Детекция РНК в живых клетках/SmartFlare зонды для детекции
advertisement
Детекция РНК в живых клетках SmartFlare™ зонды для детекции РНК Go live. It’s smart. Детекция РНК в живых клетках с зондами SmartFlare™ Работа с живыми клетками вместо лизатов позволит Вам исключить этапы пробоподготовки и трансфекции. С использованием технологии инертных наночастиц специфическое обнаружение нативной РНК в живых клетках теперь возможно в один шаг инкубации Зонды покидают клетку, предоставляя Вам возможность продолжать работу с этой же неповрежденной культурой Изображение miR-21 РНК в живых клетках рака простаты человека (DU145) с использованием зондов SmartFlare™ Клетки рака простаты человека DU145 были инкубированы со 100pM miR-21 Hu-Cy3 SmartFlare™ (Кат. No. SF-471, красный), в течение 16 часов и окрашены Hoechst 33342 (голубой) Make the smart change! Преимущества Работа с зондами SmartFlare™ для анализа экспресси генов в живых клетках исключает пробоподготовку, клеточный лизис и токсичность. Детекция в живых клетках Наблюдение экспрессии генов в режиме реального времени наиболее точно отражает процессы в клетке Нативная РНК Амплификация не потребуется, выявляйте только нативную, эндогенную РНК, уходя от артефактов с традиционными методами амплификации. Отсутствие пробоподготовки Единственный шаг инкубации, исключающий необходимость пробоподготовки Gold-quenched fluorophore on reporter strand Открытая платформа детекции Детекция сигналов флюоресценции с использованием платформы по Вашему выбору: микроскоп, персональный клетоный анализатор, проточный цитометр, сортер клеток и т.д. Отсутствие токсичности Нетоксичные наночастицы попадают в клетку и покидают ее благодаря естественным механизмам, тем самым позволяя использовать эту же культуру для дальнейших экспериментов. Рисунок 1. Строение SmartFlare™ зондов Gold nanoparticle SmartFlare™ зонды состоят из золотой наночастицы, коньюгированной с дуплексом олигонуклеотидов, один из которых несет флюорофор. Сигнал флюорофора подавляется за счет близости к золотому ядру. Capture strand/ reporter strand duplex -AAAAAAATCAACCATACACCGTGACTTTGCTTGACCC Capture Strand Reporter Strand -AGTTGGTATGTGGCACT 3 Олиго-дуплексы состоят из "РНКзахватывающей" нити (более длинная, связана с золотой наночастицей)) и комплементарной ей "репортерной" последовательностью (более короткая, несет флюорофор) Это просто! Оставим сложность и неопределенность привычным методам детекции РНК. SmartFlare™ зонды помогают совершать открытия без усилий. Без пробоподготовки Без амплификации Без реагентов для трансфекции Без клеточного лизиса Без токсичности РНК-детекция зачастую требует утомительной пробоподготовки, РНКамплификации и детекции, основанной на стандартных кривых. Зонды для РНКдетекции SmartFlare™ поглощаются клеткой с помощью существующих механизмов эндоцитоза. Пробоподготовка отсутствует, Вы просто добавляете SmartFlare™ зонды к Вашей культуре, оставляете на ночь, и получаете результаты на следующий день. Спустя некоторое время зонды покидают клетку, не оставляя изменений, позволяя Вам продолжать эксперимент с этой же культурой. Простой механизм действия SmartFlare™ зондов открывает путь к изучению состава РНК в живой клетке, оставляя ее жизнеспособной и неповрежденной. Enter Bind Probes enter cell via natural endocytosis Fluoresce Probe approaches RNA target. Probe obe binds targett and flare releases for detection. In absence of target, probe is quenched by gold and does not fluoresce Target Протокол тестирования клеток (рекомендуемый протокол для тестирования "клетка-зонд" при первом