ДВУХВОЛНОВАЯ МИКРОФЛУОРИМЕТРИЯ – МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ
advertisement
ДВУХВОЛНОВАЯ МИКРОФЛУОРИМЕТРИЯ – МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ Наталья А. Карнаухова, Лариса А. Сергиевич, Валерий Н. Карнаухов Институт биофизики клетки РАН, Пущино, Россия, 142290 nakarnaukhova@mail.ru Флуоресцентная спектроскопия является одним из важных методов исследования внутриклеточной регуляции обмена веществ. Флуоресцентный краситель акридиновый оранжевый (АО) широко используется для окрашивания нуклеиновых кислот как в живых, так и в фиксированных клетках. Функциональная (синтетическая) активность описывается безразмерным характеристическим параметром α, представляющим собой отношение РНК/ДНК в фиксированных клетках, окрашенных акридиновым оранжевым. Возможности флуоресцентной цитодиагностики были продемонстрированы при анализе клеток системы крови пациентов при различных заболеваниях с использованием микроспектрофлуориметра «МСФ-1» и двухволнового микрофлуориметра «Радикал ДМФ-2». Молекулярные изменения функциональных механизмов клеток иммунной системы под действием факторов разной природы и интенсивности могут рассматриваться как начальные стадии адаптивного и патологического ответа организма, позволяющие принять необходимые профилактические и реабилитационные меры на стадии обратимых функциональных изменений. Флуоресцентная спектроскопия является надёжным и чувствительным методом исследования таких изменений [1-3]. Флуоресцентный краситель акридиновый оранжевый (АО) широко используется для окрашивания нуклеиновых кислот как в живых, так и в фиксированных клетках. АО один и в сочетании с другими флуорохромами может предоставить широкую информацию о составе, молекулярной структуре, конформации и окружении нуклеиновых кислот в отдельных компартментах клетки. Примером перспективного использования АО является определение синтетической активности целой клетки или ее органоидов посредством регистрации безразмерного характеристического параметра α. В фиксированных клетках, окрашенных АО, параметр α представляет собой отношение интенсивностей флуоресценции в красной (640 нм) области спектра, обусловленной димерами красителя, связанными с односпиральными нуклеиновыми кислотами (НК1), и в зеленой (530 нм) области спектра, обусловленной мономерами красителя, интеркалированными в двухспиральные нуклеиновые кислоты (НК2). Показано, что при определённых условиях окрашивания клеток красителем АО изменения параметра α связаны с изменением количества РНК (НК1) на единицу ДНК (НК2) в целой клетке: α=I640/I530=κ[НК1]/[НК2]=K[AРНК]/[ДНК], где АРНК – активная РНК, к и К – коэффициенты связывания АО с субстратом. Клетки иммунной системы и периферической крови, в частности, лимфоциты, обладающие высокой чувствительностью к внутренним и внешним воздействиям, служат удобным объектом при изучении эффективности действия различных факторов на организм. Исследование функциональной (синтетической) активности лимфоцитов крови флуоресцентным микроспектральным методом является способом интегральной оценки состояния не только иммунной системы, но и процессов, происходящих в целом организме. Развитие флуоресцентной цитодиагностики в медицине и экологии возможно только при наличии системы достаточно надежно работающих методов и приборов микроспектрального анализа, представляющих собой комбинацию флуоресцентного микроскопа со спектроанализирующим устройством, снабженную электронными блоками регистрации и управления. Такая система, отвечающая потребностям цитодиагностики, может состоять из двух типов приборов [1-3]. 72 Микроспектрофлуориметр. Этот прибор является основным инструментом на этапе изучения флуоресцентных спектральных характеристик клеток. Конкретная схема этого прибора может варьировать в зависимости от задач. В качестве монохроматора могут быть использованы различные диспергирующие элементы, включая призмы, дифракционные решётки и интерференционные светофильтры переменной длины волны. Микроспектрофлюориметр МСФ-1 позволяет регистрировать спектры флюоресценции клетки и внутриклеточных органоидов размером до 0,5 мкм в спектральном диапазоне от 400 до 800 нм. Для слежения за развитием того или иного процесса не достаточно спектров флуоресценции одиночных клеток, необходимо получить информацию о поведении всей популяции