. - 19 - 005581 Используемые материалы: колонка: 1,6 см (диаметр) х 93 см (высота) гель S-100 (Pharmacia, Piscataway, NJ). Затем 5 мл собранного материала наносили на вышеописанную колонку, содержащую гель S-100. Колонка была уравновешена 5х забуференным фосфатом солевым раствором для доведения pH колонки до приблизительно 7,0. Zcyto10 очищали от примесей с использованием 1х ЗФР при скорости тока 1,5 мл/мин. Собирали фракции по 2 мл. Полипептид Zcyto10 выходил во фракциях 52-64 при приблизительно 90 мин после начала элюции, как определено при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН), который окрашивали Кумасси синим. Гель выявил одну полосу при предсказанной молекулярной массе около 14 кДа. Пример 7. Клонирование мышиного Zcyto10. Готовили ПЦР-праймеры: праймер 5'-MARATHON RACE™ (Clontech, Palo Alto, CA), представленный SEQ ID NO:38, присоединенный к адаптеру AP1 MARATHON RACE™, со вставленной последовательностью SEQ ID NO:39, присоединенной к адаптеру АР2 MARATHON RACE™, с праймером 3' MARATHON RACE™, представленным SEQ ID NO:40, присоединенным в адаптoру AP1 MARATHON RACE™, со вставленной последовательностью SEQ ID NO:41, присоединенной к адаптеру АР2 MARATHON RACE™, и проводили 5'- и 3'-rасе на кДНК MARATHON RACE™ кожи мыши. Несколько фрагментов получали из этих реакций и очищали на геле и секвенировали, что позволило выяснить полноразмерную кодирующую последовательность мышиного zcyto10, плюс некоторую 5'- и 3'-UTRпоследовательность. Были обнаружены два мышиных варианта Zcyto10, а именно, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34. Эти клоны амплифицировали при помощи ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO:43. Пример 8. Введение Zcyto10 в нормальных мышей с использованием аденовируса. Zcyto10 вводили с использованием аденовируса, содержащего ген Zcyto10. Использовали три группы мышей, описанных ниже. Аденовирус инъецировали внутривенно в самцов и самок мышей С57В1/6. Все мыши получали бромдезоксиуридин (BrdU) в их питьевой воде 3 дня перед умерщвлением. Это позволило детектировать пролиферацию клеток гистологическими способами. Измеренные параметры включают в себя изменение веса, полный анализ крови, химический анализ сыворотки, гистологию, вес органов и клеточную пролиферацию по BrdU. Построение эксперимента Группа 1 Zcyto10x1 (SEQ ID NO:18)/pAC-CMV/AdV 1 x 1011 частиц на дозу (9 самок, 9 самцов умерщвляли в день 21) (2 самки, 2 самца умерщвляли в день 11) общее число = 22 мыши. Группа 2 нуль CMV/AdV (контроль) 1 х 1011 частиц на дозу (10 самок, 10 самцов умерщвляли в день 21) (2 самки, 2 самца умерщвляли в день 11) общее число =24 мыши. Группа 3 без обработки (5 самок, 5 самцов) общее число = 10. Результаты Наиболее поразительным эффектом было значимое увеличение в числе тромбоцитов, которое наблюдали в самцах и самках мышей, обработанных Zcyto10-аденовирусом, в сравнении с "пустым" аденовирусным контролем. Это сопровождалось у самцов мышей уменьшением гематокрита и увеличением веса селезенки и печени. Вес вилочковой железы также уменьшался у самцов. В противоположность этому, обработанные Zcyto10-аденовирусом самки мышей обнаружили значимо увеличенные числа лейкоцитов, которые состояли прежде всего из увеличенных чисел лимфоцитов и нейтрофилов, в сравнении с "пустым" вирусным контролем. Эти результаты предполагают, что на гемопоэз влияет обработка Zcyto10, но, за исключением увеличенного числа тромбоцитов, действие на которое обнаруживается у обоих полов, остальные эффекты являются специфическими для определенного пола. Другие эффекты включают в себя следующее. Уровни глюкозы у самок были более низкими в обработанных группах, тогда как уровни глюкозы у самцов не обнаружили значимого изменения. Мочевинный азот крови (BUN) был более высоким как в обработанной группе самцов, так и в обработанной группе самок. Активность щелочной фосфатазы у самок была более высокой в обработанной группе, тогда как самцы не обнаружили значимого изменения. Число тромбоцитов было более высоким как в обработанной группе самцов, так и в обработанной группе самок. - 20 - 005581 Общие числа лейкоцитов (WBC) были более высокими в обработанных группах самок, тогда как самцы на обнаружили значимого изменения. Перечень последовательностей - 21 - 005581 - 22 - 005581 - 23 - 005581 - 24 - 005581 - 25 - 005581 - 26 - 005581 - 27 - 005581 - 28 - 005581 - 29 - 005581 - 30 - 005581 - 31 - 005581 - 32 - 005581 - 33 - 005581 - 34 - 005581 - 35 - 005581 - 36 - 005581 - 37 - 005581 - 38 - 005581 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид-предшественник цитокина Zcyto10 человека с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2 или SEQ ID NO 4, приведенной в перечне последовательностей, или зрелый полипептид цитокина Zcyto10 человека с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 12, или SEQ ID NO 13, или SEQ ID NO 26, приведенной в перечне последовательностей, или варианты данных полипептидов, по существу, на 90% идентичные указанным, полученные как раскрыто в описании, а также варианты данного полинуклеотида, полученные на основе вырожденности генетического кода. 2. Выделенный полинуклеотид по п.1, кодирующий полипептид-предшественник цитокина Zcyto10 человека с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2 или SEQ ID NO 4, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 1 или SEQ ID NO 3 соответственно. 3. Выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид-предшественник цитокина Zcyto10 мыши с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 19 или SEQ ID NO 34, приведенной в перечне последовательностей, или зрелый полипептид цитокина Zcyto10 мыши с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 20, или SEQ ID NO 25, или SEQ ID NO 35, приведенной в перечне последовательностей, или варианты данных полипептидов, по существу на 90% идентичные указанным, полученные как раскрыто в описании, а также варианты данного полинуклеотида, полученные на основе вырожденности генетического кода. - 39 - 005581 4. Выделенный полинуклеотид по п.3, кодирующий полипептид-предшественник цитокина Zcyto10 мыши с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 19 или SEQ ID NO 34, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 18 или SEQ ID NO 33 соответственно. 5. Выделенный цитокинподобный полипептид Zcyto10 человека, выбранный из группы, включающей a) полипептид-предшественник цитокина Zcyto10 человека с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4, приведенной в перечне последовательностей; b) зрелый полипептид цитокина Zcyto10 человека с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:12, или SEQ ID NO:13, или SEQ ID NO 26, приведенной в перечне последовательностей; c) варианты данных полипептидов а) и b), по существу на 90% идентичные указанным, полученные как раскрыто в описании. 6. Выделенный цитокинподобный полипептид Zcyto10 мыши, выбранный из группы, включающей a) полипептид-предшественник цитокина Zcyto10 мыши с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 19 или SEQ ID NO 34, приведенной в перечне последовательностей; b) зрелый полипептид цитокина Zcyto10 мыши с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:20, или SEQ ID NO 25, или SEQ ID NO 35, приведенной в перечне последовательностей; c) варианты данных полипептидов а) и b), по существу, на 90% идентичные указанным, полученные как раскрыто в описании. 7. Антитело, которое специфически связывается с полипептидом по любому из пп.5-6. 8. Антидиотипическое антитело по отношению к антителу по п.7. Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6 - 40 -