использовании): Поместите клетки желаемой концентрации в лунки планшета (например, 30,000 клеток в 200 мкл полной среды в каждую лунку 96-луночного планшета) Разведите растворенный (восстановленный из лиофилизата) SmartFlare™ реагент 1:20 стерильным фосфатно-солевым буфером для получения рабочего раствора Добавьте 4 мкл разведенного реагента SmartFlare™ в каждую лунку (лунки заполнены средой с клетками на 60-80%) + Оставьте на ночь на инкубацию (16 часов) в благоприятных условиях (37 °C), CO2 (5%) и относительной влажности. Exit Детектируйте результаты с использованием платформы флюоресценции по Вашему выбору: проточный цитометр, цитометр с функцией визуализации, флюоресцентный микроскоп и т.д. Рисунок 2. Проникновение, связывание, флюоресценция, элиминация. Клетки поглощают SmartFlare™ зонды с помощью собственного механизма эндоцитоза. Зонды циркулируют внутри клетки и связывают комплементарные РНК-последовательности. В результате связывания освобождается флуорофор, свечение может быть детектировано с помощью платформы по Вашему выбору.Через некоторое время зонды покидают клетку, оставляя ее неповрежденной, что предоставляет Вам возможность дальнейших экспериментов. 5 Probes exit cell via exocytosis. The same cell can be reused for other experiments. When target is present, it will bind the capture strand, releasing the reporter strand, which fluoresces Применения SmartFlare зондов Использование клеток после SmartFlare™ -эксперимента для последующих исследований. Отслеживание изменений РНКдинамики во времени Сортинг типов клеток. Традиционная изоляция с помощью внутриклеточных РНК-маркеров достаточно трудоемка. Детекция РНК в живых клетках с помощью проточного цитометра Определение нескольких последовательностей РНК в одном эксперименте Подсчет miRNAs Изучение уровней РНК и протеинов на одних и тех же образцах Сортинг живых клеток на основе содержания РНК Теперь Вы можете сортировать Ваши клетки, основываясь на уровнях РНК-целей. После сортинга клетки остаются живыми и неповрежденными. Эта способность детектировать и разделять клетки в завсимости от уровня специфических РНК-целей предоставляет новые возможности для понимания соотношения генной экспрессии и функционирования клеток, а Использование живых клеток позволяет Вам изучать нативную, неамплифицированную РНК, выявляя важнейшие закономерности между профилями генной экспресии и фенотипическими проявлениями. Метод SmartFlare™ позволяет "заглянуть внутрь клетки". Визуализация РНК с помощью микроскопа Использование SmartFlare™-зондов для детекции РНК с помощью микроскопа наиболее просто. Вы можете наблюдать экспрессию РНК-целей прямо в живых клетках под микроскопом, отслеживать изменения в реальном времени, контролировать профили экспрессии генов в смешанных клеточных популяциях, и получать быстрые "+/-" ответы относительно экспрессии РНК-целей в живущих клетках. A. 140 40 20 100 90 80 70 60 50 40 30 0 сортированы на основе уровня 153 80 60 маркерах. Клетки были 204 Fluorescence (M5-510) Count 100 на внутриклеточных РНК- 100 экспрессии miR-155. Клетки 101 102 103 1 2 104 No probe MCF-7 100 101 102 103 104 miR-155 Expression Level (Cy5 Fluorescence) 105 Fluorescence (M5-510) 0 10 13 16 22 19 25 29 31 34 37 40 25 29 31 34 37 40 Cycles 110 160 140 120 Count белков в этих же клетках 9 HeLa HeLa 180 изолированы и использованы для исследования уровней 6 B. экспрессии miR-155 были 51 4 MCF-7 EGFR mRNA probe (RED2-HLog) с высоким и низким уровнем 102 Рисунок 5. 