изучаемых клеток. С этой целью удобно охарактеризовать спектр флуоресценции каждой клетки одним параметром. В качестве такого характеристического параметра для исследования синтетической активности иммунокомпетентных клеток был предложен параметр α. Серия гистограмм распределения клеток по параметру α может свидетельствовать о развитии тех или иных процессов в иммунной системе и организме в целом. Таким образом, микроспектрофлуориметр используется для фундаментальных исследований клеточных реакций, поиска и изучения новых безразмерных характеристических параметров клеток. Двухволновой (двухканальный) микрофлуориметр. После того, как с использованием микроспектрофлуориметра изучены спектры флуоресценции клеток и выявлены их характеристические параметры, нет необходимости затрачивать время на регистрацию полного спектра флуоресценции клеток, достаточно измерить интенсивности флуоресценции в двух характеристических спектральных интервалах, а именно (в случае параметра α) в областях 640 и 530 нм. Микрофлуориметр ДМФ-2 (Радикал, Россия) основан на флуоресцентном микроскопе с двухканальной (двухволновой) системой регистрации. Первый канал регистрирует интенсивность зеленой флуоресценции (I530), а второй – красной - (I640) одного и того же объекта. Это позволяет измерять флуоресцентные характеристики одиночных клеток и их компартментов, структура которых контролируется микроскопом. Флуоресценция возбуждается излучением ртутной дуговой лампы ДРШ 250-2 в длине волны λ=436 nm. Размер фотометрируемой площади соответствует размеру клетки или изучаемой структуры. Специальная программа «Микрофлуор» позволяет получать гистограммы распределения интенсивностей в красной и зеленой областях спектра, а также гистограммы распределения клеток по параметру α с выводом точек на фазовую плоскость и статистической обработкой данных. Такие приборы предназначены для быстрой регистрации многих клеток и получения статистически достоверной информации о состоянии всей клеточной популяции и особенно полезны в медицинских и экологических исследованиях. Возможности флуоресцентной диагностики клеток иммунной системы ранее были изучены при ряде заболеваний, а также под воздействием γ-облучения и электромагнитных полей [4-6]. При длительных неблагоприятных воздействиях ионизирующей радиации в малых дозах и хронических патологиях, наблюдается снижение функциональной (синтетической) активности лимфоцитов крови, что способствует возникновению повышенной восприимчивости к инфекциям, увеличивает риск аллергических заболеваний, неоплазий. В данной работе представлены исследования функциональной активности синтетического аппарата клеток системы крови (параметра α) флуоресцентным 73 спектральным методом с использованием микроспектрофлуориметра МСФ-1 [1,2] и двухволнового микрофлуориметра ДМФ-2 (Радикал, Россия) [3,7,8]. Исследование лимфоцитов крови пациентов с хроническими соматическими заболеваниями, осложненными ОРЗ и/или острым фарингитом. Были сформированы 2 группы пациентов в соответствии с двумя схемами проводимого лечения. Было обнаружено, что в каждой из групп были представлены пациенты с высоким и более низким ответом на инфекцию. Поэтому суммарные гистограммы распреде-ления параметра α для всех пациентов до лечения имели полимодальную форму (рис.1b). Правый сдвиг гистограммы являлся следствием нормального ответа лимфоцитов на инфекцию и воспаление, а левый сдвиг на гистограмме указывал на низкую синтетическую активность. Рис. 1. Суммарные гистограммы распределения После лечения значения лимфоцитов крови по параметру α: a – для контрольной группы, b – для всех пациентов до лечения, c – для всех параметра α приблизились к пациентов после лечения, d – для пациентов после лечения контрольным, форма по схеме I и e – для пациентов после лечения по схеме II. гистограмм стала унимоПо оси ординат – количество клеток. дальной (рис.1c). Это свидетельствовало об эффективности проведенного лечения и позитивной динамике в иммунном статусе пациентов. Однако после лечения по схеме I (рис.1d) значения параметра α лимфоцитов крови этих больных были выше, чем у больных после лечения по схеме II (рис.1е). Дальнейший мониторинг состояния пациентов показал, что увеличение параметра α до высоких значений нормы после лечения по схеме I является благоприятным фактором, указывающим на повышение