УДК 576.32/.36 ОСОБЕННОСТИ МЕХАНИЧЕСКИХ И

УДК 576.32/.36
ОСОБЕННОСТИ МЕХАНИЧЕСКИХ И ГЕОМЕТРИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЖИВЫХ
ЭРИТРОЦИТОВ, ЗАКРЕПЛЕННЫХ НА ПОЛИЛИЗИНОВОЙ ПОДЛОЖКЕ
М.М. Халисов
(Университет ИТМО, Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург)
Научный руководитель – к.ф.-м.н., доцент А.В. Анкудинов
(Университет ИТМО, Физико-технический институт им. А.Ф. Иоффе, Санкт-Петербург)
Введение. Экстремально высокая деформируемость живых эритроцитов затрудняет
исследования этих клеток с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) без
предварительной отверждающей обработки. В связи с этим, перед АСМ исследованием
эритроциты обычно высушивают или фиксируют специальными химическими агентами.
Лишь небольшая часть АСМ исследований эритроцитов концентрируется на изучении
необработанных, живых клеток [1-4]. Традиционно для иммобилизации живых клеток
применяют полилизин. Это вещество создает положительный заряд на подложке, и
эритроциты, заряженные отрицательно, притягиваются и прикрепляются к ней, благодаря
чему и становится возможным АСМ исследование. Прикрепленное к подложке состояние не
естественно для эритроцитов, поэтому можно, например, ожидать, что взаимодействие с
подложкой деформирует клетки. Картина воздействия полилизина на эритроциты, однако,
все еще далека от ясности, несмотря на ее принципиальную важность для развития АСМ
диагностики этих клеток.
Цель работы состояла в изучении с помощью оптической микроскопии и АСМ
влияния полилизина на морфологию и модуль упругости живых эритроцитов в условиях,
максимально приближенных к физиологическим.
Базовые положения исследования. Изучались эритроциты крыс линии Wistar, для
чего использовался атомно-силовой микроскоп Bruker Bioscope Catalyst, совмещенный с
инвертированным оптическим микроскопом. Эритроциты наносили на дно чашки Петри,
предварительно обработанное раствором полилизина разной концентрации. Модификация
подложки для АСМ исследований осуществлялась раствором полилизина в объемной
концентрации 10-3. Клетки исследовались в физиологическом растворе при температуре 37°С
в режиме поточечного зондирования АСМ PeakForce QNM, позволяющем одновременно
визуализировать топографию поверхности эритроцитов и получать количественную
информацию об их локальном модуле Юнга. Использовались стандартные острые АСМ
зонды пониженной жесткости Bruker SNL-10 (D).
Промежуточные результаты. Прикрепленные к подложке эритроциты выглядели в
оптическом микроскопе круглыми и окрашенными на фоне прозрачной подложки. АСМ
эксперименты показали, что форма таких клеток отличалась от традиционной дисковидной
двояковогнутой, характерной для свободных эритроцитов в жидкости. Эритроциты были
сильно распластаны по подложке, имели небольшую высоту и преимущественно плоскую
форму. Средний модуль Юнга таких клеток составил 13±9 кПа (n=17).
С течением времени некоторые эритроциты теряли оптический контраст и
обнаруживались на подложке лишь благодаря слабо заметному в оптический микроскоп
контуру. АСМ измерение таких трансформировавшихся эритроцитов показало, что
обесцвечивание сопровождается изменением формы с плоской на близкую к
полусферической, небольшим уменьшением площади контакта с подложкой, существенным
увеличением высоты, а также упрочнением. В среднем, такие клетки демонстрировали
модуль Юнга 48±10 кПа (n=6). Обесцвечивание эритроцитов, подобное нашему,
наблюдалось также в работе [5]. Авторы связывали результат с лизисом клеток вследствие
продолжительного сильного натяжения плазматической мембраны эритроцита, вызванного
адгезионным взаимодействием с полилизиновой подложкой. Однако полученные нами АСМ
данные свидетельствуют о том, что при описанной трансформации плазматическая мембрана
эритроцитов сохраняет свою целостность, а меняются лишь свойства клеток.
Основной результат. С помощью оптической микроскопии и АСМ было проведено
исследование свойств эритроцитов, прикрепленных к полилизиновой подложке, в условиях,
приближенных к физиологическим. Зарегистрированная форма локализованных на
полилизине эритроцитов отличалась от стандартной формы здоровых неприкрепленных
клеток. Часть эритроцитов со временем резко изменяла свои свойства: клетки становились
прозрачными, полусферическими и наблюдался рост их модуля упругости. Таким образом,
можно сделать вывод, что продолжительное взаимодействие с полилизином может
трансформировать свойства живых эритроцитов. Поэтому необходимо по возможности
минимизировать концентрацию полилизина при обработке подложки и сокращать
промежуток времени до старта АСМ исследования.
1.
2.
3.
4.
5.
Литература
Mozhanova, A.A., Nurgazizov, N.I., Bukharaev, A.A. // Proceedings Nizhni Novgorod March
2–5. 2003. P. 266–267
Lekka M., Fornal M., Pyka-Fościak G., Lebed K., Wizner B., Grodzicki T., Styczeń J. //
Biorheology. 2005. Vol. 42(4). P. 307-317
Maciaszek J.L., Andemariam B., Lykotrafitis G. // J. Strain Analysis. 2011. Vol. 46 (5). P. 368379.
Rebelo L. M., Sousa J. S., Santiago T. M., Mendes Filho J. // Microscopy: advances in
scientific research and education. 2014. Vol. 1. P. 141-152.
Hategan A., Law R., Kahn S., Discher D.E. // Biophys J. 2003. Vol. 85(4). P. 2746-2759.