110 120 Рисунок 3. Сортинг, основанный Рисунок 4. Данные микроскопии демонстрируют специфичность и характер распределения SmartFlare™зондов в отношении к EGFR . Показаны различия уровней EGFR-экспрессии (красный) в клетках MCF7 (низкая экспрессия) и HeLa (высокая экспрессия) после инкубации с EGFRспецифичным SmartFlare™ зондом, и отсутствие сигнала в клетках, инкубированных с негативным контролем (слева). Определение количества РНК никогда не было проще! Амплификация больше не нужна - проточный цитометр определяет уровень флюоресценции в каждой клетке. Вы можете получать информацию о количестве специфичной РНК в каждой клетке с помощью проточных цитометров от Merck Millipore: guava easyCyte™ или Muse™ и зондов SmartFlare™. стволовые клетки. 256 EGFR Цель Определение количества РНК с использованием проточной цитометрии также для идентификации редких типов клеток, таких как настоящие раковые клетки и раковые Forward S catter Негативный контроль Клетки MCF-7 Инновационный дизайн зондов SmartFlare™ предоставит новые возможности для Ваших научных открытий! Клетки HeLa И многогранно! Что же происходит на самом деле? 100 80 60 40 20 100 90 80 70 60 50 40 0 100 10 10 1 2 10 FGF2 mRNA probe (RED2-HLog) No probe HT1376 HUVEC 3 10 4 1 2 4 HT1376 6 9 HUVEC 10 7 13 16 19 22 Cycles Детекция мРНК с помощью зондов SmartFlare™ коррелирует с данными RT-PCR. Показано использование технологии SmartFlare™ для определения уровней мРНК EGFR (A) в клетках HeLa и MCF-7, а также мРНК FGF2 (B) в клетках HUVEC и HT1376. Уровни РНК, детектированные с помощью проточной цитометрии демонстрируют удовлетворительную корреляцию с уровнями РНК, определяемыми RT-PCR. Merck Millipore предлагает мощное иннвационное решение для детекции флюоресценции на уровне единичной клетки. Какую платформу выбрать? Клеточный анализатор Muse™ РНК-детекторные зонды SmartFlare™ совместимы практически со всеми системами детекции флюоресценции. Вы можете анализировать содержание РНК в клетках после ночной инкубации на платформе по Вашему выбору. Вы можете выбрать любую платформу флюоресцентной детекции в зависимости от Ваших научных интересов. Анализ живой клетки Визуализация Персональный клеточный анализатор Микроскопия √ Сортер клеток √ √ √ √ Относительный подсчет Анализ на уровне единичной клетки √ Проточная цитометрия Проточный цитометр с функцией визуализации √ √ √ √ Упростите анализ miR-196 в единичных клетках с зондами SmartFlare™ и клеточным анализатором Muse™. www.millipore.com/muse guava easyCyte™ Настольные проточные цитометры Автоматизированный пробоотбор из 96-луночного планшета Отсутствие проточной жидкости! микрокапиллярная система предоставляет возможность использовать меньше образца и реагентов для анализа Распределение по APRIL внутри популяции, детектированное с помощью проточного цитометра guava easyCyte™ и зондов SmartFlare™. Мощное программное обеспечение InCyte™ √ с возможностью получения данных в виде "тепловых карт" и настроек анализа данных в режиме реального времени √ √ √ √ Возможности для сортинга 96-луночный формат Компактный и удобный Интуитивное программное обеспечение и сенсорный экран - все для оптимизации Вашей работы. Зеленый лазер для детекции флуорофора Cy3 Оптимизированные наборы для исследования состояния клеток, клеточного сигналинга и иммунологических параметров √ www.millipore.com/guava √ √ √ √ Проточные цитометры с функцией визуализации Amnis® Совмещает возможности флюоресцентного микроскопа со скоростью и чувствительностью проточного цитометра Возможность выполнять фенотипический анализ и проводить функциональные исследования одновременно благодаря 7 лазерам и 12 изображениям каждой клетки www.amnis.com 9 Проточный цитометр с функцией