иммунной устойчивости организма. Показано, что изменения флуоресцентного параметра α у пациентов в процессе лечения позволяют прогнозировать эффективность терапии. Обнаруженные различия в изменениях параметра α могут быть использованы для выбора лекарств в соответствии с индивидуальной реакцией крови пациентов. Флуоресцентный анализ ядерных клеток крови у пациентов с лейкозами в процессе химиотерапии. Оценка раннего ответа на химиотерапию онкологических больных является необходимой для эффективного выбора терапевтической тактики. Были исследованы изменения флуоресцентных характеристик ядерных клеток крови пациентов с лейкозами до и в процессе химиотерапии. Принимая в расчет особенности изменения параметра α клеток крови в процессе лечения, были выделены 2 группы больных (рис.2). У пациентов группы I (рис.2b) на 7 день лечения наблюдались экстремально высокие значения параметра α для всей клеточной популяции. Такие высокие значения параметра α, по-видимому, связаны с сильным повреждающим воздействием антиопухолевых и гормональных 74 препаратов на клетки циркулирующего пула, что приводит к их элиминации из кровяного русла. Клинические исследования костного мозга и крови показали, что у больных группы I в дальнейшем была достигнута клинико-гематологическая ремиссия. В то же самое время у пациентов группы II (рис.2b) не наблюдалось такого значительного повышения параметра α клеток крови в течение недели после начала лечения. Эти данные в сочетании с лабораторно-клиническими исследованиями указывают на неблагоприятный прогноз проводимой схемы лечения у пациентов группы II. Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования флуоресцентного параметра α в качестве биомаркера для прогноза эффективности выбранного лечения. Рис. 2. Гистограммы распределения ядерных клеток крови по параметру α пациентов группы I (слева) и группы II (справа) с острыми лимфобластными лейкозами до лечения (a), на 7 (b), 22(c) и 29 (d) дни в процессе лечения. По оси ординат – количество клеток. Таким образом, флуоресцентный микроспектральный метод исследования клеток является одним из приоритетных направлений современной науки. 1. В.Н. Карнаухов, Люминесцентный спектральный анализ клетки, Наука, Москва, 1978. 2. В.Н. Карнаухов, http:// www.edu.ru/db/portal/e-library/00000048/00000048.htm 3. В.Н. Карнаухов, Спектральный анализ в клеточном мониторинге состояния окружающей среды, Наука, Москва, 2001. 4. N.A. Karnaukhova, “Changes in fluorescent spectra of acridine orange stained blood cells from patient suffering from lymphosarcoma and leukemias in the course of chemotherapy,” Experimental oncology 13, 50-53 (1991). 5. N.A. Karnaukhova, L.A. Sergiyevich, G.E. Aksenova, V.N. Karnaukhov, “Synthetic activity of rat blood lymphocytes under acute and continuous gamma irradiation – Fluorescent microspectral study,” Radiation and Environmental biophysics 38(1), 49-56 (1999). 6. Карнаухова Н.А., Сергиевич Л.А., Квакина Е.Б., Барсукова Л.П., Марьяновская Г.Я., Кузьменко Т.С. Исследование функционального состояния синтетического аппарата лимфоцитов крови при действии слабых низкочастотных магнитных полей. Биофизика. Т. 45, вып. 4. С. 716-722 (2000). 75 7. В.Н. Карнаухов, В.А. Яшин, Н.А. Карнаухова, А.П. Казанцев, А.В. Карнаухов, “Двухволновой микрофлуориметр “Радикал ДМФ-2”, Тезисы докладов II съезда биофизиков России, т. II, 594-595, Москва (1999). 8. Н.А. Карнаухова, Л.А. Сергиевич, Б.М. Кужевский, Е.А. Сигаева, О.Ю. Нечаев, В.А. Карнаухов, В.Н. Карнаухов, “Исследование корреляции между функциональной активностью лимфоцитов крови различных видов животных и интенсивностью нейтронного излучения у поверхности Земли”, Биофизика 52(4), 699-704 (2007). DOUBLE WAVE MICROFLUORIMETRY IS THE METHOD IN STUDY OF THE FUNCTIONAL ACTIVITY OF IMMUNE SYSTEM CELLS Natalia A. Karnaukhova, Larisa A. Sergievich, Valery N. Karnaukhov One of the important methods to study the intracellular regulation of metabolism is the fluorescent spectroscopy. The cell functional (synthetic) activity is described by the parameter α representing the RNA/DNA ratio in fixed cells stained with AO. The possibilities of fluorescent cytodiagnosis have been studied to analyze the blood system cells in some diseases, using microspecrtrofluorimeter “MSF-1” and double wave microfluorimeter “Radical DMF-2”. 76