визуализации Amnis® и зонды SmartFlare™ помогут Вам понять характер распределения и интенсивность экспрессии Twist- в каждой из клеток Hs578t. С чего начать? Планируете работу с зондами SmartFlare™ на Вашей системе? Начните с наших контролей. Мы рекомендуем начать с Uptake и Housekeeping контролей чтобы оценить насколько РНК-детекторные зонды SmartFlare™ могут быть полезны для Вашего исследования. Сопутствующая продукция - SmartFlare Контроли Описание Housekeeping Контроли 250 реакций SF-143 18S Hu, Ms, Rt-Cy5 SmartFlare™ RNA Detection Probe 250 реакций SF-142 Beta Actin Hu-Cy5 SmartFlare™ RNA Detection Probe 250 реакций SF-144 Beta Actin Hu-Cy3 SmartFlare™ RNA Detection Probe Cyclophilin A Hu-Cy3 SmartFlare™ RNA Detection Probe Cyclophilin A Ms-Cy3 SmartFlare™ RNA Detection Probe Cyclophilin A Ms-Cy5 SmartFlare™ RNA Detection Probe GAPDH Hu-Cy3 SmartFlare™ RNA Detection Probe GAPDH Hu-Cy5 SmartFlare™ RNA Detection Probe Flare always on, does not bind target. GAPDH Ms-Cy3 SmartFlare™ RNA Detection Probe GAPDH Ms-Cy5 SmartFlare™ RNA Detection Probe GAPDH Rt-Cy3 SmartFlare™ RNA Detection Probe GAPDH Rt-Cy5 SmartFlare™ RNA Detection Probe HPRt1 Hu-Cy3 SmartFlare™ RNA Detection Probe HPRt1 Hu-Cy5 SmartFlare™ RNA Detection Probe HPRt1 Ms-Cy3 SmartFlare™ RNA Detection Probe HPRt1 Ms-Cy5 SmartFlare™ RNA Detection Probe B. Scramble Control No flare release. HPRt1 Rt-Cy3 SmartFlare™ RNA Detection Probe HPRt1 Rt-Cy5 SmartFlare™ RNA Detection Probe RNA Pol II Hu-Cy3 SmartFlare™ РНК детекторные зонды RNA Pol II Hu-Cy5 SmartFlare™ РНК детекторные зонды RNA Pol II Ms-Cy3 SmartFlare™ РНК детекторные зонды 250 реакций 250 реакций 250 реакций 250 реакций 250 реакций 250 реакций 250 реакций 250 реакций 250 реакций 250 реакций 250 реакций 250 реакций 250 реакций 250 реакций 250 реакций 250 реакций 250 реакций 250 реакций 250 реакций 250 реакций SF-145 SF-150 SF-139 SF-129 SF-128 SF-126 SF-136 SF-125 SF-138 SF-141 SF-140 SF-133 SF-132 SF-135 SF-134 SF-112 SF-189 SF-131 SF-130 SF-123 RNA Pol II Ms-Cy5 SmartFlare™ RNA Detection Probe 250 реакций SF-124 RPLP0 Ms-Cy3 SmartFlare™ RNA Detection Probe 250 реакций SF-187 RPLP0 Hu-Cy5 SmartFlare™ RNA Detection Probe RPLP0 Ms-Cy5 SmartFlare™ RNA Detection Probe C. Housekeeping Control Кат. № 18S Hu, Ms, Rt-Cy3 SmartFlare™ RNA Detection Probe Cyclophilin A Hu-Cy5 SmartFlare™ RNA Detection Probe A. Update Control Количество 250 реакций 250 реакций Flare release upon target binding. Рисунок 6. SmartFlare™ Контроли Uptake Контроль - Эти контроли флюоресцируют всегда! и это надежный способ подтверждения присутствия зондов в клетке и относительной оценки их количества Scramble Негативный контроль - Эти контроли помогают Вам оценить уровень фоновой флюоресценции внутри клетки. B. Housekeeping (Контроли "домашних генов") - Это контроли постоянно функционирующих генов. Они незаменимы для предварительной оценки работы системы "клетка - SmartFlare™ зонды" 11 SF-482 SF-199 Описание Количество Кат. № 250 реакций SF-114 250 реакций SF-137 Scramble-Cy3 SmartFlare™ RNA Detection Probe 250 реакций SF-103 Scramble-Cy5 SmartFlare™ RNA Detection Probe 250 реакций SF-102 miRNA Scramble-Cy3 SmartFlare™ RNA Detection Probe 250 реакций SF-147 miRNA Scramble-Cy5 SmartFlare™ RNA Detection Probe 250 реакций SF-146 Scramble Cy3+Uptake Cy5 SmartFlare™ RNA Detection Probe 250 реакций SF-105 250 реакций SF-104 Uptake Контроли Uptake-Cy3 SmartFlare™ RNA Detection Probe Uptake-Cy5 SmartFlare™ RNA Detection Probe Scramble Контроли Uptake/Scramble Комбинированные контроли Scramble Cy5+Uptake Cy3 SmartFlare™ RNA Detection Probe
